RU2306320C2 - Рекомбинантное опухолеспецифичное антитело (варианты) и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение касается рекомбинантного антитела (AT) к ЕрСАМ, которое содержит аминокислотную последовательность, определяющую каркасную область L-цепи - Ig, и определенные остатки аминокислот последовательности SEQ ID NO: 5 (данная и последующие последовательности приведены в описании). Описан вариант рекомбинантного AT к ЕрСАМ, содержащее аминокислотную последовательность, определяющую каркасную область Н-цепи Ig, представляющую определенные остатки аминокислот последовательности SEQ ID N0:6. Другим вариантом рекомбинантного AT является AT к ЕрСАМ, содержащее в L-цепи остатки аминокислот 1-106 последовательности SEQ ID N0:9, а в Н-цепи остатки аминокислот последовательности SEQ ID NO: 18. Изобретение также касается векторов экспрессии, каждый из которых включает нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность каждого из вариантов рекомбинантного AT. Рекомбинантные антитела по изобретению обладают сниженной иммуногенностью по сравнению с исходными мышинными антителами к ЕрСАМ. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 табл.,1 ил.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Данная заявка претендует на приоритет и эффект изобретения в соответствии с предварительной заявкой на патент США с регистрационным номером 60/288,564, поданной 3 мая 2001 г., содержание которой включено сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится в целом к рекомбинантным антителам. Более конкретно изобретение относится к рекомбинантным антителам, которые специфически связывают Молекулу Адгезии Эпителиальных Клеток человека (EpCAM), и к их использованию в качестве диагностических, прогностических и лечебных средств.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В течение последних лет достигнут значительный прогресс в разработке лекарственных средств на основе антител. Например, исследователи идентифицировали не только разнообразные маркеры, специфичные по отношению к раковым опухолям, но и разнообразные антитела, специфически связывающиеся с этими маркерами. Антитела можно использовать для доставки некоторых молекул, например токсина или иммуностимулирующей молекулы, например цитокина, к раковой клетке, экспрессирующей маркер, так что раковая клетка избирательно погибает (см., например, Патенты США №№ 5,541,087 и 5,650,150).

Антитело KS-1/4 - это моноклональное антитело мыши, направленное против молекулы адгезии эпителиальных клеток человека (EpCAM). EpCAM экспрессируется с очень низкими уровнями экспрессии на апикальной поверхности некоторых эпителиальных клеток. Например, EpCAM экспрессируется клетками кишечника на поверхности клеток, обращенной к перевариваемой пище и удаленной от кровотока, где эта молекула недоступна для большинства белков и клеток иммунной системы (Balzar et al. [1999] J. Mol. Med. 77:699-712).

Однако при определенных условиях ЕрСАМ экспрессируется на высоком уровне на некоторых клетках, например на опухолевых клетках эпителиального происхождения. В типичном случае эти опухолевые клетки теряют свою полярность, в результате чего ЕрСАМ экспрессируется на всей поверхности клеток. Таким образом, ЕрСАМ является удобным опухолеспецифичным маркером для направления иммуностимулирующих молекул на основе антител к опухолевым клеткам (Simon et al. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2755-2759; Perez et al. [1989] J. Immunol. 142:3662-3667).

Тем не менее антитела могут обладать сопутствующей иммуногенностью для млекопитающего-реципиента. Это с большей вероятностью происходит в том случае, если антитела являются неаутологичными. Вследствие этого эффективность лекарственных средств на основе антител часто бывает снижена из-за иммуногенной реакции, направленной против антитела. Иммуногенная реакция в типичном случае усиливается, если антитело полностью или частично происходит от млекопитающего, отличающегося от млекопитающего-реципиента, например, если антитело получено от мыши, а реципиентом является человек. Соответственно может быть полезным модифицировать антитела, полученные от мыши, таким образом, чтобы они больше походили на антитела человека, с целью снижения или минимизации иммуногенности антитела, полученного от мыши.

Хотя был разработан ряд подходов, включающих, например, химерные антитела, гуманизацию антител и вениринг антител, в данной области техники существует потребность в антителах, связывающихся со специфическими раковыми маркерами и обладающих сниженной иммуногенностью при введении их человеку. Кроме того, в данной области техники существует потребность в антителах, которые доставляли бы токсины или иммуностимулирующие молекулы, например, в виде слитых белков или иммуноконъюгатов, к специфическим раковым маркерам с целью избирательного уничтожения опухолевых клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано частично на идентификации рекомбинантных антител, которые специфически связывают ЕрСАМ человека, но являются менее иммуногенными для людей, по сравнению с исходными антителами мыши к ЕрСАМ. Более конкретно изобретение предусматривает рекомбинантные KS антитела, в которых аминокислотные последовательности, определяющие одну или несколько каркасных областей и/или областей, определяющих комплементарность, модифицированы с целью снижения их иммуногенности для людей.

При использовании в данной работе термины «антитело» и «иммуноглобулин» понимают как обозначающие: (i) интактное антитело (например моноклональное антитело или поликлональное антитело), (ii) его антигенсвязывающие участки, включающие, например, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, (Fab')₂-фрагмент, Fv-фрагмент, сайт связывания отдельной цепи антитела, sFv, (iii) биспецифичные антитела и их антигенсвязывающие участки и (iv) мультиспецифичные антитела и их антигенсвязывающие участки.

При использовании в данной работе термины «связывается специфически», «специфически связывается» и «специфическое связывание» понимают как обозначающие то, что антитело обладает сродством связывания с определенным антигеном не менее, чем примерно 10⁶ М^-1, более предпочтительно не менее, чем примерно 10⁷ М^-1, еще более предпочтительно не менее, чем примерно 10⁸ М^-1, и наиболее предпочтительно не менее, чем примерно 10¹⁰ М^-1.

При использовании в данной работе термин «области, определяющие комплементарность» (Complementarity-Determining Regions) и соответствующую аббревиатуру «CDRs», понимают как обозначающие гипервариабельные области или петли вариабельной области иммуноглобулина, которые первично взаимодействуют с антигеном. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (V_L) содержат по три CDRs, расположенные между каркасными областями, как показано на фигуре 1. Например, в аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:1, CDRs определены последовательностями аминокислот от Ser24 до Leu33 (CDR1), от Asp49 до Ser55 (CDR2) и от His88 до Thr96 (CDR3). В аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:2, CDRs определены последовательностями аминокислот от Gly26 до Asn35 (CDR1), от Trp50 до Gly66 (CDR2) и от Phe99 до Tyr105 (CDR3). Соответствующие CDRs других антител, описанных в данной работе, показаны на фигурах 1А-1С после сопоставления их с соответствующими последовательностями тяжелой или легкой цепей антитела KS-1/4.

При использовании в данной работе термин «каркасные области» (Framework Regions) и соответствующую аббревиатуру «FRs» понимают как обозначающие области вариабельной области иммуноглобулина, прилегающие к областям, определяющим комплементарность. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (V_L) содержат по четыре FRs, как показано на фигуре 1. Например, в аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:1, FRs определены последовательностями аминокислот от Gln1 до Cys23 (FR1), от Trp34 до Phe48 (FR2), от Gly56 до Cys87 (FR3) и от Phe97 до Lys106 (FR4). В аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:2, FRs определены последовательностями аминокислот от Gln1 до Ser25 (FR1), от Trp36 до Gly49 (FR2), от Arg67 до Arg98 (FR3) и от Trp106 до Ser116 (FR4). FRs других антител, описанных в данной работе, показаны на фигурах X и Y после сопоставления их с соответствующими последовательностями тяжелой или легкой цепей KS-1/4.

При использовании в данной работе термин «KS антитело» понимают как обозначающий антитело, специфически связывающееся с тем же ЕрСАМ антигеном человека, который связывается KS-1/4 антигеном мыши, экспрессируемым гибридомой (см., например, Cancer Res. 1984, 44(2):681-687). KS антитело предпочтительно содержит: (i) последовательность аминокислот SASSSVSY (аминокислоты 24-31 в SEQ ID NO: 1), определяющую, по меньшей мере, участок CDR1 последовательности легкой цепи иммуноглобулина, (ii) последовательность аминокислот DTSNLAS (аминокислоты 49-55 в SEQ ID NO:1), определяющую, по меньшей мере, участок CDR2 последовательности легкой цепи иммуноглобулина, (iii) последовательность аминокислот HQRSGYPYT (аминокислоты 88-96 в SEQ ID NO: 1), определяющую, по меньшей мере, участок CDR3 последовательности иммуноглобулина, (iv) последовательность аминокислот GYTFTNYGMN (аминокислоты 26-35 в SEQ ID NO: 2), определяющую, по меньшей мере, участок CDR1 последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, (v) последовательность аминокислот WINTYTGEPTYAD (аминокислоты 50-62 в SEQ ID NO: 2), определяющую, по меньшей мере, участок CDR2 последовательности иммуноглобулина, или (vi) последовательность аминокислот SKGDY (аминокислоты 101-105 в SEQ ID NO: 2), определяющую, по меньшей мере, участок CDR3 последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, или любую комбинацию указанных последовательностей.

В одном из аспектов изобретение предусматривает рекомбинантное антитело, которое специфически связывает ЕрСАМ, причем это антитело содержит последовательность аминокислот, участок которой определяет каркасную область в V_L домене иммуноглобулина. В одной из форм осуществления изобретения каркасная область (FR1) определена остатками аминокислот 1-23 SEQ ID NO: 5, где Xaa1 - это Q или E, Xaa3 - это L или V, Xaa10 - это I или Т, Хаа11 - это M или L, Xaa13 - это A или L, Xaa18 - это K или R, или Хаа 21 - это M или L, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа1, Хаа3, Хаа10, Хаа11, Хаа13, Хаа18 или Хаа21 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 1. Аминокислоты в каждом из положений обозначены стандартным однобуквенным кодом.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR2) определена аминокислотными остатками 34-48 в SEQ ID NO: 5, где Хаа41 - это S или Q, Хаа42 - это S или A, Хаа45 - это P или L, или Хаа46 - это W или L, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа41, Хаа42, Хаа45 или Хаа46 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 1.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR3) определена аминокислотными остатками 56-87 в SEQ ID NO:5, где Хаа57 - это F или I, Xaa69 - это S или D, Xaa71 - это S или Т, Хаа73 - это I или Т, Хаа77 - это M или L, Хаа79 - это А или P, Хаа82 - это A или F, или Хаа84 - это Т или V, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа57, Хаа69, Хаа71, Хаа73, Хаа77, Хаа79, Хаа82 или Хаа84 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте изобретение предусматривает рекомбинантное антитело, которое специфически связывает ЕрСАМ, причем данное антитело содержит последовательность аминокислот, участок которой определяет каркасную область в V_L домене иммуноглобулина. В одной из форм осуществления изобретения каркасная область (FR1) определена аминокислотными остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа2 - это I или V, Xaa9 - это Р или А, Хаа11 - это L или V, или Хаа17 - это T или S, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа2, Хаа9, Хаа11 или Хаа17 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 2.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR2) определена аминокислотными остатками 36-49 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа38 - это K или R, Xaa40 - это Т или А, или Хаа46 - это К или Е, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа38, Хаа40, Хаа46 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 2.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR3) определена аминокислотными остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа68 - это F или V, Xaa69 - это A или T, Хаа70 - это F или I, Xaa73 - это Е или D, Xaa76 - это А или Т, Хаа80 - это F или Y, Xaa83 - это I или L, Xaa84 - это N или S, Xaa85 - это N или S, Xaa88 - это N, A или S, Xaa91 - это M или Т, или Хаа93 - это Т или V, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа68, Хаа69, Хаа70, Xaa73, Xaa76, Xaa80, Xaa83, Xaa84, Xaa85, Xaa88, Xaa91 или Хаа93 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 2. В еще одной форме осуществления изобретения каркасная область (FR4) определена аминокислотными остатками 106-116 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа108 - это Q или Т.

В другой форме осуществления изобретения V_L домен иммуноглобулина содержит FR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) аминокислотных остатков 1-23 последовательности SEQ ID NO: 9; и (ii) аминокислотных остатков 1-23 последовательности SEQ ID NO: 8. В другой форме осуществления изобретения V_H домен иммуноглобулина содержит FR-последовательность, определенную аминокислотными остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 18, и/или FR-последовательность, определенную аминокислотными остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 18. Более предпочтительно V_L домен содержит последовательность аминокислот, определенную аминокислотами 1-106 последовательности SEQ ID NO: 9, и/или V_H домен содержит последовательность аминокислот, определенную аминокислотами 1-116 последовательности SEQ ID NO: 18.

Кроме того, антитело может факультативно включать последовательность аминокислот, определяющую, по меньшей мере, участок CDR-последовательности, включающий, например, (i) остатки аминокислот 24-31 последовательности SEQ ID NO: 1; (ii) остатки аминокислот 49-55 последовательности SEQ ID NO:1; и/или (iii) остатки аминокислот 88-96 последовательности SEQ ID NO: 1. Сходным образом антитело может факультативно включать последовательность аминокислот, определяющую, по меньшей мере, участок CDR-последовательности, включающую, например: (i) остатки аминокислот 26-35 последовательности SEQ ID NO: 2; (ii) остатки аминокислот 50-62 последовательности SEQ ID NO: 2; и/или (iii) остатки аминокислот 101-105 последовательности SEQ ID NO: 2.

В другой форме осуществления изобретения антитело содержит ориентированный на антиген участок слитого белка, состоящего из антитела и цитокина. Цитокин предпочтительно является интерлейкином и наиболее предпочтительно является интерлейкином-2.

В следующем аспекте изобретение предусматривает вектор экспрессии, кодирующий, по меньшей мере, участок антитела согласно настоящему изобретению. В предпочтительной форме осуществления изобретения вектор экспрессии содержит последовательность нуклеотидов, изображенную как последовательность SEQ ID NO: 40.

В следующем аспекте изобретение предусматривает способ диагностики, прогнозирования и/или лечения больных людей, имеющих заболевание, связанное с чрезмерной экспрессией ЕрСАМ (например, заболевание, при котором ЕрСАМ присутствует в пораженной болезнью ткани на более высоком уровне, чем в ткани без этого заболевания). Способ включает введение одного из антител согласно настоящему изобретению человеку, нуждающемуся в такой диагностике, прогнозировании или лечении.

Антитело по выбору может содержать присоединенный к нему диагностический и/или терапевтический агент. Агент может быть слит с антителом с образованием слитого белка. Альтернативно агент может быть химически присоединен к антителу с образованием иммуноконъюгата. Предполагается, что агентом может быть, например, токсин, радиоактивная метка, цитокин, визуализирующий агент и т.п. В предпочтительной форме осуществления изобретения антитело согласно настоящему изобретению слито с цитокином с получением слитого белка. Предпочтительные цитокины предпочтительно включают интерлейкины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 и IL-18, гемопоэтические факторы, такие как колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF) и эритропоэтин, факторы некроза опухолей (ФНО, англоязычная аббревиатура - TNF), такие как TNFα, лимфокины, такие как лимфотоксин, регуляторы метаболических процессов, такие как лептин, интерфероны, такие как интерферон α, интерферон β и интерферон γ, и хемокины. Предпочтительно слитый белок типа «антитело-цитокин» проявляет биологическую активность цитокина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1А, В, С изображено:

Фиг. 1А, 1В и 1С демонстрируют линеаризованные варианты легкой и тяжелой цепей и консенсусные последовательности KS антител. Каркасные области иммуноглобулинов (FR1-FR4) обозначены «-». Области, определяющие комплементарность (FR1-FR4), обозначены «*». Отдельные сегменты V области легкой цепи KS антитела обозначены как «VK», где К обозначает то, что легкая цепь является каппа-цепью. Отдельные сегменты V области тяжелой цепи KS антитела обозначены как «V_Н». Аминокислоты, которые можно заменять, в консенсусных последовательностях обозначены как «Х».

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает рекомбинантные антитела, которые специфически связывают Молекулу Адгезии Эпителиальных Клеток (ЕрСАМ) человека. Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению имеют измененные вариабельные области, что приводит к снижению их иммуногенности в организме человека. Вариабельные области антител согласно настоящему изобретению особенно целесообразно использовать для нацеливания антител и содержащих антитела слитых белков на опухолевые ткани с избыточной экспрессией ЕрСАМ у больных людей. В предпочтительных формах осуществления изобретения антитело согласно настоящему изобретению соединяют с цитокином с получением иммуноцитокина.

Последовательности белков согласно настоящему изобретению

В настоящем изобретении описано семейство последовательностей вариабельной области (или V области) антител, которые будучи соответствующим образом гетеродимеризованы, связываются с молекулой адгезии эпителиальных клеток человека (ЕрСАМ), также известной как KS антиген (или KSA). Предпочтительные белки согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения больных людей, как описано в данной работе. Соответственно предпочтительные варианты KS антител являются гуманизированными, деиммунизированными или одновременно гуманизированными и деиммунизированными с целью снижения их иммуногенности при введении человеку. Согласно настоящему изобретению, KS антитела мыши можно деиммунизировать или гуманизировать, например, с использованием таких способов деиммунизации, в которых потенциальные Т-клеточные эпитопы устраняют или ослабляют посредством внедрения в них мутаций, снижающих связывание пептидного эпитопа с молекулой МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса II (см., например, WO98/52976 и WO00/34317), или с использованием способов, в которых Т-клеточные эпитопы, не происходящие от человека, мутируют таким образом, что они начинают соответствовать собственным эпитопам человека, присутствующим в антителах человека (см., например, Патент США № 5,712,120).

I. Вариабельная область легкой цепи

Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C- S-A-S-S-S-V-S-T-X-L-W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-X-E-I-K (SEQ ID NO: 3).

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-23 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или E в положении Xaa1; L или V в положении Xaa3; I, T или S в положении Xaa10; M или L в положении Xaa11; S или A в положении Xaa12; A, L или V в положении Xaa13; E или Q в положении Xaa17, K или R в положении Xaa18, V или A в положении Xaa19; и M, L или I в положении Xaa21. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот в FR1 области: Е в положении Xaa1; V в положении Xaa3; T или S в положении Xaa10; L в положении Xaa11; A в положении Xaa12; L или V в положении Xaa13; Q в положении Xaa17, R в положении Xaa18, A в положении Xaa19; и L или I в положении Xaa21.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR1 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 24-33 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно: S-A-S-S-S-V-S-T-X-L. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR1 области одну из следующих аминокислот: M или I в положении Хаа32. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR1 области замену аминокислоты, например, I в положении Хаа32.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 34-48 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или L в положении Xaa36; S или Q в положении Xaa41; S, A или P в положении Xaa42; P или L в положении Xaa45; W или L в положении Xaa46; и F или Y в положении Xaa48. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот в FR2 области: L в положении Xaa36; Q в положении Xaa41; A или P в положении Xaa42; L в положении Xaa45; L в положении Xaa46; и Y в положении Xaa48.

В следующей форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 56-87 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или I в положении Xaa57; A или S в положении Xaa59; S, D или T в положении Xaa69; I или T в положении Xaa71; I или T в положении Xaa73; S или N в положении Xaa75; M или L в положении Xaa77; A или P в положении Xaa79; A или F в положении Xaa82; и T или V в положении Xaa84. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: I в положении Xaa57; S в положении Xaa59; D или T в положении Xaa69; T в положении Xaa71; T в положении Xaa73; N в положении Xaa75; L в положении Xaa77; P в положении Xaa79; F в положении Xaa82; и V в положении Xaa84.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR4 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 97-106 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно F-G-G-G-T-K-X-E-I-K. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот, например, L или V в положении Хаа103. Соответственно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR4 области замененную аминокислоту, например, V в положении Хаа103.

II. Вариабельная область тяжелой цепи

Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:

Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-X-S-K-G-D-Y-W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 4)

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: I или V в положении Xaa2; P или A в положении Xaa9; L или V в положении Xaa11; E или S в положении Xaa16; и T или S в положении Xaa17. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa2; A в положении Xaa9; V в положении Xaa11; S в положении Xaa16; и S в положении Xaa17.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 36-49 последовательности SEQ ID NO:4: W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: K или R в положении Xaa38; T или A в положении Xaa40; K или Q в положении Xaa43; и K или E в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: R в положении Xaa38; A в положении Xaa40; Q в положении Xaa43; и E в положении Xaa46.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR2 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 50-66 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: D или K в положении Xaa63; и K или Q в положении Xaa65. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: K в положении Xaa63; и Q в положении Xaa65.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или V в положении Xaa68, A, T или V в положении Xaa69; F или I в положении Xaa70; S или T в положении Xaa71; L или A в положении Xaa72; E или D в положении Xaa73; A или T в положении Xaa76; A или L в положении Xaa79; F или Y в положении Xaa80; I или L в положении Xaa83; N или S в положении Xaa84; N или S в положении Xaa85; N, A или S в положении Xaa88; M или T в положении Xaa91; и T или V в положении Xaa93. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa68, T или V в положении Xaa69; I в положении Xaa70; T в положении Xaa71; A в положении Xaa72; D в положении Xaa73; T в положении Xaa76; L в положении Xaa79; Y в положении Xaa80; L в положении Xaa83; S в положении Xaa84; S в положении Xaa85; A или S в положении Xaa88; T в положении Xaa91; и V в положении Xaa93.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 99-105 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно F-X-S-K-G-D-Y. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: например, I или M в положении Xaa100. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR3 области замену аминокислоты, например, М в положении Хаа100.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR4 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 106-116 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или T в положении Xaa108; и S или T в положении X111. Более предпочтительно, рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: T в положении Xaa108; и T в положении X111.

III. Усовершенствованная вариабельная область легкой цепи

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-Y-M-L-W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C -H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-L-E-I-K (SEQ ID NO: 5)

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-23 последовательности SEQ ID NO: 5, а именно X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или E в положении Xaa1; L или V в положении Xaa3; I или Т в положении Xaa10; M или L в положении Xaa11; А или L в положении Xaa13; K или R в положении Xaa18, и M или L в положении Xaa21. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: Е в положении Xaa1; V в положении Xaa3; T в положении Xaa10; L в положении Xaa11; R в положении Xaa18; и L в положении Xaa21.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или E в положении Хаа1; A или L в положении Хаа11; и M или L в положении Хаа21. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: Е в положении Хаа1; L в положении Хаа11; и L в положении Хаа21.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 34-48 последовательности SEQ ID NO: 5, а именно W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: S или Q в положении Xaa41; S или A в положении Xaa42; P или L в положении Xaa45; и W или L в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: Q в положении Xaa41; A в положении Xaa42; L в положении Xaa45; и L в положении Xaa46.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: S или A в положении Хаа42; P или L в положении Хаа45; и W или L в положении Хаа46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: A в положении Хаа42; L в положении Хаа45; и L в положении Хаа46.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 56-87 последовательности SEQ ID NO: 5, а именно G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или I в положении Xaa57; S или D в положении Xaa69; S или T в положении Xaa71; I или T в положении Xaa73; M или L в положении Xaa77; A или P в положении Xaa79; A или F в положении Xaa82; и T или V в положении Xaa84. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: I в положении Xaa57; D в положении Xaa69; T в положении Xaa71; T в положении Xaa73; L в положении Xaa77; P в положении Xaa79; F в положении Xaa82; и V в положении Xaa84.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или I в положении Хаа57; S или D в положении Хаа69; А или Р в положении Хаа79; А или F в положении Хаа82; и Т или V в положении Хаа84. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: I в положении Хаа57; D в положении Хаа69; Р в положении Хаа79; F в положении Хаа82; и V в положении Хаа84.

IV. Усовершенствованная вариабельная область тяжелой цепи

Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N- W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G- W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-I-S-K-G-D-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 6).

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: I или V в положении Xaa2; P или A в положении Xaa9; L или V в положении Xaa11; и T или S в положении Xaa17. Соответственно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa2; A в положении Xaa9; V в положении Xaa11; и S в положении Xaa17.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: I или V в положении Xaa2; P или A в положении Xaa9; и L или V в положении Xaa11. Соответственно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: V в положении Xaa2; A в положении Xaa9; и V в положении Xaa11.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 36-49 последовательности SEQ ID NO:6, а именно W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: K или R в положении Xaa38; T или A в положении Xaa40; и K или E в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: R в положении Xaa38; A в положении Xaa40; и E в положении Xaa46.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области следующие аминокислоты, например, K или E в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области замену аминокислоты, например, E в положении Xaa46.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 50-66 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: D или K в положении Xaa63; и K или Q в положении Xaa65. Более предпочтительно, рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: K в положении Xaa63; и Q в положении Xaa65.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или V в положении Xaa68, A или T в положении Xaa69; F или I в положении Xaa70; E или D в положении Xaa73; A или T в положении Xaa76; F или Y в положении Xaa80; I или L в положении Xaa83; N или S в положении Xaa84; N или S в положении Xaa85; N, A или S в положении Xaa88; M или T в положении Xaa91; и T или V в положении Xaa93. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa68, T в положении Xaa69; I в положении Xaa70; D в положении Xaa73; T в положении Xaa76; Y в положении Xaa80; L в положении Xaa83; S в положении Xaa84; А или S в положении Xaa88; T в положении Xaa91; и V в положении Xaa93.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или V в положении Xaa68; E или D в положении Xaa73; N или S в положении Xaa84; N или S в положении Xaa85; N или А в положении Xaa88; и T или V в положении Xaa93. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: V в положении Xaa68; D в положении Xaa73; S в положении Xaa84; S в положении Xaa85; А в положении Xaa88; и V в положении Xaa93.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR4 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 106-116 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно W-G-X-G-T-S-V-T-V-S-S. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот, например, Q или T в положении Xaa108. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR4 области замененную аминокислоту, например, T в положении Xaa108.

Соответственно предпочтительные V-области содержат замены в FR доменах V_H и/или VK областей, соответствующих вариабельным областям KS-1/4 антитела мыши. Кроме того, предпочтительные V области согласно настоящему изобретению не включают вставки и делеции аминокислот, соответствующих вариабельным областям KS-1/4 антитела мыши.

Предпочтительные варианты включают белки, имеющие вариабельные области с идентичностью/гомологией по отношению к KS-1/4 антителу мыши, превышающей 80%. Последовательность аминокислот вариабельной области KS мыши или ее участка может быть использована в качестве эталонной последовательности для определения того, обладает ли испытываемая последовательность сходством аминокислот, достаточным для того, чтобы иметь обоснованные надежды на успех при использовании способов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно вариантные последовательности должны быть сходными, по меньшей мере, на 70% или идентичными на 60%, более предпочтительно сходными, по меньшей мере, на 75% или идентичными на 65%, и наиболее предпочтительно сходными на 80% или идентичными на 70% по отношению к FR областям или CDR областям вариабельных областей KS антитела мыши.

Чтобы определить, имеет ли анализируемая область требуемый процент сходства или идентичности по отношению к последовательности KS антитела мыши, анализируемую последовательность аминокислот и последовательность KS антитела мыши вначале сопоставляют с использованием алгоритма динамического программирования, описанного в работе Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol., 147:195-197, совместно с матрицей замещений BLOSUM62, изображенной на фигуре 2 в работе Henikoff and Henikoff (1992) PNAS 89:10915-10919. Для настоящего изобретения подходящее значение штрафного коэффициента для вставки в промежуток равно 12, а подходящее значение штрафного коэффициента для расширения промежутка равно 4. Компьютерные программы, выполняющие сопоставление с использованием алгоритма Смита-Уотермена (Smith-Waterman) и матрицы BLOSUM62, например пакет программ GCG (Oxford Molecular Group, Оксфорд, Англия), имеются в продаже и широко используются специалистами в данной области техники. После того как сопоставление исследуемой и эталонной последовательности выполнено, можно рассчитать оценку сходства в процентах. Последовательно сравнивают отдельные аминокислоты каждой последовательности соответственно их сходству. Если значение в матрице BLOSUM62, соответствующее двум сопоставленным аминокислотам, равно нулю или имеет отрицательное значение, оценка сходства пары равна нулю; в противном случае оценка сходства пары равна 1,0. Грубой оценкой сходства является сумма оценок сходства пар сопоставленных аминокислот. Затем грубую оценку нормализуют посредством деления ее на число аминокислот в той последовательности - исследуемой или эталонной, которая является меньшей. Нормализованная грубая оценка представляет собой процент сходства. Альтернативно для расчета процента идентичности сопоставленные аминокислоты каждой последовательности снова последовательно сравнивают. Если аминокислоты не идентичны, оценка идентичности пары равна нулю; в противном случае оценка идентичности пары равна 1,0. Грубая оценка идентичности равна сумме оценок идентичности сопоставленных аминокислот. Затем грубую оценку нормализуют посредством деления ее на число аминокислот в той последовательности - исследуемой или эталонной, которая является меньшей. Нормализованная грубая оценка представляет собой процент идентичности. При расчете процентов сходства и идентичности вставки и делеции игнорируют. Соответственно штрафные коэффициенты отрезков в этом расчете не используют, хотя их используют при первоначальном сопоставлении.

В изобретении также раскрыты способы оценки экспрессии KS антител клетками, такими как клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжевые клетки, другие эукариотические клетки или прокариотические клетки (см. Пример 1). В предпочтительном способе V области KS антител экспрессируются как компоненты интактного антитела человека, а экспрессию антител из линии эукариотических клеток оценивают посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), который выявляет Fc-фрагменты человека. Для точной количественной оценки связывания KS антитела с ЕрСАМ может быть использован анализ Biacore.

Лечение болезней людей слитыми белками, содержащими KS антитела

В изобретении также открыты последовательности слитых белков, содержащих KS антитело и IL-2, которые можно использовать при лечении болезней людей, например рака. Некоторые слитые белки, содержащие KS антитело и IL-2, такие как KS-1/4-IL2 (см., например, Конструкцию 3 в Примере 4), могут быть использованы для лечения людей, больных раком, с неожиданно малой иммунной реакцией на антитело.

Обнаружено, что во время лечения раковых опухолей у людей слитым белком KS-1/4(VH2NK1)-IL2 иммуногенность даже меньше, чем у слитого белка KS-1/4(Конструкция 3)-IL2. Более конкретно во время клинического испытания у больных обнаруживались антиидиотипические антитела и антитела к соединению антитела и IL2 или к IL-2 с меньшей частотой, чем при лечении слитым белком KS-1/4(Конструкция 3)-IL2. Вариабельные области антител согласно настоящему изобретению можно также соединить с другими цитокинами, например интерлейкинами 1, 2, 6, 10 или 12; интерферонами альфа и бета; TNF и INF гамма. Изобретение можно лучше понять, обратившись к следующим, не ограничивающим его примерам.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1: Способы и реактивы для экспрессии KS антител и анализа их антигенсвязывающей активности

1А. Культивирование и трансфекция клеток

В последующих Примерах были использованы следующие общие методики. Для временной трансфекции плазмидную ДНК внедряли в клетки почки человека линии 293 посредством копреципитации плазмидной ДНК фосфатом кальция (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).

Для получения стабильно трансфицированных клонов плазмидную ДНК вводили в клетки миеломы мыши NS/0 посредством электропорации. NS/0 клетки культивировали в среде Игла (Eagle), модифицированной по Далбекко (Dulbecco), с добавкой 10% плодной сыворотки коров. Примерно 5 х 10⁶ клеток однократно промывали PBS и повторно суспендировали в 0,5 мл раствора фосфатного буфера (PBS). Затем десять микрограммов плазмидной ДНК инкубировали с клетками в кювете Gene Pulser (межэлектродное расстояние 0,4 см, BioRad) в течение 10 минут на льду. Электропорацию производили с использованием Gene Pulser (BioRad) с установками на 0,25 В и 500 мкФ. Клеткам давали восстановиться в течение 10 минут на льду, после чего их повторно суспендировали в культуральной среде и наносили на 96-луночные планшеты. Стабильно трансфицированные клоны отбирали по росту в присутствии 100 нМ метотрексата (МТХ), который добавляли через два дня после трансфекции. Через каждые 3 дня клетки разводили культуральной средой в 2-3 раза, и через 2-3 недели появлялись клоны, резистентные к МТХ. Супернатанты от клонов анализировали посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) с антителами к Fc-фрагменту человека с целью выявления высоких продуцентов (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191). Высокопродуцирующие клоны выделяли и размножали в культуральной среде, содержащей 100 нМ МТХ.

1В. Твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA)

Три различных вида твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) были использованы для определения концентраций белковых продуктов в супернатантах от МТХ-резистентных клонов и в других исследуемых пробах. ELISA с антителами к Fc-фрагменту человека (huFc) был использован для определения количества белков, содержащих Fc-фрагмент человека, например химерных антител. ELISA с антителами к каппа-цепи человека был использован для определения количества легкой цепи каппа (химерных иммуноглобулинов или иммуноглобулинов человека). ELISA с антителами к Fc-фрагменту мыши был использован для определения в исследуемых пробах количества белков, содержащих Fc-фрагмент мыши (см. Пример 1С ниже).

ELISA с с антителами к Fc-фрагменту человека подробно описан ниже.

А. Нанесение на планшеты

На планшеты для ELISA был нанесен IgG (H + L) козы против белков человека AffiniPure (Jackson Immuno Research) в концентрации 5 мкг/мл в PBS по 100 мкл/лунку 96-луночного планшета (Nunc-Immunoplate Maxisorp). Обработанные планшеты накрывали и инкубировали при 4 ^оС в течение ночи. Затем планшеты промывали 4 раза 0,05% Твином (Твин 20) в PBS и блокировали 1% BSA/1% сывороткой козы в PBS по 20 мкл/ячейку. После инкубации с блокирующим буфером при 37 ^оС в течение 2 часов планшеты 4 раза промывали 0,05%-ным раствором Твина в PBS и просушивали досуха на бумажных полотенцах.

В. Инкубация с исследуемыми пробами и вторым антителом

Исследуемые пробы разбавляли до нужных концентраций буфером для разбавления проб, который содержал 1% BSA/1% сыворотки козы/0,05% Твина в PBS. Получали калибровочную кривую для химерного антитела (содержавшего Fc-фрагмент человека), концентрации которого были известны. Для получения калибровочной кривой производили серийные разведения буфером для разбавления проб с получением калибровочной кривой в диапазоне от 125 нг/мл до 3,9 нг/мл. Разбавленные пробы и стандартные растворы добавляли на планшеты по 100 мкл/лунку, и планшет инкубировали при 37 ^оС в течение 2 часов.

После инкубации планшет промывали 8 раз 0,05%-ным раствором Твина в PBS. Затем к каждой лунке добавляли по 100 мкл второго антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) IgG, к белкам человека (Jackson Immuno Research), которое было разведено в соотношении примерно 1:120000 буфером для разбавления проб. Можно было определить точное разведение второго антитела для каждой партии, конъюгированного с HRP IgG к белкам человека. После инкубации при 37 ^оС в течение 2 часов планшет промывали 8 раз 0,05%-ным раствором Твина в PBS.

C. Проявление

К планшету добавляли раствор субстрата по 10 мкл/ячейку. Раствор субстрата готовили путем растворения 30 мг орто-фенилендиамина гидрохлорида (OPD) (1 таблетка) в 15 мл раствора 0,025 М лимонной кислоты/0,05 М Na₂HPO₄ буфера, рН 5, который содержал 0,03% свежедобавленной Н₂О₂. Окраске давали возможность проявиться в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.

Время проявления могло изменяться в зависимости от вариабельности разных партий планшетов с покрытием, вторичного антитела и т.д. Проявление окраски для калибровочной кривой наблюдали для того, чтобы определить, когда остановить реакцию. Реакцию останавливали посредством добавления 4N H₂SO₄ по 100 мкл/лунку. С планшета считывали результаты с помощью стандартного ридера, который был настроен на две длины волны - 490 нм и 650 нм - и запрограммирован на вычитание фоновой оптической плотности (OD) на длине волны 650 нм из оптической плотности на длине волны 490 нм.

При ELISA с антителами к каппа-цепи человека следовали описанной выше процедуре, за исключением того, что использовавшимся вторым антителом было конъюгированное с пероксидазой хрена антитело козы к каппа-цепи человека (Southern Biotechnology Assoc. Inc., Birmingham, AL) в разведении 1:4000.

Процедура ELISA с антителами к Fc-фрагменту мыши также была сходной, за исключением того, что на планшеты для ELISA наносили IgG (H+L) козы к белкам мыши AffiniPure (Jackson Immuno Research) в концентрации 5 мкг/мл PBS и в количестве по 100 мкл/лунку; а вторым антителом был конъюгированный с пероксидазой хрена IgG козы к белкам мыши - Fcγ (Jackson Immuno Research) в разведении 1:5000.

1С. Клонирование KS антигена (KSA, EpCAM) и экспрессия его растворимой формы в виде ЕрСАМ человека-Fc-фрагмент мыши

Информационную РНК (mRNA) получали из клеток LnCAP с использованием набора реактивов Dynabeads mRNA Direct Kit (Dynal, Inc., lake Success, NY) согласно инструкциям производителя. После синтеза первой нити кДНК с использованием олиго(dT) и обратной транскриптазы полномерную кДНК, кодирующую молекулу адгезии эпителиальных клеток (также известную под названием KS антигена или KSA), клонировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательности ПЦР-праймеров были выбраны на основании ранее опубликованной последовательности, описанной в работе Perez and Walker (1989) J. Immunol. 142:3662-3667. Последовательность прямого праймера имеет вид TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGCA (SEQ ID NO: 27), а последовательность обратного праймера имеет вид CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEQ ID NO: 28), где кодон инициации трансляции и антикодон стоп-кодона трансляции показаны жирным шрифтом, а сайты рестрикции XbaI (TCTAGA) и XhoI (CTCGAG) подчеркнуты. Продукт ПЦР был клонирован, и правильность последовательности KSA была подтверждена посредством секвенирования нескольких независимых клонов. Последовательность кДНК KSA из клеток LnCAP была практически идентична опубликованной ранее последовательности KSA из клеток UCLA-P3 (Perez and Walker, 1989). Однако на уровне аминокислотного остатка номер 115 последовательность нуклеотидов из клеток LnCAP содержала ATG, а не ACG (Met вместо Thr), а на уровне аминокислотного остатка номер 277 последовательность нуклеотидов из клеток LnCAP содержала АТА, а не ATG (Ile вместо Met).

Связывание KS-1/4 антитела с рекомбинантным KSA была продемонстрирована посредством иммуноокрашивания. Поверхностную экспрессию KSA получали посредством трансфекции клеток, например СТ26, В16 и т.д., полномерным KSA в подходящем векторе экспрессии для млекопитающих (pdCs, как описано в Патенте США № 5,541,087) с последующим иммуноокрашиванием антителом KS-1/4. Для экспрессии KSA в виде растворимого антигена удаляли участок кДНК, кодирующий трансмембранный домен KSA. Для ускорения экспрессии, обнаружения и очистки растворимый KSA экспрессировали как KSA-muFc, строение которого можно описать следующим образом. Фрагмент рестрикции XbaI-EcorI, состоящий из 780 пар оснований и кодирующий растворимый KSA, лигировали к фрагменту AfIII-XhoI, кодирующему muFc (Патент США № 5,726,044) через линкер-адаптер:

AA TTC TCA ATG CAG GGC 3' (SEQ ID NO: 29)

G AGT TAC GTC CCG AAT T 5' (SEQ ID NO: 30)

Фрагмент XbaI-XhoI, кодирующий растворимый KSA-muFc, лигировали к pdCs вектору. Результирующий вектор экспрессии - pdCs-KSA-muFc - использовали для трансфекции клеток, а стабильные клоны, экспрессирующие KSA-muFc, идентифицировали с помощью ELISA с антителами к Fc-фрагменту мыши.

1D. Оценка связывания антигена

KSA-muFc в кондиционированной среде вначале был очищен посредством хроматографии с Белком А в соответствии с протоколом производителя (Repligen, Cambridge, MA). Очищенный слитый белок KSA-muFc был использован для нанесения покрытия на 96-луночные планшеты (Nunc-Immunoplate, Maxisorp) в концентрации 5 мкг/мл в PBS и в количестве 100 мкл/лунку. Анализ был сходен с процедурой ELISA, описанной в Примере 1В. Вкратце планшеты с покрытием накрывали крышкой и инкубировали при 4^оС в течение ночи. Затем планшеты промывали и блокировали. Исследуемые пробы разводили до нужных концентраций буфером для разбавления проб, добавляли в лунки планшета в количестве 100 мкл/лунку, и планшет инкубировали при 37^оС в течение 1 часа. После инкубации планшет 8 раз промывали 0,05%-ным раствором Твина в PBS. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл второго антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена IgG к антигенам человека (Jackson Immuno Research), разбавленного в соотношении примерно 1:120000 буфером для разбавления проб. Затем планшет проявляли и считывали результаты, как описано в Примере 1В.

1Е. Измерение скорости образования и диссоциации комплексов KS-1/4 антител с ЕрСАМ с помощью анализа Biacore

Сродство молекул KS-1/4 и KS-IL2 к антигену ЕрСАМ было измерено в анализе взаимодействия антитело-антиген посредством поверхностного плазмонного резонанса с помощью аппарата Biacore (Biacore International AB, Uppsala, Sweden). ЕрСАМ-Fc-фрагмент мыши присоединяли к сенсорному чипу СМ5 в соответствии с протоколом аминного связывания, поставляемым производителем. Затем по поверхности чипа пропускали KS-1/4 и KS-IL2 в концентрациях, варьировавших между 25 нМ и 200 нМ, при этом наблюдали связывание с чипом. С использованием встроенного стандартного программного обеспечения для аппроксимации кривых Biacore рассчитывали скорость образования комплекса, скорость диссоциации комплекса, константы связывания и диссоциации.

1F. Измерение сродства связывания KS-1/4 антител с использованием клеточных линий, экспрессирующих ЕрСАМ

Очищенные KS-1/4 антитела йодировали по стандартным методикам с использованием ¹²⁵I, и возрастающие концентрации меченого белка инкубировали с ЕрСАМ-позитивной линией клеток РС-3. Были получены кривые насыщения для процесса связывания, а с помощью анализа Скетчарда (Scatchard) были определены константы диссоциации.

Пример 2: Клонирование кДНК, кодирующих V_H и V_K KS-1/4 антитела мыши и конструирование вектора экспрессии для экспрессии антитела, производного от гибридомного KS-1/4 антитела

Информационная РНК, выделенная из экспрессирующей KS-1/4 гибридомы мыши (получена от R. Reisfeld, Scripps Research Institute), была обратно транскрибирована с олиго(dT), а затем использована в качестве матриц для ПЦР с целью амплификации последовательностей, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_K). ПЦР-праймеры были разработаны на основании опубликованных последовательностей (Beavers et al., см. выше). ПЦР-праймеры для V_H имели следующие последовательности:

прямой праймер для V_H:

(5') GACTCGAGCCCAAGTCTTAGACATC (3') (SEQ ID NO: 31)

обратный праймер для V_H: (5')

CAAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGACGTTC (3')

(SEQ ID NO: 32)

где последовательности CTCGAG и AAGCTT представляют собой соответственно сайты рестрикции XhoI и HindIII, использованные для лигирования V_H в вектор экспрессии (см. ниже); а последовательность ТАС в обратном праймере предназначена для внедрения GTA, консенсусной последовательности донорного сайта сплайсинга, в прямую нить продукта ПЦР.

ПЦР-праймеры для V_K имели следующие последовательности:

прямой праймер для V_K:

(5') GATCTAGACAAGATGGATTTTCAAGTG (3') (SEQ ID NO: 33)

обратный праймер для V_K:

(5') GAAGATCTTACGTTTTATTTCCAGCTTGG (3') (SEQ ID NO: 34)

где последовательности TCTAGA и AGATCT представляют собой сайты рестрикции XbaI и BgIII соответственно использованные для лигирования V_K в вектор экспрессии (см. ниже); ATG - кодон инициации трансляции легкой цепи; а последовательность ТАС в обратном праймере предназначена для внедрения GTA, консенсусной последовательности донорного сайта сплайсинга, в прямую нить продукта ПЦР.

Продукты ПЦР, кодирующие V_H и V_K области KS-1/4 антитела мыши, клонировали в pCRII вектор (Invitrogen, Carlsbad, CA). Несколько V_H и V_K клонов были секвенированы и в каждом из них была определена консенсусная последовательность. V_H и V_K последовательности были поэтапно вставлены в вектор экспрессии pdHL7. При лигировании были использованы уникальные XhoI и HindIII сайты в случае V_H и уникальные XbaI и BgIII/BamHI сайты в случае V_K (уникальный сайт BgIII в V_K вставке и уникальный сайт BamHI в векторе имеют совместимые выступы). Результирующая конструкция получила название pdHL7-гибридомное chKS-1/4, причем она уже содержала элементы регуляции транскрипции и последовательности константной области Ig человека для экспрессии химерных антител (Gillies et al. (1989), J. Immunol. Methods 125:191).

Вектор экспрессии pdHL7 был получен из pdHL2 (Gillies et al. (1991), Hybridoma 10:347-356) со следующими модификациями: в векторе экспрессии pdHL2 единицы транскрипции для легкой цепи и тяжелой цепи - цитокина - состояли из усилителя гена тяжелой цепи иммуноглобулина и металлотионеинового промотора. В pdHL7 эти две единицы транскрипции состояли из усилителя-промотора CMV (Boshart et al. (1985), Cell 41:521-530). ДНК, кодирующая усилитель-промотор CMV, была получена из Af1III-HindIII фрагмента имеющегося в продаже рсДНКI (Invitrogen Силир., San Diego, CA).

Пример 3: Исследования экспрессии KS-1/4 антител мыши

В этом примере обсуждаются исследования экспрессии, выполненные с использованием плазмиды экспрессии, кодирующей последовательности V области, которые описаны в Патенте США № 4,975,369.

3А. Конструирование плазмиды

Для прямого сравнения химерных антител, кодируемых последовательностью гибридомного KS-1/4 антитела и последовательностями, описанными в Патенте США № 4,975,369, была синтезирована кДНК, кодирующая V_H последовательность, описанную в Патенте США № 4,975,369. Затем ее лигировали в вектор экспрессии pdHL7, уже содержащий V_K KS-1/4 антитела.

Для создания V_H последовательности, описанной в Патенте США № 4,975,369, путем обычного химического синтеза был получен фрагмент NdeI-HindIII, кодирующий часть V_H последовательности. Перекрывающиеся олигонуклеотиды химически синтезировали и лигировали. Затем лигированный дуплекс субклонировали в вектор XbaI-HindIII pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA).

Данная ДНК кодирует последовательность белка IQQPQNMRTM, описанную в Патенте США № 4,975,369. Непосредственно на 3'-конце кодирующей последовательности расположен донорный сайт сплайсинга, начинающийся с gta. ctag на 5'-конце верхней нити, является выступом для сайта клонирования XbaI. Этот липкий конец позже лигируют к сайту HindIII в интроне, предшествующем Cγ1 гену (Gillies et al. (1991), Hybridoma 10:347-356).

После подтверждения последовательности нуклеотидов выделяли фрагмент рестрикции NdeI-HindIII. Его совместно с фрагментом XhoI-NdeI, кодирующим N-терминальную половину V_H, затем лигировали к вектору экспрессии pdHL7, рестрицированному XhoI-HindIII и содержащему V_K KS-1/4. Результирующая конструкция pdHL7-'369chKs-1/4, содержащая V_K и V_H, описана в Патенте США № 4,975,369 (обозначена как US4,975,369 chKS-1/4).

3B. Сравнение гибридомного антитела chKS-1/4 и антитела US4,975,369 chKS-1/4

Плазмидные ДНК pdHL7-гибридомное chKS-1/4 и pdHL7- US4,975,369 chKS-1/4 параллельно внедряли в клетки почки человека линии 293 посредством процедуры копреципитации фосфатом кальция, описанной выше. Через пять дней после трансфекции кондиционированные культуральные среды анализировали посредством ELISA с антителами к Fc-фрагменту человека и ELISA с антителами к каппа-цепи (см. процедуры ELISA в Примере 1), результаты анализа суммированы в Таблице 1.

Таблица 1

Антитело	ELISA с антителами к huFc	ELISA с антителами к каппа-цепи
Гибридомное антитело chKS-1/4	254 нг/мл	200 нг/мл
US4,975,369 chKS-1/4	14 нг/мл	0 нг/мл

Результаты показывают, что гибридомное антитело chKS-1/4 нормально экспрессировалось и секретировалось, и что секретированное антитело состояло примерно из эквимолярных количеств тяжелых и легких цепей в пределах точности двух различных анализов ELISA. С другой стороны, в случае US4,975,369 chKS-1/4 антитела в кондиционированной среде было обнаружено лишь низкое содержание тяжелой цепи и с ней не была связана легкая каппа-цепь.

Был проведен вестерн-блот анализ общих лизатов клеток и кондиционированных сред от двух временно трансфицированных клеточных линий. Процедуры вестерн-блот анализа описаны в работе Sambrook et al. (1989) (см. ссылку выше). Для анализа общих лизатов клеток трансфицированные клетки лизировали, центрифугировали для удаления дебриса и на каждую дорожку наносили лизат, эквивалентный 5 х 10⁵ клеток. Для анализа кондиционированных сред белковый продукт из 300 мкл кондиционированной среды вначале очищали посредством хроматографии на Сефарозе с иммобилизированным Белком А перед SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. После вестерн-блот переноса блот гибридизировали с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы к Fcγ IgG человека (Jackson Immuno Research), использовавшимся в разведении 1:2000.

Вестерн-блот перенос показал, что в использованных условиях тяжелая цепь обнаруживалась как в кондиционированной среде, так и в лизированных клетках, трансфицированных pdHL7-гибридомное chKS-1/4. Результаты свидетельствуют, что тяжелая цепь антитела chKS-1/4 продуцировалась в клетках и эффективно секретировалась (совместно с легкой цепью). С другой стороны, после трансфекции US4,975,369 chKS-1/4 тяжелая цепь обнаруживалась только в лизате клеток, но не в кондиционированных средах. Этот результат показывает, что хотя в клетке тяжелая цепь и продуцировалась на сопоставимом уровне, она не секретировалась. Этот факт совпадает с результатами анализа ELISA, которые показали, что в случае US4,975,369 chKS-1/4 антитела с небольшим количеством секретированных тяжелых цепей не была ассоциирована легкая каппа-цепь. Понятно, что в типичном случае тяжелые цепи иммуноглобулинов не секретируются нормально в отсутствие легких цепей иммуноглобулинов (Hendershot et al. (1987) Immunology Today 8:111).

В дополнение к вышеизложенному клетки NS/0 параллельно трансфицировали посредством электропорации плазмидами pdHL7-гибридомное chKS-1/4 и pdHL7- US4,975,369 chKS-1/4. Отбор стабильных клонов производили в присутствии 100 нМ МТХ, как описано в Примере 1, и кондиционированные среды от МТХ-резистентных клонов исследовали посредством ELISA с антителами к Fc-фрагменту человека на 96-луночных планшетах, как описано в Примере 1. Результаты суммированы в Таблице 2.

Таблица 2

Антитело	Общее число исследованных клонов	Состояние*	Наивысший уровень экспрессии
Гибридомное антитело chKS-1/4	80	0,1-0,5 мкг/мл (41)	10-50 мкг/мл (4)
US4,975,369 chKS-1/4	47	0-10 нг/мл (36)	0,1-0,4 мкг/мл (4)

(* Цифры в скобках обозначают число клонов для данного состояния или число клонов с наивысшими уровнями экспрессии продукта, определенными посредством ELISA с антителами к Fc-фрагменту человека.)

При скрининге на стадии 96-луночного планшета большинство клонов, полученных при трансфекции конструкцией pdHL7-гибридомноеchKS-1/4, продуцировали примерно от 100 нг/мл до 500 нг/мл антитела, причем наилучшие клоны продуцировали примерно 10-50 мкг/мл. С другой стороны, большинство клонов, полученных при трансфекции конструкцией pdHL7-US4,975,369 chKS-1/4, продуцировали примерно от 0 нг/мл до 10 нг/мл антитела, причем наилучшие клоны продуцировали примерно 300-400 нг/мл. Для исследования состава и характеристик связывания антитела US4,975,369 chKS-1/4 было необходимо вырастить клоны, которые продуцировали бы порядка 300-400 нг/мл. Два таких клона были выбраны для размножения. Однако было обнаружено, что их уровни экспрессии очень нестабильны. В то время, когда объем культур достиг 200 мл, уровни экспрессии обоих клонов снизились до примерно 20 нг/мл, по результатам анализа ELISA с антителами к Fc-фрагменту. Когда те же кондиционированные среды анализировали посредством ELISA с антителами к каппа-цепи, не было обнаружено легкой каппа-цепи, как и в случае временной трансфекции клеток почки человека линии 293.

Описанный ниже эксперимент показал, что с тяжелой цепью антитела US4,975,369 chKS-1/4 не было ассоциировано обнаружимых легких каппа-цепей. Вкратце кондиционированные среды от каждого из клонов концентрировали посредством хроматографии с Белком А. Элюаты анализировали посредством ELISA c антителами к Fc-фрагменту и ELISA с антителами к каппа-цепи. В качестве контроля аналогичным образом обрабатывали и одновременно анализировали кондиционированную среду от клона, продуцирующего гибридомное антитело chKS-1/4. Результаты ELISA суммированы в Таблице 3.

Таблица 3

Антитело	ELISA c антителами к Fc-фрагменту	ELISA с антителами к каппа-цепи
Гибридомное антитело chKS-1/4	42 мкг/мл	44 мкг/мл
US4,975,369 chKS-1/4 - клон 1	253 нг/мл	0 нг/мл
US4,975,369 chKS-1/4 - клон 2	313 нг/мл	0 нг/мл

Результаты показали, что, действительно, не было обнаружимых легких каппа-цепей, ассоциированных с тяжелыми цепями US4,975,369 chKS-1/4. Кроме того, было показано, что гибридомное антитело chKS-1/4 связывает KS антиген в концентрации 10-20 нг/мл, тогда как антитело US4,975,369 от обоих клонов, концентрированное до 253 и 313 нг/мл, все еще не связывало KS антиген (см. измерение связывания с KS антигеном в Примере 9).

Пример 4. Экспрессия и определение характеристик вариантов KS антител

Ожидается, что мутации, значительно снижающие экспрессию или сродство антитела к молекуле-мишени, будут менее эффективными в задачах, связанных с лечением людей. Некоторые подходы к снижению иммуногенности, такие как «вениринг», «гуманизация» и «деиммунизация», включают в себя осуществление многочисленных замен аминокислот и могут нарушать связывание антитела с антигеном (см., например, Патенты США №№ 5,639,641 и 5,585,089 и публикации международных заявок №№ WO 98/52976, WO 00/34317). В данной области техники существует потребность в таких классах последовательностей антител, которые будут связываться с молекулой адгезии эпителиальных клеток, но будут отличаться от оригинальных моноклональных антител мыши, распознающих этот антиген.

Различные комбинации вариабельных («V») областей тяжелой и легкой цепей антитела KS-1/4 были исследованы на их способность к экспрессии и на их способность связываться с ЕрСАМ. Эти результаты суммированы в Таблицах 4-6 и описаны ниже.

Таблица 4

Последовательности V областей тяжелой и легкой цепей антитела KS-1/4

Легкие цепи:

10 20 30 40 50 60

VK0 QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR

VK1 QIVLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYILWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSR

VK6 EIVLTQSPATLSLSPGERVTLTCSASSSVSYMLWYQQKPGQAPKLLIFDTSNLASGIPAR

VK7 QILLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR

VK8 EIVLTQSPATLSLSPGERVTLTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPAR

70 80 90 100

| | | |

VK0 FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 1)

VK1 FSGSGSGTSYTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 11)

VK6 FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 7)

VK7 FSGSGSGTSYSLIISSMEPEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 8)

VK8 FSGSGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 9)

Тяжелые цепи:

10 20 30 40 50 60

IQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH1 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH2 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH2.5 QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH6 QVQLVQSGAEVKKPGESVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTY

VH7 QIQLVQSGAEVKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

VH369 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINTYTGEPTY

70 80 90 100 110

| | | | |

VH0 ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNE.DMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 2)

VH1 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE.DTATYFCVRFMSKGDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 21)

VH2 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 22)

VH2.5 ADDFKGRFTITAETSTSTLYLQLNNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 19)

VH6 AQKFQGRVTISLDTSTSTAYLQLSSLRAE.DTAVYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 17)

VH7 ADDFKGRFAFSLETSTSTAFLQINNLRSE.DTATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18)

VH369 ADDFKGRFAFSLETSASTAFLQIqqpqnmrtMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 35)

Таблица 5

Последовательности вариантов KS-1/4 антитела и вариантов CDR3 области тяжелой цепи со вставками отдельных аминокислот

VH2 часть последовательности: ... ATYFCVRF I S K GDYWGQG... (остатки

аминокислот 92-109 последовательности SEQ ID NO: 22)

VH2.1: ... ATYFCVRF IIS K GDYWGQG... (SEQ ID NO: 36)

VH2.2: ... ATYFCVRF IVS K GDYWGQG... (SEQ ID NO: 37)

VH2.3: ... ATYFCVRF I SAK GDYWGQG... (SEQ ID NO: 38)

VH2.4: ... ATYFCVRF I S KTGDYWGQG... (SEQ ID NO: 39)

Таблица 6

Уровни экспрессии и активность в отношении связывания вариантов KS-1/4 антител

	Экспрессия		Сродство к ЕрСАМ
Конструкция	Временная (*) (в нг/мл)	Стабильная (*) (в мкг/мл)	Относительное связывание (**)	Kd (нМ)
Группа 1
VK0/VH0 (Гибридомное антитело chKS-1/4)		10 - 50	1x	1,0 x 10-9
VK0/VH'369 ('369 chKS-1/4)		0,1 - 0,4(***)	≫30x
VK8/VH7 (Конструкция 3)		10 - 50		1,0 x 10-9
VK6/VH6 (Конструкция 1)	300		n.d. (****)
VK7/VH7 (Конструкция 2)	30
VK8/VH7-IL2		10 - 50		1,0 x 10-9
VK1/VH1-IL2		10 - 50		7,9 x 10-9
VK1/VH2-IL2		10 - 50		3,1 x 10-9
Группа 2
VK8/VH7 (Конструкция 3; контроль)	1500		1x
VK0/VH1	1500		8x
VK1/VH7	1500		1x
VK1/VH1	1500		2x
VK1/VH2	1500		1x -2x
VK1/VH1-IL2	1500		5x
VK1/VH2-IL2	1500		1,5x
VK1/VH2.5-IL2	1500		3x - 4x
Группа 3
VK8/VH7-IL2 (контроль)	760		1x
VK1/VH1-IL2	350		2x
VK1/VH2.1-IL2	290		>10x
VK1/VH2.2-IL2	270		>10x
VK1/VH2.3-IL2	190		7x
VK1/VH2.4-IL2	210		3x

(*) Стандартные достижимые уровни.

(**) «Относительное связывание» показывает, во сколько раз нужно увеличить концентрацию белка для достижения эквивалентного уровня связывания. Соответственно бульшие числа отражают меньшее сродство к ЕрСАМ.

(***) Легкая каппа-цепь не была обнаружима посредством ELISA (эквивалентно исходному уровню); поэтому функциональные антитела не экспрессировались.

(****) n.d. = невозможно обнаружить.

В Группе 2 и Группе 3 относительная активность связывания каждого белка была нормализована к контролю, указанному в первой строчке каждой группы. Анализ ELISA в основном является отражением скорости диссоциации комплекса и основан на количестве белка, оставшегося связанным после некоторых циклов промывки. Он используется для быстрого скрининга с целью исключения плохо связывающихся антител, но не для точного измерения сродства. В Группе 3 VH2-варианты VH2.1-VH2.4 сравнивали с VH1, чтобы определить, могут ли вставки аминокислот привести к повышению относительного связывания.

Последовательности соотносятся следующим образом. Как описано в примерах, последовательности VH0 и VK0 были получены посредством ПЦР амплификации из линии гибридомных клеток, которая экспрессирует оригинальное происходящее от мыши антитело KS-1/4 (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2). VH-'369 - это последовательность VH области, описанная в Патенте США № 4,975,369. Последовательности VH1, VH2, VH2.1-2.4, VK1 и VK2 были получены либо с использованием технологии деиммунизации, когда потенциальные Т-клеточные эпитопы удаляли или ослабляли посредством внедрения мутаций, снижающих связывание эпитопа пептида с молекулой МНС класса II, либо посредством изменения Т-клеточных эпитопов других видов млекопитающих, а не человека, таким образом, чтобы они соответствовали собственным эпитопам человека, присутствующим в антителах человека. Создание этих конструкций описано и проанализировано ниже. Конструкции из Таблицы 6 генерировали посредством трансфекции клеток млекопитающих комбинациями нуклеиновых кислот, экспрессирующих соответствующие V области тяжелой и легкой цепей. Последовательности VH6, VH7, VK6, VK7 и VK8 генерировали посредством замены поверхностных остатков гибридомного антитела KS-1/4 на парные остатки аминокислот человека, как описано ниже, с целью удаления потенциальных В-клеточных эпитопов человека. Конструкции 1-3 были генерированы посредством трансфекции клеток млекопитающих комбинациями нуклеиновых кислот, экспрессирующих V-области VH6, VH7, VK6, VK7 и VK8 тяжелой и легкой цепей, как описано в Таблице 4 и ниже.

4А. Определение характеристик KS антител с меньшим числом Т-клеточных эпитопов человека

Последовательности VH2.1-VH2.5 были получены для того, чтобы проанализировать, могут ли быть допустимыми вставки и замены отдельных аминокислот в CDR3 области тяжелой цепи антитела KS-1/4. Были сконструированы векторы экспрессии для комбинаций тяжелой и легкой цепей VK0/VH1, VK1/VH7, VK1/VH1, VK1/VH2, VK1/VH1-IL2, VK1/VH2-IL2 и VK1/VH2.5-IL2 и соответствующие антитела и слитые белки, содержащие антитело и IL-2, были экспрессированы и проанализированы в соответствии со способами, описанными в предыдущих примерах.

Более конкретно посредством общего химического синтеза были получены последовательности VH1, VH2, VK1 и VK2. Для каждой из этих последовательностей были химически синтезированы, фосфорилированы и лигированы группы перекрывающихся олигонуклеотидов, расширяющие кодирующие и комплементарные нити этих областей. Лигированные дуплексные молекулы затем были амплифицированы посредством ПЦР с использованием соответствующих праймеров для концов фрагментов, внедрены в вектор pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA), и последовательности были подтверждены. Эти фрагменты ДНК затем внедряли в вектор экспрессии pdHL7 на уровне соответствующих сайтов для генерирования полной тяжелой («Н») цепи и легкой («L») цепи соответственно.

Последовательность VH2.5 была получена из VH2 посредством модификации одного кодона с целью получения Thr вместо Gln в положении 108 (Таблица 4) с использованием стандартных методик молекулярной биологии.

Антитела были проанализированы посредством ELISA (Таблица 6) и с использованием поверхностного плазмонного резонанса (аппарат и программное обеспечение Biacore) с целью сравнения их способности связываться с ЕрСАМ. Было признано, что результаты экспериментов с ELISA отражают, главным образом, скорость диссоциации, а не скорость образования комплекса, и являются в целом менее точными, так что плохой результат ELISA обычно использовался для исключения некоторых конструкций из дальнейшего исследования. Однако антитела, показавшие в ELISA хорошее связывание, необходимо было характеризовать далее.

Результаты поверхностного плазмонного резонанса были следующими:

Слитый белок	kon (M-1.c-1)	koff (c-1)	KD (M)
VK8/VH7-IL2	3,1 x 105	3,2 x 10-4	1,0 x 10-9
VK1/VH2-IL2	1,7 x 105	5,3 x 10-4	3,1 x 10-9
VK1/VH1-IL2	2,8 x 105	2,2 x 10-3	7,9 x 10-9

Поскольку скорость диссоциации для VK1/VH1-IL2 была гораздо большей, чем для VK1/V2-IL2 или VK8/VH7-IL2, VK1/VH1-IL2, был признан наименее полезным слитым белком.

Учитывая, что VK1/VH1-IL2 и VK1/VH2-IL2 различаются только наличием метионина или изолейцина в положении 100 CDR3 области V_H, повышение скорости диссоциации комплекса у VK1/VH1-IL2 по сравнению с VK1/VH2-IL2, доказывает, что это положение обеспечивает гидрофобный контакт с ЕрСАМ и что немного более длинная боковая цепь метионина делает этот контакт менее эффективным. В области взаимодействий «белок-белок» обычно считается, что гидрофобные взаимодействия играют главную роль в определении скоростей диффузии комплексов, но значительно менее важную роль в определении скоростей образования комплексов.

4В. Определение характеристик вариантов KS-1/4 антитела с вставками отдельных аминокислот

Значение CDR3 последовательности V области тяжелой цепи для сродства KS антитела к ЕрСАМ было определено с использованием серии вариантов, содержавших в этой области вставку или замену аминокислоты. Последовательности VH2.1, VH2.2, VH2.3 и VH2.4 были созданы посредством манипулирования с вектором экспрессии, кодирующим VH2 и VK1, с использованием стандартных методик работы с рекомбинантными ДНК. Результирующие векторы экспрессии были трансфицированы в клетки NS/0, а секретированные белки-антитела были очищены, как описано в предыдущих примерах.

Было обнаружено, что VH1 вариант был субоптимальным по сравнению с VH2 вариантом, что свидетельствовало о том, что изолейцин в CDR3 не мог быть замещен метионином. Следующая цель состояла в том, чтобы исследовать, может ли вставка аминокислоты в CDR3 дать V область тяжелой цепи KS-1/4 с лучшими характеристиками связывания по сравнению с VH1. В Таблице 6 сравниваются данные по связыванию VK1/VH2.1, VK1/VH2.2, VK1/VH2.3 и VK1/VH2.4 с VK1/VH1. Было обнаружено, что ни одна из конструкций со вставкой аминокислоты в CDR3 область V_H антитела KS-1/4 не обнаружила повышенного связывания с антигеном по сравнению с VH1, обычно активность связывания антигена у мутантов со вставками либо была несколько сниженной либо была резко сниженной.

Эти результаты показывают, что вставки аминокислот в CDR3 обычно являются вредными по отношению к антигенсвязывающей активности V областей тяжелой цепи KS-1/4. Если проанализировать эти данные, можно сделать несколько общих выводов. Более конкретно сегмент последовательности аминокислот V_H KS-1/4 в положениях 84-108, состоящий из аминокислот Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg-Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln, важен для связывания антигена антителом KS-1/4. Этот сегмент включает каркасный сегмент Asn-Asn-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp-Met-Ala-Thr-Tyr-Phe-Cys-Val-Arg, который обычно толерантен к одиночным и множественным заменам аминокислот, но не толерантен к вставкам аминокислот, которые могут оказывать вредный эффект на экспрессию и сборку. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что для антитела, эффективно экспрессируемого и связывающегося с ЕрСАМ, предпочтительно иметь в качестве аминокислот в положениях 86, 91, 93, 94 и 95 гидрофобные аминокислоты.

Вставка аминокислоты в CDR3 сегмент V_H, состоящий из Phe-Ile-Ser-Lys-Gly-Asp-Tyr, обычно является вредной в отношении функции связывания антигена ЕрСАМ антителом KS-1/4, хотя могут быть допустимы некоторые вставки, приводящие лишь к частичной потере активности. Сходным образом замены в этих положениях также обычно оказывают вредное влияние на связывание антигена ЕрСАМ, хотя могут быть допустимы некоторые вставки, приводящие лишь к частичной потере активности.

4С. Конструирование активных производных антител KS-1/4 с поверхностными остатками последовательностей мыши, преобразованными в соответствующие остатки из последовательностей человека

Антитела были получены посредством замены аминокислот в антителе KS-1/4 на аминокислоты, обычно обнаруживаемые в антителах человека, с целью минимизации иммуногенности V областей, полученных от мыши. Предпочтительные KS производные также сохраняли специфическое сродство связывания с ЕрСАМ человека.

Конструкция 1. Было обнаружено, что легкая цепь антитела KS-1/4 более всего сходна с консенсусной подгруппой III человека, а тяжелая цепь более всего сходна с подгруппой I. На основании этого сходства была создана концептуальная последовательность, состоящая из аминокислот консенсусной подгруппы человека и полученных из KS-1/4 CDR-фрагментов и неконсенсусных аминокислот. Для этой и последующих конструкций были созданы трехмерные модели с использованием рабочей станции Silicon Graphics и программного обеспечения BioSym для моделирования молекул.

Анализ трехмерных моделей показал, что некоторые аминокислоты последовательностей человека очень близко напоминают CDR области и, весьма вероятно, влияют на их конфигурацию. На основании этого анализа в легкой цепи Ser22, Arg44 и Phe66 человека были заменены обратно на Thr, Lys и Tyr соответственно. В тяжелой цепи такие изменения были признаны ненужными. В конечном проекте Конструкции 1 легкая цепь содержала 18 аминокислот человека, не обнаруживаемых в легкой цепи мыши, а тяжелая цепь содержала 22 аминокислоты человека, не обнаруживаемые в тяжелой цепи мыши.

ДНК для экспрессии Конструкции 1 были созданы с использованием синтетических олигонуклеотидов. Белок Конструкции 1 эффективно экспрессировался, но в анализе со связыванием ЕрСАМ было обнаружено, что он более чем в 10 раз менее активен.

Конструкция 2. Затем был применен менее агрессивный подход, при котором производили лишь одно из приведенных ниже изменений:

Легкая цепь: K18R, A79P

Тяжелая цепь: P9A, L11V, A76T, N88S, M91T.

ДНК для экспрессии Конструкции 2 были созданы с использованием синтетических олигонуклеотидов и стандартных методик получения рекомбинантных ДНК. Белок Конструкции 2 экспрессировался неэффективно. Кроме того, было обнаружено, что комбинация легкой цепи Конструкции 2 и тяжелой цепи антитела KS-1/4 мыши экспрессируется неэффективно, тогда как комбинация тяжелой цепи Конструкции 2 и легкой цепи антитела KS-1/4 мыши экспрессируется эффективно. Следовательно, дефект экспрессии, по-видимому, был связан с легкой цепью Конструкции 2.

Конструкция 3. На основании явного дефекта экспрессии в легкой цепи Конструкции 2 была сконструирована новая легкая цепь посредством слияния N-терминального участка легкой цепи Конструкции 1 и С-терминального участка легкой цепи мыши. Был использован сайт KpnI, кодирующий аминокислоты в положениях 35 и 36. Если эту легкую цепь объединяли с тяжелой цепью Конструкции 2, наблюдали эффективную экспрессию и не наблюдали значительное снижение связывания.

Поскольку Конструкция 3 позволила получить антитело с превосходными свойствами в отношении экспрессии белка и сродства к антигену по сравнению с Конструкциями 1 или 2, последовательности ДНК Конструкции 3 были вставлены в pdHL7s-IL2, что привело к получению плазмиды pdHL7s-VK8/VH7-IL2, которая описана как последовательность SEQ ID NO: 40. Для целей экспрессии эту плазмидную ДНК электропорировали в клетки миеломы мыши NS/0 с получением стабильно трансфицированной линии клеток, как описано в Примере 1А. Культуральную среду, взятую от стабильно трансфицированных клонов, затем анализировали на экспрессию антитела посредством анализа ELISA с покрытием, содержащим Fc-фрагмент человека, как описано в Примере 1В. Последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепей этого содержащего антитело слитого белка изображены как SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 соответственно.

Кроме того, связывание йодированных VK8/VH7 и VK8/VH7-IL2 с ЕрСАМ, экспрессированной на поверхности опухолевых клеток РС-3, сравнивали со связыванием йодированного VK0/VH0-IL2, с использованием способов, описанных в Примере 1F. В пределах ошибки эксперимента было обнаружено практически идентичное сродство связывания для VK8/VH7 и VK0/VH0 и для VK8/VH7-IL2 и VK0/VH0-IL2.0

4D. Структурно-функциональные взаимоотношения, полезные для конструирования активных KS-1/4 антител

Обобщая, можно сказать, что антигенсвязывающая активность антител KS-1/4 и слитых белков с последовательностями V области согласно настоящему изобретению обеспечивает руководящие принципы проектирования последовательностей KS-1/4антител к ЕрСАМ, а также для соответствующей экспрессии и секреции KS-1/4 антител. В частности, в V областях тяжелой и легкой цепей KS-1/4 антител допустимы многочисленные замены аминокислот без потери активности, при условии, что эти замены аминокислот производятся вне CDR областей. В V областях тяжелой и легкой цепей KS-1/4 антител, по-видимому, обычно недопустимы вставки аминокислот, особенно в пределах CRR областей или в каркасных областях между CDR областями.

Например, если последовательность гибридомного KS-1/4 антитела была взята в качестве исходной, «дикого типа», последовательности, то результаты показали, что в V области тяжелой цепи допустимы замены аминокислот в положениях 9, 11, 16, 17, 38, 40, 69, 70, 71, 72, 76, 79, 80, 83, 88, 91 и 111, приводящие к малому снижению активности или к отсутствию этого снижения. Сходным образом в легкой цепи допустимы замены аминокислот в положениях 1, 3, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 19, 21, 41, 42, 59, 71, 73, 75, 77, и 103, приводящие к малому снижению активности или к отсутствию этого снижения. Эти изменения расположены за пределами CDR областей V областей тяжелой и легкой цепей KS-1/4. 17 явно приемлемых замен аминокислот тяжелой цепи составляют примерно 21% положений аминокислот вне CDR областей и примерно 68% положений аминокислот вне CDR областей, в которых предпринимались попытки замены аминокислот. Сходным образом восемнадцать явно приемлемых замен аминокислот легкой цепи составляют примерно 23% положений аминокислот вне CDR областей и примерно 72% положений аминокислот вне CDR областей, в которых предпринимались попытки замены аминокислот. Было только два примера замены аминокислот вне CDR области, которые привели к получению заметно менее полезного белка: замена Ala79Pro в легкой цепи, которая, по-видимому, оказала негативное влияние на экспрессию; и замена Q108T в тяжелой цепи, которая оказала негативное влияние на связывание антигена. Следовательно, замены аминокислот могут быть произведены в последовательностях тяжелой и легкой цепей антитела KS-1/4 за пределами CDR областей, и существует большая вероятность того, что после этой замены будет получен активный белок.

Мутации, включающие замену аминокислоты в CDR области, часто оказывают негативное влияние на связывание антигена. Например, замена I100M в тяжелой цепи снижает связывание примерно в 8 раз. Мутации, которые включают вставку аминокислоты, обычно оказывают негативное влияние на полезность последовательности антитела KS-1/4. Например, V-область тяжелой цепи VH-'369 не способна к сборке в правильное антитело с легкой цепью, как описано в настоящей работе. Мутации VH2.1-VH2.4 имеют вставку аминокислоты в CDR3 области V области тяжелой цепи, и все эти мутации оказывают негативное влияние на связывание антигена.

Пример 5: Иммуногенность слитого белка, состоящего из KS антитела (Конструкция 3) и IL-2, у людей

В клиническом испытании на людях двадцать два больных получали одну или несколько схем лечения, причем все схемы лечения включали три последовательные ежедневные 4-часовые внутривенные инфузии слитого белка, состоявшего из KS антитела (Конструкция 3) и IL-2. Все схемы лечения были разделены месячными интервалами (Weber et al. (2001). Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 20:259a). Пробы сыворотки крови брали у каждого больного до и после выполнения каждой схемы лечения и исследовали на реактивность антител против молекулы, содержавшей целое KS антитело (Конструкция 3) и IL-2, или ее компонента, состоявшего из Fc-фрагмента и IL-2 (без Fv-области). Ни в одной из сывороток, полученных до иммунизации, не была обнаружена реактивность. Результаты показали, что только у 4 больных возник существенный иммунный ответ либо только против Fv-областей либо против Fv-областей и компонента Fc-IL2. Кроме того, эти ответы, судя по всему, не усиливались после последующего воздействия huKS-IL2.

Принято считать, что использование слитого белка, содержащего антитело и IL-2, представляет собой особенно строгий тест на иммуногенность V области, поскольку молекула интерлейкина-2 оказывает адьювантный эффект. Соответственно результаты свидетельствуют о том, что KS антитело (Конструкция 3) можно вводить людям, причем лишь у очень малого числа реципиентов будет развиваться явная реакция антител к слитому белку, состоящему из KS антитела (Конструкция 3) и IL-2. Эти результаты являются весьма обнадеживающими с учетом того факта, что KS антитело (Конструкция 3) содержит вариабельную область, которая почти полностью происходит от мыши и содержит лишь небольшое число остатков аминокислот, замененных на соответствующие остатки аминокислот человека.

Эквиваленты

Изобретение может быть осуществлено в других специфических формах без отклонения от его смысла или основных характеристик. Поэтому приведенные выше формы осуществления следует считать во всех аспектах скорее иллюстративными, нежели ограничивающими описанное здесь изобретение. Соответственно объем настоящего изобретения в большей степени определяется прилагаемой формулой изобретения, нежели приведенным выше описанием, и все изменения, которые совпадают со смыслом и диапазоном эквивалентности формулы изобретения, следует включать в него.

Включение посредством ссылок

Содержание всей патентной документации и научных публикаций, описанных в данной работе, полностью включено в данную заявку посредством ссылок.

Claims (15)

1. Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ, которое содержит последовательность аминокислот, определяющую каркасную область легкой цепи иммуноглобулина, выбранную из группы, состоящей из

(i) остатков аминокислот 1-23 SEQ ID NO: 5, где Xaa1 - это Q или Е, Хаа3 - это L или V, Xaa10 - это I или Т, Xaa11 - это М или L, Хаа13 - это А или L, Xaa18 - это К или R, или Хаа21 - это М или L, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Xaa1, Хаа3, Xaa10, Xaa11, Хаа13, Xaa18 или Хаа21 отличается от аминокислоты в SEQ ID NO: 1 в соответствующем положении;

(ii) остатков аминокислот 34-48 в SEQ ID NO: 5, где Хаа41 - это S или Q, Хаа42 - это S или А, Хаа45 - это Р или L, или Хаа46 - это W или L, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа41, Хаа42, Хаа45 или Хаа46, отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO:1; и

(iii) остатков аминокислот 56-87 в SEQ ID NO:5, где Хаа57 - это F или I, Хаа69 - это S или D, Хаа71 - это S или Т, Хаа73 - это I или Т, Хаа77 - это М или L, Хаа79 - это А или Р, Хаа82 - это А или F, или Хаа84 - это Т или V, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа57, Хаа69, Хаа71, Хаа73, Хаа77, Хаа79, Хаа82 или Хаа84 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO:1.

2. Рекомбинантное антитело по п.1, отличающееся тем, что указанная каркасная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из

(i) остатков аминокислот 1-23 последовательности SEQ ID NO:8; и (ii) остатков аминокислот 1-23 последовательности SEQ ID NO:9.

3. Рекомбинантное антитело по п.2, отличающееся тем, что указанная легкая цепь содержит аминокислоты 1-106 последовательности SEQ ID NO:9.

4. Рекомбинантное антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из

(i) остатков аминокислот 24-31 последовательности SEQ ID NO:1.

(ii) остатков аминокислот 49-55, последовательности SEQ ID NO:1; и

(iii) остатков аминокислот 88-96 последовательности SEQ ID NO:1.

5. Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ, которое содержит последовательность аминокислот, определяющую каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранную из группы, состоящей из

(i) остатков аминокислот 1-25 последовательности SEQ ID NO:6, где Хаа2 - это I или V, Хаа9 - это Р или A, Xaa11 - это L или V, или Хаа17 - это Т или S, при условии, что по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа2, Хаа9, Xaa11 или Xaa17 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO:2;

(ii) остатков аминокислот 36-49 последовательности SEQ ID NO:6, где Хаа38 - это К или R, Хаа40 - это Т или А, или Хаа46 - это К или Е, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа38, Хаа40, ХАА46 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO:2;

(iii) остатков аминокислот 67-98 последовательности SEQ ID NO:6, где Xaa68 - это F или V, Хаа69 - это А или Т, Хаа70 - это F или I; Хаа73 - это Е или D, Хаа76 - это А или Т, Хаа80 - это F или Y, Хаа83 - это I или L, Хаа84 -это N или S, Хаа85 - это N или S, Хаа88 - это N, А или S, Хаа91 - это М или Т, или Хаа93 - это Т или V, при условии что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Xaa68, Хаа69, Хаа70, Хаа73, Хаа76, Хаа80, Хаа83, Хаа83, Хаа84, Хаа85, Хаа88, Хаа91 или Хаа93 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO:2; и

(iv) остатков аминокислот 106-116 последовательности SEQ ID NO:6, где Хаа108 - это Q или Т.

6. Рекомбинантное антитело по п.5, отличающееся тем, что указанная каркасная область тяжелой цепи выбрана из группы состоящей из

(i) остатков аминокислот 1-25 последовательности SEQ ID NO:18; и

(ii) остатков аминокислот 67-98 последовательности SEQ ID NO:18.

7. Рекомбинантное антитело по п.6, отличающееся тем, что указанная тяжелая цепь содержит аминокислоты 1-116 последовательности SEQ ID NO:18.

8. Рекомбинантное антитело по п.1 или 5, отличающееся тем, что указанное антитело имеет Kd комплекса с ЕрСАМ не менее 10^-8 М.

9. Рекомбинантное антитело по п.1 или 5, отличающееся тем, что указанное антитело содержит цитокин.

10. Рекомбинантное антитело по п.8, отличающееся тем, что указанный цитокин - это IL-2.

11. Рекомбинантное антитело по п.5, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из

(i) остатков аминокислот 26-35 последовательности SEQ ID NO:2;

(ii) остатков аминокислот 50-62 последовательности SEQ ID NO:2; и

(iii) остатков аминокислот 101-105 последовательности SEQ ID NO:2.

12. Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ, содержащее в легкой цепи остатки аминокислот 1-106 SEQ ID NO:9, а в тяжелой цепи - остатки аминокислот SEQ ID NO:18.

13. Вектор экспрессии, включающий последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело к ЕрСАМ по п.1.

14. Вектор экспрессии, включающий последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело к ЕрСАМ по п.5.

15. Вектор экспрессии, включающий последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело к ЕрСАМ по п.12.

Images