CN101173295A - 用于鉴定引起免疫反应的抗原的组合物和方法 - Google Patents

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CN101173295A CNA2007101628003A CN200710162800A CN101173295A CN 101173295 A CN101173295 A CN 101173295A CN A2007101628003 A CNA2007101628003 A CN A2007101628003A CN 200710162800 A CN200710162800 A CN 200710162800A CN 101173295 A CN101173295 A CN 101173295A
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antigen
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Z·尤
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Abstract

本发明涉及一种表达载体，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原蛋白或肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。更具体地说，本发明涉及引起针对哺乳动物体内抗原的免疫反应的方法，该方法包括下列步骤：将所述表达载体导入细胞；在所述抗原分泌自所述细胞的条件下表达该载体以便产生抗原；使所分泌的抗原胞吞入细胞；加工所述抗原；并将片段呈递给受体以便引起T－细胞反应。此外，本发明涉及一种疫苗及其使用方法。本发明还涉及结合在MHC－II上的表位的鉴定方法。

Description

用于鉴定引起免疫反应的抗原的组合物和方法
发明领域
本发明涉及一种表达载体及其在哺乳动物体内引起完全免疫反应的应用。更具体地说，本发明涉及将内源性抗原加工成用于在MHC-II上呈递的外源性抗原的方法。本发明还涉及一种疫苗及其对哺乳动物进行免疫接种的使用方法。
发明背景
人体中不充分的抗原呈递导致控制和清除致病性感染和恶性细胞生长的人免疫系统衰竭。用于慢性感染和癌症的成功的治疗用疫苗和免疫疗法依赖于开发诱发能够控制和清除攻击性抗原的强烈免疫反应的有效抗原呈递的新手段。
细胞识别抗原的能力取决于抗原与MHC I型(MHC-I)或II型(MHC-II)蛋白的结合。例如，细胞毒性T-细胞对与MHC-I蛋白结合的抗原有反应。因此，杀灭病毒感染的细胞的细胞毒性T细胞不会杀灭被相同病毒感染的细胞，条件是该细胞也不表达合适的MHC-I蛋白。辅助T细胞识别MHC-II蛋白。辅助T细胞的活性一般取决于对抗原呈递细胞上的抗原的识别和“自体”MHC-II蛋白在这些细胞上的存在。这种识别与自体-MHC蛋白结合抗原的需求称作MHC结合。发现MHC-I蛋白实际上存在于所有带核细胞的表面上。发现MHC-II蛋白存在于包括脾脏的巨噬细胞、B细胞和树突细胞以及皮肤的朗格汉斯细胞在内的某些细胞的表面上。
一个使哺乳动物体内发动免疫反应的决定性步骤就是激活识别结合在主要组织相容性复合物(MHC)-II上的外源性抗原的CD4+辅助T-细胞。在诸如树突细胞(DCs)这样的抗原呈递细胞中以细胞内体途径俘获并加工这些抗原(Zajac等，1998；Bona等，1998；Kalams等，1998；Mellman等，1998；Banchereau等，1998)。在内体和溶酶体中，将所述抗原加工成在高尔基体区室内的MHC-II上呈递的小抗原肽类以便形成抗原-MHC-II复合物。这种复合物在细胞表面上表达，这种表达可诱导CD4+T细胞的活化。
在诱发动物体内的有效免疫反应中的其它决定性事件包括激活CD8+T-细胞和B细胞。当将所需的蛋白质以这类方式通过细胞传递以便作为在与MHC-I抗原复合的加工蛋白在细胞表面呈递时，CD8+细胞被激活。B细胞可以通过其表面的免疫球蛋白(IgM和IgD)与抗原发生相互作用而不需MHC蛋白。然而，CD4+T-细胞的活化刺激免疫系统的全部分支。在活化时，CD4+T-细胞(辅助T细胞)产生白细胞介素。这些白细胞介素帮助激活免疫系统的其它分支。例如，辅助T细胞产生帮助B细胞产生抗体的白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-5(IL-5)、激活CD4+和CD8+T-细胞的白细胞介素-2(IL-2)和激活巨噬细胞的γ干扰素。
由于识别结合在MHC-II上的抗原的辅助T-细胞在激活和克隆扩充细胞毒性T-细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和B细胞中起主要作用，所以激活辅助T细胞对抗原作出反应的起始事件对诱发针对该抗原的有效免疫反应来说是决定性的。已经报导了使用一种来源于溶酶体跨膜蛋白的序列刺激辅助T-细胞活化的尝试(Wu，1995)。然而，这些尝试没有导致诱发就CD8+T-细胞和B细胞而言在所测试哺乳动物体内的有效免疫反应。
因此，在本领域中存在对引起用于治疗哺乳动物体内疾病的免疫反应的有效和定向方式的持久需求。本发明满足了这一需求。
发明概述
本发明的一个实施方案是一种表达载体，它包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
在本发明的特定实施方案中，所述的多核苷酸启动子序列选自组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子组成的组。
在本发明的另一个特定的实施方案中，所述的编码信号序列的多核苷酸选自乙型肝炎病毒E抗原信号序列、免疫球蛋白重链前导序列和细胞因子前导序列组成的组。
本发明的一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的B细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的CD4+T-细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的CD8+T-细胞反应。
本发明的一个特定实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发导入了所述抗原的哺乳动物体内的B细胞反应、CD4+T-细胞反应和CD8+T-细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸序列包括用于多个表位的多核苷酸序列，其中所述的多个表位诱发导入了所述抗原的哺乳动物体内的B细胞反应、CD4+T-细胞反应和CD8+T-细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种与细胞表面受体结合的配体的多核苷酸序列。在特定的实施方案中，所述的细胞结合元件选自编码Fc片段、毒素细胞结合结构域、细胞因子、小肽和抗体的多核苷酸序列组成的组。在特定的实施方案中，编码细胞结合元件的多核苷酸是一种同源多核苷酸序列或异源多核苷酸序列。
本发明的另一个实施方案是一种包括表达载体的转化的细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
本发明的另一个实施方案是一种融合蛋白，其中该融合蛋白包括信号序列、抗原和细胞结合元件。在特定的实施方案中，已经用该融合蛋白在体外转导了抗原呈递细胞。在其它实施方案中，将该融合蛋白直接给予哺乳动物。
本发明的一个特定实施方案是一种包括表达载体的疫苗，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。在特定的实施方案中，疫苗包括抗原呈递细胞，其中用所述的表达载体在体外转导了所述的抗原呈递细胞。在其它实施方案中，疫苗包括抗原呈递细胞，其中用所述的融合蛋白在体外转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，它至少包括编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸和编码细胞结合元件的多核苷酸。
本发明的另一个实施方案是一种引起针对抗原的免疫反应的方法，该方法包括下列步骤：将表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在下列条件下表达所述的载体以便产生抗原：其中所述的抗原分泌自所述细胞；所述的分泌抗原被胞吞入所述细胞；在所述细胞内加工所述的胞吞抗原；和将所述加工的抗原呈递给细胞表面蛋白，从而引起T-细胞介导的免疫反应。在特定的实施方案中，所述抗原由第一种细胞分泌并由第二种细胞摄入，其中第一种和第二种细胞是抗原呈递细胞。在其它实施方案中，第一种细胞是非抗原呈递细胞而第二种细胞是抗原呈递细胞。
本发明的另一个特定实施方案是一种鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能够激活CD4+辅助T细胞，所述的方法包括下列步骤：将表达载体导入抗原呈递细胞以便产生转导的抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；使所述的转导的抗原呈递细胞与原初T-细胞或致敏的T-细胞接触；和评价是任何的原初T-细胞还是致敏的T细胞在与所述转导的抗原呈递细胞接触时被激活，其中任何所述T-细胞的激活表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段。在特定实施方案中，所述的编码测试多肽的多核苷酸选自由病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组组成的cDNA文库的组。
本发明的另一个实施方案是一种鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能够在体内引起免疫反应，所述的方法包括下列步骤：将表达载体导入抗原呈递细胞以便产生转导的抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；通过非肠道途径给哺乳动物施用所述的转导的抗原呈递细胞；收集来自脾细胞中的T-细胞并与树突细胞一起共培养；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段。在特定的实施方案中，所述的编码测试多肽的多核苷酸是一种分离自肿瘤细胞系的cDNA文库。在特定的实施方案中，所述的编码测试多肽的多核苷酸选自由病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组组成的cDNA文库的组。
本发明的一个特定实施方案是一种鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能够在体内引起免疫反应，所述的方法包括下列步骤：通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；通过非肠道途径给哺乳动物施用所述转导的抗原呈递细胞；收集来自脾细胞中的T-细胞并与树突细胞一起共培养；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段。在特定的实施方案中，所述的编码测试多肽的多核苷酸选自由病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组组成的cDNA文库的组。
本发明的一个特定的实施方案是一种治疗癌症的方法，该方法包括下列步骤：鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体将抗原呈递细胞转导成产生转导的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；且通过非肠道途径给哺乳动物施用抗原呈递细胞，其中用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的另一个特定的实施方案是一种治疗癌症的方法，该方法包括下列步骤：鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体将抗原呈递细胞转导成产生转导的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；且通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体包括至少一种编码测试多肽的多核苷酸和编码细胞结合元件的多核苷酸且用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的另一个特定的实施方案是一种治疗病毒性感染的方法，该方法包括下列步骤：鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体将抗原呈递细胞转导成产生转导的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；且通过非肠道途径给哺乳动物施用抗原呈递细胞，其中用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的另一个实施方案是一种治疗病毒性感染的方法，该方法包括下列步骤：鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体将抗原呈递细胞转导成产生转导的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；且通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体包括至少一种编码测试多肽的多核苷酸和编码细胞结合元件的多核苷酸且用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的另一个实施方案是一种治疗自身免疫病的方法，该方法包括下列步骤：鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体将抗原呈递细胞转导成产生转导的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；且通过非肠道途径给哺乳动物施用抗原呈递细胞，其中用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的一个特定的实施方案是一种治疗自身免疫病的方法，该方法包括下列步骤：鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体将抗原呈递细胞转导成产生转导的抗原呈递细胞的抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；且通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体包括至少一种编码测试多肽的多核苷酸和编码细胞结合元件的多核苷酸且用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
本发明的另一个实施方案是一种生产用于对哺乳动物进行免疫接种的疫苗的方法，该方法包括下列步骤：通过将一种表达载体导入细胞来转导抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述抗原分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生抗原。在特定的实施方案中，在给哺乳动物施用抗原呈递细胞前在体外或体内用所述抗原转导抗原呈递细胞。
本发明的另一个特定的实施方案是一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物共同施用细胞因子表达载体和retrogen表达载体的步骤，其中所述的retrogen表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
本发明的另一个实施方案是一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物共同施用一种表达载体的步骤，其中所述的表达载体包括在一种启动子的转录控制下的编码细胞因子蛋白的多核苷酸序列和编码融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的融合蛋白包括抗原和细胞结合元件。在特定的实施方案中，编码细胞因子蛋白质的多核苷酸序列和编码融合蛋白的多核苷酸序列均在独立的转录控制下，且其中编码细胞因子蛋白的多核苷酸序列和编码融合蛋白的多核苷酸序列以串联方式位于一种表达载体中。
本发明的另一个实施方案是一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物共同施用两种不同的retrogen表达载体的步骤，其中第一种retrogen表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码第一种抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列，而第二种retrogen表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码第二种抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
本发明的另一个特定的实施方案是一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种表达载体的步骤，其中所述的表达载体包括在一种启动子的转录控制下的编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的第一种融合蛋白包括第一种抗原和第一种细胞结合元件且所述的第二种融合蛋白包括第二种抗原和第一种细胞结合元件。在特定的实施方案中，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的细胞结合元件是Fc片段。在其它实施方案中，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的第一种和第二种细胞结合元件是不同的细胞结合元件。另一个实施方案包括编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列均在独立的转录控制下，且其中编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列以串联方式位于一种表达载体中。
本发明的一个特定的实施方案是一种同时诱导CD4+和CD8+T-细胞的方法，该方法包括给予一种融合蛋白的步骤，其中所述的蛋白质包括与细胞结合元件融合的MHC-I和MHC-II表位。
本发明的另一个实施方案是一种生产融合蛋白的方法，该方法包括下列步骤：通过将一种表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生融合蛋白。在特定的实施方案中，在体外用所述融合蛋白转导抗原呈递细胞。
本发明的一个特定的实施方案是一种分泌胞内蛋白的方法，该方法包括下列步骤：将一种表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码胞内蛋白的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生融合蛋白。更具体地说，所述编码胞内蛋白的多核苷酸被截短以便增加分泌功效。
本发明的另一个特定的实施方案是一种分泌膜蛋白的方法，该方法包括下列步骤：将一种表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码膜蛋白的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生融合蛋白。更具体地说，所述编码膜蛋白的多核苷酸被截短或使之发生突变以便增加分泌功效。
附图简述
附图1A和附图1B是表示本发明retrogen策略的示意图。使本发明的retrogen在例如一种肌细胞这样的细胞中产生(附图1A)且然后由抗原呈递细胞吸收(附图1B)。将retrogen在抗原呈递细胞中加工并在其上表达为MHC-I或MHC-II复合物或如附图1A和附图1B中所示呈递给B细胞受体。retrogen的MHC-I呈递导致激活细胞毒性CD8+T-细胞且retrogen的MHC-II呈递导致激活CD4+T-细胞。
附图2A、附图2B和附图2C是一系列表达载体的图解表示。附图2A说明了通过如示意图中所示产生融合基因并将该基因克隆入逆转录病毒载体(LNC-NGFR)或表达载体pRc/CMV而构建的包括HBeAg(分泌性)、HBcAg(胞质)或带有信号序列(分泌性)的Fc片段的载体。附图2B和附图2C说明了构建的其它载体。
附图3是描绘HBe-retrogen表达和分泌的蛋白质印迹影象。用各种表达载体转染COS细胞。然后用抗-IgG或抗-HbeAg抗体沉淀培养基(M)和细胞裂解物(C)并通过SDS-PAGE进行分析。
附图4A、附图4B和附图4C是一系列描绘树突细胞中retrogen转导和表达的示意图。用各种重组逆转录病毒载体转导鼠骨髓细胞；在有GM-CSF、TNF和IL-4存在的情况下使所述细胞发育成树突细胞并用抗-NGFR染色。通过流式细胞测定法测定它们。附图4A表示未转导的树突细胞。附图4B表示转导的树突细胞。附图4C是阴性对照。
附图5A、附图5B、附图5C、附图5D和附图5E是一系列描绘如流式细胞测定法测定的树突细胞上存在的表面标记(MHC-I、MHC-II、共刺激和粘着分子(CD11C、CD54、CD80和CD86))的示意图。附图5A表示存在的CD11C表面标记。附图5B表示存在的CD54表面标记。附图5C表示存在的CD80表面标记。附图5D表示存在的CD86表面标记。且附图5E表示存在的MHC-II。
附图6A和附图6B说明了描绘体外通过retrogen转导的树突细胞激活原初CD4+T-细胞的两种棒形示意图。附图6A表示共培养物中GM-CSF的含量。附图6B表示共培养基中IFN-γ的含量。
附图7A和附图7B说明了MHC-II依赖性活化。附图7A表示来自获自用HBe-retrogen转导并进行了共培养的MHC-II-剔除(KO)或野生型(WT)C57BL/6小鼠的细胞和来自野生型小鼠的原初CD4+T-细胞的细胞因子浓度(IFN-γ)。
附图8表示免疫接种小鼠血清中的抗体反应。
附图9A、附图9B、附图9C、附图9D、附图9E和附图9F表示s-MAGE-3-Fc融合蛋白的构建和表达。附图9A表示重组逆转录病毒载体的图解表示。(S：信号序列；IRES：内部核糖体进入位点序列)。附图9B表示通过用小鼠抗-MAGE-3和抗小鼠IgG HRP缀合物染色的蛋白质印迹分析测定的树突细胞中不同构建体的表达。附图9C表示通过使用Image-Quant软件的PhosphorImager(分子动力学(MolecularDynamics))分析的附图9B的蛋白质印迹的蛋白质带的强度。附图9D、附图9E和附图9F说明了用各构建体转导并对MHC-II(附图9E)(M5/114.15.2)、CD40(附图9D)(HM40-3)和CD86/B7.2(附图9F)(GL1)(PharMingen)染色的转导树突细胞的流式细胞分析。
附图10A、附图10B、附图10C和附图10D表示共培养CD4+T-细胞后体内诱发的培养基中免疫接种了用不同载体转导的树突细胞的小鼠的CD4+Th1反应。附图10A表示IFN-γ的浓度。附图10B表示IL-2的浓度。附图10C表示TNF-α的浓度。附图10D表示IL-4的浓度。
附图11A和附图11B表示在有或没有抗-CD4或抗-CD8抗体存在的情况下分离自与s-MAGE-3-Fc-树突细胞共培养(附图11A)或与HBcAg转导的树突细胞共培养(附图11B)的免疫接种小鼠的s-MAGE-3-Fc-树突细胞的CD4+T-细胞的IFN-γ水平。
附图12A、附图12B、附图12C和附图12D表示分离自收集的小鼠脾细胞的CD4+T-细胞中的细胞因子水平，其中所述的小鼠按1000∶1的比例免疫接种了与分离自相同免疫接种小鼠排空淋巴结(LN)的树突细胞共培养的树突细胞。附图12B表示IL-2的浓度。附图12C表示TNF-α的浓度。附图12D表示IL-4的浓度。
附图13表示从分离自免疫接种小鼠的脾细胞诱发体内细胞毒性反应，其中将所述的小鼠在体外用照射的EL4-MAGE-3细胞重新刺激(E)并与3H-胸苷标记的靶细胞EL4-MAGE-3或EL4-HBcAg(对照)(T)一起共培养。
附图14表示树突细胞免疫接种后6周诱发的抗体反应。
附图15表示通过在有或没有由ELISA测定的抗-CD40L抗体(MR1，PharMingen)存在的情况下测定共培养物中IL-12水平而增强的T-细胞与s-MAGE-3-Fc-树突细胞的相互作用。
附图16A和附图16B表示在皮内接种EL4-MAGE-3肿瘤细胞前通过静脉内注射1×105个用不同构建体转导的树突细胞而免疫接种小鼠的抗肿瘤免疫性。附图16A表示肿瘤的体积。附图16B表示各组中存活小鼠的百分比。
附图17说明了HPV 16E7的带电荷的氨基酸残基，使它们缺失以便稳定蛋白质并有助于分泌。
附图18说明了表达载体的图解表示。在CMV启动子控制下分别将HBe-Fc融合基因、HBcAg(胞质)基因、HBeAg(分泌性)基因或带有信号序列(分泌性)的Fc的cDNA片段克隆入pRc/CMV载体。黑色正方形代表信号序列。
附图19A和附图19B表示HBe-Fc、HBcAg、HBeAg和Fc构建体的表达。附图19A表示如蛋白质印迹分析测定的细胞内表达的不同构建体的表达。附图19B表示通过使用Image-Quant软件的PhosphorImager(分子动力学(Molecular Dynamics))分析的附图19A中蛋白质印迹的蛋白质带的强度。
附图20说明了体内诱发的在用不同质粒或致敏的T细胞进行DNA免疫接种后小鼠的T-细胞反应，其中将所述的小鼠在免疫接种后4周处死。用HBe/cAg重组蛋白将脾细胞重新刺激5天。
附图21A、附图21B、附图21C和附图21D说明了体内诱发的用不同质粒免疫接种并在免疫接种后4周处死的小鼠的CD4+T-细胞反应。附图21A和附图21B表示以一式两份与HBe/cAg脉冲的树突细胞共培养的CD4+T细胞。附图21C和附图21D表示在有或没有抗-CD4+或抗-CD8+抗体存在的情况下来自与HBe/cAg脉冲的树突细胞共培养的HBeFc免疫接种小鼠的CD4+T细胞。在共培养72小时后通过ELISA测定培养基中IFN-γ和IL-2的浓度。
附图22说明了体内诱发的在分离自DNA免疫接种小鼠并在体外用照射的EL4-HBcAg细胞重新刺激5天的脾细胞中的CTL反应。将重新刺激的脾细胞(E)与3H-标记的靶细胞EL4-HbcAg或EL4-MAGE3(对照)(T)一起共培养4小时。
附图23表示抗体反应的诱发。通过ELISA测定DNA免疫接种后4-6周时来自小鼠的HBc/eAg-特异性IgG抗体。
附图24说明了来自树突细胞转移实验中的数据。CD11c+树突细胞分离自免疫接种了DNA疫苗的供体小鼠的脾细胞。将致敏的树突细胞注入同源原初受体侧尾静脉。在过继转移后2-4周进行T-细胞增殖测定试验。
附图25描绘了用于构建鉴定结合在MHC-II上的表位的cDNA文库的逆转录病毒示意图。
附图26描绘了能够引起CD4+辅助T-细胞反应的结合在MHC-II上的表位的鉴定方法的示意图。
详细描述
本领域技术人员显然可以理解可以实施本申请中公开的本发明的各种实施方案并对其进行修改而不会脱离本发明的范围和实质。
本文所用的术语“抗体”指的是能够特异性地结合抗原上的特异性表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以不同形式存在，例如包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1988；Houston等，1988；Bird等，1988)。
将本文所用的术语“抗原”定义为激发免疫反应的分子。这种免疫反应可以包括抗体的产生或特异性免疫感受态细胞的激活或两者兼而有之。抗原可以来源于微生物、蛋白质/抗原的亚单位、杀灭的或失活的完整细胞或裂解物。典型的微生物包括但不限于螺杆菌属、弯曲杆菌属、梭状芽孢杆菌属、白喉棒状杆菌、百日咳博德特氏杆菌、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdofei)、疟原虫属、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒、霍乱弧菌、大肠杆菌、麻疹病毒、轮状病毒、志贺氏菌属、伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)。因此，本领域技术人员认识到实际上包括所有蛋白质或肽类在内的任何大分子可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA，本领域技术人员认识到含有致病基因组或可引起免疫反应的蛋白质的基因或基因片段的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA可使抗原合成。此外，本领域技术人员认识到本发明并不限于应用基因或基因组的完整核酸序列。本身便利的是本发明包括但不限于应用一种以上基因或基因组的部分核酸序列且可以将这些核酸序列按照各种组合进行排列以引起所需的免疫反应。
将本文所用的术语“自身免疫病”定义为因自身免疫反应导致的疾病。自身免疫性是一种对自身抗原不合适且过度的反应。实例包括但不限于艾迪生病、格雷夫斯病、I型糖尿病、多发性硬化、粘液性水肿、恶性贫血、风湿热、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和溃疡性结肠炎。
将本文所用的术语“癌症”定义为一种细胞增殖情况，其唯一的特征-正常控制缺失-导致不加调节的生长、缺乏分化、局部组织侵入和转移。实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌和肺癌。
本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括其任何和全部随后产生的子代。可以理解所有子代因有意或无意突变而不可能相同。
将本文所用的术语“细胞结合元件”定义为能够结合细胞膜上的受体的蛋白质的部分。
将本文所用的术语“DNA”定义为脱氧核糖核酸。
将本文所用的术语“树突细胞”或“DC”定义为来源于骨髓的抗原呈递细胞的一个实例。
将本文所用的术语“表位”定义为可以引发抗体并与抗体反应的抗原分子上的小化学基团。抗原可以带有一个或多个表位。大部分抗原带有许多表位，即它们是多价的。一般来说，表位约为5个氨基酸或糖的大小。本领域技术人员理解分子的总体三维结构而非特定的线性序列是抗原特异性的主要标准。
将本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列通过其启动子驱动的转录和/或翻译。
本文所用的术语“表达载体”指的是含有编码至少部分能够被转录的基因产物的核酸序列的载体。在某些情况中，随后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在其它情况中，例如在产生反义分子或核酶的过程中不翻译这些序列。表达载体可以含有各种控制序列，它们指的是转录和可能翻译特定宿主生物体中可操作地连接的编码序列所必不可少的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可以含有也可产生其它功能的核酸序列且如下文所述。
将本文所用的术语“辅助T-细胞”定义为其基本功能是促进其它B和T淋巴细胞和巨噬细胞的活化和功能的效应T-细胞。
将本文所用的术语“异源”定义为来源于不同物种的DNA或RNA序列或蛋白质。
将本文所用的术语“同源”定义为来源于相同物种的DNA或RNA序列或蛋白质。
将本文所用的术语“宿主细胞”定义为表达异源核酸序列的细胞。
将本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”定义为一类起抗体作用的蛋白质。在该类蛋白质中包括的5个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgB。IgA起初次抗体的作用，这些抗体存在于诸如唾液、眼泪、乳汁、胃肠分泌物和呼吸道和生殖泌尿道的粘液分泌物这样的身体分泌物中。IgG起最常见的循环抗体的作用。IgM是初次应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其它抗体应答中最有效的免疫球蛋白且在防御细菌和病毒中是重要的。IgD是尚未了解抗体功能但可以用作抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在接触过敏原时使介体从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中释放而介导即发型超敏反应的免疫球蛋白。
将本文所用的术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”定义为基因的特定簇，它们中的许多编码在抗原呈递中所涉及的与进化相关的细胞表面蛋白，这些基因属于组织相容性的最重要决定簇。I型MHC或MHC-I主要在将抗原呈递给CD8 T淋巴细胞中起作用。II型MHC或MHC-II主要在将抗原呈递给CD4 T淋巴细胞中起作用。
将本文所用的术语“多核苷酸”定义为一条核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是可以水解成单体“核苷酸”的多核苷酸这样的一般知识。单体核苷酸可以水解成核苷酸。本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域中可得到的任何方法获得的所有核酸序列，所述的方法包括但不限于：重组方法，即使用常规克隆技术和PCRTM从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列等和通过合成方法。此外，本领域技术人员认识到多核苷酸包括通过本领域中众所周知方法得到的多核苷酸的局限突变，包括但不限于核苷酸的突变或核苷突变。
将本文所用的术语“多肽”定义为通常具有确定序列的一条氨基酸残基链。本文所用的术语多肽相互包含术语“肽类”和“蛋白质”。
将本文所用的术语“启动子”定义为由启动多核苷酸序列特异性转录所需的细胞的合成机构或导入的合成机构识别的DNA序列。
本文所用的术语“retrogen”或“retrogen融合蛋白”指的是带有在如本文所述表达和加工时能够引起哺乳动物体内免疫反应的表位的多肽，其中该多肽与细胞结合元件融合。
本文所用的术语“retrogen表达载体”指的是包括至少一种编码信号序列、抗原和细胞结合元件的多肽序列的表达载体。
将本文所用的术语“RNA”定义为核糖核酸。
将本文所用的术语“重组DNA”定义为通过连接不同来源的DNA片段产生的DNA。
将本文所用的术语“重组多肽”定义为通过使用重组DNA方法产生的杂交蛋白。
将本文所用的术语“T-细胞”定义为胸腺衍生的参与各种细胞介导的免疫反应的细胞。
本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是外源核酸转化入或导入宿主细胞的过程。转化的细胞包括原始主体细胞及其子代。
本文所用的术语“在转录控制下”或“可操作地连接的”指的是相对于多核苷酸启动子处于正确的位置和方向上以便控制RNA聚合酶的启动和多核苷酸的表达。
将本文所用的术语“疫苗”定义为用于在给哺乳动物施用所述物质后激发免疫反应且由此产生免疫性的物质。
将本文所用的术语“病毒”定义为由包封在有或没有外层脂被膜的蛋白质外壳中的核酸(RNA或DNA)组成的颗粒，它仅能够在完整细胞内复制和在细胞间扩散。
本发明的一个实施方案是一种表达载体，它包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
在特定的实施方案中，编码融合蛋白(抗原细胞结合元件)的核酸序列处于启动子的转录控制下。大量有关启动子如何组织化的考虑来源于对几种病毒启动子的分析，这些病毒启动子包括那些用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的启动子。由近来更进一步的工作扩充的这些研究已经证实启动子由分立的功能组件构成，它们各自由约7-20bp的DNA组成并含有一个或多个转录激活物或阻抑蛋白的识别位点。
在各启动子中至少一种组件起确定RNA合成的起始位点定位的作用。它的最佳公知实例是TATA盒状室，而在某些启动子中缺乏TATA盒状室，诸如用于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和用于SV40基因的启动子，位于起始位点上面的分立元件本身能够有助于固定起始位置。
其它启动子元件，即增强子，调节转录开始的频率。一般来说，它们位于起始位点上游的30-110bp区，不过，近来已经证实许多启动子还含有起点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，使得当元件彼此相互颠倒或移动时启动子的功能是保守的。在tk启动子中，在活性开始下降前启动子元件之间的间隔可以增加至50bp间距。随着启动子的不同，看起来各个元件可以以共操作的方式起作用或独立地起作用以便激活转录。
启动子可以是一种天然与基因或多核苷酸序列相关联的启动子，它可以通过分离定位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而获得。将这类启动子称作“内源性的”。类似地，增强子可以是一种天然与多核苷酸序列相关联的增强子，它位于所述序列的下游或上游。另一方面，通过在重组或异源启动子控制下给编码多核苷酸区段定位将获得某些优点，所述的编码多核苷酸区段指的是通常不与其天然环境中的多核苷酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子也指通常不与其天然环境中的多核苷酸序列相关联的增强子。这类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子和分离自任何其它原核细胞、病毒细胞或真核细胞的启动子或增强子以及并非“天然存在的”，即含有不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。除了以合成方式产生启动子和增强子的核酸序列外，使用包括PCRTM在内的重组克隆和/或核酸扩增技术与本文公开的组合物(美国专利4,683,202；美国专利5,928,906)也可以产生序列。此外，值得关注的是还可以使用在诸如线粒体、叶绿体等这样的非核细胞器内指导序列转录和/或表达的控制序列。
实际上，重要的是使用有效指导在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体内DNA区段的表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员一般了解如何使用用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型的组合，例如参见Sambrook等(1989)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在指导导入DNA区段的高水平表达的适宜条件下可用的，诸如在大规模生产重组蛋白质和/或肽类中有利的启动子。该启动子可以是异源的或内源的。
本文列举的实验例中典型的启动子序列是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一种能够驱动可操作连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于：猿猴病毒40(SV40)早期启动子；小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子；人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子；莫洛尼氏病毒启动子；鸟白血病病毒启动子；EB病毒立即早期启动子；劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。本发明的诱导型启动子的应用提供了一种能够在需要表达时启动可操作连接的多核苷酸序列表达或在不需表达时中断表达的分子开关。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。此外，本发明包括组织特异性启动子的应用，该启动子仅在所需组织中具有活性。组织特异性启动子在本领域中是众所周知的且包括但不限于HER-2启动子和与PSA相关联的启动子序列。
在本发明的特定实施方案中，所述的表达载体包括编码信号序列的多核苷酸，所述的信号序列指导由此编码的蛋白质的加工进入合适的细胞机构(cellular machinery)以便使蛋白质从所述细胞中分泌。可以使用包括但不限于乙型肝炎病毒E抗原信号序列、免疫球蛋白重链前导序列、细胞因子前导序列等这样的典型信号序列。指导蛋白质从细胞中分泌的任何信号序列基本上适用于本发明的表达载体。除信号序列外，可以使用其它用于分泌的机理，诸如但不限于抑制蛋白质分泌的序列的截短或缺失、抑制蛋白质分泌的序列的点突变和使蛋白质与装配入病毒颗粒的病毒基因连接。
本发明的一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的B细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的CD4+T-细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的CD8+T-细胞反应。
本发明的一个特定实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发导入了所述抗原的哺乳动物体内的B细胞反应、CD4+T-细胞反应和CD8+T-细胞反应。
本发明的另一个实施方案是一种表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于多个表位的多核苷酸序列，其中所述的多个表位诱发导入了所述抗原的哺乳动物体内的B细胞反应、CD4+T-细胞反应和CD8+T-细胞反应。
在本发明的特定实施方案中，所述的表达载体包括编码抗原的多核苷酸序列。所述的编码抗原的多核苷酸序列选自至少一种与疾病相关的多核苷酸序列，其中所述的疾病选自感染性疾病、癌症和自身免疫病组成的组。更具体地说，所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自导致由病毒、细菌、真菌和原生动物组成的感染性疾病的致病微生物的组。这些编码公知蛋白质或其片段的DNA序列包括病毒抗原，诸如但不限于：乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒抗原；人免疫缺陷病毒抗原；包括但不限于gp160、gp120和gag蛋白；乳头瘤病毒抗原，包括但不限于E7和E6蛋白。作为有用的retrogen融合蛋白，疱疹病毒蛋白质诸如例如由EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹1型和2型病毒、人疱疹6、7和8型病毒编码的蛋白质也是本发明所关注的。在其它实施方案中，编码抗原的多核苷酸是一种选自乳腺癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌和前列腺癌组成的组的多核苷酸。此外，所述的蛋白质可以是一种诱导激活针对肿瘤细胞的免疫反应的蛋白质，其目的在于抑制其生长和复制，即激活对黑素瘤中黑素细胞的免疫反应的酪氨酸酶。其它与肿瘤相关的蛋白质包括但不限于MART、trp、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、HER-2、PSA、与肺癌相关的Ras抗原和任何其它肿瘤特异性、组织特异性或与肿瘤相关的抗原。本领域技术人员了解已知编码与肿瘤相关抗原的多核苷酸序列且它们充分公开在科学文献中且正在非常迅速地发现迄今为止未知的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述的编码抗原的多核苷酸序列选自包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病和局限性回肠炎在内的自身免疫病。此外，本发明应包括编码自身抗原的DNA以便诱发在一些情况中的免疫耐受性，其中这类耐受性对哺乳动物可能是有利的。此外，本发明应包括编码能够诱发哺乳动物体内全身性免疫反应的抗原的DNA，其中全身性免疫反应对哺乳动物来说是有利的。全身性免疫反应在哺乳动物是免疫抑制的情况中对哺乳动物有利，即作为HIV感染、化疗或其它免疫抑制过程的结果。这类抗原可以包括但不限于当与抗原呈递细胞上的Fc受体结合时用于通过这些细胞增量调节抗原呈递的Fc抗体片段。此外，可以将诸如但不限于白细胞介素5这样的白细胞介素用于在需要诱发全身性免疫反应的哺乳动物体内产生相似的辅助作用。本发明由此应包括任何已知或迄今为止未知的多核苷酸序列，如果它们包含在本发明的表达载体中，那么当将载体或由此编码的融合蛋白导入哺乳动物时它们能够激活免疫反应。
本领域技术人员认识到核酸序列编码全长蛋白质并非必要。所表达的蛋白质包括在抗原呈递细胞中加工时引起所需免疫反应的表位是完全必要的。因此，由此信息中显然可以看出核酸序列可以编码能引起导入了表达载体的动物体内免疫反应的任何抗原。因此，本发明决不应限定表达载体内包含的核酸序列类型，而应包括通过本领域中可得到的任何方法获得的任何和所有的核酸序列，所述的方法包括但不限于重组方法和通过合成方法，其中所述的重组方法包括不限于使用常规克隆技术和PCRTM从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列的方法。本发明也不应以任何方式限定核酸序列的来源，因为核酸序列可以获自任何可得到的来源。本领域技术人员了解获得核酸序列的方案在本领域中是众所周知的且例如如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1997)所述。
在本发明的特定实施方案中，所述的表达载体进一步包括编码细胞结合元件的多核苷酸序列。所述的细胞结合元件是一种多肽的部分，它有利于使蛋白质与细胞受体结合。可以将编码与细胞受体蛋白结合的任何配体的多核苷酸用于本发明的表达载体中。典型的细胞结合元件包括但不限于：免疫球蛋白Fc片段；毒素受体蛋白细胞结合结构域，诸如例如假单胞菌外毒素结合结构域；细胞因子，例如白细胞介素5和白细胞介素6；任何类型的抗体分子等。本领域技术人员认识到任何的抗体能够结合抗原呈递细胞表面上的细胞表面标记，从而启动抗原/抗体复合物的摄入。因此，可以将抗体或其片段用作启动摄入的细胞结合元件。典型的抗体包括但不应限于抗CDC11、抗CD54、抗CD80和抗CD86。此外，本领域技术人员认识到所述的细胞结合元件可以是同源的或异源的。例如，Fc片段可以是同源的或异源的。因此，本发明不应以任何方式限定所述细胞结合元件的来源，因为用于细胞结合元件的序列可以获自任何可得到的来源，包括但不限于使用常规克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组中克隆DNA的方法和通过合成方法。
除了使用已知结合元件的部分外，本领域技术人员认识到通过本领域中众所周知的典型筛选步骤可以鉴定小肽类。筛选DNA文库(cDNA或基因组)以便鉴定有效地与抗原呈递细胞结合的小肽类。一旦鉴定了这些肽类，则对所述肽测序并用作本发明中的细胞结合元件。
在表达中，一般包括聚腺苷酸化序列以便对转录物进行适当的聚腺苷酸化。并不认为聚腺苷酸化序列的性质对成功实施本发明来说是决定性的和/或可以使用任何这类序列。优选的实施方案包括适宜和/或已知在各种靶细胞中充分起作用的SV40聚腺苷酸化序列、LTR聚腺苷酸化序列和/或牛生长激素聚腺苷酸化序列。作为表达载体的元件另外所关注的是转录终止位点。这些元件能用于提高信息水平和/或使从插入的编码抗原和细胞结合元件的多核苷酸序列到载体的其它序列的连续减少到最低限度。
特异性起始信号也是有效翻译编码序列所需的。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号。本领域技术人员能够便利地测定它并提供必要的信号。众所周知起始密码子必须与所需编码序列读框“符合”以便确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可以提高表达的效率。
为了使载体在宿主细胞中增殖，它可以含有一个或多个复制起点(通常称作“ori”)，它是在该位点上开始复制的特异性核酸序列。另一方面，如果宿主细胞是酵母，那么可以使用自主复制序列(ARS)。在表达载体在细胞内复制是有利的情况中，载体可以通过整合序列整合入细胞的基因组，所述的整合序列即逆转录病毒长末端重复序列(LTRs)、腺伴随病毒的ITR序列，它们存在于所述载体中；或另一方面，所述载体自身可以含有DNA复制起点和其它有利于载体在细胞内复制的序列，同时该载体维持附加型。例如，表达载体可以任选地包括EB病毒(EBV)的DNA复制起点和编码EBV EBNA-1蛋白的序列以便载体的附加型复制在导入了该载体的细胞中得到促进。例如，带有EBV起点和核心抗原EBVA-1编码的DNA构建体能够在哺乳动物细胞内复制到高拷贝数并且例如商购自Invitrogen(San Diego，CA)。
重要的是应注意在本发明中，为适宜的蛋白质表达而将所述表达载体整合入宿主细胞的基因组并不是必要的。相反，所述的表达载体还可以以附加型分子形式存在于所需细胞中。例如，存在某些细胞类型，其中表达载体复制以便表达所需蛋白质并不是必要的。这些细胞是那些诸如肌细胞这样通常不复制且仍然完全能够进行基因表达的细胞。可以将表达载体导入非分化细胞非在没有表达载体复制的情况下表达由此编码的蛋白质。
为了鉴定含有本发明核酸构建体的细胞，在体外或体内通过使标记包含在表达载体中来鉴定所述细胞。这类标记为细胞提供了可鉴定的改变，从而可以便利地鉴定含有所述表达载体的细胞。一般来说，选择标记是一种提供选择特性的标记。正选择标记是一种在有标记存在的情况下使其进行选择的标记，而负选择标记是一种其存在可防止其进行选择的标记。正选择标记的实例是药物抗性标记。
通常包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如产生新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择标记。除了产生鉴别基于实施条件的转化体的表型的标记外，还关注包括诸如GFP这样的筛选性标记在内的其它类型的标记，其基础是比色分析。另一方面，可以使用诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)这样的筛选性酶。本领域技术人员还了解如何将免疫性标记与FACS分析结合使用。例如，在表达载体中包含NGFR(神经生长因子受体)是为了有利于通过使用流式细胞测定法筛选包括所述载体的细胞，从而检测该细胞表面上的NGFR表达。并不认为所用的标记是重要的，条件是它能够与编码基因产物的核酸一起同时被表达。选择和筛选性标记的其它实例对本领域技术人员来说是众所周知的。
所述的表达载体还可以包括原核细胞的DNA复制起点和编码用于选择包括所述表达载体的原核细胞的检测标记的基因，例如一种抗生素抗性基因，诸如例如氨苄西林抗性基因。
此外，可以将所述的表达载体以RNA而不是DNA的形式提供给细胞。载体的核心成分与本文所述的用于DNA载体的那些成分相同且另外可以添加用于使体液中和组织和细胞中的RNA保持稳定的其它成分。
将本文所述的各种成分彼此连接以产生本发明的表达载体的实际方法在本领域中是众所周知的且例如如Sambrook等(1989)、Ausubel等(1994)和Gerhardt等(1994)所描述。
在特定的实施方案中，所述的表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物载体组成的组。存在包括上述组成中至少一部分或全部的大量表达载体系统。可以将以原核生物和/或真核生物载体为基础的系统用于本发明以便产生核酸序列、或其关连多肽类、蛋白质类和肽类。许多这类系统是商购的和可广泛得到的。
昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生异源核酸片段的高水平蛋白质表达，诸如它们描述在美国专利号5,871,986、4,879,236中；且例如这些系统可以在下列商品名下购买：来自INVITROGEN的MAXBAC2.0和来自CLONTECH的BACPACKTMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM。
表达载体系统的其它实例包括STRATAGENE的包括合成蜕皮激素诱导型受体的COMPLETE CONTROLTM诱导型哺乳动物表达系统或其pET表达系统，即一种大肠杆菌表达系统。另一种诱导型表达系统的实例商购自INVITROGEN，它携带T-REXTM(四环素调节的表达)系统，即一种使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。INVITROGEN还提供了一种称作甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达系统的酵母表达系统，设计它是为了在甲基营养酵母甲醇毕赤酵母中产生高含量的重组蛋白。本领域技术人员了解如何表达诸如表达构建体这样的载体以便产生核酸序列或其关连多肽、蛋白质或肽。
通过将表达载体导入细胞而产生包括表达载体的转化细胞。将DNA导入细胞或宿主细胞是分子生物学领域中众所周知的技术且例如如Sambrook等(1989)、Ausubel等(1994)和Gerhardt等(1994)所描述。细胞的转染方法包括磷酸钙沉淀法、脂质体介导的转染法、DEAE葡聚糖介导的转染法、电穿孔等。另一方面，可以使用参考文献和其中提供的实施例中所述的常规技术用本发明的retrogen表达载体简单转导细胞。宿主细胞包括原核细胞或真核细胞且它包括能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的任何可转化的生物体。可以并且已经将宿主细胞用作载体的受体。宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物，这取决于所需的结果是载体的复制还是载体编码的核酸序列的部分或全部的表达。可以得到用作宿主细胞的大量细胞系和培养物且它们可以通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，ATCC是一个作为活的培养物和遗传材料的存档的组织(www.atcc.org)。它在本领域中是众所周知的且本领域技术人员可确定合适的宿主。一般来说，这要以载体主链和所需结果为基础。例如，可以将质粒或粘粒导入原核生物的宿主细胞以用于许多载体的复制。用作载体复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8以及许多诸如SURE感受态细胞和SOLOPACKTM金细胞(STRATAGENE，La Jolla，CA)这样的商购细菌宿主细胞。另一方面，可以将诸如大肠杆菌LE392这样的细菌细胞用作噬菌体病毒的宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于酵母、昆虫和哺乳动物。复制和/或表达载体用的哺乳动物真核宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。酵母菌株的实例包括但不限于YPH499、YPH500和YPH501。来自各种细胞类型和生物体的许多宿主细胞是可得到的且它们对本领域技术人员来说是公知的。类似地，可以将病毒载体与真核或原核宿主细胞，特别是一种允许复制或表达载体的宿主细胞结合使用。
此外，可以以病毒载体形式将所述的表达载体提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的且例如如Sambrook等(1989)、Ausubel等(1994)和Gerhardt等(1994)以及其它病毒学和分子生物学指南中所描述。用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒属。
某些载体可以使用允许在原核细胞和真核细胞中复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将会进一步认识到培养所述的所有宿主细胞以维持它们并允许复制载体的条件。大规模生产载体以及生产由载体编码的核酸及其关连多肽类、蛋白质类或肽类的技术和条件也是可以理解的和公知的。
本发明的一个特定实施方案是一种包括信号序列和抗原和细胞结合元件的融合蛋白。本发明还包括retrogen蛋白或融合蛋白作为疫苗的应用。可以通过在包括表达载体的任何细胞内表达retrogen蛋白并从细胞、细胞碎片和细胞培养基中分离retrogen蛋白而获得retrogen蛋白。特别可以将亲和柱纯化方法用于纯化本发明的retrogen，因为根据定义retrogen包括细胞结合元件。可以将包括配对细胞受体或诸如蛋白质A或蛋白质G这样的通用蛋白质的亲和柱用于从细胞成分中分离retrogen。另一个实施方案是一种包括在体外用所述融合蛋白转导的抗原呈递细胞的疫苗。
在其它实施方案中，疫苗包括所述的表达载体，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的编码启动子序列的多核苷酸、编码分泌信号序列的多核苷酸序列、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和编码聚腺苷酸化序列的多核苷酸。可以将包括所述表达载体的所述疫苗直接对哺乳动物的部位给药，在这些部位中存在可以向其中导入在该载体内所包含的所述序列、表达和可能引起针对所需蛋白质的免疫反应的细胞。在这种情况中，以在一种药物载体中和制剂形式给予所述的表达载体，使得DNA能够进入细胞并在其中被表达。然后所表达的蛋白质可以进入抗原呈递细胞以用于本文所述的加工和MHC呈递。本领域技术人员认识到可以以各种方式给予DNA且随注射途径的不同可能需要操作DNA的组合物。非肠道注射的典型途径包括但不限于肌内、腹膜内、静脉内、皮下和皮内。此外，通过将表达载体的DNA直接注入哺乳动物的组织而将表达载体的DNA导入哺乳动物细胞并不是必要的。相反，可以使用将所述表达载体导入哺乳动物的其它方式，包括但不限于非侵入性压力注射、鼻内、口服等。
导入哺乳动物的DNA的量是足以在细胞中有效表达DNA的量，使得足够量的蛋白质被表达并从其中分泌，然后该蛋白质被抗原呈递细胞吸收并在其上表达为MHC复合物。本文将这样的DNA量称作DNA的“治疗量”。构成治疗量的DNA的精确浓度可以由将这类化合物给予哺乳动物的本领域技术人员便利地确定且当然会随其中包含的成分和包括但不限于导入了DNA的组织和哺乳动物的年龄和健康情况在内的其它因素而改变。
本发明的另一个特定的实施方案是一种包括用所述表达载体转导的细胞的疫苗。将这些转导的细胞以药物组合物的形式给予哺乳动物，目的在于在其中引起免疫反应。细胞中retrogen蛋白质的表达使retrogen蛋白从细胞中分泌。然后分泌的retrogen蛋白可以被哺乳动物体内的抗原呈递细胞吸收以用于在其中加工和由此表达为MHC-I或MHC-II复合物。当真核细胞是抗原呈递细胞时，retrogen蛋白可以在其中表达、从其中分泌并可以重新进入细胞以便加工和抗原的MHC呈递。当真核细胞不是抗原呈递细胞时，细胞表达和分泌retrogen蛋白，随后它被抗原呈递细胞吸收以用于抗原的MHC呈递。用于本发明的非抗原呈递细胞包括不能加工MHC呈递用抗原的任何细胞，即肌细胞。抗原呈递细胞包括树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞等。另外包括的肿瘤细胞可以是能够或不能加工MHC呈递用抗原的细胞。
还可以将所述的表达载体导入哺乳动物的干细胞，可以直接在体内导入哺乳动物或更优选在体外导入从哺乳动物中分离并在将载体导入细胞后重新导入哺乳动物的细胞。还可以按照体外手段将表达载体导入哺乳动物中的其它细胞。当将载体导入哺乳动物的细胞时，所述载体立即表达由此编码的蛋白质并不是必要的，因为更为需要的可能是在稍后的时间时在细胞中表达蛋白质。在这种情况中，所述的表达载体优选包括诱导型启动子，它在将合适的诱导物给予哺乳动物或哺乳动物细胞时被激活。体外技术在本领域中是众所周知的且例如在美国专利号5,399,346中描述。
另一个实施方案是一种至少包括编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸和编码细胞结合结构域的多核苷酸的表达载体。
本发明的另一个实施方案是一种引起针对抗原的免疫反应的方法。更具体地说，该方法使用本发明的表达载体操纵细胞以便产生内源性抗原，如同它们是外源性抗原。这种新型抗原呈递策略包括用新型重组表达载体转导细胞以便产生和分泌由抗原和细胞结合元件组成的融合蛋白。分泌的融合蛋白通过受体介导的胞吞作用被胞吞入或“以逆向方式”被转运入抗原呈递细胞(Daeron，1997；Serre等，1998；Ravetch等，1993)。作为结果，尽管已经以内源方式产生，但是在本公开说明书中所称的融合蛋白或“retrogen”因其分泌后的逆向转运而在附加型途径中被加工并作为结合在MHC-II上的外源性抗原片段在抗原呈递细胞的细胞表面上被呈递。抗原呈递细胞表面上的抗原的MHC-II结合的抗原片段激活CD4+T-细胞，该细胞随后刺激CD8+T-细胞和巨噬细胞以及B-细胞，从而诱发细胞和体液免疫。
在本发明中还发现也可以在融合蛋白的合成、分泌和胞吞过程中的胞质途径内加工retrogen蛋白且它与抗原呈递细胞表面上的MHC-I相关联，从而直接激活CD8+T-细胞。在本领域中和例如由Kovacsovics-Bankowski等在1995年描述了通过摄入的抗原激活CD8+T-细胞。此外，如上所述和另外在本文中更详细地描述的，通过分泌的retrogen可以激活B细胞。因此，B细胞的激活在本系统中明显被增强，因为CD4+细胞也激活B细胞。因此，这种策略使用一致的机理来激活免疫系统中所有的分支。
在特定的实施方案中，将表达载体导入细胞以便产生转导的细胞。在细胞中表达retrogen蛋白导致retrogen蛋白从细胞中分泌。然后分泌的retrogen蛋白被哺乳动物体内的抗原呈递细胞吸收以用于在其中加工和由此表达为MHC-I或MHC-II复合物。因此，本领域技术人员认识到转导的细胞或第一种细胞分泌抗原且分泌的抗原被摄入细胞，即属于相同或不同细胞的第二种细胞。当真核细胞是抗原呈递细胞时，retrogen蛋白可以在其中表达、从其中分泌并可以重新进入细胞以便加工和抗原的MHC呈递。当真核细胞不是抗原呈递细胞时，细胞表达和分泌retrogen蛋白，随后它被抗原呈递细胞吸收以用于抗原的MHC呈递。用于本发明的非抗原呈递细胞包括不能加工MHC呈递用抗原的任何细胞，即肌细胞。抗原呈递细胞包括树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞等。另外包括的肿瘤细胞可以是能够或不能加工MHC呈递用抗原的细胞。
本发明的另一个实施方案是一种引起针对抗原的免疫反应的方法，该方法包括直接给哺乳动物施用所述表达载体的步骤。
本发明还包括一种筛选或鉴定多核苷酸序列的方法，所述的多核苷酸序列编码至少一种能够引起哺乳动物体内免疫反应的结合在MHC-II上的表位。优选所鉴定的多肽是一种引起有利于哺乳动物的免疫反应的多肽。该方法包括获得分离的DNA分子群体并筛选那些分离的DNA分子的步骤，这些DNA分子编码至少一种能够激活CD4+辅助T-细胞的结合在MHC-II上的表位。DNA分子在本文中称作“测试DNA”或“测试多核苷酸序列”。将测试多核苷酸序列克隆入本发明的表达载体，在该载体中它位于例如附图25中所述的信号序列与细胞结合元件之间。在该方法中，通过将包括测试多核苷酸序列的载体导入抗原呈递细胞来转导抗原呈递细胞、使转导的抗原呈递细胞与原初T-细胞或致敏T-细胞接触且通过评价是任何原初T-细胞还是致敏T-细胞在与所述转导的抗原呈递细胞接触时被激活来评估转导的细胞在体外对原初CD4+T-细胞的能力。转导的抗原呈递细胞对T细胞的激活表示其中包含的测试多核苷酸序列是编码至少一种能够激活CD4+辅助T-细胞以引起哺乳动物体内免疫反应的表位的多核苷酸序列、基因或其片段。在本测定试验中可以使用的合适的对照品包括用包括已知不会激活哺乳动物体内免疫反应的分离的多核苷酸序列的表达载体转导的细胞(阴性对照)和用包括已知激活哺乳动物体内免疫反应的分离的多核苷酸序列的表达载体转导的细胞(阳性对照)。本领域技术人员认识到可以将这种筛选过程用于筛选人基因组以便鉴定编码蛋白质或表位的基因，所述的蛋白质或表位由可用于癌症或自身免疫病的免疫疗法或用于基因疗法的CD4+T-细胞识别。此外，可以筛选包括细菌、病毒或寄生虫的基因组在内的其它基因组。
这种T-细胞的体外激活测定试验可以适合于高流通量自动测定试验以便有利于同时检测许多不同的测试多核苷酸序列。本领域技术人员认识到可以操作本发明以便用含有各种可能表位序列的表达载体转导细胞。可以将转导的细胞置于含有原初T-细胞的96孔平板内并可以通过掺入T-细胞的DNA中的放射性的自动评价、使用临床免疫学中便于获得的技术来评估T-细胞的激活情况。
在其它实施方案中，可以进一步评价由测试多核苷酸序列编码的蛋白质产物以便体内评估哺乳动物中的免疫反应的激活。除了将通过导入包括测试多核苷酸序列的表达载体转导的转导抗原呈递细胞经非肠道途径给予哺乳动物外，本测定试验与体外测定试验相同。在特定的实施方案中，直接将包括测试多核苷酸序列的表达载体给予哺乳动物。从脾细胞中收集T-细胞并与树突细胞一起共培养。评价T-细胞的激活情况以便测定编码测试多肽的测试多核苷酸是否能够激活CD4+辅助T-细胞。此外，本领域技术人员认识到可以将这种筛选过程用于鉴定可用于治疗癌症、病毒性感染和自身免疫病的结合在MHC-II上的表位。
如本文所述，可以通过在分子生物学领域中常用的任何普通方法获得所述的测试多核苷酸序列。例如，测试多核苷酸序列可以获自表达文库，该文库可以表达其功能未知的蛋白质。测试多核苷酸序列还可以获自表达已知功能但迄今为止尚未得知具有激活哺乳动物体内免疫系统的特性的蛋白质的表达文库。典型的表达cDNA文库包括但不限于肿瘤细胞、病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组。还可以使用组合的方法获得测试多核苷酸序列，其中最初尚不了解所述的多核苷酸序列是否编码蛋白质；且此外尚不了解所述的多核苷酸序列是否编码能够激活免疫反应的蛋白质。也可以通过合成方法获得测试多核苷酸序列，其中在自动合成仪中合成多核苷酸序列，将不连续长度的片段克隆入所述的表达载体并如本文所述进行测试。
并不始终必要的是免疫反应是保护性的，但仅仅是对宿主哺乳动物有利。例如，对哺乳动物可能有利的是在对抗原的免疫反应对哺乳动物有害的情况中诱发免疫耐受性，例如在诸如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化和局限性回肠炎等这样的某些自身免疫病中，可以通过诱发针对攻击抗原的免疫耐受性而获得的免疫反应的减少是需要的。在这种情况中，DNA包括编码攻击抗原的DNA，然后所述的攻击抗原在哺乳动物细胞中被表达且随后在抗原呈递细胞中被加工以便在其表面上被表达为MHC-I和/或MHC-II复合物，从而在哺乳动物体内诱发对所述抗原的免疫耐受性。
在另外的实施方案中，将所鉴定的多核苷酸序列用作治疗癌症、病毒性感染或自身免疫病的方法。更具体地说，将所鉴定的编码测试多肽的多核苷酸转导入抗原呈递细胞并通过非肠道途径将转导的抗原呈递细胞直接给予哺乳动物以便治疗癌症、病毒性感染或自身免疫病。此外，通过非肠道途径将至少含有编码测试多肽和细胞结合元件的多核苷酸的表达载体直接给予哺乳动物以便治疗癌症、病毒性感染或自身免疫病。
本发明的另一个实施方案是一种生产对哺乳动物进行免疫接种的疫苗的方法，该方法包括下列步骤：通过将本发明的表达载体导入细胞并表达所述载体以便在所述抗原分泌自所述细胞的条件下产生抗原来转导抗原呈递细胞。在特定的实施方案中，在将抗原呈递细胞给予哺乳动物前用所述抗原在体外或离体转导抗原呈递细胞。可以通过非肠道方式给予本发明的所有疫苗。
在特定的实施方案中，诱发免疫反应的方法包括将表达载体和细胞因子表达载体共同给予生物体的步骤。大量研究已经证实通过共同给予细胞因子表达质粒可以提高对各个质粒的反应。应注意从表达载体局部合成的细胞因子的皮克至纳克量过低以致于不能对哺乳动物整体产生系统性作用，但仍然可以强烈地影响局部细胞因子环境和由此影响对给予的抗原的免疫反应。细胞因子的实例包括但不限于GM-CSF和IL-2。本领域技术人员认识到可以将用于细胞因子的多核苷酸序列和用于抗原的多核苷酸序列混入一种表达载体，由此消除使用两种独立的载体。除了细胞因子外，含有未甲基化的CpG序列的质粒提高细胞介导(Th1)的反应(Carson等，1997)。CpG序列基元包括但不限于RRCpGYY。因此，本领域技术人员认识到在本发明中用表达载体补充细胞因子或添加CpG序列基元导致免疫反应的增强。
在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件用于生成多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点上启动翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自细小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)和来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源可读框连接。可以一起转录多个可读框；通过IRES将它们各自分离，从而生成多顺反子信息。各可读框通过IRES元件接近用于有效翻译的核糖体。可以使用单一启动子/增强子有效表达多个核酸序列以便转录单个信息(美国专利5,925,565和5,935,819)。此外，本领域技术人员认识到不必使用基因的整个核酸序列。代之以可以将结合在MHCI型和II型上的表位的部分核酸序列彼此融合，从而产生由一种启动子转录的嵌合融合基因。例如，本发明的一个特定实施方案是一种同时诱导CD4+和CD8+T-细胞的方法，该方法包括给予一种融合蛋白的步骤，其中所述的蛋白质包括与细胞结合元件融合的MHC-I和MHC-II表位。因此，本领域技术人员认识到多个抗原序列的应用使得通过给予一种疫苗治疗各种疾病成为可能。
本发明的另一个特定的实施方案是一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种表达载体的步骤，其中所述的载体包括在一种启动子的转录控制下的编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的第一种融合蛋白包括第一种信号序列、第一种抗原和第一种细胞结合元件且所述的第二种融合蛋白包括第二种信号序列、第二种抗原和第一种细胞结合元件。在特定的实施方案中，第一种和第二种信号序列是相同的信号序列，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的细胞结合元件是Fc片段。在其它实施方案中，第一种和第二种信号序列是相同的、第一种和第二种抗原是不同的抗原且第一种和第二种细胞结合元件是相同的细胞结合元件。其它实施方案包括：第一种和第二种信号序列是不同的、第一种和第二种抗原是不同的抗原且第一种和第二中细胞结合元件是相同的细胞结合元件或第一种和第二种信号序列是相同的、第一种和第二种抗原是不同的抗原且第一种和第二种细胞结合元件是不同的细胞结合元件。另一个实施方案包括编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列均在独立的转录控制下，且其中编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列以串联方式位于一种表达载体中。
本领域技术人员认识到可以将多个核酸序列以串联方式克隆入所述载体，使得各核酸序列是一个独立的整体。各整体含有驱动各个核酸序列表达的启动子，从而由一种载体表达独立的抗原。这项技术使用用于转录各个信息的多个启动子有效地表达了核酸序列。
本发明的另一个实施方案是一种生产融合蛋白的方法，该方法包括将本发明的表达载体导入细胞并表达所述载体以便在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下产生融合蛋白的步骤。在特定的实施方案中，在体外用融合蛋白转导抗原呈递细胞。更具体地说，将所述的融合蛋白通过非肠道方式给予哺乳动物。
本发明的一个特定的实施方案是一种分泌胞内蛋白的方法，该方法包括将表达载体导入细胞并表达所述载体以便在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下产生融合蛋白的步骤，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码胞内蛋白的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。更具体地说，将编码胞内蛋白的多核苷酸序列截短或使之发生突变以便提高分泌的效率。在特定的实施方案种，所述的胞内蛋白是HPV16 E7。
本发明的另一个特定的实施方案是一种分泌膜蛋白的方法，该方法包括将表达载体导入细胞并表达所述载体以便在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下产生融合蛋白的步骤，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码膜蛋白的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。更具体地说，将编码膜蛋白的多核苷酸序列截短或使之发生突变以便提高分泌的效率。在特定的实施方案中，所述的膜蛋白是EBV核心抗原1。
本发明还包括一种试剂盒，它包括本发明的组合物和描述通过外膜给哺乳动物的细胞或组织施用该组合物的说明书。在另一个实施方案中，该试剂盒包括适合于在将本发明的化合物给予哺乳动物前溶解或悬浮所述组合物的溶剂(优选无菌的)。
剂量和制剂
可以配制并给予本发明的表达载体、转导的细胞和融合蛋白(活性组分)以便通过使所述活性组分与生物体内活性剂的作用部位接触的任何方式治疗各种疾病状态。可以将它们与作为各个治疗活性组分或与治疗活性组分的组合的药物一起通过可得到的任何常规方法来给药。可以单独给予它们，不过，一般将它们与以选择的给药途径和标准药物操作为基础选择的药物载体一起给药。
可以以诸如胶囊剂、片剂和粉剂这样的固体剂型或诸如酏剂、糖浆剂、乳剂和混悬剂这样的液体剂型通过口服方式给予所述的活性组分。还可以将所述的活性组分配制成通过注射、快速输注、鼻咽吸入或皮肤吸收的非肠道给药的剂型。可以通过肌内、静脉内或作为栓剂给予所述的活性剂。
胶囊含有活性组分和诸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等这样的粉状载体。可以使用类似的稀释剂以便制成压制片剂。可以将片剂和胶囊剂制备成缓释产品以便在数小时的期限内使药物连续释放。可以给压制片剂包糖衣或包薄膜衣以便掩盖任何不令人满意的味道并防止片剂接触空气或可以将压制片剂包肠溶衣以便在胃肠道内选择性地崩解。
用于口服给药的液体剂型可以含有着色剂和调味剂以便增加患者的可接受性。
一般来说，水、合适的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液和相关的糖溶液以及诸如丙二醇或聚乙二醇这样的二醇类是合适的非肠道用溶液的载体。非肠道给药用溶液含有活性组分、合适的稳定剂且如果必要含有缓冲物质。单独或组合使用的诸如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸这样的抗氧化剂是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外，非肠道用溶液可以含有诸如苯扎氯胺、羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸丙酯和氯代丁醇这样的防腐剂。合适的药物载体描述在《Remington氏药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中，在本领域种它是一本标准的参考书。
可以将本发明的活性组分配制成可将其悬浮在适用于哺乳动物且特别是人的药物上可接受的组合物中的形式。这类制剂包括应用诸如胞壁酰二肽衍生物(MDP)这样的佐剂或描述在美国专利号4,082,735、4,082,736、4,101,536、4,185,089、4,235,771和4,406,890中所述的类似物。可利用的其它佐剂包括矾(Pierce Chemical Co.)、脂A、海藻糖二霉菌酸酯和二甲基二辛酸十八烷溴化铵(DDA)、弗氏佐剂和IL-12。其它成分可以包括聚氧化丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(Pluronic)、非离子型表面活性剂和诸如角鲨烯这样的产生代谢变化的油(美国专利4,606,918)。
另外，可以将标准制药方法用于控制作用期限。它们在本领域中众所周知的且包括控释制剂且可以包括例如聚合物、聚酯类、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白这样的合适大分子。可以调节大分子的浓度和导入的方法以便控制释放。另外，可以将所述的试剂混入诸如聚酯类、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物这样的聚合物颗粒中。除混入外，还可以将这些试剂用于捕集微囊中的化合物。
用于给予本发明化合物的有用的药物剂型如下所述。
胶囊剂：通过给两段硬胶囊各填充100毫克粉状活性组分、175毫克乳糖、24毫克滑石和6毫克硬脂酸镁的装填物来制备胶囊剂。
软胶囊：制备活性组分溶于大豆油中的混合物并用正位移泵将其注入胶囊以便形成含有100毫克活性组分的软胶囊。然后洗涤并干燥该胶囊。
片剂：通过常规方法制备片剂，使得剂量单位为100毫克活性组分、0.2毫克胶体二氧化硅、5毫克硬脂酸镁、275毫克微晶纤维素、11毫克玉米淀粉和98.8毫克乳糖。可以将合适的包衣材料用于增加可口性或用于延缓吸收。
可注射的剂型：通过在10％(体积)的丙二醇和水中搅拌1.5％(重量)的活性组分来制备适合于经注射给药的非肠道用组合物。用氯化钠将该溶液制成等渗溶液并灭菌。
混悬剂：制备用于口服给药的水混悬剂，使得每5毫升含有100毫克精细分散的活性组分、200毫克羧甲基纤维素钠、5毫克苯甲酸钠、1.0克的山梨醇溶液U.S.P.和0.025毫升香草醛。
因此，可以通过各种途径输送本发明的药物组合物并输送至哺乳动物体内的不同部位以获得特定的作用(例如，参见Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1991a；Jaffe等，参见上文；Berkner，参见上文)。本领域技术人员会认识到：尽管可以使用一种以上的给药途径，但是特定的途径可以比另一种途径产生更为迅速和更为有效的反应。通过包括将所述制剂施用于体腔或滴注入体腔、吸入或吹入气溶胶在内的给药或通过包括肌内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部给药在内的非肠道导入可以完成局部或全身输送。
可以将本发明的活性组分制成单位剂型，其中例如茶匙、片剂、溶液或栓剂这样的各剂量单位含有预定量的组合物，可以单独含有或以与其它活性剂联用的方式含有它们。本文所用的术语“单位剂型”指的是适合作为人和哺乳动物受治疗者的单位剂量的物理分散单位，各单位含有预定量的以单独或以与其它活性剂联用形式的本发明组合物，所述的量按照足以产生所需作用的量来计算，如果合适，该组合物中还含有药物上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，本发明对单位剂型的说明取决于所实现的特定作用和与特定宿主中的药物组合物相关的药效学。
本文所述的这些方法决非包含了全部方法，而其它方法也适合于特定的应用，这对本领域技术人员来说是显而易见的。此外，通过与已知发挥所需作用的化合物类似可以进一步近似得到所述组合物的有效量。液体制剂和/或毫微型胶囊
在某些实施方案中，为了将表达载体导入宿主细胞，关注的是液体制剂和/或毫微型胶囊的应用。
毫微型胶囊一般以稳定和/或可再现的方式捕集化合物。为了避免以胞内聚合物过载导致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物设计这类超微粒(大小在0.1μm左右)。所关注的是用于本发明的满足这些要求的可降解的聚烷基氰基丙烯酸酯毫微型颗粒和/或易于制备这类颗粒。
在本发明的一个特定的实施方案中，所述的表达载体可以与脂类结合。可以使与脂类结合的表达载体包囊在脂质体的水层内、散布在脂质体的脂双层内、通过与脂质体和寡核苷酸连接的连接分子与脂质体结合、在脂质体中捕集、与脂质体复合、分散在含有脂类的溶液中、与脂类混合、与脂类合并、作为混悬液包含在脂类中、包含在胶束内或与胶束复合否则与脂类结合。与脂类或脂类/表达载体结合的本发明组合物并不限于溶液形式的任何特定结构。例如，它们可以作为胶束存在于双层结构中或具有“可收缩的”结构。还可以简单地使它们散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集物。
脂类是可以属于天然存在或合成的脂类的脂肪物质。例如，脂类包括在细胞质中天然存在的脂滴以及本领域中众所周知含有长链脂族烃类及其衍生物类型的化合物，诸如脂肪酸类、醇类、胺类、氨基醇类和醛类。
可以将磷脂类用于制备本发明的脂质体且它们可以携带净正电荷、负电荷或呈电中性。可以将磷酸二乙酰酯用于提供脂质体上的负电荷并可以将硬脂酰胺用于提供脂质体上的正电荷。该脂质体可以由一种或多种磷脂类制成。
呈电中性的脂类可以包括不带电荷的脂类、基本上不带电荷的脂类或带有相同数量的正电荷和负电荷的脂类混合物。合适的磷脂类包括磷脂酰胆碱类和其它本领域技术人员众所周知的磷脂类。
适用于本发明的脂类可以获自商品来源。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自Sigma Chemical Co.；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)获自K & K Laboratories(Plainview，NY)；胆固醇(“Chol”)获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂类可以获自Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL.)。可以将脂类的氯仿或氯仿/甲醇储备溶液储存在约-20℃下。优选将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更易于蒸发。
来自诸如卵或大豆磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心磷脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺这样天然来源的磷脂类并不优选作为主要磷脂即构成50％或50％以上总磷脂组合物的磷脂，这是由于所得脂质体的不稳定性和渗漏程度所造成的。
“脂质体”是一种包括通过产生包封的脂双层或聚集物而形成的各种单层和多层脂小泡的通用术语。脂质体的特征在于具有带有磷脂双层膜的囊状结构和内部水介质。多层脂质体具有通过水介质隔离的多脂层。它们在磷脂类悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂成分在形成封闭结构前进行自身重排并捕集脂双层之间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。然而，本发明还包括在溶液中具有不同结构而非正常囊状结构的组合物。例如，可以推定脂类是一种微团结构或仅作为不均匀的脂类分子聚集物存在。还关注lipofectamine-核酸复合物。
磷脂类在分散在水中时可以形成非脂质体的各种结构，这取决于脂类与水的摩尔比。在低比例下脂质体是优选的结构。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和/或存在的二价阳离子。脂质体可以表现出对离子和/或极性物质的低渗透性，而在升温下发生显著改变其渗透性的相变。相变包括从称作凝胶态的稠密填充的有序结构改变成称作液态的疏松填充的无序结构。这种情况在特征相变温度下发生和/或导致对离子、糖类和/或药物的渗透性增加。
脂质体通过4种不同的机理与细胞发生相互作用：通过诸如巨噬细胞和/或中性粒细胞这样的网状内皮系统的吞噬细胞的胞吞作用；通过非特异性弱疏水作用和/或静电力和/或通过与细胞表面成分的特异性相互作用吸附在细胞表面；通过将脂质体的脂双层插入质膜而与浆细胞融合，同时将脂质体内含物释放入细胞质；和/或通过将脂质体脂类转入细胞和/或亚细胞膜和/或反之亦然，但不结合脂质体内含物。改变脂质体制剂可以改变操作机理，不过，可以同时实施一种以上的机理。
已经在体外极为成功地进行了脂质体介导的寡核苷酸转运和外源DNA的表达。Wong等(1980)证实了在培养的鸡胚胎、HeLa和肝细胞瘤细胞中进行脂质体介导的转运和外源DNA的表达的可行性。Nicolau等(1987)成功地完成了静脉注射后大鼠体内脂质体介导的基因转移。
在本发明的某些实施方案中，可以将脂类与血凝病毒(HVJ)结合。已经证实了这种情况，从而有利于与细胞膜的融合和促进细胞进入脂质体包裹的DNA(Kandeda等，1989)。在其它实施方案中，脂类可以与核非组蛋白染色体蛋白质(HMG-1)复合或与之一起使用(Kato等，1991)。在其它实施方案中，脂类可以与HVJ和HMG-1复合或与之一起使用。即已经成功地将这类表达载体用于在体外和体内转移和表达寡核苷酸，然后它们可应用于本发明。尽管在DNA构建体中使用细菌启动子，但是在脂质体内包括合适的细菌聚合酶也是需要的。
可以通过不同方法制备本发明使用的脂质体。脂质体的大小根据合成方法的不同而改变。悬浮在水溶液中的脂质体一般呈球形囊泡的形状，它们带有一层或多层脂双层分子的同心层。各层由通式XY代表的平行排列的分子组成，其中X是亲水部分而Y是疏水部分。在水混悬液中，同心层的排列使得亲水部分倾向于保持与水相接触，而疏水区倾向于自结合。例如，当水相存在于脂质体内和不存在于脂质体内时，脂类分子均可以形成称作片层的XY-YX排列的双层。当一种以上脂类分子的亲水和疏水部分彼此结合时，可以形成脂类的聚集物。这些聚集物的大小和形状取决于许多不同的变化因素，诸如溶剂的性质和溶液中存在的其它化合物。
可以按照公知的实验室技术制备本发明范围内的脂质体。在一个优选的实施方案中，通过在例如玻璃梨形烧瓶这样的容器内混合脂质体脂类来制备脂质体。该容器应具有大于预计脂质体混悬液体积10倍的体积。使用旋转蒸发器在约40℃和负压下除去溶剂。溶剂通常在约5分钟-2小时内被除去，这取决于所需的脂质体的体积。可以在真空中的干燥器内进一步干燥所述组合物。因随时间变质的倾向而一般在约1周后弃去干燥的脂类。
通过阵摇至所有液体膜重新悬浮可以使干燥的脂类在无菌的不合致热原的水中水合成约25-50mM磷脂。然后可以将这种水脂质体分离成等分部分、将它们各自置于小瓶内、冻干并在真空中密封。
在另一种选择中，可以按照其它公知的实验室方法制备脂质体：Bangham等(1965)的方法，将该文献的内容引入本文作为参考；Gregoiradis的方法，如《生物学和药物中的药物载体》(DRUG CARRIERSIN BIOLOGY AND MEDICINE)中所述，G.Gregoiradis编辑(1979)287-341页，将该文献的内容引入本文作为参考；Deamer和Uster在1983年所述的方法，将该文献的内容引入作为参考；和如Szoka和Papahadjopoulos在1978年所述的反相蒸发法。上述方法在其捕集含水物质的相应能力及其相应的含水空间与液体比方面存在差异。
可以使如上所述制备的干燥脂类或冻干脂质体脱水并在抑制性肽溶液中再溶解和用例如DPBS这样的合适溶剂稀释成合适的浓度。然后在涡流混合器中剧烈振摇该混合物。通过以29,000×g离心除去未包裹的核酸并洗涤脂质体沉淀。将洗涤的脂质体重新悬浮至合适的总磷脂浓度、例如约50-200mM。可以按照标准方法测定包裹的核酸的量。在测定脂质体制剂中包裹的核酸的量后，可以将该脂质体稀释成合适的浓度并在4℃下储存至应用为止。
包括所述脂质体的药物组合物通常包括无菌的药物上可接受的载体或稀释剂，诸如水或盐水溶液。
基因疗法的给药
本领域技术人员认识到可以将本发明的表达载体用于基因疗法。就基因疗法而言，本领域技术人员认识到所用的载体必须含有可操作地与启动子连接的有意义的基因。就反义基因疗法而言，有意义的基因的反义序列可操作地与启动子连接。本领域技术人员认识到在某些情况中，诸如3’UTR调节序列这样的其它序列可用于表达有意义的基因。如果合适，可以按照本领域中公知的方式将基因疗法的载体配制成固体、半固体、液体或气态形式的制剂以适合于其相应的给药途径。可以将本领域中公知的方法用于防止组合物的释放和吸附，直到它达到靶器官或确保组合物的定时释放为止。应使用不会使本发明组合物无效的药物上可接受的剂型。在药物剂型中，可以将所述组合物单独使用或以合适的结合方式以及组合方式与其它具有药物活性的化合物一起使用。必须给予足够量的含有治疗核酸序列的载体以便提供药理上有效剂量的基因产物。
本领域技术人员认识到可以将不同的转运方法用于将载体给药入细胞。实例包括：(1)使用物理方式的方法，诸如电穿孔(电)、基因枪(物理力)或应用大体积的液体(压力)；和(2)使所述载体与诸如脂质体、凝集的蛋白质或转运蛋白分子这样的另一种整体复合的方法。
因此，本发明提供了一种将治疗基因转入宿主的方法，该方法包括使用任何上述给药途径或本领域技术人员所公知且适合于特定应用的可选择途径给予本发明的载体，优选作为组合物的一部分的步骤。可以依据治疗作用(例如与所治疗特定疾病相关的某些症状的缓解)或另外通过证实转移的基因或基因在宿主内的表达监测按照本发明将载体转入宿主细胞的有效基因转移(例如，使用与测序、RNA印迹或DNA杂交结合的聚合酶链反应；或检测宿主细胞内核酸的转录测定试验；或使用免疫印迹分析、抗体介导的检测、mRNA或蛋白质半衰期研究；或检测由转移的核酸编码的蛋白质或多肽或因这类转移导致的对水平或功能的影响的颗粒化试验)。
本文所述的这些方法决不意味着包含所有方法且可以使用适合于特定应用的其它方法，这对本领域技术人员来说是显而易见的。此外，可以通过与已知发挥所需作用的化合物类似而进一步近似得到所述组合物的有效量。
此外，实际剂量和方案可以根据是否将所述组合物与其它药物组合物联用给药或根据个体之间的药代动力学、药物性能和代谢方面的差异来改变。类似地，剂量可以在体外应用中改变，这取决于所用的特定细胞系(例如，基于存在于细胞表面上的载体受体的数量或所用的特定载体用于基因转移以便在该细胞系中复制的能力)。此外，每个细胞中添加的载体量能够随插入载体的治疗基因的长度和稳定性以及序列的性质来改变且它特别是一种需要根据经验确定的参数且可以因并不是本发明方法固有的因素(例如，与合成相关的成本)而改变它。本领域技术人员可以根据特定情况中的要求方便地进行任何必要的调整。
含有治疗基因的细胞还可以含有一种自杀基因(即编码可以用于破坏细胞的产物的基因，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶)，这是可能的。在许多基因疗法的情况中，需要能够在宿主细胞中表达用于治疗目的的基因，而且需要具有一旦完成疗法、成为无法控制的或不会导致可预计的或所需的结果就破坏宿主细胞的能力。因此，可以通过启动子驱动治疗基因在宿主细胞中的表达，不过，所述自杀基因的产物在没有前体药物的情况下仍保持无害。一旦疗法完成或不再需要或需求治疗，则前体药物的给药会导致自杀基因产物对细胞成为致命性的。可以使用的自杀基因/前体药物组合的实例是：单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤、无环鸟苷或FIAU；氧化还原酶和环己酰亚胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk:Tmk)和AZT；以及脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿糖胞苷。
通过实例提供了下列实施例且它们不以任何方式来限定本发明的范围。
实施例1
逆转录病毒载体中HBe抗原的构建和表达
尽管由HBV前CC基因编码HBcAg和HBeAg蛋白，但是分泌性HBeAg蛋白开始于HBcAg的起始密码子上游29个残基的起始密码子。修复获自美国典型培养保藏中心(Rockville，MD)的HbeAg基因以便修正两个突变。发现这两个突变因在74位密码子上产生移码的单碱基对缺失而发生，从而在84和85位上产生两个连续的终止密码子。通过使用PCR诱变插入缺失的碱基来修正这些突变。使在病毒感染过程中裂解的HBeAg的富含精氨酸的C’-末端序列(aa 150-185)缺失。然后使截短的HBeAg基因与IgG Fc片段进行符合读框的融合。将HBe-retrogen融合基因(HBe-retrogen)克隆入逆转录病毒载体(LNC-NGFR)或表达载体pRc/CMV。使用本领域可获得的技术构建包括HBcAg(胞质)和HBeAg(分泌)的载体且所述的技术例如由Sambrook等(1989)和Ausubel等(1997)描述。将IgG Fc片段基因与IgG信号前导序列融合并如附图2A中所示克隆入表达载体中。以这种方式，如附图2A中所示构建含有HBeAg基因(分泌)、带有信号前导序列的Fc片段基因(分泌性)或HBcAg基因(胞质)的一系列对照逆转录病毒载体。
为了评价HBe-Fc融合蛋白的表达和分泌，用不同的表达载体转染COS细胞并在48小时后对所述细胞进行放射性标记。正如附图3中所示，当用抗人IgG或抗-HBeAg抗体(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)沉淀时，在细胞裂解物和培养基中均检测到了符合HBeAg-Fc融合蛋白的蛋白质带。
对转染细胞的免疫荧光染色还显示出一种典型的分泌性蛋白质图式。仅在获自转染细胞的细胞裂解物中观察到了HBcAg蛋白并且在所述培养基和所述细胞裂解物中均观察到了HBeAg和Fc片段蛋白质。这些结果表明有效地产生了HBeAg-Fc蛋白(HBe-retrogen)且它们分泌自细胞。
实施例2
树突细胞(DCs)中HBe-retrogen的转导和表达
为了在DCs中评价“retrogen”策略，使用瞬时转染法由PA317包装细胞生产含有HBe-retrogen或包括NGFR标记的各种对照基因(附图2A)的逆转录病毒载体。鼠骨髓细胞获自C57BL/B6小鼠。在补充了鼠干细胞因子(SCF)和IL-6的培养基中刺激所述细胞并将其用下文所述的逆转录病毒载体等转导。
Dcs的转导
在装有含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)的10mm培养皿中以约40％的融合率培养获自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)的PA317包装细胞。用10-15μm滤膜转染这些细胞。
从小鼠肢体骨中冲洗出鼠骨髓、使之通过尼龙筛网并用氯化铵排空红细胞。在用RPMI-1640充分洗涤后，在37℃下用家兔补体和一组单克隆抗体、抗-CD4+、抗-CD8+、抗-B细胞和抗-MHC型阳性细胞混合物在RPMI-1640中将所述细胞培养40-60分钟。在用RPMI-1640充分洗涤后，将5×105个细胞/ml悬浮在补充了6％FBS、80ng mSCF/ml和20UrmIL-6/ml的RPMI-1640中。将该细胞平板固定在12孔培养平板(3ml/孔)中，在37℃和5％CO2下培养过夜且然后用含有相同组分的新鲜培养基替换。在进行48小时培养后，将所述细胞通过离心收集，重新悬浮在1.5ml的逆转录病毒上清液中并平板固定在24孔培养平板上，将该平板用10mg/ml浓度的逆转录柄蛋白(Retronectin)包被。在37℃下以2,500rpm将所述细胞离心90-120分钟且然后在37℃和5％CO2下将它们再培养3-4小时以便进行逆转录病毒转导。接着用补充了5％FBS、10ngmSCF/ml、60ng mGM-CSF/ml和100U mIL-4/ml的2.5mlRPMI-1640(R & DSystems，Minneapolis，MN)替换逆转录病毒上清液过夜。接下来将转导过程重复2-3次。转导后，洗涤细胞并在含有mGM-CSF和mIL-4的Opti-MEM(GIBCO，Grand Island，NY)中培养几天以便在收集前进一步使DCs成熟(Banchereau等，1998；Inaba等，1992)。
转导的评价(表达的测定)
在培养几天后，在骨髓衍生的DCs上表达显示出典型的DC形态和高水平的MHC、粘着和共同刺激分子(CD11、CD54、CD80和CD86)的所述细胞(附图4A-4C和5A-5E)。正如通过抗-NGFR染色所测定的，培养物中的细胞被转导了约20-30％。在RT-PCR测定中证实转录了DCs中的HBe-retrogen基因。
如下进行RT-PCR测定：使用Trizoal(Gibco-BRL Grand Island，NY)从DCs中提取细胞RNA并在37℃下将其用不合RNASE的DNASE处理30分钟。在进行逆转录后，将cDNAs用作使用对应于HBeAg基因的引物对的PCR反应的模板。通过经琼脂糖的电泳对PCR产物进行分析。
这些结果共同表明将HBe-retrogen融合基因有效转导入了鼠骨髓细胞并在骨髓衍生的DCs中表达。有意义的是MHC-II和共同刺激分子在包括转导HBe-retrogen的DCs上的表面表达明显高于所述分子在用HBeAg或HBcAg转导的DCs上的表达。这一观察结果提示Fc与受体的结合激活了DCs。
实施例3
原初CD4+-T-细胞的体外活化
为了评价转导的DCs是否能够在细胞培养物中致敏原初CD4+-T-细胞，将分离自C57BL/B6小鼠脾细胞的原初CD4+-T-细胞与用实施例1的逆转录病毒载体转导的鼠DCs按1∶20的比例(DCs∶T-细胞)一起共培养。使用富含CD4+T细胞的柱(R & D Systems，Minneapolis，MN)从小鼠脾脏悬浮液中分离CD4+T细胞。使用富含CD8+T细胞的柱(R&DSystems，Minneapolis，MN)从小鼠脾脏悬浮液中分离CD8+T细胞。在37℃和5％CO2下用补充了10％FBS的RPMI-1640培养纯化的CD4+或CD8+T细胞。
当将原初CD4+-T-细胞与用HBeAg、HBcAg或Fc片段基因转导的DCs一起共培养时，在培养基中通过ELISA仅检测到低或背景水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素(IFN)-γ。此外，当监测到细胞数量或3H-胸苷掺入率时，没有观察到明显的T-细胞增殖。相反，当将原初CD4+-T-细胞与用HBe-retrogen转导的DCs一起共培养5天时，T-细胞活跃地增殖且在培养基中检测到了高水平的GM-CSF和IFN-γ(附图6A和6B)。这些结果提示不能将分泌性HBeAg或胞质HBcAg有效加工和由DCs呈递给MHC-II。相反，在Fc-受体介导的摄入和呈递给DCs中的MHC-II后能有效加工分泌性HBe-retrogen，从而导致原初CD4+T-细胞的体外活化。
在含有转导的DCs的共培养物中没有检测到明显的原初CD8+T-细胞活化。在细胞培养物中没有检测到原初CD8+T-细胞活化可能是由于在HBeAg中仅存在一种已知结合在MHC-I上的表位和CD4+-T-细胞是CD8+T-细胞的有效活化所需要的这一事实(Ridge等，1998)。
为了使用retrogen策略进一步证实结合在MHC-II上的抗原呈递，使用MHC-II剔除(KO)C5 7BL/6小鼠(Charles River，NY)，其中消除了MHC-II通过DCs的抗原呈递。用HBe-retrogen转导来源于野生型(WT)或MHC-II KO小鼠的DCs且然后将它们与获自WT小鼠的CD4+T-细胞按1∶20的比例一起共培养。正如附图7A和7B中所示，在含有转导的KO-DCs的共培养物的培养基中仅检测到低浓度的GM-CSF和IFN-γ，而没有观察到明显的T-细胞增殖。相反，当将CD4+T-细胞与用转导的WT DCs一起共培养5天时，T-细胞活跃地增殖且在培养基中检测到了高浓度的GM-CSF和IFN-γ(附图7A和7B)。
实施例4
辅助和细胞毒性T-细胞的体内诱导以及B-细胞的免疫反应
评价体内retrogen抗原呈递策略的可能性。将小鼠(C57BL/6)分成4组(4-6只小鼠/组)并通过腹膜内注射对每只小鼠给予用HBcAg、HBeAg、Fc或HBe-retrogen在含有50,000U IL-2(ChironCorp.Emmeryville，CA)的0.2ml PBS中转导的约50万个DCs。在最终给药后的不同的时间处死小鼠并收集外周血液、脾脏和其它器官。分离T-细胞以便使用富含CD4或CD8+T-细胞的柱(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行分析。
在第一次注射后3个月，处死小鼠并收集外周血液、脾脏和其它组织样品。从总体检查中可以看出，在给予HBe-retrogen-转导的DCs的小鼠体内的腹腔中的淋巴结显著扩大，而正常小鼠和给予其它构建体的小鼠体内淋巴结小至难以观察到。组织学检查还显示在给予HBe-retrogen-DCs的小鼠腹部淋巴结中的T-细胞和B-细胞增殖活跃。
实施例5
TH1和TH2辅助T-细胞的诱导
将如实施例4中所述免疫接种的小鼠用于测定TH1和TH2辅助T-细胞的诱导情况。本领域技术人员认识到了测定TH1和TH2细胞的诱导的重要性。众所周知CD4+-T-细胞具有下列功能：1)它们帮助B-细胞发育成产生抗体的浆细胞；2)它们帮助CD8+-T-细胞成为活化的细胞毒性T-细胞；和3)它们引起迟发过敏性。这些功能通过CD4细胞的两种亚群来完成：TH1细胞介导迟发过敏性并主要产生IL-2和γ干扰素(IFN-γ)，而TH2细胞具有B-细胞辅助功能且主要产生IL-4和IL-5。
使用抗-CD4柱(R & D Systems，Minneapolis，MN)从免疫接种的小鼠脾脏中分离CD4+-T-细胞且然后将这些细胞与用重组HBeAg蛋白脉冲的小鼠DCs一起共培养。在T-细胞：DCs之比为1000∶1的细胞共培养物中仅2天后，来自给予HBe-retrogen-DCS的CD4+-T-细胞增殖活跃。在所述共培养基中检测到了高浓度的GM-CSF和IFN-γ(刺激巨噬细胞和CD8+-T-细胞)以及IL-4和IL-5(刺激B-细胞)。抗-CD4抗体而非抗-CD8抗体显著阻断了细胞因子在这些共培养的T-细胞中的产生。相反，当将获自免疫接种了HBeAg-、HBcAg-或Fc-DCs的小鼠的CD4+-T-细胞与HBeAg-DCs一起共培养时，在共培养基中仅检测到了低浓度的GM-CSF、IFN-γ、IL-4和IL-5而没有观察到活跃的T-细胞的增殖。由于IL-4和IL-5主要由TH2产生且GM-CSF和IFN-γ主要由TH1细胞产生，所以这些结果表明HBe-retrogen-转导的DCs有效激活TH1和TH2 T-细胞。
实施例6
高滴度抗-HBeAg抗体的诱导
如实施例4中所述给小鼠免疫接种以便测定抗体的水平。给小鼠免疫接种HBe-retrogen-转导的DCs在小鼠体内诱发了高滴度的、长期的抗-HBe/cAg抗体反应。正如附图8中所示，在给予HBe-retrogen-转导的DCs的小鼠血清中检测到的抗-HBeAg抗体的滴度显著高于给予HBeAg-转导的DCs的小鼠体内的抗-HBeAg抗体的滴度。使用ELISA评价免疫接种小鼠血清中抗-HBeAg抗体的水平。简单地说，在4℃下用连续稀释的血清在封闭性缓冲液中将包被了HBcAg重组蛋白的微量滴定板(50ng/孔)培养2小时。用针对在封闭性缓冲液中稀释的小鼠IgG的过氧化物酶接合的抗体培养后检测结合的抗体。将获自Chiron Corp.(Emmergyville，CA)的多克隆抗-HBcAg抗体用作阳性对照而将正常小鼠血清用作阴性对照。将抗体滴度定义为具有OD450值的最高稀释度，它高于阴性水平的2倍。
所观察到的抗体产生的倍增可能是由于CD4+辅助T-细胞较强活化造成的。免疫接种了HBcAg-转导的DCs的小鼠血清中抗-HBe/cAg抗体水平明显较低可能是由于HBcAg的胞质定位和CD4+T-细胞活化缺乏所造成的。因此，HBe-retrogen在诱发免疫接种它的哺乳动物体内的抗体反应方面显著优于其它HBeAg和HBcAg构建体。这些小鼠模型的研究结果共同表明用HBe-retrogen转导的DCs诱发了CD4+-和CD8+-T-细胞的强有力的活化以及B-细胞的活化。
实施例7
胞内肿瘤抗原的载体构建
MAGE-3是一种缺乏用于内源性MHC-II呈递途径的引导序列的胞质和核内蛋白，它使得在MHC-II上呈递变得不可能或难以在MHC-II上进行呈递。由于没有小鼠的同源物，所以将人MAGE-3基因与来源于人趋化因子RANTES基因的信号前导序列连接以便使MAGE-3分泌。使用下列引物对将编码全长MAGE-3基因的质粒用作模板以便扩增MAGE-3 DNA：5’-引物(A)：(SEQ ID No.1)5’-ACGCGTCGACATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAG-3’，它相当于带有附加Sa1 I限制位点的MAGE-3基因的1-24位多核苷酸序列；和3’-引物(B)：(SEQ ID No.2)5’-CCGCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCTCAAAAC-3’，它相当于带有Xho I位点的MAGE-3基因的921-945位多核苷酸序列。通过使用下列引物对的PCR扩增来产生来源于人RANTES基因的附加的信号前导序列：5’-引物(C)：(SEQ ID No.3)5’-ACGCGTCGACATGAAGGTCTCCGCGGCAGCCCTCGCTGTCATCCTCATTGCTACTGCCCTCTGCGCTCCTGCATCTGCCATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAG-3’，它相当于RANTES信号前导序列且相当于带有Sa1 I位点的MAGE-3基因的1-24位多核苷酸序列；和3’-引物(B)。通过使用5’-引物-C和3’-引物(D)的PCR来产生不合终止密码子的信号-MAGE-3片段(s-MAGE-3)：(SEQ ID No.4)5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCTCTTCCCCCTCTCTCAAAAC-3’，它相当于带有Not I位点的MAGE-3的921-942位多核苷酸序列。属于最有效的APCs的DCs表达IgG Fc受体(FcγRs)，它介导有效结合在MHC-II和MHC-I上的抗原的特许抗原摄入途径。因此，将来源于可有效与鼠DCs上的Fc受体结合的人IgG1a的Fc片段cDNA与修饰的MAGE-3基因进行符合读框的融合以便通过DCs介导MAGE-3的摄入(附图9A)。然后将分泌性MAGE-3融合基因(s-MAGE-3-Fc)克隆入鼠逆转录病毒载体pFB-Neo(Stratagene)(附图9A)。通过应用含有人IgG1a重链cDNA的质粒pEE6/CLL-1作为模板的PCR扩增产生人IgG cDNA Fc片段。用于PCR反应的引物对是：5’-引物(E)，(SEQ ID No.5)5’-ATAAGCGGCCGCTAAAACTCACACATGCCCA-3’，它相当于带有附加Not I位点的重链的785-802位多核苷酸序列；和3’-引物(F)：(SEQ ID No.6)5’-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’，它相当于带有Xho I位点的重链的1447-1468位多核苷酸序列。将鼠逆转录病毒载体pFB-Neo(Stratagene)用于本研究。通过对不含终止密码子的s-MAGE-3片段、Fc和Sa1 I/Xho I切割的pFB-Neo进行三段连接来构建逆转录病毒载体s-MAGE-3-Fc。通过分别将s-MAGE-3或MAGE-3基因插入Sa1 I/Xho I切割的pFB-Neo来构建逆转录病毒载体s-MAGE-3或MAGE-3。为了构建IgG Fc表达载体，通过两次PCR反应将人IgG Fc cDNA片段与免疫球蛋白重链(VH)信号前导序列连接。在第一次PCR反应中，将IgG Fc cDNA用作应用下列引物对进行扩增的模板：5’引物，(SEQ IDNo.7)5’-GCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC-3’，它相当于重链的785-815位多核苷酸序列和部分VH-前导序列；和3’-引物F：(SEQ ID No.6)。应用第一次PCR产物作为模板的第二次PCR使用下列引物对进行：5’引物，(SEQ ID No.8)5’-ACGCGTCGACATGGGAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3’，它相当于带有附加Sa1 I位点的VH-分泌信号前导序列的N-末端多核苷酸序列和；和3’-引物F：(SEQ ID No.6)。然后将带有信号前导序列的Fc cDNA克隆入逆转录病毒载体。通过将MAGE-3插入XhoI/XbaI-切割的pcDNA3.1(Invitrogen)来构建表达载体pcDNA3.1-MAGE-3。还构建了表达天然胞内MAGE-3、分泌性s-MAGE-3或分泌性Fc片段的几种对照逆转录病毒载体(附图9A)。通过限制酶分析鉴定所得的各载体并通过DNA测序来进一步证实。
实施例8
逆转录病毒的生产和骨髓衍生的DC的转导
通过瞬时转染生产逆转录病毒载体。将包装细胞(PA317)在装有含10％加热失活的FBS(Gibco-BRL)的DMEM的100-mm培养皿中培养并用通过使用Lipofectin生产的不含内毒素的QIAGEN试剂盒(Gibco-BRL)制备的10-15μg逆转录病毒载体质粒(来自实施例7，即胞内MAGE-3、分泌性s-MAGE-3或分泌性Fc片段)转染。在培养过夜后，用含有5％FBS的DMEM替换所述培养基。48小时后，如上所述收集合有重组逆转录病毒的培养基并过滤(0.22μm)(Chen等，1997)。为了产生DCs，从小鼠肢体骨中冲洗出骨髓细胞，使之通过尼龙筛网并用氯化铵排空红细胞。在用RPMI-1640充分洗涤后，在37℃下用家兔补体(Calbiochem)和由抗-CD4、抗-CD8、抗-CD45R/B220和抗-MHC-II组成的单克隆抗体混合物(PharMingen and BioSource International)在RPMI-1640中将所述细胞培养40-60分钟。在用RPMI-1640充分洗涤后，将在补充了6％FBS、80ng mSCF/ml(R & D System)和20个单位(U)mIL-6/ml(BioSourceInternational)的RPMI-1640中的细胞(5×105个细胞/ml)平板固定在12孔培养平板(2.5ml/孔)中，在37℃和5％CO2下培养过夜且然后向其中重新加进新鲜培养基。在进行48小时培养后，使所述细胞充分旋转，重新悬浮在1.5ml的逆转录病毒上清液中，以10-20ng/ml的浓度平板固定在包被了逆转录柄蛋白(PanVera)的2 4孔培养平板上并在37℃和5％CO2下培养3-4小时。接着用补充了5％FBS、10ng鼠干细胞因子(mSCF)/ml、60ng mGN-CSF/ml(BioSource International)和100UmIL-4/ml(R & D Systems)替换上清液过夜。将转导过程重复2-3次且通过该过程通常转导了约30％的BM细胞。在最终的转导后，洗涤细胞并在含有mGM-CSF和mIL-4的Opti-MEM(Gibco-BRL)中培养几天以便使DC进一步分化。如上所述使用50％FCS-RPMI-1640沉降过程进一步富集DCs(Inaba等，1992)。
在培养几天后，细胞的主要级分显示出不同的DC形态。正如通过逆转录(RT)-PCR测定试验所证实的，转导DCs中的s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、MAGE-3或Fc基因得到了转录。将定量蛋白质印迹分析用于证实蛋白质通过转导DCs中的构建体的表达和分泌。简单地说，在冰上用缓冲液(Boehringer Mannheim)(10mM Tris 150mM NaCl(pH 7.4)、1％TX-100(Sigma)、0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物片)将转导的DCs裂解10分钟。然后用针对MAGE-3的家兔多克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基，随后用蛋白质A-琼脂糖(Sigma)培养。接着将沉淀物重新悬浮于20μl加样缓冲液中。将蛋白质样品(20μl)上10％SDS-PAGE凝胶并转移到Hybond PVDF膜(Amersham Pharmacial Biotech)上，在4℃下通过在含有5％脱脂奶粉(Carnation)和0.1％(v/v)Tween-20(FisherScientific)的PBS(pH7.5)中过夜培养将该膜封闭。在用缓冲液(含有0.1％(v/v)Tween-20的PBS)洗涤后，在室温下将该膜用针对在含有2.5％脱脂奶粉和0.1％Tween-20(1∶400)的PBS缓冲液中稀释的MAGE-3的小鼠单克隆抗体培养1小时。在洗涤后，在室温下将该膜用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG(Amersham Pharmacial Biotech)在缓冲液(1∶10,000)中培养1小时。在最终的洗涤后，用ECL+化学发光检测试剂盒(Amersham Pharmacial Biotech)使该膜显影并在Kodak胶片上曝光。测定胶片上蛋白质印迹的蛋白质带强度并通过带有Image-Quant 1.2版本软件的PhosphorImager(Molecular Dynamics)进行分析。发现有效地产生了s-MAGE-3-Fc和s-MAGE-3蛋白质且它们分泌自DCs，而MAGE-3保留在胞内(附图9B和9C)。在转导的DCs中表达了相差无几水平的s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3和MAGE-3蛋白质。
实施例9
Fc对DC的相互作用
Fc与DCs上FcγRs的相互作用引发细胞活化，从而导致对抗原呈递中所涉及的细胞表面分子的增量调节。检验表面标记以便评价转导的DCs中s-MAGE3-Fc的表达是否可以诱发DC活化。通过流式细胞测定法测定用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3或载体转导的DCs的表面标记。简单地说，在4℃下用阻断FcγRs的抗-CD16/CD32抗体(2.4G2，PharMingen)将DCs预培养30-60分钟。然后在4℃下用初次抗体将DCs培养30分钟，随后用抗小鼠或抗家兔IgG-FITC缀合物进行培养。在充分洗涤后，通过带有CellQuest软件的FACScan(Becton Dickinson)分析DCs。正如附图9D、9E和9F中所示，在来源于用s-MAGE-3-Fc转导的BM细胞的DCs上和在有LPS存在的情况下的DCs上表达的MHC II型、CD40和CD86的水平高于在用s-MAGE-3或载体对照品转导的DCs上表达的MHC II型、CD40和CD86的水平。这些结果提示融合蛋白Fc的分泌和随后的与FcγRs相互作用激活DCs。
实施例10
体内有效TH1的诱导
为了评价MAGE-3的分泌和随后的摄入是否可以促进这种抗原在体内的免疫原性，将DCs用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、MAGE-3或Fc通过逆转录病毒载体转导且然后通过静脉注射给C57BL/6小鼠一次(溶于30μl含有50,000U IL-2(chiron)的PBS的0.5-1×105DC/小鼠)。在免疫接种4-6周后，处死小鼠并收集外周血液、脾脏和其它组织样品。免疫接种了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠体内的淋巴结基本上扩大，对此可以考虑病原体感染，而在给予了用s-MAGE-3、MAGE-3或Fc转导的DCs的小鼠体内没有出现这种情况。
为了确定免疫接种转导的DCs是否可以诱发CD4+辅助T细胞的反应，从免疫接种小鼠的脾细胞中分离CD4+T-细胞且然后将它们与骨髓(BM)衍生的用s-MAGE-3-Fc转导的DCs一起共培养。简单地说，使用CD4+或CD8+T-细胞富集柱(R & D System)从脾细胞混悬液中分离CD4+或CD8+T-细胞且然后在进一步分析前在补充了10％FBS的RPMI-1640中培养24-48小时。在37℃下将来自免疫接种小鼠的排空的淋巴结用0.1％DNA酶I(级分IX，Sigma)和1mg/ml胶原酶(Roche Molecular Biochemicals)的混合物消化40-60分钟。使用抗CD11c(N418)Micro-Beads(MiltenyiBiotec Inc)从淋巴结或脾的细胞混悬液中确切分离DCs以便进一步研究。在以CD4+T-细胞与DCs的不同比例共培养2周的过程中，来自免疫接种了s-MAGE-3-DCs、MAGE-3-DCs或Fc-DCs的小鼠的CD4+T-细胞没有活跃地增殖且在共培养基中仅检测到了低水平的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4(附图10A、10B、10C和10D)。将来自免疫接种小鼠的CD4+T-细胞与DCs按1000∶1的比例(T细胞：DC，2×105∶2×102)一起共培养不同的时间。收集共培养物中的上清液且随后通过ELISA、按照制造商的说明(PharMingen)检测细胞因子浓度。相反，在与来自免疫接种了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠的CD4+T-细胞的共培养过程中，甚至仅在按1∶1000(DC∶T-细胞)比例共培养48小时后在共培养基中检测到了高水平的IL-2和IFN-γ。抗-CD4而非抗-CD8抗体通过共培养的细胞阻断了细胞因子的产生(附图11A)。重复实验显示出了相似的结果。为了进一步测定T-细胞反应的特异性，将用表达无关乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的逆转录病毒载体转导的BM衍生的DCs与来自s-MAGE-3-Fc-DCs免疫接种小鼠的CD4+T-细胞一起共培养。在共培养基中仅检测到了低水平的IFN-γ和其它细胞因子(附图11B)。此外，使用抗-CD11c微珠(Miltenyi Biotec Inc.)分离来自免疫接种后6周小鼠淋巴结的DCs并将其与来自相同免疫接种小鼠的CD4+T-细胞一起共培养。正如附图12A、12B、12C和12D中所示，仅在来自s-MAGE-3-Fc-DCs免疫接种小鼠的细胞共培养物中检测到了高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α。这些结果表明用s-MAGE-3-Fc转导的Dcs可以返回到淋巴样器官或组织中且比用天然MAGE-3或s-MAGE-3转导的DCs更有效地激活Th1反应。
实施例11
体内CTLs的诱导
进行JAM或“合理的另一种方法”试验以便测定免疫接种了s-MAGE-3-Fc-DCs是否可以诱发强CTL反应。将JAM试验用于测定细胞毒性活性。简单地说，在免疫接种后的不同时间点处死小鼠并在RPMI1640 10％FBS中培养脾细胞的单细胞混悬液。在37℃下在5％CO2中在24-孔平板(Costar)内将总计4×106个脾细胞用8×104γ-照射的(10,000拉德)同源的EL4-MAGE-3细胞或EL4-HBcAg细胞/2ml重新刺激4-6天、收集且然后重新悬浮至1×107个细胞/ml。为了标记靶细胞，以2μCi/ml的终浓度将3H-胸苷加入到5×105/ml EL4-MAGE-3或EL4-HBcAg细胞中。在进行6小时培养后，将所述细胞用PBS温和洗涤一次并重新悬浮于培养基中(1×105个细胞/ml)。然后在37℃下在96孔圆底平板(200μl/孔)中将不同数量的效应细胞与恒定数量的靶细胞(1×104/孔)一起共培养4小时，此后将细胞及其培养基抽吸到纤维玻璃滤膜(Filter MateHarvester，Packard)上，然后将该滤膜用水充分洗涤。在将该滤膜干燥并置于96孔平板上后，向各孔中加入25μl MicroScint 20(Packard)。在TopCount NXT微量平板闪烁和发光计数器(Packard)中对平板进行计数。在一些实验中，用抗-CD4或抗-CD8抗体(30μl/孔，PharMingen)将重新刺激的效应细胞群体培养30-60分钟以便在细胞毒性测定试验前排空CD4+或CD8+T-细胞。将特异性杀灭百分比定义为：(在没有T-细胞存在情况下保留的靶细胞DNA(自发)-在有T-细胞存在情况下保留的靶细胞DNA)/保留的自发DNA×100。总3H-胸苷掺入值通常与自发保留值相似。在体外在RPMI-1640、10％FBS中用同源细胞EL4-MAGE-3重新刺激来自免疫接种小鼠的脾细胞且然后将它们与3H-胸苷标记的EL4-MAGE-3细胞按不同的效应细胞/靶细胞比例一起共培养以便测定特异性杀灭率。通过用MAGE-3表达载体(pcDNA3.1-MAGE-3)转染和Zeocin(Invitrogen)选择确定EL4-MAGE-3细胞且证实它们可通过PCR和免疫沉淀测定法表达MAGE-3。
来自免疫接种s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠的脾细胞对靶细胞的杀灭比来自免疫接种s-MAGE-3、MAGE-3或Fc的小鼠的那些脾细胞对靶细胞的杀灭更为有效(附图13)。通过s-MAGE-3-Fc-DCs-免疫接种小鼠脾细胞没有能力杀灭表达无关HBcAg的EL4-HBcAg细胞(附图13)并通过使用抗-CD8而非抗-CD4抗体对杀灭的抑制进一步证实了杀灭的特异性。因此，这些结果证明了s-MAGE-3-Fc-DCs诱发CTL反应的优良能力，这是由于TH1增强和受体介导的抗原摄入交叉致敏所导致的。
实施例12
抗体的诱导
由于抗体还在抗肿瘤免疫性方面起作用，所以通过ELISA测定免疫接种小鼠血清中的抗-MAGE-3的抗体滴度(类似于实施例10)。通过ELISA检测免疫接种小鼠血清中的抗-MAGE-3抗体。简单地说，在室温下在封闭缓冲液(KPL，Gathersburg，MD)中用连续稀释的血清将包被了重组MAGE-3蛋白质(各50ng/孔)的微量滴定平板(Dynatech)培养2小时。在用针对封闭缓冲液中稀释的小鼠IgG(Sigma)的过氧化物酶接合的抗体培养后检测结合的抗体。将抗MAGE-3的单克隆抗体用作阳性对照并将正常小鼠血清用作阴性对照。将抗体滴度定义为使用大于0.2的ODA450得到的最高稀释度。正常小鼠血清的背景ODA450低于0.1。在DC免疫接种后2周诱导抗-MAGE-3抗体且在免疫接种后4-6周达到峰值。
正如附图14中所示，在s-MAGE-3-Fc-DC免疫接种小鼠血清中检测到的抗-MAGE-3抗体的滴度显著高于在免疫接种了s-MAGE-3-DCs或MAGE-3-DCs小鼠血清中检测到的抗-MAGE-3抗体的滴度。通过缺乏抗免疫接种小鼠体内无关HBcAg的抗体来证实抗体反应的特异性。这些发现的结果共同表明s-MAGE-3-Fc-DCs在诱导CD4+Th、CD8+CTL和B-细胞反应方面优于MAGE-3-DCs或s-MAGE-3-DCs。
实施例13
辅助T-细胞增强的相互作用
就DCs上的MHC-II而言识别其特异性肽类的致敏的CD4+TH显著增加了它们与条件DCs的相互作用。这种通过CD40-CD40L的相互作用可以引起DC产生IL-12且对于生成CTL反应的T-细胞辅助细胞来说是关键的。为了测试这种手段是否可以增强CD4+TH与s-MAGE-3-Fc-DCs的相互作用，测定在与致敏的CD4+T-细胞的共培养物中通过转导的DCs产生的IL-12。从免疫接种了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠体内分离致敏的CD4+T-细胞且然后将它们与用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、s-MAGE-3或Fc转导的BM衍生的DCs一起共培养。正如附图15中所示，在CD4+T-细胞与s-MAGE-3-Fc-DCs的共培养物中观察到了IL-12的产生显著增加，而在与s-MAGE-3-Fc或s-MAGE-3-DCs的共培养物中没有观察到这种情况。在致敏的CD4+T-细胞上通过用CD40L阻断来抑制通过s-MAGE-3-Fc-DCs产生IL-12。Fc在DCs中的表达在较低的程度上也非特异性地强化IL-12的产生。这些结果与实施例10、11和12数据的体内结果一起表明MAGE-3的分泌和随后FcγRs-介导的摄入导致MAGE-3在DCs上交叉呈递以便诱导TH1和CTL反应。
实施例14
由s-MAGE-3-Fc-DCs诱导的保护性免疫
为了检验抗-MAGE-3免疫反应的强化是否能够导致有效的抗肿瘤免疫性，进行攻击实验。EL4-MAGE-3细胞系来源于在同源小鼠体内快速生长的亲本肿瘤EL-4系并将它们用于攻击实验。当皮内植入同源C57BL/6小鼠时，EL4-MAGE-3细胞(0.5-1×106个细胞)显示出类似于亲本EL-4细胞的侵害性肿瘤生长，从而仅在接种后3-5天在小鼠体内产生肉眼可见的肿瘤并通常在接种后1个月导致小鼠死亡。为了测试s-MAGE-3-Fc-DCs抑制EL4-MAGE-3肿瘤生长的能力，给小鼠以静脉注射的方式免疫接种2次(间隔7天)用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、s-MAGE-3或Fc转导的1×105DCs，随后用EL4-MAGE-3细胞攻击(1×106)。通过在第0天和第7天静脉注射给C57BL/6小鼠免疫接种1×105转导的DCs且然后在第二次免疫接种后1周用1×106呈指数生长的EL4-MAGE-3或EEL4-HBcAg细胞以皮内方式进行攻击。每隔2-3天测量一次肿瘤大小，其中如下计算肿瘤体积：(最长直径)×(最短直径)2。
正如附图16A中所示，尽管免疫接种s-MAGE-3-DCs、MAGE-3-DCs、s-MAGE-3乃至Fc-DCs(非特异性免疫刺激剂)确实产生了一定程度的保护作用，但是在免疫接种了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠体内将肿瘤生长抑制到极高的程度。由这些构建体显示出的抗肿瘤活性的效能与其诱导免疫反应的能力相关。免疫接种s-MAGE-3-DCs的小鼠的存活时间始终显著长于免疫接种其它载体转导的DCs的小鼠的存活时间(附图16B)。由s-MAGE-3-Fc-DCs诱导的抗肿瘤活性是特异性的，这是因为免疫接种s-MAGE-3-Fc-DCs并用野生型EL4或EL4-HBcAg细胞攻击的小鼠发展成了致命的肿瘤并在1个月内死亡。S-MAGE-3-Fc-DCs还部分抑制了小鼠体内建立的EL4-MAGE-3肿瘤的生长，不过，该免疫系统在这种模型中可能不具有有效控制致命性肿瘤快速生长的足够反应时间。
实施例15
HBe抗原在哺乳动物表达载体中的构建
编码全长HBV(adw亚型)基因组的质粒获自美国典型培养保藏中心(ATCC)。发现HBV前核心/核心基因含有单一碱基对缺失，它造成在79位密码子上移码，从而产生84和85位上的两个连续的终止密码子。通过使用PCR诱变插入缺失的碱基来修复该基因并通过DNA测序来证实。通过使用下列引物对对修复的HBV基因组进行PCR扩增来产生全长HBeAg基因：(5’-引物(P-A)：(SEQ ID No.9)5’-TTAAGCTTATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3’，它相当于带有附加Hind III限制位点的HBV基因组的1904-2020位多核苷酸序列；和3’-引物(P-B)：(SEQ ID No.10)5’-TTTCTAGFAATCGATTAACATTGAGATTCCCGAGA-3’，它相当于带有Xba I和C1a I位点的HBV基因组的2437-2457位多核苷酸序列。通过使用下列引物对的PCR扩增来产生带有缺失的在病毒感染过程中裂解的富含精氨酸的HBeAg的C’-末端序列(aa 150-185)的截短的HBeAg基因：(5’-引物(P-A)：(SEQ ID No.9)和3’-引物(SEQ ID No.11)5’-GTGCGGCCGCTCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGT-3’，它相当于带有附加Not I限制位点的HBV基因组的2324-2350位多核苷酸序列。通过使用下列引物对的PCR扩增来产生全长HBcAg基因：(5’-引物：(SEQ ID No.12)5’-TTAAGCTTATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGC-3’，它相当于带有附加HindIII限制位点的HBV基因组的1901-1932位多核苷酸序列；和引物P-B(SEQ ID No.10)。通过使用含有人IgG重链cDNA的质粒pEE6/CLL-1作为模板的PCR扩增来产生人IgG cDNA Fc片段。用于PCR反应的引物对是：5’-引物(SEQ ID No.13)5’-ATAAGCGGCCGCTAAAACTCACACATGCCCA-3’，它相当于带有附加Not I位点的重链的785-802位多核苷酸序列；和3’-引物(P-C)(SEQ ID No.14)5’-TATTCTAGATCGATCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3’，它相当于带有C1a I位点的重链的1447-1468位多核苷酸序列。将pRc/CMV载体(Invitrogen)用于本研究。通过三段连接截短的HBe片段、IgG Fc和HindIII/C1a I切割的pRc/CMV载体来构建表达载体HBe-Fc，它表达由与IgG Fc进行符合读框的融合的截短的HBeAg组成的分泌性HBe-Fc融合蛋白。通过将HBeAg基因插入HindIII/C1a I切割的pRc/CMV载体来构建表达分泌性HBeAg蛋白的表达载体HBeAg。通过将HBcAg基因插入HindIII/C1a I切割的pRc/CMV载体来构建表达胞质HBcAg蛋白的表达载体HBcAg。为了构建IgGFc表达载体，通过两次PCR反应将人IgG FccDNA片段与小鼠VH信号前导序列连接。在第一次PCR反应中，将IgG FccDNA用作使用下列引物对进行扩增的模板：(5’-引物(SEQ ID No.15)5’-GCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC-3’，它相当于重链和部分VH-前导序列的785-815位多核苷酸序列；和3’-引物(P-C)：(SEQ ID No.14))。应用第一次PCR产物作为模板的第二次PCR使用下列引物对进行：(5’引物，(SEQ ID No.16)5’-TTAAGCTTCATATGGGAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3’，它相当于带有附加HindIII和NdeI位点的VH-前导序列的N-末端多核苷酸序列和；和3’-引物P-C：(SEQ ID No.14))。然后将带有前导序列的Fc cDNA克隆入HindIII/C1aI切割的-pRc/CMV载体。通过限制酶分析来鉴定这些得到的载体并通过DNA测序来证实。将质粒转入大肠杆菌菌株(XL-1蓝)并在37℃和有50μg/ml氨苄西林存在的情况下使其从单菌落开始生长16-20小时。使用不合内毒素的纯化试剂盒(Qiagen)、按照标准方案分离DNA。将DNA重新悬浮于不合内毒素的PBS(Sigma)中至终浓度为1mg/ml。OD260/280之比在1.8-2.0的范围。将DNA储存在-200℃下并在免疫接种的该天之前通过限制消化来分析。
将来源于人IgG1a的Fc片段用作细胞结合元件以便促进模型HBV核壳蛋白的摄入，这是由于DCs表达IgG Fc受体(FcγRs)的结果，该受体介导用于与MHC-II和I-有效结合的抗原呈递的特定抗原摄入途径。尽管HBcAg和HBeAg由HBV前C/C基因编码，但是分泌性HBeAg蛋白从HbcAg起始密码子上游的29个残基的起始密码子开始。HBeAg以符合读框的形式与人IgG1a Fc片段cDNA基因融合且然后被克隆入pRc/CMV。IgG1a Fc片段可以有效地与小鼠APCs上的Fc受体结合。构建含有HBeAg基因(分泌性)、带有分泌信号前导序列的Fc片段(分泌性)或HBcAg基因(胞质)的对照载体(附图18)。使鼠骨髓DCs产生。简单地说，在补充了6％的FBS、60ng mHM-CSF/ml和100U mIL-4/ml的RPMI-1640中将骨髓干细胞培养4天。然后在含有重组HBeAg(100μg/ml)和HBcAg100μg/ml)蛋白(American Research Products，Boston，MA)的混合物的培养基中将DCs再培养4天。将脉冲的DCs(PDCs)用1×PBS以1000rpm洗涤2次、持续5分钟并重新悬浮于RPMI 1640中以便进一步分析。通过使用放射性标记和免疫沉淀/SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析(PAGE)发现有效地产生了HBeAg-Fc蛋白(HBe-Fc)且它们分泌自转染的细胞(附图19A)。通过蛋白质A珠直接沉淀胞内和分泌的HBe-Fc，这表明融合蛋白保留了其对蛋白质A的结合能力。
实施例16
TH1、辅助T-细胞通过HBe-Fc DNA疫苗的体内诱导
给小鼠免疫接种以便评价这种体内策略。将C57BL/6或BALB/c小鼠分成4组并且通过肌内注射一次100μg(25-50μg(μl)/四头肌)HBcAg、HBeAg、Fc或HBeAg-Fc DNA给各只小鼠进行免疫接种。在免疫接种2-4周后，处死小鼠并采集外周血液、脾脏和其它组织样品。
首先，用重组HBe/cAg蛋白将来自免疫接种DNA疫苗后2-4周小鼠的脾细胞重新刺激5天。从重新刺激的脾细胞中分离T-细胞且然后通过使用3-胸苷结合测定试验进行评价。正如附图20中所示，来自免疫接种HBe Fc构建体或HBe-Fc DNA疫苗致敏的T细胞的小鼠的T细胞增殖活跃。相反，来自免疫接种HBeAg、HBcAg或Fc DNA疫苗或HBeAg、HBcAg或Fc DNA疫苗致敏的T细胞的小鼠的T细胞没有显示出活跃地增殖。
类似于实施例5，将来自免疫接种小鼠的CD4+T-细胞与使用重组HBeAg和HBcAg脉冲的DCs一起共培养。在与不同比例的T-细胞与DCs的6天共培养过程中，来自免疫接种HBeAg、HBcAg或Fc构建体的小鼠的CD4+T-细胞没有显示出活跃地增殖且在共培养基中仅检测到了低浓度的IL-2和IFN-γ(附图21A和附图21B)。相反，在与来自免疫接种HBe-Fc构建体的小鼠的CD4+T-细胞的共培养中，CD4+T-细胞仅在甚至以1∶1000(DC∶T-细胞)比例的48小时共培养后也活跃地增殖。此外，共培养基中的IL-2和IFN-γ浓度显著高于在与来自给予了HBeAg或HBcAg构建体的小鼠的CD4+T-细胞的共培养物中的IL-2和IFN-γ浓度(附图21A和附图21B)。抗-CD4而非抗-CD8抗体通过共培养的细胞显著阻断了这些细胞因子的产生(附图21C和附图21D)。此外，以平行方式将一种无关抗原即重组HBsAg蛋白(American Research Products，Boston，MA)用于与HBe/cAg一起脉冲DCs。HBsAg脉冲的DCs不能在所述试验中刺激HBe-Fc构建体免疫接种小鼠的CD4+T-细胞，从而证明了由HBe-Fc构建体免疫接种诱发的CD4+T辅助1细胞反应的特异性。这些结果表明HBe-Fc构建体可以比HBeAg或HBcAg构建体更为有效地激活TH1。在任何实验中没有检测到显著浓度的IL-4。由此IL-2和IFN-γ主要由TH1细胞产生。该结果表明HBe-Fc构建体诱发TH1反应。
实施例17
体内CTLs的诱导
为了测定免疫接种HBe-Fc构建体是否可以诱发CTL反应，与实施例11类似进行JAM试验。在含有合成肽HBcAg13-27的培养基中将来自不同免疫接种小鼠的脾细胞在体外重新刺激4-6天且然后与3H-标记的肽(HBcAg13-27)脉冲的靶细胞EL-4(H-2b)和p815(H-2d)按不同效应细胞/靶细胞比例一起共培养以便测定靶细胞的杀灭率。正如附图22中所示，来自免疫接种HBe-Fc构建体的小鼠的脾细胞显示出对靶细胞的杀灭显著高于来自免疫接种HBeAg或HBcAg的小鼠的那些脾细胞对靶细胞的杀灭率。通过这些脾细胞没有能力杀灭带有H-2d背景的HBcAg脉冲的p815靶细胞并通过抗-CD8而非抗-CD4抗体对杀灭率的抑制来证实了杀灭的特异性。此外，还将HBsAg用于重新刺激来自HBe-Fc构建体免疫接种小鼠的脾细胞且没有观察到通过HBsAg-再刺激的脾细胞可显著杀灭HBcAg-脉冲的靶细胞。由HBe-Fc构建体诱发的优良细胞毒性反应是由于T辅助1增强和由DCs对摄入的HBe-Fc融合蛋白进行直接的MHC-I型呈递所导致的。
实施例18
抗体的诱导
为了测定HBe-Fc-DC的免疫接种是否可以诱发抗体反应，与实施例6类似在收集的免疫接种了不同载体的小鼠血清中测定抗-HBe/cAg的抗体滴度。正如附图23中所示，在免疫接种HBe-Fc构建体的小鼠血清中检测到了抗-HBe/cAg抗体。通过缺乏抗免疫接种小鼠体内HBsAg的抗体来证实抗体反应的特异性。相反，在免疫接种HBeAg或HBcAg构建体的小鼠体内检测到了显著低的抗体滴度(附图23)。这些结果共同表明HBe-Fc DNA在诱发CD4+T辅助细胞1和CD8+细胞毒性T-细胞以及B-细胞反应反应方面显著优于表达原初HBeAg或HBcAg的DNAs。
实施例19
DCs通过HBe-Fc DNA疫苗接种的系统性活化
为了评价HBe-Fc或HBeAg蛋白从转导的细胞中分泌并通过体循环以进行抗原呈递的可能性，进行DC转移实验。将DCs从免疫接种小鼠体内分离并转入幼鼠以便评价转化的DCs是否可以致敏原初CD4+和CD8+T-细胞。在1个月后处死免疫接种HBeAg-Fc、PEA-HBe或对照DNA疫苗的小鼠。将小鼠CD11c(N418)MicroBeads(Miltenyi Biotec)用于从小鼠脾脏中分离DCs。将CD11c+DCs注入(IP或IV)幼鼠(约1-5×105/小鼠)。在DC转移2-4周后，处死小鼠并监测不同小鼠的抗原特异性CD4+和CD8+T-细胞反应。正如附图24中所示，来自HBe-Fc免疫接种小鼠脾细胞的DCs有效激活了原初T-细胞反应，而来自HBe或HBc免疫接种小鼠脾细胞的DCs没有在幼鼠体内激活T-细胞。该结果与PCR和摄入测定试验的结果共同表明通过FcγR-介导的抗原胞吞作用可促进DC抗原呈递。
实施例20
改变的膜和胞内蛋白的分泌
可以将含有防止蛋白质膜运输和分泌的序列或缺乏分泌用信号序列的膜蛋白和胞内蛋白用于本发明的策略而不需进一步修改。预计阻断蛋白质分泌的序列的缺失或突变可以导致蛋白质分泌。膜蛋白通常含有高比例前疏水氨基酸，由此改变这些蛋白质的疏水性，使得它们被靶向而分泌。本领域技术人员认识到还可以将retrogen策略用于增强这些蛋白质的免疫原性。用于缺失或突变膜蛋白的两个实例是HPV E7和EBV蛋白。
E7是一种胞质蛋白。一段带电荷残基的存在阻碍了该蛋白质的分泌。消除这些残基有利于蛋白质的分泌并使该蛋白质保持稳定(附图17)。因此，通过两次PCR反应使HPV 16 E7蛋白的一段带电荷残基在该构建体中缺失(实心方块)。结果是在与前导信号(IL-2)连接后截短的E7蛋白的分泌得到了显著提高。
EBV核心抗原1是一种核蛋白，它含有一段会干扰蛋白质膜运输和分泌的疏水氨基酸残基。在一项研究中，使EBNA1蛋白中的该段疏水氨基酸残基缺失。结果是截短的EBNA1蛋白在与前导信号序列连接后可有效地从细胞中分泌。
除所述序列缺失或截短外，本领域技术人员还认识到还可以使该序列发生突变以便降低蛋白质的疏水性。位点定向诱变通过将一种或多种多核苷酸序列改变导入所选择的DNA而制备和测试了序列变体。
一般来说，首先获得单链载体或融合双链载体的两个链，在其序列中包括编码所需蛋白质或遗传因子的DNA序列。然后使用单链DNA制备物使以合成方式制备的含有所需突变序列的寡核苷酸引物退火，当选择杂交条件时要考虑到失配的程度。使杂交产物接触诸如大肠杆菌聚合酶I(克列诺片段)这样的DNA聚合酶以便完成对含有突变的链的合成。因此，形成异源双链，其中一个链编码原始的非突变序列而第二个链带有所需的突变。接着将这种双链载体用于转化诸如大肠杆菌细胞这样的合适的宿主细胞并选择包括带有突变序列排列的重组载体的克隆。
位点定向诱变公开在美国专利5,220,007、5,284,760、5,354,670、5,366,878、5,389,514、5,635,377和5,789,166中。
除膜蛋白外，还可以修饰胞内蛋白，从而产生分泌。一种这样的修饰方法仅在于添加信号前导序列。例如，MAGE是一种缺乏分泌用信号序列的蛋白质。在实施例7中，通过使用PCR技术将信号序列添加到MAGE中。向MAGE中添加信号序列能够使这种胞内蛋白得到分泌。另一种对胞内蛋白的修饰方法是改变通常属于一种胞内蛋白的前体，使得它类似于成熟蛋白而得到分泌。例如，IL-1β前体蛋白是一种胞质蛋白，且可分泌成熟蛋白。因此，Siders和Mizel(《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)1995)截短了该前体蛋白中的氨基酸残基。他们的解释是使100-104位之间的几个氨基酸缺失可将截短蛋白质的分泌水平增加到成熟IL-1β的水平。因此，本领域技术人员能够应用这种信息来改变其它胞内蛋白。
进一步的修饰包括应用从细胞中释放的病毒颗粒。因此，将retrogen与病毒基因融合并装配入用于释放的病毒颗粒。病毒颗粒由被蛋白质壳包围的核酸基因组构成。通过本领域中众所周知方法中的任何一种来包装病毒颗粒。
实施例21
蛋白质的糖基化
在本领域中已知IgG-Fc的糖基化对通过FcγR识别使效应细胞得到最佳活化来说是必不可少的。因此，必须在能够进行糖基化的系统中产生含有Fc部分的重组融合蛋白，条件是与FcγR结合对其可能的应用来说是必不可少的。通常将杆状病毒昆虫细胞系统用于产生高产率的重组蛋白。该系统向糖蛋白中添加核心寡糖和外臂(outer arm)糖残基的能力对本领域技术人员来说是众所周知的且使一种合适的系统表达和纯化HBe-Fc融合蛋白成为可能。
构建tHBeAgFc质粒中包含的1230bp的HBeFc片段，它表达由与IgGFc以符合读框形式融合的截短的HBeAg组成的分泌性HBe-Fc蛋白。简单地说，使用带有pFB1供体质粒的pFastBac系统(Gibco BRL)产生重组HBe-Fc杆状病毒。首先使用下列引物从tHBeAgFc模板对HBe-Fc片段进行PCR扩增：分别是5’引物(DEQI DNO.17)5’-GATCGAATTCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3’和3’引物(DEQ ID NO.18)5’-GATCAAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’，从而将EcoRI和HindIII限制位点导入5’和3’末端。将这种PCR产物进行凝胶纯化、消化并连入EcoRI/HindIII切割的pFB1供体质粒中。通过限制酶分析鉴定所得的载体(pFB1-HBeFc)并通过DNA测序来证实。通过用pFB1-HBeFc供体质粒转化DH10Bac大肠杆菌将来自供体质粒的HBe-Fc表达弹夹转座入杆状病毒基因组。当转座入杆粒破坏lacZα肽的表达时，通过X-ga1选择来鉴定重组杆状病毒。通过小量制备分离重组杆粒DNA并按照制造商的说明将其用于转染Sf9昆虫细胞。
通过用0.5ml的病毒储备液转染50ml、2×106个细胞/ml的Sf9细胞混悬液培养物来扩增获自起始转染的病毒储备液并在48小时后收集上清液。然后使该储备液再进行两个循环的扩增，此时＞90％的细胞产生重组HBe-Fc，正如通过对感染细胞进行免疫荧光染色所监测到的。接着将扩增的储备液用于将4份100ml的Sf9细胞培养物感染72-90小时。收集上清液并在4℃下通过以14,000 RPM离心20分钟来使该上清液净化。接下来使澄清的上清液通过5ml洗涤吸附剂凝胶柱(BoehringerMannheim)以便除去可能干扰蛋白质回收的泊洛沙姆(pluronic)。然后通过以1ml/分钟的流速过蛋白质G柱(Pharmacia)从上清液中纯化重组HBe-Fc蛋白。将该柱用10个体积的100mM、pH 6.0的Tris和10mM、pH 6.0的Tris依次洗涤并用10个体积pH 2.7的100mM甘氨酸将所述蛋白质洗脱在1ml级分中。立即通过添加1/10体积的1M、pH 8.0的Tris将所有级分的pH调节至中性。通过A280测定含有蛋白质的级分并通过12％SDS-PAGE进行分离以便测定纯度。然后使纯化的级分进行蛋白质印迹。简单地说，在还原(R)或非还原(NR)条件下通过12％SDS-PAGE分离了15μg含有主要蛋白质的洗脱级分、将它们转到硝化纤维上、印迹并使用ECL蛋白质印迹检测试剂展开。初次抗体、家兔抗-HBc、二次抗体、小鼠抗-家兔-过氧化物酶缀合物。
实施例22
结合在MHC-II上的抗原的鉴定
本发明用于鉴定结合在MHC-II上的病毒抗原，即HIV、HCV、EBV、细菌抗原、其它病原体抗原、肿瘤抗原和涉及自身免疫病的自身抗原。将本发明中的表达载体进行修饰以便包括“测试”多核苷酸。尚不了解引起免疫反应的多核苷酸序列。本发明的策略鉴定了用于开发新疫苗的新抗原/表位。
首先使用来自所选择的细胞即肿瘤细胞的mRNA构建cDNA文库。当由以极高水平表达所关注的多核苷酸序列的细胞或组织制备cDNA时，可以通过最小的努力选择含有所述多核苷酸序列的多个cDNA克隆。就较少转录的多核苷酸序列而言，可以将各种方法用于在制备文库前富集特定的mRNAs。将逆转录病毒用作所述文库的载体。逆转录病毒文库提供了将高复杂度文库输送入实际上任何的有丝分裂活性细胞类型以表达克隆的理想方式。因为病毒颗粒以高效感染，所以它们可输送比基于转染的方法更为复杂的文库。本领域技术人员认识到可以将任何的载体用于该文库。通过使用本领域中众所周知的方法来构建cDNA文库。简单地说，由肿瘤样品建立肿瘤细胞系。通过与来源于单核细胞/巨噬细胞的哺乳动物肿瘤裂解物脉冲的DCs共培养使来自相同哺乳动物外周血液的CD4+T-细胞膨胀。鉴定由膨胀的自体CD4+T-细胞识别的这些肿瘤细胞。接下来将所述细胞系平板固定在96孔中。将膨胀的自体CD4+T-细胞添加到96孔中并监测96孔共培养基中IFN-γ或GM-CSF的浓度。下一步是培养并从阳性肿瘤细胞中提取mRNA。将分离的mRNA转化成cDNA并插入例如带有GFP标记的慢病毒载体这样的载体中或将测试cDNAs克隆入本发明的表达载体。将测试cDNAs克隆入例如附图25中所述的信号序列与细胞结合元件之间的载体中。一旦构建了cDNA文库，就将病毒载体转染入包装细胞。接着用重组载体转导来源于来自具有相同MHC-II基因型的哺乳动物单核细胞的未成熟DCs并测定效率。将转导的DCs与膨胀的自体CD4+T-细胞一起共培养。通过ELISA(GM-CSF)或经流式细胞排列的IL2表面表达来鉴定阳性克隆。对该阳性克隆进行PCR扩增并测序以便测定蛋白质(附图26)。
筛选人基因组以便鉴定编码由CD4+T-细胞识别的蛋白质和表位的多核苷酸序列。将这些多核苷酸序列用于癌症疗法或诱发对自身免疫病疗法的免疫耐受性或用于基因疗法。这种基本的筛选过程为用于设计小治疗分子的表位提供了鉴定方法。
因此，本领域技术人员认识到可以将这种筛选过程进行改变以便筛选不同的基因组，即人、病毒、细菌或寄生虫基因组。cDNA文库的构建在本领域中是众所周知的。因此，本领域技术人员能够应用这种信息来改变本发明以便鉴定抗原。
本说明书中所述的全部专利和公开出版物表明了本发明涉及的本领域技术人员的水平。将全部专利和公开出版物引入本文作为参考，就如同特别和分别指定将各个公开文献引入作为参考一样。
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本领域技术人员会轻易地理解为适应本发明的目的可以对本发明进行充分的修改并获得所述的以及其中固有的结果和优点。本文所述的疫苗、载体、方法、步骤和技术是目前优选实施方案的代表且是典型的而不用来限定范围。本领域技术人员对其中所作的改变和其它应用也包括在本发明或由所附权利要求范围定义的范围内。
序列表
<110>Wake Forest University
<120>用于鉴定引起免疫反应的抗原的组合物和方法
<130>53665-5009CN
<140>PCT/US00/12177
<141>2000-05-05
<150>60/132,752
<151>1999-05-06
<150>60/132,750
<151>1999-0506
<160>19
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人类
<400>1
acgcgtcgac atgcctcttg agcagaggag tcag    34
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>2
ccgctcgagt cactcttccc cctctctcaa aac     33
<210>3
<211>103
<212>DNA
<213>人类
<400>3
acgcgtcgac atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctactgccct    60
ctgcgctcct gcatctgcca tgcctcttga gcagaggagt cag                      103
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人类
<400>4
ataagaatgc ggccgctctc ttccccctct ctcaaaac                            38
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人类
<400>5
ataagcggcc gctaaaactc acacatgccc a                                   31
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>6
ccgctcgagt catttacccg gagacaggga gag                                 33
<210>7
<211>55
<212>DNA
<213>人类
<400>7
gcagctccca gatgggtcct gtccaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcac         55
<210>8
<211>68
<212>DNA
<213>人类
<400>8
acgcgtcgac atgggaacat ctgtggttct tccttctcct ggtggcagct cccagatggg    60
tcctgtcc                                                             68
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>9
ttaagcttat gcaacttttt cacctctgcc taatc                               35
<210>10
<211>34
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>10
tttctagaat cgattaacat tgagattccc gaga                                34
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>11
gtgcggccgc tctaacaaca gtagtttccg gaagtgt                             37
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>12
ttaagcttat ggacattgac ccttataaag aatttggagc                          40
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人类
<400>13
ataagcggcc gctaaaactc acacatgccc a                                  31
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人类
<400>14
tattctagat cgatcactca tttacccgga gacagg                             36
<210>15
<211>55
<212>DNA
<213>人类(前30)/鼠(后25)
<400>15
Figure S2007101628003D00771
<210>16
<211>69
<212>DNA
<213>鼠
<400>16
ttaagcttca tatgggaaca tctgtggttc ttccttctcc tggtggcagc tcccagatgg  60
gtcctgtcc                                                          69
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>17
gatcgaattc atgcaacttt ttcacctctg c                            31
<210>18
<211>31
<212>DNA
<213>人类
<400>18
gatcaagctt tcatttaccc ggagacaggg a                            31
<210>19
<211>98
<212>PRT
<213>人类乳头瘤E7型病毒
<400>19
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1               5                   10                  15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser
        20                      25                  30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
        35                  40                  45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
    50                  55                  60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
                85                  90                  95
Lys Pro

Claims (119)

1.一种表达载体，它包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
2.权利要求1所述的表达载体，其中所述的多核苷酸启动子序列选自组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子组成的组。
3.权利要求2所述的表达载体，其中所述的组成型启动子选自下列启动子组成的组：猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复启动子、莫洛尼氏病毒启动子、鸟白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人肌酸启动子。
4.权利要求2所述的表达载体，其中所述的诱导型启动子选自金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子组成的组。
5.权利要求2所述的表达载体，其中所述的组织特异性启动子选自HER-2启动子和与PSA相关联的启动子组成的组。
6.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码信号序列的多核苷酸选自乙型肝炎病毒E抗原信号序列、免疫球蛋白重链前导序列和细胞因子前导序列组成的组。
7.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的B细胞反应。
8.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的CD4+T-细胞反应。
9.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发哺乳动物体内的CD8+T-细胞反应。
10.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于至少一个表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一个表位诱发导入了所述抗原的哺乳动物体内的B细胞反应、CD4+T-细胞反应和CD8+T-细胞反应。
11.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸包括用于多个表位的多核苷酸序列，其中所述的多个表位诱发导入了所述抗原的哺乳动物体内的B细胞反应、CD4+T-细胞反应和CD8+T-细胞反应。
12.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自至少一种与疾病相关的多核苷酸序列，其中所述的疾病选自感染性疾病、癌症和自身免疫病组成的组。
13.权利要求12所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自至少一种来自感染性疾病的多核苷酸序列，其中所述的感染性疾病是由选自病毒、细菌、真菌和原生动物组成的组的致病微生物引起的。
14.权利要求13所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自至少一种来自病毒基因的多核苷酸序列，其中所述的病毒基因选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和疱疹病毒组成的组。
15.权利要求14所述的表达载体，其中所述的乙型肝炎病毒是乙型肝炎病毒e抗原或乙型肝炎病毒核心抗原。
16.权利要求14所述的表达载体，其中所述的人免疫缺陷病毒是gp160或gp120。
17.权利要求14所述的表达载体，其中所述的乳头瘤病毒是乳头瘤病毒E7或乳头瘤病毒E6。
18.权利要求14所述的表达载体，其中所述的疱疹病毒选自下列病毒组成的组：单纯疱疹1型病毒、单纯疱疹2型病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹6型病毒、人疱疹7型病毒和人疱疹8型病毒。
19.权利要求12所述的表达载体，其中所述的疾病选自乳腺癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌和前列腺癌组成的组。
20.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码用于抗原的序列的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自编码酪氨酸酶、MART、trp、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、HER-2、Ras和PSA的多核苷酸序列组成的组。
21.权利要求12所述的表达载体，其中所述的疾病选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病和局限性回肠炎组成的组。
22.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码抗原的多核苷酸编码Fc抗体片段或白细胞介素。
23.权利要求22所述的表达载体，其中所述的多核苷酸序列编码白细胞介素5。
24.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种与细胞表面受体结合的配体的多核苷酸序列。
25.权利要求24所述的表达载体，其中所述的配体的多核苷酸序列选自编码Fc片段、毒素细胞结合结构域、细胞因子、小肽和抗体的多核苷酸序列组成的组。
26.权利要求25所述的表达载体，其中所述的多核苷酸序列编码假单胞菌外毒素细胞结合结构域。
27.权利要求25所述的表达载体，其中所述的多核苷酸序列编码白细胞介素5或白细胞介素6。
28.权利要求1所述的表达载体，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种同源多核苷酸序列或异源多核苷酸序列。
29.权利要求28所述的表达载体，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种同源Fc片段。
30.权利要求28所述的表达载体，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种异源Fc片段。
31.权利要求1所述的表达载体，其中所述的表达载体进一步包括有利于将所述表达载体整合入细胞基因组的整合信号序列。
32.权利要求31所述的表达载体，其中所述的整合信号序列是一种病毒长末端重复序列或腺伴随病毒ITR序列。
33.权利要求1所述的表达载体，其中所述的载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物载体组成的组。
34.一种包括表达载体的转化的细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
35.权利要求34所述的细胞，其中所述的细胞是原核细胞或真核细胞。
36.权利要求35所述的细胞，其中所述的真核细胞选自由酵母、昆虫和哺乳动物组成的真核细胞的组。
37.一种包括信号序列、抗原和细胞结合元件的融合蛋白。
38.一种包括表达载体的疫苗，其中所述的表达载体包括编码启动子序列的多核苷酸、编码分泌信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和编码聚腺苷酸化序列的多核苷酸，其中所述的序列均是可操作地连接的。
39.一种包括抗原呈递细胞的疫苗，其中在体外用权利要求37所述的融合蛋白转导所述的抗原呈递细胞。
40.一种包括抗原呈递细胞的疫苗，其中在体外用权利要求1所述的表达载体转导所述的抗原呈递细胞。
41.一种包括权利要求37所述的融合蛋白的疫苗。
42.一种表达载体，它至少包括编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸和编码细胞结合元件的多核苷酸。
43.一种引起针对抗原的免疫反应的方法，该方法包括下列步骤：
将表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码所述抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和
在下列条件下表达所述的载体以便产生所述的抗原：其中所述的抗原分泌自所述细胞；所述的分泌抗原被胞吞入所述细胞；在所述细胞内加工所述的胞吞抗原；和将所述加工的抗原呈递给细胞表面蛋白，从而引起T-细胞介导的免疫反应。
44.权利要求43所述的方法，其中将所加工的抗原呈递给选自MHC-I、MHC-II或B-细胞受体组成的组的细胞表面蛋白。
45.权利要求43所述的方法，其中所述的抗原由第一种细胞分泌并由第二种细胞摄入。
46.权利要求45所述的方法，其中所述的第一种细胞和第二种细胞是抗原呈递细胞。
47.权利要求45所述的方法，其中所述的第一种细胞是非抗原呈递细胞且所述的第二种细胞是抗原呈递细胞。
48.权利要求47所述的方法，其中所述的第一种细胞是肌细胞。
49.一种引起针对抗原的免疫反应的方法，该方法包括通过非肠道途径直接给哺乳动物施用权利要求1所述的表达载体的步骤。
50.权利要求43所述的方法，其中所述的多核苷酸启动子序列选自组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子组成的组。
51.权利要求50所述的方法，其中所述的组成型启动子选自下列启动子组成的组：猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复启动子、莫洛尼氏病毒启动子、鸟白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人肌酸启动子。
52.权利要求50所述的方法，其中所述的诱导型启动子选自金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子组成的组。
53.权利要求50所述的表达载体，其中所述的组织特异性启动子选自HER-2启动子和与PSA相关联的启动子组成的组。
54.权利要求43所述的方法，其中所述的编码信号序列的多核苷酸选自乙型肝炎病毒e抗原信号序列、免疫球蛋白重链前导序列和细胞因子前导序列组成的组。
55.权利要求43所述的方法，其中所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自至少一种与疾病相关的多核苷酸序列，其中所述的疾病选自感染性疾病、癌症和自身免疫病组成的组。
56.权利要求55所述的方法，其中所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自至少一种来自感染性疾病的多核苷酸序列，其中所述的感染性疾病是由选自病毒、细菌、真菌和原生动物组成的组的致病微生物引起的。
57.权利要求56所述的方法，其中所述的编码抗原的多核苷酸是一种多核苷酸序列，它选自至少一种来自病毒基因的多核苷酸序列，其中所述的病毒基因选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和疱疹病毒组成的组。
58.权利要求57所述的方法，其中所述的乙型肝炎病毒是乙型肝炎病毒e抗原或乙型肝炎病毒核心抗原。
59.权利要求57所述的方法，其中所述的人免疫缺陷病毒是gp160或gp120。
60.权利要求57所述的方法，其中所述的乳头瘤病毒是乳头瘤病毒E7或乳头瘤病毒E6。
61.权利要求57所述的方法，其中所述的疱疹病毒选自下列病毒组成的组：单纯疱疹1型病毒、单纯疱疹2型病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹6型病毒、人疱疹7型病毒和人疱疹8型病毒。
62.权利要求55所述的方法，其中所述的疾病选自乳腺癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌和前列腺癌组成的组。
63.权利要求55所述的方法，其中所述的疾病选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病和局限性回肠炎。
64.权利要求43所述的方法，其中所述的编码抗原的多核苷酸编码Fc抗体片段或白细胞介素。
65.权利要求64所述的方法，其中所述的多核苷酸序列编码白细胞介素5。
66.权利要求43所述的方法，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种与细胞表面受体结合的配体的多核苷酸序列。
67.权利要求66所述的方法，其中所述的配体的多核苷酸序列选自编码Fc片段、毒素细胞结合结构域、细胞因子、小肽和抗体的多核苷酸序列组成的组。
68.权利要求67所述的方法，其中所述的多核苷酸序列编码假单胞菌外毒素细胞结合结构域。
69.权利要求67所述的方法，其中所述的多核苷酸序列编码白细胞介素5或白细胞介素6。
70.权利要求43所述的方法，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种同源多核苷酸序列或异源多核苷酸序列。
71.权利要求70所述的方法，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种同源Fc片段。
72.权利要求70所述的方法，其中所述的编码细胞结合元件的多核苷酸是一种异源Fc片段。
73.权利要求43所述的方法，其中所述的表达载体进一步包括有利于将所述表达载体整合入细胞基因组的整合信号序列。
74.权利要求73所述的方法，其中所述的整合信号序列是一种病毒长末端重复序列或腺伴随病毒ITR序列。
75.权利要求43所述的方法，其中所述的载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物载体组成的组。
76.一种鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能够激活CD4+辅助T细胞，所述的方法包括下列步骤：
将表达载体导入抗原呈递细胞以便产生转导的抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；
使所述的转导的抗原呈递细胞与原初T-细胞或致敏的T-细胞接触；和
评价是任何的原初T-细胞还是致敏的T细胞在与所述转导的抗原呈递细胞接触时被激活，其中所述T-细胞的激活表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段。
77.权利要求76所述的方法，其中所述的编码测试多肽的多核苷酸是一种分离自肿瘤细胞系的cDNA文库。
78.权利要求76所述的方法，其中所述的编码测试多肽的多核苷酸选自由病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组组成的cDNA文库的组。
79.一种鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能够在体内引起免疫反应，所述的方法包括下列步骤：
将表达载体导入抗原呈递细胞以便产生转导的抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；
通过非肠道途径给哺乳动物施用所述的转导的抗原呈递细胞；
收集来自脾细胞中的T-细胞并与树突细胞一起共培养；和
评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的多核苷酸序列或其片段。
80.权利要求79所述的方法，其中所述的编码测试多肽的多核苷酸是一种分离自肿瘤细胞系的cDNA文库。
81.权利要求79所述的方法，其中所述的编码测试多肽的多核苷酸选自由病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组组成的cDNA文库的组。
82.一种鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，所述的表位能够在体内引起免疫反应，所述的方法包括下列步骤：
通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；
收集来自脾细胞中的T-细胞并与树突细胞一起共培养；和
评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的多核苷酸或其片段。
83.权利要求82所述的方法，其中所述的编码测试多肽的多核苷酸是一种分离自肿瘤细胞系的cDNA文库。
84.权利要求82所述的方法，其中所述的编码测试多肽的多核苷酸选自由病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组和人基因组组成的cDNA文库的组。
85.一种治疗癌症的方法，该方法包括下列步骤：
鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体转导抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；和
通过非肠道途径给哺乳动物施用抗原呈递细胞，其中用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
86.一种治疗癌症的方法，该方法包括下列步骤：
鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体转导抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；和
通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体至少包括编码所述测试多肽的多核苷酸和一种编码细胞结合元件的多核苷酸。
87.一种治疗病毒性感染的方法，该方法包括下列步骤：
鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体转导抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；和
通过非肠道途径给哺乳动物施用抗原呈递细胞，其中用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
88.一种治疗病毒性感染的方法，该方法包括下列步骤：
鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体转导抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；和
通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体至少包括编码所述测试多肽的多核苷酸和一种编码细胞结合元件的多核苷酸。
89.一种治疗自身免疫病的方法，该方法包括下列步骤：
鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体转导抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；和
通过非肠道途径给哺乳动物施用抗原呈递细胞，其中用所述的测试多肽转导所述的抗原呈递细胞。
90.一种治疗自身免疫病的方法，该方法包括下列步骤：
鉴定编码至少一种结合在MHC-II上的表位的测试多肽，其中在用一种表达载体转导抗原呈递细胞的条件下鉴定所述多肽，所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码测试多肽的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并评价T-细胞的激活情况，其中所述T-细胞的激活表明所述编码测试多肽的多核苷酸是一种能够激活CD4+辅助T细胞的基因或其片段；和
通过非肠道途径给哺乳动物施用一种表达载体，其中所述的表达载体包括至少一种编码所述测试多肽的多核苷酸和一种编码细胞结合元件的多核苷酸。
91.一种生产用于对哺乳动物进行免疫接种的疫苗的方法，该方法包括下列步骤：
通过将一种表达载体导入所述抗原呈递细胞来转导抗原呈递细胞以便产生转导的抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和
在所述抗原分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生抗原。
92.一种权利要求41所述疫苗的给药方法，其中在对哺乳动物给药前在体外用所述疫苗转导抗原呈递细胞。
93.一种权利要求38所述疫苗的给药方法，其中通过非肠道途径给予所述疫苗。
94.一种权利要求41所述疫苗的给药方法，其中在对哺乳动物给药前在体内用所述疫苗转导抗原呈递细胞。
95.一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物施用细胞因子表达载体和retrogen表达载体的步骤，其中所述的retrogen表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
96.权利要求95所述的方法，其中所述的细胞因子表达载体含有用于GM-CSF的序列。
97.权利要求95所述的方法，其中所述的细胞因子表达载体含有用于IL-2的序列。
98.一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种表达载体的步骤，其中所述的表达载体包括在一种启动子的转录控制下的编码细胞因子蛋白的多核苷酸序列和编码融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的融合蛋白包括信号序列、抗原和细胞结合元件。
99.权利要求98所述的方法，其中编码细胞因子蛋白的多核苷酸序列和编码融合蛋白的多核苷酸序列均在独立的转录控制下，且其中编码细胞因子蛋白的多核苷酸序列和编码融合蛋白的多核苷酸序列以串联方式位于一种表达载体中。
100.一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物施用两种不同的retrogen表达载体的步骤，其中第一种retrogen表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码第一种抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列，而第二种retrogen表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码第二种抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
101.一种诱发免疫反应的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种表达载体的步骤，其中所述的表达载体包括在一种启动子的转录控制下的编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的第一种融合蛋白包括第一种信号序列、第一种抗原和第一种细胞结合元件且所述的第二种融合蛋白包括第二种信号序列、第二种抗原和第二种细胞结合元件。
102.权利要求101所述的方法，其中所述的第一种和第二种信号序列是相同的信号序列，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的第一种和第二种细胞结合元件是Fc片段。
103.权利要求101所述的方法，其中所述的第一种和第二种信号序列是相同的信号序列，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的第一种和第二种细胞结合元件是相同的细胞结合元件。
104.权利要求101所述的方法，其中所述的第一种和第二种信号序列是不同的信号序列，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的第一种和第二种细胞结合元件是相同的细胞结合元件。
105.权利要求101所述的方法，其中所述的第一种和第二种信号序列是相同的信号序列，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的第一种和第二种细胞结合元件是不同的细胞结合元件。
106.权利要求101所述的方法，其中所述的第一种和第二种信号序列是不同的信号序列，第一种和第二种抗原是不同的抗原且所述的第一种和第二种细胞结合元件是不同的细胞结合元件。
107.权利要求101所述的方法，其中编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列均在独立的转录控制下，且其中编码第一种融合蛋白的多核苷酸序列和编码第二种融合蛋白的多核苷酸序列以串联方式位于一种表达载体中。
108.一种同时诱导CD4+和CD8+T-细胞的方法，该方法包括给予一种融合蛋白的步骤，其中所述的蛋白质包括与细胞结合元件融合的MHC-I和MHC-II表位。
109.一种生产融合蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
通过将一种表达载体导入所述抗原呈递细胞来转导抗原呈递细胞以便产生转导的抗原呈递细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码抗原的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和
在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生融合蛋白。
110.一种融合蛋白的给药方法，该方法包括在对哺乳动物给药前在体外用所述融合蛋白转导抗原呈递细胞的步骤。
111.一种融合蛋白的给药方法，该方法包括通过非肠道途径给哺乳动物施用所述融合蛋白的步骤。
112.一种分泌胞内蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
将一种表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码胞内蛋白的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和
在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生融合蛋白。
113.权利要求112所述的方法，其中所述编码胞内蛋白的多核苷酸的一定区被截短以便增加分泌功效。
114.权利要求112所述的方法，其中使所述编码胞内蛋白的多核苷酸的一定区发生突变以便增加分泌功效。
115.权利要求112所述的方法，其中所述编码胞内蛋白的多核苷酸是HPV 16 E7。
116.一种分泌膜蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
将一种表达载体导入细胞，其中所述的表达载体包括均为可操作地连接的多核苷酸启动子序列、编码信号序列的多核苷酸、编码膜蛋白的多核苷酸、编码细胞结合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和
在所述融合蛋白分泌自所述细胞的条件下表达所述载体以便产生融合蛋白。
117.权利要求116所述的方法，其中所述编码膜蛋白的多核苷酸的一定区被截短以便增加分泌功效。
118.权利要求116所述的方法，其中使所述编码膜蛋白的多核苷酸的一定区发生突变以便增加分泌功效。
119.权利要求12所述的方法，其中所述编码膜蛋白的多核苷酸是EBV核心抗原1。
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