DE10156863B4 - Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen - Google Patents

Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen Download PDF

Info

Publication number
DE10156863B4
DE10156863B4 DE2001156863 DE10156863A DE10156863B4 DE 10156863 B4 DE10156863 B4 DE 10156863B4 DE 2001156863 DE2001156863 DE 2001156863 DE 10156863 A DE10156863 A DE 10156863A DE 10156863 B4 DE10156863 B4 DE 10156863B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cells
promoter
apc
cell
epitope
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE2001156863
Other languages
English (en)
Other versions
DE10156863A1 (de
Inventor
Ludwig Deml
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LOPHIUS BIOSCIENCES GMBH, 93053 REGENSBURG, DE
Original Assignee
Deml, Ludwig, Dr.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deml, Ludwig, Dr. filed Critical Deml, Ludwig, Dr.
Priority claimed from DE10164819A external-priority patent/DE10164819A1/de
Priority to DE10164819A priority Critical patent/DE10164819A1/de
Priority to DE2001156863 priority patent/DE10156863B4/de
Priority to US10/495,843 priority patent/US7659058B2/en
Priority to PCT/DE2002/004270 priority patent/WO2003046212A2/de
Priority to DE50210523T priority patent/DE50210523D1/de
Priority to AT02796502T priority patent/ATE367444T1/de
Priority to EP02796502A priority patent/EP1448781B1/de
Priority to AU2002361929A priority patent/AU2002361929A1/en
Publication of DE10156863A1 publication Critical patent/DE10156863A1/de
Publication of DE10156863B4 publication Critical patent/DE10156863B4/de
Application granted granted Critical
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Abstract

Gentransfervektor, enthaltend einen spezifisch in antigenpräsentierenden Zellen durch den epitop-spezifischen Kontakt mit einer T-Zelle induzierbaren ersten Promotor, eine mit diesem ersten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure kodierend ein Markergen, einen in antigenpräsentierenden Zellen konstitutiven zweiten Promotor, und eine mit diesem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen und von Zielepitopen reaktiver T-Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, umfassend einen spezifisch in antigenpräsentierenden Zellen durch den epitop-spezifischen Kontakt mit einer T-Zelle induzierbaren ersten Promotor, eine mit diesem ersten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure kodierend ein Markergen, einen in antigenpräsentierenden Zellen konstitutiven zweiten Promotor, und eine mit diesem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner antigenpräsentierende Zellen, transduziert mit den erfindungsgemäßen Vektoren.
  • Der erworbene Ast des Immunsystems besteht aus einer humoralen (Immunglobuline) und einer zellulären Immunabwehr. Zelluläre und erregerspezifische Polypeptide werden von Zellen durch spezifische Spaltung aufgearbeitet und Bruchstücke (Epitope) davon zusammen mit MHC-Molekülen der Klassen-I und/oder -II auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APC) präsentiert. T-Zellen erkennen mittels ihres T-Zellrezeptors spezifisch Epitope, die im Komplex mit körpereigenen MHC-Proteinen präsentiert werden, und setzen eine Immunreaktion in Gang.
  • T-Zellen können anhand spezifischer Oberflächenproteine in verschiedene Effektorpopulationen untergliedert werden. CD4+ T-Helferzellen haben eine zentrale Bedeutung bei der Steuerung der Immunabwehr. Nach einer spezifischen Erkennung von Epitopen, die ihnen auf der Oberfläche von APC zusammen mit MHC-Proteinen präsentiert werden, steuern sie durch die Sekretion unterschiedlicher Botenstoffe (beispielsweise Zytokine) die Produktion von Antikörpern durch B-Zellen (humoraler Ast der Immunantwort) und die Aktivierung CD8+ zytotoxischer T-Zellen (CTL) (zellulärer Ast der Immunantwort). Die Bedeutung von CD8+ CTL liegt in der Erkennung und Zerstörung entarteter und von Mikroorganismen oder Parasiten befallener Zellen und Gewebe. T-Zellen stellen somit einen bedeutenden Schutzmechanismus des erworbenen Immunsystems zur Verhinderung und Kontrolle mikrobiell, insbesondere virusbedingter Erkrankungen und zur Erkennung und Zerstörung entarteter körpereigener Zellen dar.
  • Professionelle APC, wie dendritische Zellen, Monozyten, Makrophagen, aber auch nicht professionelle APC wie B-Zellen spielen sowohl bei der Auslösung einer T-Zell-Antwort gegen körperfremde Immunogene als auch bei der Induktion einer T-Zell-Toleranz gegen körpereigene Gewebe eine zentrale Rolle. Die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen erfolgt durch das gleichzeitige Auslösen von zwei Signalen. Das erste Signal wird durch den T-Zellrezeptor, der ein Epitop im Zusammenhang mit MHC auf der Oberfläche von APC erkennt, in die T-Zelle geleitet. Das zweite kostimulatorische Signal wird durch die spezifische Interaktion der kostimulatorischen Moleküle B7.1 (CD80) oder B7.2 (CD86) auf der APC mit dem zugehörigen Rezeptor (CD28) auf der Oberfläche der T-Zelle vermittelt. In Abwesenheit des kostimulatorischen Signals wird die T-Zelle anerg. Anergie beschreibt einen Zustand, in dem die T-Zellen sich nicht vermehren und nicht auf ein Antigen reagieren.
  • Der Aktivierungsgrad einer APC und die Beschaffenheit einer Fremdsubstanz entscheiden maßgeblich über das Profil der induzierten Immunantwort. So beeinflussen die Konzentration und biochemischen Eigenschaften einer Fremdsubstanz sowie die An- oder Abwesenheit von immunodulatorischen Substanzen (insbesondere bakterielle Lipopolysaccharide (LPS), bakterielle Nuk1einsäuren (CpG Motive) und körperfremde Polypeptide z.B. bakterielles Flagellin) maßgeblich, ob der zelluläre (Th-1-Typ, vermittelte Immunität) oder humorale Ast (Th-2-Typ, vermittelte Immunantwort) des Immunsystems aktiviert wird oder ob die Immunantwort tolerogen verläuft.
  • Zur Verwendung unerwünschter Immunreaktionen gegen körpereigene Proteine und Gewebe werden autoreaktive T-Zellen frühzeitig eliminiert (klonale Deletion) oder inaktiviert (Anergie). Die Folge ist eine antigenspezifische Toleranz gegen körpereigene Strukturen (Polypeptide, Zellen, Gewebe und Organe). Bei Autoimmunerkrankungen sind diese Schutzmechanismen gestört oder nur unzureichend ausgeprägt. Die Ursachen, die der Entstehung von Autoimmunerkrankungen zugrunde liegen, sind bislang nur wenig verstanden. Möglicherweise werden körpereigene Strukturen aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit Erreger- und Fremdgewebespezifischen Polypeptiden fälschlicherweise als fremd erkannt und von fehlgeleiteten Effektoren des erworbenen Immunsystems (T-Zellen und/oder Antikörpern) geschädigt oder sogar zerstört.
  • Daneben kommt es im Zusammenhang mit chronisch persistierenden Virusinfektionen nicht selten zu entzündlichen Prozessen, die zum Teil lebenswichtige Organe wie die Leber (virale Hepatiden) betreffen, obwohl die Immunantwort primär gegen erregerspezifische Strukturen gerichtet ist. In solchen Fällen spricht man von Immunpathogenese, da der Schaden und die Krankheitssymptome primär durch das eigene Immunsystem und nicht durch den Erreger verursacht werden.
  • Ähnliche Immunreaktionen liegen auch der Abstoßung von transplantierten Geweben und Organen zugrunde. Hier wird eine Kombination aus fremden MHC-Proteinen des Spenders und körpereigenen Epitopen von T-Zellen des Empfängers als fremd erkannt und angegriffen.
  • Im Unterschied zu den oben genannten Erkrankungen ist bei Tumorerkrankungen oftmals eine unzureichende Immunerkennung zu beobachten. Häufig werden tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) nachgewiesen, die den Tumor in begrenztem Umfang angreifen, deren Spezifität auf molekularer Ebene aber meist nicht bekannt ist. Warum diese TILs in vivo nicht in der Lage sind, den Tumor zu eliminieren, ist unklar. Die Konzentration dieser TILs im Blut, die in der Regel sehr gering ist und oftmals sogar unter der Nachweisgrenze liegt, ist vermutlich ein entscheidender Faktor. Zur Stimulation und Steigerung einer solchen tumorspezifischen Immunantwort wird heute versucht, es vivo (außerhalb des Körpers) TILs mit Tumormaterial zu stimulieren und in den Körper zurückzuführen. In anderen Ansätzen wird Tumorbiopsiematerial ex vivo mittels unterschiedlicher Antigene markiert und nach Bestrahlung wieder in den Körper zurückgegeben. Die Überlegung hierbei ist, den Tumor aufgrund der neuen Antigene für das Immunsystem auffällig zu machen und dabei durch die Zerstörung der Tumorzellen in vivo auch TILs gegen natürlich bedeutsame tumorassoziierte Antigene zu stimulieren. Diese Ansätze sind jedoch nur sehr beschränkt wirksam, da die Tumorzellen kaum eine Immunreaktion stimulieren können. Die Ursachen liegen einerseits in der geringen Konzentration spezifischer Antigene. Andererseits führt das Fehlen kostimulatorischer Moleküle oder MHC Moleküle zu einer ineffizienten Präsentation.
  • Weiterhin spielt die zelluläre Immunantwort bei der Kontrolle einer Vielzahl von viralen Infekten, beispielsweise bei HIV Infektionen oder herpesviralen Infekten eine zentrale Rolle. Unter Berücksichtigung der Bedeutung der zellulären Immunantwort zur Kontrolle mikrobieller Infekte und Tumore werden derzeit vielfältige neue Impfstrategien zur Induktion antigenspezqifischer T-Zellen getestet. Diese beinhalten den Einsatz von lebend attenuierten Viren und Bakterien, rekombinanten Lebendimpfstoffen (auf der Basis verschiedener rekombinanter Bakterien und Viren), partikulären Immunogenen, (Lipo-) Proteinen, (Lipo-) Peptiden und DNS-Impfstoffen. Zudem werden verschiedene Verabreichungsformen dieser Impfstoffgruppen, beispielsweise die Kombination unterschiedlicher Impfstoffe in "Prime-Boost" Verfahren und die kombinierte Gabe mit Adjuvanzien und Trägersubstanzen bezüglich ihrer Eignung zur Induktion einer T-Zellantwort hin getestet. Die meisten der genannten Impfvektoren sind im Prinzip geeignet, neben einer CD4+ T-Helfer Zellantwort auch eine CD8+ T-zellvermittelte, zytotoxische Immunantwort hervorzurufen. Die Effizienz dieser Verfahren zur gezielten Induktion einer effizienten CD8+ T-Zellantwort ist jedoch bislang dadurch limitiert, dass bei sehr vielen, durch Mikroorganismen induzierten Erkrankungen und Tumoren die Zielepitope protektiver T-Zellen nicht, oder nur in geringer Zahl bekannt sind. Das gezielte Einbringen rational ausgewählter T-Zellepitope würde die Wirksamkeit und Effizienz der zuvor beschriebenen Impfvektoren erheblich steigern.
  • Insbesondere bei Impfstoffen und Impfvektoren mit einer begrenzten Kapazität zur Aufnahme von Fremdgenen (insbesondere DNS-Impfstoffe, Replikons, rekombinante bakterielle und virale Vektoren) oder Fremdepitopen (insbesondere Impfstoffen auf der Basis von Peptiden, Polypeptiden, Lipoproteinen und chimären partikulären Immunogenen) ist die Kenntnis relevanter Zielstrukturen der T-Zellantwort von entscheidender Bedeutung. Bei der ungezielten Expression einer großen Zahl von Epitopen kann es zudem durch (zum größten Teil unbekannte) Epitope zu einer Ablenkung der Immunantwort auf nicht relevante Ziele kommen.
  • Mit den derzeit verfügbaren immunologischen Techniken zur Identifizierung von Zielepitopen reaktiver T-Zellen werden APC in solcher Weise verändert, dass sie zuvor ausgewählte Epitope von Polypeptiden auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die veränderten APC werden mit autologen T-Zellen, oder solchen, die in MHC-Molekülen mit den T-Zellen übereinstimmen, die die gesuchten Epitope möglicherweise erkennen, zusammen inkubiert und spezifische Reaktionen der T-Zellen (beispielsweise Proliferation, Zytokinausschüttung oder zytotoxische Aktivität) nach einer spezifischen Erkennung von Epitop/MHC Komplexen auf der Oberfläche von APC gemessen.
  • APC werden hierzu beispielsweise mit Peptiden oder Gemischen unterschiedlicher Peptide, die potenzielle oder bereits bekannte Zielepitope reaktiver T-Zellen beinhalten, inkubiert. Bei diesem experimentellen Ansatz werden Peptide direkt auf membranständige MHC-Proteine geladen. Alternativ können für Polypeptide, die potenzielle Zielepitope reaktiver T-Zellen beinhalten, kodierende Polynukleotide mittels Transduktion verschiedener rekombinanter Transfersysteme (Plasmide, nicht virale oder virale Vektoren) in APC eingebracht und die Polypeptide in den APC exprimiert werden. Diese werden dann im Zytoplasma der APC aufbereitet, auf MHC Proteine der Klassen I und II geladen und mit diesen zusammen auf der Oberfläche der APC präsentiert.
  • In Cui, Y. et al., Blood 98, Nr 11, Part 1, 2001, pp 214a wird ein Verfahren zur Transgenexpression nach Transformation von Stammzellen und ex vivo Differenzierung von APC und Dendritischen Zellen (DC) mittels selbstinaktivierender lentiviraler Gentransfervektoren unter Verwendung eines zelltyp-spezifischen humanen MHC Klasse II Promotors beschrieben. Dabei werden humane CD34-positive Stammzellen oder murine Zellen aus dem Knochenmark ex vivo mit selbstinaktivierenden Lentiviralen Gentransfervektoren behandelt, welche ein Transgen unter der Kontrolle eines in APC aktiven, zelltypspezifischen Promotors (MHC Klasse II Promotor) exprimieren.
  • Takayama, T. et al., Transplantation 68 (12), 1999, 1903-9 beschreibt die Herstellung und Verwendung von retroviralen Gentransfervektoren, welche gleichzeitig ein immunsuppressives Molekül, virales Interleukin IL-10 (vIL-10), und ein Markerprotein (EGFP) exprimieren. Mit diesen retroviralen Gentransfervektoren können dendritische Zellen (DC) mit einer relativ geringen Effizienz von etwa 20% transfiziert werden. Das gleichzeitige Einbringen und die dadurch induzierte gleichzeitige Expression des biologisch aktiven Gens (vIL10) und eines Markers (EGFP) mittels einer Genfähre ermöglicht die Gewinnung hochreiner Populationen modifizierten DC mittels der FACSSort Technologie für therapeutische Zwecke, beispielsweise zur Induktion einer Toleranz antigenspezifischer T-Zellen.
  • In WO 00/67761 wird ein Verfahren zur Transfektion von Expressionsvektoren, enthaltend funktionell verknüpfte Polynukleotide für eine Promotorsequenz, ein Signalpeptid, ein Polyprotein, einen Liganden, welcher die Bindung des exprimierten Polyproteins an einen Zelloberflächenrezeptor vermittelt, und eine Polyadenylierungssequenz in Zellen beschrieben, welche eine Expression und Sekretion der gewünschten Polypeptide in der Art erlauben, dass die von anderen Zellen, insbesondere antigenpräsentierenden Zellen (APC) mittels des MHC-Klasse II Prozessierungs- und Präsentationsweges aufgenommen, verarbeitet und auf MHC Proteinen präsentiert werden. Dieses Verfahren findet Verwendung zur Stimulation von antigenspezifischen Immunantworten und zur Identifizierung von MHC-Klasse II restringierten Epitopen und zur Stimulatierung von T-Zellantworten.
  • In WO 97/26325 wird ein Verfahren zum gezielten Einbringen von Molekülen mit antiinflammatorischen Eigenschaften, vorzugsweise sezernierten Zytokinen, Zytokinblockern oder Apoptose-induzierenden Molekülen in inflammatorische Zellen, vorzugsweise T-Zellen und dendritische Zellen beschrieben. Der gezielte Gentransfer in die gewünschten Zellpopulationen erfolgt entweder durch einen ex vivo Gentransfer oder unter Verwendung von pseudotypisierten retroviralen Gentransfer Vektoren, welche eine Spezifität für inflammatorische Zellen aufweisen. Die gezielte Produktion der antiinflammatorischen Moleküle am gewünschten Wirkort wird durch Verwendung anschaltbarer Promotoren erzielt.
  • Alternativ kann eine Epitop-Beladung von MHC-Proteinen durch eine Inkubation von APC mit Polypeptiden, (Lipo-) Proteinen, oder (Lipo-) Proteinaggregaten erzielt werden. Zur Steigerung der Aufnahme dieser Polypeptide oder Polypeptidkomplexe können diese einer Behandlung mit physikalischen (Hitzedenaturierung) oder chemischen Verfahren (Harnstoff- oder Säurebehandlung) unterzogen werden. Weiterhin steigert die Fusion der Polypeptide mit CpGhaltigen Nukleinsäuren oder Polypeptiden des SV40 T-Antigens deren Aufnahme, Prozessierung und Epitoppräsentation. Polypeptide, die möglicherweise antigene Epitope tragen, werden zuvor entweder auf biochemischem Wege aus Geweben, Zellen, Mikroorganismen oder sonstigem biologischem Material aufgereinigt. Zudem können Polypeptide auf rekombinantem Wege beispielsweise mittels gentechnisch veränderter Zellen, Hefen, Bakterien oder Viren produziert und aus diesen aufgereinigt werden. Weiterhin eignet sich auch die Inkubation von APC mit vitalen oder abgetöteten polypeptidproduzierenden Bakterien, Hefen, Säuger- und Insektenzellen oder deren Lysaten zum Einbringen dieser Polypeptide in den MHC-Klasse-I und -II Antigenprozessierungs- und Präsentationsweg. Anschließend werden die in dieser Art vorbehandelten APC mit T-Zellpopulationen kokultiviert. Die Identifizierung von Polypeptiden, welche Zielepitope reaktiver T-Zellen enthalten, erfolgt durch die Bestimmung charakteristischer Reaktionen reaktiver T-Zellen (beispielsweise Proliferation, Zytokinausschüttung oder zytotoxische Aktivität) infolge einer spezifischen Erkennung von Epitop/MHC Komplexen auf der Oberfläche von APC. Ähnliches trifft auch zu für die Bestimmung von tumorassoziierten Antigenen, die durch tumorinfiltrierende Lymphozyten erkannt werden.
  • Alternativ zu einzelnen zuvor ausgewählten Polypeptiden kann theoretisch auch eine große Zahl von Polypeptiden simultan getestet werden. Zu diesem Zweck werden mittels unterschiedlicher
  • nichtviraler- und viraler Transfersysteme Polynukleotide einer Genbank, die beispielsweise für alle Polypetide einer Zelle kodiert, in APC eingebracht. Die modifizierten APC werden wiederum mit T-Zellen inkubiert und in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten verteilt. Die Identifizierung von Zielepitopen oder Polypeptiden, welche Zielepitope reaktiver T-Zellen enthalten, erfolgt wiederum durch Bestimmung einer spezifischen Reaktion der T-Zellen. Da es sich um Gemische unterschiedlicher APC, die verschiedene Epitope präsentieren, handelt, werden die APC aus einer Vertiefung mit T-Zellerkennung erneut auf verschiedene Vertiefungen einer weiteren Mikrotiterplatte verteilt (Lumting Dilution) und erneut auf eine Erkennung durch spezifische T-Zellen getestet. Dieses Verdünungs-Verfahren wird so lange wiederholt, bis statistisch in jeder Vertiefung mit meßbarer T-Zellreaktion nur noch Abkömmlinge einer Epitoppräsentierenden APC vorhanden sind.
  • Keines der bislang verfügbaren Verfahren zur Epitopsuche ist jedoch geeignet, um mit einem tragbaren Kosten- und Arbeitsaufwand die Zielepitope protektiver oder autoaggressiver T-Zellen in einer für die vielfältigen, dringend benötigten prophylaktischen, therapeutischen und diagnostischen Anwendungen erforderlichen Geschwindigkeit und Vollständigkeit zu bestimmen. Die Verwendung der oben genannten Verfahren zur schnellen und umfassenden Bestimmung von T-Zellepitopen scheitert in erster Linie an den nachstehend aufgeführten Problemen.
  • Die Peptidbeladung von membranständigen MHC-Proteinen auf APC stellt zwar eine sehr effiziente Methode zur Stimulation von T-Zellen dar; jedoch besteht die erhebliche Einschränkungen, dass mit dieser Methode nur bekannte Polypeptidsequenzen ausgetestet werden können. Die selbe Limitation besteht auch für die Verfahren, welche auf der Inkubation der APC mit gereinigten Polypeptiden, (Lipo-) Proteinen, (Lipo-) Proteinaggregaten, Zelllysaten oder apoptotischen, Polypeptid-produzierenden Zellen basieren. Verfahren der Transformation von APC mit Polynukleotiden, die für diese Polypeptide kodieren, besitzen die selben Einschränkungen. Diese Beschränkung auf wenige bekannte Epitope oder Polypeptide kann aufgrund der Komplexität der biologischen Nachweissysteme nicht durch eine Erhöhung der Zahl an getesteten Polynukleotiden, Polypeptiden oder Zelllysaten umgangen werden. So erfordert beispielsweise die exakte Untersuchung der T-Zell-Erkennung eines einzigen Proteins mittlerer Größe von 20-40 kDa (etwa 200 bis 400 Aminosäuren) die Synthese und Austestung von mehr als 50 überlappenden Peptiden. Nach neuesten Schätzungen auf der Grundlage von Ergebnissen des Humanen Genom-Projektes zur Aufklärung des menschlichen Genoms beträgt die Gesamtzahl der menschlichen Gene etwa 40,000. Die Gesamtzahl an spezifisch in einer differenzierten Zelle exprimierten Proteinen, welche alle putative Zielepitope reaktiver T-Zellen enthalten können, ist somit deutlich zu hoch, um mit den bislang verfügbaren molekularbiologischen bzw. biochemischen Methoden umfassend auf die Anwesenheit von T-Zellepitopen hin untersucht werden zu können.
  • Derzeit verfügbare Screening-Verfahren von Genbanken zur Suche nach T-Zellepitopen haben ebenfalls zwei entscheidende Einschränkungen. Aufgrund des sehr hohen zeitlichen Aufwands dieser Untersuchungen von mehreren Wochen und der begrenzten Lebensdauer der modifizierten APC und der T-Zellen in Kultur, können diese Untersuchungen in der Regel nicht mit primären APC und T-Zellen durchgeführt werden. Statt dessen erfordern diese Untersuchungen die Herstellung immortalisierter T-Zell- und APC-Populationen. In jedem Fall ist dieser Schritt sehr zeitaufwendig und aufgrund der Notwendigkeit übereinstimmender MHC-Muster in seiner Anwendung limitiert.
  • Durch die Verwendung immortalisierter T-Zelllinien findet zudem eine Reduktion der ursprünglich polyklonalen T-Zell-Population auf oligoklonale T-Zelllinien statt. Selbst bei der Untersuchung tumorinfiltrierender Lymphozyten, in denen einzelne T-Zellklone angereichert sind, müssen diese zum Zwecke der Untersuchung erst subkloniert werden.
  • Die Verwendung willkürlich ausgewählter Peptide und Polypeptide zur T-Zellsuche ist somit aufgrund (i) der hohen Zahl potentieller Ziele einer T-Zellantwort und der MHC-Restriktion der spezifischen Epitop-Erkennung durch T-Zellen sowie (ii) dem extrem hohen Kosten- und Zeitaufwand zur Herstellung und Reinigung von Polypeptiden und zur Durchführung der bislang verfügbaren Verfahren zur Epitopsuche nicht praktikabel.
  • Zum Nachweis von T-Zellen mit einer bestimmten Antigenspezifität in einer Population von T-Zellen werden die T-Zellen mit APC, die spezifische Epitope präsentieren, inkubiert. Der Nachweis Antigen-spezifischer CD4+ T-Helferzellen erfolgt anschließend entweder durch die Bestimmung der Zytokinsekretion (mittels der FACS, ELISPOT oder ELISA Technik), durch Messung der T-Zellproliferation (mittels der Bestimmung des Einbaus von 3H Tritium in die DNS proliferierender Zellen) nach spezifischer Restimulation der T-Zellen mit Polypeptiden oder Epitopen geeigneter Länge oder dem Nachweis von Epitop-spezifischen T-Zellen mittels der Dimer- oder Tetramer Technologie.
  • Der Nachweis von spezifischen CD8+ T-Zellen (CTL) erfolgt durch eine Kokultivierung dieser Zellen mit Peptid-beladenen APC und die Bestimmung der zytolytischen Aktivität der CD8+ CTL (beispielsweise mittels eines 51Chrom-Freisetzungstest) oder durch die Messung der IFN-γ Sekretion aus CTL (mittels der FACS, ELISPOT oder ELISA Technik). Alternativ können Epitop-spezifische T-Zellen wiederum mittels der Dimer- oder Tetramertechnologie spezifisch nachgewiesen werden.
  • Einer der Nachteile der heute verfügbaren Verfahren zum Nachweis von T-Zellen mit einer bestimmten Antigenspezifität liegt in ihrer geringen Sensitivität. Bisher ist es nur möglich, Reaktion der T-Zellen infolge einer Epitop-spezifischen Erkennung der APC zu messen. Dadurch ist die Sensitivität des Nachweises direkt von der Konzentration der Epitop-spezifischen T-Zellen abhängig. Im Falle des Screenings von Genbanken ist dies ein besonderer Nachteil. Aufgrund der relativ hohen Zahl an Polynukleotidfragmenten in einer Genbank ist die Kopienzahl einzelner Polynukleotidfragmente der Genbank nach Einbringen in die APC sehr gering.
  • Eine Vorstimulation der T-Zellpopulation mit epitoppräsentierenden APC erhöht die Konzentration der Zellen und damit die Empfindlichkeit des Nachweises. Für bestimmte Anwendungen, bei denen zwischen aktivierten und nicht aktivierten T-Zellen unterschieden werden soll, wie beispielsweise dem Nachweis autoagressiver T-Zellen bei Verdacht auf Multiple Sklerose, ist eine in vitro Restimulation jedoch nicht anwendbar.
  • Die Di- und Tetramertechnologien sind neue und elegante Verfahren zum Nachweis Epitopspezifischer CD8+ und CD4+ T-Zellen. Beschränkungen dieser Verfahren für einen breiten Einsatz in der T-Zelldiagnostik sind jedoch in den sehr hohen Kosten für die Herstellung der Di- und Tetramere begründet. Zudem ist die Di- und Tetramertechnologie bislang nur für eine begrenzte Anzahl von MHC Typen, insbesondere für MHC-Klasse I Proteine verfügbar. Zudem erlaubt diese Technik nur den Nachweis definierter Epitop-spezifischer T-Zellen. Die Austestung von T-Zellreaktivitäten gegen multiple Epitope ist mit diesem Verfahren nur mit einen großen Zeit- und Kostenaufwand möglich.
    •
  • Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Identifizierung von Epitopen, die von reaktiven T-Zellen spezifisch erkannt werden, bereitzustellen. Ferner liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verfahren zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen bereitzustellen.
  • Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
  • Die folgenden Figuren dienen der Erläuterung der Erfindung.
  • 1A und B zeigen in einer schematischen Darstellung die Anordnung der Promotoren und funktionell verbundenen Nukleinsäuren in den erfindungsgemäßen Vektoren. (P2) kennzeichnet einen in APC konstitutiv aktiven Promotor, (PP) kennzeichnet beliebige Polypeptide, (P1) kennzeichnet einen in APC durch den epitop-spezifischen Kontakt mit einer T-Zelle induzierbaren Promotor, (M) kennzeichnet einen Marker, RE kennzeichnet Restriktionsschnittstellen, Ori bedeutet Replikationsursprung und R bedeutet Resistenzgen.
  • 2 zeigt das erfindungsgemäße Vektorbackbone pcDNA3(+)OX40LAeGFP. Dieses Plasmidbackbone enthält das Gen für das enhanced green flucorescent Protein (eGFP) als Marker unter der transkriptionellen Kontrolle des in APC nach einer epitopspezifischen Erkennung durch eine T-Zelle induzierbaren OX40-Ligand Promotors.
  • 3 zeigt den erfindungsgemäßen Vektor pcDNTA3(+)OX40LAeGFP-Z. Dieses Plasmid beinhaltet das Gen für das eGFP als Marker unter der Kontrolle des induzierbaren OX40-Ligand Promotors. Zudem beinhaltet dieses Plasmid den kodierenden Bereich des Epstein-Barr Virus BZLF1 Proteins unter der transkriptionellen Kontrolle des in APC konstitutiv aktiven Cytomegalievirus (CMV)-Promotors.
  • 4 zeigt den erfindungsgemäßen Vektor pcDNA3(+)OX40LAeGFP-MBP. Dieses Plasmid beinhaltet das Gen für eGFP als Marker unter der Kontrolle des induzierbaren OX40-Ligand Promotors. Zudem beinhaltet dieses Plasmid den kodierenden Bereich des humanen Myelinbasischen Proteins (MBP) unter der transkriptionellen Kontrolle des in APC konstitutiv aktiven Cytomegalievirus (CMV)-Promotors.
  • 5 zeigt die Nukleinsäuresequenz des mittels PCR amplifizierten humanen OX40 Ligand Promotors (SEQ ID NO:1).
  • Der hier verwendete Begriff "genomisch" bezeichnet die Gesamtheit oder Fragmente des genetischen Materials eines Organismus.
  • Der hier verwendete Begriff "Polynukleotid" bezeichnet die polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, präferentiell Desoxyribonukleotiden (DNS) oder Ribonukleotiden (RNS). Dieser Begriff bezeichnet nur die Primärstruktur des Moleküls. Der Begriff beinhaltet doppel- und einzelsträngige DNS und RNS sowie Antisense-Polynukleotide.
  • Der hier verwendete Begriff "Kontrollsequenzen" bezeichnet Polynukleotidsequenzen, die erforderlich sind für die Expression von kodierenden Polynukleotidsequenzen, mit denen sie verknüpft sind. Kontrollsequenzen befinden sich auf dem Genom von Organismen und regulieren die Transkription von Genen, das heißt die Synthese vom mRNA. Kontrollsequenzen befinden sich auch auf mRNA-Polynukleotiden und regulieren die Translation, das heißt die Synthese von Polypeptiden. Die Eigenschaften derartiger Kontrollsequenzen unterscheiden sich in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; in Prokaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen üblicherweise einen Promotor, eine ribosomale Eintrittsstelle, und eine Transkriptionsterminations-Sequenz; in Eukaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen üblicherweise Promotoren und Transkriptionsterminations-Sequenzen. Der Begriff "Kontrollsequenz" beinhaltet zudem alle Polynukleotide, deren Anwesenheit für die konstitutive oder induzierbare Expression von kodierenden Sequenzen erforderlich sind und schließt zudem zusätzliche Komponenten mit ein, deren Anwesenheit für die Expression eines Polypeptids förderlich ist, wie z.B. Leadersequenzen und die Sequenzen eines Fusionspartners.
  • Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" bezeichnet ein Polymer von Aminosäuren beliebiger Länge. Der Begriff Polypeptid umfasst auch die Begriffe (Ziel-) Epitop, Peptid, Oligopeptid, Protein, Polyprotein, und Aggregate von Polypeptiden. Ebenso sind in diesem Begriff Polypeptide eingeschlossen, die posttranslationelle Modifikationen wie z.B. Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und ähnliche Modifikationen aufweisen. Weiterhin umfasst dieser Begriff zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehrere Analoge von Aminosäuren (z.B. unnatürliche Aminosäuren), Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, sowie anderen Modifikationen, die Stand der Technik sind, aufweisen, unabhängig davon ob sie natürlicherweise vorkommen oder nicht natürlichen Ursprungs sind.
  • Der hier verwendete Begriff "Epitop" bezeichnet den Bereich eines Polypeptides, das antigene Eigenschaften besitzt und beispielsweise als Erkennungsstelle von T-Zellen oder Immunglobulinen dient. Im Sinne dieser Erfindung sind Epitope beispielsweise solche Bereiche von Polypeptiden, die von Immunzellen wie z.B. CD4+ T-Helferzellen, CD8+ zytotoxischen T-Zellen, CD 161+ NKT Zellen oder CD4+CD25+ T-Suppressorzellen erkannt werden. Ein Epitop kann 3 oder mehr Aminosäuren umfassen. Üblicherweise besteht ein Epitop aus mindestens 5 bis 7 Aminosäuren oder, was häufiger ist, aus mindestens 8-11 Aminosäuren, oder aber aus mehr als 11 Aminosäuren, oder aber aus mehr als 20 Aminosäuren, seltener sogar aus mehr als 30 Aminosäuren. Der Begriff "Epitop" umfasst sowohl lineare als auch eine für das Epitop einzigartige räumliche Konformation. Die räumliche Konformation ergibt sich aus der Abfolge der Aminosäuren im Bereich des Epitops.
  • Der hier verwendete Begriff "Mikroorganismus" bezeichnet Viren sowie prokaryotische und eukaryotische Mikroben wie z.B. Archebakterien, Bakterien, Einzeller und Pilze; die letztere Gruppe umfasst beispielsweise Hefen und filamentöse Pilze.
  • Der hier verwendete Begriff "Vektor" oder "Gentransfervektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Organismen und Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung. Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren in Zellen. Vektoren sind beispielsweise Viren, wie Lentiviren, Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Pockenviren, Alphaviren, Bakuloviren, Tollwutviren oder Herpesviren. Vektoren sind beispielsweise auch Bakterien, wie Listerien, Shigellen oder Salmonellen. Vektoren sind beispielsweise auch nackte DNS, wie bakterielle Plasmide und MDGES, von Viren abgeleitete Plasmide, Phagemide, Cosmide, Bakteriophagen oder künstlich hergestellte Nukleinsäuren wie artifizielle Chromosomen. Vektoren besitzen die Fähigkeit, sich in einer Zelle autonom zu vermehren. Der Vektor kann zudem ein zusätzliches Polynukleotid in der Art beinhalten, dass dieses repliziert und/oder exprimiert wird. Vektoren können zudem einen Selektionsmarker enthalten.
  • T-Zellen im Sinne der Erfindung sind Lymphozyten mit regulatorischen oder zytolytischen Eigenschaften, wie beispielsweise CD4+ T-Helferzellen, CD4+CD25+ T-Suppressorzellen, CD161+ NKT Zellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen.
  • Der verwendete Begriff "antigenpräsentierende Zelle" (APC) umfasst Zellen, die in der Lage sind Polypeptide aufzunehmen, zu prozessieren und Bruchstücke dieser Polypeptide (Epitope) dem Immunsystem in Verbindung mit MHC I und MHC II Proteinen zu präsentieren. Insbesondere umfasst der Begriff "antigenpräsentierende Zelle" dendritische Zellen (Langerhanns Zellen), Monozyten, Makrophagen, B-Zellen aber auch vaskuläre endotheliale Zellen und verschiedene epitheliale, mesenchymale Zellen, sowie Microgliazellen des Gehirns.
  • Der Begriff "gekoppelt" bezeichnet eine Anheftung mittels kovalenter Bindung oder starker, nichtkovalenter Wechselwirkungen (z.B. hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoff Brückenbindungen, etc.). Kovalente Bindungen können beispielsweise, Ester, Äther, Phosphoester, Amide, Peptide, Imide, Kohlenstoff-Schwefel- Bindungen, Kohlenstoff-Phophat-Bindungen oder ähnliche Bindungen sein.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Vektoren, umfassend einen spezifisch in APC durch den epitop-spezifischen Kontakt mit einer T-Zelle induzierbaren ersten Promotor (P1), eine mit diesem ersten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure kodierend ein Markergen, einen in APC konstitutiven zweiten Promotor (P2), und eine mit diesem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure. Vorzugsweise enthält der Vektor ferner einen bakteriellen Replikationsursprung (ori) und ein Resistenzgen. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor geeignete Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen enthalten, welche den konstitutiven zweiten Promotor (P2), und die mit diesem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäuresequenz, sowie den bakteriellen Replikationsursprung und die kodierende Sequenz für die bakterielle Resistenz flankieren. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor einen dritten Promotor enthalten, der funktionell mit einem weiteren Markergen verbunden ist.
  • Die für einen Marker kodierenden Polynukleotide stehen unter der Kontrolle eines in APC infolge einer Epitop-spezifischen Erkennung mittels einer T-Zelle induzierbaren Promotors (P1). Im Sinne der Erfindung geeignete Marker sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, leicht detektierbare Polypeptide oder Polypeptidfragmente sowie beliebig modifizierte Abkömmlinge davon, die durch einfache enzymatische Reaktionen oder immunologische Techniken oder aufgrund ihrer Fluoreszenz nachgewiesen werden können. Beispiele für autofluoreszente Marker sind das VitalityTM humane rekombinante (hr)GFP (Stratagene, Amsterdam, Holland), das "green-fluoreszent" Protein (GFP) (BD Clontech, Heidelberg), FACS-optimierte Varianten des GFP, das "blue-fluoreszent" Protein (BFP), das "DsRed fluorescent Protein" (BD Clontech), das "red-fluoreszent" Protein (RFP), das "yellow-fluoreszent" Protein (YFP), das „"Cyan fluoreszent" Protein (CFP) (BD Clontech) oder Derivate dieser Proteine, die eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen, wie das "enhanced green-fluoreszent" Protein eGFP (BD Clontech), das "enhanced blue-fluoreszent" Protein eBFP, das "enhanced red-fluoreszent" Protein eRFP, das "enhanced Cyan-fluorescent" Protein eCFP (BD Clontech) oder das "enhanced yellowfluoreszent" Protein eYFP (BD Clontech). Beispiele für Marker mit enzymatischer Aktivität sind beispielsweise die Luziferase (LUC) (BD Clontech), die alkalische Phosphatase (AP) (BD Clontech), die sekretorische alkalische Phosphatase (SEAP) (BD Clontech), die Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) (Promega, Mannheim), die Photinus-Luciferase (BD PharMingen), die β-Glucuronidase (GUS) (Research Diagnostics, New York, USA), die Renilla Luciferase (Promega) und die β-Galaktosidase (β-Gal) (BD Clontech). Beispiele für mittels immunologischer Verfahren leicht nachweisbare Marker sind zudem beliebige intrazelluläre und membranständige Polypeptide, die in der durch die erfindungsgemäßen Vektoren modifizierten APC natürlicherweise nicht vorkommen. So eignen sich beispielsweise, aber nicht ausschließlich, die membranständigen murinen Proteine CD90, CD4, CDS, CD8a, CD62L, CD19, CD43 CD45, CD11b, CD11c, aber auch die Proteine CD4, CD134 (OX40), CD8a, CD45, CD45RA der Ratte als Marker, sofern sie keine störenden Kreuzreaktivität mit den entsprechenden humanen Oberflächenproteinen aufweisen. In Analogie eignen sich humane Oberfächenproteine, wie beispielsweise CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD22, CD27, CD30, CD45RO, CD45RA, CD56, CD69, CD138 als Marker für den Nachweis von Zielepitopen reaktiver T-Zellen aus nicht humanen Vertebraten. Zum Nachweis all dieser Proteine mittels der FACS-Technologie sind Fluoreszenz- (beispielsweise R-Phycoerythrin (R-PE), Peridin-Chlorophyll c (PerCP), Fluoescein (FITC), Texas Red (TX), Allophycocyanin (APC), Tandem PE-TX, Tandem PE-Cy5, PE-Cy7, Tandem APC-Cy7) gekoppelte Antikörper geeignet und kommerziell erhältlich (beispielsweise von dem Firmen Becton Dickinson, Dako, Coulter). Weiterhin eignen sich beispielsweise mikrobielle, insbesondere virale Hüllproteine, wie beispielsweise aber nicht ausschließlich die Hüllproteine des humanen Immundefizienzvirus (HN), des Affenimmundefizienzvirus (SIV), der humanen T- Zell Leukämieviren (HTLV), und des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) als Marker. Als Marker sind aber auch Hüllproteine und Strukturproteine beliebiger Viren geeignet. Die zu untersuchenden Probanden/Patienten dürfen jedoch natürlicherweise keine Antikörper gegen diese Markerproteine im Serum aufweisen.
  • Als Marken sind zudem Polypeptide geeignet, die zelltransformierenden Eigenschaften aufweisen. Beispiele für derartige Polypeptide sind virale Proteine wie die adenoviralen Proteine E1A und E1B, die E6 und E7 Proteine des humanen Papillomvirus, das große T-Antigen des SV 40 Virus, das LMP1 Protein des Epstein Barr Virus (EBV) sowie das X Antigen des Hepatitis B Virus. Zudem können auch andere nichtvirale Polypeptide mit transformierenden Eigenschaften verwendet werden.
  • Als Marken eignen sich insbesondere auch Polypeptide, die natürlicherweise nach einer Epitopspezifischen Erkennung einer APC durch eine T-Zelle in der APC in ihrer Expression meßbar gesteigert werden. Beispiele für diese Polypeptide sind der OX-40 Ligand (OX-40L) und der 4-1BB Ligand (4-1BBL) (den Haan and Bevan; 2000, PNAS 97, 12950-12952). Geeignet sind zudem die kostimulatorischen Proteine B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) und der Fas Ligand (FasL). Geeignet im Sinne der Erfindung ist zudem jedes beliebige Polypeptid, das infolge der spezifischen Erkennung eines zusammen mit MHC Proteinen auf der Oberfläche von APC präsentierten Epitops in derselben APC angeschaltet oder in seiner Aktivität messbar gesteigert wird.
  • Weiterhin sind auch Polypeptide als Marken geeignet, die durch eine beliebige Kombination verschiedener natürlich vorkommender Polypeptide erzeugt wurden, sowie nicht in der Natur vorkommende Polypeptidsequenzen. Diese Polypeptide sind dann als Marken geeignet, wenn sie durch immunologische, (bio)chemische oder physikalische Verfahren innerhalb oder auf der Oberfläche der mit den erfindungsgemäßen Transfersystemen modifizierten APC nachweisbar sind.
  • Die Expression des Markers steht unter der Kontrolle eines in APC durch den epitopspezifischen Kontakt mit einer T-Zelle induzierbaren Promotors (erster Promotor, P1). Geeignet im Sinne der Erfindung ist hierbei jeder Promotor, der infolge einer spezifischen Interaktion des T-Zellrezeptors (TCR) einer spezifischen T-Zelle mit einem in Verbindung mit MHC-Proteinen auf der Oberfläche der durch den erfindungsgemäßen Vektor modifizierten APC präsentierten Peptid in der APC angeschaltet oder in seiner Aktivität signifikant gesteigert wird. Beispiele für solche Promotoren sind die Promotoren für den OX-40 Liganden (OX-40L) und den 4-1BB Liganden (4-1BBL) (den Haan and Bevan; 2000). Geeignet sind zudem die Promotoren für die kostimulatorischen Proteine B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) und der Promotor für den Fas Liganden (FasL). Geeignet im Sinne der Erfindung ist zudem jeder beliebige Promotor, der infolge der spezifischen Erkennung eines zusammen mit MHC Proteinen auf der Oberfläche von APC präsentierten Epitops durch eine spezifische T-Zelle in derselben APC angeschaltet oder in seiner Aktivität messbar gesteigert wird.
  • Geeignete Promotoren im Sinne der Erfindung sind ferner solche, welche infolge einer spezifischen Interaktion des T-Zellrezeptors (TCR) einer spezifischen T-Zelle mit einem in Verbindung mit MHC-Proteinen auf der Oberfläche der durch den erfindungsgemäßen Vektoren modifizierten APC präsentierten Peptid in der APC abgeschaltet oder deren Aktivität meßbar reduziert werden. Hierbei kann die Abnahme der Expression eines naturlicherweise von APC produzierten Polypeptids aber auch die Abnahme der Expression eines Markers in der APC infolge eines Epitop-spezifischen Kontakts mit einer T-Zelle als Selektionskriterium dienen.
  • Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren für einen Marker oder eine Kombination von zwei oder mehreren unterschiedlichen Markern, die unter der Kontrolle desselben oder verschiedener, in der oben beschriebenen Weise, induzierbaren ersten Promotoren stehen. Wenn zwei oder mehr Marker auf den erfindungsgemäßen Vektoren vorhanden sind, muß nur das erste Markergen unter der transkriptionellen Kontrolle eines in APC induzierbaren Promotors stehen. Die Expression der weiteren Marker unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors eignet sich beispielsweise zur Überprüfung der Transfektions/Transformationseffizienz der mit den erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Transfersystemen behandelten APC.
  • Der erfindungsgemäße Vektor enthält fernes einen zweiten Promotor (P2), der in APC eine konstitutive und effiziente Expression der mit ihm funktionell verbundenen Nukleinsäure bewirkt. Gene von Viren, die Säuger infizieren, werden oftmals sehr effizient in Säugerzellen exprimiert und weisen ein breites Wirtsspektrum auf. Deshalb sind die zugehörigen viralen Promotorsequenzen für die Expression von Gensequenzen in Säugerzellen besonders geeignet. Einige Vertreter geeigneter viraler Promotorsequenzen sind beispielsweise der frühe SV40 Promotor (Mulligan and Berg, 1981 PNAS), der Cytomegalovirus (CMV) Promotor (US Patente Nr. 5,168,062 und 5,385,839), der Respiratory Syncytial Virus (RSV) Promotor, der Maus Mamma Tumorvirus (MMTV) LTR Promotor, der humane Immundefizienz Virus Typ 1 (HN-1) LTR Promotor, der Adenovirus major late-Promotor (Ad MLP) und der Herpes Simplex Virus (HSV) Promotor und davon abgeleitete Promotorsequenzen. Ferner sind auch Promotoren nicht viraler Gene, wie z.B. der murine 3-Phosphoglycerat-Kinase Promotor, der humane Ubiquitin C-Promotor, der humane EF-1α Promotor, der humane β-Caseinpromotor und der murine Metallothionein Promotor zur effizienten Expression von Polynukleotiden in Säugern geeignet.
  • Die beiden funktionellen Bereiche (1) für die konstitutive Expression des Polypeptids und die (2) induzierbare Expression des Marker befinden sich üblicherweise auf einem Vektor. Jedoch können sich diese beiden funktionellen Bereiche auch auf getrennten Vektoren befinden, die dann gemeinsam in eine APC eingebracht werden.
  • Die mit dem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure kodiert für Polypeptide, die bekannte oder putative Ziele reaktiver T-Zellen darstellen oder beinhalten. Die Nukleinsäure kann dabei eine natürlicherweise vorkommende Sequenz oder willkürliche Sequenz aufweisen. Die Nukleinsäuresequenz kann z.B. aus einer beliebigen genomischen oder cDNS- Bank stammen.
  • Sollen die erfindungsgemäßen Vektoren zur Suche nach Epitopen verwendet werden, können beliebige Nukleinsäuren, welche für Polypeptide mit unbekannten, potentiellen Zielepitopen reaktiver T-Zellen kodieren, beispielsweise Polynukleotide einer cDNA-Bank oder einer genomischen Bank, unter die Kontrolle des konstitutiven Promotors (P,) kloniert werden. Die cDNA-Bank kann z.B. eine speciesspezifische, erregerspezifische, gewebespezifische, entwicklungsspezifische, oder eine subtraktive sein. Eine Größenbeschränkung hinsichtlich der klonierten Polynukleotide besteht nicht. Die klonierten Polynukleotide können weniger als 20 Nukleotide umfassen, oder, was häufiger ist, 21 bis 100 Nukleotide, aber auch 101 bis 1500 Nukleotide, aber auch bis zu 5000 Nukleotiden, seltener bis zu 10000 Nukleotiden, aber auch mehr als 10000 Nukleotide.
  • Sollen die erfindungsgemäßen Vektoren zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen verwendet werden, können Nukleinsäuren, welche für Polyeptide mit bekannten Zielepitopen reaktiver T- Zellen kodieren, unter die Kontrolle des konstitutiven Promotors (P2) kloniert werden. Die Korrektheit der erfindungsgemäßen Vektoren wird durch Sequenzierung bestätigt.
  • Die verwendeten beliebigen oder bekannten Nukleinsäuren können von Menschen oder Säuqetieren stammen, aber auch von beliebigen Tieren, Parasiten, Mikroorganismen oder Viren. Sie können aber auch Pflanzen oder Algen entstammen. Sie können zudem Prionproteinen entstammen.
  • Beispiele für Viren, deren Polypeptide oder Fragmente die im erfindungsgemäßen Vektor enthaltenen Nukleinsäuresequenzen kodieren sind nachfolgend aufgelistet. Besonders bedeutende (human)pathogene virale Erreger sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Polioviren, Coxsachie-Viren, Echo-Viren, Enteroviren, Rhino-Viren, Orthomyxo-Viren (insbesondere Typ A, B, C Influenza-Viren), Paramyxo-Viren (insbesondere Parainfluenza-Viren, Mumpsviren, Masern-Viren, Respiratorische Syncytial-Viren (RS-Virus), Corona-Viren, Flavi- (insbesondere Gelbfieber-, Dengue-, Japan B-Enzephalitis-, Zeckenenzephalitis (FSME)-Viren), das Hepatitis C Virus (HCV)), Toga (insbesondere Alpha- und Rubiviren)- und Bunya (insbesondere die Bunya-, Hanta-, Nairo-, Phlebo- und Tospo-Virus Genera)-Viren, Röteln-Viren, Tollwut-Viren, Arena-Viren (insbesondere das Lymphozytäre Chorio-Meningitis Virus (LCMV) und das Lassa-Fieber Virus), Gastroenteritis-Viren (insbesondere Rota-Viren, Adenoviren, Calqici-Viren, Astr-Viren, Corona-Viren), Retroviren (insbesondere Typ A, B, C und D Retroviren, Lentiviren (insbesondere die humanen Immundefizienz-Viren Typ-1 (HIV-1) und -2 (HN-2)), das Affenimmundefizienzvirus (SN), Katzenimmundefizienzvirus (FN), und Rinderimmundefizienzvirus (BN)), Spumaviren, die humanen T-Zell-Leukämie-Viren Typ-1 (HTLV-1) und -2 (HTLV-2)), Parvo-Viren (insbesondere Parvo-Virus B 19 und adeno-assoziierte Viren (AAV)), Papova-Viren (insbesondere Papillom-Viren, das Virus der progressiven multifokalen Leukoenzephalopathie (PML), BK-Virus), Adenoviren, Herpes-Viren (insbesondere das Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1) und- 2 (HSV-2), das Varizellen Zoster Virus (VZV), Zytomegalie Virus (CMV) und Epstein-Barr-Virus (EBV), die Humanen Herpesviren 6, 7 und 8 (HHV 6, 7 und 8), Hepatitis-Viren (insbesondere das Hepatitis A Virus (HAV), Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis D Virus (HDV), Hepatitis C Virus (HCV), Hepatitis E Virus (HEV) und Hepatitis G Virus (HGV) sowie das Transfusion-transmitted Viqrus (TTV)) und Pocken Viren (insbesondere Orthopocken-Viren (wie das Menschenpocken-Virus, Vaccinia-Viren, Kuhpocken-Viren und Parapox-Viren)). Desweiteren können die Polypeptide von viralen Erregern seltener, subakuter oder chronischer Krankheiten (insbesondere Marburg und Ebola-Viren, sowie Borna-Viren entstammen.
  • Beispielsweise können die Polypeptide wichtigen tierpathogenen Viren entstammen. Bedeutende Vertreter tierpathogener viraler Erreger sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, das equine Morbillivirus (EMP), Picornaviren (insbesondere Enteroviren, Aphthoviren (mit dem Erreger der Maul- und Klauenseuche (MKS)), das vesikuläre Stomatitis-Virus, Paramyxoviren (insbesondere Morbilliviren, aviäre Paramyxoviren), Pockenviren (insbesondere Capripoxviren), Bunyaviren, Reoviren (insbesondere Orbiviren), Flaviviren (insbesondere Pestiviren), Orthomyxoviren (insbesondere das Influenza A Virus), Herpesviren (insbesondere Alphaherpesviren), Tollwutviren, Retroviren (insbesondere Lentiviren und C-Typ Retroviren), Togaviren, Rhabdoviren, Birnaviren, Coronaviren und Caliciviren.
  • Eine umfassende Auflistung der derzeit beschriebenen Viren wurde beispielsweise von dem Internationalen Committee für Virustaxonomie (The International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)) zusammengestellt und ist über das Internet abrufbar (http://wvvw.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/).
  • Beispiele für Bakterien, deren Polypeptide oder Fragmente die im erfindungsgemäßen Vektor enthaltenen Nukleinsäuresequenzen kodieren sind nachfolgend aufgelistet. Prinzipiell können die Polypeptide von jedem beliebigen Bakterium entstammen. Vorzugsweise stammen sie jedoch von intrazellulären Bakterien. Bedeutende intrazelluläre Bakterien sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Listerien (insbesondere L. monocytogenes), Salmonellen (insbesondere S. typhimurum) und Mykobacterien (insbesondere M. tuberculosis).
  • Ferner können die Polypeptide humanpathogenen Bakterien entstammen. Bedeutende Vertreter humanpathogener bakterielle Erreger sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken, Neisserien, Enterobakterien (insbesondere Escherichia coli (E. coli), inkluisive Säuglingspathogenen E. coli Stämmen (EPEC), Enteroaggregativen E. coli Stämmen (EAggEC), Klebsiellen, Enterobacter, Serratia, Proteus, Citrobacter und Typhösen Salmonellen), Enteritis Salmonellen, Shigellen, Yersinien), Vibrionen (insbesondere Vibrio cholerae und Vibrio El Tor), Pseudomonaden, Burkholderia, Stenotrophomas, Acinetobacter, Campylobacter, Helicobacter (insbesondere Helicobacter pylori), Hämophilus, Bordetellen, Legionellen, Listerien, Brucellen, Francisellen, Erysipelothrix, Korynebakterien, Bacillus, Clostridien, Bacteroide, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, Anaerobiospirillum, Anaerorhabdus, Anaerovibrio, Butyrivibrio, Centripedia, Desulfomonas, Dichelobacter, Fibrobacter, Leprotricha, Megamonas, Mitsuokella, Rikenella, Sebaldella, Selenomonas, Succinovibrio, Succinimonas, Tisserella, Mycobacterien (insbesondere NI. tuberculosis, atypische Mycobakterien (MOTT) und M. leprae), Nocardien, Treponemen (insbesondere T. paliduim und T. carateum), Borrelien (insbesondere B. burgdorferi und B. recurrentis), Leptospiren, Ricksettsien, Coxiellen, Ehrlichien, Bartonellen, Mycoplasmen (insbesondere M. pneumoniae und M. hominis), Ureaplasmen, Actinomyceten, Chlamydien. Zudem können die Polypeptide weiteren medizinisch bedeutsamen Bakterien entstammen, wie beispielsweise Tropheryma, Pasteurella, Branhamella, Streptobacillus, Spirillum und Gardnerella.
  • Ferner können Polypeptide tierpathogenen Bakterien entstammen. Bedeutende Vertreter tierpathogener bakterielle Erreger sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Mycoplasmen, Bacillus (insbesondere bacillus anthracis), Brucellen, Mycobakterien (insbesondere M. tuberculosis und M. bovis), Campylobacter, Tritrichomonas, Leptospiren, Rickettsien, Salmonellen, Clostridien, Actinobazillen, Clamydien, Echinokokken, Listerien, Yersinien, Corynebakterien und Francisella.
  • Beispiele für Pilze, deren Polypeptide oder Fragmente die im erfindungsgemäßen Vektor enthaltenen Nukleinsäuresequenzen kodieren sind nachfolgend aufgelistet. Besonders bedeutende (human)pathogene Pilze sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Sproßpilze (insbesondere Candida, Cryptococcus, Malassetia), Fadenpilze (insbesondere Aspergillus, Trichphyton, Microsporum, und Epidermophyton), Dimorphe Pilze (insbesondere Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Paracoccidioides, Sporothrix) und Pneumocystis.
  • Beispiele für Parasiten, deren Polypeptide oder Fragmente die im erfindungsgemäßen Vektor enthaltenen Nukleinsäuresequenzen kodieren sind nachfolgend aufgelistet. Bedeutende Vertreter humanpathogener Parasiten sind insbesondere auch Protozoen wie Tryphanosomen, Leishmanien, Trichomonen, Giardia, Amöben, Plasmodien, Toxoplasma, Kryptosporidien, Mikrosporidien. Bedeutende Vertreter humanpathogener Parasiten sind insbesondere auch Trematoden wie beispielsweise Schistosomen, sowie Cestoden wie beispielsweise Bandwürmer und Echinococcen, sowie Nematoden, wie beispielsweise Trichuris, Trichinella, Strongyloides, Ancyclostoma, Necator, Enterobius, Ascaris und Filarien. Bedeutende Vertreter tierpathogener Parasiten sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich Protozoen (insbesondere Protomonaden, Diplomonaden, Polymastigiden, Amoben, Toxoplasmen und Coccidien), Microsporen, Helminthen, Trematoden, Cestoden und Nematoden.
  • Die für Polypeptide unterschiedlicher Organismen kodierenden Polynukleotide können zudem in beliebiger Weise gekoppelt sein. Die Nukleinsäuren können aber auch mit für Leaderpolypeptide, beispielsweise, aber nicht ausschließlich den Mellitin-, humanen Interleukin 3-, und humanen Interleukin-8 Leader und für Transmembrandomänen, beispielsweise, aber nicht ausschließlich die Transmembrandomäne Epstein Barr Virus gp220/350 Hüllproteins kodierenden Nukleinsäuren gekoppelt sein.
  • Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten üblicherweise einen bakteriellen Replikationsursprung (ori) und ein Gen, das eine Resistenz z.B. gegen Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin oder Zeozin vermittelt. Die kodierenden Bereiche für den bakteriellen Replikationsursprung und die Antibiotikaresistenz befinden sich vorzugsweise benachbart zu der Expressionseinheit zur konstitutiven Expression von Polypeptiden (P2) mit bekannten oder vermuteten T-Zellepitopen. Die für die konstitutive Expression eines Polypeptids, den Replikationsursprung und das Resistenzgen erforderlichen Nukleinsäuren können auf dem erfindungsgemäßen Vektor, beiderseitig durch eine oder mehrere Erkennungssequenz(en) für Restriktionsschnittstellen begrenzt werden, die bevorzugt innerhalb der begrenzten Nukleinsäuresequenz inklusive der Sequenz für den Replikationsursprung, das Resistenzgen und der Expressionseinheit zur konstitutiven Expression des Polypeptids mit dem bekannten oder vermuteten T-Zellepitop nicht vorkommt. Dieser Sequenzabschnitt auf dem Vektor kann auch durch zwei unterschiedliche, jedoch kompatible Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen begrenzt werden, wenn beide Schnittstellen nicht innerhalb der den Replikationsursprung, das Resistenzgen und der Expressionseinheit zur konstitutiven Expression des Polypeptids umfassenden Nukleinsäuresequenz vorkommen. Die Anwesenheit dieser Schnittstellen für Restriktionsenzyme ist nicht erforderlich, wenn episomal vorliegende Plasmide als Transfersystem für die erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäße Vektor kann ferner die dem Fachmann bekannten und zum Stand der Technik gehörenden folgenden Elemente enthalten: Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, Enhancer, Introns mit funktionellen Splice-Donor und Akzeptorstellen sowie Leadersequenzen, eine TATA-Box, eine GC-Box, eine CAAT-Box und andere Promotorelemente, die üblicherweise stromaufwärts der TATA-Box lokalisiert sind, sowie eine optimale aber auch suboptimale Kozak-Sequenz.
  • Expressionskassetten sind oft in einem Replikon enthalten, wie z.B. in extrachromosomalen Elementen (z.B. Plasmiden), die in der Lage sind, stabil in einem Wirt, wie z.B. einer Säugerzelle zu überdauern. Säuqerreplikationssysteme beinhalten solche, die von aninmalen Viren, beispielsweise Papovaviren, Polyomaviren, Rinderpapillomviren oder dem Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind und trans-aktive Faktoren zur Replikation benötigen.
  • Weiterhin kann die Expressioneffizienz des gewünschten Fremdgens durch die Auswahl und Verwendung geeigneter, wirtsspezifischer Codons gesteigert werden. Diese Beobachtung beruht auf dem Befund, dass sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Gene keinen statistischen Gebrauch synonymer Codons aufweisen.
  • Als Vektorbackbone für die Herstellung erfindungsgemäßer Plasmide eignen sich beispielsweise, aber nicht ausschließlich auf dem Prototyp Plasmid pBR322 (Bolivar et al. 1977) basierende pcDNA Expressionsvektoren, die eine effiziente Genexpression in Säugerzellen erlauben.
  • Ferner ist eine Vielzahl unterschiedlicher nicht-viraler und viraler Gentransfervektoren geeignet, um Nukleinsäuren in Säugerzellen einzubringen. Einige der bedeutendsten Vektorsysteme zur Genexpression in Säugerzellen sind in dem Review von Makrides (Makrides, Protein Expr. Purif. (1999), 17(7), 183-202) aufgeführt. Viele der beschriebenen Vektoren sind zur Transduktion von Nukleinsäuren in APC besonders geeignet und kommerziell verfügbar.
  • Beispielsweise kann Plasmid-DNS, insbesondere auch die erfindungsgemäßen Vektoren direkt zur Transduktion von Zellen eingesetzt werden. Insbesondere eignen sich eine zweite Generation von linearen DNS-Plasmiden, die sogenannten MIDGE-Transfektionsvektoren (Mologen AG, Berlin) zum effizienten Transfer der in dieser Patentschrift beschriebenen Nukleinsäuresequenzen Verschiedene Verabreichungsformen zur Transduktion von Säugerzellen und zur Steigerung der Effizienz der Aufnahme von Vektoren sind publiziert und Stand der Technik.
  • Die Effizienz des Gentransfers mittels retroviraler Transfersysteme kann z.B. durch Adjustierung der Zielzellen in der S Phase gesteigert werden. Methoden zur Optimierung der Effizienz der Transduktion von Säugerzellen mittels viraler Transfersysteme umfassen zudem die Variation der "multiplicity of infection" (M.O.I.), die Depletion von Ionen wie z.B. von Phospationen, Zugabe von polykationischen Substanzen, beispielsweise von Protaminsulfat, die Variation der Kontaktzeit, Temperatur, pH-Wert, eine gemeinsame Zentrifugation der Zellen und Virus- bzw. Vektorstocks oder die Inkubation der Zellen mit den Transfersystemen in einem kleinen Mediumvolumen.
  • Die in der Art hergestellten erfindungsgemäßen Transfersysteme eignen sich sowohl für die Epitopsuche als auch zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen.
  • Die Erfindung betrifft somit die Bereitstellung von Gentransfervektoren zur Veränderung von APC mittels dieser Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren übertragen auf APC eine Kombination aus zwei Eigenschaften:
    • (1) Die APC erlangen die Fähigkeit, einzelne bekannte Zielstrukturen, z.B. bei der Anwendung in der Diagnostik, oder noch unbekannte potentielle Zielstrukturen z.B. bei der Epitopsuche, konstitutiv intrazellulär zu produzieren und Bruchstücke davon in Verbindung mit MHC-Proteinen der Klassen I und/oder II auf ihrer Oberfläche zu präsentieren.
    • (2) Bei Erkennung der auf der Oberfläche der APC präsentierten Zielstruktur (Epitop) durch eine spezifische T-Zelle wird die Expression des Markers über das von der T-Zelle ausgelöste Signal in der APC induziert oder inhibiert. Die veränderte Expression des Markers und damit die aktivierte APC kann in einfacher und quantitativer Weise beispielsweise mittels kommerziell erhältlicher Geräte und Verfahren zuverlässig und schnell nachgewiesen (FACS, Immunfluoreszenz, ELISA) und isoliert (FACSsorting, magnetisches Zell-Sorting) werden kann.
  • Die mittels der erfindungsgemäßen Vektoren veränderten APC eignen sich zu einer schnellen Charakterisierung von bislang unbekannten Zielstrukturen aktivierter T-Zellen und stellen somit ein geeignetes Werkzeug zur Erstellung Krankheits- oder Patienten-spezifischer Datenbanken dar. Zudem können die mittels der erfindungsgemäßen Vektoren modifizierten. APC zum Nachweis beliebiger T-Zellpopulationen verwendet werden, deren Zielstrukturen bekannt sind.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren finden Anwendung bei allen Vertebraten, die T-Zellen besitzen, insbesondere am Menschen, Primaten und Nagetieren. Die Kenntnis von bislang unbekannten Zielregionen aktivierter T-Zellen eröffnet zudem neue Perspektiven für die Entwicklung neuartiger Diagnostik-, Therapie- und Impfkonzepte zur Vorbeugung und Behandlung von Erreger-induzierten Erkrankungen. Weiterhin eröffnet die Kenntnis von T-Zellepitopen in nichthumanen Vertebraten die Etablierung neuer Tiermodellsysteme für Forschungszwecke.
  • Ein weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft mit den erfindungsgemäßen Vektoren transduzierte antigenpräsentierende Zellen (APC). Die Herstellung von erfindungsgemäßen APC erfolgt durch die Behandlung von APC mit den erfindungsgemäßen Gentransfervektoren. Die Behandlung der APC mit den erfindungsgemäßen Gentransfervektoren kann entweder direkt durch eine mehrstündige Inkubation von heparinisiertem Vollblut mit den erfindungsgemäßen Gentransfervektoren erfolgen. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere bei Verwendung von viralen und bakteriellen Gentransfervektoren, welche einen spezifischen Tropismus für alle APC oder definierte Subpopulationen von APC aufweisen. Alternativ eignen sich gereinigte Populationen von peripheren blutmononukleären Zellen (PBMC) zur Behandlung mit den erfindungsgemäßen nichtviralen und viralen Gentransfervektoren. Verfahren zur Reinigung von PBMC aus heparinisiertem Vollblut sind Stand der Technik.
  • Der Erfolg des Transfers der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kann anhand eines Nachweises der Expression des unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors (Promotor P2) stehenden Polypeptids oder des unter der Kontrolle des dritten Promotors stehenden Markers mittels gängiger molekularbiologischer und immunologischer Methoden, beispielsweise der Immunoblotanalyse oder der Immunfluoreszenzanalyse unter Verwendung geeigneter Antikörper überprüft werden. Derartige molekularbiologischen und immunologischen Methoden zum spezifischen Nachweis von Polypeptiden sind vielfach publiziert und Stand der Technik.
  • Zur Herstellung der erfindungsgemäßen APC zur Epitopsuche werden erfindungsgemäße Vektoren verwendet, die unter anderem die unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven Promotors (P2) beliebige Polynukleotide, welche für Polypeptide mit potentiellen Zielepitopen reaktiver T-Zellen kodieren, beispielsweise Polynukleotide einer (subtraktiven) Genbank aufweisen.
  • Zur Herstellung erfindungsgemäßer APC zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen werden erfindungsgemäße Transfersysteme verwendet, die unter anderem die unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven Promotors (P2) definierte Polynukleotide, welche für ein oder mehrere Polypeptide mit bekannten Zielepitopen reaktiver T-Zellen kodieren, aufweisen.
  • Ein Aspekt der Erfindung betrifft ferner APC zur Epitopsuche oder zum Nachweis Epitopspezifischer T-Zellen, die mit einem Vektor transduziert wurden, der den erfindungsgemäßen Gentransfervektoren entsprecht, mit der Einschränkung, dass er die Expressionseinheit für den Marker, umfassend den in APC induzierbaren Promotor (P,) und die funktionell verbundene Nukleinsäure kodierend ein Markergen nicht aufweist.
  • Ein weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis Epitopspezifischer T-Zellen und zum Nachweis von Zielepitopen reaktiver T-Zellen, umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Isolierung von APC-haltiger und/oder T-zellhaltiger Körperflüssigkeit, vorzugsweise von Blut oder Liquor,
    • b) in Kontakt bringen von APC-haltiger Körperflüssigkeit mit den erfindungsgemäßen Gentransfervektoren,
    • c) Inkubieren der Körperflüssigkeit enthaltend die transduzierten APC oder von isolierten transduzierten APC mit der Körperflüssigkeit enthaltend die T-Zellen oder die isolierten T-Zellen, bevorzugt für 2 bis 36 Stunden oder länger, besonders bevorzugt für 2 bis 6, 6 bis 12, 12 bis 36 Stunden oder 36 bis 168 Stunden,
    • d) Nachweis von Marker exprimierenden APC, und
    • e) gegebenenfalls Isolierung und Charakterisierung der mit dein zweiten Promotor funktionell verbundenen für die Zielepitope reaktiver T-Zellen kodierenden Nukleinsäure.
  • Vorzugsweise ist die APC-haltiger Körperflüssigkeit in Schritt b) der Verfahren Blut, Liquor, eine gereinigte PBMC-Population oder eine separierte APC-Population. Vorzugsweise sind die isolierten T-Zellen CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD4+CD25+ Suppressor T-Zellen, CD161+ NKT Zellen oder ein Gemisch aus NKT, CD4+, CD8+ und/oder CD4+CD25+ T-Zellen.
  • Der Nachweis und die Quantifizierung Epitop-spezifischer T-Zellen und die Suche von Zielepitopen reaktiver T-Zellen kann beispielsweise aus Patienten, die an einer Autoimmunerkrankung, einer chronisch entzündlichen Erkrankung, einer mikrobiellen Infektion, einer Tumorerkrankung oder einer Transplantatabstoßung leiden, erfolgen, oder aber aus gesunden Probanden oder Teilnehmern therapeutischer oder präventiver Studien. Zudem kann der Nachweis von epitopspezifischen T-Zellen und die Suche von Zielepitopen reaktiver T- Zellen mittels der erfindungsgemäßen APC auch in Primaten oder anderen Tieren erfolgen, die T-Zellen besitzen.
  • Zur Durchführung des Verfahrens wird einem Probanden oder Patienten beispielsweise Blut oder eine andere APC-haltige und/oder T-zellhaltige Körperflüssigkeit entnommen und die APC mit den erfindungsgemäßen Gentransfervektoren behandelt. Die Behandlung der APC mit den erfindungsgemäßen Vektoren kann in Blut, gereinigten PBMC Populationen, oder separierten APC Populationen erfolgen. Die Isolierung der gereinigten oder der separierten Populationen kann auch nach der Transduktion erfolgen. Die in der Art hergestellten erfindungsgemäßen APC werden dann mit isolierten T-Zellpopulationen, insbesondere CD4+ T-Zellen, aber auch CD8+ T-Zellen, CD161+ NKT Zellen, CD4+CD25+ Suppressor T-Zellen, einem Gemisch aus CD161+ NKT Zellen, CD4+, CD8+ und/oder CD4+CD25+ T-Zellen, oder auch T-zellhaltigen Zellpopulationen oder T-zellhaltiger Körperflüssigkeit desselben Patienten für 2 bis 6 Stunden oder aber für 6-12 Stunden oder aber für 12 bis 36 Stunden, oder aber für 36 bis 168 Stunden, oder aber für mehr als 168 Stunden unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, beispielsweise bei 37° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 bis 8 % CO2 in T-Zellmedium (RPMI 1640 mit 2 bis 10% hitzeinaktiviertem (30 min, 56°C) fötalem Kälberserum (FKS), 2 mM Glutamin und 100 mg/ml Kanamycin oder Gentamycin (alle Komponenten von PanSystems, Aidenbach) inkubiert. Die Indukation kann in Ab- oder Anwesenheit geeigneter (ko)-stimulatorischer Substanzen Polypetide und Substanzen, wie beispielsweise Zytokine (insbesondere IL-2), oder Antikörper (beispielsweise anti CD28) durchgeführt werden. Alternativ können die Tzellhaltigen Zellpopulationen auch aus Patienten/Probanden mit kompatiblem MHC-Muster stammen. Befinden sich in der gemischten APC/T-Zellkultur reaktive T-Zellen, welche mit den Gentransfervektoren transduzierte APC erkennen, die spezifische T-Zellepitope präsentieren, so induzieren oder inhibieren diese in den Subpopulationen der erfindungsgemäßen APC die Markerexpression. Befinden sich in der gemischten APC/T-Zellkultur erfindungsgemäße APC, die T-Zellepitope präsentieren, welche von reaktiven T-Zellen des Probanden/Patienten erkannt werden, so wird infolge der Epitop-spezifischen Erkennung in diesen APC die Markerexpression induziert oder inhibiert.
  • Das Vorhandensein und die Anzahl Marker-positiver APC kann beispielsweise mittels der FACS, ELISA oder der Immunfluoreszenztechnologie unter Verwendung spezifischer, chemisch modifizierter Antikörper, bzw. Antikörperpärchen nachgewiesen werden. Alternativ werden Marker mit Enzymfunktion durch Zugabe und Umsetzung geeigneter Substrate nachgewiesen. Erfindungsgemäße epitoppräsentierende APC, welche die Expression eines der beschriebenen Marker aufweisen, können mittels verschiedener immunologischer und biochemischer Verfahren unter Verwendung kommerziell erhältlicher Geräte und Testsysteme nachgewiesen, isoliert und vereinzelt werden. So kann die Expression ausgewählter Marker beispielsweise mittels der FACS-, ELISA- oder Immunfluoreszenztechnologie beispielsweise unter Verwendung spezifischer, chemisch modifizierter Antikörper, bzw. Antikörperpärchen nachgewiesen werden. Alternativ werden Marker mit Enzymfunktion durch Zugabe und Umsetzung geeigneter Substrate nachgewiesen. Die Isolierung und Vereinzelung markerpositiver APC kann unter Verwendung der FACSSort Technologie (beispielsweise der Firmen Coulter, Becton Dickinson) erfolgen. Die molekularbiologischen und immunologischen Methoden Verfahren, welche bei der Epitopsuche verwendet werden, z.B. die Durchführung von FACSscan Analysen, FACSsorting, ELISA Assays, Immunflioreszeuzanalysen, Nachweis von Enzymreaktionen, Gesamt DNS Präparation aus Zellen, PCR sowie Sequenzierung von Nukleinsäuren sind Stand der Technik.
  • Die Isolierung und Charakterisierung der für die Zielepitope reaktiver T-Zellen kodierenden Polynukleotide aus selektionierten, markerpositiven erfindungsgemäßen APC kann mittels unterschiedlicher Verfahren erfolgen, die nachfolgend beispielhaft beschrieben sind. Beispielsweise ist das PCR-Verfahren zur Identifizierung der die Zielepitope reaktiver T-Zellen kodierenden Polynukleotide aus den selektionierten, markerpositiven erfindungsgemäßen APC geeignet. Aus den vereinzelten, erfindungsgemäßen Marker-positiven APC wird mittels eines kommerziellen Kits (beispielsweise der Firmen Stratagene oder Qiagen) Gesamt-DNS präpariert und die unbekannte Nukleinsäuresequenz des gesuchten T-Zellepitops unter Verwendung geeigneter Oligonukleotide (Primer) mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert. Die Primen weisen bevorzugt konstante Bereiche innerhalb der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in unmittelbarer Nachbarschaft zu den zu identifizierenden Polynukleotiden auf.
  • Alternativ kann auch das Lysat der selektionierten und vereinzelten markerpositiven APC als Template für die PCR-Reaktion verwendet werden. Durch die Verwendung spezifischer Primen außerhalb der unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors (P2) klonierten Polynukleotide in den flankierenden Bereichen auf den erfindungsgemäßen nicht viralen bzw. viralen Vektoren können die unbekannten, unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors befindlichen cDNA amplifiziert, durch Sequenzierung beschrieben und eventuell durch Vergleich mit Sequenzen einer Datenbank identifiziert werden.
  • Alternativ kann aus den vereinzelten markerpositiven APC oder einem Gemisch an markerpositiven APC Gesamt-DNS z.B. mittels eines kommerziellen Kits präpariert werden. Die erhaltene DNS wird anschließend mit einer Restriktionsendonuklease, deren Erkennungssequenz den konstitutiven Promotor inklusive des unter seiner Kontrolle stehenden Polynukleotides, sowie eine bakterielle Resistenz und den bakteriellen Replikationsursprung enthält, (siehe 1B) im 5' und 3' Bereich flankiert, geschnitten. Die erhaltenen DNS Fragmente werden anschließend religiert und in geeignete Bakterien, beispielsweise DH10B Bakterien transformiert. Falls episomale Plasmide als erfindungsgemäße Transfersysteme zur Transduktion der APC verwendet wurden, kann die aus Marker-positiven APC gewonnene Gesamt-DNS direkt zur Transformation von geeigneten Bakterien verwendet werden.
  • Bakterien, die nach diesem Verfahren mit Plasmiden transformiert wurden, welche den erfindungsgemäßen Promotor P2 und die unter dessen Kontrolle befindlichen Polynukleotide in Kombination mit einer bakteriellen Antibiotikaresistenz und den bakteriellen Replikationsursprung enthalten, können durch das Ausstreichen auf Agarplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, selektiv kultiviert und ausvereinzelt werden. Nach einer Anzucht der klonalen Bakterienkolonien in einem entsprechenden antibiotikahaltigem Selektivmeduim wird die Plasmid DNS aus den Bakterien mittels gängiger Verfahren, beispielsweise der alkalischen Schnelllyse, gewonnen.
  • Die aus den Bakterien gereinigten Plasmide werden direkt als Template für die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Durch die Verwendung spezifischer Primer, welche in konservierten Bereichen des erfindungsgemäßen Vektors nahe dem zu identifizierenden Poynukleotid unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors P2 binden, können die unter der Kontrolle des Promotors P2 befindlichen Polynukleotide durch Sequenzierung bestimmt, und deren Identität möglicherweise durch Vergleich mit Sequenzen biologischer und medizinischer Datenbanken bestimmt werden. Zur Bestätigung der mittels dieser Verfahren identifizierten cDNS-Sequenzen und zum Ausschluß falsch positiver Ergebnisse werden die erhaltenen Nukleinsäuresequenzen nochmals unter die Kontrolle des konstitutiven Promotors in die erfindungsgemäßen Vektoren kloniert und mittels eines erfindungsgemäßen Transfersystems in APC transfiziert. Die in der Art hergestellten APC werden dann nochmals auf Erkennung durch reaktive T-Zellen desselben Patienten getestet. Durch eine kontinuierliche 5'- und 3' seitige Verkürzung der identifizierten Polynukleotide und das Einbringen dieser mittels erfindungsgemäßer Transfersysteme in APC kann die minimale Länge der erkannten Zielregion in Kokultivierungsexperimenten mit reaktiven T-Zellen des Patienten/Probanden bestimmt werden.
  • Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können beispielsweise Polypeptide und Epitope identifiziert werden, die bei der Erkennung und Kontrolle von durch Mikroorganismen und Parasiten induzierten Erkrankungen durch T-Zellen, bei der Erkennung und Kontrolle von Tumorerkrankungen durch T-Zellen bedeutsam sind, Zielstrukturen fehlgeleiteter, körpereigener T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen und chronisch entzündlichen Prozessen oder Zielstrukturen körpereigener T-Zellen bei der Abstoßung transplantierter Gewebe oder Organe darstellen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren sind geeignet für eine Vielzahl unterschiedicher medizinischer Anwendungen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Epitop- und Polypeptid-spezifische T-Zellen identifiziert werden zur frühzeitigen Diagnostik von Autoimmunerkrankungen; zum Monitoring reaktiver T-Zellen in Patienten mit Autoimmunerkrankungen, die einen chronisch progressiven oder relapsing/remtting Krankheitsverlauf aufweisen; zur Bestimmung der Effizient therapeutischer Behandlungen von Erkrankungen mit T-Zellbeteiligung; zum Screening der Sicherheit und Effizienz von Medikamenten, die eine Deletion oder Anergie von T-Zellen hervorrufen oder eine generelle Immunsuppression bewirken; zum Monitoring der Effizienz therapeutischer und prophylaktischer Impfungen zur Induktion von T-Zellen; zum Monitoring und der Diagnostik von durch Mikroorganismen und Parasiten induzierten Erkrankungen mit T-Zellbeteiligung; zum Monitoring und zur Diagnostik chronischer Entzündungen mit T-Zellbeteiligung; zum Monitoring und zur Diagnostik von Tumorartigen-spezifischen T-Zellen; zum Monitoring und zur Diagnostik von T-Zellen, die bei der Transplantatabstoßung eine Rolle spielen oder zur gezielten Auswahl von Probanden mit für Impfstudien und die Testung therapeutischer Behandlungen
  • Desweiteren umfasst die Erfindung einen Kit zum diagnostischen Nachweis autoreaktiver T-Zellen, umfassend geeignete erfindungsgemäße Vektoren oder Transfersysteme zur Herstellung erfindungsgemäßer APC, verpackt in geeigneten Behältern; eine detaillierte Anleitung zur Durchführung des diagnostischen Nachweises und einen geeigneten Behälter zum Transport und der Lagerung des erfindungsgemäßen Kits.
  • Für die Epitopsuche ergeben sich aufgrund der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren in Kombination mit Genbanken ermöglicht die schnelle Identifizierung von T-Zellepitopen aus derzeit bekannten und charakterisierten Polypeptiden aber auch aus bislang noch nicht beschriebenen bzw. charakterisierten Polypeptiden. Durch die Verwendung von Genbanken kann zudem in einem oder einer sehr begrenzten Anzahl von Versuchsansätzen gleichzeitig sehr viele Zielepitope reaktiver T-Zellen eines Probanden/Patienten isolieren und beschreiben werden. Dieses Verfahren ist somit im Vergleich zu den bisher verwendeten Verfahren zur Epitopsuche mnit einem deutlich geringerem Zeit- und Kostenaufwand verbunden.
  • Zur Epitopsuche können polyspezifische T-Zellen eines Patienten verwendet werden. Dadurch kann der sehr zeit- und arbeitsaufwendige Schritt der Erzeugung von T-Zellinien umgangen werden. APC, die Zielepitope reaktiver T Zellen exprimieren, können aufgrund der Markerexpression sehr schnell mittels kommerziell erhältlicher Geräte (beispielsweise FACSsort) selektioniert und die Gene der gesuchten T-Zellepitope mittels molekularbiologischer Routineverfahren identifiziert werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich universell für die Epitopsuche bei unterschiedlichen Probanden/Patienten. Genfähren, welche die erfindungsgemäßen Vektoren tragen, können unabhängig von dem Haplotyp bei allen Probanden/Patienten universell zur gentechnischen Veränderung der APC für die Epitopsuche eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Suche von Zielepitopen unterschiedlicher T-Zellpopulationen (insbesondere von CD4+ T-Helferzellen, aber auch von CD8+ zytotoxischen T-Zellen, CD161+ NKT-Zellen und CD4+CD25+ T-Suppressorzellen).
  • Für den Nachweis und die Diagnostik Epitop-spezifischer T-Zellen ergeben sich aufgrund der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin begründet, dass es auf der Messung einer durch eine epitopspezifische Erkennung durch eine T-Zelle in APC induzierten Markergenexpression und nicht, wie bei allen bisherigen Verfahren, auf der Messung von Reaktionen der T-Zelle infolge einer Epitoperkennung auf APC beruht. Dadurch wird die Sensitivität des Assaysystems erheblich gesteigert. Das Nachweisverfahren für die reaktiven T-Zellen ist im Vergleich zu den herkömmlichen Diagnostikverfahren (CTL-Assay, ELISPOT, Zytokin-ELISA, Proliferationsassay) universell einsetzbar, leichter handhabbar, deutlich kostengünstiger, weniger zeitaufwendig und sensitiv. Die Anwesenheit und Anzahl reaktiver T-Zellen kann einfach mittels, kommerziell erhältlicher und in vielen Diagnostiklabors routinemäßig verwendeter Gerätschaften (FACS) leicht nachgewiesen und quantifiziert werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikverfahren kann unabhängig von dem Haplotyp des Probanden/Patienten universell für den Nachweis reaktiver T-Zellen eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum Nachweis verschiedenster Epitop-spezifischer T-Zellpopu1ationen (insbesondere CD4+ T-Helferzellen, aber auch CD8+ zytotoxische T-Zellen, CD161+ NKT-Zellen und CD4+CD25+ T-Suppressorzellen).
    •
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
  • Beispiel 1: Klonierung des erfindungsgemäßen Vektorbackbones pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP, sowie der erfindungsgemäßen Vektoren pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-Z und pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-MBP.
  • Als Ausgangsvektor zur Klonierung des erfindungsgemäßen Vektorbackbones pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP (2), sowie der erfindungsgemäßen Vektoren pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-Z (3) und pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-MBP (4) diente das Plasmid pcDNA3.1(+) (Invitrogen). Der durch einen Epitop-spezifischen Kontakt einer T-Zelle mit einer Epitop-präsentierenden APC induzierbare Promotor des OX40-Liganden wurde aus Gesamt-DNS aus humanen PBMC mittels des PCR-Verfahrens amplifiziert. Die Gewinnung von PBMC erfolgte wie nachfolgend beschrieben: Frisch abgenommenes Vollblut eines gesunden Probanden wurde mit 25 IU/ml Heparin versetzt. 50 ml-Leukosep-Gefäße mit Trennmembran wurden mit 15 ml Ficoll-Histopaque (Sigma, Deisenhofen) befällt und 2 min bei 500 × g zentrifugiert. Die Röhrchen wurden mit dem heparinisierten Vollblut befüllt und 1:1 mit RPMI 1640 Medium (PanSystems, Aidenbach) verdünnt. Die Ansätze wurden 30 min bei 500 × g zentrifugiert, ohne den Rotor am Ende des Laufes abzubremsen. Die lymphozytenhaltige, trübe Interphase wurde vorsichtig abgezogen und in 3 Volumina T-Zell-Medium (RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem (30 Min. bei 56° C) fötalem Kälberserum (FKS), 2 mM Glutamin und 100 mg/ml Kanamycin bzw. Gentamycin (alle Komponenten von PanSystems, Aidenbach)) dreimal gewaschen.
  • Die Isolierung von genomischer DNS aus PBMC wurde mit dem "DNA Extraction Kit" (Stratagene) nach der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen 2 × mit kaltem PBS (phosphate buffered saline) gewaschen und die Zellzahl bestimmt. Je 1 × 108 Zellen wurden anschließend in 15 ml Plastikröhrchen überführt und sofort auf Eis gestellt. Auf Eis erfolgten auch alle nachfolgenden Arbeitsschritte. Nach einer 15-minutigen Zentrifugation (350 × g, 4 °C) wurden die Zellen in 11 ml Lösung 2 (50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA, 2 % SDS) resuspendiert und mit einem Dounce Homogenisator homogenisiert. Danach wurde Pronase (Stratagene) bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml hinzugefügt und der Ansatz über Nacht unter leichtem Schütteln bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz 10 Min. auf Eis abgekühlt und 4 ml einer eiskalten Lösung 3 (gesättigte NaCl-Lösung) hinzupipettiert. Nach kurzem Vermischen der Lösungen wurde für weitere 5 Min. auf Eis inkubiert und das Pellet bei 4 °C abzentrifugiert (15 Min., 2.000 × g). Danach wurde der Überstand mit einer abgeschnittenen Plastikpipette in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt, RNAse in einer Endkonzentration von 20 μg/ml zugegeben und 15 Min. bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 2 Volumenteilen 100 %-igem Ethanol und leichtem Schütteln konnte das Ausfallen der genomischen DNS in weißen Schlieren beobachtet werden. Die DNS konnte nun entweder auf einem Glasstab aufgewickelt oder durch 15-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 2.000 × g pelletiert werden. Nach einem Waschschritt mit 2 ml kaltem 70 %-igem Ethanol wurde die DNS in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, abzentrifugiert und 15 Min. bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Das DNS-Pellet wurde in H2Obid. aufgenommen und über Nacht bei Raumtemperatur bzw. für 1-2 Std. bei 55 °C gelöst. Die Bestimmung der DNS-Konzentration erfolgte photometrisch bei 258 nm.
  • Danach wurde die 979 Basenpaare umfassende Sequenz des Promotors des OX40 Liganden mittels PCR unter Verwendung nachfolgender Amplifikationsbedingungen amplifiziert: Einleitender Deraturierungsschritt: 94° C, 2 Min; danach folgte eine 3-Stufen PCR (35 Zyklen) mit folgenden Bedingungen: Denaturierung: 94° C, 30 Sek., Annealing 55° C, 1 Min., Elongation: 72° C, 3 Min; danach folgte ein abschließenden Polymerisationsschritt bei 72° C für 10 Min. mit anschleißender Dauerkühlung bei 4° C. Zur Amplifkation wurden die Primer A (5' Primer: 5'-GGCGGGGGATCCGGTACCTGGTGTCTATTG-3'; SEQ ID NO:2) und Primer B (3' Primer: 5'-GGCGGGAGATCTCTTCACAATCTGGGTAG-3'; SEQ ID NO:3) verwendet. Die in den Primern enthaltenen Schittstellen (BamH1 im 5' Primer; BglII im 3' Primer sind kursiv dargestellt). Die Sequenz des amplifizierten PCR Fragments ist in 5 und SEQ ID NO:1 dargestellt. Als Richtlinie für die Hybridisierungstemperatur wurden in der Regel 5° unter dem Schmelzpunkt des Primers gewählt, als Polymerisationszeit wurden 60 Sek. pro 1.000 Bp angenommen. Das erhaltene PCR-Produkt wurden mittels eines QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt und anschließend wurden 20 μg der erhaltenen PCR Bande im 100 μl Maßstab mit den Restriktionsenzymen BamH1 und BglII verdaut. Gleichzeitig wurden 20 μg des Plasmids pcDNA3.1(+) mit dem Restriktionsenzym BglII linearisiert. Die erhaltenen Spaltprodukte wurden über ein 1%-iges Agarosegel aufgetrennt, die Polynukleotide für den linearisierten pcDNA3.1(+) Vektor und den OX40L Promotor aus dem Gel atisgeschnitten und die Nuk1einsäuren mittels eines QIAquick Gel Extraktion Kits (Qiagen) aufgereinigt. Anschließend wurden die erhaltenen Polynukleotide in einem molaren Verhältnis von 1 : 10 (linearisierten pcDNA3.1(+) Vektor zu der Nukleinsäure für den OX40L Promotor) in einem Ligationsansatz zusammen bei 16°C über Nacht inkubiert und der Ligationsansatz dann in Bakterien (DH5α) transformiert. Nach einer 1 stundigen Inkubation bei 37°C in LB-Medium ohne Selektionsantibiotikum wurden die transformierten Bakterien auf LBAmp Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die erhaltenen Bakterienkolonien wurden dann in LBAmp Medium kultiviert, die bakterielle Plasmid DNS mittels der Technik der alkalischen Schnelllyse isoliert und mittels eines Restriktionsverdaus unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen BglII/EcoRI charakterisiert. Das in der Art erzeugte, 6414 Basenpaare (bp) umfassende Plasmid wurde pcDNA3.1(+)0X40L genannt.
  • Anschließend wurde die 224 Basenpaare umfassende bovine growth hormone (BGH) Polyadenylierungssequenz aus dem pcDNA3.1(+) Vektor mittels PCR unter Verwendung geeigeter PCR Bedingungen (Einleitender Denaturierungsschritt: 94° C, 2 Min; anschließende 3-Stufen PCR (35 Zyklen) mit folgenden Bedingungen: Denaturierung: 94° C, 30 Sek.; Annealing 55° C, 1 Min.; Elongation: 72° C, 1 Min; und einem abschließenden Polymerisationsschritt bei 72° C für 10 Min. mit anschließender Dauerkühlung bei 4° C) amplifiziert. Zur Amplifikation wurden die Primer C (5' Primer: 5'-GGCGGGAGATCCTGTGCCTTCTAGTTGCC-3 ; SEQ ID NO:4) und Primer D (3' Primer: 5'-GGCGGGGGATCCCCATAGAGCCCACCGC-3'; SEQ ID NO:5) verwendet. Die in den Primern enthaltenen Schittstellen (BglII im 5' Primer; BamHI im 3` Primer sind kursiv dargestellt). Die mittels der PCR amplifizierte Bande wurde dann wie vorstehend beschrieben aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BglII und BamHI gespalten und die in der Art erhaltene Bande in das mit BglII linearisierte Plasmid pcDNA3.1(+)OX40L ligiert. Der so erzeugte Vektor wurde pcDNA3.1(+)OX40LA genannt.
  • Anschließend wurde das Gen für das „enhanced green fluorescent protein" (eGFP) mittels PCR unter Verwendung geeigneter PCR Bedingungen (Einleitender Denaturierungsschritt: 94° C, 2 Min; anschließende 3-Stufen PCR (35 Zyklen) mit folgenden Bedingungen: Denaturierung: 94° C, 30 Sek.; Annealing 55° C 1 Min.; Elongation: 72° C, 2 Min; und einem abschließenden Polymerisationsschritt bei 72° C für 10 Min. mit anschließender Dauerkühlung bei 4° C) aus dem Plasmid pRC/CMV-EGFP (Vogel et al., 1998, BioTechniques 143, 1967-1983) amplifiziert. Zur Amplifikation wurden die Primer E (5' Primer: 5'-GGCGGGGGATCCCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3'; SEQ ID NO:6) und Primer F (3' Primer: 5'-GGCGGGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3 ; SEQ ID NO:7) verwendet. Die mittels der PCR amplifizierte spezifische Bande mit einer Größe von 752 by wurde dann wie vorstehend beschrieben aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und BglII gespalten und die erhaltene Bande in das mit BglII linearisierte Plasmid pcDNA3.1(+)OX40LA ligiert. Der so erzeugte 7387 by umfassende Vektor wurde pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP (2) genannt. Dieser Vektor kann als Vektorbackbone für die Klonierung der erfindungsgemäßen Vektoren zur Epitopsuche und dem Nachweis reaktiver T-Zellen verwendet werden.
  • Anschließend wurde die cDNS für das EBV BZLF1 Protein mittels PCR unter Verwendung geeigneter PCR-Bedingungen (Einleitender Denaturierungsschritt: 94° C, 2 Min; darauffolgend eine 3-Stufen PCR (15 Zyklen) mit folgenden Bedingungen: Denaturierung: 94° C, 30 Sek.; Annealing 52° C, 1 Min.; Elongation: 72° C, 2 Min; danach nochmals (25 Zyklen) mit folgenden Bedingungen: Denaturierung: 94° C, 30 Sek.; Annealing 62° C, 1 Min.; Elongation: 72° C, 2 Min; und einem abschließenden Polymerisationsschritt bei 72° C für 10 Min. mit anschließender Dauerkühlung bei 4°C) aus viraler DNA des EBV Stammes B95-8 in der Gesamt-DNS infizierter Marmoset-Zellen amplifiziert. Bei der PCR Reaktion zur Amplifikation des BZLF1 cDNS wurde dem PCR Ansatz 2,5% DMSO beigefügt. Zur Amplifikation wurden die Primer G (5' Primer: 5'-GGCGGTCTAGATTAGAAATTTAAGAGATCC-3'; SEQ ID NO:8) und Primer H (3' Primer: 5'-GGCGGGGAATTCATGATGGACCCAAACTCG-3 ; SEQ ID NO:9) verwendet. Die mittels der PCR amplifizierte 970 Nukleotide umfassende Bande wurde dann wie vorstehend beschrieben aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI gespalten und die erhaltene Bande in das ebenfalls mit EcoRI und XbaI linearisierte Plasmid pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP ligiert. Der so erzeugte Vektor wurde pcDNA3.1(+)0X40LAeGFP-Z (3) genannt.
  • Alternativ wurde die cDNS für das MBP-Protein mittels PCR unter Verwendung geeigneter Bedingungen (Einleitender Denaturierungsschritt: 94° C, 2 Min; darauf folgend eine 3-Stufen PCR (35 Zyklen) mit folgenden bedingungen: Denaturierung: 94° C, 30 Sek.; Annealing 55° C, 1 Min.; Elongation: 72° C, 2 Min; und einem abschließenden Polymerisationsschritt bei 72° C für 10 Min. mit anschließender Dauerkühlung bei 4° C) aus Gesamt DNS von Hirnzellen amplifiziert. Zur Amplifikation wurden die Primer I (5' Primer: 5'-GGCGGTCTAGAATGGCGTCACAGAAGAGACC-3'; SEQ ID NO:10) und Primer J (3' Primer: 5'-GGCGGGGAATTCTCAGCGTCTAGCCATGGG-3'; SEQ ID NO:11) verwendet. Die mittels der PCR amplifizierte 585 Nukleotide umfassende Bande wurde dann wie vorstehend beschrieben aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI gespalten und die erhaltene Bande in das ebenfalls mit EcoRI und XbaI linearisierte Plasmid pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP ligiert. Der so erzeugte Vektor wurde pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-MBP (4) genannt. Die Korrektheit der Sequenz und Orientierung der in die jeweiligen Vektoren integrierten Polynukleotide wurde mittels Sequenzierung bestätigt.
  • Beispiel 2: Aufreinigung von APC (B-Zellen) zu Herstellung der erfindungsgemäßen APC
  • Die Gewinnung von spezifischer Populationen antigenpräsentierender Zellen (APC) erfolgte üblicherweise aus aus Vollblut aufgereinigten peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMCs). Die Gewinnung von PBMC aus dem Vollblut von freiwilligen Spendern oder Patienten erfolgte wie nachfolgend beschrieben: Frisch abgenommenes Vollblut eines gesunden Probanden wurde mit 25 IU/ml Heparin versetzt. 50 ml-Leukosep-Gefäße mit Trennmembran wurden mit 15 ml Ficoll- Histopaque (Sigma, Deisenhofen) befüllt und 2 min bei 500 × g zentrifugiert. Die Röhrchen wurden mit dem heparinisierten Vullblut befüllt und 1:1 mit RPMI 1640 Medium verdünnt. Die Ansätze wurden 30 min bei 500 x g zentrifugiert, ohne den Rotor am Ende des Laufes abzubremsen. Die lymphozytenhaltige, trübe Interphase wurde vorsichtig abgezogen und in 3 Volumina T-Zell-Medium (RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem (30 Min. bei 56° C) fötalem Kälberserum (FKS), 2 mM Glutamin und 100 mg/ml Kanamycin bzw. Gentamycin (alle Komponenten von PanSystems, Aidenbach)) dreimal gewaschen und mit einer Zellzahl von 2 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% FKS, 100μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, und 2 mM G1utaMAX (Invitrogen/Live Technologies) aufgenommen und bis zur weiteren Aufreinigung von definierten APC- und T-Zellpopulationen bei 3?°C in einem befeuchteten Brutschrank mit 5% CO-, Begasung aufbewahrt. Die Aufreinigung von B-Zellen aus frisch präparierten PBMC erfolgte durch positive Selektion mittels immunomagnetischer CD19 MicroBeczts nach dem Protokoll des Herstellers (Miltenyi Biotec).
  • Dazu wurden isolierte PBMC gezählt und in einer Konzentration von 107 PBMC/80 μl MACS Puffer (PBS, 0,5% BSA und 2 mM EDTA, entgast) aufgenommen. Pro 10' PBMC wurden 20 μl MACS CD 19-MicroBeads zugesetzt und 15 Min. bei 6°C inkubiert. Anschließend wurde die markierte Zellsuspension mit 2 ml Puffer pro 107 PBMC versetzt und 10 Min. bei 300 × g in einer Hettich-Rotanta-Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde sorfältig abgezogen und die Zellen in 500 μl MACS-Puffer aufgenommen. Vor dem Auftragen auf die Säule wurden die Zellen durch Applikation eines Zellnetzes, 70 μm Maschengröße (BectonDickinson, Heidelberg) vereinzelt. Zur positiven Selektion der magnetisch markierten Zellen wurden Säulen des Typs XS+ gewählt (max. 109 positive Zellen) und in einem MACS Separator (Miltenyi Biotec, Deutschland) plaziert. Die Säulen wurden ein- bis zweimal mit 10 ml MACS Puffer gewaschen bis der Durchfluß klar war. Anschließend wurden die vereinzelten Zellen auf die vorbereitete Säule aufgetragen und die Negativfraktion eluiert. Die Säule wurde wiederum 3 × mit MACS Puffer gewaschen, aus dem MACS-Separator genommen und in ein steriles Plastikgefäß überführt. Die B-Zellen wurden anschließend durch Auftrag von MACS-Puffer und Ausübung eines leichten Drucks mittels eines zur Säule gehörenden Stempels eluiert. Danach wurden die Zellen bis zur Transfektion mit einer Zellzahl von 1 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% FKS, 100μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, und 2 mM G1utaMAX (Invitrogen/Live Technologies) bei 37°C in einem befeuchteten Brutschrank mit 5% CO2 Begasung aufbewahrt.
  • Beispiel 3: Transfektion von B-Zellen mit dem erfindungsgemäßen Vektor.
  • Exemplarisch erfolgte die Transfektion der gereinigten B-Zellen mit dem erfindungsgemäßen Vektor pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-Z mittels der NucleovectorTM Technologie unter Verwendung des Human B Cell NucleofectorTM Kits nach dem detaillierten Protokoll des Herstellers (Amaxa, Deutschland). Nach erfolgter Electroporation wurden die Zellen mit einer Zellzahl von 1 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% FKS, 100μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, und 2 mM G1utaMAX (Invitrogen/Live Technologies) aufgenommen und 12 bis 24 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Brutschrank mit 5% CO2 Begasung inkubiert. Nachdem bei den mit dein erfindungsgemäßen Vektor pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-Z transfizierten B-Zellen eine Produktion des EBV-BZLF1-Proteins nachweisbar war, wurde diese in Kokultivierungsexperimenten mit T-zellhaltigen Zellpopulationen des selben Patienten eingesetzt.
  • Beispiel 4: Kokultivierung von T-Zellen und erfindungsgemäßen APC zur Epitopsuche und/oder dem Nachweis reaktiver T-Zellen.
  • Die Austestung der Eignung der erfindungsgemäßen APC zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen und zur Epitopsuche wurde anhand eines sehr gut charakterisierten Modelsystems durchgeführt. Dieses beruht auf den Versuchungsergebnissen, dass alle HLA B8-positiven, EBVpositiven Probanden mit hoher Vorläuferfrequenz CD8+ zytotoxische Z-Zellen besitzten, die ein spezifisches Epitop (RAKFKQLL; Aminosäure 190-197) innerhalb des EBV Proteins BZLF1 erkennen (Bogedain et al., 1995, J. Virol. 69, 4872-4879; Benninger-Döring et al., 1999, Virol. 264, 289-297). Für den Nachweis von Zielepitopen reaktiver T-Zellen innerhalb des BZLF-1 Proteins des Epstein-Barr Virus wurde einem HLA-B8 positiven EBV seropositiven Spender (SD) und zur Kontrolle einem HLA-B8 negativen EBV seropositiven Spender (SD) Vollblut entnommen, daraus PBMCs präpariert und verschiedene Populationen von T-Zellen durch positive Selektion aus frisch präparierten PBMC mittels immunomagnetischer CD3+- oder alternativ CD4+- bzw. CD8+ Beats nach dem Protokoll des Herstellers (Miltenyi Biotec) gewonnen.
  • Die gewonnenen autologen T-Zellen wurden anschließend mit mittels des erfindungsgemäßen Vektors pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Z erzeugten Epitup-präsentierenden B-Zellen kokultiviert. Dazu wurden in 20 parallelen Ansätzen verschiedene Verhältnisse (10:1 bis 1:10) von T-Zellen und erfindungsgemäß veränderten B-Zellen mit einer Gesamtzellzahl von 5 × 106 Zellen in RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% FKS, 100μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, und 2 mM G1utaMAX (Invitrogen/Live Technologies) für 6 bis 24 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Brutschrank mit 5% CO2 Begasung inkubiert.
  • Beispiel 5: Nachweis und Isolierung fluoreszierender APC mittels FACSscan und FACSSorting.
  • Das Fluorescence activated cell scan (FACS) erlaubt die Messung der Fluoreszenzintensität einzelner Zellen in einer gemischten Zellpopulation mit Hilfe eines Durchflußzytometers. Dazu wurden die Zellen nach erfolgter Kokultivierung in 0,1% EDTA/PBS aufgenommen. Die Durchflußzytometrie erfolgte an einem FACS CALIBUR, Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA), die Auswertung mit Hilfe des WinMdi Programms in der DotBlot Darstellung. Die Separation fluoreszierender APC wurde an einem FacsStarPlus Gerät der Firma Becton Dickinson durch die FACS-Methode durchgeführt. Dazu wurden die geernteten Zellen in PBS aufgenommen, durch die FACS-Methode separiert und in einem Plastikgefäß in dem RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% FKS, 100μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin vorgelegt wurde, aufgenommen. In den unterschiedlichen Kokultivierungsansätzen konnten in Abhängigkeit von dem Verhältnis der verwendeten T-B-Zellen 0,001 bis 1 % B-Zellen detektiert werden, welche eine meßbar gesteigerte Fluoreszenz aufwiesen. In in gleicher Weise durchgeführte Untersuchungen mit Zellen eines EBV-positiven, HLA B8-negativen Spenders (LD) ergaben dagegen keine signifikant gesteigerte Zahl fluoreszierender APC. Dieser Befund belegt, dass dieses Verfahren zum Nachweis Epitop-spezifischer Zellen geeignet ist.
  • Beispiel 6: Überprüfung der Epitopspezifität T-Zellerkennung von Epitop-präsentierenden APCs.
  • Um zu überprüfen, ob die Induktion der Markerexpression in dem zuvor beschriebenen Experiment Epitop-spezifisch erfolgte wurden Kontrollexperimente durchgeführt. Hierzu wurde wiederum dem HLA-B8 positiven EBV-seropositiven Spender (SD) und zur Kontrolle dem HLA-B8 negativen EBV- seropositiven Spender (SD) (beide Spender sind HN negativ) Vollblut entnommen, daraus PBMCs präpariert und T-Zellen durch positive Selektion aus frisch präparierten PBMC mittels immunomagnetischer CD3+-Beats nach dem Protokoll des Herstellers (Miltenyi Biotec) gewonnen. Diese wurden dann entweder (A) mit mittels des erfindungsgemäßen Vektors pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Z oder (B) mittels eines, anstelle des EBV BZLF1 das HIVHTLV/III Gag Protein (Ratner et al., 1985, Nature 313, 277-284) exprimierenden pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Gag Plasmids oder mittels einem 1:1 Gemisch aus mit dem Plasmid pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Z und dem Plasmid pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Gag transfizierten B-Zellen kokultiviert. Vor der Kokultivierung der transformierten B-Zellen mit autologen T-Zellen wurde die Expression des BZLF1- oder Gag Proteins in den jeweiligen transfizierten B-Zellen mittels Immunoblotting bestätigt. Dann wurden in jeweils 20 parallelen Ansätzen verschiedene Verhältnisse (10:1 bis 1:10) von autologen T-Zellen und erfindungsgemäß mittels beider Vektoren veränderten B-Zellen mit einer Gesamtzellzahl von 5 × 106 Zellen in RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% FKS, 100μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, und 2 mM G1utaMAX (Invitrogen/Live Technologies) für 6 bis 24 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Brutschrank mit 5% CO, Begasung inkubiert.
  • In diesen Experimenten zeigten nur APC in gemischten APC/T-Zellkulturen eine meßbar gesteigerte Fluoreszenz, welche mit dem Vektor pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Z veränderte APC oder Mischkulturen von mit dem Vektor pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Z und pcDNA3(+)OX40LAeGFP-Gag behandelten APC zusammen mit autologen T-Zellen des HLA-B8-positiven, EBV-positiven Spenders SD enthielten.
  • Beispiel 7: Identifikation der Polynukleotide, welche für die Zielpolypeptide reaktiver T-Zellen kodieren.
  • Zur Identifizierung der von den reaktiven T-Zellen des HLA B8-positiven Spenders (SD) erkannten Polypeptide wurden alle APC, welche eine erhöhte Fluoreszenz aufwiesen mittels FACSSort selektioniert, gesammelt und aus diesen APC Gesamt DNS präpariert. Zur Transformation der Gesamt-DNS in Bakterien wurden 20 μl der DH10B Bakteriensuspension mit 1 μg Gesamt-DNS versetzt und etwa 5 mSec. bei einer Spannung von 2.400 V elektroporiert. Danach wurden die Bakterien kurz auf Eis abgekühlt, anschließend mit 1 ml LB-Meduim versetzt und 1,5 Std. bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Schließlich wurden unterschiedliche Mengen der Bakteriensuspension auf LBAmp Selektionsplatten ausplattiert. Diese wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. In diesen Experimenten konnte durch Transfektion von 1 μg Gesamt-DNS eine signifikante Zahl Ampicillin-resistenter Klonien/Platte (10-100) erzeugt werden. Durch PCR-Analyse der Bakterienklone unter Verwendung geeigneter EBV BZLF1 und Gagspezifischer Primer, sowie durch Sequenzierung der aus den Bakterienklonen gewonnenen Plasmide mittels geeigneter Sequenzierprimer konnte gezeigt werden, dass alle resistenten Bakterienklone den pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-Z Vektor und nicht den pcDNA3.1(+)OX40LAeGFP-Gag Vektor enthielten.
  • Beispiel 8: Nachweis spezifischer vektorkodierter Polynukleotide aus dem Genom stabil transfizierter Insektenzellen.
  • In den frühen 90-ern wurde von Wolff und Mitarbeitern eine sehr sensitive Methode beschrieben, die es erlaubt, selbst episomaler, aber auch stabil in das Genom der transfizierten Zellen integrierter Plasmide nachzuweisen (Wolff et al. 1991). Dieses Nachweisverfahren beruht auf der Beobachtung, dass episomal in der Zelle vorliegende Plasmide, nicht jedoch stabil in das Genom einer Wirtszelle integrierte Plasmide nach Gesamt-DNS Extraktion und anschließender Elektroporation der DNS in Bakterien zur Ausbildung Antibiotika-resistenter Kolonien führen. Das Plasmid muß hierzu einen bakteriellen Replikationsursprung und ein selektierbares bakterielles Resistenzgen enthalten.
  • In Kontrollexperimenten konnte nach Elektroporation von 1 pg, 5 pg und 10 pg des für das kleine Hüllprotein (HBsAg) des Hepatitis B Virus kodierende Plasmid pAM-HBsAg (Deml et al., J. Virol. Methods, (1999), 79:191-203) eine Transformationseffizienz von etwa 108 Kolonien pro μg transfizierter Plasmid-DNS ermittelt werden. Eine vergleichbare Elektroporationseffizienz wurde beobachtet, wenn die Plasmid-DNS zusammen mit 1 μg chromosomaler DNS aus Drosophila Schneider-2 (DS-2) Zellen verabreicht wurde. Somit wird die Elektroporationseffizienz von Plasmiden nicht durch die Anwesenheit von chromosomaler DNS beeinträchtigt. Durch Elektroporation der entsprechenden linearisierter Plasmid-DNS konnten dagegen nur sehr wenige Ampicillin-resistente Bakterienkolonien erzeugt werden.
  • Um zu überprüfen, ob das durch Lipofektion in DS-2 Insektenzellen transfizierte Plasmid pAM-HBsAg extrachromosomal oder integriert im Genom der Zellen vorliegt, wurde in drei unabhängigen Ansätzen Gesamt-DNS aus dieser Zellinie präpariert und in Bakterien transfiziert. Zur Kontrolle wurden Bakterien mit Gesamt-DNS aus nicht transfizierten DS-2 Zellen transformiert. In beiden Fällen konnte durch Transfektion von 1 μg Gesamt-DNS nur sehr wenige Ampicillin-resistente Klonien erzeugt werden. Durch PCR-Analyse unter Verwendung HBsAg-spezifischer Primer konnte gezeigt werden, dass keiner dieser resistenten Bakterienklone das HBsAg-Gen enthielt. Aus diesen Experimenten kann somit abgeleitet werden, dass die aus stabil transfizierten DS-2 Zellen präparierte Gesamt-DNS keine nachweisbaren Mengen episomal vorliegender pAM-HBsAg Plasmid-DNS enthielt.
  • In weiteren Elektroporationsstudien sollte gezeigt werden, dass Plasmid-DNS integriert im Genom der stabil transfizierten klonalen DS-2 Zellinie vorliegt. Dazu wurde aus der stabil transfizierten DS-2 Zellinie und nichttransfizierten DS-2 Zellen Gesamt-DNS gewonnen, mit ausgewählten Restriktionsenzymen geschnitten, religiert und in Bakterien transfiziert. Durch diese Vorgehensweise sollten integriere Kopien des Expressionsplasmids pAM-HBsAg in extrachromosomale Plasmide überführt werden, die nach Elektroporation in Bakterien durch Vermittlung einer Ampicillinresistenz nachgewiesen werden können. Das zur Spaltung der Gesamt-DNS eingesetzte Restriktionsenzym EcoRV schneidet das Plasmid pAM-HBsAg singulär im Bereich zwischen dem Mtn-Promotor und dem Leserahmen für das HBsAg-Reporter-Gen. Durch Verdau der chromosomalen DNS der stabil mit pAM-HBsAg transfizierten DS-2 Zellen mit EcoRV, Religation und Elektroporation in E. coli konnten mehr als 200 Ampicillin-resistente Bakterienkolonien gewonnen werden. Mehr als 80 % der etablierten Bakterienklone erwiesen sich in der PCR als HBsAg-positiv. Zur weiteren Charakterisierung dieser Klone wurde die Plasmid-DNS aus E. coli präpariert und mit EcoRV verdaut. Die meisten dieser Bakterienklone enthielten das "Input"-Plasmid pAM-HBsAg in der ursprünglichen Größe von etwa 8,2 kBp. Diese Plasmide mit zu pAM-HBsAg unveränderter Größe resultieren wahrscheinlich aus Plasmiden, die in mehrfacher Kopienzahl an einem Integrationsort in das Genom der Wirtszelle integrierten. Etwa 15 % der analysierten HBsAg-positiven Bakterienklone beinhalteten Plasmide, die eine von dem Koexpressionsplasmid pAM-HBsAg abweichende Größe aufwiesen. Diese Plasmide wurden wahrscheinlich an Übergangsbereichen von chromosomaler DNS und der integrierten Plasmid-DNS aus dem Genom ausgeschnitten, wobei neben der Plasmid-kodierten eine weitere in Nachbarschaft zum integrierten Plasmid befindliche, genomische EcoRV Schnittstelle genutzt wurde. Nach Transfektion vor Bakterien mit in gleicher Weise behandelter chromosomaler DNS aus nicht transfizierten DS-2 Zellen konnten 22 Ampicillin resistente Bakterienkolonien erzeugt werden. Diese erwiesen sich alle in der PCR-Analyse als HBsAgnegativ.
  • Vergleichbare Ergebnisse wurden nach Elektroporation von mit der Restriktionsendonuklease Eco RI verdauter Gesamt-DNS aus der stabil transfizierten DS-2 Zellinie und nicht transfizierten DS-2 Zellen erzielt. EcoRI spaltet das Plasmid pAM-HBsAg an zwei Stellen, wodurch zwei Fragmente von etwa 4,7 kBp und 3,5 kBp entstehen. Das größere Fragment beinhaltet neben der kodierenden Region für den Metallothionein (Mtn)-Promotor und das HBsAg-Reporter-Konstrukt auch den bakteriellen Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen, und somit alle wichtigen Komponenten, um nach Religation und Transformation Amphicillinresistente Bakterien erzeugen zu können. Das kleinere 3,5 kBp Fragment beinhaltet dagegen keine der zur Ausbildung Ampicillin-resistenten Bakterienklone erforderlichen Sequenzen. Nach der Religation und Elektroporation von mit EcoRI verdauter DNS konnten 295 Bakterienkolonien auf Amphicillin-haltigen LB-Platten ausgezählt werden. Durch Analyse der aufgereinigten Plasmid-DNS mittels EcoRI Restriktionsverdau, konnte gezeigt werden, dass 43 von 46 getesteten HBsAg-positiven Klonen ein 4,7 kBp DNS-Fragment beinhalteten. 4 der 46 extrahierten Plasmide entsprachen nach einem EcoRI Verdau dem Bandenmuster des EcoRI geschnittenen pAM-HBsAg Plasmids. Nach der analytischen Restriktionsenzymspaltung mit EcoRI, konnte bei einigen Plasmid-Präparationen zusätzlich zum 4,7 kBp Fragment noch kleinere DNS-Fragmente detektiert werden. Diese Fragmente könnten von chromosomalen Sequenzen stammen, die während des EcoRI Verdaus aus chromosomaler DNS gespalten und mit dem 4,7 kBp Fragment zu einem größeren Plasmid religiert wurden. Etwa 5 % der analysierten HBsAg-positiven Bakterienklone enthalten ausschließlich 1 Plasmid, das die kodierende Sequenz des HBsAg beinhaltet, jedoch in der Größe von dem 4,7 kBp Fragment abweicht. Diese Plasmide entstammen wahrscheinlich wiederum dem Übergangsbereich zwischen chromosomaler DNS und der in mehrfacher Kopienzahl an einem Integrationsort in das Genom der Wirtszelle einrekombinierten Plasmid-DNS. Die nach Transfektion von chromosomaler DNS aus nicht transfizierten DS-2 Zellen erzeugten Ampicillin-resistenten Bakterienkolonien erwiesen sich in der PCR-Analyse mit spezifischen Primern als HBsAg-negativ.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00450001
    Figure 00460001
    Figure 00470001
    Figure 00480001
    Figure 00490001

Claims (17)

  1. Gentransfervektor, enthaltend einen spezifisch in antigenpräsentierenden Zellen durch den epitop-spezifischen Kontakt mit einer T-Zelle induzierbaren ersten Promotor, eine mit diesem ersten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure kodierend ein Markergen, einen in antigenpräsentierenden Zellen konstitutiven zweiten Promotor, und eine mit diesem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure.
  2. Gentransfervektor nach Anspruch 1, wobei der induzierbare erste Promotor ein Promotor für den OX-40 Liganden (OX-40L), den 4-1BB Liganden (4-1BBL), das kostimulatorische Protein B7.1 (CD80), das kostimulatorische Protein B7.2 (CD86) oder für den Fas Liganden (Fast) ist.
  3. Gentransfervektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Markergen ein fluoreszierendes Polypetid, Luziferase (LUC), alkalische Phosphatase (AP), sekretorische alkalische Phosphatase (SEAP), Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT), Photinus-Luciferase, ß-Glucuronidase (GUS), Renilla Luciferase, β-Galaktosidase (β-Gal), mikrobielle Struktur- oder Hüllproteine, OX-40 Ligand (OX-40L), 4-1BB Ligand (4-1BBL), B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), Fas Ligand (FasL), oder natürlicherweise in APC nicht vorkommende intrazelluläre und membranständige Polypeptide kodiert.
  4. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der konstitutive zweite Promotor der frühe SV40 Promotor, der Cytomegalovirus (CMV) Promotor, der Respiratory Syncytial Virus (RSV) Promotor, der Maus Mamma Tumorvirus (M1V1TV) LTR Promotor, der humane Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) LTR Promotor, der Adenovirus major late-Promotor (Ad MLP), der Herpes Simplex Virus (HSV) Promotor, der murine 3-Phosphoglycerat-Kinase Promotor, der humane Ubiquitin C-Promotor, der humane EF-1α Promotor, der humane β-Caseinpromotor oder der murine Metallothionein Promotor ist.
  5. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mit dem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure aus einer cDNA-Bank oder einer genomischen Bank stammt.
  6. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ferner enthaltend einen bakteriellen Replikationsursprung (ori) und ein Resistenzgen.
  7. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner enthaltend Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, die den konstitutiven zweiten Promotor und die mit diesem zweiten Promotor funktionell verbundene Nukleinsäure sowie den bakteriellen Replikationsursprung und die kodierende Sequenz für die bakterielle Resistenz flankieren.
  8. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ferner enthaltend einen dritten Promotor funktionell verbunden mit einem Markergen.
  9. Verfahren zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen, enthaltend die folgenden Schritte: a) Isolierung von APC-haltiger und/oder T-zellhaltiger Körperflüssigkeit, vorzugsweise von Blut oder Liquor, b) in Kontakt bringen von APC-haltiger Körperflüssigkeit mit den Gentransfervektoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, c) Inkubieren der Körperflüssigkeit enthaltend die transduzierten APC oder von isolierten transduzierten APC mit der Körperflüssigkeit enthaltend die T-Zellen oder die isolierten T-Zellen, und d) Nachweis von Marker exprimierenden APC.
  10. Verfahren zum Nachweis zum Nachweis von Zielepitopen reaktiver T-Zellen, enthaltend die folgenden Schritte: a) Isolierung von APC-haltiger und/oder T-zellhaltiger Körperflüssigkeit, vorzugsweise von Blut oder Liquor, b) in Kontakt bringen von APC-haltiger Körperflüssigkeit mit den Gentransfervektoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, c) Inkubieren der Körperflüssigkeit enthaltend die transduzierten APC oder von isolierten transduzierten APC mit der Körperflüssigkeit enthaltend die T-Zellen oder die isolierten T-Zellen, d) Nachweis von Marker exprimierenden APC, und e) Isolierung und Charakterisierung der mit dem zweiten Promotor funktionell verbundenen für die Zielepitope reaktiver T-Zellen kodierenden Nukleinsäure.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die APC-haltige Körperflüssigkeit in Schritt b) Blut, eine gereinigte PBMC-Population oder eine separierte APC-Population ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Zeitraum des in Kontakt bringens in Schritt a) und der Zeitraum des Inkubierens in Schritt c) mindestens von 2 bis 36 Stunden beträgt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die isolierten T-Zellen CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD161+ NKT Zellen, CD4+CD25+ Suppressor T-Zellen, oder ein Gemisch aus CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD161+ NKT-Zellen und/oder CD4+CD25+ T-Zellen sind.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei der Marker in Schritt d) ein Polypeptid ist, das natürlicherweise nach Epitop-spezifischer Erkennung einer APC durch eine T-Zelle in seiner Expression messbar gesteigert oder reduziert wird.
  15. Antigenpräsentierende Zelle, transduziert mit Gentransfervektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  16. Antigenpräsentierende Zelle nach Anspruch 15, wobei die antigenpräsentierende Zelle eine dendritische Zelle (Langerhanns Zelle), Monozyt, Makrophage, B-Zelle, vaskuläre endotheliale Zelle, epitheliale oder mesenchymale Zelle ist.
  17. Verwendung der antigenpräsentierenden Zelle nach Anspruch 15 oder 16 zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen und zum Nachweis von Zielepitopen reaktiver T-Zellen.
DE2001156863 2001-11-20 2001-11-20 Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen Expired - Fee Related DE10156863B4 (de)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10164819A DE10164819A1 (de) 2001-11-20 2001-11-20 Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen
DE2001156863 DE10156863B4 (de) 2001-11-20 2001-11-20 Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen
DE50210523T DE50210523D1 (de) 2001-11-20 2002-11-20 Verfahren zur identifizierung von zielepitopen der t-zell-vermittelten immunantwort und zum nachweis epitop-spezifischer t-zellen
PCT/DE2002/004270 WO2003046212A2 (de) 2001-11-20 2002-11-20 Verfahren zur identifizierung von zielepitopen der t-zell-vermittelten immunantwort und zum nachweis epitop-spezifischer t-zellen
US10/495,843 US7659058B2 (en) 2001-11-20 2002-11-20 Method for identifying target epitopes of the T cell mediated immune response and for assaying epitope-specific T cells
AT02796502T ATE367444T1 (de) 2001-11-20 2002-11-20 Verfahren zur identifizierung von zielepitopen der t-zell-vermittelten immunantwort und zum nachweis epitop-spezifischer t-zellen
EP02796502A EP1448781B1 (de) 2001-11-20 2002-11-20 Verfahren zur identifizierung von zielepitopen der t-zell-vermittelten immunantwort und zum nachweis epitop-spezifischer t-zellen
AU2002361929A AU2002361929A1 (en) 2001-11-20 2002-11-20 Method for identifying target epitopes of the t cell mediated immune response and for assaying epitope-specific t cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10164819A DE10164819A1 (de) 2001-11-20 2001-11-20 Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen
DE2001156863 DE10156863B4 (de) 2001-11-20 2001-11-20 Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE10156863A1 DE10156863A1 (de) 2003-06-05
DE10156863B4 true DE10156863B4 (de) 2004-06-09

Family

ID=32313522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2001156863 Expired - Fee Related DE10156863B4 (de) 2001-11-20 2001-11-20 Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE10156863B4 (de)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997026325A1 (en) * 1996-01-16 1997-07-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and their uses for transfer of down-regulatory genes into cells associated with inflammatory responses
WO2000067761A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 Wake Forest University Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997026325A1 (en) * 1996-01-16 1997-07-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and their uses for transfer of down-regulatory genes into cells associated with inflammatory responses
WO2000067761A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 Wake Forest University Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosis 2002: 163 468/AN (Abstr. zu: Cui, Y. et al., Blood 98, Nr. 11, Part 1, 2001, pp 214a) *
Medline 2000 092 353/AN (Abstr. zu: Takayama, T. et al., Transplantation 68(12), 1999, 1903-9) *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10156863A1 (de) 2003-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1257290B1 (de) Verfahren zur antigen-spezifischen stimulation von t-lymphozyten mit synthetischen peptidbibliotheken
Flügel et al. Gene transfer into CD4+ T lymphocytes: green fluorescent protein-engineered, encephalitogenic T cells illuminate brain autoimmune responses
DE102010037622B4 (de) Verfahren zum Nachweis, Differenzieren und Quantifizieren von T-Zellpopulationen mittels der Reverse Transkription quantitativen Real-Time PCR (RT-qPCR) Technologie
DE60034947T2 (de) Virusähnliche partikel, vorbereitung und verwendung in screening und funktionelle genomanwendung
EP3810764A2 (de) Durch transposon der hat-familie vermittelter verbesserter gentransfer und zugehörige zusammensetzungen, systeme und verfahren
Carpenter et al. Neurofilament triplet protein interactions: evidence for the preferred formation of NF-L-containing dimers and a putative function for the end domains
Tohill et al. Green fluorescent protein is a stable morphological marker for schwann cell transplants in bioengineered nerve conduits
Kreiter et al. Simultaneous ex vivo quantification of antigen-specific CD4+ and CD8+ T cell responses using in vitro transcribed RNA
EP3628744B1 (de) Intrazelluläre aufzeichnungselektrode und verfahren zur messung des membranpotenzials/membranstroms einer zelle
EP1448781B1 (de) Verfahren zur identifizierung von zielepitopen der t-zell-vermittelten immunantwort und zum nachweis epitop-spezifischer t-zellen
Roan et al. Antigen-specific CD8+ T cells respond to Chlamydia trachomatis in the genital mucosa
EP3265480B1 (de) System zur präsentation von peptiden auf der zelloberfläche
DE10156863B4 (de) Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen
DE69723681T2 (de) Verfahren zur identifizierung von mhc-class i beschränkten, durch einen zellulären sekretorischen weg endogen verarbeiteten antigenen
DE69830594T2 (de) Dna expression in transfizierten zellen und testverfahren in transfizierten zellen
DE60037263T2 (de) Virus-ähnliche Partikel, ihre Herstellung und ihre Verwendung beim pharmazeutischen Screening und funktionelle Genomanwendungen
DE102005016234B4 (de) Verfahren zur Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen
CN110423777A (zh) 无荧光染料标记外泌体及其制备方法
EP1487497B1 (de) Verwendung harnstoff-adjuvierter polypeptide zur diagnose, prophylaxe und therapie
Cools et al. mRNA electroporation as a tool for immunomonitoring
Yanamandra Guruvenkata Response of immune killer cells to mechanical cues and living therapeutic materials
DE60210979T2 (de) Vektor zur phänotypischen charakterisierung von v3-sequenzen aus dem gp120-protein von hiv-1
US7435546B2 (en) System to detect inducible translocation
DE102018010282A1 (de) Verfahren zur Feststellung der Wirksamkeit von viralen Vektoren
CN117230097A (zh) 一种检测程序性细胞坏死的双分子荧光片段互补体系及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8364 No opposition during term of opposition
8369 Partition in:

Ref document number: 10164819

Country of ref document: DE

Kind code of ref document: P

Q171 Divided out to:

Ref document number: 10164819

Country of ref document: DE

Kind code of ref document: P

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: LOPHIUS BIOSCIENCES GMBH, 93053 REGENSBURG, DE

8381 Inventor (new situation)

Inventor name: DEML, LUDWIG, DR., 93128 REGENSTAUF, DE

R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee