DE102005016234B4 - Verfahren zur Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen - Google Patents
Verfahren zur Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen Download PDFInfo
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- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
Abstract
In
vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter
zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse
I-Präsentationsweg
von Zellen, umfassend die Schritte von
a) ein in Kontakt bringen von geeigneten antigenpräsentierenden Zellen mit einem Hämolysin und einer Marker-Substanz,
b) Messung des Einstroms der Substanz in die Zellen, und
c) geeignete Modifizierung der spezifischen Parameter,
wobei die spezifischen Parameter ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
– der Zelllinie oder Primärzelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll;
– der Qualität der eingesetzten Zellen;
– der eingesetzten Zellkonzentration;
– dem Volumen der Ansätze;
– dem verwendeten Kulturmedium und/oder Puffer;
– der An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen während der Inkubation;
– der Serum- und/oder Cholesterinkonzentration;
– dem Antigen, das eingeschleust werden soll;
– dem Labormaterial, das während der Versuche verwendet wird;
– der Temperatur während der...
a) ein in Kontakt bringen von geeigneten antigenpräsentierenden Zellen mit einem Hämolysin und einer Marker-Substanz,
b) Messung des Einstroms der Substanz in die Zellen, und
c) geeignete Modifizierung der spezifischen Parameter,
wobei die spezifischen Parameter ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
– der Zelllinie oder Primärzelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll;
– der Qualität der eingesetzten Zellen;
– der eingesetzten Zellkonzentration;
– dem Volumen der Ansätze;
– dem verwendeten Kulturmedium und/oder Puffer;
– der An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen während der Inkubation;
– der Serum- und/oder Cholesterinkonzentration;
– dem Antigen, das eingeschleust werden soll;
– dem Labormaterial, das während der Versuche verwendet wird;
– der Temperatur während der...
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein zweistufiges in vitro Verfahren zur Einschleusung von exogenen Antigenen in den MHC Klasse-I-Präsentationsweg von antigenpräsentierenden Zellen (APCs), umfassend die Schritte von a) Bereitstellen von geeigneten antigenpräsentierenden Zellen, b) Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen, umfassend 1.) ein in Kontakt bringen der Zellen mit einem Hämolysin wie z.B. Listeriolysin (LLO) und einer Marker-Substanz, 2.) Messung des Einstroms der Marker-Substanz in die Zellen, und 3.) gegebenenfalls, geeignete Modifizierung der spezifischen Parameter, und c) Einschleusung des exogenen Antigens in die antigenpräsentierenden Zellen umfassend die direkte Übertragung der in Schritt b) ermittelten spezifischen Parameter, umfassend ein in Kontakt bringen der Zellen mit einem Hämolysin und dem einzuschleusenden Antigen. Die spezifischen Parameter können ausgewählt werden in Abhängigkeit von der Zelllinie oder primären Zelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll; der Zellqualität; der eingesetzten Zellkonzentration; dem Volumen der Ansätze; dem verwendeten Kulturmedium und/oder Puffer; der An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen während der Inkubation; der Serum- und/oder Cholesterinkonzentration; dem Antigen, das eingeschleust werden soll; dem Labormaterial, das während der Versuche verwendet wird; der Temperatur während der Inkubation; der Inkubationszeit der Zelllinie oder der primären Zellen mit dem Hämolysin; der Art des Hämolysins; wie das Hämolysin aufgereinigt wurde; der Konzentration des verwendeten Hämolysins; und dem Redoxzustand des Hämolysins bei der Inkubation.
- Hintergrund der Erfindung
- Professionell antigenpräsentierende Zellen, wie etwa dendritische Zellen (DCs), sind für die Induktion einer spezifischen zellulären Immunantwort verantwortlich. Die Stimulierung einer Immunantwort hängt somit von der Anwesenheit von Antigenen ab, die durch das Immunsystem des Wirts als fremd erkannt werden.
- Generell werden extrazelluläre Antigene nach ihrer Aufnahme durch antigenpräsentierende Zellen in vesikulären Kompartimenten degradiert und vorwiegend mit MHC Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche CD4+ T-Helferzellen präsentiert, was zur Aktivierung CD4+ T-Zellen führt. Endogen gebildete Antigene werden dagegen in der Regel mit Hilfe des Proteasom-Komplexes gespalten und von MHC Klasse I-Molekülen auf der Zelloberfläche CD8+ T-Zellen präsentiert.
- Um eine spezifische Immunantwort gegen Viren, intrazelluläre Baktererien und Tumorzellen hervorzurufen, ist die gezielte Induktion einer CD8+ zytotoxischen T-Zellantwort notwendig. Die Entdeckung der Existenz Tumor-assoziierter Antigene hat die Möglichkeit eröffnet, das Immunsystem eines Wirts dazu zu verwenden, das Tumorwachstum zu beeinflussen. Während antigenpräsentierende Zellen sehr effizient Antigene aufnehmen und daraus generierte Peptide MHC Klasse II-restringiert präsentieren können, sind die bislang bekannten Verfahren zur gezielten Einschleusung von extrazellulären Antigenen zur Präsentation mit MHC-Klasse I-Molekülen aufwendig und schwierig durchzuführen. Die MHC Klasse I-Präsentation von Antigen ist Voraussetzung zur Induktion einer CD8+ T-Zellantwort.
- CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) töten Zellen, die mit intrazellulären Pathogenen infiziert sind, wie zum Beispiel Viren, Parasiten oder Bakterien. CTLs erkennen spezifische Peptide, die von MHC Klasse I-Molekülen präsentiert werden. In der Regel assoziieren MHC I-Moleküle exklusiv mit Peptiden, die von endogen gebildeten Proteinen abgeleitet sind.
- Im Gegensatz dazu weisen professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs), wie zum Beispiel dendritische Zellen (DCs), Makrophagen und B-Zellen, die Fähigkeit auf, Antigene aus extrazellulären Quellen für eine Präsentation durch MHC I-Moleküle zu prozessieren. Dieser alternative MHC I-Präsentationsweg, auch als "Kreuzpräsentation" bezeichnet, spielt möglicherweise eine wichtige Rolle in der Generation der CTL-Immunität (Rock K.L. 1996. A new foreign policy: MHC class I molecules monitor the outside world. Immunology Today 17: 129–137; Jondal M., Schirmbeck R. and Reimann J. 1996. MHC class I-restricted CTL responses to exogenous antigens. Immunity 5: 295–302; Yewdell J.W. 1999. Mechanisms of exogenous antigen presentation by MHC class I molecules in vitro and in vivo: Implications for generating CD8+ T cell responses to infectious agents, tumors, transplants, and vaccines.
- Adv. in Immunol. 73: 7–77; Ackerman A.L. and Cresswell P. 2004. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. Nat. Immunol. 5(7): 678–84).
- APCs nehmen exogene Antigene über verschiedene Mechanismen, wie zum Beispiel Phagocytose, Makropinocytose, oder Rezeptor-vermittelte Endozytose auf (Lanzavecchia A. 1996. Mechanisms of antigen uptake for presentation. Curr. Op. in Immunol. 8: 348–354). Der genutzte Aufnahmemechanismus beeinflusst die Effizienz der Antigenprozessierung und-Präsentation. Zur Aktivierung von CTLs mittels der „Kreuzpräsentation" von löslichen Antigenen, welche die APCs über Makropinocytose oder Phagocytose aufgenommen haben, sind hohe Antigenkonzentrationen erforderlich (Watts C. 1997. Capture and processing of exogenous antigens for presentation an MHC molecules. Arm. Rev. Immunol. 15: 821–850). Die Aggregation von Antigen, die Kopplung mit Perlen oder die Assoziierung mit Hitzeschock-Proteinen hat eine Verstärkung der MHC I-Präsentation zur Folge (Kovacsovics-Bankowski M. and Rock K.L. 1995. A phagosome to cytosol pathway for exogenous antigens presented an MHC class I molecules. Science 267: 243–246; Singh-Jasuja H. et al. 2000. Cross-presentation of glycoprotein 96-associated antigens an major histocompatibility complex. class I molecules requires receptor-mediated endocytosis. J. Exp. Med. 191: 1965–1974; Castellino F. et al. 2000. Rezeptor-mediated uptake of antigen/heat shock Protein complexes results in major histocompatibility class 1 antigen presentation via two distinct processing pathways. J. Exp. Med. 191: 1957–1964).
- Die Internalisierung von Antigenen durch spezifische Membranrezeptoren, wie zum Beispiel Fc- oder Mannoserezeptoren, führt auch zur „Kreuzpräsentation" der Antigene durch die APCs (Lanzavecchia A. 1996. Mechanisms of antigen uptake for presentation. Curr. Op. in Immunol. 8: 348–354; Regnault A. et al. 1999. Fcg receptor-mediated induction of dendritic cell maturation and major histocompatibility complex class I-restricted antigen presentation after immune complex internalisation. J. Exp. Med. 189: 371–380). Die Prozessierung und MHC I-Präsentation von internalisierten Antigenen kann über den klassischen zytosolischen Proteasom- und TAP-abhängigen MHC I-Präsentationsweg erfolgen, wenn Antigene aus endozytotischen Vesikeln (Endosom oder Phagosom) ins Zytosol gelangen. Alternativ können internalisierte Antigene beim nichtzytosolischen Weg in den endozytotischen Vesikeln mit Hilfe von pH-Wert-adaptierten Proteinasen zu Peptiden zerlegt werden, die an MHC I-Moleküle binden und als Komplex zur Zelloberfläche transportiert werden. Bei den MHC I-Molekülen kann es sich um internalisierte von der Plasmamembran stammende oder um neu synthetisierte Komplexe handeln (Rock K.L. 1996. A new foreign policy: MHC class I molecules monitor the outside world. Immunology Today 17: 131; Castellino F. et al. 2000. Receptor-mediated uptake of antigen/heat shock Protein complexes results in major histocompatibility class 1 antigen presentation via two distinct processing pathways. J. Exp. Med. 191: 1957–1964; Rodriguez A., Regnault A., Kleijmeer M, Ricciardi-Castagnoli P. and Amigorena S. 1999. Selective transport of internalized antigens to the cytosol for MHC class I presentation in dendritic cells. Nature Cell Biol. 1: 362–368, Gromme M. et al. 1999. Recycling MHC class I molecules and endosomal peptide loading. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 96: 10326–10331).
- DCs sind die einzigen APCs, die naive CD8+ T-Lymphozyten stimulieren und eine CTL-Antwort initiieren können (Banchereau J. and Steinman R.M.. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392: 245–252). Unreife DCs, die sich in peripheren Geweben befinden, nehmen exogene Antigene aus verschiedenen Quellen, einschließlich Mikroben und infizierten Zellen, Zelldebris, Proteinen und Immunkomplexen auf. Antigen-beladene DCs migrieren in Richtung der sekundären lymphoiden Organe, prozessieren die Antigene für ihre Präsentation und erwerben während dieser Migration die Fähigkeit, ruhende CD8+ T-Zellen anzulocken und zu aktivieren.
- Die MHC I-Präsentation von exogenen Antigenen durch DCs ist somit Voraussetzung für die Stimulation einer CTL-Antwort gegen Tumore, intrazelluläre Bakterien oder Antigen von Viren, die APCs nicht infizieren. In vivo, wurde die Rolle der „Kreuzpräsentation" in einem murinen Modell der Poliovirusinfektion untersucht. Die Induktion der CTL-Immunität gegen dieses Virus, das nicht in APCs repliziert, erfordert die MHC I-Präsentation von extrazellulären viralen Antigenen (Yewdell J.W. 1999. Mechanisms of exogenous antigen presentation by MHC class I molecules in vitro and in vivo: Implications for generating CD8+ T cell responses to infectious agents, tumors, transplants, and vaccines. Adv. in Immunol. 73: 7–77; Albert M.L., Sauter B., and Bhardwaj N. 1998. Dendritic cells aquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs. Nature 392: 86–89; Sigal L.J., Crotty S., Andino R. and Rock. K.L. 1999. Cytotoxic T cell immunity to virus-infected nonhematopoietic cells requires presentation of exogenous antigen. Nature 398: 77–80; Yewdell J.W., Bennink J.R. and Hosaka Y. 1988. Cells process exogenous Proteins for recognition by cytotoxic T lymphocytes. Science 239: 637–640; Reimann J. and Schirmbeck R. 1999. Alternative pathways for processing exogenous and endogenous antigens that can generate peptides for MHC class I-restricted presentation. Immunol. Rev. 172: 131–152).
- Verschiedene Mechanismen der Aktivierung sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunität werden im Augenblick für die Tumor-Immuntherapie untersucht. Elemente der zellulären Immunität sind in der Lage, spezifisch Tumorzellen zu erkennen und zu zerstören. Die Isolierung von CTLs aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus peripherem Blut ließ vermuten, daß solche Zellen eine wichtige Rolle bei der natürlichen Immunabwehr von Krebs spielen (Cheever et al. 1993. Annals N.Y. Acad. Sci. 690: 101–112). Es gibt bereits viele Beispiele von sowohl murinen als auch humanen CTLs, die spezifisch Tumorzellen erkennen und eine therapeutische Aktivität nach adoptivem Transfer aufweisen, wobei in einigen Fällen eine vollständige Remission induziert wird. Jedoch ist wegen des progressiven Wachstums der meisten Krebsarten offensichtlich, daß trotz des Potentials von CD8+ T-Zellen Tumorzellen zu zerstören, viele dieser Tumore der Erkennung durch CTLs in vivo entkommen. Die Induktion einer ausreichenden Anzahl von CD8+ T-Zellen in vivo war bis jetzt schwierig (Burns D.M. and Crawford D.H. 2004. Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T-lymphocytes for adoptive immunotherapy of post-transplant lymphoproliferative disease Blond Rev. 18(3): 193–209; Kawai K., Saijo K., Oikawa T., Morishita Y., Noguchi M., Ohno T. and Akaza H. 2003. Clinical course and immune response of a renal cell carcinoma Patient to adoptive tansfer of autologous cytotoxic T lymphocytes. Clin. Exp. Immunol. 134(2): 264–9; Bathe O.F., Dalyot-Herman N. and Malek T.R. 2003. Therapeutic limitations in tumorspecific CD8+ memory T cell engraftment. BMC Cancer 3(1): 21).
- Die meisten Verfahren zur Einschleusung von Proteinen in das Zytosol unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit der Zelle sind aufwendig und schwierig durchzuführen, allgemein durchgesetzt hat sich bisher keines. Für die Anwendung außerhalb der Forschung in einer klinischen Umgebung ist bisher gar kein Verfahren bekannt:
Die Mikroinjektion ist möglich, jedoch technisch anspruchsvoll und auf geringe Zellzahlen beschränkt (Schneider G.B., Gilmore A.P., Lohse D.L., Romer L.H., Burridge K. 1998. Microinjection of Protein tyrosine phosphatases into fibroblasts disrupts focal adhesions and stress fibers. Cell Adhes. Commun.. 5(3): 207–219; Gorbsky G.J., Chen R.-H. and Murray A.W. 1998. Microinjection of Antibody to Mad2 Protein into Mammalian Cells in Mitosis Induces Premature Anaphase J. Cell Biol. 141: 1193–1205). Die Elektroinjektion erscheint vielversprechend, kann aber bei adhärenten Zellen nicht angewendet werden (Wilson A.K., Horwitz J. and De Lanerolle P. 1991. Evaluation of the electroinjection method for introducing Proteins into living cells. Am. J. Physiol. 260: C355–63). - Weitere Verfahren zur Einschleusung von extrazellulären Makromolekülen ins Zytosol und in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen wurden beschrieben. Alle erfordern beträchtliche methodologische Expertise und kein einziges Verfahren hat verbreitete Anwendung gefunden (Bungener L., Huckriede A., Wilschut J. and Daemen T. 2002. Delivery of Protein Antigens to the Immune System by Fusion-active Virosomes: A Comparison with Liposomes and ISCOMS. Bioscience Reports 22: 323–338). Das "Trojanische" Peptid-Penetrationssystem ist auf die Zufuhr von Oligopeptiden beschränkt (Derossi D., Chassaing G. and Prochiantz A. 1998. Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery Trends Cell Biol. 8(2): 84–7). Die virale Hämagglutinin-vermittelte Fusionstechnik funktioniert gut, ist jedoch schwierig durchzuführen (Doxsey S.J., Sambrook J., Helenius A. and White J. 1985. An efficient method for introducing macromolecules into living cells. J. Cell Biol. 101(1): 19–27).
- Virus-ähnliche Partikel (Virus-Like Particles, VLPs) stellen eine weitere Möglichkeit dar, in vivo oder in vitro antigene Epitope in den MHC I-Präsentationsweg einzuschleusen. Bei DCs gelangen nach Internalisierung der VLPs die enthaltenen Antigene vom Endosom ins Zytosol und werden mit MHC Klasse I-Molekülen präsentiert. Die DCs sind dadurch in der Lage CD8+ T-Zellen zu aktivieren. Ein Nachteil der Methode ist die aufwendige Herstellung und Reinigung der VLPs (Moron V.G., Rueda P., Sedlik C. and Leclerc C. 2003. In vivo Dendritic Cells can cross-present Virus-like Particles using an Endosome-to-Cytosol Pathway. J. Immunol. 171: 2242–2250; Storni T., Lechner F., Erdmann I., Bächi T., Jegerlehner A., Dumrese T., Kündig T.M., Ruedl C. and Bachmann M.F. 2002. Critical Role for Activation of Antigen-presenting cells in Priming of Cytotoxic T Cell Response After Vaccination with Virus-Like Particles. J. Immunol. 168: 2880–2886).
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WO 02/072140 - Ähnlich wie VLPs sind auch PLGA-(Poly(lactic-co-glycolic acid))-Partikel in der Lage, enkapsulierte Peptide oder Proteine in den MHC I-Präsentationsweg einzuschleusen. Wie bei den VLPs ist auch hier die Herstellung der Partikel aufwendig (Waeckerle-Men Y. and Groettrup M. 2005. PLGA microspheres for improved antigen delivery to dendritic cells as cellular vaccines. Adv. Drug Deliv. Rev. 57(3): 475–82; Zheng C.H., Gao J.Q., Zhang Y.P. and Liang W.Q. 2004. A Protein delivery system: biodegradable alginate-chitosan-poly(lacticco-glycolic acid) composite microspheres. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323(4): 1321–7).
- Kationische Lipide, die als Komplex mit Protein an negativ geladenen Zelloberflächen binden, werden in zunehmendem Umfang angeboten, um Proteine ins Zytosol von Zellen einzuschleusen. Die Methode hat den Vorteil, dass nur geringe Mengen an Protein benötigt werden. Bei positiv geladenen Molekülen treten mitunter aufgrund mangelnder Interaktion mit den kationischen Lipiden Probleme auf (Simberg D., Weisman S., Talmon Y. and Barenholz Y. 2004. DOTAP (and other cationic lipids): chemistry, biophysics, and transfection. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 21(4): 257–317; Zelphati O., Wang Y., Kitada S., Reed J.C., Felgner P.L. and Corbeil J. 2001. Intracellular delivery of Proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276: 35103–110).
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US 5,643,599 beschreibt ein Verfahren, um mit Hilfe von Liposomen extrazelluläre Antigene ins Zytosol von Zielzellen einzubringen. Die Liposomen enthalten neben dem einzuschleusenden Antigen eine Substanz (z.B. ein Hämolysin), die nach Aufnahme der Liposomen durch Phagozytose und Freisetzung ihres Inhalts im Phagosom, die phagosomale Membran permeabilisieren kann und so dem extrazellulären Antigen den Zugang zum Zytosol ermöglicht. Dieses Verfahren erlaubt die Einschleusung von exogenem Antigen in Zellen, die die Fähigkeit besitzen, Liposomen zu internalisieren. Im Gegensatz dazu erfolgt beim vorliegenden Verfahren die Behandlung mit Hämolysin in löslicher Form und kann auch bei nicht-phagozytierenden Zellen zur Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg eingesetzt werden. -
WO 01/87325 - Die orale oder parenterale Immunisierung mit rekombinanten Listerien oder Salmonellen, die Tumor-assoziierte Antigene exprimieren, hat in verschiedenen murinen Modellen die Protektion vor oder die Regression von Tumoren durch Induktion Tumorantigen-spezifischer CTLs zur Folge (Cochlovius B., Stassar M.J., Schreurs M.W., Berner A. and Adema G.J. 2002. Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity. Immunol. Lett. 80(2): 89–96; Weth R., Christ O., Stevanovic S. and Zoller M. 2001. Gene delivery by attenuated Salmonella typhimurium: comparing the efficacy of helper versus cytotoxic T cell priming in tumor vaccination. Cancer Gene Ther. 8(8): 599–611; Paterson Y. and Johnson R.S. 2004. Progress towards the use of Listeria monocytogenes as a live bacterial vaccine vector for the delivery of HIV antigens. Expert Rev. Vaccines 3(4Supl.): 119–134; Sewell D.A., Douven D., Pan Z.K. Rodriguez A. and Paterson Y. 2004. Regression of HPV-positive tumors treated with a new Listeria monocytogenes vaccine. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130(1): 92–7; Lin C.W., Lee J.Y., Tsao Y.P., Shen C.P., Lai, H.C. and Chen S.L. 2002. Oral vaccination with recombinant Listeria monocytogenes, expressing human papillomavirus type 16 E7 can cause tumor growth in mice to regress. Int. J. Cancer 102(6): 629–637).
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US 6,565,852 beschreibt ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Tumorassoziierte Antigene durch Verabreichung einer rekombinanten Form von Listeria monocytogenes, die ein Tumor-assoziiertes Antigen oder ein Fragment davon exprimiert. Das Tumor-assoziierte Antigen kann von den rekombinanten Listerien allein oder als Listeriolysin-Fusionsprotein exprimiert werden.US 5,830,702 beschreibt lebende rekombinante Listeria monocytogenes und die Induktion einer zytotoxischen T-Zellantwort mittels eines attenuierten Stammes von Listeria spp., der ein bestimmtes fremdes Antigen exprimiert. Weiterhin werden Verfahren zur Induktion einer protektiven Immunität durch Verabreichen einer effektiven Menge des Vakzins zur Verfügung gestellt.US 6,051,237 beschreibt die spezifische Tumor-Immuntherapie unter der Verwendung eines lebenden rekombinanten bakteriellen Vakzinvektors in Form von rekombinanten Listeria monocytogenes, die Tumor-spezifische Antigene exprimieren. - Der Einsatz gentechnisch veränderter lebender potentiell humanpathogener Vektoren zur Humantherapie wird kontrovers diskutiert. Ein besonderes Risiko besteht für Personen, deren Immunfunktionen z.B. durch Infektion mit HIV oder Tumorerkrankungen supprimiert ist (Redfield R.R., Wright D.C., James W.D., Jones T.S., Brown C. and Burke D.S. 1987. Disseminated vaccinia in a military recruit with human immunodeficiency virus (HIV) disease. N. Engl. J. Med. 316: 673–676; Kavanaugh D.Y. and Carbone D.P. 1996. Immunologic dysfunction in cancer. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 10: 927–951).
- Radford et al. (Radford K.J., Higgins D.E., Pasquini S., Cheadle E..J., Carta L., Jackson A.M., Lemoine N.R., Vassaux G. A recombinant E. coli vaccine to promote MHC class I-dependent antigen presentation: application to cancer immunotherapy. Gene Ther. 2002: 9(21): 1455–63; Radford K.J., Jackson A.M., Wang J.H., Vassaux G., Lemoine N.R. Recombinant E. coli efficiently delivers antigen and maturation signals to human dendritic cells: presentation of MART1 to CD8+ T cells. Int. J. Cancer. 2003: 105(6): 811–9) beschreiben sowohl in einem murinen Modellsystem (2002) als auch in einem humanen Modellsystem (2003) die Induktion bzw. Aktivierung antigenspezifischer CTLs durch Infektion von DCs mit rekombinanten E. coli, die neben einem Modellantigen LLO exprimieren. Innerhalb des murinen Modellsystems führte die Injektion von DCs, die zuvor mit LLO und OVA-exprimierenden E. coli gepulst wurden, zur Aktivierung naiver OVA-spezifischer CTLs, die in der Lage waren, das Wachstum eines OVA-exprimierenden Tumors zu unterdrücken. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden bei humanen DCs E. coli eingesetzt, die das Melanom-Antigen MART-1 zusammen mit LLO exprimieren. Humane DCs zeigten nach Inkubation mit Paraformaldehyd-fixierten MART-1/LLO-exprimierenden E. coli eine phänotypische und funktionelle Ausreifung. Nach der oben beschriebenen Vorbehandlung waren die DCs fähig, MART-1-spezifische CTLs zu aktivieren, was auf die Präsentation des MHC I-restringierten Peptides MART-1 27–35 schließen lässt. Radford et al. diskutieren das Potential dieses Systems als eine neue Strategie für die humane Tumor-Immuntherapie. Das System umfaßt rekombinante Antigen-exprimierende E. coli, und erfordert die Klonierung des zu präsentierenden Antigens. Diese Methode zur Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg kann ausschließlich bei Zellen angewandt werden, die in der Lage sind, lebende oder fixierte E. coli zu internalisieren. Im Gegensatz dazu erfolgt beim vorliegenden Verfahren die Behandlung mit LLO in löslicher Form und kann auch bei nicht-phagozytierenden Zellen zur Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg eingesetzt werden.
- Trotz der oben diskutierten Ansätze gibt es bislang kein einfaches, reproduzierbares Verfahren, um exogene Antigene effektiv und schnell reproduzierbar in den MHC Klasse I-Prozessierungsweg verschiedener Zellen einzuschleusen.
- Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der effektiven und reproduzierbaren Einschleusung von exogenen Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen mit dem Ziel der Induktion oder Aktivierung von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen zur Verfügung zu stellen.
- Die vorliegende Erfindung löst in ihrem ersten Aspekt diese Aufgabe durch ein einfaches und generell anwendbares in vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen mittels reversibler Permeabilisierung von potentiell antigenpräsentierenden Zellen durch Cholesterol-bindende Hämolysine allgemein wie z.B. Listeriolysin (LLO; Palmer M. 2001. The family of thiol-activated, cholesterol-binding cytolysins. Toxicon 39(11): 1681–9; Alouf J.E. 2000. Cholesterol-binding cytolytic Protein toxins. Int. J. Med. Microbiol. 290(4–5): 351–6). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe Hämolysin und LLO austauschbar verwendet. Das erfindungsgemäße in vitro Verfahren umfaßt die Schritte von 1.) ein in Kontakt bringen der Zellen mit einem Hämolysin wie z.B. Listeriolysin (LLO) und einer Marker-Substanz, 2.) Messung des Einstroms der Marker-Substanz in die Zellen während und/oder nach Einwirkung von LLO, und 3.) geeignete Modifizierung der oben genannten spezifischen Parameter.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt grundsätzlich Hämolysine zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen. Während die vorliegende Erfindung als Beispiel LLO beschreibt, können auch andere Hämolysine zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen verwendet werden, wie z. B. die in der relevanten Literatur (z. B. Provoda C.J., Lee K.D. 2000. Bacterial Pore-forming hemolysins and their use in the cytosolic delivery of macromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 41(2): 209– 21. Welch R.A. 1991. Pore-forming cytolysins of gram-negative bacteria. Mol. Microbiol. 5(3): 521–8 oder Braun V., Focareta T. 1991. Pore-forming bacterial Protein hemolysins (cytolysins). Crit. Rev. Microbiol. 18(2): 115–58) beschriebenen Hämolysine. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe Hämolysin und LLO somit austauschbar verwendet.
- Bevorzugte Hämolysine sind das Streptolysin O aus Streptococcus pyogenes, S. equisimilis oder S. canis, Pneumolysin aus S. pneumoniae, Suilysin aus S. suis, Intermedilysin aus S. intermedius, sowie Listeriolysin aus Listeria monocytogenes, Ivanolysin aus L. ivanovii, Seeligerolysin aus L. seeligeri, sowie andere Hämolysine der Gruppe der Thiol-aktivierten Hämolysine (z.B. Alouf J.E. 2000. Cholesterol-binding cytolytic Protein toxins. Int. J. Med. Microbiol. 290: 351–6)
- Das vorliegende Verfahren besteht somit allgemein aus dem Austesten der individuellen Rahmenbedingungen (Konzentration und Inkubationszeit) für den LLO-Einsatz mit Hilfe einer Marker-Substanz (z.B. PI), die einfach und direkt beobachtet werden kann. Dabei wird die Marker-Substanz während oder nach der Einwirkung von LLO zugegeben und der Einstrom der Substanz in die Zelle beobachtet. Fließt zuviel Marker-Substanz in die Zelle ein, so ist die LLO-Menge zu verringern oder die Inkubationszeit zu verkürzen, fließt zuwenig LLO ein, so muß die LLO-Konzentration oder die Inkubationszeit erhöht werden. Diese Testungen können in Versuchen durchgeführt werden, die ca. 15–45 min benötigen. Sind dann die Rahmenbedingungen identifiziert, werden diese auf die Einschleusung von Antigen übertragen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das vorliegende Verfahren zuerst die Messung des Propidiumjodid (PI)-Einstroms während oder nach der Einwirkung von Listeriolysin (LLO) unter definierten Bedingungen in die potentiell antigenpräsentierenden Zellen. Die optimale LLO-Konzentration bzw. Inkubationsdauer ist in der Regel die zu Beginn des PI-Einstromes (bei beginnendem Einstrom von PI, bei nachweisbarem Einstrom von PI, abhängig von der Sensitivität der Zellen). Es hat sich in Versuchen zudem gezeigt, daß der Antigen Einstrom zeitlich etwas vor dem Einstrom des PI (Surrogat) liegen kann. So ermittelte Parameter werden dann auf die LLO-Behandlung zur Einschleusung von Antigen übertragen. Dieses Vorgehen führt zur Reproduzierbarkeit des Verfahrens, was die schnelle zuverlässige Anwendung, insbesondere im klinischen Kontext, überhaupt erst ermöglicht. So kann durch die strikte Übertragung der Rahmenbedingungen des Vorversuchs durch LLO- Inkubation von PBMCs eine Steigerung der nachweisbaren antigenspezifischen CD8+ T-Zellen um mehr als 100% erreicht werden (Beispiel 5).
- Ein Beispiel für ein Poren-bildendes Protein ist Streptolysin O (SLO), Prototyp der Cholesterin-bindenden Familie der bakteriellen Exotoxine. Streptolysin bildet Poren in der Plasmamembran von Säugerzellen. Die dreidimensionale Struktur von Perfringolysin, einem weiteren Mitglied dieser Familie, wurde ermittelt und die molekularen Mechanismen, die zur Porenbildung durch SLO führen, sind teilweise verstanden (Sekiya K., Danbara H., Vase K. and Futaesaku V. 1996. Electron microscopic evaluation of a two-step theory of Pore formation by streptolysin O. J. Bacteriol. 178(23): 6998–7002; Heuck A.P., Tweten R. K. and Johnson A.E. 2003. Assembly and topography of the prepore complex in cholesteroldependent cytolysins. J. Biol. Chem. 278(33): 31218–225). Nach der Bindung an die Membranen, diffundieren Hämolysin-Monomere lateral in die Bilayer und oligomerisieren, um Homotyp-Aggregate zu bilden, die sehr große Transmembranporen darstellen, deren Durchmesser 35 nm erreichen kann. Mit den herkömmlich verwendeten Protokollen ist der SLO-Angriff im allgemeinen letal für die Zielzelle, so daß die Möglichkeiten der Durchführung von zellbiologischen Untersuchungen nach Permeabilisierung begrenzt waren. Trotzdem wird das Toxin zur Untersuchung von zellulären Prozessen in kurzen Zeitabschnitten verwendet.
- Walev et al. (Walev I., Bhakdi S.C., Hofmann F., Djonder N., Valeva A., Aktories K., Bhakdi S. 2001. Delivery of Proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(6): 3185–90) beschreiben das Poren-bildende Toxin Streptolysin O (SLO), das dazu verwendet werden kann, reversibel adhärente und nicht-adhärente Zellen zu permeabilisieren, was einen Eintritt von Molekülen mit bis zu 100 kDa Masse ins Zytosol ermöglichen soll. Unter Verwendung von FITC-markiertem Albumin wurde geschätzt, daß 105–106 Moleküle pro Zelle aufgenommen werden. Es wird weiter beschrieben, daß die Reparatur von Toxinläsionen von Ca(2+)-Calmodulin und intakten Mikrotubuli abhängig ist. Die aktiven Domänen von großen clostridialen Toxinen wurden in drei verschiedene Zeltlinien eingeführt. Es wird über die breite Anwendbarkeit allgemein diskutiert, eine Antigen-Einschleusung mit anschließender MHC Klasse I-Präsentation wird nicht erwähnt.
- Darji et al. (Darji A., Chakraborty T., Wehland J. and Weiss S. 1995. Listeriolysin generates a route for the presentation of exogenous antigens by major histocompatibility complex class I. Eur. J. Immunol. 25(10): 2967–71) beschreiben Untersuchungen über die Poren-bildende Aktivität von Listeriolysin, dem Hämolysin von Listeria monocytogenes, um CD8+ T-Zellen mit löslichen Proteinen in vivo und in vitro zu stimulieren. Die Immunisierung mit löslichem hämolytisch aktivem Listeriolysin induziert sowohl CD8+ als auch CD4+ LLO-spezifische T-Zellen. Hitzeinaktiviertes LLO induziert nur CD4+ LLO-spezifische T-Zellen. Hämolytisch aktives LLO bewirkt also seine eigene Einschleusung in den MHC Klasse I-Präsentationsweg. Darüber hinaus werden Modellantigene, wie z.B. Ovalbumin, gemischt mit Listeriolysin, auch in den MHC Klasse I-Weg in vitro und in vivo eingeschleust.
- Ähnlich beschreiben Darji et al. (Darji A., Chakraborty T., Wehland J. and Weiss S. 1997. TAP-dependent major histocompatibility complex class I presentation of soluble Proteins using listeriolysin. Eur. J. Immunol. 27(6): 1353–9) die Immunisierung von Mäusen mit Listeriolysin und Antigen wie z.B. lösliches Ovalbumin, Nukleoprotein von Influenzavirus oder beta-Galaktosidase von Escherichia coli. Dies führte in vivo zur Induktion einer zytotoxischen CD8+ T-Zellantwort gegen definierte MHC I–restringierte Peptidepitope dieser Proteine. Die Inkubation etablierter Zelllinien mit LLO und den verschiedenen Antigenen führte zur Einschleusung der Antigene in den MHC I-Präsentationsweg. Die Präsentation MHC I–restringierter Peptide aus den Antigenen wurde durch Proliferation antigenspezifischer T-Zell-Klone nachgewiesen. Die LLO-vermittelte Einschleusung in den MHC I-Präsentationsweg war abhängig von einem funktionellen TAP-Transporter und konnte durch Brefeldin A inhibiert werden. Beide Kriterien deuten darauf hin, dass LLO exogenen Antigenen den Zugang zum Zytosol und zum klassischen MHC I-Präsentationsweg erlaubt. Die Behandlung der Zielzellen mit Listeriolysin wird als unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen nicht die Zell-Lebensfähigkeit beeinflussend beschrieben. Die durch die Listeriolysin Behandlung erzeugten Poren werden innerhalb von 60 min repariert. Die Einschleusung von löslichen Proteinen in den MHC Klasse I Präsentationsweg durch Listeriolysin stellt ein System zur Verfügung, um die zytotoxische Antwort gegen intrazelluläre Pathogene zu untersuchen, und würde ein schnelles Screening von potentiellen Antigenen in Vakzin-Formulierungen ermöglichen.
- Darji et al. beschreiben die Einschleusung mittels LLO in vitro nur in EL-4- und P815-Zellen (murine Zelllinien), sowie in einem Tiermodell. Bei murinen Milzzellen (primäre Zellen) wird die in vitro Anwendung lediglich hinsichtlich der Untersuchung des Einflusses von LLO auf die MHC II-Präsentation beschrieben. Die Anwendung von LLO bei sensiblen primären Zellen wie humanen PBMCs wurde von Darji et al. nicht durchgeführt.
- Bei dem Versuch der Erfinder, das Verfahren, wie es von Darji et al. beschrieben wurde, anzuwenden, ließ sich das Verfahren nicht ohne extrem hohen Aufwand nachvollziehen und gelang nur in wenigen Ausnahmefällen. So haben die vorliegenden Erfinder (mit der fachlichen Unterstützung von Dr. Darji) mehr als zwei Jahre benötigt, um die Ergebnisse der Publikation mit EL-4-Zellen und OVA in Teilen zu reproduzieren. Als Gründe dafür konnten durch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten aufwendigen Versuche folgendes ermittelt werden: Um Antigene mit Hilfe von LLO in eukaryontische Zellen einzuschleusen, ist es erforderlich, so viel LLO einzusetzen, daß dieses beinahe toxisch wirkt. Wird zuviel LLO eingesetzt, sterben die behandelten Zellen ab und können das eingeschleuste Antigen nicht mehr prozessieren. Falls zu wenig LLO verwendet wird, wird kein oder nicht ausreichend Antigen ins Zytosol eingeschleust und mit MHC Klasse I-Molekülen präsentiert. Folgt man den Angaben aus Darji et al. gelingt es nur in wenigen Ausnahmefällen exogenes Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg einzuschleusen (Beispiel 3). Dies hängt damit zusammen, daß neben LLO-Konzentration und Inkubationsdauer eine Vielzahl anderer Faktoren die Wirkung von LLO auf die Zielzellen beeinflußt.
- Die Publikationen von Darji et al. beschreiben ein Verfahren zur Einschleusung von Proteinen in den MHC I-Weg von Zellen unter Verwendung des porenbildenden Toxins LLO. Proteine, die in den MHC I-Weg eingeschleust werden, werden über das Proteasom degradiert und mit Hilfe des TAP-Transporters letztlich als Peptide auf MHC I-Molekülen präsentiert. Für den Erfolg der Methode aus Darji et al. ist es unabdingbar, daß die LLO-behandelten Zellen vital sind. Als Porenbildendes Toxin ist LLO tödlich für die behandelten Zellen, wenn sich die induzierten Poren nicht mehr schließen. Aus diesem Grund, schreiben die Autoren, ist es notwendig extrem niedrige LLO-Konzentrationen zu verwenden, die den Zellen nicht schaden. Die Vitalität der LLO-behandelten Zellenreproduzierbar zu erhalten, ist eines der essentiellen Probleme, das die Autoren von Darji et al. nicht lösen. Das Verfahren in Darji et al. funktioniert somit vereinzelt, jedoch nicht reproduzierbar. Dieses Problem löst nur die vorliegende Erfindung.
- Die Versuche der Erfinder haben zudem gezeigt, daß die folgenden Parameter die Versuche beeinflussen:
- – die Zelllinie oder Primärzelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll;
- – die Qualität der eingesetzten Zellen
- – die eingesetzte Zellkonzentration;
- – das Volumen der Ansätze;
- – das verwendete Kulturmedium und/oder Puffer;
- – der pH-Wert des Mediums oder Puffers
- – die An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen;
- – die Serum- und/oder Cholesterinkonzentration;
- – die Beschaffenheit und Reinheit des Antigens, das eingeschleust werden soll;
- – die Labormaterialien, die während der Versuche verwendet werden;
- – die Reaktionstemperatur;
- – die Art des LLO;
- – wie das LLO aufgereinigt wurde; und
- – der Redoxzustand des LLO.
- Die aufgelisteten Parameter sind nicht vollständig und beeinflussen die wirksame LLO-Konzentration und Inkubationsdauer während und z.T. auch nach der Inkubation von Zellen mit LLO. Wird das oben diskutierte Verfahren nach Darji et al. verwendet, so führt die Veränderung von bereits einem dieser Parameters dazu, daß die Versuche scheitern und der komplette Entwicklungsprozess von neuem begonnen werden muß. Das Verfahren von Darji et al. ist daher für Routineuntersuchungen in breiter Anwendung nicht einsetzbar. Die Veröffentlichungen von Darji et al. offenbaren damit kein allgemeingültiges Verfahren zur MHC Klasse I-Präsentation von exogenem Antigen.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die wirksame LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung des PI-Einstromes während oder nach Einwirkung von LLO ermittelt. Dazu wird z.B. ausgehend von einer für die gewählten Bedingungen geschätzten optimal wirksamen LLO-Konzentration in einem vorgegebenen Zeitfenster von 1 bis 45 Minuten so lange wiederholt gemessen, bis ein Einstrom von PI in die Zielzellen detektierbar ist. Unter „gewählte Bedingungen" sind die vom Experimentator ausgewählten Rahmenbedingungen wie die gewünschte Zellkonzentration, die gewünschte Inkubationstemperatur, das gewünschte Medium etc. zu verstehen. Die optimale LLO-Konzentration bzw. Inkubationsdauer für die Einschleusung von Antigen in den MHC I- Präsentationsweg ist in der Regel die, bei der der Einstrom von PI unter definierten Bedingungen beginnt. Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß durch Übertragung der vorher ermittelten Reaktionsbedingungen auf die Einschleusung von exogenem Antigen bei Konstanthaltung aller anderer Parameter, die oben erwähnte multifaktorielle Beeinflussung der wirksamen LLO-Konzentration vernachlässigt bzw. eliminiert werden kann. Als Konsequenz werden die Versuche reproduzierbar. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, daß es die schnelle Übertragung der Anwendung von LLO von einem Labor auf ein anderes ermöglicht, in dem andere Rahmenbedingungen erwünscht oder vorgegeben sind.
- Der Einstrom von PI wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielhaft und bevorzugt genutzt, um den Wirkungsbereich von LLO für die Einschleusung von Antigen ins Zytosol mit anschließender Prozessierung und Präsentation mit MHC I einzugrenzen. In den hier beschriebenen Anwendungsbeispielen ließ sich parallel zum LLO-vermittelten Einstrom von PI in die Zellen im Präsentationsexperiment eine Zunahme der Anzahl aktivierter antigenspezifischer CD8+ T-Zellen erreichen, solange die Toxizitätsgrenze noch nicht erreicht war (Beispiel 4).
- Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, daß adhärente Zellen sowie Suspensionszellen erfolgreich mit LLO und Antigen behandelt werden können, frische oder kryokonservierte Zellen geeignet sind und die Behandlung in An- oder Abwesenheit von Serum in verschiedenen Medien oder Puffer erfolgen kann. Im Gegensatz zu dem Verfahren, wie es von Darji et al. beschrieben wurde, verkürzt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zeit erheblich, die für die initiale Etablierung der LLO-vermittelten Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg benötigt wird, auf wenige Wochen (Anpassung an die verwendeten Plastik-Artikel, Etablierung geeigneter Temperatur usw.). Aufgrund der Möglichkeit den Marker-Einstrom "live" zu beobachten, kann das Verfahren nach Bewertung des PI-Einstromes ohne großen Zeitaufwand optimal auf die Antigene und Zellen übertragen werden (Einsatz der optimal wirksamen LLO-Konzentration und -inkubationsdauer). Darüber hinaus können die Rahmenbedingungen nach Wunsch variiert werden. Bei Veränderung der Rahmenbedingungen wie z.B. Zellkonzentration oder LLO-Charge kann die wirksame LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung des PI-Einstromes schnell und sensitiv detektiert werden.
- Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich:
- 1. Exogene Antigene in Primärzellen einzubringen, sowohl in Zellen von der Maus wie auch vom Menschen (Darji et al. beschreiben bei der in vitro-Anwendung ausschließlich etablierte Zelllinien und keine Verwendung humaner Zellen).
- 2. Exogene Antigene in unseparierte humane PBMCs einzubringen (Beispiele 4–6). Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die klinische Anwendung des LLO zur Ermittlung der CTL-Reaktivität von Patienten oder zur Expansion antigenspezifischer CTLs. Klinische Testsituationen erfordern eine schnelle und einfache Durchführbarkeit des angewandten Verfahrens. Aufgrund der aufwendigen Vortests und der mangelnden Reproduzierbarkeit kann das Verfahren von Darji et al. nicht routinemäßig und laborübergreifend in diesem Umfeld verwendet werden.
- 3. Exogene Antigene in humane primäre Monozyten oder in humane Monozyten-Linien (THP-1) einzubririgen.
- Wesentlicher Kernpunkt ist somit die Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen sensitiven Zellart-spezifischen Bestimmung der potentiell wirksamen Hämolysin- und bevorzugt der LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung eines Marker-(z.B. Propidiumjodid (PI))-Einstroms während der Einwirkung von Hämolysin unter definierten Bedingungen. Bei Übertragung der definierten Rahmenbedingungen (Parameter), bei denen ein effektiver Marker-Einstrom nachgewiesen werden kann, auf die Inkubation mit Antigen, bedürfen die oben beschriebenen beeinflussenden Parameter keiner weiteren Berücksichtigung. Das soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "direkte Übertragung der ermittelten spezifischen Parameter" verstanden werden.
- Weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg jeder Art von Zelle, die zur MHC I-Präsentation in der Lage ist, insbesondere in tierische Zellen wie z.B. primäre humane und murine Zellen sowie Zellinen, unseparierte oder separierte Zellen wie z.B. PBMCs, in Monozyten oder Lymphozyten, unreife aus Monozyten erzeugte DCs, die Zelllinie THP-1, Maus-Knochenmarkszellen in Suspension, adhärente Maus-Knochenmarksmakrophagen, die Zelllinie EL-4 und die Zelllinie NIH3T3.
- In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung des in vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen ist ein weiterer spezifischer Parameter die Größe, Ladung und/oder Aminosäurezusammensetzung des Antigens. Antigene, die für die Zielzellen toxisch sind und daher nicht prozessiert und präsentiert werden, können in einer inaktivierten Form (nach Mutagenese oder chemisch inaktiviert) eingesetzt werden.
- Ebenfalls weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei das LLO ausgewählt ist aus Kulturüberstand, aufgereinigtem LLO, oder rekombinant hergestelltem LLO. Entsprechende Verfahren zur Herstellung sind dem Fachmann bekannt und können der entsprechenden Literatur entnommen werden, wie zum Beispiel Giammarini et al. (J. Biotechnol. 2004: 109(1–2): 13–20), Walton et al. (Protein Expr. Purif. 1999: 15(2): 243–5), Traub und Bauer (Zentralbl. Bakteriol. 1995: 283(1): 29–42) und Darji et al. (J. Biotechnol. 1995: 43(3): 205–12).
- Ebenfalls noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen, wobei als Marker ein Farbstoff und/oder eine fluoreszierende Verbindung, wie zum Beispiel Propidiumjodid (PI, in einer Konzentration zwischen 1-10μg/ml) oder ähnliches verwendet wird. Weitere geeignete Marker sind z.B. 7-AAD, eGFP, fluoreszenzmarkierte Proteine wie z.B. BSA-FITC, BSA-PE, OVA-FITC.
- Noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen, wobei die Messung des Einstroms des Markers mittels einer Fluoreszenzmessung erfolgt. Weitere geeignete Messungen sind z.B. der Einstrom von Ionen wie z.B. Calcium; die Messung der Veränderung der Membranpolarisation; die Freisetzung intrazellulärer Bestandtteile wie z.B. Laktat-Dehydrogenase (LDH); die Messung der Zellproliferation nach Hämolysin (z.B. LLO)-Inkubation im Vergleich zur Proliferation einer Kontrolle ohne Hämolysin; die Messung der Proliferation durch Einbau von Tritium-markiertem Thymidin in die DNA, durch Umsetzung eines Substrates wie z.B. MTT, XTT oder WST-1 oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
- Noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei die Inkubationszeit mit dem LLO bis zu 16 Stunden, insbesondere zwischen 1 bis 45 Minuten beträgt und besonders zwischen 1–20 min lang ist.
- Ebenfalls weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei die Konzentration des verwendeten LLO zwischen 1 und 5000 ng/ml, insbesondere zwischen 1 und 500 ng/ml und bevorzugt zwischen 1 und 250ng/ml beträgt.
- Noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei Zellkonzentrationen zwischen 105/ml und 109/ml eingesetzt werden. Bevorzugt sind Zellkonzentrationen zwischen 5 × 105 und 5 × 106/ml.
- Noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen der vorliegenden Erfindung, wobei das verwendete Kulturmedium und/oder der Puffer ausgewählt sind aus Puffern und/oder Zellkulturmedien unterschiedlicher Zusammensetzung und Herkunft wie z.B. PBS, DMEM und RPMI. Dem Fachmann sind weitere Puffer und Medien bekannt, die ebenfalls verwendet werden können.
- Bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei der Parameter des Labormaterials ausgewählt ist aus dem verwendeten Plastik-Material (z.B. PS – Polystyrol oder PP – Polypropylen oder PE – Polyethylen) insbesondere der Eppendorf- Gefäßen, Falcon-Röhrchen, Pipetten, Probenröhrchen, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten und Kulturschalen.
- Noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen der vorliegenden Erfindung, wobei die Temperatur während der Inkubation zwischen 0°C und 37°C, bevorzugt 4°C und 25°C und besonders bevorzugt Raumtemperatur (ca. 20°C), beträgt.
- Ebenfalls noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen resultierend in der Aktivierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen. Geeignete Methoden zum Nachweis der Aktivierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen sind z.B. die Messung der Produktion von Zytokinen wie z.B. IFN-γ, TNF-α oder IL-2; Proliferationtests; Zytotoxizitätstests oder andere Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt und in der entsprechenden Literatur beschrieben sind.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des in vitro Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern für die antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen der Einschleusung von exogenen Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen, umfaßt das Verfahren die Schritte von a) Gegebenenfalls Separation oder Konzentration der antigenpräsentierenden Zellen mittels Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation und/oder Zell sortieren und/oder Isolierung mit magnetischen Perlen und/oder Adhärenz und/oder anderen dem Fachmann bekannten Verfahren und Einstellen auf eine Zellkonzentration von zwischen 105 bis 109 Zellen/ml, b) Zugabe von PI in einer Konzentration zwischen 1 und 10μg/ml zu den antigenpräsentierenden Zellen, c) Zugabe von LLO in Konzentrationen von zwischen 1 und 5000 ng/ml, d) Inkubation für eine Zeit von 1 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur, e) Ermittlung des Einstroms von PI in die Zellen während oder nach der LLO-Inkubation, und f) Ermittlung von spezifischen Parameter, bei denen bei den antigenpräsentierenden Zellen ein Einstrom von PI gemessen werden kann, und g) anschließende Einschleusung eines Antigens in den MHC I-Präsentationsweg der antigenpräsentierenden Zellen, umfassend die direkte Übertragung der in Schritt f) ermittelten spezifischen Parameter, umfassend ein in Kontakt bringen der Zellen mit Listeriolysin (LLO) und dem einzuschleusenden Antigen.
- In einer weiteren Ausführungsform des in vitro Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann bei Ermittlung des PI-Einstromes in PBS und Übertragung der Bedingungen auf das Präsentationsexperiment mit der Abweichung, daß statt PBS Zellkulturmedium eingesetzt wird, in einigen Zelltypen eine verbesserte MHC I-Präsentation der Antigene erreicht werden.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer APC, die antigene Epitope aus eingeschleusten exogenen Antigenen mit MHC Klasse I präsentiert, umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von antigenpräsentierenden Zellen wie oben beschrieben und ein anschließendes Kultivieren und/oder Isolieren der MHC Klasse-I antigenpräsentierenden APCs. Ein Isolieren kann z. B. mit Hilfe von Antikörpern, die gegen mit definierten Peptiden beladene MHC I-Moleküle gerichtet sind (Porgador A., Yewdell J.W., Deng Y., Bennink J.R., and Germain R.N. 1997. Localisation, quantitation, and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody. Immunity 6: 715) oder anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erfolgen.
- Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen, umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von antigenpräsentierenden Zellen wie oben beschrieben und die Isolierung der zytotoxischen CD8+ T-Zellen. Ein Isolieren aktivierter. IFN-γ-sekretierender CTLs kann hier z. B. mit Hilfe von magnetischen perlen oder durch FACS-Sorting (wie z. B. beschrieben in Oelke et al. 2001. Functional analysis of antigenspecific CTLs after enrichment based an cytokine secretion in: Miltenyi Biotec MACS & more newsletter Vol. 5, No.1 2001; Oelke et al. 2000. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based an cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand. J. Immunol. 2000 Dec 52(6): 544–9.) oder anderer Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt und in der entsprechenden Literatur beschrieben sind, erfolgen.
- Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von MHC Klasse-I präsentierten Antigen-Epitopen, umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von antigenpräsentierenden Zellen wie oben beschrieben und Isolieren und Bestimmen der präsentierten Antigen-Epitope, z.B. wie beschrieben in Purcell A.W. (Isolation and characterisation of naturally processed MHC-bound peptides from the surface of antigen-presenting cells. Methods Mol. Biol. 2004; 251: 291–306) und Torabi-Pour N. et al. (Comparative Study of Peptides Isolated from Class I Antigen Groove of Urological Specimens. A Further Step toward the Future of Peptide Therapy in Bladder Cancer Patients. Urologia Internationalis 2002; 68:183–188) oder anderen dem Fachmann bekannten Verfahren.
- Ein letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit, enthaltend Materialien zur Durchführung des in vitro Verfahrens zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen wie oben beschrieben, zur Herstellung einer APC, die antigen Peptidepitope von extrazellulären Proteinen mit MHC Klasse I präsentiert wie oben beschrieben, zur Herstellung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen wie oben beschrieben und/oder zur Ermittlung von MHC Klasse-I präsentierten Antigen-Epitopen wie oben beschrieben, wobei das/die Verfahren in klinischer Umgebung ("point of care") durchgeführt wird/werden. Solche Materialien umfassen neben den Verbrauchsmaterialien auch entsprechende Gebrauchsanweisungen, so daß eine hohe Reproduzierbarkeit des Verfahrens gewährleistet ist.
- Zusammengefaßt eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit zur schnellen sensitiven Zellart-spezifischen Bestimmung der für die Einschleusung von Antigen optimal wirksamen LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung z.B. des Propidiumjodid (PI)-Einstromes (oder des Einstromes anderer fluoreszierender Verbindungen) während oder nach der Einwirkung von LLO unter definierten Bedingungen. Durch genaue Übertragung der Bedingungen, bei denen ein PI-Einstrom detektiert werden kann, auf die LLO-Behandlung vor oder während Inkubation mit Antigen, wird die Abhängigkeit von Parameter, die die wirksame LLO-Konzentration nachhaltig störend beeinflussen können, in einem Schritt aufgehoben.
- Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Beispiele und den beigefügten Abbildungen weiter verdeutlicht werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Es zeigt:
-
1 : Mittlere PI-Fluoreszenzintensität von EL-4-Zellen unter Einwirkung unterschiedlicher LLO-Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten - (a) Darstellung der Zellpopulation im Dot Blot FSC (Forward Scatter) gegen PI
- (b) Darstellung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit
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2 : MHC I-Präsentation von OVA nach Inkubation von EL-4-Zellen mit verschiedenen LLO-Konzentrationen -
3 : MHC I-Präsentation von OVA nach Inkubation von EL-4-Zellen mit verschiedenen LLO-Konzentrationen -
4 : Mittlere PI-Fluoreszenzintensität von EL-4-Zellen unter Einwirkung unterschiedlicher LLO-Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten -
5 : Mittlere PI-Fluoreszenzintensität von EL-4-Zellen unter Einwirkung unterschiedlicher LLO-Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten - (a) Darstellung der Zellpopulation im Dot Blot FSC gegen PI
- (b) Darstellung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit
-
6 : MHC I-Präsentation von OVA nach LLO-Inkubation von EL-4-Zellen nach publizierten Angaben -
7 .: Streulichtdarstellung von Monozyten und Lymphozyten PBMCs werden anhand ihrer Streulichparameter in Monozyten (R2) und Lymphozytenpopulation (R1) unterteilt. Der Einstrom von PI wurde für jede Population einzeln ausgewertet -
8 .: Einstrom von PI in Monozyten (a) und Lymphozyten (b) in Anwesenheit von LLO -
9 : Anteil der IFN-γ-seketierenden CD8+ T-Zellen nach Vorbehandlung mit LLO und Stimulation mit CMVpp65 -
10 : Einstrom von PI in Monozyten (a) und Lymphozyten (b) nach der Inkubation mit LLO -
11 : Anteil der IFN-γ-seketierenden CD8+ T-Zellen nach Vorbehandlung mit LLO und Stimulation mit CMV-Lysat -
12 : Einstrom von PI in Monozyten (a) und Lymphozyten (b) in Anwesenheit von LLO -
13 : Anteil der IFN-γ-seketierenden CD8+ T-Zellen nach Vorbehandlung mit LLO und Stimulation mit Influenza-Antigen - Beispiele
- Die Konzentrationsaugabe "null" bezieht sich auf mMol/l.
- Beispiel 1
- Messung des LLO-vermittelten Einstromes von PI als Vorversuch vor der LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen
- Im vorliegenden Beispiel wurden EL-4 als antigenpräsentierende Zellen (APCs) verwendet. Die Thymomzelllinie EL-4 (H-2Kb) wurde durch Benzanthrazen-induzierte Karzinogenese aus einer C57BL/6-Maus gewonnen (Ghose T., Guclu A., Tai J., Norvell S.T., and MacDonald A.S. 1976. Active immunoprophylaxis and immunotherapy in two mouse lymphoma models. J. Natl. Cancer Inst. 57(2): 303–15; Talmage D.W., Woolnough J.A., Hemmingsen H., Lopez L. and Lafferty K.J. 1977. Activation of cytotoxic T cells by nonstimulating tumor cells and spleen cell factor(s). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(10): 4610–4). Es wird dem Fachmann jedoch ersichtlich sein, daß dieses Verfahren ohne weiteres für andere antigenpräsentierende Zellen auch entsprechend angepaßt durchgeführt werden kann. Listeriolysin wurde hergestellt wie beschrieben in Darji et al. (J. Biotechnol. 1995 Dec 15; 43(3): 205–12).
- A. Messung des Einstromes von PI in EL-4-Zellen während der Einwirkung von LLO:
- Im vorliegenden Experiment wurde der Einstrom von PI unter Einwirkung von zwei verschiedenen LLO-Konzentrationen (20ng/ml und 120ng/ml) als Vorversuch gemessen. Die EL-4-Zellen wurden mit RPMI/25mM HEPES/5%FCS bei Raumtemperatur (RT) auf eine Zellkonzentration von 2 × 106/ml eingestellt. Zu 500μl der Zellsuspension wurden 20μl PI (Stammlösung 100μg/ml, 2μg/ml Endkonzentration), 409μl RPMI/25mM HEPES/5%FCS und 71 μl in RPMI/25mM HEPES/5%FCS verdünntes LLO (20ng LLO) gegeben (Probenvolumen 1 ml mit 20ng/ml LLO). Die Zugabe von LLO entspricht dem Zeitpunkt 0 min, ab dem der Einstrom von PI durchflußzytometrisch detektiert wurde (BD FACScalibur). Die Messung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität wurde zu den angegebenen Zeitpunkten wiederholt durchgeführt. Gleichzeitig wurden 500μl mit 1 × 106 EL-4-Zellen nach Zugabe von 2μg/ml PI und 52μl RPMI/25mM HEPES/5%FCS mit 428μl in RPMI/25mM HEPES/5%FCS verdünntem LLO (120ng LLO) bei RT inkubiert. Der Einstrom von PI in die Zellen wurde zu den gleichen Zeitpunkten detektiert wie zuvor bei Inkubation mit 20ng/ml LLO.
- Die Ergebnisse sind in
1 dargestellt. Es wurde für EL-4-Zellen die mittlere PI-Fluoreszenzintensität nach Einwirkung von 20 bzw. 120ng/ml LLO nach Inkubation für 0, 5, 10, 15 und 20 Minuten bei RT in RPMI/25mM HEPES/5%FCS ermittelt. In Anwesenheit von 20ng/ml LLO ließ sich zu keinem Messzeitpunkt ein Einstrom von PI in die EL-4-Zellen detektieren. Bei Inkubation mit 120ng/ml LLO war nach 5minütiger Inkubation ein beginnender PI-Einstrom zu verzeichnen, der mit zunehmender Dauer der Inkubation mit LLO weiter anstieg. - B. Übertragung der Bedingungen (LLO-Konzentration und -inkubationszeit) auf die Einschleusung von Antigen in den MHC I-Prozessierungsweg
- Die Messung des PI-Einstromes im Vorversuch wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie sie für die nachfolgende LLO-vermittelte Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg ausgewählt waren. Die zu behandelnden EL-4-Zellen wurden mit RPMI/25mM HEPES/5%FCS auf eine Zellkonzentration von 2 × 106/ml eingestellt. Wie im Vorversuch wurden je Ansatz 1 × 106 EL-4-Zellen im gleichen Volumen und bei gleicher Konzentration des LLO für die oben dargestellten Inkubationszeiten, aber diesmal ohne PI inkubiert. Zum Ausgleich des Volumens wurden 20μl RPMI/25mM HEPES/5%FCS zugesetzt. Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne LLO mitgeführt. Für die Inkubation mit LLO wurden im vorliegenden Versuch LLO-Konzentrationen gewählt, bei denen sich im Vorversuch kein Einstrom von PI (20ng/ml) und der Beginn des Einstroms von PI mit zunehmender mittlerer PI-Fluoreszenzintensität (120ng/ml) nachweisen ließ (Tabelle 1). Tabelle 1:
Ansatz LLO-Konz. [ng/ml] LLO in RPMI 5% FCS 25mM Hepes [μl] RPMI 5% FCS 25mM Hepes [μl] EL-4 2 × 106/ml in RPMI 5% FCS 25mM Hepes [μl] Zeit [min] Temperatur 1 0 0 500 500 5 RT 2 120 428 72 500 5 RT 3 120 428 72 500 10 RT 4 120 428 72 500 15 RT 5 120 428 72 500 20 RT 6 0 0 500 500 5 RT 7 20 71 429 500 5 RT 8 20 71 429 500 10 RT 9 20 71 429 500 15 RT 10 20 71 429 500 20 RT - Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion durch Zugabe von 3ml RPMI/25mM HEPES/5%FCS gestoppt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und in jeweils 1 ml RPMI/25mM HEPES/5%FCS resuspendiert. Von jedem Ansatz wurden Triplikate mit 100μl/well (je 1 × 105 EL-4 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und mit 500μg/ml Ovalbumin (OVA, 45kDA) und 5 × 104 B3Z-Zellen/well für 20h kultiviert.
- Im murinen Testsystem wurden als reaktive T-Zellen B3Z-Zellen eingesetzt (Karttunen J. and Shastri N. 1991. Measurement of ligand induced activation of single viable T-cells using the lacZ reporter gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3972–76). Diese CD8+ T-Zell-Hybridomlinie besitzt einen T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für OVA-Peptid 257–264 präsentiert durch das MHC Klasse I–Molekül H-2Kb. Interagiert der TCR von B3Z-Zellen mit OVA-Peptid 257–264 -präsentierenden H-2Kb-Molekülen, sekretieren die B3Z-Zellen IL-2. Als Kontrollen wurden unbehandelte EL-4-Zellen mit bzw. ohne 1 μg/ml OVA 257–264 (P) und B3Z-Zellen inkubiert. Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden pro well 2 × 50μl Kulturüberstand abgenommen und in eine 96well-Platte überführt. Der IL-2-Gehalt im Überstand wurde über das Wachstum der IL-2-abhängigen T-Zell-Linie CTLL-2 detektiert. Bei diesem Proliferationstest wurden als Kontrollen CTLL-2-Zellen mit und ohne IL-2 mitgeführt. Die Proliferation der CTLL-2-Zellen wurde mit Hilfe eines Proliferationstestes der Firma Roche (Cell Proliferation Reagent Cat. No. 1 644 807) als OD-Wert nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in
2 dargestellt. - Zusammenfassend lässt sich im vorliegenden Beispiel nach Inkubation von EL-4-Zellen mit 20ng/ml LLO kein Einstrom von PI (A) und nur eine schwach ausgeprägte MHC I-Präsentation von OVA (B) nachweisen. Im Gegensatz dazu konnte nach Behandlung von EL-4-Zellen mit 120ng/ml OVA ein zunehmender Einstrom von PI (A) und eine stark ausgeprägte MHC I-Präsentation von OVA (B) beobachtet werden. Die erfolgreiche Einschleusung von extrazellulärem OVA in den MHC I-Präsentationsweg von EL-4-Zellen verläuft im vorliegenden Beispiel parallel zum detektierbaren LLO-vermittelten Einstrom von PI in die Zellen.
- Beispiel 2
- Messung der LLO-abhängigen mittleren PI-Fluoreszenzintensität parallel zur LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg
- Als APCs wurden EL-4-Zellen verwendet. Die Messung des PI-Einstromes wurde zeitgleich zur LLO-Inkubation mit dem Ziel der Einschleusung von Antigen durchgeführt. EL-4-Zellen wurden mit RPMI/25mM HEPES/5%FCS auf eine Zellkonzentration von 2 × 106/ml eingestellt. Pro Ansatz wurden jeweils 1 × 106 EL-4-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an LLO für unterschiedlich lange Zeit inkubiert (Tabelle 2). Tabelle 2:
Ansatz LLO-Konz [ng/ml] LLO in RPMI 5% FCS 25mM HEPES [μl] RPMI 5% FCS 25mM HEPES [μl] EL-4 2 × 106/ml RPMI 5% FCS 25mM HEPES [μl] Zeit [min] Temperatur 1 0 0 500 500 0 RT 2 1 36 464 500 0 RT 3 20 71 429 500 0 RT 4 50 179 321 500 0 RT 5 100 360 140 500 0 RT 6 1 36 464 500 15 RT 7 20 71 429 500 15 RT 8 50 179 321 500 15 RT 9 100 360 140 500 15 RT 10 1 36 464 500 30 RT 11 20 71 429 500 30 RT 12 50 179 321 500 30 RT 13 100 360 140 500 30 RT - Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion durch Zugabe von 3ml RPMI/25mM HEPES/5%FCS gestoppt. Die Zellen wurden nach einem Zentrifugationsschritt in jeweils 1 ml RPMI/25mM HEPES/5%FCS resuspendiert. Von jedem Ansatz wurden Triplikate mit 100μl/well (je 1 × 105 EL-4 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und mit 500μg/ml Ovalbumin (OVA, 45kDA) und 5 × 104 B3Z-Zellen/well für 20h kultiviert. Der Nachweis der MHC Klasse I-Präsentation von OVA (45kDA) wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung dargestellt.
- Parallel zur Inkubation der Zellen zur Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg (Tabelle 2) wurde für jede LLO-Konzentration ein Ansatz mit PI mitgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten zur Bestimmung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität gemessen (Tabelle 3). Die Ergebnisse sind in
4 dargestellt. Tabelle 3:Ansatz LLO-Konz. [ng/ml] LLO in RPMI 5% FCS 25mM HEPES, [μl] PI–Stamm-lösung 100μg/ml [μl] RPMI 5% FCS 25mM HEPES [μl] EL-4 2 × 106/ ml RPMI 5% FCS 25mM HEPES [μl] Zeit [min] Temperatur PI 1 0 0 20 480 500 0, 15, 30 RT PI 2 1 36) 20 444 500 0, 15, 30 RT PI 3 20 71 20 409 500 0, 15, 30 RT PI 4 50 179 20 301 500 0, 15, 30 RT PI 5 100 360 20 120 500 0, 15, 30 RT - Im vorliegenden Beispiel ließ sich nach Inkubation von EL-4-Zellen mit 1 bzw. 20ng/ml LLO zu keinem Messzeitpunkt ein im Vergleich zur Kontrolle erhöhter Einstrom von PI nachweisen, die MHC I-Präsentation von OVA war nach 15 und 30 Minuten Inkubation mit 20ng/ml LLO wie in Beispiel 1 nur sehr schwach ausgeprägt. Im Gegensatz dazu konnte bei Inkubation mit 50ng/ml LLO nach 15min Inkubation ein beginnender PI-Einstrom festgestellt werden, der bis zum Messzeitpunkt 30 Minuten deutlich nachweisbar war. Die bei 50ng/ml im Vergleich zu 20ng/ml stärkere Zunahme der mittleren PI-Fluoreszenzintensität spiegelt sich zu jedem Zeitpunkt auch in einer stärker ausgeprägten MHC I-Präsentation von OVA wider. Nach Inkubation mit 100ng/ml LLO war bereits nach 15 Minuten der Einstrom von PI deutlich ausgeprägt und nahm bis zum Zeitpunkt 30min weiter zu. Parallel dazu konnte nach Inkubation der EL-4-Zellen für 15 und 30min mit 100ng/ml LLO eine effiziente Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg nachgewiesen werden.
- Im vorliegenden Beispiel ist solange noch kein PI-Einstrom zu beobachten ist (20ng) nur eine sehr schwache Einschleusung von Antigen zu beobachten. Die LLO-Behandlung bei deutlich nachweisbaren Einstrom von PI (50ng) ist gefolgt von einer effizienten Einschleusung und MHC I-Präsentation von exogenem Antigen, die mit steigender LLO-Konzentration zunimmt.
- Beispiel 3
- Inkubation mit LLO nach publizieren Angaben
- Im Gegensatz zu Beispiel 1 und 2 erfolgte im vorliegenden Beispiel 3 die Inkubation mit LLO nach publizierten Angaben (Darji A., Chakraborty T., Wehland J., Weiss S. 1995. Listeriolysin generstes a route for the presentation of exogenous antigens by major histocompatibility complex class I. Eur. J. Immunol. 25(10):2967–71, und Darji A., Chakraborty T., Wehland J., Weiss S. 1997. TAP-dependent major histocompatibility complex class I presentation of soluble Proteins using listeriolysin. Eur. J. Immunol. 27(6):1353–9).
- Als APCs wurden EL-4-Zellen eingesetzt und nach den publizierten Angaben mit LLO zur Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg inkubiert. Die EL-4-Zellen wurden mit RPMI/25mM HEPES (37°C ohne Serum) auf eine Zellkonzentration von 2 × 106/ml eingestellt und bei 37°C mit 1 μg/ml LLO und 100μg/ml OVA für 15min und 60min inkubiert. Als Kontrollen wurden Ansätze ohne LLO mitgeführt (Tabelle 4). Tabelle 4:
Ansatz LLO-Konz. [μg/ml] LLO in RPMI 25mM HEPES [μl] OVA [10mg/ml] [μl] RPMI 25mM HEPES [μl] EL-4 2 × 106/ml RPMI 25mM HEPES [μl] Zeit [min] Temperatur [°C] 1 0 0 10μl 490 500 15 37 2 0 0 10μl 490 500 60 37 5 1 357 10μl 133 500 15 37 6 1 357 10μl 133 500 60 37 - Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion durch Zugabe von 3ml RPMI/25mM HEPES gestoppt. Die Zellen wurden nach einem Zentrifugationsschritt in jeweils 1ml RPMI/10%FCS resuspendiert. Von jedem Ansatz wurden Triplikate mit 100μl/well (je 1 × 105 EL-4 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und entweder ohne Antigen oder mit 500μg/ml Ovalbumin (OVA, 45kDA) und 5 × 104 B3Z-Zellen/well für 20h kultiviert. Der Nachweis der MHC Klasse I-Präsentation von OVA (45kDA) wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse der Inkubation mit 500μg/ml OVA in der Mikrotiterplatte sind mit denen der Inkubation ohne Antigen vergleichbar und in
6 dargestellt. - Parallel zur Inkubation der Zellen zur Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg (Tabelle 4) wurde wie in Beispiel 2 für jeden Testansatz ein Ansatz mit PI mitgeführt und zu den angegebenen Zeitpunkten zur durchflußzytometrischen Bestimmung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität im FACScalibur gemessen. Die Ergebnisse sind in
5 dargestellt. - Im vorliegenden Beispiel 3, des Ansatzes nach Literaturangaben, ließ sich nach Inkubation von EL-4-Zellen mit LLO weder nach 15minütiger noch nach 60minütiger Inkubation eine Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg erreichen (
6 ). Die parallel ermittelten mittleren PI-Fluoreszenzintensitäten sind nach 15minütiger Inkubation der Zellen mit 1 μg/ml LLO ohne Serum bei 37°C im Vergleich zum PI-Einstrom bei gelungener Einschleusung in den MHC I-Präsentationsweg (1 ) extrem hoch und zeigen bis zum Zeitpunkt 60min keine weitere Steigerung mehr (5 ). Dieser sehr starke Einstrom von PI bei Inkubation mit LLO nach publizierten Angaben legt die Vermutung nahe, dass im vorliegenden Beispiel der optimale Wirkungsbereich von LLO bereits weit überschritten ist und LLO auf die Zellen zytotoxisch wirkt, so dass keine Prozessierung und Präsentation von Antigen mehr erfolgen kann. - Beispiel 4
- Anwendungsbeispiel PBMCs (peripheral blond mononuclear cells) Messung des LLO-vermittelten Einstromes von PI als Vorversuch vor der LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen
- Im vorliegenden Beispiel wurden humane PBMCs als antigenpräsentierende Zellen verwendet. Es wird dem Fachmann jedoch ersichtlich sein, daß dieses Verfahren ohne weiteres für andere antigenpräsentierende Zellen auch entsprechend angepaßt durchgeführt werden kann.
- Vorarbeiten:
- Aus Buffy coats von CMV-seropositiven Spender werden durch Dichtegradientenzentrifugation PBMCs isoliert. Die Zellen der einzelnen Spender werden entweder sofort für Testungen eingesetzt oder aliquotiert in autologem Plasma mit 10% DMSO kryokonserviert. Im folgenden Beispiel wurden kryokonservierte PBMCs aufgetaut und für die Testung eingesetzt.
- A. Messung des Einstromes von PI in PBMCs während der Einwirkung von LLO:
- Im vorliegenden Experiment wurden die PBMCs mit PBS/5%AB-Serum bei Raumtemperatur auf eine Zellkonzentration von 6 × 106/ml eingestellt. Zu 500μl der Zellsuspension wurden 20μl PI (Stammlösung 100μg/ml, 2μg/ml Endkonzentration), 391ml PBS/5%AB-Serum und 89μl in PBS/%AB-Serum verdünntes LLO (25ng LLO) pipettiert. Die Probe hatte zu Beginn der Messung ein Volumen von 1 ml (25ng LLO/ml). Die Zugabe von LLO entspricht dem Zeitpunkt 0 min, ab dem der Einstrom von PI in die einzelnen Zellpopulationen (Monozyten und Lymphozyten,
7 ) durchflußzytometrisch detektiert wurde. - Die anschließende Messung wurde zu den angegebenen Zeitpunkten wiederholt, bis für die gewählte LLO-Konzentration der Zeitpunkt des Einstromes von PI bestimmt war. Es wurde für Monozyten und Lymphozyten der von 25ng/ml LLO vermittelte PI-Einstrom nach Inkubation für 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in PBS/5% AB-Serum ermittelt. Bei dem hier beschriebenen Experiment konnte ab dem Zeitpunkt 10min nach Zugabe von LLO zu den Zellen ein zunehmender Einstrom von PI in Monozyten und Lymphozyten detektiert werden. Die Ergebnisse sind in
8 dargestellt. - Erläuterungen zu
8 : - In
8 ist der LLO-vermittelte Einstrom von PI-Einstrom als Überlagerung von zwei Histogrammen darstellt, jeweils Zeitpunkt 0min zusammen mit einem späteren Meßzeitpunkt. Solange die beiden Histogramme vollständig zur Deckung kommen, lässt sich kein Einstrom von PI detektieren. Sobald sich der Peak des jeweils dargestellten Messzeitpunktes vom Zeitpunkt 0 Peak wegbewegt, beginnt der Einstrom von PI, der zunehmend deutlicher detektierbar wird. - B. Übertragung der Bedingungen (LLO-Konzentration und -inkubationszeit) des detektierbaren PI-Einstromes auf die Einschleusung von Antigen in den MHC I-Prozessierungsweg
- Die Messung des PI-Einstromes wurde abgesehen vom Puffer (PBS/5%AB-Serum) unter den Bedingungen durchgeführt, wie sie für die nachfolgende LLO-vermittelte Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg ausgewählt sind: Eingesetzt wurde die gleiche Zellkonzentration, das gleiche Volumen, die gleiche Konzentration und Charge an Serum, der gleiche Typ Reaktionsgefäß und die gleiche LLO-Charge. Die Messung des PI-Influxes während der Einwirkung von LLO wurde bei der gleichen Temperatur durchgeführt, wie die nachfolgende LLO-Inkubation zur Einschleusung von exogenem Antigen.
- Die zu behandelnden PBMCs wurden mit RPMI/5%AB-Serum auf eine Zellkonzentration von 6 × 106/ml eingestellt. Wie im Vorversuch wurden je Ansatz 3 × 106 PBMCs in gleichen Volumina und bei gleicher Konzentration des LLO, aber diesmal ohne PI inkubiert. Das Volumen wurde durch RPMI/5%AB-Serum ersetzt. Als Negativkontrolle wurde ein Ansatz ohne LLO mitgeführt. Für die Inkubation mit LLO wurden Inkubationszeiten gewählt, bei denen sich im Vorversuch noch kein Einstrom von PI, der Beginn des Einstroms von PI und ein zunehmender Einstrom von PI in Lymphozyten nachweisen ließ (
8 und Tabelle 5). Tabelle 5:Ansatz LLO-Konz [ng/ml] LLO in RPMI/5%AB-Serum [μl] RPMI/5% AB-Serum [μl] PBMCs 107/ml PBS [μl] Zeit [min] Temperatur 1 0 0 500 500 0 RT 2 25 89 411 500 0 RT 3 25 89 411 500 4 RT 4 25 89 411 500 6 RT 5 25 89 411 500 8 RT 6 25 89 411 500 10 RT 7 25 89 411 500 12 RT 8 25 89 411 500 15 RT - Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion in den einzelnen Ansätzen durch Zugabe von 3 ml RPMI/5%AB-Serum gestoppt. Die Zellen wurden nach einem Zentrifugationsschritt in jeweils 280μl RPMI/5%AB-Serum resuspendiert. Von der Zellsuspension wurden 150μl/well (mit 1,6 × 106 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und mit 2,5μg/ml CMVpp65 für 16h kultiviert. Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden die Zellen geerntet und mit Hilfe des IFN-γ-Secretion Assays der Firma Miltenyi Biotec (Deutschland) wurde der prozentuale Anteil IFN-sekretierender CD8+ T-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation durchflußzytometrisch bestimmt (
9 ). - Der Einstrom von PI wurde somit genutzt, um den Wirkungsbereich von LLO für die Einschleusung von Antigen (CMVpp65) ins Zytosol mit anschließender Prozessierung und MHC I-Präsentation zu definieren. Im beschriebenen Anwendungsbeispiel ließ sich parallel zum beginnenden PI-Einstrom in die Zellen (im Vorversuch mit PBS/5%AB-Serum zum Zeitpunkt 10min nach Zugabe von LLO) im nachfolgenden Präsentationsexperiment eine Zunahme der Frequenz aktivierter antigenspezifischer CD8+ T-Zellen nachweisen. Mit zunehmender Dauer der Inkubation mit LLO steigt die Anzahl der detektierbaren antigenspezifischen CD8+ T-Zellen bis zu einem Maximum an. Bei längerer Inkubation wirkt LLO zunehmend zytotoxisch und die Frequenz aktivierter antigenspezifischer CD8+ T-Zellen nimmt wieder ab. Das Fenster, innerhalb dessen die Inkubation mit LLO eine Einschleusung und Prozessierung von Antigen ermöglicht, kann durch die Messung des LLO-vermittelten PI-Einstromes bestimmt werden.
- Beispiel 5
- Anwendungsbeispiel PBMCs (peripheral blond mononuclear cells) Messung des PI-Einstromes nach der Einwirkung von LLO auf die Zellen
- Im vorliegenden Beispiel 5 wurden wie in Beispiel 4 kryokonservierte PBMCs eines CMV-seropositiven Spenders aufgetaut und für die Testung eingesetzt. Die Messung des PI-Einstromes erfolgte im vorliegenden Beispiel nach der Inkubation der PBMCs mit LLO. Die Zellen wurden in RPMI/3%AB-Serum (RT) auf eine Zellkonzentration von 1 × 107/ml eingestellt. Je Ansatz wurden 5 × 106 PBMCs mit 30ng/ml LLO für die angegebenen Zeiträume inkubiert (Tabelle 6). Tabelle 6:
Ansatz LLO-Konz [ng/ml] LLO in RPMI/3%AB-Serum [μl] RPMI/3%AB-Serum [μl] PBMCs 10/ml RPMI/3%ABSerum [μl] Zeit [min] Temperatur 1 30 107 393 500 0 RT 2 30 107 393 500 10 RT 3 30 107 393 500 15 RT 4 30 107 393 500 20 RT 5 30 107 393 500 25 RT 6 30 107 393 500 30 RT - Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion in den einzelnen Ansätzen durch Zugabe von 3ml RPMI/3%AB-Serum gestoppt. Von den jeweils insgesamt 4ml je Ansatz wurden nach vorsichtigem Resuspendieren 500μl in ein anderes Röhrchen überführt und nach Zugabe von 2μg/ml PI durchflußzytometrisch analysiert. Die Ergebnisse sind in
10 dargestellt (siehe Erläuterungen zu8 , Seite 31). Die restlichen Zellen wurden nach einem Zentrifugationsschritt in 300μl RPMI/3%AB-Serum resuspendiert. Von der Zellsuspension wurden 150μl/well (mit 2,2 × 106 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und mit 10μg/ml CMV-Lysat für 16h inkubiert. Der prozentuale Anteil IFN-γ-sekretierender CD8+ T-Zellen wurde wie in Beispiel 4 detektiert. Die Ergebnisse sind in11 dargestellt. - Im vorliegenden Beispiel ließ sich bereits nach 10minütiger Inkubation der PBMCs mit LLO ein Einstrom von PI nachweisen, der mit zunehmender Inkubationsdauer stärker wurde.
- Parallel zum Einstrom von PI ließ sich bis zur 20minütigen Inkubation mit LLO eine Zunahme des prozentualen Anteils IFN-γ-sekretierender CD8+ T-Zellen detektieren, bei längerer Inkubation mit LLO nahm der Anteil detektierbarer antigenspezifischer CTLs aufgrund der zytotoxischen Wirkung des LLO wieder ab.
- Beispiel 6
- Anwendungsbeispiel PBMCs (peripheral blond mononuclear cells) Messung des LLO-vermittelten Einstromes von PI als Vorversuch vor der LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen
- Im vorliegenden Beispiel 6 wurden wie in Beispiel 4 und 5 PBMCs als antigenpräsentierende Zellen verwendet. Die PBMCs wurden aus heparinisiertem Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und im Gegensatz zu den vorhergehenden Beispielen 4 und 5 ohne vorhergehendes Einfrieren sofort zur Testung eingesetzt. Bei diesem Experiment wurde Influenza-Antigen zur Stimulation eingesetzt.
- A. Messung des Einstromes von PI in PBMCs während der Einwirkung von LLO:
- 5 × 105 PBMCs wurden in PBS/5%AB-Serum bei Raumtemperatur mit 2μg/ml PI und 8ng LLO in einem Volumen von 1ml inkubiert: Das Pellet von 5 × 105 PBMCs wurde in 694μl PBS/5%AB-Serum resuspendiert, nach Zugabe von 20μl PI (Stammlösung 100μg/ml, 2μg/ml Endkonzentration) wurden 286μl LLO (in PBS/5%AB-Serum verdünnt) zugegeben. Die Zugabe von LLO entspricht dem Zeitpunkt 0 min, ab dem der Einstrom von PI in die einzelnen Zellpopupulationen (Monozyten und Lymphozyten) durchflußzytometrisch analysiert wurde. Die anschließende Messung wurde zu den angegebenen Zeitpunkten wiederholt, bis für die gewählte LLO-Konzentration der Zeitpunkt des Einstromes von PI bestimmt war. Es wurde für Monozyten und Lymphozyten der LLO-vermittelte PI-Einstrom von 8 ng/ml LLO nach Inkubation für 0, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 und 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in PBS/5% AB-Serum ermittelt. Bei dem hier beschriebenen Experiment konnte ab dem Zeitpunkt 15min nach Zugabe von LLO zu den Zellen ein zunehmender Einstrom von PI in Monozyten und Lymphozyten detektiert werden. Die Ergebnisse sind in
12 dargestellt (siehe Erläuterungen zu8 , Seite 31). - B. Übertragung der Bedingungen (LLO-Konzentration und -Inkubationszeit) des detektierbaren PI-Einstromes auf die Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg
- Wie in Beispiel 4 wurden die Bedingungen des Vorversuchs auf die LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen übertragen. Die zu behandelnden PBMCs wurden mit RPMI/5%AB-Serum auf eine Zellkonzentration von 1 × 106/ml eingestellt. Wie im Vorversuch wurden je Ansatz 5 × 105 PBMCs mit 8ng/ml LLO bzw. als Kontrolle ohne LLO inkubiert. Ausgewählt wurden ein Zeitpunkt, bei dem der Beginn des PI-Einstromes nachzuweisen war, und ein Zeitpunkt, bei dem der Einstrom von PI deutlich detektierbar war (15min bzw. 20min, Tabelle 7,
12 ). Tabelle 7:Ansatz LLO-Konz [ng/ml] LLO in RPMI/5%AB-Serum [μl] RPMI/5%AB-Serum [μl] PBMCs 106/ml RPMI/5%ABSerum [μl] Zeit [min] Temperatur 1 0 0 500 500 15 RT 2 8 286 214 500 15 RT 3 8 286 214 500 20 RT 4 0 0 500 500 15 RT 5 8 286 214 500 15 RT - Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion in den einzelnen Ansätzen durch Zugabe von 3 ml RPMI/5%AB-Serum gestoppt. Die Zellen wurden nach einem Zentrifugationsschritt in jeweils 100μl RPMI/5%AB-Serum mit 10μg/ml Influenza-Antigen (Ansätze 1 bis 3) bzw. als Kontrolle ohne Antigen (Ansätze 4 und 5) resuspendiert und in eine Mikrotiterplatte überführt. Nach 16 Stunden Kultur wurden die Zellen geerntet und der prozentuale Anteil IFN-γ-sekretierender CD8+ T-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation wurde wie in Beispiel 4 durchflußzytometrisch bestimmt (
13 ). Parallel zum beginnenden Einstrom von PI (15min) und bei nachweisbarem Einstrom von PI (20min) konnte im vorliegenden Beispiel bei Übertragung der Bedingungen des Vorversuchs (A) auf die Einschleusung von Antigen (B) eine Steigerung des prozentualen Anteils aktivierter antigenspezifischer CTLs nachgewiesen werden.
Claims (23)
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen, umfassend die Schritte von a) ein in Kontakt bringen von geeigneten antigenpräsentierenden Zellen mit einem Hämolysin und einer Marker-Substanz, b) Messung des Einstroms der Substanz in die Zellen, und c) geeignete Modifizierung der spezifischen Parameter, wobei die spezifischen Parameter ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: – der Zelllinie oder Primärzelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll; – der Qualität der eingesetzten Zellen; – der eingesetzten Zellkonzentration; – dem Volumen der Ansätze; – dem verwendeten Kulturmedium und/oder Puffer; – der An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen während der Inkubation; – der Serum- und/oder Cholesterinkonzentration; – dem Antigen, das eingeschleust werden soll; – dem Labormaterial, das während der Versuche verwendet wird; – der Temperatur während der Inkubation; – der Inkubationszeit der Zelllinie oder der primären Zellen mit dem Hämolysin; – der Art des Hämolysins; – wie das Hämolysin aufgereinigt wurde; – der Konzentration des verwendeten Hämolysins; und – dem Redoxzustand des Hämolysins.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach Anspruch 1, wobei ein weiterer spezifischer Parameter die Größe, Ladung und/oder Aminosäurezusammensetzung des Antigens ist.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Labormaterial ausgewählt ist aus dem verwendeten Plastik-Material (PS – PP) und Eppendorf-Gefäßen, Falcon-Röhrchen, Pipettenspitzen, Probenröhrchen, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten und Kulturschalen.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zelllinie oder Primärzelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll, ausgewählt ist aus jeder Art von Zelle, die zur MHC I-Präsentation in der Lage ist, insbesondere tierische Zellen wie insbesondere primäre humane und murine Zellen sowie Zelllinen, unseparierte oder separierte Zellen wie insbesondere PBMCs, Monozyten oder Lymphozyten, unreife aus Monozyten erzeugte DCs, die Zelllinie THP-1, murine Knochenmarkszellen in Suspension, adhärente murine Knochenmarksmakrophagen, die Zelllinie EL-4 und die Zelllinie NIH3T3.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Antigen eine Größe von bis zu 540 kDa aufweist.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Antigen ausgewählt ist aus Proteinen jeglicher Art, von denen die Präsentation antigener Epitope mit MHC I erzielt werden soll, oder Teilen davon.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Zellkonzentrationen zwischen 105/ml und 109/ml eingesetzt werden.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Hämolysin LLO ist, wobei das LLO ausgewählt ist aus Kulturüberstand, aufgereinigtem LLO oder rekombinant hergestelltem LLO.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Inkubationszeit mit dem LLO bis zu 16 Stunden, insbesondere zwischen 1 bis 45 Minuten beträgt.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritt b) 1–45 min lang ist.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Konzentration des verwendeten LLO zwischen 1 und 5000 ng/ml, insbesondere zwischen 1 und 500 ng/ml und bevorzugt zwischen 1 und 250 ng/ml beträgt.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das verwendete Kulturmedium und/oder der Puffer ausgewählt sind aus Puffern und Kulturmedien unterschiedlicher Zusammensetzung und Herkunft insbesondere PBS, DMEM und RPMI.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Temperatur während der Inkubation zwischen 0°C und 37°C, insbesondere Raumtemperatur, beträgt.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei als Marker ein Farbstoff und/oder eine fluoreszierende Verbindung, insbesondere Propidiumjodid (PI) verwendet wird.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Messung des Einstroms des Markers mittels einer Fluoreszenzmessung erfolgt.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, weiter umfassend eine Aktivierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen.
- In vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parameter zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend die Schritte von a) gegebenenfalls, Separation oder Konzentration der antigenpräsentierenden Zellen mittels Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation und/oder Zellsortieren und Einstellen auf eine Zellkonzentration von zwischen 105 bis 109 Zellen/ml, b) Inkubation der antigenpräsentierenden Zellen mit 1 bis 10 μg/ml PI für einen Zeitraum zwischen 1 min und 5 min bei Raumtemperatur, c) Zugabe von LLO in Konzentrationen von zwischen 1 und 5000 ng/ml, d) Inkubation für eine Zeit von 1 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur, e) durchflußzytometrische Bestimmung des Einstroms von PI in die Zellen, f) Ermittlung von spezifischen Parameter, bei denen bei den antigenpräsentierenden Zellen ein Einstrom von PI gemessen werden kann.
- In vitro Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen umfassend a) Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und b) Einschleusung des Antigens in den MHC Klasse I-Präsentationsweg der Zellen umfassend die direkte Übertragung der in den Ansprüchen 1 bis 17 ermittelten spezifischen Parameter, umfassend ein in Kontakt bringen der Zellen mit dem Hämolysin und dem einzuschleusenden Antigen.
- In vitro Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach Anspruch 18, umfassend ein in Kontakt bringen der Zellen mit Listeriolysin (LLO) und dem einzuschleusenden Antigen.
- Verfahren zur Herstellung einer APC, die aus Antigenen generierte Peptide mit MHC Klasse I präsentiert, umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 18 oder 19 und Isolieren der MHC Klasse I-präsentierenden APCs.
- Verfahren zur Induktion und/oder Aktivierung und/oder Expansion von zytotoxischen CD8+ T-Zellen, umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 18 oder 19 und Isolieren der aktivierten zytotoxischen CD8+ T-Zellen.
- Verfahren zur Ermittlung von MHC Klasse I-präsentierten Antigen-Epitopen, umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC Klasse-I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 18 oder 19 und Isolieren und Bestimmen der MHC Klasse I-präsentierten Peptide.
- Kit, enthaltend Materialien zur Durchführung des in vitro Verfahren zur Ermittlung von geeigneten spezifischen Parametern zur Einschleusung von extrazellulären Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 17, zur Herstellung einer APC mit einem MHC Klasse-I präsentierten Antigen nach Anspruch 19, zur Herstellung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen nach Anspruch 20 und/oder zur Ermittlung von MHC Klasse I-präsentierten Antigen-Epitopen nach Anspruch 21, wobei das/die Verfahren in klinischer Umgebung ("point of care") durchgeführt wird/werden.
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