JP7093557B2 - 導入剤、キット、物質導入方法、及びスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、導入剤、キット、物質導入方法、及びスクリーニング方法に関する。
本願は、２０１６年７月１９日に、日本に出願された特願２０１６－１４１２１９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

従来、細胞に物質を導入し、それが細胞に及ぼす影響を評価することが行われている。例えば、病気への治療効果が期待される化合物が見いだされれば、治療薬の有効成分として使用できる可能性がある。
これまでｉｎ ｖｉｔｒｏで活性を持ちながら、細胞膜透過性を持たない化合物は、細胞を用いたスクリーニングでその効用が検証できず見過ごされてきた。しかしながら、膜不透過性化合物を細胞内に導入できれば、これまで見逃されてきた活性のある化合物を新たに見つけることができる。また、それをリード化合物として優れた活性を持つ新規化合物を合成することも可能となる。

膜不透過性化合物を細胞内に導入する方法として、実用上有用なものは数限られている。Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＰＣ）の結合はその一つであるが、化合物にペプチドの結合作業を行う必要があり煩雑であること、またＣＰＣはエンドソーム内にトラップされがちで細胞質まで運搬される量は不明であり、細胞内での化合物の機能評価系として不安があることが問題点としてある。

これまでに本発明者らは、連鎖球菌毒素ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を用いた可逆的膜穿孔法を開発してきた。可逆的膜穿孔法を用いることで形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞を得ることができる。特許文献１に示されるように、セミインタクト細胞では、オルガネラや細胞骨格の構造や機能及びそれらの相対的空間配置はほぼインタクトに保持したまま、元の細胞質を流出させて他の細胞や臓器から調製した細胞質と「交換」することができる。例えば、セミインタクト細胞の細胞質と、病態細胞から得た細胞質とを交換することにより、細胞内に病態環境を構築できる。

日本国特開２０１３－２１３６８８号公報

しかしながら、ＳＬＯを用いた可逆的膜穿孔法では、細胞に直径約３０ｎｍの比較的大きな孔を開け、細胞質交換が可能な程度の穿孔状態となる。そのため、該方法を化合物導入方法への使用に適用しようとした場合には、細胞へのダメージを生じさせることへの懸念がある。また、細胞膜の再封入時に外部より細胞質を加え、細胞膜のリシールを促進させ、ダメージの回復を進めることができるが、細胞質の調整が手間のかかる作業であることが問題点である。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、細胞へのダメージを低減でき、物質の高効率な細胞内導入を可能とする導入剤、キット、物質導入方法、及び該方法を利用したスクリーニング方法を提供する。

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る導入剤は、３０℃以上４０℃以下における膜穿孔活性の至適ｐＨが、０以上６未満の範囲であるコレステロール依存性細胞溶解毒素を含有し、細胞への物質導入に用いられる。
前記コレステロール依存性細胞溶解毒素が、リステリオリシンＯであってもよい。
上記第１態様に係る導入剤において、分子量１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下の前記物質の導入率が、分子量３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下の前記物質の導入率よりも高くてもよい。
導入剤のｐＨが６以上１０以下であってもよい。
前記コレステロール依存性細胞溶解毒素の含有量が、０．０１μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であってもよい。

本発明の第２態様に係るキットは、上記第１態様に係る導入剤を備え、細胞への物質導入に使用される。

本発明の第３態様に係る物質導入方法は、上記第１態様に係る導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔し、物質を前記細胞に導入する工程１を含む方法である。
更に、前記工程１の後、カルシウムイオンを含む液を、前記孔が形成された細胞に接触させ、前記孔を再封入する工程２を含んでもよい。
前記工程２において、外来の細胞質を含む液を前記孔が形成された細胞に接触させずに、前記孔を再封入してもよい。
前記工程１において、前記穿孔は、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を、ｐＨ６以上１０以下の条件下で前記細胞に作用させて行ってもよい。
導入する前記物質の分子量が、０．１ｋＤａ以上２０ｋＤａ以下であってもよい。
導入する前記物質が核酸を含んでもよい。

本発明の第４態様に係る物質のスクリーニング方法は、上記第３態様に係る物質導入方法を用いる方法であり、前記細胞に導入する前記物質が被験物質であり、前記導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔し、被験物質を前記細胞に導入する工程Ａを含む方法である。
上記第４態様に係る物質のスクリーニング方法において、更に、工程Ａの後に、前記被験物質が導入された細胞又はその調整物と、被験物質が導入されていない細胞又はその調整物とを比較し、前記被験物質を評価する工程Ｂを含んでもよい。

上記態様に係る導入剤、キット及び導入方法によれば、細胞へのダメージが生じ難く、高効率に物質を細胞内へと導入できる。
上記態様に係るスクリーニング方法によれば、細胞へのダメージを生じさせ難く、被験物質を高効率に細胞内へと導入できるので、細胞本来の機能が反映された高精度な被験物質のスクリーニングが可能となる。

本実施形態の物質導入方法を説明する模式図である。 実施例１において取得された、細胞のフルオレセイン蛍光（１０ｋＤａ）の測定結果を示す図である。 実施例１において取得された、細胞のフルオレセイン蛍光（４０ｋＤａ）の測定結果を示す図である。 実施例１において取得された、細胞のフルオレセイン蛍光（７０ｋＤａ）の測定結果を示す図である。 実施例１において取得された、細胞のＦＩＴＣ蛍光（１５０ｋＤａ）の測定結果を示す図である。 実施例２において取得された、ＬＬＯで穿孔されたリシール細胞と、ＳＬＯで穿孔されたリシール細胞との細胞形態の比較結果を示す画像である。 実施例３において、ＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質を、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した結果を示す画像である。 実施例３において、膜不透過性のｃＡＭＰアナログを本実施形態に係る物質導入方法により細胞に導入し、細胞内でのｃＡＭＰアナログの機能を確認した結果を示す画像である。 実施例４において、ＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質を、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した結果を示す画像である。 実施例４において、図９ＡのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる検出結果から、ＧＡＰＤＨの輝度に対するＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質である「ｂａｎｄ－ｅ」の輝度を定量したグラフである。 実施例４において、膜不透過性のｃＡＭＰアナログ又は膜透過性ＰＫＡ活性化剤（ｄｂ－ｃＡＭＰ）を本実施形態に係る物質導入方法により細胞に導入し、細胞内でのｃＡＭＰアナログ又はｄｂ－ｃＡＭＰの機能をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した結果を示す画像である。 実施例４において、図１０ＡのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる検出結果から、β－Ｔｕｂｕｌｉｎの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度を定量したグラフである。 実施例４において、膜不透過性のｃＡＭＰアナログを本実施形態に係る物質導入方法により細胞に導入し、細胞内でのｃＡＭＰアナログの機能をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した結果を示す画像である。 実施例４において、図１１ＡのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる検出結果から、β－Ｔｕｂｕｌｉｎの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度を定量したグラフである。 実施例５における各工程の概要図である。 実施例５において、膜不透過性のＡＫＴ阻害剤を本実施形態に係る物質導入方法により細胞に導入し、細胞内でのＡＫＴ阻害剤の機能をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した結果を示す画像である。 実施例５において、図１２ＢのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる検出結果から、総ＡＫＴ（Ｔｏｔａｌ－ＡＫＴ）の輝度に対するリン酸化ＡＫＴ（Ｐ－ＡＫＴ）の輝度を定量したグラフである。

≪導入剤≫
本発明の一実施形態に係る導入剤は、細胞への物質導入に使用されるものであって、３０℃以上４０℃以下における膜穿孔活性の至適ｐＨが、０以上６未満の範囲であるコレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する。
以下、実施の形態に基づき、本実施形態の導入剤を説明する。

本明細書において「細胞への物質導入」とは、物質導入の対象となる細胞の細胞膜よりも内側へと、新たに物質を導入することをいう。新たに導入される物質は、物質導入の対象となる細胞が有している物質と同種の物質であってもよい。例えば、物質導入の対象となる細胞が有する核酸と同一の配列を有する核酸を、新たに細胞に導入することも、細胞への物質導入に含まれる。

本実施形態の導入剤は、後述の物質導入方法に好適に用いられる。導入対象の物質については、後述の物質導入方法で例示するものが挙げられる。

本明細書において、「コレステロール依存性細胞溶解毒素」とは、コレステロールと結合し、細胞膜に孔を形成させる（細胞膜を穿孔する）膜穿孔活性を有するものを指す。コレステロール依存性細胞溶解毒素としては、連鎖球菌が産生する毒素が知られている。該毒素はタンパク質であり、細胞膜上のコレステロールに結合した後、細胞膜上で自己集合して細胞膜に孔を形成する。
細胞にコレステロール依存性細胞溶解毒素を接触させると、細胞膜に孔が形成され、形成された孔を通じて物質を導入できる。すなわち、前記物質導入とは、コレステロール依存性細胞溶解毒素によって細胞膜に形成された前記孔を介した、物質導入を意味する。

コレステロール依存性細胞溶解毒素の活性には、至適ｐＨの存在が知られている。例えば、コレステロール依存性細胞溶解毒であるリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）は、ｐＨが６未満の範囲に、至適ｐＨを有するとされる（参考資料１：Schuerch, D.W., Wilson-Kubalek, E.M. and Tweten, R.K.(2005) Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. PNAS, 102, 12537-12542.）。
本発明者らは、３０℃以上４０℃以下における膜穿孔活性の至適ｐＨが、０以上６未満の範囲であるコレステロール依存性細胞溶解毒素を用いることにより、ＳＬＯを用いた場合よりも細胞へのダメージが少なく、高効率に物質を細胞内に導入可能なことを見出した。
細胞の状態を良好に保ちつつ、細胞の処理を行おうとするとき、中性付近のｐＨを有する液で処理することが通常である。ここでｐＨが０以上６未満の範囲に至適ｐＨを有するコレステロール依存性細胞溶解毒を用いると、細胞状態が良好で且つ膜穿孔活性が穏やかに発揮され、物質導入用途に好都合な程度に細胞が穿孔されるものと考えられる。

上記膜穿孔活性は、３０℃以上４０℃以下におけるものであり、３３℃以上３８℃以下であってもよく、３５℃以上３７℃以下であってもよい。
上記至適ｐＨは、ｐＨ１以上６未満であってもよく、ｐＨ３以上５．５以下であってもよく、ｐＨ４．５以上５．５未満であってもよい。

上記膜穿孔活性の至適ｐＨは公知の方法により測定できる。例えば、上記温度及びｐＨ条件で培養している赤血球に対してコレステロール依存性細胞溶解毒素を接触させる。次いで、赤血球膜が破壊されてヘモグロビンが溶出される血球の溶血活性（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔ；ＨＵ）の程度を基準として膜穿孔活性を測定できる。さらに、膜穿孔活性が最大となるｐＨを、至適ｐＨと判断できる。

３０℃以上４０℃以下における膜穿孔活性の至適ｐＨが、０以上６未満の範囲であるコレステロール依存性細胞溶解毒素とは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）であってよい。本発明の一実施形態に係る導入剤は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を含有し、細胞への物質導入に用いられるものである。

リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に属するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって生産されることが知られる。ＬＬＯはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＬＬＯであってもよい。
本実施形態の導入剤が含有する前記毒素は、ＬＬＯと実質的に同等の機能を有するタンパク質であってもよい。ＬＬＯは天然に存在する天然型のタンパク質であってもよい。又は、ＬＬＯは天然型と同等の機能を有するものであれば、天然型とは異なるアミノ酸配列、修飾、付加等を有する突然変異型又は人為的改変型のタンパク質であってもよい。

ＬＬＯによる穿孔が、ＳＬＯによる穿孔よりも細胞へのダメージが少ないのは、おそらく、ＬＬＯにより形成される孔の直径が、ＳＬＯにより形成される孔の直径よりも小さいためと考えられる。また、係る性質により、ＳＬＯを用いた可逆的膜穿孔法よりも細胞質の成分の流出が抑えられ、細胞へのダメージが生じ難く、細胞状態が良好となると考えられる。また、細胞状態が良好なため、細胞膜の再封入（リシール）時に外部より細胞質を加えずとも、良好な細胞状態を実現できる。

本実施形態の導入剤により導入される物質の導入率は、分子量１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下の物質の導入率が、分子量３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下の物質の導入率よりも高いことが好ましく、分子量７ｋＤａ以上１３ｋＤａ以下の物質の導入率が、分子量３５ｋＤａ以上５５ｋＤａ以下の物質の導入率よりも高いことがより好ましい。
物質の導入率は、例えば、実施例に記載の手法により確認できる。本発明者らは、後述する実施例に示すように、ＬＬＯを用いて、分子量１０ｋＤａ、４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、及び１５０ｋＤａの、それぞれ分子量の異なる蛍光標識デキストランの細胞への導入率を計測した。ＬＬＯによる穿孔では、中分子量（１０ｋＤａ）のデキストランの細胞への導入率が、その他の分子量（４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、１５０ｋＤａ）のデキストランよりも大きいことが判明した。
このような中分子の選択的な透過性は、ＳＬＯを用いた可逆的膜穿孔法では、確認されていない。

ＬＬＯによれば、分子量１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下の物質は通しやすく、分子量３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下の物質は通しにくい程度の直径の孔を、形成可能であると考えられる。したがって、分子量に相関し、孔を通過できる物質が篩分けされているものと考えられる。
細胞膜に開いた孔を通じて細胞内へ物質を導入可能であるということは、同様に当該孔を通じて細胞内の成分が細胞外へと流出する可能性がある。例えば、細胞質に含まれる酵素の分子量は２０ｋＤａ以下程度のものが多いとされている。分子量１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下の物質の導入率が、分子量３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下の物質の導入率よりも高いことにより、より細胞へのダメージを生じさせ難く、良好な細胞状態で物質を高効率に細胞内へと導入できる。

本実施形態の導入剤は、コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有するものであればよい。本実施形態の導入剤は、実質的にコレステロール依存性細胞溶解毒素のみからなるものであってもよく、該毒素以外の任意成分を含有していてもよい。なお、ここでいう「実質的にコレステロール依存性細胞溶解毒素のみからなる」とは、本実施形態の導入剤が、コレステロール依存性細胞溶解毒素のみからなる、又は、前記毒素以外の任意成分を検出限界以下の極微量しか含まないことを意味する。
導入剤１００質量％中に含まれるコレステロール依存性細胞溶解毒素の含有量は、例えば、１質量％以上１００質量％以下であってもよく、１０質量％以上９８質量％以下であってもよく、５０質量％以上９０質量％以下であってもよく、６０質量％以上８０質量％以下であってもよい。

前記孔を通過できる物質のサイズについては、細胞に作用させるコレステロール依存性細胞溶解毒素の濃度に依存して、条件が変化する。そのため導入したい物質の分子量に応じて、細胞に作用させるコレステロール依存性細胞溶解毒素の濃度を調節すればよい。

導入剤の形態は特に限定されず、固体（粉体、粒状体等）、液体等の種々の形態であってよい。
前記粉体としては、例えば、コレステロール依存性細胞溶解毒素の乾燥物が挙げられる。前記粉体の水分含量は、一例として、０質量％以上２０質量％以下であってよく、５質量％以上１０質量％以下であってよい。
前記粒状体としては、前記粉体の成形体が挙げられる。
前記液体としては、コレステロール依存性細胞溶解毒素が媒体に分散又は溶解した、コレステロール依存性細胞溶解毒素の分散体又は溶液が挙げられる。前記媒体としては、水性溶媒が挙げられ、具体的には、水、バッファー、血清非添加培地等の細胞培養に用いられる各種培地が挙げられる。

本実施形態の導入剤は、培養細胞に対して使用されることが好ましく、培養細胞を培養する培地に添加されて使用されてもよい。本実施形態の導入剤は、培養細胞を培養可能な培地として提供され、使用されてもよい。
なお、本明細書において、「培養」とは、生体（個体）外で細胞を飼育又は生育させることを指す。飼育又は生育の期間は、例えば１分以上７日以下であってもよく、５分以上１６時間以下であってもよく、１０分以上１時間以下であってもよい。
また、「培地」とは、細胞を培養可能なもの全般を指す概念である。導入剤が培地である場合、導入剤からコレステロール依存性細胞溶解毒素該毒素を除いた残りの成分は、非常に短期間でも細胞を培養できるものであればよく、一般的に培地とは称されないバッファーや水等であってもよい。培地に含まれ得る成分としては、通常の細胞培養用の培地に含有される成分が挙げられる。前記成分として具体的には、例えば、グルコース、塩化ナトリウム、ビタミン・ミネラル類、アミノ酸類等の栄養成分、成長因子、細胞増殖因子、分化誘導因子、抗菌剤、抗真菌剤等を挙げることができる。

導入剤が、培養細胞を培養可能な培地として提供される場合、導入剤に含まれるコレステロール依存性細胞溶解毒素の含有量が、導入剤１ｍＬあたり、０．０１μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．０２５μｇ／ｍＬ以上０．６μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、０．０３μｇ／ｍＬ以上０．５μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、０．０５μｇ／ｍＬ以上０．３μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。コレステロール依存性細胞溶解毒素を上記濃度範囲で含有する導入剤は、細胞に与えるダメージがより少なく、且つ細胞への物質導入効果をより均等なものとすることができる。

ＬＬＯでは、おそらく細胞膜に形成される孔の直径の影響により、中分子（１０ｋＤａ以下程度）の物質の導入効率が高いものであるが、濃度依存的により大きな分子を導入可能である。
上述の、分子量１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下の物質の導入率が、分子量３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下の物質の導入率よりも高いという傾向を得たい場合には、上記の濃度範囲のうち、導入剤に含まれるコレステロール依存性細胞溶解毒素の含有量を０．０５μｇ／ｍＬ以上０．３μｇ/ｍＬ以下の範囲とすることができる。

導入剤が、培養細胞を培養可能な培地として提供される場合、導入剤のｐＨは、ｐＨ６以上１０以下であってもよく、６．５以上８以下であってもよく、７．０以上７．５以下であってもよい。ｐＨは３０℃以上４０℃以下の温度範囲における測定値とする。
上記範囲内にある導入剤では、細胞をより良好に培養できる。更には、ｐＨが０以上６未満の範囲に至適ｐＨを有するコレステロール依存性細胞溶解毒素の膜穿孔活性が、より穏やかに発揮される点からも好ましい。

従来、ＳＬＯを用いた可逆的膜穿孔法では、細胞膜の穿孔により細胞が傷つき、手法によっては細胞死が生じやすくなる場合があった。
ＬＬＯは、ｐＨが０以上６未満の範囲に至適ｐＨを有するとされ、物質導入に使用されることは試みられてこなかった。
しかし、本発明者らは、驚くべきことに、ＬＬＯを用いることで、細胞へのダメージを生じさせ難く、物質を高効率に細胞内へと導入できることを見出した。
本実施形態の導入剤によれば、ｐＨが０以上６未満の範囲に至適ｐＨを有するコレステロール依存性細胞溶解毒素を含有するので、細胞へのダメージを生じさせ難く、物質を高効率に細胞内へと導入できる。

≪キット≫
本発明の一実施形態に係るキットは、上述の導入剤を備え、細胞の物質導入に用いられるものである。
以下、実施の形態に基づき、本実施形態のキットを説明する。

本実施形態のキットは、導入剤の他に、培地、緩衝剤等の試薬類や、カルシウム塩、ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系等の細胞膜のリシールを促進させる試薬等を、更に備えるものであってよい。

本実施形態のキットは、後述の本実施形態の物質導入方法に好適に用いることができる。本実施形態のキットは、本実施形態の物質導入方法を説明する指示書を備えることができる。
このように、後述の本実施形態の物質導入方法に用いら得る試薬類を、キット化することにより、より簡便かつ短時間に物質導入方法を行うことができる。

≪物質導入方法≫
本発明の一実施形態に係る物質導入方法は、上述の導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔し、物質を前記細胞に導入する工程１を含む方法である。

当該導入剤は、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有するものである。即ち、本実施形態の物質導入方法は、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を細胞に接触させて、該細胞の細胞膜を穿孔し、物質を前記細胞に導入する工程１ａを含む方法であってもよい。

物質導入方法に用いられてもよい当該導入剤は、コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する液であってもよい。又は、コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する培地であってもよい。又は、コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する液体培地であってもよい。
以下、導入剤がコレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する液体培地である場合を例に、本実施形態の物質導入方法を説明する。細胞を当該培地（導入剤）で培養することで、導入剤を細胞に接触させることとなる。
以下、図１を参照し、実施の形態に基づき、本実施形態の物質導入方法を説明する。

本実施形態の物質導入方法は、
前記導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔する穿孔工程と、
前記穿孔工程において細胞膜に形成された孔を介して、前記細胞に物質を導入する導入工程と、
前記導入工程の後、カルシウムイオンを含む液を、前記孔が形成された前記細胞に接触させ、前記孔を再封入（リシール）する再封入工程と、を含む。

（穿孔工程）
穿孔工程は、導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔する工程である。
図１の（ａ）～（ｃ）は穿孔工程を説明する模式図である。
図１の（ａ）に示すように、ウェルＷには、コレステロール依存性細胞溶解毒素１（以下、「毒素１」ということがある。）を含有する培地Ｍ１（導入剤）、及び細胞Ｃが収容されている。コレステロール依存性細胞溶解毒素としては、上記導入剤で例示したものが挙げられる。

図１の（ｂ）に示すように、毒素１を含む培地Ｍ１（導入剤）で細胞Ｃを培養すると、毒素１が細胞Ｃの細胞膜中のコレステロールと結合することで、細胞Ｃの細胞膜に結合する。

毒素１を含有する培地Ｍ１は、例えば、細胞培養に用いられる公知の培地に、毒素１を添加することで得ることができる。
培地Ｍ１から毒素１を除いた培地成分としては、特に制限されず、細胞培養に用いられる培地を使用すればよく、従来公知の培地を使用してもよい。前記公知の培地として具体的には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ'ｓ ＭＥＭ）、Ｄ－ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）培地等が挙げられる。

細胞に接触させる培地Ｍ１（導入剤）に含まれる毒素１の濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．０２５μｇ／ｍＬ以上０．６μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、０．０５μｇ／ｍＬ以上０．３μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、０．０８μｇ／ｍＬ以上０．１μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。毒素１を上記濃度範囲で含有する培地Ｍ１は、細胞に与えるダメージがより少なく、且つ細胞への物質導入効果をより均等なものとすることができる。

培地Ｍ１に含まれる毒素１の量と細胞Ｃとの量比は、細胞の細胞種に応じて適宜定めることができる。例えば、細胞の細胞膜中のコレステロール含量が多いほど、膜穿孔で必要な毒素量が少なくなると考えられる。細胞膜中のコレステロール含量が高い場合は、培地Ｍ１に含まれる毒素の量（濃度）が少なくなる方向に調整すればよく、細胞膜中のコレステロール含量が低い場合は、培地Ｍ１に含まれる毒素の量（濃度）が高くなる方向に調整すればよい。

毒素１を含む培地Ｍ１で培養されるとき、細胞Ｃは０℃以上１０℃以下の温度で培養されることが好ましく、２℃以上５℃以下の温度で培養されることが好ましい。即ち、培地Ｍ１の温度は、０℃以上１０℃以下が好ましく、２℃以上５℃以下が好ましい。例えば、ウェルＷが形成された培養容器を氷上（ｏｎ ｉｃｅ）に置くことで、培地Ｍ１の温度を管理してもよい。当該温度域では、毒素１の膜穿孔活性が抑制されている。そのため、毒素１を含む培地Ｍ１と細胞Ｃとを接触させると、毒素１は細胞Ｃの細胞膜に結合するものの、穿孔の作用がより発揮され難く、細胞膜の穿孔の程度をより制御しやすくできる。

毒素１を含む培地Ｍ１（導入剤）で細胞Ｃを培養する培養時間は、毒素の種類や細胞種に応じて適宜定めればよい。培養時間の一例として１分以上３０分以下程度が挙げられる。

物質導入される細胞は特に限定されず、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の細胞や、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。前記細胞は、細胞塊、スフェロイド、組織、胚様体、器官等の細胞集合体を構成するものであってもよい。

培地Ｍ１（導入剤）で細胞を培養した後、培地Ｍ１を、毒素１を含まない培地Ｍ２に交換し、培地Ｍ２で細胞を培養して、細胞Ｃの細胞膜を穿孔する。
毒素１を含む培地Ｍ１から、毒素１を含まない培地Ｍ２に交換することで、細胞Ｃに結合した以外の毒素１は、ウェルＷ内の反応系から取り除かれる。

培地Ｍ２で培養されるとき、細胞Ｃは３０℃以上４０℃以下で培養されることが好ましく、３３℃以上３８℃以下で培養されることがより好ましく、３５℃以上３７℃以下で培養されることがさらに好ましい。即ち、培地Ｍ２の温度は、３０℃以上４０℃以下が好ましく、３３℃以上３８℃以下がより好ましく、３５℃以上３７℃以下がさらに好ましい。当該温度域で培養することで、毒素１の膜穿孔活性がより発揮され、細胞Ｃの細胞膜が穿孔され、細胞膜に孔が形成された細胞Ｃｐとなる。培地Ｍ２には細胞Ｃに結合した毒素１以外の毒素１が除かれているため、孔からさらに毒素１が細胞内に入り細胞質中のオルガネラが穿孔されることを防止できる。

培地Ｍ２で細胞Ｃを培養する培養時間は、毒素の種類や細胞種に応じて適宜定めればよい。培養時間の一例として１分以上３０分以下程度が挙げられる。

培地Ｍ２としては、上記培地Ｍ１で例示した培地を用いてもよいが、実施例で使用したＴＢ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ）培地を、特に好ましい培地として例示できる。ＴＢ培地では、細胞質のイオンの組成を考慮して調製されており、細胞膜の穿孔による影響を小さくできる。

前記穿孔は、毒素１をｐＨ６以上１０以下の条件下で細胞Ｃに作用させて行うことが好ましく、６．５以上８以下の条件下で作用させて行うことがより好ましく、７．０以上７．５以下の条件下で作用させて行うことがさらに好ましい。即ち、培地Ｍ２のｐＨは、６以上１０以下が好ましく、６．５以上８以下がより好ましく、７．０以上７．５以下がさらに好ましい。ｐＨは３０℃以上４０℃以下の温度範囲における測定値とする。
上記範囲内では、細胞をより良好に培養でき、毒素１の膜穿孔活性が、より穏やかに発揮される点からも好ましい。

前記穿孔は、毒素１を３０℃以上４０℃以下及びｐＨ６以上１０以下の条件下で細胞Ｃに作用させて行うことが好ましく、３３℃以上３８℃以下及びｐＨ６．５以上８以下の条件下で作用させて行うことがより好ましく、３５℃以上３７℃以下及びｐＨ７．０以上７．５以下の条件下で作用させて行うことがさらに好ましい。即ち、培地M２は、３０℃以上４０℃以下及びｐＨ６以上１０以下が好ましく、３３℃以上３８℃以下及びｐＨ６．５以上８以下がより好ましく、３５℃以上３７℃以下及びｐＨ７．０以上７．５以下がさらに好ましい。

（導入工程）
導入工程は、前記穿孔工程において細胞膜に形成された孔を介して、細胞に物質を導入する工程である。
図１の（ｄ）は導入工程を説明する模式図である。図１の（ｄ）に示すように、ウェルＷには、細胞Ｃｐに導入される物質３を含有する培地Ｍ３、及び前記穿孔工程で細胞膜に孔が形成された細胞Ｃｐが収容されている。
図１の（ｄ）に示すように、細胞Ｃｐを培地Ｍ３中で培養することで、物質３が細胞Ｃｐに形成された孔を通り、細胞Ｃｐの細胞膜の内側に導入される。

物質３を含有する培地Ｍ３は、例えば、前記穿孔工程の培地Ｍ２に、物質３を添加することで得ることができる。培地Ｍ３に含まれる物質３の量は、物質３の種類に応じて適宜設定可能である。

本実施形態の物質導入方法において、細胞に導入される物質としては、当該方法によって細胞に導入可能なものであれば特に制限されない。該物質の分子量としては、例えば分子量０．１ｋＤａ以上２０ｋＤａ以下であってもよく、１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下であってもよく、５ｋＤａ以上１０ｋＤａ以下であってもよい。上記範囲の物質の導入を行う場合、細胞質に含まれる成分の流出が生じにくいので、細胞へのダメージをより生じさせ難く、本実施形態の物質導入方法の利点がより発揮されやすく、より良好な細胞状態で物質を高効率に細胞内へと導入できる。

本実施形態の物質導入方法において、細胞に導入される物質としては、細胞膜不透過性の性質を有するものであってもよい。
なお、本明細書において、「細胞膜不透過性を有する物質」とは、細胞膜の脂質二重膜に溶け込めず、脂質二重膜を透過できない性質を有する物質を意味する。本実施形態の物質導入方法によれば、細胞膜不透過性の物質であっても、前記孔を通じて、細胞内に高効率に導入可能である。

なお、本実施形態では、細胞に導入される物質は培地Ｍ３に含有されていたが、細胞膜に形成された孔を介して物質を導入可能であれば、物質導入の手法は上記手法に限定されるものではない。物質導入の手法としては、例えば、上記細胞Ｃｐに物質を接触させる方法が挙げられ、細胞Ｃｐに直接に物質を吹き付ける方法、細胞Ｃｐに直接に物質を滴下する方法等が挙げられる。

本実施形態の物質導入方法において、細胞に導入される物質としては、化合物であってよく、有機化合物であってよい。当該物質は核酸を含んでいてもよい。前記核酸としては、例えば、アンチセンス核酸、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー等が挙げられる。これらの化合物は、核酸医薬の有効成分となり得る。これらの核酸を含む化合物は、通常は細胞膜不透過性であるが、本実施形態の物質導入方法によれば、これらを効率よく細胞に導入可能である。

（再封入工程）
再封入工程は、前記導入工程の後、カルシウムイオンを含む液を、前記孔が形成された前記細胞に接触させ、前記孔を再封入する工程である。
図１の（ｅ）は、再封入工程を説明する模式図である。図１の（ｅ）に示すように、培地Ｍ４はカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）を含有する。

なお、本明細書において「再封入（リシール）」とは、前記穿孔工程で細胞膜に形成された孔の開口が全部または部分的に閉じられることを意味する。再封入は、エンドサイトーシス及びエキソサイトーシスのうち少なくともいずれかによって、細胞膜から毒素１が取り除かれることにより生じるとされ、カルシウムイオンの存在により促進される。Ｃａ^２＋を含有する培地Ｍ４で培養された細胞Ｃｐは、細胞膜がリシールされ、細胞Ｃとなる。前記導入工程で細胞内に導入された物質３は、再封入によって効率的に細胞Ｃ内に保持される。

細胞に接触させる前記カルシウムイオンの濃度は、一例として、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。即ち、培地Ｍ４が含有するカルシウムイオンの濃度は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。

カルシウムイオンを含む液は、例えば、前記導入工程の培地Ｍ３に、カルシウムの塩を添加することで得ることができる。添加するカルシウムの塩としては、ＣａＣｌ_２が挙げられる。

再封入工程において、外来の細胞質を含む液を前記孔が形成された細胞に接触させずに、前記孔を再封入することが好ましい。細胞質には、エンドサイトーシス及びエキソサイトーシスのうち少なくともいずれかを促進させる因子が含まれている。従来行われていた再封入では、外来の細胞質を含む液を前記孔が形成された細胞に接触させて、再封入が行われていた。これは、従来法では、穿孔により細胞質成分が細胞外に放出されてしまうため、放出された分の細胞質を補充することが有効であったと考えられる。一方、本実施形態の物質導入方法によれば、細胞へのダメージが生じ難いため、細胞膜の再封入時に外部より細胞質を加えずとも、良好に再封入がなされるものと考えられる。

本明細書において「外来の細胞質」とは、導入剤で処理されて穿孔された物質導入対象の細胞以外の細胞の細胞質を意味する。例えば、細胞膜に孔が形成された細胞Ｃｐの細胞質は、外来の細胞質に該当しない。図１に示される例では、外来の細胞質とは、ウェルＷに収容された細胞Ｃ，Ｃｐ以外の細胞から得られた細胞質である。なお、外来の細胞質の種類は、前記物質導入対象の細胞とは違う種類の細胞の細胞質でもよいし、同じ種類の細胞の細胞質でもよく、組織から調製した細胞質でもよい。

なお、再封入工程において、外来の細胞質を含む液を前記孔が形成された細胞に接触させてもよく、その場合には、例えば外来の細胞質を、上記培地Ｍ３及び上記培地Ｍ４のうち少なくともいずれかに添加し、細胞を培養してもよい。

本実施形態の物質導入方法では、ＡＴＰ再生系を含む培地で細胞を培養してもよく、導入工程及び再封入工程のうち少なくともいずれかにおいて、ＡＴＰ再生系を含む培地で細胞を培養してもよい。例えば、ＡＴＰ再生系を、上記培地Ｍ３及び上記培地Ｍ４のうち少なくともいずれかに添加し、細胞を培養してもよい。ＡＴＰ再生系としては、例えば、ＡＴＰ、クレアチンキナーゼ、及びクレアチンリン酸の組み合わせ等が挙げられる。

なお、本実施形態の物質導入方法では、穿孔工程と導入工程とを独立の工程として実施したが、穿孔と物質導入とはほぼ同時に生じてもよい。その場合、本実施形態の物質導入方法では、物質３は穿孔工程の後に、Ｍ３培地に添加することを例示したが、物質３は、穿孔工程の培地Ｍ２に添加されていてもよい。
また、本実施形態の物質導入方法では再封入工程を実施したが、本実施形態の物質導入方法において、再封入工程は必須の工程ではない。
なお、「工程１」とは、上述の「穿孔工程」及び上述の「導入工程」を示す。「工程１ａ」とは、前記導入剤の具体例としてコレステロール依存性細胞溶解毒素を用いた場合における、上述の「穿孔工程」及び上述の「導入工程」を示す。「工程２」とは、再封入工程を示す。

以上のとおり、本実施形態の物質導入方法によれば、上述の導入剤を用いることにより、細胞へのダメージを生じさせ難く、高効率に物質を細胞内へと導入できる。また、細胞膜の再封入時に外部より細胞質を加えずとも、良好に再封入がなされ、細胞内に物質が保持される。

≪スクリーニング方法≫
本発明の一実施形態に係るスクリーニング方法は、上述の物質導入方法を用いる方法であり、前記細胞に導入する前記物質が被験物質であり、上述の導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔し、被験物質を前記細胞に導入する工程Ａを含む方法である。
以下、実施の形態に基づき、本実施形態のスクリーニング方法を説明する。

本実施形態のスクリーニング方法は、
上述の導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔する穿孔工程と、
前記穿孔工程において細胞膜に形成された孔を介して、前記細胞に被験物質を前記細胞に導入する導入工程と、
被験物質が導入された細胞と、被験物質が導入されていない細胞とを比較し、前記被験物質を評価する評価工程と、を含む。

被験物質としては、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等が挙げられる。
また、上述の物質導入方法において例示した、細胞に導入される物質を好適なものとして例示できる。

穿孔工程及び導入工程は、上述の物質導入方法において、説明したとおりである。また、被験物質の導入方法としては、上述の物質導入方法において例示した方法を例示できる。
また、穿孔工程と導入工程とを独立の工程としてもよく、穿孔と物質導入とはほぼ同時に生じてもよい。
また、導入工程の後であって、評価工程の前に、上述の再封入工程を実施してもよい。
なお、「工程Ａ」とは、細胞に導入する物質が被験物質である場合における上述の「穿孔工程」及び上述の「導入工程」を示す。「工程Ｂ」とは、後述の評価工程を示す。

（評価工程）
細胞に導入された被験物質は、細胞内で機能を発揮し得る。
評価工程は、被験物質が導入された細胞と、被験物質が導入されていない細胞とを比較し、前記被験物質を評価する工程である。
比較項目は、スクリーニングの目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、疾患Ａの治療剤又は予防剤の有効成分をスクリーニングするのであれば、疾患Ａに関わる表現型の程度を比較項目とすればよい。より具体的には、例えば、被験物質が導入された細胞での疾患Ａに関わる表現型の程度が、被験物質が導入されていない細胞での疾患Ａに関わる表現型の程度よりも低い場合、被験物質が疾患Ａの治療剤又は予防剤の有効成分となり得ると評価できる。
前記細胞の比較は、細胞抽出物や切片、細胞から得られた核酸の増幅産物等の細胞調整物に対して行ってもよい。

本実施形態のスクリーニング方法によれば、本実施形態の物質導入方法を用いるので、細胞へのダメージを生じさせ難く、被験物質を高効率に細胞内へと導入でき、細胞本来の機能が反映された高精度な被験物質のスクリーニングが可能となる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（試薬類）
実施例で用いた試薬類を以下に示す。
・リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）：（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ製、型番:ＣＬＰＲＯ３２０）
・ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）：（バイオアカデミア製、型番：０１－５３１）
・ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ １５０：（ＴｄＢ製、型番:ＦＤ１５０）
・Ｄｅｘｔｒａｎ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ， ４０，０００ ＭＷ， Ａｎｉｏｎｉｃ， Ｌｙｓｉｎｅ Ｆｉｘａｂｌｅ:（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、型番:Ｄ１８４５）
・Ｄｅｘｔｒａｎ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ， １０，０００ ＭＷ， Ａｎｉｏｎｉｃ， Ｌｙｓｉｎｅ Ｆｉｘａｂｌｅ （Ｆｌｕｏｒｏ－Ｅｍｅｒａｌｄ） : （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、型番:Ｄ１８２０）
・Ｄｅｘｔｒａｎ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ， ７０，０００ ＭＷ， Ａｎｉｏｎｉｃ， Ｌｙｓｉｎｅ Ｆｉｘａｂｌｅ : （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、型番:Ｄ１８２２）

［実施例１］ＬＬＯを用いた細胞内への分子導入
リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）が細胞に可逆的に穴を開け細胞内へ分子導入可能かどうかを確かめるため、様々な分子量の蛍光標識デキストランの細胞内への導入を検証した。

（１）穿孔工程
まずＨｅＬａ細胞をＰＢＳで洗浄後、ＬＬＯをＤＭＥＭ（－ＦＣＳ）で希釈し、それぞれＬＬＯを１１００倍希釈（０．４５μｇ／ｍＬ）、２２００倍希釈（０．２３μｇ／ｍＬ）、３３００倍希釈（０．１５μｇ／ｍＬ）、４４００倍希釈（０．１１μｇ／ｍＬ）、５５００倍希釈（０．０９１μｇ／ｍＬ）の各濃度で含むＤＭＥＭ（－ＦＣＳ）中で、細胞を氷上で５分培養し、細胞上にＬＬＯを付着させた。氷上で冷したＰＢＳで、上記細胞を３回洗浄したのち、あらかじめ温めておいたＴＢ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｕｆｆｅｒ: ２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ， １．１５ｍＭ ＫＯＡＣ，２５０μＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ ＥＧＴＡ，ｐＨ７．２） を添加し、３７℃で１０分間インキュベーションし、細胞膜に穿孔を形成させた。

（２）導入工程
次いで、ＴＢで上記細胞を一回洗浄したのち、ＡＴＰ再生系（１ｍＭ ＡＴＰ，５０μｇ/ｍＬ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，２．６２ｍｇ／ｍＬ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＧＴＰ（１ｍＭ）、Ｇｌｕｃｏｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）、及び１０ｋＤａ、４０ｋＤａ若しくは７０ｋＤａのフルオレセイン標識デキストラン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄｅｘｔｒａｎ、濃度１００μｇ／ｍＬ）、又は、１５０ｋＤａのＦＩＴＣ標識デキストラン（ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ、濃度１００μｇ／ｍＬ）を上記終濃度となるよう添加し、３７℃で３０分間インキュベーションし、細胞内に導入させた。

（３）再封入工程
次いで、さらに１ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加して３７℃で５分間インキュベーションすることで、細胞膜の再封入（リシール）を誘導した。

（４）蛍光の定量
上記細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭに交換し、３７℃５％ＣＯ_２環境下で１時間培養した。次に、細胞をトリプシンで剥がし、Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより細胞のＦＩＴＣ蛍光を定量した。
結果を図２～５に示す。グラフ中の％は、インタクトの細胞に対して検出された蛍光強度の領域を含まないようゲートを設定し、Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙで検出された細胞のうちゲート内にプロットされた細胞の割合（％）を示している。

図２～５で示すとおり、１／５５００（０．０９１μｇ／ｍＬ）のＬＬＯを含む培地で細胞膜に穴を開けた場合、１０ｋＤａのデキストランは９６％以下の細胞に保持されているのに対し、４０ｋＤａでは６０％以下、７０ｋＤａでは５％以下、１５０ｋＤａでは７％以下と、大きな分子は細胞内に導入されない傾向であった。また、導入される分子の大きさはＬＬＯ濃度に依存し、例えば一番濃い濃度で作用させた１／１１００（０．４５μｇ／ｍＬ）のＬＬＯでは、１０ｋＤａのデキストランは９７％以下、４０ｋＤａでは９０％以下、７０ｋＤａでは５３％以下、１５０ｋＤａでは４２％以下の細胞にデキストランが導入された。
本実施例の使用濃度の条件では約１０ｋＤａまでのデキストランはＬＬＯによって形成される孔を自由に通過可能であり、それ以上の分子量のデキストランの場合は、ＬＬＯの濃度に依存して通過しやすさが変化することがわかった。

［実施例２］ＬＬＯを用いた細胞内への分子導入と、ＳＬＯを用いた細胞内への分子導入との比較
ＬＬＯによるリシール細胞とＳＬＯによるリシール細胞との細胞形態の比較を行った（図６）。

（１）穿孔工程
ＬＬＯ（０．１５μｇ／ｍＬ）又はＳＬＯ（０．１２５μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ（－ＦＣＳ）中で、ＨｅＬａ細胞を氷上で５分間培養し、ＬＬＯ又はＳＬＯを作用させた。上記細胞をＰＢＳで洗浄後、温めておいたプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）を含むＴＢで、３７℃１０分インキュベーションした。ＰＩは細胞膜不透過性の核酸染色剤であり、細胞膜に穴が空いた細胞のみが染色される。

（２）導入工程
そのあとＬ５１７８Ｙ細胞から調整した細胞質（１．５ｍｇ／ｍＬ）存在下（ｃｙｒｏｓｏｌ＋）又は非存在下(ｃｙｒｏｓｏｌ－)で上記ＡＴＰ再生系、ＧＴＰ、グルコース及び１０ｋＤａのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄｅｘｔｒａｎを加え３７℃で３０分間インキュベーションをし、細胞内に導入させた。

（３）再封入工程
１ｍＭ ＣａＣｌ_２を加えて３７℃で５分間インキュベーションし、細胞膜を再度閉じた。

（４）細胞の観察
ＤＭＥＭに交換し、３７℃５％ＣＯ_２環境下で３０分間培養した。培養後、細胞を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。結果を図６に示す。

図６で示すとおり、ＬＬＯで穴を開けたリシール細胞は、細胞質の添加あり、なしにかかわらず、細胞の形が綺麗でインタクトのままであった。それに対して、ＳＬＯで穴を開けたリシール細胞では（特に細胞質なしのときに）、細胞膜からボコボコとした膜の飛び出し（ブレブ）が観察された。ＳＬＯによるリシール細胞で見られるブレブは時間が経つとなくなるものではあるが、ＬＬＯの方が細胞膜のインテグリティーを破壊せずに細胞内に分子導入できることが明らかとなった。

［実施例３］ＬＬＯによる分子導入後の細胞の機能解析１
次に、膜非透過性分子を、ＬＬＯを用いて外来の細胞質の添加なしで細胞内に導入し、その分子の細胞内における機能を検定した。導入に用いたのはｃＡＭＰの膜非透過性アナログである。ｃＡＭＰはＰＫＡを活性化するため、ｃＡＭＰアナログ導入後のＰＫＡによる基質タンパク質のリン酸化について検証を行った。

（１）インタクトＨｅＬａ細胞におけるＰＫＡの基質タンパク質の検出（コントロール）
まず、コントロールとして、インタクトＨｅＬａ細胞におけるＰＫＡの基質タンパク質の検出を行った（図７）。インタクトＨｅＬａ細胞に膜透過性のＰＫＡ阻害剤（Ｈ８９）、又はセリン／スレオニンフォスファターゼ阻害剤でありＰＫＡ基質のリン酸化レベルを上昇させるオカダ酸（ＯＡ）を加え、０分間、３０分間、６０分間、９０分間又は１２０分間培養した。培養後の細胞からライセートを作製し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ ＰＫＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質のバンドを検出した。結果を図７に示す。

図７に示すとおり、Ｈ８９を３０～１２０分間作用させた時に消失し、オカダ酸を作用させた時にはあるバンドを２本、１５０ｋＤａと５０ｋＤａとに見出した。これらのバンドはＰＫＡの活性化又は非活性化に鋭敏に反応する基質タンパク質であると考えられる。このうち、１５０ｋＤａのほうのバンドについて、ＬＬＯによるリシール細胞にｃＡＭＰ膜非透過性アナログを添加した時の、基質タンパク質のリン酸化の指標とすることにした。

（２）ＬＬＯを用いたｃＡＭＰアナログの細胞内導入
ＬＬＯを用いたｃＡＭＰアナログの細胞内導入を以下の方法で行った。

（２－１）穿孔工程
まず、ＨｅＬａ細胞をＬＬＯ（０．１５μｇ／ｍＬ）存在下又は非存在下で、氷上で５分間作用させた。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳで３７℃１０分間インキュベーションした。

（２－２）導入工程
その後、ＡＴＰ再生系、ＧＴＰ、グルコースとともに１ｍＭ ８－ＯＨ－ｃＡＭＰ（膜不透過性活性化剤）、１ｍＭ Ｒｐ－８－ＯＨ－ｃＡＭＰ（膜不透過性阻害剤）存在下又は非存在下で細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。

（２－３）再封入工程
その後、ＣａＣｌ_２によるリシール操作を行った。

（２－４）ＰＫＡの基質タンパク質の検出
さらに３７℃５％ＣＯ_２環境下で１時間培養した。その後、細胞を可溶化しライセートを作製し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ ＰＫＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質のバンドを検出した。結果を図８に示す。

図８に示すとおり、上記１５０ｋＤａのバンドは、インタクトのコントロール実験と同様、ｃＡＭＰ活性型アナログ導入時に若干強く、ｃＡＭＰ非活性型アナログ導入時には顕著に弱く検出された。
このことは、ＬＬＯ処理により導入された膜非透過性ｃＡＭＰアナログが、細胞内でも確かに機能することを意味している。

［実施例４］ＬＬＯによる分子導入後の細胞の機能解析２
次に、再度、膜非透過性分子を、ＬＬＯを用いて外来の細胞質の添加なしで細胞内に導入し、その分子の細胞内における機能を検定した。導入に用いたのはｃＡＭＰの膜非透過性アナログである。ｃＡＭＰはＰＫＡを活性化するため、ｃＡＭＰアナログ導入後のＰＫＡによる基質タンパク質のリン酸化について検証を行った。

（１）インタクトＨｅＬａ細胞におけるＰＫＡの基質タンパク質の検出（コントロール）
まず、コントロールとして、インタクトＨｅＬａ細胞におけるＰＫＡの基質タンパク質の検出を行った（図９Ａ及び図９Ｂ）。インタクトＨｅＬａ細胞に、膜透過性の１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ若しくは２０００μＭのＰＫＡ活性化剤（ｄｂ－ｃＡＭＰ）、又は、０．３μＭ、３μＭ、３０μＭ若しくは６０μＭのＰＫＡ阻害剤（Ｈ８９）を加え、１時間培養した。また、コントロール１として薬剤無添加、コントロール２としてＤＭＳＯ添加のインタクトＨｅＬａ細胞も同様に１時間培養した。培養後の細胞からライセートを作製し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ ＰＫＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質のバンドを検出した。結果を図９Ａに示す。図９Ａにおいて、「ｂａｎｄ－ａ」～「ｂａｎｄ－ｉ」は、ｄｂ－ｃＡＭＰに対して濃度依存的に変化する複数のバンドを示す。また、ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールである。

図９Ａに示すとおり、ｄｂ－ｃＡＭＰに対して濃度依存的に変化するバンドを９本見出した。これらのバンドはＰＫＡの活性化に鋭敏に反応する基質タンパク質であると考えられる。このうち、「ｂａｎｄ－ｅ」について、ＬＬＯによるリシール細胞にｃＡＭＰ膜非透過性アナログを添加した時の、基質タンパク質のリン酸化の指標とすることにした。

また、図９Ｂは、ＧＡＰＤＨの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度を定量したグラフである。
図９Ｂからも、ＧＡＰＤＨの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度がｄｂ－ｃＡＭＰに対して濃度依存的に上昇することが確かめられた。

（２）ＬＬＯを用いたｃＡＭＰアナログの細胞内導入１
ＬＬＯを用いたｃＡＭＰアナログの細胞内導入を以下の方法で行った。

（２－１）穿孔工程
まず、ＨｅＬａ細胞をＬＬＯ（０．１５μｇ／ｍＬ）存在下で、氷上で５分間作用させた。細胞をＴＢで洗浄後、ＴＢで３７℃１０分間インキュベーションした。

（２－２）導入工程
その後、ＡＴＰ再生系、ＧＴＰ、グルコースとともに１ｍＭ ８－ＯＨ－ｃＡＭＰ（膜不透過性活性化剤）又は１ｍＭ ｄｂ－ｃＡＭＰ（膜透過性活性化剤）存在下で細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。

（２－３）再封入工程
その後、ＣａＣｌ_２によるリシール操作を行った。

（２－４）評価工程（ＰＫＡの基質タンパク質の検出）
さらに３７℃５％ＣＯ_２環境下で１時間培養した。その後、細胞を可溶化しライセートを作製し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ ＰＫＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質のバンドを検出した。結果を図１０Ａに示す。β－Ｔｕｂｕｌｉｎは、ローディングコントロールである。

図１０Ａに示すとおり、上記ｂａｎｄ－ｅは、インタクトのコントロール実験と同様、膜不透過性活性化剤であるｃＡＭＰ活性型アナログ導入時に顕著に強く検出された。
一方、上記ｂａｎｄ－ｅは、インタクトのコントロール実験と比較して、膜透過性活性化剤であるｄｂ－ｃＡＭＰ導入時に若干弱く検出された。

また、図１０Ｂは、図１０ＡのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの検出結果から、β－Ｔｕｂｕｌｉｎの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度を定量したグラフである。
図１０Ｂからも、β－Ｔｕｂｕｌｉｎの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度が、膜透過性活性化剤であるｄｂ－ｃＡＭＰ導入時よりも、膜非透過性ｃＡＭＰアナログが導入時に上昇することが確かめられた。

以上のことから、ＬＬＯ処理により、膜透過性活性化剤であるｄｂ－ｃＡＭＰよりも、膜非透過性ｃＡＭＰアナログがより多く細胞内に導入され、機能したことが示唆された。

（３）ＬＬＯを用いたｃＡＭＰアナログの細胞内導入２
ＬＬＯを用いたｃＡＭＰアナログの細胞内導入を以下の方法で行った。

（３－１）穿孔工程
まず、ＨｅＬａ細胞をＬＬＯ（０．１５μｇ／ｍＬ）存在又は非存在（コントロール）下で、氷上で５分間作用させた。細胞をＴＢで洗浄後、ＴＢで３７℃１０分間インキュベーションした。

（３－２）導入工程
その後、ＡＴＰ再生系、ＧＴＰ、グルコースとともに１ｍＭ ８－ＯＨ－ｃＡＭＰ（膜不透過性活性化剤）存在又は非存在下で細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。

（３－３）再封入工程
その後、ＣａＣｌ_２によるリシール操作を行った。

（３－４）評価工程（ＰＫＡの基質タンパク質の検出）
さらに３７℃５％ＣＯ_２環境下で１時間培養した。その後、細胞を可溶化しライセートを作製し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ ＰＫＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＰＫＡによってリン酸化されるタンパク質のバンドを検出した。結果を図１１Ａに示す。β－Ｔｕｂｕｌｉｎは、ローディングコントロールである。

図１１Ａに示すとおり、本実施形態の物質導入方法を用いたＨｅＬａ細胞において、上記ｂａｎｄ－ｅは、インタクトのコントロール実験と同様、顕著に強く検出された。
一方、ＬＬＯ処理を行わなかった場合では、上記ｂａｎｄ－ｅは、インタクトのコントロール実験と比較して、若干弱く検出された。

また、図１１Ｂは、図１１ＡのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの検出結果から、β－Ｔｕｂｕｌｉｎの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度を定量したグラフである。
図１１Ｂからも、β－Ｔｕｂｕｌｉｎの輝度に対するｂａｎｄ－ｅの輝度が、本実施形態の物質導入方法を用いた場合に上昇することが確かめられた。

以上のことから、ＬＬＯ処理により、膜透過性活性化剤であるｄｂ－ｃＡＭＰが細胞内に導入され、機能したことが示唆された。

［実施例５］ＬＬＯによる分子導入後の細胞の機能解析３
次に、異なる膜非透過性分子を、ＬＬＯを用いて外来の細胞質の添加なしで細胞内に導入し、その分子の細胞内における機能を検定した。導入に用いたのはＡｋｔ阻害剤である。Ａｋｔは、ＰＨ（Ｐｌｅｋｓｔｒｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインをＮ末に有するセリン／スレオニンキナーゼである。また、Ａｋｔは細胞死（アポトーシス）を制御する重要な細胞内シグナル伝達因子である。Ａｋｔは、Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３とがリン酸化されることで、活性化する。そのため、Ａｋｔ阻害剤導入後のＡｋｔのリン酸化について検証を行った。

（１）ＬＬＯを用いたＡｋｔ阻害剤の細胞内導入
ＬＬＯを用いたＡｋｔ阻害剤の細胞内導入を以下の方法で行った。なお、各工程の概要図を図１２Ａに示す。図１２Ａにおいて、上の矢印が各工程における操作の概要を示している。また、下の四角は、サンプルごとに加えた試薬の種類及びタイミングを示している。

（１－１）穿孔工程
まず、ＨｅＬａ細胞をＬＬＯ（０．１５μｇ／ｍＬ）存在下で、氷上で５分間作用させた。細胞をＴＢで洗浄後、ＴＢで３７℃１０分間インキュベーションした。

（１－２）導入工程
その後、ＡＴＰ再生系、ＧＴＰ、グルコースとともに、Ａｋｔ阻害剤存在又は非存在下で細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。なお、Ａｋｔ阻害剤として、１ｍＭの配列番号１（ＡＶＤＴＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ）に示すアミノ酸配列からなるペプチド（Ａｋｔ－ｉｎ）、５０μＭの配列番号２（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＶＤＴＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ）に示すアミノ酸配列からなるＴＡＴ標識された前記ペプチド（ＴＡＴ－Ａｋｔ－ｉｎ）、又は、３１．２μＭのトリシリビンを添加した。

（１－３）再封入工程
その後、ＣａＣｌ_２によるリシール操作を行った。

（１－４）評価工程（ＰＫＡの基質タンパク質の検出）
さらに３７℃５％ＣＯ_２環境下で２時間培養した。なお、図１２Ａに示すとおり、ＴＡＴ－Ａｋｔ－ｉｎ及びトリシリビンは、リシール後においても培地に添加して培養した。その後、ＥＧＴを添加し、５分間培養した。その後、細胞を可溶化しライセートを作製し、抗リン酸化Ａｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）抗体及び抗総Ａｋｔ（Ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ）抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりリン酸化Ａｋｔ及び総Ａｋｔを検出した。結果を図１２Ｂに示す。

図１２Ｂに示すとおり、Ａｋｔ阻害剤非存在下で培養した細胞では、ＥＧＴ刺激により、リン酸化Ａｋｔが顕著に強く検出された。
一方、Ａｋｔ阻害剤存在下で培養した細胞では、Ａｋｔ阻害剤非存在下で培養した細胞と比較して、リン酸化Ａｋｔが顕著に弱く検出された。

また、図１２Ｃは、図１２ＢのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの検出結果から、総Ａｋｔ（Ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ）の輝度に対するリン酸化Ａｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）の輝度を定量したグラフである。
図１２Ｃからも、Ａｋｔ阻害剤非存在下で培養した細胞では、ＥＧＴ刺激により、総Ａｋｔ（Ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ）の輝度に対するリン酸化Ａｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）の輝度が顕著に上昇することが確かめられた。また、Ａｋｔ阻害剤存在下で培養した細胞では、Ａｋｔ阻害剤非存在下で培養した細胞と比較して、リ総Ａｋｔ（Ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ）の輝度に対するリン酸化Ａｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）の輝度が顕著に低下することが確かめられた。
また、膜非透過性のＡｋｔ－ｉｎ存在下で培養した細胞と、膜透過性のＴＡＴ－Ａｋｔ－ｉｎ存在下で培養した細胞とでは、総Ａｋｔ（Ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ）の輝度に対するリン酸化Ａｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）の輝度に大きな差は見られなかった。さらに、膜透過性のトリシリビン存在下で培養した細胞では、総Ａｋｔ（Ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ）の輝度に対するリン酸化Ａｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）の輝度が、特に顕著に低下した。

このことから、ＬＬＯ処理により、膜非透過性のＡｋｔ阻害剤（Ａｋｔ－ｉｎ）が、膜透過性のＡｋｔ阻害剤（ＴＡＴ－Ａｋｔ－ｉｎ）と同程度に細胞内に導入され、機能したことが示唆された。

各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

本実施形態の導入剤、キット及び導入方法によれば、細胞へのダメージが生じ難く、高効率に物質を細胞内へと導入できる。
本実施形態のスクリーニング方法によれば、細胞へのダメージを生じさせ難く、被験物質を高効率に細胞内へと導入できるので、細胞本来の機能が反映された高精度な被験物質のスクリーニングが可能となる。

１…毒素、３…物質、Ｃ…細胞、Ｃｐ…細胞、Ｍ１…培地、Ｍ２…培地、Ｍ３…培地、Ｍ４…培地、Ｗ…ウェル

Claims (7)

1. ３０℃以上４０℃以下における膜穿孔活性の至適ｐＨが、０以上６未満の範囲であるコレステロール依存性細胞溶解毒素を含有し、細胞への物質導入に用いられる導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔し、物質を前記細胞に導入する工程１を含み、
   前記コレステロール依存性細胞溶解毒素が、リステリオリシンＯであり、
   導入する前記物質の分子量が、０．１ｋＤａ以上２０ｋＤａ以下であり、
   前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する培地Ｍ１で、０℃以上１０℃以下の温度で前記細胞を培養した後、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を含まない培地Ｍ２に交換し、３０℃以上４０℃以下の温度で前記細胞を培養して前記穿孔を行い、
   前記培地Ｍ１に含まれる前記コレステロール依存性細胞溶解毒素の濃度が０．０９１μｇ／ｍＬ以上０．４５μｇ／ｍＬ以下であり、
   前記穿孔は、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を、ｐＨ７以上１０以下の条件下で前記細胞に作用させて行う、物質導入方法。
2. 更に、前記工程１の後、カルシウムイオンを含む液を、前記孔が形成された細胞に接触させ、前記孔を再封入する工程２を含む請求項１に記載の物質導入方法。
3. 前記工程２において、外来の細胞質を含む液を前記孔が形成された細胞に接触させずに、前記孔を再封入する請求項２に記載の物質導入方法。
4. 導入する前記物質が核酸を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の物質導入方法。
5. 前記導入剤の分子量１ｋＤａ以上１５ｋＤａ以下の前記物質の導入率が、分子量３０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下の前記物質の導入率よりも高い請求項１～４のいずれか一項に記載の物質導入方法。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の物質導入方法において、
   前記細胞に導入する前記物質が被験物質であり、
   ３０℃以上４０℃以下における膜穿孔活性の至適ｐＨが、０以上６未満の範囲であるコレステロール依存性細胞溶解毒素を含有し、細胞への前記被検物質の導入に用いられる導入剤を細胞に接触させて細胞膜を穿孔し、前記被験物質を前記細胞に導入する工程Ａを含み、
   前記コレステロール依存性細胞溶解毒素が、リステリオリシンＯであり、
   導入する前記被検物質の分子量が、０．１ｋＤａ以上２０ｋＤａ以下であり、
   前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を含有する培地Ｍ１で、０℃以上１０℃以下の温度で前記細胞を培養した後、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を含まない培地Ｍ２に交換し、３０℃以上４０℃以下の温度で前記細胞を培養して前記穿孔を行い、
   前記培地Ｍ１に含まれる前記コレステロール依存性細胞溶解毒素の濃度が０．０９１μｇ／ｍＬ以上０．４５μｇ／ｍＬ以下であり、
   前記穿孔は、前記コレステロール依存性細胞溶解毒素を、ｐＨ７以上１０以下の条件下で前記細胞に作用させて行い、
   前記被験物質が前記細胞内で所望の機能を発揮する物質であるかをスクリーニングする、物質のスクリーニング方法。
7. 更に、前記工程Ａの後に、前記被験物質が導入された前記細胞又はその調整物と、被験物質が導入されていない細胞又はその調整物とを比較し、前記被験物質が前記細胞内で所望の機能を発揮する物質であるかを評価する工程Ｂを含む請求項６に記載の物質のスクリーニング方法。

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