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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein zweistufiges in vitro Verfahren
zur Einschleusung von exogenen Antigenen in den MHC Klasse-I-Präsentationsweg
von antigenpräsentierenden
Zellen (APCs), umfassend die Schritte von a) Bereitstellen von geeigneten
antigenpräsentierenden
Zellen, b) Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern
für die
antigenpräsentierenden
Zellen, umfassend 1.) ein in Kontakt bringen der Zellen mit einem
Hämolysin
wie z.B. Listeriolysin (LLO) und einer Marker-Substanz, 2.) Messung des Einstroms
der Marker-Substanz in die Zellen, und 3.) gegebenenfalls, geeignete
Modifizierung der spezifischen Parameter, und c) Einschleusung des
exogenen Antigens in die antigenpräsentierenden Zellen umfassend
die direkte Übertragung
der in Schritt b) ermittelten spezifischen Parameter, umfassend
ein in Kontakt bringen der Zellen mit einem Hämolysin und dem einzuschleusenden
Antigen. Die spezifischen Parameter können ausgewählt werden in Abhängigkeit
von der Zelllinie oder primären
Zelle, in die das Antigen eingeschleust werden soll; der Zellqualität; der eingesetzten
Zellkonzentration; dem Volumen der Ansätze; dem verwendeten Kulturmedium
und/oder Puffer; der An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen
während
der Inkubation; der Serum- und/oder Cholesterinkonzentration; dem
Antigen, das eingeschleust werden soll; dem Labormaterial, das während der
Versuche verwendet wird; der Temperatur während der Inkubation; der Inkubationszeit
der Zelllinie oder der primären
Zellen mit dem Hämolysin;
der Art des Hämolysins;
wie das Hämolysin
aufgereinigt wurde; der Konzentration des verwendeten Hämolysins;
und dem Redoxzustand des Hämolysins
bei der Inkubation.
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Hintergrund
der Erfindung
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Professionell
antigenpräsentierende
Zellen, wie etwa dendritische Zellen (DCs), sind für die Induktion einer
spezifischen zellulären
Immunantwort verantwortlich. Die Stimulierung einer Immunantwort
hängt somit von
der Anwesenheit von Antigenen ab, die durch das Immunsystem des
Wirts als fremd erkannt werden.
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Generell
werden extrazelluläre
Antigene nach ihrer Aufnahme durch antigenpräsentierende Zellen in vesikulären Kompartimenten
degradiert und vorwiegend mit MHC Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche CD4+ T-Helferzellen präsentiert, was zur Aktivierung
CD4+ T-Zellen führt. Endogen gebildete Antigene
werden dagegen in der Regel mit Hilfe des Proteasom-Komplexes gespalten
und von MHC Klasse I-Molekülen
auf der Zelloberfläche
CD8+ T-Zellen präsentiert.
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Um
eine spezifische Immunantwort gegen Viren, intrazelluläre Baktererien
und Tumorzellen hervorzurufen, ist die gezielte Induktion einer
CD8+ zytotoxischen T-Zellantwort notwendig.
Die Entdeckung der Existenz Tumor-assoziierter Antigene hat die
Möglichkeit
eröffnet,
das Immunsystem eines Wirts dazu zu verwenden, das Tumorwachstum
zu beeinflussen. Während
antigenpräsentierende
Zellen sehr effizient Antigene aufnehmen und daraus generierte Peptide
MHC Klasse II-restringiert präsentieren
können,
sind die bislang bekannten Verfahren zur gezielten Einschleusung
von extrazellulären
Antigenen zur Präsentation
mit MHC-Klasse I-Molekülen
aufwendig und schwierig durchzuführen.
Die MHC Klasse I-Präsentation
von Antigen ist Voraussetzung zur Induktion einer CD8+ T-Zellantwort.
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CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) töten Zellen,
die mit intrazellulären
Pathogenen infiziert sind, wie zum Beispiel Viren, Parasiten oder
Bakterien. CTLs erkennen spezifische Peptide, die von MHC Klasse
I-Molekülen
präsentiert
werden. In der Regel assoziieren MHC I-Moleküle exklusiv mit Peptiden, die
von endogen gebildeten Proteinen abgeleitet sind.
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Im
Gegensatz dazu weisen professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs),
wie zum Beispiel dendritische Zellen (DCs), Makrophagen und B-Zellen,
die Fähigkeit
auf, Antigene aus extrazellulären
Quellen für
eine Präsentation
durch MHC I-Moleküle
zu prozessieren. Dieser alternative MHC I-Präsentationsweg, auch als "Kreuzpräsentation" bezeichnet, spielt
möglicherweise
eine wichtige Rolle in der Generation der CTL-Immunität (Rock
K.L. 1996. A new foreign policy: MHC class I molecules monitor the
outside world. Immunology Today 17: 129-137; Jondal M., Schirmbeck
R. and Reimann J. 1996. MHC class I-restricted CTL responses to
exogenous antigens. Immunity 5: 295-302; Yewdell J.W. 1999. Mechanisms
of exogenous antigen presentation by MHC dass I molecules in vitro
and in vivo: Implications for generating CD8+ T
cell responses to infectious agents, tumors, transplants, and vaccines.
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Adv.
in Immunol. 73: 7-77; Ackerman A.L. and Cresswell P. 2004. Cellular
mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. Nat.
Immunol. 5(7): 678-84).
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APCs
nehmen exogene Antigene über
verschiedene Mechanismen, wie zum Beispiel Phagocytose, Makropinocytose,
oder Rezeptor-vermittelte Endozytose auf (Lanzavecchia A. 1996.
Mechanisms of antigen uptake for presentation. Curr. Op. in Immunol.
8: 348-354). Der genutzte Aufnahmemechanismus beeinflusst die Effizienz
der Antigenprozessierung und – Präsentation.
Zur Aktivierung von CTLs mittels der „Kreuzpräsentation" von löslichen Antigenen, welche die
APCs über
Makropinocytose oder Phagocytose aufgenommen haben, sind hohe Antigenkonzentrationen
erforderlich (Watts C. 1997. Capture and processing of exogenous
antigens for presentation on MHC molecules. Ann. Rev. Immunol. 15:
821-850). Die Aggregation von Antigen, die Kopplung mit Beads oder
die Assoziierung mit Hitzeschock-Proteinen hat eine Verstärkung der
MHC I-Präsentation
zur Folge (Kovacsovics-Bankowski
M. and Rock K.L. 1995. A phagosome to cytosol pathway for exogenous
antigens presented on MHC class I molecules. Science 267: 243-246;
Singh-Jasuja H. et al. 2000. Cross-presentation of glycoprotein
96-associated antigens on major histocompatibility complex class
I molecules requires receptor-mediated endocytosis. J. Exp. Med.
191: 1965-1974;
Castellino F. et al. 2000. Receptor-mediated uptake of antigen heat
shock protein complexes results in major histocompatibility class
1 antigen presentation via two distinct processing pathways. J.
Exp. Med. 191: 1957-1964).
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Die
Internalisierung von Antigenen durch spezifische Membranrezeptoren,
wie zum Beispiel Fc- oder Mannoserezeptoren, führt auch zur „Kreuzpräsentation" der Antigene durch
die APCs (Lanzavecchia A. 1996. Mechanisms of antigen uptake for
presentation. Curr. Op. in Immunol. 8: 348-354; Regnault A. et al.
1999. Fcg receptor-mediated induction of dendritic cell maturation
and major histocompatibility complex class I-restricted antigen
presentation after immune complex internalisation. J. Exp. Med.
189: 371-380). Die Prozessierung und MHC I-Präsentation von internalisierten
Antigenen kann über
den klassischen zytosolischen Proteasom- und TAP-abhängigen MHC
I-Präsentationsweg
erfolgen, wenn Antigene aus endozytotischen Vesikeln (Endosom oder
Phagosom) ins Zytosol gelangen. Alternativ können internalisierte Antigene
beim nichtzytosolischen Weg in den endozytotischen Vesikeln mit
Hilfe von pH-Wert-adaptierten Proteinasen zu Peptiden zerlegt werden, die
an MHC I-Moleküle binden
und als Komplex zur Zelloberfläche
transportiert werden. Bei den MHC I-Molekülen kann es sich um internalisierte
von der Plasmamembran stammende oder um neu synthetisierte Komplexe
handeln (Rock K.L. 1996. A new foreign policy: MHC class I molecules
monitor the outside world. Immunology Today 17: 131; Castellino
F. et al. 2000. Receptor-mediated uptake of antigen heat shock protein
complexes results in major histocompatibility class 1 antigen presentation
via two distinct processing pathways. J. Exp. Med. 191: 1957-1964;
Rodriguez A., Regnault A., Kleijmeer M, Ricciardi-Castagnoli P.
and Amigorena S. 1999. Selective transport of internalized antigens
to the cytosol for MHC class I presentation in dendritic cells. Nature
Cell Biol. 1: 362-368, Gromme M. et al. 1999. Recycling MHC class
I molecules and endosomal peptide loading. Proc. Nat. Acad. Sci.
(USA) 96: 10326-10331).
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DCs
sind die einzigen APCs, die naive CD8+ T-Lymphozyten
stimulieren und eine CTL-Antwort
initiieren können
(Banchereau J. and Steinman R.M.. 1998. Dendritic cells and the
control of immunity. Nature 392: 245-252). Unreife DCs, die sich
in peripheren Geweben befinden, nehmen exogene Antigene aus verschiedenen
Quellen, einschließlich
Mikroben und infizierten Zellen, Zelldebris, Proteinen und Immunkomplexen
auf. Antigen-beladene DCs migrieren in Richtung der sekundären lymphoiden
Organe, prozessieren die Antigene für ihre Präsentation und erwerben während dieser
Migration die Fähigkeit,
ruhende CD8+ T-Zellen anzulocken und zu
aktivieren.
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Die
MHC I-Präsentation
von exogenen Antigenen durch DCs ist somit Voraussetzung für die Stimulation
einer CTL-Antwort gegen Tumore, intrazelluläre Bakterien oder Antigen von
Viren, die APCs nicht infizieren. In vivo, wurde die Rolle der „Kreuzpräsentation" in einem murinen
Modell der Poliovirusinfektion untersucht. Die Induktion der CTL-Immunität gegen
dieses Virus, das nicht in APCs repliziert, erfordert die MHC I-Präsentation
von extrazellulären
viralen Antigenen (Yewdell J.W. 1999. Mechanisms of exogenous antigen presentation
by MHC class I molecules in vitro and in vivo: Implications for
generating CD8+ T cell responses to infectious
agents, tumors, transplants, and vaccines. Adv. in Immunol. 73:
7-77; Albert M.L., Sauter B., and Bhardwaj N. 1998. Dendritic cells
aquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted
CTLs. Nature 392: 86-89; Sigal L.J., Crotty S., Andino R. and Rock.
K.L. 1999. Cytotoxic T cell immunity to virus-infected nonhematopoietic
cells requires presentation of exogenous antigen. Nature 398: 77-80;
Yewdell J.W., Bennink J.R. and Hosaka Y. 1988. Cells process exogenous
proteins for recognition by cytotoxic T lymphocytes. Science 239:
637-640; Reimann J. and Schirmbeck R. 1999.
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Alternative
pathways for processing exogenous and endogenous antigens that can
generate peptides for MHC class I-restricted presentation. Immunol.
Rev. 172: 131-152).
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Verschiedene
Mechanismen der Aktivierung sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunität werden
im Augenblick für
die Tumor-Immuntherapie untersucht. Elemente der zellulären Immunität sind in
der Lage, spezifisch Tumorzellen zu erkennen und zu zerstören. Die
Isolierung von CTLs aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder
aus peripherem Blut ließ vermuten,
daß solche
Zellen eine wichtige Rolle bei der natürlichen Immunabwehr von Krebs
spielen (Cheever et al. 1993. Annals N.Y. Acad. Sci. 690: 101-112).
Es gibt bereits viele Beispiele von sowohl murinen als auch humanen
CTLs, die spezifisch Tumorzellen erkennen und eine therapeutische
Aktivität
nach adoptivem Transfer aufweisen, wobei in einigen Fällen eine
vollständige
Remission induziert wird. Jedoch ist wegen des progressiven Wachstums
der meisten Krebsarten offensichtlich, daß trotz des Potentials von
CD8+ T-Zellen Tumorzellen zu zerstören, viele
dieser Tumore der Erkennung durch CTLs in vivo entkommen. Die Induktion
einer ausreichenden Anzahl von CD8+ T-Zellen
in vivo war bis jetzt schwierig (Burns D.M. and Crawford D.H. 2004.
Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T-lymphocytes for adoptive
immunotherapy of post-transplant lymphoproliferative disease Blood
Rev. 18(3): 193-209; Kawai K., Saijo K., Oikawa T., Morishita Y.,
Noguchi M., Ohno T. and Akaza H. 2003. Clinical course and immune
response of a renal cell carcinoma patient to adoptive transfer
of autologous cytotoxic T lymphocytes. Clin. Exp. Immunol. 134(2):
264-9; Bathe O.F., Dalyot-Herman N. and Malek T.R. 2003. Therapeutic
limitations in tumorspecific CD8+ memory
T cell engraftment. BMC Cancer 3(1): 21).
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Die
meisten Verfahren zur Einschleusung von Proteinen in das Zytosol
unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit
der Zelle sind aufwendig und schwierig durchzuführen, allgemein durchgesetzt
hat sich bisher keines. Für
die Anwendung außerhalb
der Forschung in einer klinischen Umgebung ist bisher gar kein Verfahren
bekannt:
Die Mikroinjektion ist möglich, jedoch technisch anspruchsvoll
und auf geringe Zellzahlen beschränkt (Schneider G.B., Gilmore
A.P., Lohse D.L., Romer L.H., Burridge K. 1998. Microinjection of
protein tyrosine phosphatases into fibroblasts disrupts focal adhesions
and stress fibers. Cell Adhes. Commun.. 5(3): 207-219; Gorbsky G.J.,
Chen R.-H. and Murray A.W. 1998. Microinjection of Antibody to Mad2
Protein into Mammalian Cells in Mitosis Induces Premature Anaphase
J. Cell Biol. 141: 1193-1205). Die Elektroinjektion erscheint vielversprechend,
kann aber bei adhärenten
Zellen nicht angewendet werden (Wilson A.K., Horwitz J. and De Lanerolle P.
1991. Evaluation of the electroinjection method for introducing
proteins into living cells. Am. J. Physiol. 260: C355-63).
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Weitere
Verfahren zur Einschleusung von extrazellulären Makromolekülen ins
Zytosol und in den MHC Klasse I-Präsentationsweg von Zellen wurden
beschrieben. Alle erfordern beträchtliche
methodologische Expertise und kein einziges Verfahren hat verbreitete
Anwendung gefunden (Bungener L., Huckriede A., Wilschut J. and Daemen
T. 2002. Delivery of Protein Antigens to the Immune System by Fusion-active
Virosomes: A Comparison with Liposomes and ISCOMS. Bioscience Reports
22: 323-338). Das "Trojanische" Peptid-Penetrationssystem
ist auf die Zufuhr von Oligopeptiden beschränkt (Derossi D., Chassaing
G. and Prochiantz A. 1998. Trojan peptides: the penetratin system
for intracellular delivery Trends Cell Biol. 8(2): 84-7). Die virale Hämagglutinin-vermittelte
Fusionstechnik funktioniert gut, ist jedoch schwierig durchzuführen (Doxsey
S.J., Sambrook J., Helenius A. and White J. 1985. An efficient method
for introducing macromolecules into living cells. J. Cell Biol.
101(1): 19-27).
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Virus-ähnliche
Partikel (Virus-Like Particles, VLPs) stellen eine weitere Möglichkeit
dar, in vivo oder in vitro antigene Epitope in den MHC I-Präsentationsweg
einzuschleusen. Bei DCs gelangen nach Internalisierung der VLPs
die enthaltenen Antigene vom Endosom ins Zytosol und werden mit
MHC Klasse I-Molekülen präsentiert.
Die DCs sind dadurch in der Lage CD8+ T-Zellen
zu aktivieren. Ein Nachteil der Methode ist die aufwendige Herstellung
und Reinigung der VLPs (Moron V.G., Rueda P., Sedlik C. and Leclerc
C. 2003. In vivo Dendritic Cells can cross-present Virus-like Particles
using an Endosome-to-Cytosol Pathway. J. Immunol. 171: 2242-2250;
Storni T., Lechner F., Erdmann I., Bächi T., Jegerlehner A., Dumrese
T., Kündig
T.M., Ruedl C. and Bachmann M.F. 2002. Critical Role for Activation
of Antigen-presenting cells in Priming of Cytotoxic T Cell Response
After Vaccination with Virus-Like Particles. J. Immunol. 168: 2880-2886).
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WO
02/072140 beschreibt eine immunogene Zusammensetzung, die in der
Lage ist, in vitro oder in vivo durch MHC I-Präsentation von exogenen Antigenen,
eine CTL-Antwort gegen eine virale Erkrankung zu induzieren, ohne
daß eine
virale Replikation erforderlich ist. Die Zusammensetzung enthält z.B.
ein Virus, das die Fähigkeit
besitzt, mit Zellen zu fusionieren, dessen infektiöse Eigenschaften
jedoch inaktiviert oder attenuiert sind.
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Ähnlich wie
VLPs sind auch PLGA-(Poly(lactic-co-glycolic acid))-Partikel in
der Lage, enkapsulierte Peptide oder Proteine in den MHC I-Präsentationsweg
einzuschleusen. Wie bei den VLPs ist auch hier die Herstellung der
Partikel aufwendig (Waeckerle-Men Y. and Groettrup M. 2005. PLGA
microspheres for improved antigen delivery to dendritic cells as
cellular vaccines. Adv. Drug Deliv. Rev. 57(3): 475-82; Zheng C.H.,
Gao J.Q., Zhang Y.P. and Liang W.Q. 2004. A protein delivery system:
biodegradable alginate-chitosan-poly(lactic-co-glycolic acid) composite microspheres.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 323(4): 1321-7).
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Kationische
Lipide, die als Komplex mit Protein an negativ geladenen Zelloberflächen binden,
werden in zunehmendem Umfang angeboten, um Proteine ins Zytosol
von Zellen einzuschleusen. Die Methode hat den Vorteil, dass nur
geringe Mengen an Protein benötigt
werden. Bei positiv geladenen Molekülen treten mitunter aufgrund
mangelnder Interaktion mit den kationischen Lipiden Probleme auf
(Simberg D., Weisman S., Talmon Y. and Barenholz Y. 2004. DOTAP
(and other cationic lipids): chemistry, biophysics, and transfection. Crit.
Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 21(4): 257-317; Zelphati O., Wang
Y., Kitada S., Reed J.C., Felgner P.L. and Corbeil J. 2001. Intracellular
delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.
J. Biol. Chem. 276: 35103-110).
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US 5,643,599 beschreibt
ein Verfahren, um mit Hilfe von Liposomen extrazelluläre Antigene
ins Zytosol von Zielzellen einzubringen. Die Liposomen enthalten
neben dem einzuschleusenden Antigen eine Substanz (z.B. ein Hämolysin),
die nach Aufnahme der Liposomen durch Phagozytose und Freisetzung
ihres Inhalts im Phagosom, die phagosomale Membran permeabilisieren
kann und so dem extrazellulären
Antigen den Zugang zum Zytosol ermöglicht. Dieses Verfahren erlaubt
die Einschleusung von exogenem Antigen in Zellen, die die Fähigkeit
besitzen, Liposomen zu internalisieren. Im Gegensatz dazu erfolgt
beim vorliegenden Verfahren die Behandlung mit Hämolysin in löslicher
Form und kann auch bei nicht-phagozytierenden Zellen zur Einschleusung
von Antigen in den MHC I – Präsentationsweg
eingesetzt werden.
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WO
01/87325 beschreibt Verfahren zur Steigerung der MHC Klasse I-Präsentation
von löslichen
Tumor- oder Gewebeantigenen durch humane dendritische Zellen (DCs).
DCs von humanen Spendern werden bevor sie Tumorpatienten verabreicht
werden, mit löslichem Antigen
in Kombination mit Bacillus Calmette Guérin (BCG) inkubiert. Die
Anwesenheit von BCG bei der Inkubation von DCs mit löslichem
exogenem Antigen führt
zu einer gesteigerten Prozessierung und Präsentation antigener Epitope
mit MHC I-Molekülen
im Vergleich zur Inkubation mit Antigen allein. In vivo wird nach
Verabreichung von DCs, die mit Antigen und dem Adjuvans BCG vorbehandelt
wurden, eine größere Anzahl
antigenspezifischer CTLs aktiviert als nach Gabe von DCs, die nur
mit Antigen vorinkubiert wurden.
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Die
orale oder parenterale Immunisierung mit rekombinanten Listerien
oder Salmonellen, die Tumor-assoziierte Antigene exprimieren, hat
in verschiedenen murinen Modellen die Protektion vor oder die Regression
von Tumoren durch Induktion Tumorartigen-spezifischer CTLs zur Folge
(Cochlovius B., Stassar M.J., Schreurs M.W., Benner A. and Adema
G.J. 2002. Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by
dendritic cells elicits protective immunity. Immunol. Lett. 80(2):
89-96; Weth R., Christ O., Stevanovic S. and Zoller M. 2001. Gene
delivery by attenuated Salmonella typhimurium: comparing the efficacy
of helper versus cytotoxic T cell priming in tumor vaccination.
Cancer Gene Ther. 8(8): 599-611;
Paterson Y. and Johnson R.S. 2004. Progress towards the use of Listeria
monocytogenes as a live bacterial vaccine vector for the delivery
of HIV antigens. Expert Rev. Vaccines 3(4Sup1.): 119-134; Sewell
D.A., Douven D., Pan Z.K. Rodriguez A. and Paterson Y. 2004. Regression
of HPV-positive tumors treated with a new Listeria monocytogenes
vaccine. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130(1): 92-7; Lin C.W.,
Lee J.Y., Tsao Y.P., Shen C.P., Lai H.C. and Chen S.L. 2002. Oral
vaccination with recombinant Listeria monocytogenes expressing human
papillomavirus type 16 E7 can cause tumor growth in mice to regress.
Int. J. Cancer 102(6): 629-637).
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US 6,565,852 beschreibt
ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Tumor-assoziierte Antigene
durch Verabreichung einer rekombinanten Form von Listeria monocytogenes,
die ein Tumor-assoziiertes Antigen oder ein Fragment davon exprimiert.
Das Tumor-assoziierte Antigen kann von den rekombinanten Listerien
allein oder als Listeriolysin-Fusionsprotein exprimiert werden.
US 5,830,702 beschreibt
lebende rekombinante Listeria monocytogenes und die Induktion einer
zytotoxischen T-Zellantwort mittels eines attenuierten Stammes von
Listeria spp., der ein bestimmtes fremdes Antigen exprimiert. Weiterhin
werden Verfahren zur Induktion einer protektiven Immunität durch
Verabreichen einer effektiven Menge des Vakzins zur Verfügung gestellt.
US 6,051,237 beschreibt
die spezifische Tumor-Immuntherapie unter der Verwendung eines lebenden rekombinanten
bakteriellen Vakzinvektors in Form von rekombinanten Listeria monocytogenes,
die Tumor-spezifische Antigene exprimieren.
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Der
Einsatz gentechnisch veränderter
lebender potentiell humanpathogener Vektoren zur Humantherapie wird
kontrovers diskutiert. Ein besonderes Risiko besteht für Personen,
deren Immunfunktionen z.B. durch Infektion mit HIV oder Tumorerkrankungen
supprimiert ist (Redfield R.R., Wright D.C., James W.D., Jones T.S.,
Brown C. and Burke D.S. 1987. Disseminated vaccinia in a military
recruit with human immunodeficiency virus (HIV) disease. N. Engl.
J. Med. 316: 673-676; Kavanaugh D.Y. and Carbone D.P. 1996. Immunologic
dysfunction in cancer. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 10: 927-951).
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Radford
et al. (Radford K.J., Higgins D.E., Pasquini S., Cheadle E..J.,
Carta L., Jackson A.M., Lemoine N.R., Vassaux G. A recombinant E.
coli vaccine to promote MHC class I-dependent antigen presentation:
application to cancer immunotherapy. Gene Ther. 2002: 9(21): 1455-63;
Radford K.J., Jackson A.M., Wang J.H., Vassaux G., Lemoine N.R.
Recombinant E. coli efficiently delivers antigen and maturation
signals to human dendritic cells: presentation of MART1 to CD8+ T cells. Int. J. Cancer. 2003: 105(6):
811-9) beschreiben sowohl in einem murinen Modellsystem (2002) als
auch in einem humanen Modellsystem (2003) die Induktion bzw. Aktivierung
antigenspezifischer CTLs durch Infektion von DCs mit rekombinanten
E. coli, die neben einem Modellantigen LLO exprimieren. Innerhalb
des murinen Modellsystems führte
die Injektion von DCs, die zuvor mit LLO und OVA-exprimierenden
E. coli gepulst wurden, zur Aktivierung naiver OVA-spezifischer
CTLs, die in der Lage waren, das Wachstum eines OVA-exprimierenden
Tumors zu unterdrücken.
Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden bei humanen DCs E. coli
eingesetzt, die das Melanom-Antigen MART-1 zusammen mit LLO exprimieren.
Humane DCs zeigten nach Inkubation mit Paraformaldehyd-fixierten
MART-1/LLO-exprimierenden E. coli eine phänotypische und funktionelle
Ausreifung. Nach der oben beschriebenen Vorbehandlung waren die
DCs fähig,
MART-1-spezifische CTLs zu aktivieren, was auf die Präsentation
des MHC I-restringierten Peptides MART-1 27-35 schließen lässt. Radford
et al. diskutieren das Potential dieses Systems als eine neue Strategie
für die
humane Tumor-Immuntherapie. Das System umfaßt rekombinante Antigen-exprimierende
E. coli, und erfordert die Klonierung des zu präsentierenden Antigens. Diese
Methode zur Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC Klasse
I-Präsentationsweg
kann ausschließlich
bei Zellen angewandt werden, die in der Lage sind, lebende oder
fixierte E. coli zu internalisieren. Im Gegensatz dazu erfolgt beim vorliegenden
Verfahren die Behandlung mit LLO in löslicher Form und kann auch
bei nicht-phagozytierenden
Zellen zur Einschleusung von Antigen in den MHC I – Präsentationsweg
eingesetzt werden.
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Trotz
der oben diskutierten Ansätze
gibt es bislang kein einfaches, reproduzierbares Verfahren, um exogene
Antigene effektiv und schnell reproduzierbar in den MHC Klasse I-Prozessierungsweg
verschiedener Zellen einzuschleusen.
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Es
ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur effektiven und reproduzierbaren Einschleusung von exogenen Antigenen
in den MHC Klasse I-Präsentationsweg
von Zellen mit dem Ziel der Induktion oder Aktivierung von antigenspezifischen
CD8+ T-Zellen zur Verfügung zu stellen.
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Die
vorliegende Erfindung löst
in ihrem ersten Aspekt diese Aufgabe durch ein einfaches und generell anwendbares
zweistufiges in vitro Verfahren für die Einschleusung von Antigenen
mittels reversibler Permeabilisierung von potentiell antigenpräsentierenden
Zellen durch Cholesterol-bindende Hämolysine allgemein wie z.B.
Listeriolysin (LLO; Palmer M. 2001. The family of thiol-activated,
cholesterol-binding cytolysins. Toxicon 39(11): 1681-9; Alouf J.E.
2000. Cholesterol-binding cytolytic protein toxins. Int. J. Med.
Microbiol. 290(4-5): 351-6).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe Hämolysin
und LLO austauschbar verwendet. Das erfindungsgemäße in vitro
Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg
von Zellen, umfaßt
die Schritte von a) Bereitstellen von geeigneten antigenpräsentierenden
Zellen, b) Ermittlung von geeigneten spezifischen Verfahrensparametern
für die
antigenpräsentierenden Zellen,
umfassend 1.) ein in Kontakt bringen der Zellen mit einem Hämolysin
wie z.B. Listeriolysin (LLO) und einer Marker-Substanz, 2.) Messung
des Einstroms der Marker-Substanz in die Zellen während und/oder
nach Einwirkung von LLO, und 3.) gegebenenfalls, geeignete Modifizierung
der oben genannten spezifischen Parameter, und c) Einschleusung
von Antigenen in den MHC I – Präsentationsweg
von Zellen umfassend die Übertragung
der in Schritt b) ermittelten spezifischen Parameter, umfassend
ein in Kontakt bringen der Zellen mit LLO und dem einzuschleusenden
Antigen (der Kontakt mit Antigen erfolgt während oder nach der Inkubation mit
LLO).
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Die
vorliegende Erfindung verwendet grundsätzlich Hämolysine zur Einschleusung
von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg
von Zellen. Während
die vorliegende Erfindung am nicht-limitierend vorgesehenen Beispiel
LLO beschrieben wird, können
auch andere Hämolysine
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen verwendet
werden, wie z. B. die in der relevanten Literatur (z. B. Provoda C.J.,
Lee K.D. 2000. Bacterial pore-forming hemolysins and their use in
the cytosolic delivery of macromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev.
41(2): 209-21. Welch R.A. 1991. Pore-forming cytolysins of gram-negative
bacteria. Mol. Microbiol. 5(3): 521-8 oder Braun V., Focareta T.
1991. Pore-forming bacterial protein hemolysins (cytolysins). Crit.
Rev. Microbiol. 18(2): 115-58) beschriebenen Hämolysine. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung werden die Begriffe Hämolysin
und LLO somit austauschbar verwendet.
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Bevorzugte
Hämolysine
sind das Streptolysin O aus Streptococcus pyogenes, S. equisimilis
oder S. canis, Pneumolysin aus S. pneumoniae, Suilysin aus S. suis,
Intermedilysin aus S. intermedius, sowie Listeriolysin aus Listeria
monocytogenes, Ivanolysin aus L. ivanovii, Seeligerolysin aus L.
seeligeri, sowie andere Hämolysine
der Gruppe der Thiol-aktivierten Hämolysine (z.B. Alouf J.E. 2000.
Cholesterol-binding cytolytic protein toxins. Int. J. Med. Microbiol.
290: 351-6)
-
Das
vorliegende Verfahren besteht somit allgemein aus den folgenden
Elementen zur Anpassung der Wirkung von LLO unter definierten Bedingungen
(Konstanthaltung aller Parameter außer LLO-Konzentration und Inkubationsdauer):
Austesten der individuellen Rahmenbedingungen (Konzentration und
Inkubationszeit) für
den LLO-Einsatz mit Hilfe einer Marker-Substanz (z.B. PI), die einfach
und direkt beobachtet werden kann. Dabei wird die Marker-Substanz
während
oder nach der Einwirkung von LLO zugegeben und der Einstrom der Substanz
in die Zelle beobachtet. Fließt
zuviel Marker-Substanz in die Zelle ein, so ist die LLO-Menge zu
verringern oder die Inkubationszeit zu verkürzen, fließt zuwenig LLO ein, so muß die LLO-Konzentration
oder die Inkubationszeit erhöht
werden. Diese Testungen können
in Versuchen durchgeführt
werden, die ca. 15-45 min benötigen.
Sind dann die Rahmenbedingungen identifiziert, werden diese auf
die Einschleusung von Antigen übertragen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
das vorliegende Verfahren zuerst die Messung des Propidiumjodid
(PI)-Einstroms während
oder nach der Einwirkung von Listeriolysin (LLO) unter definierten
Bedingungen in die potentiell antigenpräsentierenden Zellen. Die optimale
LLO-Konzentration bzw. Inkubationsdauer ist in der Regel die zu Beginn
des PI-Einstromes (bei beginnendem Einstrom von PI, bei nachweisbarem Einstrom
von PI, abhängig
von der Sensitivität
der Zellen). Es hat sich in Versuchen zudem gezeigt, dass der Antigen
Einstrom zeitlich etwas vor dem Einstrom des PI (Surrogat) liegen
kann. So ermittelte Parameter werden dann auf die LLO-Behandlung
zur Einschleusung von Antigen übertragen.
Dieses Vorgehen führt
zur Reproduzierbarkeit des Verfahrens, was die schnelle zuverlässige Anwendung,
insbesondere im klinischen Kontext, überhaupt erst ermöglicht.
So kann durch die strikte Übertragung
der Rahmenbedingungen des Vorversuchs durch LLO-Inkubation von PBMCs eine Steigerung
der nachweisbaren antigenspezifischen CD8+ T-Zellen um mehr als
100% erreicht werden (Beispiel 5).
-
Ein
Beispiel für
ein Poren-bildendes Protein ist Streptolysin O (SLO), Prototyp der
Cholesterin-bindenden Familie der bakteriellen Exotoxine. Streptolysin
bildet Poren in der Plasmamembran von Säugerzellen. Die dreidimensionale
Struktur von Perfringolysin, einem weiteren Mitglied dieser Familie,
wurde ermittelt und die molekularen Mechanismen, die zur Porenbildung
durch SLO fuhren, sind teilweise verstanden (Sekiya K., Danbara
H., Yase K. and Futaesaku Y. 1996. Electron microscopic evaluation
of a two-step theory of pore formation by streptolysin 0. J. Bacteriol.
178(23): 6998-7002; Heuck A.P., Tweten R. K. and Johnson A.E. 2003. Assembly
and topography of the prepore complex in cholesteroldependent cytolysins.
J. Biol. Chem. 278(33): 31218-225). Nach der Bindung an die Membranen,
diffundieren Hämolysin-Monomere
lateral in die Bilayer und oligomerisieren, um Homotyp-Aggregate
zu bilden, die sehr große
Transmembranporen darstellen, deren Durchmesser 35 nm erreichen
kann. Mit den herkömmlich
verwendeten Protokollen ist der SLO-Angriff im allgemeinen letal
für die
Zielzelle, so daß die
Möglichkeiten
der Durchführung
von zellbiologischen Untersuchungen nach Permeabilisierung begrenzt
waren. Trotzdem wird das Toxin zur Untersuchung von zellulären Prozessen
in kurzen Zeitabschnitten verwendet.
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Walev
et al. (Walev I., Bhakdi S.C., Hofmann F., Djonder N., Valeva A.,
Aktories K., Bhakdi S. 2001. Delivery of proteins into living cells
by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98(6): 3185-90) beschreiben das Poren-bildende
Toxin Streptolysin O (SLO), das dazu verwendet werden kann, reversibel
adhärente
und nicht-adhärente
Zellen zu permeabilisieren, was einen Eintritt von Molekülen mit
bis zu 100 kDa Masse ins Zytosol ermöglichen soll. Unter Verwendung
von FITC-markiertem Albumin wurde geschätzt, daß 105-106 Moleküle
pro Zelle aufgenommen werden. Es wird weiter beschrieben, daß die Reparatur
von Toxinläsionen
von Ca(2+)-Calmodulin und intakten Mikrotubuli
abhängig
ist. Die aktiven Domänen
von großen
clostridialen Toxinen wurden in drei verschiedene Zelllinien eingeführt. Es
wird über die
breite Anwendbarkeit allgemein diskutiert, eine Antigen-Einschleusung
mit anschließender
MHC Klasse I- Präsentation
wird nicht erwähnt.
-
Darji
et al. (Darji A., Chakraborty T., Wehland J. and Weiss S. 1995.
Listeriolysin generates a mute for the presentation of exogenous
antigens by major histocompatibility complex class I. Eur. J. Immunol.
25(10): 2967-71) beschreiben Untersuchungen über die Poren-bildende Aktivität von Listeriolysin,
dem Hämolysin
von Listeria monocytogenes, um CD8+ T-Zellen
mit löslichen
Proteinen in vivo und in vitro zu stimulieren. Die Immunisierung
mit löslichem
hämolytisch
aktivem Listeriolysin induziert sowohl CD8+ als
auch CD4+ LLO-spezifische T-Zellen. Hitzeinaktiviertes
LLO induziert nur CD4+ LLO-spezifische T-Zellen.
Hämolytisch
aktives LLO bewirkt also seine eigene Einschleusung in den MHC Klasse
I-Präsentationsweg.
Darüber
hinaus werden Modellantigene, wie z.B. Ovalbumin, gemischt mit Listeriolysin,
auch in den MHC Klasse I-Weg in vitro und in vivo eingeschleust.
-
Ähnlich beschreiben
Darji et al. (Darji A., Chakraborty T., Wehland J. and Weiss S.
1997. TAP-dependent major histocompatibility complex class I presentation
of soluble proteins using listeriolysin. Eur. J. Immunol. 27(6):
1353-9) die Immunisierung von Mäusen
mit Listeriolysin und Antigen wie z.B. lösliches Ovalbumin, Nukleoprotein
von Influenzavirus oder beta-Galaktosidase von Escherichia coli.
Dies führe
an vivo zur Induktion einer zytotoxischen CD8+ T-Zellantwort
gegen definierte MHC I-restringierte Peptidepitope dieser Proteine.
Die Inkubation etablierter Zelllinien mit LLO und den verschiedenen
Antigenen führte
zur Einschleusung der Antigene in den MHC I-Präsentationsweg. Die Präsentation
MHC I-restringierter Peptide aus den Antigenen wurde durch Proliferation
antigenspezifischer T-Zell-Klone nachgewiesen. Die LLO-vermittelte
Einschleusung in den MHC I – Präsentationsweg
war abhängig
von einem funktionellen TAP-Transporter und konnte durch Brefeldin
A inhibiert werden. Beide Kriterien deuten darauf hin, dass LLO
exogenen Antigenen den Zugang zum Zytosol und zum klassischen MHC
I-Präsentationsweg
erlaubt. Die Behandlung der Zielzellen mit Listeriolysin wird als
unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen nicht die Zell-Lebensfähigkeit
beeinflussend beschrieben. Die durch die Listeriolysin Behandlung
erzeugten Poren werden innerhalb von 60 min repariert. Die Einschleusung
von löslichen
Proteinen in den MHC Klasse I Präsentationsweg
durch Listeriolysin stellt ein System zur Verfügung, um die zytotoxische Antwort
gegen intrazelluläre
Pathogene zu untersuchen, und würde
ein schnelles Screening von potentiellen Antigenen in Vakzin-Formulierungen
ermöglichen.
-
Darji
et al. beschreiben die Einschleusung mittels LLO in vitro nur in
EL-4- und P815-Zellen (murine Zelllinien), sowie in einem Tiermodell.
Bei murinen Milzzellen (primäre
Zellen) wird die in vitro Anwendung lediglich hinsichtlich der Untersuchung
des Einflusses von LLO auf die MHC II-Präsentation beschrieben. Die Anwendung
von LLO bei sensiblen primären
Zellen wie humanen PBMCs wurde von Darji et al. nicht durchgeführt.
-
Bei
dem Versuch der Erfinder, das Verfahren, wie es von Darji et al.
beschrieben wurde, anzuwenden, ließ sich das Verfahren nicht
ohne extrem hohen Aufwand nachvollziehen und gelang nur in wenigen
Ausnahmefällen.
So haben die vorliegenden Erfinder (mit der fachlichen Unterstützung von
Dr. Darji) mehr als zwei Jahre benötigt, um die Ergebnisse der
Publikation mit EL-4-Zellen und OVA in Teilen zu reproduzieren.
Als Gründe
dafür konnten
durch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten aufwendigen
Versuche folgendes ermittelt werden: Um Antigene mit Hilfe von LLO
in eukaryontische Zellen einzuschleusen, ist es erforderlich, so
viel LLO einzusetzen, daß dieses
beinahe toxisch wirkt. Wird zuviel LLO eingesetzt, sterben die behandelten
Zellen ab und können
das eingeschleuste Antigen nicht mehr prozessieren. Falls zu wenig LLO
verwendet wird, wird kein oder nicht ausreichend Antigen ins Zytosol
eingeschleust und mit MHC Klasse I-Molekülen präsentiert. Folgt man den Angaben
aus Darji et al. gelingt es nur in wenigen Ausnahmefällen exogenes
Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg
einzuschleusen (Beispiel 3). Dies hängt damit zusammen, dass neben
LLO-Konzentration und Inkubationsdauer eine Vielzahl anderer Faktoren
die Wirkung von LLO auf die Zielzellen beeinflusst.
-
Die
Versuche der Erfinder haben zudem gezeigt, daß die folgenden Parameter die
Versuche beeinflussen:
- – die Zelllinie oder Primärzelle,
in die das Antigen eingeschleust werden soll;
- – die
Qualität
der eingesetzten Zellen
- – die
eingesetzte Zellkonzentration;
- – das
Volumen der Ansätze;
- – das
verwendete Kulturmedium und/oder Puffer;
- – der
pH-Wert des Mediums oder Puffers
- – die
An- oder Abwesenheit von Serum-Bestandteilen;
- – die
Serum- und/oder Cholesterinkonzentration;
- – die
Beschaffenheit und Reinheit des Antigens, das eingeschleust werden
soll;
- – die
Labormaterialien, die während
der Versuche verwendet werden;
- – die
Reaktionstemperatur;
- – die
Art des LLO;
- – wie
das LLO aufgereinigt wurde; und
- – der
Redoxzustand des LLO.
-
Die
aufgelisteten Parameter sind nicht vollständig und beeinflussen die wirksame
LLO-Konzentration und
Inkubationsdauer während
und z.T. auch nach der Inkubation von Zellen mit LLO. Wird das oben
diskutierte Verfahren nach Darji et al. verwendet, so führt die
Veränderung
von bereits einem dieser Parameters dazu, daß die Versuche scheitern und
der komplette Entwicklungsprozess von neuem begonnen werden muß. Das Verfahren
von Darji et al. ist daher für
Routineuntersuchungen in breiter Anwendung nicht einsetzbar. Die Veröffentlichungen
von Darji et al. offenbaren damit kein allgemeingültiges Verfahren
zur MHC Klasse I-Präsentation
von exogenem Antigen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die wirksame LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung
des PI-Einstromes während
oder nach Einwirkung von LLO ermittelt. Dazu wird z.B. ausgehend
von einer für
die gewählten
Bedingungen geschätzten
optimal wirksamen LLO-Konzentration in einem vorgegebenen Zeitfenster
von 1 bis 45 Minuten so lange wiederholt gemessen, bis ein Einstrom
von PI in die Zielzellen detektierbar ist. Unter „gewählte Bedingungen" sind die vom Experimentator
ausgewählten
Rahmenbedingungen wie die gewünschte
Zellkonzentration, die gewünschte
Inkubationstemperatur, das gewünschte
Medium etc. zu verstehen. Die optimale LLO-Konzentration bzw. Inkubationsdauer
für die
Einschleusung von Antigen in den MHC I – Präsentationsweg ist in der Regel die,
bei der der Einstrom von PI unter definierten Bedingungen beginnt.
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, dass durch Übertragung
der vorher ermittelten Reaktionsbedingungen auf die Einschleusung
von exogenem Antigen bei Konstanthaltung aller anderer Parameter,
die oben erwähnte
multifaktorielle Beeinflussung der wirksamen LLO-Konzentration vernachlässigt bzw.
eliminiert werden kann. Als Konsequenz werden die Versuche reproduzierbar.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, dass es die schnelle Übertragung
der Anwendung von LLO von einem Labor auf ein anderes ermöglicht,
in dem andere Rahmenbedingungen erwünscht oder vorgegeben sind.
-
Der
Einstrom von PI wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielhaft
und bevorzugt genutzt, um den Wirkungsbereich von LLO für die Einschleusung
von Antigen ins Zytosol mit anschließender Prozessierung und Präsentation
mit MHC I einzugrenzen. In den hier beschriebenen Anwendungsbeispielen
ließ sich parallel
zum LLO-vermittelten Einstrom von PI in die Zellen im Präsentationsexperiment
eine Zunahme der Anzahl aktivierter antigenspezifischer CD8+ T-Zellen erreichen, solange die Toxizitätsgrenze
noch nicht erreicht war (Beispiel 4).
-
Weitere
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind, daß adhärente Zellen
sowie Suspensionszellen erfolgreich mit LLO und Antigen behandelt
werden können,
frische oder kryokonservierte Zellen geeignet sind und die Behandlung
in An- oder Abwesenheit von Serum in verschiedenen Medien oder Puffern
erfolgen kann. Im Gegensatz zu dem Verfahren, wie es von Darji et
al. beschrieben wurde, verkürzt
sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
die Zeit erheblich, die für
die initiale Etablierung der LLO-vermittelten Einschleusung von
exogenem Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg benötigt wird,
auf wenige Wochen (Anpassung an die verwendeten Plastik-Artikel,
Etablierung geeigneter Temperatur usw.). Aufgrund der Möglichkeit
den Marker-Einstrom "live" zu beobachten, kann
das Verfahren nach Bewertung des PI-Einstromes ohne großen Zeitaufwand
optimal auf die Antigene und Zellen übertragen werden (Einsatz der
optimal wirksamen LLO-Konzentration
und -inkubationsdauer). Darüber
hinaus können
die Rahmenbedingungen nach Wunsch variiert werden. Bei Veränderung
der Rahmenbedingungen wie z.B. Zellkonzentration oder LLO-Charge
kann die wirksame LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung
des PI-Einstromes schnell und sensitiv detektiert werden.
-
Mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es möglich:
- 1. Exogene Antigene in Primärzellen einzubringen, sowohl
in Zellen von der Maus wie auch vom Menschen (Darji et al. beschreiben
bei der in vitro-Anwendung ausschließlich etablierte Zelllinien
und keine Verwendung humaner Zellen).
- 2. Exogene Antigene in unseparierie humane PBMCs einzubringen
(Beispiele 4-6). Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die klinische
Anwendung des LLO zur Ermittlung der CTL-Reaktivität von Patienten oder zur Expansion
antigenspezifischer CTLs. Klinische Testsituationen erfordern eine
schnelle und einfache Durchführbarkeit
des angewandten Verfahrens. Aufgrund der aufwendigen Vortests und
der mangelnden Reproduzierbarkeit kann das Verfahren von Darji et
al. nicht routinemäßig und
laborübergreifend
in diesem Umfeld verwendet werden.
- 3. Exogene Antigene in humane primäre Monozyten oder in humane
Monozyten-Linien (THP-1) einzubringen.
-
Wesentlicher
Kernpunkt ist somit die Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen
sensitiven Zellart-spezifischen Bestimmung der potentiell wirksamen
Hämolysin-
und bevorzugt der LLO-Konzentration und Inkubationsdauer durch Messung
eines Marker- (z.B. Propidiumjodid (PI))-Einstroms während der
Einwirkung von Hämolysin
unter definierten Bedingungen. Bei Übertragung der definierten
Rahmenbedingungen (Parameter), bei denen ein effektiver Marker-Einstrom
nachgewiesen werden kann, auf die Inkubation mit Antigen, bedürfen die
oben beschriebenen beeinflussenden Parameter keiner weiteren Berücksichtigung.
Das soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "direkte Übertragung
der ermittelten spezifischen Parameter" verstanden werden.
-
Weiter
bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg jeder An von
Zelle, die zur MHC I-Präsentation
in der Lage ist, insbesondere in tierische Zellen wie z.B. primäre humane
und murine Zellen sowie Zellinen, unseparierte oder separierte Zellen
wie z.B. PBMCs, in Monozyten oder Lymphozyten, unreife aus Monozyten
erzeugte DCs, die Zelllinie THP-1, Maus-Knochenmarkszellen in Suspension, adhärente Maus-Knochenmarksmakrophagen,
die Zelllinie EL-4 und die Zelllinie NIH3T3.
-
Noch
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei das Antigen
ausgewählt
ist aus Proteinen jeglicher An oder Teilen davon, von denen die
Präsentation
antigener Epitope mit MHC I erwünscht
ist. Beispiele solcher Antigene können unter anderem aus der "Cancer immunity peptide
database, MHCBN Database" (kann über das Internet
unter http://www.imtech.res.in/raghava/mhcbn/ oder http://bioinformatics.uams.edu/mirror/mhcbn/ (mirror
site) aufgerufen werden) entnommen werden und schließen Tumor-assoziierte
Antigene ein, aber auch virale Antigen, Antigene intrazellulärer Bakterien,
Modellantigene wie z.B. Ovalbumin, CMVpp65 und Albumin oder Teilen
davon ein. Unter "Teilen" im Rahmen der vorliegenden
Erfindung sollen alle Peptide, Oligopeptide und Proteine (sowie Fusionsproteine)
verstanden werden, die ausreichend groß sind, um in der Zelle in
den MHC Klasse I-Präsentationsweg
eingeschleust zu werden. Solche Peptide sind bis zu 540kDa groß, bevorzugt zwischen
5 kDa und 200 kDa und weiter bevorzugt zwischen 10 kDa und 50 kDa
groß.
Ein Überblick über entsprechende
Peptid-Datenbanken der Epitope kann gefunden werden in: Lund et
al. (2002. Web-based tools for vaccine design in : Korber B., Brander
C., Haynes B., Koup R., Kuiken C., Moore J., Walker B. and Watkins D.,
eds., HIV Molecular Immunology 45-51. Theoretical Biology and Biophysics
Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos NM).
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung des in vitro Verfahren zur Einschleusung
von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg
von Zellen ist ein weiterer spezifischer Parameter die Größe, Ladung
und/oder Aminosäurezusammensetzung
des Antigens. Antigene, die für
die Zielzellen toxisch sind und daher nicht prozessiert und präsentiert
werden, können
in einer inaktivierten Form (nach Mutagenese oder chemisch inaktiviert)
eingesetzt werden.
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Ebenfalls
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei das LLO
ausgewählt
ist aus Kulturüberstand,
aufgereinigtem LLO, oder rekombinant hergestelltem LLO. Entsprechende
Verfahren zur Herstellung sind dem Fachmann bekannt und können der
entsprechenden Literatur entnommen werden, wie zum Beispiel Giammarini
et al. (J. Biotechnol. 2004: 109(1-2): 13-20), Walton et al. (Protein
Expr. Purif. 1999: 15(2): 243-5), Traub und Bauer (Zentralbl. Bakteriol.
1995: 283(1): 29-42) und Darji et al. (J. Biotechnol. 1995: 43(3):
205-12).
-
Ebenfalls
noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden
Erfindung zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg
von Zellen, wobei als Marker ein Farbstoff und/oder eine fluoreszierende
Verbindung, wie zum Beispiel Propidiumjodid (PI, in einer Konzentration
zwischen 1-10μg/ml) oder ähnliches
verwendet wird. Weitere geeignete Marker sind z.B. 7-AAD, eGFP,
fluoreszenzmarkierte Proteine wie z.B. BSA-FITC, BSA-PE, OVA-FITC.
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Noch
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen, wobei
die Messung des Einstroms des Markers mittels einer Fluoreszenzmessung
erfolgt. Weitere geeignete Messungen sind z.B. der Einstrom von
Ionen wie z.B. Calcium; die Messung der Veränderung der Membranpolarisation;
die Freisetzung intrazellulärer
Bestandtteile wie z.B. Laktat-Dehydrogenase (LDH); die Messung der
Zellproliferation nach Hämolysin
(z.B. LLO)-Inkubation im Vergleich zur Proliferation einer Kontrolle
ohne Hämolysin;
die Messung der Proliferation durch Einbau von Tritium-markiertem
Thymidin in die DNA, durch Umsetzung eines Substrates wie z.B. MTT,
XTT oder WST-1 oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
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Noch
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei die Inkubationszeit
mit dem LLO bis zu 16 Stunden, insbesondere zwischen 1 bis 45 Minuten
beträgt
und besonders zwischen 1-20 min lang ist.
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Ebenfalls
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei die Konzentration
des verwendeten LLO zwischen 1 und 5000 ng/ml, insbesondere zwischen
1 und 500 ng/ml und bevorzugt zwischen 1 und 250ng/ml beträgt.
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Noch
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg, wobei Zellkonzentrationen
zwischen 105/ml und 109/ml
eingesetzt werden. Bevorzugt sind Zellkonzentrationen zwischen 5 × 105 und 5 × 106/ml.
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Noch
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen der
vorliegenden Erfindung, wobei das verwendete Kulturmedium und/oder
der Puffer ausgewählt
sind aus Puffern und/oder Zellkulturmedien unterschiedlicher Zusammensetzung
und Herkunft wie z.B. PBS, DMEM und RPMI. Dem Fachmann sind weitere
Puffer und Medien bekannt, die ebenfalls verwendet werden können.
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Bevorzugt
ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Einschleusung
von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg,
wobei der Parameter des Labormaterials ausgewählt ist aus dem verwendeten Plastik-Material
(z.B. PS – Polystyrol
oder PP – Polypropylen
oder PE – Polyethylen)
insbesondere der Eppendorf-Gefäßen, Falcon-Röhrchen, Pipetten, Probenröhrchen,
Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten und Kulturschalen.
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Noch
weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen der
vorliegenden Erfindung, wobei die Temperatur während der Inkubation zwischen
0°C und
37°C, bevorzugt
4°C und
25°C und
besonders bevorzugt Raumtemperatur (ca. 20°C), beträgt.
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Ebenfalls
noch weiter bevorzugt ist ein in vitro Verfahren der vorliegenden
Erfindung zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg
von Zellen resultierend in der Aktivierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen. Geeignete Methoden zum Nachweis
der Aktivierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen sind
z.B. die Messung der Produktion von Zytokinen wie z.B. IFN-γ, TNF-α oder IL-2;
Proliferationtests; Zytotoxizitätstests
oder andere Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt und in der entsprechenden
Literatur beschrieben sind.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des in vitro Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Einschleusung
von exogenen Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen, umfaßt das Verfahren die
Schritte von a) Gegebenenfalls Separation oder Konzentration der
antigenpräsentierenden
Zellen mittels Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation und/oder
Cell-sorting und/oder Isolierung mit magnetischen Beads und/oder
Adhärenz
und/oder anderen dem Fachmann bekannten Verfahren und Einstellen
auf eine Zellkonzentration von zwischen 105 bis
109 Zellen/ml, b) Zugabe von PI in einer
Konzentration zwischen 1 und 10μg/m1
zu den antigenpräsentierenden
Zellen, c) Zugabe von LLO in Konzentrationen von zwischen 1 und 5000
ng/ml, d) Inkubation für
eine Zeit von 1 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur, e) Ermittlung
des Einstroms von PI in die Zellen während oder nach der LLO-Inkubation,
und f) Ermittlung von spezifischen Parametern, bei denen bei den
antigenpräsentierenden
Zellen ein Einstrom von PI gemessen werden kann, und g) anschließende Einschleusung
eines Antigens in den MHC I-Präsentationsweg
der antigenpräsentierenden
Zellen, umfassend die direkte Übertragung
der in Schritt f) ermittelten spezifischen Parameter, umfassend
ein in Kontakt bringen der Zellen mit Listeriolysin (LLO) und dem
einzuschleusenden Antigen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des in vitro Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann bei Ermittlung
des PI-Einstromes in PBS und Übertragung
der Bedingungen auf das Präsentationsexperiment
mit der Abweichung, daß statt
PBS Zellkulturmedium eingesetzt wird, in einigen Zelltypen eine
verbesserte MHC I-Präsentation
der Antigene erreicht werden.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung einer APC, die antigene Epitope aus eingeschleusten
exogenen Antigenen mit MHC Klasse I präsentiert, umfassend ein Verfahren
zur Einschleusung von Antigenen in den MHC I-Präsentationsweg
von antigenpräsentierenden
Zellen wie oben beschrieben und ein anschließendes Kultivieren und/oder
Isolieren der MHC Klasse-I antigenpräsentierenden APCs. Ein Isolieren
kann z. B. mit Hilfe von Antikörpern,
die gegen mit definierten Peptiden beladene MHC I-Moleküle gerichtet
sind (Porgador A., Yewdell J.W., Deng Y., Bennink J.R., and Germain
R.N. 1997. Localisation, quantitation, and in situ detection of
specific peptide-MHC
class I complexes using a monoclonal antibody. Immunity 6: 715)
oder anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erfolgen.
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Ein
noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen,
umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC
I-Präsentationsweg
von antigenpräsentierenden
Zellen wie oben beschrieben und die Isolierung der zytotoxischen
CD8+ T-Zellen. Ein Isolieren aktivierter
IFN-γ-sekretierender
CTLs kann hier z. B. mit Hilfe von magnetischen Beads oder durch
FACS-Sorting (wie z. B. beschrieben in Oelke et al. 2001. Functional
analysis of antigenspecific CTLs alter enrichment based on cytokine
secretion in: Miltenyi Biotec MACS & more newsletter Vol. 5, No.1 2001;
Oelke et al. 2000. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific
cytotoxic T lymphocytes alter enrichment based on cytokine secretion:
comparison with the MHC-tetramer technology. Scand. J. Immunol. 2000
Dec 52(6): 544-9.) oder anderer Verfahren, wie sie dem Fachmann
bekannt und in der entsprechenden Literatur beschrieben sind, erfolgen.
-
Ein
noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Ermittlung von MHC Klasse-I präsentierten Antigen-Epitopen,
umfassend ein Verfahren zur Einschleusung von Antigenen in den MHC
I-Präsentationsweg
von antigenpräsentierenden
Zellen wie oben beschrieben und Isolieren und Bestimmen der präsentierten
Antigen-Epitope, z.B. wie beschrieben in Purcell A.W. (Isolation
and characterisation of naturally processed MHC-bound peptides from
the surface of antigen-presenting cells. Methods Mol. Biol. 2004;
251: 291-306) und Torabi-Pour N. et al. (Comparative Study of Peptides
Isolated from Class I Antigen Groove of Urological Specimens. A
Further Step toward the Future of Peptide Therapy in Bladder Cancer
Patients. Urologia Internationalis 2002; 68:183-188) oder anderen
dem Fachmann bekannten Verfahren.
-
Ein
noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische
Zusammensetzung, umfassend eine APC wie oben beschrieben, eine zytotoxische
CD8+ T-Zelle.
wie oben beschrieben und/oder ein Peptid umfassend ein MHC Klasse-I
präsentiertes
Antigen-Epitop wie oben beschrieben, zusammen mit pharmazeutisch
akzeptablen Hilfs- und Zusatzstoffen. Die erfindungsgemäßen aktiven
Bestandteile können
mit den üblichen
dem Fachmann bekannten Puffern, Lösungsmitteln, Hilfs- und Trägerstoffen
zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions-
und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutisch
zur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendung
zu finden.
-
Ein
letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit, enthaltend
Materialien zur Durchführung
des in vitro Verfahrens zur Einschleusung von Antigenen in den MHC
I-Präsentationsweg
von Zellen wie oben beschrieben, zur Herstellung einer APC, die
antigene Peptidepitope von extrazellulären Proteinen mit MHC Klasse
I präsentiert
wie oben beschrieben, zur Herstellung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen wie oben beschrieben und/oder
zur Ermittlung von MHC Klasse-I präsentierten Antigen-Epitopen
wie oben beschrieben, wobei das/die Verfahren in klinischer Umgebung
("point of care") durchgeführt wird/werden.
Solche Materialien umfassen neben den Verbrauchsmaterialien auch
entsprechende Gebrauchsanweisungen, so daß eine hohe Reproduzierbarkeit
des Verfahrens gewährleistet
ist.
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Zusammengefaßt eröffnet die
vorliegende Erfindung die Möglichkeit
zur schnellen sensitiven Zellart-spezifischen Bestimmung der für die Einschleusung
von Antigen optimal wirksamen LLO-Konzentration und Inkubationsdauer
durch Messung z.B. des Propidiumjodid (PI)-Einstromes (oder des Einstromes anderer fluoreszierender
Verbindungen) während
oder nach der Einwirkung von LLO unter definierten Bedingungen. Durch
genaue Übertragung
der Bedingungen, bei denen ein PI-Einstrom detektiert werden kann,
auf die LLO-Behandlung vor oder während Inkubation mit Antigen,
wird die Abhängigkeit
von Parametern, die die wirksame LLO-Konzentration nachhaltig störend beeinflussen
können,
in einem Schritt aufgehoben.
-
Die
Erfindung soll nun im folgenden anhand der Beispiele und den beigefügten Abbildungen
weiter verdeutlicht werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Es zeigt:
-
1:
Mittlere PI-Fluoreszenzintensität
von EL-4-Zellen unter Einwirkung unterschiedlicher LLO-Konzentrationen
zu verschiedenen Zeitpunkten
- (a) Darstellung
der Zellpopulation im Dot Blot FSC (Forward Scatter) gegen PI
- (b) Darstellung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit
von der Zeit
-
2:
MHC I-Präsentation
von OVA nach Inkubation von EL-4-Zellen mit verschiedenen LLO-Konzentrationen
-
3:
MHC I-Präsentation
von OVA nach Inkubation von EL-4-Zellen mit verschiedenen LLO-Konzentrationen
-
4:
Mittlere PI-Fluoreszenzintensität
von EL-4-Zellen unter Einwirkung unterschiedlicher LLO- Konzentrationen
zu verschiedenen Zeitpunkten
-
5:
Mittlere PI-Fluoreszenzintensität
von EL-4-Zellen unter Einwirkung unterschiedlicher LLO- Konzentrationen
zu verschiedenen Zeitpunkten
- (a) Darstellung
der Zellpopulation im Dot Blot FSC gegen PI
- (b) Darstellung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit
von der Zeit
-
6:
MHC I-Präsentation
von OVA nach LLO-Inkubation von EL-4-Zellen nach publizierten Angaben
-
7:
Streulichtdarstellung von Monozyten und Lymphozyten
PBMCs werden
anhand ihrer Streulichparameter in Monozyten (R2) und Lymphozytenpopulation
(R1) unterteilt. Der Einstrom von PI wurde für jede Population einzeln ausgewertet
-
8:
Einstrom von PI in Monozyten (a) und Lymphozyten (b) in Anwesenheit
von LLO
-
9:
Anteil der IFN-γ-seketierenden
CD8+ T-Zellen nach Vorbehandlung mit LLO
und Stimulation mit CMVpp65
-
10:
Einstrom von PI in Monozyten (a) und Lymphozyten (b) nach der Inkubation
mit LLO
-
11:
Anteil der IFN-γ-seketierenden
CD8+ T-Zellen nach Vorbehandlung mit LLO
und Stimulation mit CMV-Lysat
-
12:
Einstrom von PI in Monozyten (a) und Lymphozyten (b) in Anwesenheit
von LLO
-
13:
Anteil der IFN-γ-seketierenden
CD8+ T-Zellen nach Vorbehandlung mit LLO
und Stimulation mit Influenza-Antigen
-
Beispiel 1
-
Messung des LLO-vermittelten
Einstromes von PI als Vorversuch vor der LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen
-
Im
vorliegenden Beispiel wurden EL-4 als antigenpräsentierende Zellen (APCs) verwendet.
Die Thymomzelllinie EL-4 (H-2Kb) wurde durch
Benzanthrazen-induzierte Karzinogenese aus einer C57BL/6-Maus gewonnen
(Ghose T., Guclu A., Tai J., Norvell S.T., and MacDonald A.S. 1976.
Active immunoprophylaxis and immunotherapy in two mouse lymphoma
models. J. Natl. Cancer Inst. 57(2): 303-15; Talmage D.W., Woolnough
J.A., Hemmingsen H., Lopez L. and Lafferty K.J. 1977. Activation
of cytotoxic T cells by nonstimulating tumor cells and spieen cell
factor(s). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(10): 4610-4). Es wird
dem Fachmann jedoch ersichtlich sein, daß dieses Verfahren ohne weiteres
für andere
antigenpräsentierende
Zellen auch entsprechend angepaßt
durchgeführt
werden kann. Listeriolysin wurde hergestellt wie beschrieben in
Darji et al. (J. Biotechnol. 1995 Dec 15; 43(3): 205-12).
-
A. Messung des Einstromes
von PI in EL-4-Zellen während
der Einwirkung von LLO:
-
Im
vorliegenden Experiment wurde der Einstrom von PI unter Einwirkung
von zwei verschiedenen LLO-Konzentrationen (20ng/ml und 120ng/ml)
als Vorversuch gemessen. Die EL-4-Zellen wurden mit RPMU25mM HEPES/5%FCS
bei Raumtemperatur (RT) auf eine Zellkonzentration von 2 × 106/ml eingestellt. Zu 500μl der Zellsuspension wurden
2Oμl PI
(Stammlösung
100μg/ml,
2μg/ml Endkonzentration),
409μl RPMU25mM
HEPES/5%FCS und 71μl
in RPMI/25mM HEPES/5%FCS verdünntes
LLO (20ng LLO) gegeben (Probenvolumen 1 ml mit 20ng/ml LLO). Die
Zugabe von LLO entspricht dem Zeitpunkt 0 min, ab dem der Einstrom
von PI durchflußzytometrisch
detektiert wurde (BD FACScalibur). Die Messung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität wurde
zu den angegebenen Zeitpunkten wiederholt durchgeführt. Gleichzeitig
wurden 500μl
mit 1 × 106 EL-4-Zellen nach Zugabe von 2μg/ml PI und
52μl RPMU25mM
HEPES/5%FCS mit 428μl
in RPMU25mM HEPES/5%FCS verdünntem
LLO (120ng LLO) bei RT inkubiert. Der Einstrom von PI in die Zellen wurde
zu den gleichen Zeitpunkten detektiert wie zuvor bei Inkubation
mit 20ng/ml LLO.
-
Die
Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Es wurde für EL-4-Zellen
die mittlere PI-Fluoreszenzintensität nach Einwirkung
von 20 bzw. 120ng/ml LLO nach Inkubation für 0, 5, 10, 15 und 20 Minuten
bei RT in RPMU25mM HEPES/5%FCS ermittelt. In Anwesenheit von 20ng/ml
LLO ließ sich
zu keinem Messzeitpunkt ein Einstrom von PI in die EL-4-Zellen detektieren.
Bei Inkubation mit 120ng/ml LLO war nach 5minütiger Inkubation ein beginnender
PI-Einstrom zu verzeichnen, der mit zunehmender Dauer der Inkubation
mit LLO weiter anstieg.
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B. Übertragung der Bedingungen
(LLO-Konzentration und -Inkubationszeit) auf die Einschleusung von
Antigen in den MHC I-Prozessierungsweg
-
Die
Messung des PI-Einstromes im Vorversuch wurde unter den gleichen
Bedingungen durchgeführt, wie
sie für
die nachfolgende LLO-vermittelte Einschleusung von Antigen in den
MHC I-Präsentationsweg
ausgewählt
waren. Die zu behandelnden EL-4-Zellen wurden mit RPMU25mM HEPES/5%FCS
auf eine Zellkonzentration von 2× 106/ml
eingestellt. Wie im Vorversuch wurden je Ansatz 1 × 106 EL-4-Zellen im gleichen Volumen und bei
gleicher Konzentration des LLO für
die oben dargestellten Inkubationszeiten, aber diesmal ohne PI inkubiert.
Zum Ausgleich des Volumens wurden 2Oμl RPMU25mM HEPES/5%FCS zugesetzt.
Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne LLO mitgeführt. Für die Inkubation mit LLO wurden
im vorliegenden Versuch LLO-Konzentrationen gewählt, bei denen sich im Vorversuch
kein Einstrom von PI (20ng/ml) und der Beginn des Einstroms von
PI mit zunehmender mittlerer PI-Fluoreszenzintensität (120ng/ml)
nachweisen ließ (Tabelle
1).
-
-
Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion durch Zugabe von
3ml RPMU25mM HEPES/5%FCS gestoppt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert
und in jeweils 1ml RPMU25mM HEPES/5%FCS resuspendiert. Von jedem
Ansatz wurden Triplikate mit 100μl/well
(je 1 × 105 EL-4 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und
mit 500μg/ml
Ovalbumin (OVA, 45kDA) und 5 × 104 B3Z-Zellen/well für 20h kultiviert.
-
Im
murinen Testsystem wurden als reaktive T-Zellen B3Z-Zellen eingesetzt
(Karttunen J. and Shastri N. 1991. Measurement of ligand induced
activation of single viable T-cells using the lacZ reporter gene.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3972-76). Diese CD8+ T-Zell-Hybridomlinie besitzt
einen T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für OVA-Peptid 257-264 präsentiert
durch das MHC Klasse I-Molekül
H-2Kb. Interagiert der TCR von B3Z-Zellen mit OVA-Peptid 257-264
-präsentierenden
H-2Kb-Molekülen, sekretieren die B3Z-Zellen
IL-2. Als Kontrollen wurden unbehandelte EL-4-Zellen mit bzw. ohne
1 μg/ml
OVA 257-264 (P) und B3Z-Zellen inkubiert. Nach der angegebenen Inkubationszeit
wurden pro well 2 × 50μl Kulturüberstand
abgenommen und in eine 96well-Platte überführt. Der IL-2-Gehalt im Überstand
wurde über
das Wachstum der IL-2-abhängigen T-Zell-Linie
CTLL-2 detektiert. Bei diesem Proliferationstest wurden als Kontrollen
CTLL-2-Zellen mit und ohne IL-2 mitgeführt. Die Proliferation der
CTLL-2-Zellen wurde mit Hilfe eines Proliferationstestes der Firma
Roche (Cell Proliferation Reagent Cat. No. 1 644 807) als OD-Wert
nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
-
Zusammenfassend
lässt sich
im vorliegenden Beispiel nach Inkubation von EL-4-Zellen mit 20ng/ml LLO
kein Einstrom von PI (A) und nur eine schwach ausgeprägte MHC
I-Präsentation
von OVA (B) nachweisen. Im Gegensatz dazu konnte nach Behandlung
von EL-4-Zellen mit 120ng/ml OVA ein zunehmender Einstrom von PI
(A) und eine stark ausgeprägte
MHC I-Präsentation
von OVA (B) beobachtet werden. Die erfolgreiche Einschleusung von
extrazellulärem
OVA in den MHC I-Präsentationsweg
von EL-4-Zellen verläuft
im vorliegenden Beispiel parallel zum detektierbaren LLO-vermittelten
Einstrom von PI in die Zellen.
-
Beispiel 2
-
Messung der LLO-abhängigen mittleren
PI-Fluoreszenzintensität
parallel zur LLO-Inkubation
zur Einschleusung von Antigen in den MHC Klasse I-Präsentationsweg
-
Als
APCs wurden EL-4-Zellen verwendet. Die Messung des PI-Einstromes
wurde zeitgleich zur LLO-Inkubation mit dem Ziel der Einschleusung
von Antigen durchgeführt.
EL-4-Zellen wurden mit RPMU25mM HEPES/5%FCS auf eine Zellkonzentration
von 2×106/ml eingestellt. Pro Ansatz wurden jeweils 1 × 106 EL-4-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen
an LLO für
unterschiedlich lange Zeit inkubiert (Tabelle 2).
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-
Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion durch Zugabe von
3ml RPMU25mM HEPES/5%FCS gestoppt. Die Zellen wurden nach einem
Zentrifugationsschritt in jeweils 1ml RPMU25mM HEPES/5%FCS resuspendiert.
Von jedem Ansatz wurden Triplikate mit 10Oμl/well (je 1 × 105 EL-4 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und
mit 500μg/ml
Ovalbumin (OVA, 45kDA) und 5×104 B3Z-Zellen/well für 20h kultiviert. Der Nachweis
der MHC Klasse I-Präsentation
von OVA (45kDA) wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
Abbildung dargestellt.
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Parallel
zur Inkubation der Zellen zur Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg
(Tabelle 2) wurde für
jede LLO-Konzentration ein Ansatz mit PI mitgeführt und zu den angegebenen
Zeitpunkten zur Bestimmung der mittleren PI-Fluoreszenzintensität gemessen
(Tabelle 3). Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
-
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Im
vorliegenden Beispiel ließ sich
nach Inkubation von EL-4-Zellen mit 1 bzw. 20ng/ml LLO zu keinem Messzeitpunkt
ein im Vergleich zur Kontrolle erhöhter Einstrom von PI nachweisen,
die MHC I-Präsentation von
OVA war nach 15 und 30 Minuten Inkubation mit 20ng/ml LLO wie in
Beispiel 1 nur sehr schwach ausgeprägt. Im Gegensatz dazu konnte
bei Inkubation mit 50ng/ml LLO nach 15min Inkubation ein beginnender PI-Einstrom
festgestellt werden, der bis zum Messzeitpunkt 30 Minuten deutlich
nachweisbar war. Die bei SOng/ml im Vergleich zu 20ng/ml stärkere Zunahme
der mittleren PI-Fluoreszenzintensität spiegelt sich zu jedem Zeitpunkt
auch in einer stärker
ausgeprägten
MHC I-Präsentation
von OVA wider. Nach Inkubation mit 100ng/ml LLO war bereits nach
15 Minuten der Einstrom von PI deutlich ausgeprägt und nahm bis zum Zeitpunkt
30min weiter zu. Parallel dazu konnte nach Inkubation der EL-4-Zellen
für 15
und 30min mit 100ng/ml LLO eine effiziente Einschleusung von OVA
in den MHC I-Präsentationsweg
nachgewiesen werden.
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Im
vorliegenden Beispiel ist solange noch kein PI-Einstrom zu beobachten
ist (20ng) nur eine sehr schwache Einschleusung von Antigen zu beobachten.
Die LLO-Behandlung bei deutlich nachweisbaren Einstrom von PI (50ng)
ist gefolgt von einer effizienten Einschleusung und MHC I-Präsentation
von exogenem Antigen, die mit steigender LLO-Konzentration zunimmt.
-
Beispiel 3
-
Inkubation mit LLO nach
publizieren Angaben
-
Im
Gegensatz zu Beispiel 1 und 2 erfolgte im vorliegenden Beispiel
3 die Inkubation mit LLO nach publizierten Angaben (Darji A., Chakraborty
T., Wehland J., Weiss S. 1995. Listeriolysin generates a route for
the presentation of exogenous antigens by major histocompatibility
complex class I. Eur. J. Immunol. 25(10):2967-71, und Darji A.,
Chakraborty T., Wehland J., Weiss S. 1997. TAP-dependent major histocompatibility
complex class I presentation of soluble proteins using listeriolysin.
Eur. J. Immunol. 27(6):1353-9).
-
Als
APCs wurden EL-4-Zellen eingesetzt und nach den publizierten Angaben
mit LLO zur Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg
inkubiert. Die EL-4-Zellen wurden mit RPMI/25mM HEPES (37°C ohne Serum)
auf eine Zellkonzentration von 2 × 106/ml
eingestellt und bei 37°C
mit 1 μg/ml
LLO und 100μg/ml
OVA für
15min und 60min inkubiert. Als Kontrollen wurden Ansätze ohne
LLO mitgeführt
(Tabelle 4).
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Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion durch Zugabe von
3ml RPMU25mM HEPES gestoppt. Die Zellen wurden nach einem Zentrifugationsschritt
in jeweils 1ml RPM/10%FCS resuspendiert. Von jedem Ansatz wurden
Triplikate mit 100μl/well
(je 1 × 105 EL-4 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und
entweder ohne Antigen oder mit 500μg/ml Ovalbumin (OVA, 45kDA)
und 5 × 104 B3Z-Zellen/well für 20h kultiviert. Der Nachweis
der MHC Klasse I-Präsentation
von OVA (45kDA) wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse der Inkubation
mit 500μg/ml
OVA in der Mikrotiterplatte sind mit denen der Inkubation ohne Antigen vergleichbar
und in 6 dargestellt.
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Parallel
zur Inkubation der Zellen zur Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg
(Tabelle 4) wurde wie in Beispiel 2 für jeden Testansatz ein Ansatz
mit PI mitgeführt
und zu den angegebenen Zeitpunkten zur durchflußzytometrischen Bestimmung
der mittleren PI-Fluoreszenzintensität im FACScalibur gemessen.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
-
Im
vorliegenden Beispiel 3, des Ansatzes nach Literaturangaben, ließ sich nach
Inkubation von EL-4-Zellen mit LLO weder nach 15minütiger noch
nach 60minütiger
Inkubation eine Einschleusung von OVA in den MHC I-Präsentationsweg
erreichen (6). Die parallel ermittelten
mittleren PI-Fluoreszenzintensitäten
sind nach 15minütiger
Inkubation der Zellen mit 1 μg/ml
LLO ohne Serum bei 37°C
im Vergleich zum PI-Einstrom bei gelungener Einschleusung in den
MHC I-Präsentationsweg
(1) extrem hoch und zeigen bis zum Zeitpunkt 60min
keine weitere Steigerung mehr (5). Dieser
sehr starke Einstrom von PI bei Inkubation mit LLO nach publizierten
Angaben legt die Vermutung nahe, dass im vorliegenden Beispiel der
optimale Wirkungsbereich von LLO bereits weit überschritten ist und LLO auf
die Zellen zytotoxisch wirkt, so dass keine Prozessierung und Präsentation
von Antigen mehr erfolgen kann.
-
Beispiel 4
-
Anwendungsbeispiel PBMCs
(peripheral blood mononuclear cells)
-
Messung des LLO-vermittelten
Einstromes von PI als Vorversuch vor der LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen
-
Im
vorliegenden Beispiel wurden humane PBMCs als antigenpräsentierende
Zellen verwendet. Es wird dem Fachmann jedoch ersichtlich sein,
daß dieses
Verfahren ohne weiteres für
andere antigenpräsentierende
Zellen auch entsprechend angepaßt
durchgeführt
werden kann.
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Vorarbeiten:
-
Aus
Buffy coats von CMV-seropositiven Spendern werden durch Dichtegradientenzentrifugation PBMCs
isoliert. Die Zellen der einzelnen Spender werden entweder sofort
für Testungen
eingesetzt oder aliquotiert in autologem Plasma mit 10% DMSO kryokonserviert.
Im folgenden Beispiel wurden kryokonservierte PBMCs aufgetaut und
für die
Testung eingesetzt.
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A. Messung des Einstromes
von PI in PBMCs während
der Einwirkung von LLO:
-
Im
vorliegenden Experiment wurden die PBMCs mit PBS/5%AB-Serum bei
Raumtemperatur auf eine Zellkonzentration von 6 × 106/ml
eingestellt. Zu 500μl
der Zellsuspension wurden 20μl
PI (Stammlösung 100μg/ml, 2μg/ml Endkonzentration),
391ml PBS/5%AB-Serum und 89μl
in PBS/%AB-Serum verdünntes
LLO (25ng LLO) pipettiert. Die Probe hatte zu Beginn der Messung
ein Volumen von 1 ml (25ng LLO/ml). Die Zugabe von LLO entspricht
dem Zeitpunkt 0 min, ab dem der Einstrom von PI in die einzelnen
Zellpopulationen (Monozyten und Lymphozyten, 7) durchflußzytometrisch
detektiert wurde.
-
Die
anschließende
Messung wurde zu den angegebenen Zeitpunkten wiederholt, bis für die gewählte LLO-Konzentration
der Zeitpunkt des Einstromes von PI bestimmt war. Es wurde für Monozyten
und Lymphozyten der von 25ng/ml LLO vermittelte PI-Einstrom nach
Inkubation für
0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 20 Minuten bei Raumtemperatur
(RT) in PBS/5% AB-Serum ermittelt. Bei dem hier beschriebenen Experiment
konnte ab dem Zeitpunkt 10min nach Zugabe von LLO zu den Zellen
ein zunehmender Einstrom von PI in Monozyten und Lymphozyten detektiert
werden. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt.
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Erläuterungen zu 8:
-
In 8 ist
der LLO-vermittelte Einstrom von PI-Einstrom als Überlagerung
von zwei Histogrammen darstellt, jeweils Zeitpunkt 0min zusammen
mit einem späteren
Meßzeitpunkt.
Solange die beiden Histogramme vollständig zur Deckung kommen, lässt sich
kein Einstrom von PI detektieren. Sobald sich der Peak des jeweils
dargestellten Messzeitpunktes vom Zeitpunkt 0 Peak wegbewegt, beginnt
der Einstrom von PI, der zunehmend deutlicher detektierbar wird.
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B. Übertragung der Bedingungen
(LLO-Konzentration und -Inkubationszeit) des detektierbaren PI-Einstromes auf
die Einschleusung von Antigen in den MHC I-Prozessierungsweg
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Die
Messung des PI-Einstromes wurde abgesehen vom Puffer (PBS/5%AB-Serum)
unter den Bedingungen durchgeführt,
wie sie für
die nachfolgende LLO-vermittelte Einschleusung von Antigen in den
MHC I-Präsentationsweg
ausgewählt
sind: Eingesetzt wurde die gleiche Zellkonzentration, das gleiche
Volumen, die gleiche Konzentration und Charge an Serum, der gleiche
Typ Reaktionsgefäß und die
gleiche LLO-Charge. Die Messung des PI-Influxes während der
Einwirkung von LLO wurde bei der gleichen Temperatur durchgeführt, wie
die nachfolgende LLO-Inkubation zur Einschleusung von exogenem Antigen.
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Die
zu behandelnden PBMCs wurden mit RPMI/5%AB-Serum auf eine Zellkonzentration
von 6 × 106/ml eingestellt. Wie im Vorversuch wurden
je Ansatz 3 × 106 PBMCs in gleichen Volumina und bei gleicher Konzentration
des LLO, aber diesmal ohne PI inkubiert. Das Volumen wurde durch
RPMI/5%AB-Serum ersetzt. Als Negativkontrolle wurde ein Ansatz ohne
LLO mitgeführt.
Für die
Inkubation mit LLO wurden Inkubationszeiten gewählt, bei denen sich im Vorversuch
noch kein Einstrom von PI, der Beginn des Einstroms von PI und ein
zunehmender Einstrom von PI in Lymphozyten nachweisen ließ (8 und
Tabelle 5).
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Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion in den einzelnen
Ansätzen
durch Zugabe von 3 ml RPMI/5%AB-Serum gestoppt. Die Zellen wurden
nach einem Zentrifugationsschritt in jeweils 280μl RPMI/5%AB-Serum resuspendiert.
Von der Zellsuspension wurden 150μl/well
(mit 1,6 × 106 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und mit
2,5μg/ml
CMVpp65 für
16h kultiviert. Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden die
Zellen geerntet und mit Hilfe des IFN-γ-Secretion Assays der Firma
Miltenyi Biotec (Deutschland) wurde der prozentuale Anteil IFN-sekretierender
CD8+ T-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation
durchflußzytometrisch
bestimmt (9).
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Der
Einstrom von PI wurde somit genutzt, um den Wirkungsbereich von
LLO für
die Einschleusung von Antigen (CMVpp65) ins Zytosol mit anschließender Prozessierung
und MHC I-Präsentation
zu definieren. Im beschriebenen Anwendungsbeispiel ließ sich parallel
zum beginnenden PI-Einstrom in die Zellen (im Vorversuch mit PBS/5%AB-Serum
zum Zeitpunkt 10min nach Zugabe von LLO) im nachfolgenden Präsentationsexperiment
eine Zunahme der Frequenz aktivierter antigenspezifischer CD8+ T-Zellen nachweisen. Mit zunehmender Dauer
der Inkubation mit LLO steigt die Anzahl der detektierbaren antigenspezifischen
CD8+ T-Zellen bis zu einem Maximum an. Bei
längerer
Inkubation wirkt LLO zunehmend zytotoxisch und die Frequenz aktivierter
antigenspezifischer CD8+ T-Zellen nimmt
wieder ab. Das Fenster, innerhalb dessen die Inkubation mit LLO
eine Einschleusung und Prozessierung von Antigen ermöglicht,
kann durch die Messung des LLO-vermittelten PI-Einstromes bestimmt
werden.
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Beispiel 5
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Anwendungsbeispiel PBMCs
(peripheral blood mononuclear cells)
-
Messung des PI-Einstromes
nach der Einwirkung von LLO auf die Zellen
-
Im
vorliegenden Beispiel 5 wurden wie in Beispiel 4 kryokonservierte
PBMCs eines CMV-seropositiven Spenders aufgetaut und für die Testung
eingesetzt. Die Messung des PI-Einstromes erfolgte im vorliegenden Beispiel
nach der Inkubation der PBMCs mit LLO. Die Zellen wurden in RPMI/3%AB-Serum
(RT) auf eine Zellkonzentration von 1 × 107/ml
eingestellt. Je Ansatz wurden 5 × 106PBMCs
mit 30ng/ml LLO für
die angegebenen Zeiträume
inkubiert (Tabelle 6).
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Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion in den einzelnen
Ansätzen
durch Zugabe von 3ml RPMI/3%AB-Serum gestoppt. Von den jeweils insgesamt
4ml je Ansatz wurden nach vorsichtigem Resuspendieren 500μl in ein
anderes Röhrchen überführt und
nach Zugabe von 2μg/ml
PI durchflußzytometrisch analysiert.
Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt (siehe Erläuterungen
zu 8, Seite 31). Die restlichen Zellen wurden nach
einem Zentrifugationsschritt in 300μl RPMU3%AB-Serum resuspendiert.
Von der Zellsuspension wurden 150μl/well
(mit 2,2 × 106 Zellen) in eine 96well-Platte überführt und
mit 10μg/ml
CMV-Lysat für 16h
inkubiert. Der prozentuale Anteil IFN-γ-sekretierender CD8+ T-Zellen
wurde wie in Beispiel 4 detektiert. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt.
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Im
vorliegenden Beispiel ließ sich
bereits nach 10minütiger
Inkubation der PBMCs mit LLO ein Einstrom von PI nachweisen, der
mit zunehmender Inkubationsdauer stärker wurde. Parallel zum Einstrom
von PI ließ sich
bis zur 20minütigen
Inkubation mit LLO eine Zunahme des prozentualen Anteils IFN-γ-sekretierender
CD8+ T-Zellen detektieren, bei längerer Inkubation
mit LLO nahm der Anteil detektierbarer antigenspezifischer CTLs
aufgrund der zytotoxischen Wirkung des LLO wieder ab.
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Beispiel 6
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Anwendungsbeispiel PBMCs
(peripheral blood mononuclear cells)
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Messung des LLO-vermittelten
Einstromes von PI als Vorversuch vor der LLO-Inkubation zur Einschleusung von Antigen
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Im
vorliegenden Beispiel 6 wurden wie in Beispiel 4 und 5 PBMCs als
antigenpräsentierende
Zellen verwendet. Die PBMCs wurden aus heparinisiertem Vollblut
durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und im Gegensatz zu
den vorhergehenden Beispielen 4 und 5 ohne vorhergehendes Einfrieren
sofort zur Testung eingesetzt. Bei diesem Experiment wurde Influenza-Antigen
zur Stimulation eingesetzt.
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A. Messung des Einstromes
von PI in PBMCs während
der Einwirkung von LLO:
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5 × 105 PBMCs wurden in PBS/5%AB-Serum bei Raumtemperatur
mit 2μg/ml
PI und 8ng LLO in einem Volumen von 1ml inkubiert: Das Pellet von
5 × 105 PBMCs wurde in 694μl PBS/5%AB-Serum resuspendiert, nach
Zugabe von 20μl
PI (Stammlösung
100μg/ml,
2ug/ml Endkonzentration) wurden 286μl LLO (in PBS/5%AB-Serum verdünnt) zugegeben.
Die Zugabe von LLO entspricht dem Zeitpunkt 0 min, ab dem der Einstrom
von PI in die einzelnen Zellpopupulationen (Monozyten und Lymphozyten)
durchflußzytometrisch analysiert
wurde. Die anschließende
Messung wurde zu den angegebenen Zeitpunkten wiederholt, bis für die gewählte LLO-Konzentration
der Zeitpunkt des Einstromes von PI bestimmt war. Es wurde für Monozyten
und Lymphozyten der LLO-vermittelte PI-Einstrom von 8 ng/ml LLO
nach Inkubation für
0, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 und 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT)
in PBS/5% AB-Serum ermittelt. Bei dem hier beschriebenen Experiment
konnte ab dem Zeitpunkt 15min nach Zugabe von LLO zu den Zellen
ein zunehmender Einstrom von PI in Monozyten und Lymphozyten detektiert
werden. Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt
(siehe Erläuterungen
zu 8, Seite 31).
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B. Übertragung der Bedingungen
(LLO-Konzentration und -Inkubationszeit) des detektierbaren PI-Einstromes auf
die Einschleusung von Antigen in den MHC I-Präsentationsweg
-
Wie
in Beispiel 4 wurden die Bedingungen des Vorversuchs auf die LLO-Inkubation
zur Einschleusung von Antigen übertragen.
Die zu behandelnden PBMCs wurden mit RPMI/5%AB-Serum auf eine Zellkonzentration
von 1 × 106/ml eingestellt. Wie im Vorversuch wurden
je Ansatz 5 × 105 PBMCs mit 8ng/ml LLO bzw. als Kontrolle
ohne LLO inkubiert. Ausgewählt
wurden ein Zeitpunkt, bei dem der Beginn des PI-Einstromes nachzuweisen
war, und ein Zeitpunkt, bei dem der Einstrom von PI deutlich detektierbar
war (15min bzw. 20min, Tabelle 7, 12).
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Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde die Reaktion in den einzelnen
Ansätzen
durch Zugabe von 3 ml RPMI/5%AB-Serum gestoppt. Die Zellen wurden
nach einem Zentrifugationsschritt in jeweils 100μl RPMI/5%AB-Serum mit 10μg/ml Influenza-Antigen
(Ansätze
1 bis 3) bzw. als Kontrolle ohne Antigen (Ansätze 4und 5) resuspendiert und
in eine Mikrotiterplatte überführt. Nach
16 Stunden Kultur wurden die Zellen geerntet und der prozentuale
Anteil IFN-γ-sekretierender
CD8+ T-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation
wurde wie in Beispiel 4 durchflußzytometrisch bestimmt (13).
Parallel zum beginnenden Einstrom von PI (15min) und bei nachweisbarem
Einstrom von PI (20min) konnte im vorliegenden Beispiel bei Übertragung
der Bedingungen des Vorversuchs (A) auf die Einschleusung von Antigen
(B) eine Steigerung des prozentualen Anteils aktivierter antigenspezifischer
CTLs nachgewiesen werden.