CN113727720A - 用于治疗表达cldn6的癌症的嵌合抗原受体修饰的细胞 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其显示出对表达CLDN6的靶细胞的高特异性和灵敏的识别以及CAR T细胞的存活和重复刺激的高潜力。

Description

用于治疗表达CLDN6的癌症的嵌合抗原受体修饰的细胞
背景技术
基于过继性细胞转移(ACT)的免疫疗法可以广义地定义为一种被动免疫形式，将先前致敏的T细胞从低前体频数离体扩增至临床相关的T细胞数量后转移至非免疫受者或自体宿主。使用基因工程方法将确定特异性的靶向抗原的受体插入T细胞，极大地扩展了ACT的潜在能力。嵌合抗原受体(CAR)是一种靶向抗原的受体，包含胞内T细胞信号传导结构域，其与胞外抗原结合结构域融合，最常见的是来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。CAR直接识别细胞表面抗原，独立于MHC介导的呈递。
通过使用遗传修饰的T细胞，通过CAR的表达靶向在肿瘤细胞上表达的抗原来治疗癌症的尝试取得了非常有限的成功。尽管B细胞恶性肿瘤患者有显著响应，但在使用具有各种特异性的CAR T细胞靶向实体瘤后成功的临床响应答更加有限。用于实体瘤的CAR T细胞疗法面临着众多挑战。这些包括物理障碍、免疫抑制性肿瘤微环境以及重要的是缺乏真正特异性和安全的肿瘤靶标。
因此，本领域亟需使用CAR治疗癌症的有效组合物和方法。本发明解决了这种需要。
为了实施基于CAR的疗法来治疗实体癌，我们选择了癌胎抗原CLDN6(紧密连接蛋白6)，其具有基于CAR的疗法的理想靶标的所有特征。CLDN6是一种四次跨膜蛋白(tetraspin)的膜蛋白，在器官发生过程中参与原始紧密连接的形成，因此仅在胎儿发育过程中以显著水平表达，在成人健康组织中不存在，但在不同高医疗需求癌症中高度过表达，包括卵巢癌、子宫内膜癌、睾丸癌和肺癌。
CLDN6具有可药用的胞外环，并且细胞表面水平高到足以允许由CAR T细胞识别。此外，CLDN6表达与疾病进展相关，因为它可以在转移性病变和去分化细胞中以更高的频率检测到，表明在致癌过程中起作用。在晚期卵巢癌患者中使用抗CLDN6单克隆抗体IMAB027(OVAR，NCT02054351)的临床I/II期试验表明靶向CLDN6的安全性，其中未检测到与IMAB027相关的不良事件。
根据我们的体外和体内实验结果，我们选择了具有4-1BB结构域(CLDN6-CAR-CD8h-BBz)作为先导结构的第二代CAR用于临床前和临床测试。我们可以证明，对表达CLDN6的靶细胞具有高特异性和灵敏的识别，以及对CAR T细胞的存活和重复刺激的高潜力。
我们使用卵巢癌异种移植模型进一步评估了CLDN6-CAR的体内抗肿瘤潜力，并且可以证明CLDN6-CAR转导的T细胞的过继性转移导致晚期肿瘤的完全根除。此外，这些结果可以用用GMP设施中产生的冷冻保存的CAR T细胞重现。
正如过去可以证明的那样，CAR T细胞疗法的临床结果与体内注入的CAR T细胞的持久性正相关(Robbins et al.(2004)J Immunol.173(12):7125-30,Huang et al.(2005)28(3):258-67)，我们将CLDN6-CAR疗法与我们使用脂质体配制的编码CAR抗原的mRNA的创新CAR体内扩增概念相结合(WO 2016/180778)。
最后，我们可以在不同的肿瘤模型中证实，过继性转移的CAR T细胞与基于RNA(LIP)的疫苗接种相结合，可以加速持续的抗肿瘤应答，并且还可以恢复不足CAR T细胞剂量的抗肿瘤效力。
发明内容
本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含：
i)CLDN6抗原结合结构域；
ii)跨膜结构域；和
iii)胞内结构域，其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
在一实施方案中，所述CLDN6抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域或骆驼科(camelid)VHH结构域。在一实施方案中，所述CLDN6抗原结合结构域包含scFv。在一实施方案中，所述CLDN6抗原结合结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或其功能性变体。
在一实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其功能性变体。在一实施方案中，本发明的CAR分子不包含其他共刺激结构域。
在一实施方案中，所述CD3-ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其功能性变体。
在一实施方案中，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAMl(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C或其功能性变体。
在一实施方案中，所述跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。在一实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其功能性变体。
在一实施方案中，所述抗原结合结构域通过铰链结构域连接至所述跨膜结构域。在一实施方案中，所述铰链结构域为CD8α铰链结构域。在一实施方案中，所述铰链结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能性变体。
在一实施方案中，本发明的CAR分子包含：
i)CLDN6抗原结合结构域；
ii)CD8α铰链结构域；
iii)CD8α跨膜结构域；和
iv)胞内结构域，其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
在一实施方案中，本发明的CAR分子进一步包含前导序列。
在一实施方案中，本发明的CAR分子包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其功能性变体。
本发明还提供一种核酸，其编码本发明的CAR分子。在一实施方案中，所述核酸为DNA或RNA。
本发明还提供一种载体，其包含本发明的核酸。在一实施方案中，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。在一实施方案中，所述载体进一步包含启动子。在一实施方案中，所述启动子选自EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
本发明还提供一种免疫效应细胞，其包含：
本发明的CAR分子；
本发明的核酸；或者
本发明的载体。
在一实施方案中，所述免疫效应细胞为遗传修饰的以表达CAR。在一实施方案中，所述免疫效应细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一实施方案中，所述免疫效应细胞为CD8+ T细胞。在一实施方案中，所述免疫效应细胞为人细胞。
本发明还提供一种免疫效应细胞群，其包含多种本发明的免疫效应细胞。
在本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群的一实施方案中，所述细胞缺乏功能性TCR或功能性HLA的表达，或者具有功能性TCR或功能性HLA的低表达。
本发明还提供一种制备免疫效应细胞或免疫效应细胞群的方法，其包括在一定条件下将本发明的核酸或者本发明的载体引入免疫效应细胞，从而表达所述CAR分子。
本发明还提供一种用于在受试者中刺激针对表达CLDN6的靶细胞群或组织的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者提供有效量的本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群。免疫效应细胞或者免疫效应细胞群可以离体产生并向受试者给药，或者可以在受试者中产生免疫效应细胞或者免疫效应细胞群。
本发明还提供一种治疗患有与CLDN6表达相关的疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者提供有效量的本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群。免疫效应细胞或者免疫效应细胞群可以离体产生并向受试者给药，或者可以在受试者中产生免疫效应细胞或者免疫效应细胞群。在一实施方案中，所述与CLDN6表达相关的疾病选自与CLDN6表达相关的增殖性疾病、癌前疾病状况、癌症和非癌症相关的适应症。在一实施方案中，所述癌症选自卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌。
本发明还提供一种在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，其包括向所述受试者提供有效量的本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群。免疫效应细胞或者免疫效应细胞群可以离体产生并向受试者给药，或者可以在受试者中产生免疫效应细胞或者免疫效应细胞群。在一实施方案中，所述肿瘤为表达CLDN6的肿瘤。
在本发明的方法的一实施方案中，所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群为所述受试者自体的或同种异体的。
在本发明的方法的一实施方案中，所述方法进一步包括给药增加所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群的效力的物质。在一实施方案中，所述物质选自以下的一种或多种：
蛋白磷酸酶抑制剂；
激酶抑制剂；
细胞因子；
免疫抑制剂分子的抑制剂；或
降低TREG细胞的水平或活性的物质。
在本发明的方法的一实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：使所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群，离体或在所述受试者中，与结合CLDN6抗原结合结构域的同源抗原分子接触。在一实施方案中，所述同源抗原分子选自CLDN6或其片段或者CLDN6或CLDN6片段的变体。在一实施方案中，使所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群与所述同源抗原分子在一定条件下接触，从而发生所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群的扩增和/或激活。在一实施方案中，使所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群与所述同源抗原分子接触的步骤体内或离体进行。
在本发明的方法的一实施方案中，所述方法包括以下步骤：向所述受试者给药所述同源抗原分子或编码其的核酸。在一实施方案中，在所述受试者的细胞中表达编码所述同源抗原分子的核酸以提供所述同源抗原分子。在一实施方案中，在所述细胞的表面表达所述同源抗原分子。在一实施方案中，在所述受试者的细胞中瞬时表达编码所述同源抗原分子的核酸。在一实施方案中，编码所述同源抗原分子的核酸为RNA。在一实施方案中，全身性给药所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群和/或所述同源抗原分子或编码其的核酸。在一实施方案中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，编码所述同源抗原分子的核酸在脾中表达。在一实施方案中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，编码所述同源抗原分子的核酸在抗原呈递细胞中表达，优选地在专职抗原呈递细胞中表达。在一实施方案中，所述抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在一实施方案中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生编码所述同源抗原分子的核酸的表达。在一实施方案中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，脾中的编码所述同源抗原分子的核酸的表达是肺中的表达量的至少5倍。
在一实施方案中，编码所述同源抗原分子的核酸配制在递送媒介物中。在一实施方案中，所述递送媒介物包括颗粒。在一实施方案中，所述递送媒介物包含至少一种脂质。在一实施方案中，所述至少一种脂质包含至少一种阳离子脂质。在一实施方案中，所述脂质与编码所述同源抗原分子的核酸形成复合物和/或包裹编码所述同源抗原分子的核酸。在一实施方案中，所述脂质包含于囊泡中，所述囊泡包裹编码所述同源抗原分子的核酸。在一实施方案中，编码所述同源抗原分子的核酸配制于脂质体中。
在本发明的免疫效应细胞、本发明的免疫效应细胞群或本发明的方法的一实施方案中，所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群为表达CAR的免疫效应细胞或表达CAR的免疫效应细胞群。
本发明还提供本发明的CAR分子、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群，用作药物。
本发明还提供本发明的CAR分子、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群，用于治疗表达CLDN6的疾病。
本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明的CAR分子、本发明的核酸、本发明的载体、本发明的免疫效应细胞或者本发明的免疫效应细胞群。在一实施方案中，所述试剂盒进一步包含结合所述CLDN6抗原结合结构域的同源抗原分子或编码其的核酸。在一实施方案中，所述试剂盒进一步包含所述试剂盒用于本发明的方法的说明书。
在另一方面，本发明提供本文所述的物质和组合物，如免疫效应细胞，用于本文所述的方法。
本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和权利要求中显而易见。
附图说明
图1：不同CLDN6-CAR的产生和表征
A)基于CLDN6特异性抗体IMAB206-C46S的重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域，已经设计并产生四种不同的靶向CLDN6的CAR。IgG1ΔFc：具有突变的IgG Fcγ受体(FcγR)结合位点的人IgG1铰链-CH2-CH3 Fc结构域，以防止表达FcγR的先天免疫细胞激活(HombachA.et al.,(2010)Gene Therapy 17,1206–1213)；CD28ΔLck：CD28跨膜和胞质结构域，在CD28内结构域的Lck结合部分中有缺失，在CAR接合时取消IL-2诱导，以防止肿瘤部位不想要的Treg细胞扩增(Kofler D.M.et al.,(2011)Molecular Therapy19(4),760–767)；4-1BB：4-1BB共刺激内结构域；CD3ζ：CD3ζ信号传导结构域；CD3ζ*：具有突变Q14→K的CD3ζ；CD8α：人CD8α铰链结构域。B)在PA1-SC12-A2-eGFP肿瘤球测定中对不同CLDN6-CAR的功能测试。使用
Figure BDA0003286339920000051
活细胞成像系统，基于共培养24h后的eGFP表达(E:T＝10:1)分析肿瘤球的溶解(lysis)情况。在共培养开始时(0h)和此后24h用4x物镜扫描孔的图像，并代表三次技术重复的肿瘤球杀伤。
图2：剂量依赖性CAR介导的对表达CLDN6的靶细胞的识别和溶解
A)在用荧光染料偶联的IMAB206-独特型特异性抗体染色后，在转导的T细胞上分析CLDN6-CAR-BBz表面表达。未转导的T细胞用作阴性对照。为细胞在单个CD4+或CD8+淋巴细胞上设门。标示的数字代表母群体的频数(frequency)(表示为％)。B)通过流式细胞术分析用滴定量的CLDN6-RNA转染的Colo699-N细胞上的CLDN6表面表达。C)在E:T比例为20:1的共培养12h后，使用xCELLigence装置分析CLDN6-CAR-BBz转导的T细胞对转染有RNA的Colo699-N细胞的特异性溶解。数据表示为三次技术重复的平均值±SD。
图3：CLDN6-CAR介导的对表达CLDN6的肿瘤细胞系的特异性溶解
通过流式细胞术分析CLDN6-CAR-BBz转导的人T细胞，并与一组不同来源的CLDN6阳性和阴性人肿瘤细胞系共培养。A)在开始共培养之前，通过流式细胞术评估CAR表面表达。标示的数字代表母群体的频数(表示为％)。B)使用10:1的E:T比例。C)共培养12h后，使用xCELLIigence系统分析特异性溶解，根据公式％溶解＝(CI eGFP–CI效应子)/CI eGFP*100；CI：细胞指数。数据表示为三次技术重复的平均值±SD。D)用CLDN6特异性抗体染色后，通过流式细胞术分析肿瘤细胞系上的CLDN6表面表达。示出母群体的百分比。E)在对看家基因HPRT1标准化后，计算通过qRT-PCR评估的(A-D)中使用的肿瘤细胞系中的相对CLDN6mRNA表达水平。条形代表三次技术重复的平均值±SD。
图4：响应于表达CLDN6的靶细胞，CLDN6-CAR-BBz介导的剂量依赖性增殖
CAR转导的T细胞用CFSE标记，并与用滴定量的CLDN6-RNAlipoplex(RNA(LIP))转染的自体DC共培养。在共培养5天并用针对CD4、CD8和CAR的荧光染料偶联抗体染色后，基于CFSE分析增殖。A)在开始共培养之前，通过流式细胞术评估CAR表面表达。标示的数字代表母群体的频数(表示为％)。B)使用荧光染料偶联的CLDN6特异性抗体通过流式细胞术评估转染DC表面的CLDN6表达。C)基于CFSE增殖染料的稀释，通过流式细胞术分析特异性增殖。条形示出增殖的表达CAR的CD8+和CD4+ T细胞的百分比。
图5：晚期卵巢癌(OV90)异种移植肿瘤模型中，CLDN6-CAR-BBz转导的T细胞的抗肿瘤活性
在i.v.给药单剂量的1x107个CLDN6-CAR-BBz或eGFP转导的人T细胞的过继性细胞转移(ACT)前25天，皮下移植5x106个OV90-SC12肿瘤细胞，(n＝10/组)。在T细胞治疗的这个时间点，小鼠已经出现平均170mm3的晚期肿瘤。使用卡尺每周测定肿瘤体积3次，并根据以下公式计算：V＝1/2(长x宽2)，使用肿瘤的最大长度和宽度。当肿瘤体积超过1500mm3或肿瘤破溃时处死动物。A)进行的小鼠实验的示意图概述。B)在ACT当天，通过流式细胞术分析转导的人CD4+和CD8+ T细胞的转基因表达(GFP或CAR)。标示的数字代表母群体的频数(表示为％)。C)示出ACT后直到第44天的CLDN6-CAR-BBz和eGFP-T细胞处理的动物的平均肿瘤体积(以虚线表示)。数据表示为所有小鼠/组的平均值±SEM。D)使用流式细胞术，在ACT后3周分析外周血中的T细胞持久性和CAR表面表达。示出代表性的点图。指示的数字代表母群体的频数。
图6：通过培养7天和10天的CLDN6-CAR T细胞重复消除肿瘤球
分别在7天和10天内产生CLDN6-CAR转导的T细胞，根据活细胞成像评估它们重复杀伤表达CLDN6和eGFP的肿瘤球的潜力。A)在用荧光染料偶联的IMAB206-独特型特异性抗体染色后，在转导的T细胞上分析培养7天和10天的CLDN6-CAR T细胞的CAR表面表达。未转导的T细胞用作阴性对照。为细胞在单个CD4+或CD8+淋巴细胞上设门。标示的数字代表母群体的频数(表示为％)。B)使用PA1-SC12-A2-eGFP肿瘤球测试，对培养7天和10天的CLDN6-CAR T细胞进行功能测试。使用
Figure BDA0003286339920000071
活细胞成像系统，在10天的总时间段内，基于eGFP表达，分析肿瘤球的溶解。5天后加入新的肿瘤球。数值代表三次技术重复的绿色目标的积分强度，表示为平均值±SD。
图7：GMP制造的CLDN6-CAR T细胞的抗肿瘤功效
在以1x107的单剂量i.v.给予CLDN6-CAR-BBz或未转导的人T细胞的过继性转移之前35天，皮下移植5x106个OV90-SC12肿瘤细胞(n＝12/组)。所用T细胞产品在GMP设施中以标准(10天体外培养天数)或缩短的生产程序(7天后已经收获)生产。以与转导的T细胞相同的方式处理的未转导的T细胞用作阴性对照。将标示的T细胞产物解冻，用PBS洗涤，并且直接注射到小鼠中，小鼠已经出现平均160mm3的晚期肿瘤。使用卡尺每周测定肿瘤体积3次，并根据以下公式计算：V＝1/2(长x宽2)，使用肿瘤的最大长度和宽度。当肿瘤体积超过1500mm3或肿瘤破溃时处死动物。A)进行的小鼠实验的示意图概述。B)在ACT当天通过流式细胞术分析转导的人CD4+和CD8+ T细胞上的CAR表面表达。指示的数字代表母群体的频数(表示为％)。C)示出直到第57天，CLDN6-CAR-BBz和对照T细胞处理的动物的肿瘤体积。数据表示为所有小鼠/组的平均值±SEM。D)使用流式细胞术，在ACT后2周，分析外周血中的T细胞持久性和CAR表面表达。示出代表性的点图。数字代表母群体的频数。
图8：通过RNA(LIP)进行的体内扩增导致CLDN6-CAR-BBz T细胞的持久性增强
向经2.5Gy照射的(XRAD320)C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc小鼠(n＝2-3/组)i.v.移植5x106个CLDN6-CAR-BBz-Luc-GFP转导的C57Bl/6-Thy1.1+ T细胞。ACT后8天，小鼠接受编码hCLDN6或OvaI(对照(ctrl)RNA)的mRNA lipoplex疫苗接种(RNA(LIP)；20μg，i.v.)，然后i.p.给药配制的核苷修饰的编码鼠白蛋白的RNA(1μg/mRNA/小鼠)。在第15、22、50和85天重复疫苗接种。在ACT后第1天(基线)直至第92天进行顺序生物发光成像以监测扩增和持续性。A)进行的小鼠实验的示意图概述。B)在所标示的ACT和用抗原RNA(LIP)处理后时间点，侧位小鼠的生物发光成像示例。非彩色图像代表叠加在灰度参考图像上的光强度(黑色，强度最低；白色到深灰色，最强烈)。C)示出在标示的配制的核苷修饰的细胞因子RNA的存在下，使用CLDN6-RNA(LIP)/ctrl-RNA(LIP)的扩增轮期间和之后的生物发光定量(平均值+/-s.e.m.)。灰色，垂直线表示RNA(LIP)疫苗接种的时间点。ACT：过继性T细胞转移；TBI：全身照射，BLI：生物发光成像，Luc：有效萤火虫荧光素酶；BBz：4-1BB；z：CD3ζ。
图9：体内扩增的CLDN6-CAR-BBz T细胞的提高的抗肿瘤活性
在4Gy全身照射前20天和以1x106的单剂量i.v.的CLDN6-CAR-BBz或ctrl-CAR-BBz转导的Balb/c-Thy1.1+ T细胞的ACT前26天，将5x105个CT26肿瘤细胞皮下移植到Balb/c小鼠中(n＝10/组)。在T细胞处理的时间点，小鼠出现确立的肿瘤，平均约80mm3。使用卡尺每周测定肿瘤体积3次，并根据以下公式计算：V＝1/2(长x宽2)，使用肿瘤的最大长度和宽度。A)进行的小鼠实验的示意图概述。B)示出在CLDN6-CAR-BBz和ctrl-CAR-BBz T细胞处理的动物中直到第40天的平均肿瘤体积。数据表示为所有小鼠/组的平均值±SEM。ACT用虚线表示，并且RNA(LIP)处理用灰线表示。
图10：低剂量的体内扩增的CLDN6-CAR T细胞的恢复的抗肿瘤效力
在单剂量i.v.的低剂量(1x105)或高剂量(1x106)CLDN6-CAR-BBz转导的或者1x107个未转导的人T细胞的ACT前30天，皮下移植5x106个OV90-SC12肿瘤细胞(n＝9/组)。所用的T细胞产品根据缩短的转导方法(7天后已经收获)在GMP设施中生产。将与转导的T细胞相同的方式处理的未转导的T细胞用作阴性对照。将指示的T细胞产物解冻，用PBS洗涤，并直接注射到荷瘤小鼠中。此外，接受低剂量CAR T细胞的小鼠进一步疫苗接种20μg所标示的编码CLDN6或对照抗原的RNA(LIP)。使用卡尺每周测定肿瘤体积3次，并根据以下公式计算：V＝1/2(长x宽2)，使用肿瘤的最大长度和宽度。当肿瘤体积超过1500mm3或肿瘤破溃时处死动物。A)进行的小鼠实验的示意图概述。B)在过继性转移当天通过流式细胞术分析转导的人CD4+和CD8+ T细胞上的CAR表面表达。标示的数字代表母群体的频数(表示为％)。C)用不同剂量的CLDN6-CAR-BBz+/-RNA(LIP)或对照T细胞处理的动物的肿瘤生长曲线。数据表示为所有小鼠/组的平均值±SEM。ACT用虚线表示，并且RNA(LIP)处理用灰线表示。D)在ACT后2.5周，使用流式细胞术分析外周血中的T细胞持久性和CAR表面表达。示出代表性的点图。数字代表母群体的频数。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗包括但不限于实体瘤的癌症的组合物和方法。本发明涉及转导以表达CAR的细胞(如T细胞)的过继性细胞转移策略。CAR是将对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性(其优选基于抗体)与激活T细胞受体的胞内结构域结合的分子，以产生表现出特定细胞免疫活性(例如，特定抗肿瘤细胞免疫活性)的嵌合蛋白。优选地，可以对细胞进行遗传修饰以在其表面稳定表达CAR，从而赋予不依赖于MHC的新抗原特异性。本发明一般地涉及遗传修饰以稳定表达期望CAR的T细胞。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。
本发明的CAR将CLDN6抗原结合结构域(优选特定抗体的结构域)与胞内结构域组合成单个嵌合蛋白，所述胞内结构域包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ链的结构域。在一实施方案中，本发明的CAR包含胞外结构域(其包含CLDN6抗原结合结构域)、跨膜结构域和胞内结构域(其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ链的结构域)。在一实施方案中，跨膜结构域与CAR中的结构域之一不天然地相关。在一实施方案中，跨膜结构域与CAR中的结构域之一天然地相关。在一实施方案中，跨膜结构域通过氨基酸取代进行修饰，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。优选地，跨膜结构域源自CD8α。
本发明还提供CAR T细胞及其用于过继性治疗的方法。在一实施方案中，本发明的CAR T细胞可以通过将包含期望CAR的逆转录病毒如慢病毒载体引入细胞产生，例如包含抗CLDN6、CD8α铰链和跨膜结构域以及4-1BB和CD3-ζ信号传导结构域的CAR。本发明的CAR T细胞优选能够在体内复制，导致长期持续存在，其导致持续的肿瘤控制。
在一实施方案中，本发明涉及给药表达期望CAR的遗传修饰的T细胞，用于治疗患有癌症或有患癌症风险的患者。优选地，在治疗中使用自体细胞。在一实施方案中，从需要治疗的患者收集自体PBMC，并且使用本文所述和本领域已知的方法激活和扩增T细胞，然后输回患者。
在一实施方案中，本发明一般地涉及对患有表达CLDN6的癌症或有发展表达CLDN6的癌症的风险的患者的治疗。本发明包括使用表达抗CLDN6-CAR的T细胞，所述CAR包含CD3-ζ和4-1BB共刺激结构域。本发明的CAR T细胞可以进行稳健的体内T细胞扩增，特别是如果与其同源抗原接触，并且可以以高水平持续延长的时间。在一些情况下，注入患者的本发明的CAR-T细胞可以消除患者体内的癌细胞。
定义
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制本发明的范围，本公开的范围仅由所附权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
在下文中，将描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，然而应当理解，它们可以以任何方式和以任何数量组合以产生额外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选元素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的元素的任何排列和组合都视为由本申请说明书所公开。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或相等的任何方法和材料可以在实践中用于测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，会使用以下术语。
在这个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及其变化如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，虽然在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用来指一个或一个以上(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如，“一个元件”表示一个元件或一个以上元件。
如本文所用，当指可测量的值如量、持续时间等时，“约”表示涵盖指定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及仍然更优选±0.1％的变化。
如本文所用，术语“抗体”是指结合、优选特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分或片段。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以各种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,in:Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。
B细胞表达的抗体有时称作BCR(B细胞受体)或抗原受体。这类蛋白中包括的5个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的主要抗体，如唾液、泪液、乳汁、呼吸道和泌尿生殖道的胃肠分泌物和粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，IgM是初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒中很重要。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以充当抗原受体。IgE是一种免疫球蛋白，其通过在暴露于反应原时引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导立即超敏反应。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，通常包含完整抗体的抗原决定可变区。
抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“抗体重链”是指在它们天然存在的构型中，抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链”是指在它们天然存在的构型中，抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较小者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的激活，或者两者。技术人员会理解任何大分子，包括几乎所有蛋白或肽，都可以作为抗原。此外，抗原可以是天然存在或重组的抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”是指特定的过度增殖性疾病(如癌症)所共有的抗原。
紧密连接蛋白是位于上皮和内皮紧密连接处的整合膜蛋白。预测紧密连接蛋白具有4个跨膜区段，带有2个胞外环，以及位于细胞质中的N和C端。称作EC1或ECL1的第一胞外环平均由53个氨基酸组成，而称作EC2或ECL2的第二胞外环由大约24个氨基酸组成。跨膜蛋白的紧密连接蛋白(CLDN)家族在维持上皮和内皮紧密连接中起关键作用，并且还可能在维持细胞骨架和细胞信号传导中起作用。
紧密连接蛋白6(CLDN6)是一种癌胚基因，在小鼠和人干细胞以及定型为上皮细胞命运的胚状体中表达(Turksen,K.et al.(2001)Dev Dyn 222,292-300；Anderson WJ.etal.(2008)Dev Dyn 237,504-12；Turksen K.et al.(2002)Development,129,1775-84；Assou S.et al.(2007)Stem Cells 25,961-73)。作为肿瘤相关抗原，它可以归类为分化抗原，因为它在表皮形态发生的早期阶段表达，对表皮分化和屏障形成至关重要。此外在舌、皮肤、胃和乳房的上皮组织或新生儿正常上皮组织中观察到表达(Abuazza G.et al.(2006),Am J Physiol Renal Physiol 291,1132-1141；Troy T.C.et al.(2007),Molecular Biotechnology 36,166-74；Zhao L.et al.(2008),Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol 294,1856-1862)。除此之外，自己的数据还显示CLDN6在人胎盘、膀胱、子宫内膜、前列腺和外周神经中低表达或极低表达，以及CLDN6在不同癌症中经常过表达。已证实CLDN6在肿瘤中过表达，包括小儿脑肿瘤、胃腺癌和生殖细胞肿瘤以及内脏癌(如卵巢癌)。还已证实CLDN6在胃癌细胞中的过表达导致侵袭、迁移和增殖增加，表明CLDN6是不良预后的标志物，并且在维持恶性表型中发挥潜在作用。此外，已表明CLDN6在乳腺癌细胞系中通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来发挥癌症抑制物的功能。
已发现CLDN6在例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌中表达。CLDN6是特别优选的靶标用于预防和/或治疗卵巢癌，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌，肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌，胃癌，乳腺癌，肝癌，胰腺癌，皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌，恶性黑素瘤，头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤，肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤，胆管癌，膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌，肾癌，特别是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌，结肠癌，小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌，睾丸胚胎性癌，胎盘绒毛膜癌，宫颈癌，睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎性睾丸癌，子宫癌，生殖细胞肿瘤如畸胎癌或胚胎性癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及它们的转移形式。在一实施方案中，与CLDN6表达相关的癌症疾病选自卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，所述卵巢癌是癌或腺癌。优选地，所述肺癌是癌或腺癌，并且优选细支气管癌(bronchiolar cancer)如细支气管癌(bronchiolar carcinoma)或细支气管腺癌。
术语“CLDN6”优选涉及人CLDN6，并且特别涉及这样的蛋白，其包含序列表的SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者所述氨基酸序列变体，优选由其组成。CLDN6的第一胞外环优选包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的氨基酸28-80，更优选氨基酸28-76。CLDN6的第二胞外环优选包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的氨基酸138-160，优选氨基酸141-159，更优选氨基酸145-157。所述第一和第二胞外环优选形成CLDN6的胞外部分。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面关联”表示分子(如CLDN6)与细胞的质膜关联并位于细胞的质膜上，其中分子的至少一部分面向细胞的细胞外空间，并且可从所述细胞的外部接近，例如，由位于细胞外部的抗体。在这个上下文中，一部分是优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。所述关联可以是直接或间接的。例如，所述关联可以是通过一个或多个跨膜结构域，一个或多个脂质锚定物，或者通过与可以在细胞质膜的外小叶上发现的任何其他蛋白、脂质、糖或其他结构相互作用。例如，与细胞表面关联的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一蛋白(跨膜蛋白)相互作用而与细胞表面关联的蛋白。
“细胞表面”或“细胞的表面”按照其在本领域中的正常含义使用，因此包括可由蛋白和其他分子接近结合的细胞外部。
“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或相似术语表示包括针对特征是表达抗原的细胞，特别是特征是用I类或II类MHC呈递抗原的细胞的细胞应答。细胞应答涉及称作T细胞或T淋巴细胞的细胞，其充当“助手”或“杀手”。辅助性T细胞(也称作CD4+ T细胞)通过调节免疫应答发挥中心作用，而杀伤细胞(也称作细胞毒性T细胞、细胞溶解性T细胞、CD8+ T细胞或CTL)杀死患病细胞如癌细胞，防止产生更多患病细胞。
术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即，免疫系统识别(即结合)的分子的一部分或片段，例如，抗体或CAR识别的分子的一部分或片段。例如，表位是免疫系统识别的抗原上的离散的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于对前者而非后者的结合在变性溶剂的存在下丧失。优选地，表位能够引发针对抗原或表达抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。蛋白(如肿瘤抗原)的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分，并且优选长度为5-100、优选5-50、更优选8-30、最优选10-25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物(其是所述抗原的片段(例如，蛋白降解为肽))以及这些片段中的一个或多个与MHC分子的关联(例如，通过结合)用于通过细胞(优选特定T细胞的抗原呈递细胞)呈递。
抗原呈递细胞(APC)是在主要组织相容性复合物(MHC)的背景下在其表面展示抗原的细胞。T细胞可以利用它们的T细胞受体(TCR)识别这种复合物。抗原呈递细胞加工抗原并将它们呈递至T细胞。根据本发明，术语“抗原呈递细胞”包括专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
专职抗原呈递细胞在内化抗原方面非常有效，通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用，然后在它们的膜上展示结合至II类MHC分子的抗原片段。T细胞识别并与抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物相互作用。然后抗原呈递细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞的激活。共刺激分子的表达是专职抗原呈递分子的定义性特征。专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最广泛的抗原呈递，并且可能是最重要的抗原呈递细胞，巨噬细胞，B细胞和某些激活的上皮细胞。
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚群。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞非特异性地吞噬并通过水解和氧化攻击杀死巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体降解。来自降解的蛋白的肽展示在巨噬细胞表面上，在那里它们可以被T细胞识别，并且它们可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T和B细胞激活并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一实施方案中，所述巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一实施方案中，树突细胞源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟的细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞激活潜力。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体(如病毒和细菌)。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们会活化为成熟的树突细胞并开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将它们的蛋白降解为小片，并且在成熟时利用MHC分子将那些片段呈递在它们的细胞表面。同时，它们上调在T细胞激活中充当共受体的细胞表面受体(如CD80、CD86和CD40)，大大增强它们激活T细胞的能力。它们还上调趋化性受体CCR7，其诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结。这里它们充当抗原呈递细胞，并且通过向它们呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号来激活辅助性T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可以活跃地诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一实施方案中，所述树突细胞是脾树突细胞。
根据本发明，术语“CAR”(或“嵌合抗原受体”)涉及包含单个分子或分子复合物的人工受体，其识别即结合靶细胞(如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(例如通过抗原结合结构域结合至靶细胞表面上表达的抗原)，并且可以赋予在细胞表面上表达所述CAR的免疫效应细胞(如T细胞)特异性。优选地，CAR对靶结构的识别导致表达所述CAR的免疫效应细胞的激活。CAR可以包含一个或多个蛋白单元，所述蛋白单元包含一个或多个如本文所述的结构域。术语“CAR”不包括T细胞受体。
用表达嵌合抗原受体的CAR工程化的T细胞的过继细胞转移疗法是一种有前途的抗癌治疗方法，因为可以工程化CAR修饰的T细胞以靶向几乎任何肿瘤抗原。例如，可以将患者的T细胞遗传工程化(遗传修饰)以表达特异性地针对患者肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后输回患者体内。
如本文所用的术语“抗肿瘤”是指一种生物效应，其可以表现为肿瘤体积减少，肿瘤细胞数量减少，转移数量减少，首先预防肿瘤发生，预期寿命增加，或者改善与癌症状况相关的各种生理症状。
如本文所用，术语“自体的”指源自相同个体的任何材料，随后将其重新引入该个体。
“同种异体的指源自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的”指源自不同物种的动物的移植物。
术语“同基因的”用来描述源自具有相同基因型的个体或组织的任何事物，即，同一自交系的同卵双胞胎或动物，或者它们的组织。
如本文所用的术语“癌症”定义为特征在于异常细胞的快速且不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或者通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括含有通过肽键互相连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中通常也称作例如肽、寡肽和寡聚体)和长链(其在本领域中一般称作蛋白)，其中有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
如本文所用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员公知核酸是多核苷酸，其可以水解为单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，包括但不限于重组方式，即，从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，使用普通的克隆技术和PCRTM等，以及通过合成方式。如本文所用的术语“多核苷酸”应当广泛解释，并且包括DNA和RNA，包括修饰的DNA和RNA。
在本公开中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基的核苷酸。RNA涵盖但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文中还考虑RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，认为这些改变的RNA是天然存在的RNA的类似物。
在本公开的某些实施方案中，所述RNA是与编码肽或蛋白的RNA转录物有关的信使RNA(mRNA)。如本领域中建立的，mRNA一般包含5'非翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，所述RNA是通过体外转录或化学合成产生的。在一实施方案中，所述mRNA是利用DNA模板通过体外转录产生的，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
在一实施方案中，RNA可以具有修饰的核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸的实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷和/或1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中，本公开的RNA包含5'-帽。在一实施方案中，本公开的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一实施方案中，所述RNA可以通过5'-帽类似物修饰。术语“5'-帽”是指在mRNA分子的5'端发现的结构，并且通常由通过5'至5'三磷酸键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一实施方案中，这个鸟苷在7-位置甲基化。提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中将5'-帽共转录表达至RNA链中，或者可以利用加帽酶转录后连接至RNA。
在一些实施方案中，本公开的RNA包含5'-UTR和/或3'-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中的区域，其转录但不翻译为氨基酸序列，或者涉及RNA分子(如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。5'-UTR，如果存在，位于5'端，蛋白编码区的起始密码子的上游。5'-UTR位于5'-帽(如果存在)的下游，例如直接与5'-帽相邻。3'-UTR，如果存在，位于3'端，蛋白编码区的终止密码子的下游，但是术语“3'-UTR”优选不包括poly(A)尾。因此，3'-UTR位于poly(A)序列(如果存在)的上游，例如与poly(A)序列直接相邻。
在一些实施方案中，本公开的RNA包含3'-poly(A)序列。术语“poly(A)序列”涉及腺嘌呤基(A)残基的序列，其通常位于RNA分子的3'端。根据本公开，在一实施方案中，poly(A)序列包含至少约20、至少约40、至少约80或至少约100，以及达约500、达约400、达约300、达约200或达约150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。
“编码”指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，以便用作模板用于在生物过程中合成其他聚合物或大分子，所述聚合物或大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此所致的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录模板的非编码链均可以称作编码那个基因或cDNA的蛋白或其他产物。
如本文所用，“内源”指来自生物体、细胞、组织或系统或者在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源”指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或者在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列相同性。当两个比较的序列中的一个位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每个中的一个位置被腺嘌呤占据时，则分子在那个位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置的数目除以比较的位置数目X 100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中的6个匹配或同源，则两个序列是60％同源的。一般来说，当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。根据本公开，同源序列表现出氨基酸或核苷酸残基的至少40％、特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％并且优选至少95％、至少98或至少99％相同性。
关于氨基酸序列(肽或蛋白)的“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)是可获得的，例如，通过翻译缺少开放阅读框的3'-端的截短的开放阅读框。在N端缩短的片段(C端片段)是可获得的，例如，通过翻译缺少开放阅读框的5'-端的截短的开放阅读框，只要截短的开放阅读框包含用于启动翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含例如，来自氨基酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
本文中的“变体”或“变体蛋白”或“变体多肽”表示由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白的蛋白。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，或者可以是野生型多肽的修饰形式。优选地，与亲本多肽相比，变体多肽具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。
如本文所用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”表示随后被修饰以产生变体的未修饰的多肽。亲本多肽可以是野生型多肽，或者野生型多肽的变体或工程化形式。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然”表示在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型蛋白或多肽具有未经有意修饰的氨基酸序列。
为了本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构象、亚型(isoform)、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或者两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或多个氨基酸残基被插入到氨基酸序列中的特定位点，尽管随机插入并适当筛选所得产物也是可能的。氨基酸添加变体包含在氨基端和/或羧基端融合的一个或多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸，例如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。包含蛋白N端和/或C端缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被移除，并且另一个残基被插入到其位置。优选在同源蛋白或肽之间不保守的氨基酸序列位置的修饰和/或用具有相似性质的其他氨基酸替换氨基酸。优选地，肽和蛋白变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电或不带电氨基酸的取代。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族中之一的取代。天然存在的氨基酸一般分为四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。在一实施方案中，保守氨基酸取代包括以下组内的取代：
甘氨酸，丙氨酸；
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺，谷氨酰胺；
丝氨酸、苏氨酸；
赖氨酸、精氨酸；和
苯丙氨酸、酪氨酸。
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性程度，优选相同性程度为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，对于参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选对于至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出相似性或相同性程度。在优选的实施方案中，对于参考氨基酸序列的全长给出相似性或相同性程度。用于确定序列相似性、优选序列相同性的比对可以用本领域已知的工具完成，优选使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“百分比相同性”旨在表示在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计的，并且两个序列之间的差异随机分布在其全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较通常通过在将它们最佳比对之后比较这些序列来进行，所述比较通过区段或“比较窗”进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。除了手动之外，用于比较的序列的最佳比对可以通过以下产生：通过Smith and Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法；通过Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源算法；通过Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性检索方法；或通过使用这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics软件包(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)。
通过确定被比较的两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目并将所得结果乘以100，从而获得这两个序列之间的百分比相同性来计算百分比相同性。
如本文所用，术语“功能性变体”是指变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或多种功能，例如，结合至靶分子或有助于结合至靶分子。在一实施方案中，功能性变体单独或与其他元件组合来与亲本分子或序列竞争结合至靶分子。换句话说，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变分子或序列的结合特征。在不同实施方案中，功能性变体的结合可以降低但仍显著存在，例如，功能性变体的结合可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。但是，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能性变体的结合可以增强。
氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)“源自”指定氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的是指第一个氨基酸序列的起源。优选地，源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与那个特定序列或其片段相同、基本相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是那个特定序列或其片段的变体。
如本文所用，“指导材料”或“说明书”包括可以用来传达本发明的组合物和方法的可用性的出版物、记录、图标或任何其他表达介质。本发明的试剂盒的指导材料可以例如粘帖至包含本发明的组合物的容器，或者与包含组合物的容器一起运送。或者，指导材料可以与容器分开运送，目的是指导材料和组合物由接受者合作使用。
“分离的”表示从自然状态改变或脱离。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如，宿主细胞。
在本发明的上下文中，使用常见核酸碱基的以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，而“U”是指尿苷。
如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供在体内实现显著水平的基因转移的方式。
术语“可操作地连接”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则将启动子可操作地连接至编码序列。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区时，在同一阅读框中。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示相对于来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平，患者的特定组织或器官内来自疾病区域如实体瘤的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。
如本文所用的术语“启动子”定义为细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，需要其启动多核苷酸序列的特异性转录。
如本文所用，术语“启动子/调节序列”表示可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物的表达所需要的核酸序列。在某些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，这个序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需要的其他调节元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子是核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，其导致在细胞的大部分或所有生理条件下在细胞中产生所述基因产物。
“诱导型”启动子是核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，其基本上仅在细胞中存在对应于所述启动子的诱导物时导致在细胞中产生所述基因产物。
“组织特异性”启动子是核苷酸序列，当与基因编码或指定的多核苷酸可操作地连接时，其基本上仅在细胞是对应于所述启动子的组织类型的细胞时导致细胞中产生基因产物。
如本文所用，术语“特异性地结合”表示识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品或受试者中的其他分子的分子，如抗体或CAR。例如，特异性地结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个其他物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身不改变抗体的特异性分类。在另一实例中，特异性地结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。但是，这种交叉反应性本身不改变抗体的特异性分类。在某些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以用于指抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用，表示相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定蛋白结构而不是一般的蛋白。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的、未标记的A)的存在会减少结合至抗体的标记的A的量。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用的短语“在转录控制下”或“可操作地连接”表示启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用来将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒以及病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当理解为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
描述
本发明提供用于治疗癌症等疾病的组合物和方法。所述癌症可以是实体瘤、原发性或转移性肿瘤。在一实施方案中，所述癌症是表达CLDN6的癌症。在一实施方案中，所述癌症选自卵巢癌，特别是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌，肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，特别是鳞状细胞肺癌和腺癌，胃癌，乳腺癌，肝癌，胰腺癌，皮肤癌，特别是基底细胞癌和鳞状细胞癌，恶性黑素瘤，头颈癌，特别是恶性多形性腺瘤，肉瘤，特别是滑膜肉瘤和癌肉瘤，胆管癌，膀胱癌，特别是移行细胞癌和乳头状癌，肾癌，特别是肾细胞癌，包括透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌，结肠癌，小肠癌，包括回肠癌，特别是小肠腺癌和回肠腺癌，睾丸胚胎性癌，胎盘绒毛膜癌，宫颈癌，睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎性睾丸癌，子宫癌，生殖细胞肿瘤如畸胎癌或胚胎性癌，特别是睾丸的生殖细胞肿瘤，以及它们的转移形式。在一实施方案中，与CLDN6表达相关的癌症疾病选自卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，所述卵巢癌是癌或腺癌。优选地，所述肺癌是癌或腺癌，并且优选细支气管癌如细支气管癌或细支气管腺癌。
本发明提供包含胞外和胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包含靶标特异性结合元件，也称作抗原结合部分或结构域。胞内结构域或胞质结构域包含4-1BB共刺激信号区和CD3-ζ链部分。4-1BB共刺激信号区是指包含共刺激分子4-1BB的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或者在CAR的胞质结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域或区域。在实施方案中，间隔结构域提供抗原结合结构域的柔性。如本文所用，术语“间隔结构域”一般表示起到将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域或胞质结构域的作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可以包含达300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，并且最优选25-50个氨基酸。在实施方案中，间隔结构域具有约10-300个氨基酸、约10-200个氨基酸、约10-175个氨基酸、约10-150个氨基酸、约10-125个氨基酸、约10-100个氨基酸、约10-75个氨基酸、约10-50个氨基酸、约10-40个氨基酸、约10-30个氨基酸、约10-20个氨基酸或约10-15个氨基酸，并且包括任何所列范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔结构域源自免疫球蛋白样分子的铰链区。在实施方案中，间隔结构域包含来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的铰链区的全部或部分，并且可以包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，间隔结构域源自CD8α的铰链区序列。
在一实施方案中，本发明提供一种工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中所述CAR工程化的细胞表现出抗肿瘤特性。当在细胞中表达时，本发明的CAR能够基于CAR的抗原结合特异性重新定向抗原识别。在一实施方案中，CLDN6在本文公开的癌症类型的细胞上表达。当结合至其同源抗原时，CAR工程化的细胞影响肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞无法生长，促使其死亡，或者受到影响，从而减少或消除患者的肿瘤负荷。
根据本发明，CLDN6抗原结合部分通过源自CD8α的铰链结构域与包含4-1BB(CD137)信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域的组合的胞内结构域融合。与未工程化表达4-1BB(CD137)的其他相同的CAR T细胞相比，包含4-1BB(CD137)信号传导结构域显著增加CAR T细胞的抗肿瘤活性和体内持久性。
抗原结合部分
本发明的CAR包含靶标特异性结合元件，也称作抗原结合部分或抗原结合结构域，其一般是CAR的胞外结构域的一部分。抗原结合结构域识别配体，所述配体在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标志物。具体地，本发明的CAR靶向肿瘤细胞上的肿瘤抗原CLDN6。
在一实施方案中，本发明的CAR中的CLDN6结合结构域特异性地结合CLDN6。在一实施方案中，本发明的CAR中的CLDN6结合结构域结合的CLDN6在癌细胞中表达。在一实施方案中，CLDN6在癌细胞表面上表达。在一实施方案中，CLDN6结合结构域结合CLDN6的胞外结构域或胞外结构域中的表位。在一实施方案中，CLDN6结合结构域结合活细胞表面上存在的CLDN6的天然表位。在一实施方案中，CLDN6结合结构域结合CLDN6的第一胞外环，优选CLDN6的氨基酸位置28-76，或者CLDN6的第二胞外环，优选CLDN6的氨基酸位置141-159。在特定实施方案中，CLDN6结合结构域结合CLDN6上不存在于CLDN9上的表位。优选地，CLDN6结合结构域结合CLDN6上不存在于CLDN4和/或CLDN3上的表位。最优选地，CLDN6结合结构域结合CLDN6上的表位，所述表位不存在于CLDN6以外的CLDN蛋白上。CLDN6结合结构域优选结合CLDN6但不结合CLDN9，并且优选不结合CLDN4和/或CLDN3。优选地，CLDN6结合结构域是CLDN6特异性的。优选地，CLDN6结合结构域结合细胞表面上表达的CLDN6。
在本发明的一实施方案中，CLDN6抗原结合结构域包含对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白重链可变区(VH)和对CLDN6具有特异性的免疫球蛋白轻链可变区(VL)。在一实施方案中，所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)通过肽接头连接，优选包含氨基酸序列(GGGGS)3的肽接头。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含选自SEQ ID NO:3、5、7和9的氨基酸序列或者其功能性变体。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含选自SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24的氨基酸序列或者其功能性变体。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:x的氨基酸序列或其功能性变体的重链可变区(VH)，以及
(ii)包含SEQ ID NO:x+1的氨基酸序列或其功能性变体的轻链可变区(VL)；
其中x选自3、5、7和9。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)包含选自SEQ ID NO:3、5、7和9的氨基酸序列或者其功能性变体的重链可变区(VH)，以及
(ii)包含选自SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24的氨基酸序列或者其功能性变体的轻链可变区(VL)。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能性变体的重链可变区(VH)，以及
(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能性变体的轻链可变区(VL)。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能性变体的重链可变区(VH)，以及
(ii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或其功能性变体的轻链可变区(VL)。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能性变体的重链可变区(VH)，以及
(ii)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或其功能性变体的轻链可变区(VL)。
在某些优选的实施方案中，CLDN6结合结构域包含选自以下可能性(i)-(xi)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合：
(i)VH包含SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，
(ii)VH包含SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，
(iii)VH包含SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，
(iv)VH包含SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，
(v)VH包含SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，
(vi)VH包含SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，
(vii)VH包含SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段。
在一特别优选的实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的以下组合：
VH包含SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段，并且VL包含SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列或其功能性变体，或者所述氨基酸序列或功能性变体的片段。
术语“片段”特别指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或多个互补决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一实施方案中，所述一个或多个互补决定区(CDR)选自一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。在一特别优选的实施方案中，术语“片段”是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一实施方案中，如本文所述的包含一个或多个CDR、一组CDR或者CDR组的组合的CLDN6结合结构域包含所述CDR连同其间的框架区。优选地，该部分还包括第一和第四框架区之一或两者的至少约50％，所述50％是第一框架区的C端50％和第四框架区的N端50％。通过重组DNA技术进行的结合结构域构建可以导致将接头编码的残基N或C端引入可变区，引入所述接头以促进克隆或其他操作步骤，包括引入接头以连接可变区或连接可变区至其他蛋白序列，包括如本文所述的序列。
在一实施方案中，如本文所述的包含一个或多个CDR、一组CDR或者CDR组的组合的结合结构域包含在人抗体框架中的所述CDR。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含本文描述的重链可变区(VH)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，例如，包含选自SEQ ID NO:3、5、7和9的氨基酸序列或其功能性变体的重链可变区(VH)。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含本文描述的轻链可变区(VL)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，例如，包含选自SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24的氨基酸序列或其功能性变体的轻链可变区(VL)。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组合的重链可变区(VH)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，例如，其中VH包含SEQID NO:5表示的氨基酸序列或其功能性变体，并且VL包含SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列或其功能性变体的组合，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组合的轻链可变区(VL)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:x的重链可变区(VH)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，或者其功能性变体，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:x+1的轻链可变区(VL)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，或者其功能性变体；
其中x选自3、5、7和9。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:5的重链可变区(VH)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，或者其功能性变体，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:6的轻链可变区(VL)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，或者其功能性变体。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:5的重链可变区(VH)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，或者其功能性变体，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:4的轻链可变区(VL)的至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列，或者其功能性变体。
术语“至少一个、优选两个、更优选所有三个CDR序列”优选涉及至少CDR3序列，任选地与CDR1序列和/或CDR2序列组合。
选自SEQ ID NO:3、5、7和9的重链可变区(VH)的CDR1优选分别包括SEQ ID NO:3、5、7和9所示序列的氨基酸26-33。选自SEQ ID NO:3、5、7和9的重链可变区(VH)的CDR2优选分别包括SEQ ID NO:3、5、7和9所示序列的氨基酸51-58。选自SEQ ID NO:3、5、7和9的重链可变区(VH)的CDR3优选分别包括SEQ ID NO:3、5、7和9所示序列的氨基酸97-106。
选自SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24的轻链可变区(VL)的CDR1优选分别包括SEQ IDNO:4、6、8、10、23和24所示序列的氨基酸27-31。选自SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24的轻链可变区(VL)的CDR2优选分别包括SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24所示序列的氨基酸49-51。选自SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24的轻链可变区(VL)的CDR3优选分别包括SEQ ID NO:4、6、8、10、23和24所示序列的氨基酸88-97。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含CDR3序列Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3，其中Xaa1是任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更优选Phe或Tyr，最优选Tyr，Xaa2是任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更优选Phe或Tyr，最优选Tyr，并且Xaa3是任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu。在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含CDR3序列Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3或Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3如上文所定义。在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含CDR3序列Asp Xaa1 GlyXaa2 Val Xaa3 Asp，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3如上文所定义。在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含CDR3序列Ala Arg Asp Xaa1 GlyXaa2 Val Xaa3 Asp Tyr，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3如上文所定义。在一实施方案中，根据前述实施方案的CLDN6结合结构域包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含根据SEQ IDNO:16的CDR1序列或其功能性变体和/或根据SEQ ID NO:17的CDR2序列或其功能性变体。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDR3序列Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro，其中Xaa1是任何氨基酸，优选Ser或Asn，最优选Ser，Xaa2是任何氨基酸，优选Tyr、Ser、Ile、Asn或Thr，更优选Tyr、Ser或Asn，最优选Asn，并且Xaa3是任何氨基酸，优选Ser或Tyr，更优选Tyr。在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDR3序列Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3如上文所定义。在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDR3序列Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro TrpThr，其中Xaa1、Xaa2和Xaa3如上文所定义。在一实施方案中，根据前述实施方案的CLDN6结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含根据SEQ ID NO:21的CDR1序列或其功能性变体和/或根据SEQ ID NO:22的CDR2序列或其功能性变体。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3、Asp Xaa1 Gly Xaa2Val Xaa3、Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp、Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp和Ala ArgAsp Xaa1Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr的CDR3序列，其中Xaa1是任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更优选Phe或Tyr，最优选Tyr，Xaa2是任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更优选Phe或Tyr，最优选Tyr，并且Xaa3是任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含选自Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro、Gln Arg Xaa1 Xaa2Xaa3Pro Pro、Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr的CDR3序列，其中Xaa1是任何氨基酸，优选Ser或Asn，最优选Ser，Xaa2是任何氨基酸，优选Tyr、Ser、Ile、Asn或Thr，更优选Tyr、Ser或Asn，最优选Asn，并且Xaa3是任何氨基酸，优选Ser或Tyr，更优选Tyr。
在一实施方案中，根据前述实施方案的CLDN6结合结构域包含：(i)重链可变区(VH)，其包含根据SEQ ID NO:16的CDR1序列或其功能性变体和/或根据SEQ ID NO:17的CDR2序列或其功能性变体，和/或(ii)轻链可变区(VL)，其包含根据SEQ ID NO:21的CDR1序列或其功能性变体和/或根据SEQ ID NO:22的CDR2序列或其功能性变体。
在一实施方案中，CLDN6结合结构域与上述CLDN6结合结构域竞争CLDN6结合和/或具有上述CLDN6结合结构域对CLDN6的特异性。在这些和其他实施方案中，CLDN6结合结构域可以与上述CLDN6结合结构域高度同源。考虑的优选的CLDN6结合结构域具有与上述CLDN6结合结构域的CDR区相同或高度同源的CDR区。“高度同源”考虑在每个CDR区中可以产生1-5，优选1-4，如1-3或1或2个取代。
术语“竞争”是指两个结合分子之间竞争结合靶抗原。如果两个结合分子不互相阻断结合靶抗原，则这类结合分子是非竞争性的，并且这表明所述结合分子不结合靶抗原的相同部分，即表位。本领域技术人员熟知如何测试结合分子(如抗体)竞争结合靶抗原。这种方法的一个实例是所谓的交叉竞争测定，其可以例如作为ELISA或通过流式细胞术进行。例如，可以进行基于ELISA的测定，通过用抗体之一包被ELISA板孔；添加竞争抗体和His标记的抗原/靶标并检测添加的抗体是否抑制His标记的抗原结合包被抗体，例如，通过添加生物素化的抗His抗体，然后添加链霉亲和素-聚-HRP，并且进一步用ABTS将反应显影并在405nm处测量吸光度。例如，流式细胞术测定可以这样进行，将表达抗原/靶标的细胞用过量的未标记的抗体孵育，将细胞与次优浓度的生物素标记的抗体孵育，然后用荧光标记的链霉亲和素孵育并通过流式细胞术分析。
如果两个结合分子结合相同抗原和相同表位，则它们具有“相同特异性”。待测试的分子是否识别与某个结合分子相同的表位，即，结合分子是否结合相同表位，可以通过技术人员已知的不同方法测试，例如，基于结合分子(如抗体)对相同抗原的竞争。结合分子之间的竞争可以通过交叉阻断测定来检测。例如，竞争性ELISA测定可以用作交叉阻断测定。例如，可以将靶抗原包被在微量滴定板的孔上，并且可以添加抗原结合抗体和候选竞争测试抗体。结合至孔中抗原的抗原结合抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争测试抗体的结合能力间接相关。具体地，候选竞争测试抗体对相同表位的亲和力越大，结合至抗原包被的孔的抗原结合抗体的量越少。结合至孔的抗原结合抗体的量可以通过用可检测或可测量的标记物质标记抗体来测量。
优选地，本发明的CAR中的抗原结合部分是抗CLDN6 scFV，其中所述抗CLDN6scFV优选包含SEQ ID NO:35所示的序列或其功能性变体。
跨膜结构域
本发明的CAR设计为包含融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一实施方案中，所述跨膜结构域与CAR中的结构域之一不天然相关。在一实施方案中，所述跨膜结构域与CAR中的结构域之一天然相关。在一实施方案中，通过氨基酸取代修饰跨膜结构域以避免这类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可以源自天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明中特别使用的跨膜区可以源自(即至少包含跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。或者，跨膜结构域可以合成的，在这种情况下其主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每个末端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
优选地，本发明的CAR中的跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。在一实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其功能性变体。
在某些情况下，本发明的CAR包含形成跨膜结构域和胞外结构域之间的连接的CD8α铰链结构域。在一实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能性变体。
胞质结构域
本发明的CAR的胞质结构域或胞内信号传导结构域负责激活其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白部分。虽然通常可以采用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不必使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可以用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。因此术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
已知单独通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要二次或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活是由两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)和以不依赖抗原的方式起作用来提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
本发明的CAR包含源自CD3-ζ的初级胞质信号传导序列。此外，本发明的CAR的胞质结构域设计为包含与源自4-1BB的共刺激信号传导区组合的CD3-ζ信号传导结构域。
术语“4-1BB”是指也称作CD137的膜受体蛋白，其是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，作为一种辅助分子在激活的T细胞表面上表达。4-1BB的分子量为55kDa，并且是同源二聚体。
T细胞表面糖蛋白CD3-ζ链也称作T细胞受体T3ζ链或CD247，是一种在人类中由CD247基因编码的蛋白。T细胞受体zeta(ζ)与T细胞受体α/β和γ/δ异源二聚体以及CD3-γ、-δ和-ε一起形成T细胞受体-CD3复合物。ζ链在将抗原识别耦合至几个胞内信号转导通路方面起着重要作用。抗原的低表达导致免疫应答受损。
本发明的CAR的胞质信号部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定顺序互相连接。任选地，长度优选在2至10个氨基酸之间的短寡或多肽接头可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
因此，本发明的CAR中的胞质结构域设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一实施方案中，本发明的CAR的胞质结构域设计为包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其功能性变体，并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其功能性变体。
在一实施方案中，本发明的CAR包含引导新生蛋白进入内质网的信号肽。在一实施方案中，信号肽位于抗原结合结构域之前。在一实施方案中，信号肽源自免疫球蛋白如IgG。在一实施方案中，信号肽包含根据SEQ ID NO:25的序列或其功能性变体。
在一实施方案中，本发明的CAR按以下顺序包含以下元件：NH2–CLDN6抗原结合结构域-跨膜结构域–4-1BB共刺激结构域–CD3-ζ信号传导结构域–COOH。
在一实施方案中，本发明的CAR按以下顺序包含以下元件：NH2–CLDN6抗原结合结构域-CD8α铰链-CD8α跨膜结构域–4-1BB共刺激结构域–CD3-ζ信号传导结构域–COOH。
在一实施方案中，本发明的CAR包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其功能性变体。
载体
本发明涵盖核酸构建体如DNA构建体，其包含编码本发明的CAR的序列。
本发明还提供其中插入本发明的DNA的载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合并在子细胞中增殖。慢病毒载体比源自癌逆转录病毒(如小鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并将构建体并入表达载体来实现。载体可以适合真核生物中的复制和整合。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、起始序列以及可用于调节期望核酸序列表达的启动子。
可以将本发明的核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆至载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬粒、噬菌体衍生物、动物病毒以及粘粒和转座子。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。此外，可以以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术是本领域公知的，并且例如在Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的载体包含至少在一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点以及一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可以使用本领域已知的技术将所选基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近已显示许多启动子也包含位于起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，从而当元件相互倒置或移动时，仍保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子，单个元件看来可以协同或独立地激活转录。合适启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。但是，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃巴(Epstein-Barr)病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子，还考虑诱导型启动子作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当期望这种表达时，能够开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评价CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可以包含选择标记基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染过程。选择标记和报告基因都可以侧翼有适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。可用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定潜在的转染细胞和评价调节序列的功能性。一般来说，报告基因是受者生物体或组织中不存在或不表达并且编码多肽的基因，通过一些易于检测的特性(如酶促活性)证明所述多肽的表达。已将DNA引入受者细胞之后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因，或者绿色荧光蛋白基因。合适的表达系统是公知的，并且可以利用已知技术制备或商业获得。
在细胞中引入并表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学方法将表达载体转移至宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
将所关注的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人)细胞的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
细胞
与本发明的CAR系统结合使用并且其中可以引入编码本发明的CAR系统的核酸(DNA或RNA)的细胞包括具有溶解潜力的任何细胞，特别是淋巴样细胞，并且优选是T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。当激活时，这些细胞毒性淋巴细胞中的每种触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的一种或两种触发靶细胞的破坏。第一，当激活时，T细胞释放细胞毒素如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。第二，可以通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导凋亡。细胞毒性淋巴细胞优选是自体细胞，虽然可以使用异源细胞或同种异体细胞。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+ T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+ T细胞)，其包含细胞溶解性T细胞。术语“抗原特异性T细胞”或相似术语涉及识别T细胞靶向的抗原并优选发挥T细胞的效应子功能的T细胞。如果细胞杀死表达抗原的靶细胞，则认为T细胞是抗原特异性的。可以利用各种标准技术中的任一种，例如，在铬释放测定或增殖测定内评价T细胞特异性。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。
如本文所用，术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达以及不存在T细胞受体(CD3)所定义的外周血淋巴细胞的亚群。如本文提供的，NK细胞还可以从干细胞或祖细胞分化而来。
本发明的上下文中的术语“效应功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀伤患病细胞如肿瘤细胞，或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤传播和转移。优选地，本发明的上下文中的效应功能是T细胞介导的效应功能。这类功能在辅助性T细胞(CD4+ T细胞)的情况下包括释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括消除细胞，即，特征是表达抗原的细胞，例如，通过凋亡或穿孔素介导的细胞溶解，细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的产生，以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞溶解性杀伤。
在本发明的上下文中术语“免疫效应细胞”或“免疫反应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。“免疫反应细胞”优选能够结合抗原(如细胞表面上表达的抗原)并介导免疫应答。例如，免疫效应细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫效应细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+ T细胞。根据本发明，术语“免疫效应细胞”还包括用合适的刺激可以成熟为免疫细胞(如T细胞，特别是T辅助细胞，或细胞溶解性T细胞)的细胞。免疫效应细胞包含CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞以及未成熟和成熟的B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为细胞溶解性T细胞，与免疫系统的克隆选择相似。
优选地，“免疫效应细胞”以某种程度的特异性识别抗原，特别是如果存在于患病细胞(如癌细胞)的表面上。优选地，所述识别使得识别抗原的细胞能够响应或反应。如果所述细胞是辅助性T细胞(CD4+ T细胞)，则这样的响应性或反应性可以涉及释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞。如果所述细胞是CTL，则这样的响应性或反应性可以包括消除细胞，即，特征是表达抗原的细胞，例如，通过凋亡或穿孔素介导的细胞溶解。根据本发明，CTL响应性可以包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的产生、上调激活标记(如CD44和CD69)以及特异性细胞溶解性杀伤表达抗原的靶细胞。还可以使用准确指示CTL响应性的人工报告物确定CTL响应性。这样的识别抗原并响应或反应的CTL在本文中也称作“抗原反应性CTL。”
“淋巴样细胞”是这样的细胞，其任选地在合适的修饰之后，例如在CAR转移之后，能够产生免疫应答如细胞免疫应答，或者这种细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞，优选T淋巴细胞、类淋巴母细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文所述的免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是可以修饰以在细胞表面上表达CAR的T细胞。在一实施方案中，淋巴样细胞缺少T细胞受体的内源性表达。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+ T细胞)和包含细胞溶解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+ T细胞)。
T细胞属于一组称为淋巴细胞的白细胞，并且在细胞介导的免疫中发挥核心作用。它们可以通过其细胞表面存在的称为T细胞受体(TCR)的特殊受体与其他淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)区分。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了几个不同的T细胞亚群，每个具有不同的功能。
T辅助细胞在免疫过程中协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活，以及其他功能。这些细胞也称为CD4+ T细胞，因为它们在其表面表达CD4蛋白。辅助性T细胞在抗原呈递细胞(APC)表面表达的MHC II类分子呈递肽抗原时激活。一旦激活，它们迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白，其调节或协助活性免疫应答。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排斥有关。这些细胞也称为CD8+ T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类相关的抗原来识别它们的靶标，MHC I类几乎存在于身体的每个细胞表面。
大多数T细胞具有T细胞受体(TCR)，其以若干蛋白的复合物存在。实际的T细胞受体包括两条独立的肽链，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且称为α-和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表T细胞的小亚群，其表面具有独特的T细胞受体(TCR)。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。这组T细胞比αβT细胞更少(T细胞总数的2％)。
所有T细胞均来源于骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞位于胸腺，并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们的发育，它们会变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最后成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。
通常可以使用标准程序体外或离体制备T细胞。例如，可以使用市售的细胞分离系统从哺乳动物(例如患者)的骨髓、外周血或骨髓或外周血的部分中分离T细胞。或者，T细胞可源自相关或不相关的人、非人动物、细胞系或培养物。包含T细胞的样品可以是，例如外周血单个核细胞(PBMC)。
本发明所用的T细胞可表达内源性T细胞受体或者可以缺乏内源性T细胞受体的表达。
术语“靶向抗原的CAR”指，如上文所述，当存在于免疫效应细胞(如，T细胞)上时，识别抗原(如抗原呈递细胞或患病细胞(如，癌细胞)表面上的抗原)，从而刺激、引发和/或扩增免疫效应细胞，或者发挥免疫效应细胞的效应子功能。
T细胞的来源
在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，T细胞的来源获得自受试者。T细胞可以获得自许多来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术，如FicollTM分离，从采集自受试者的血液单位获得T细胞。在一优选实施方案中，通过单采术(apheresis)获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，用于随后的加工步骤。在本发明的一实施方案中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一可选实施方案中，洗涤液缺少钙，并且可能缺少镁或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。同样，令人惊讶的是，在没有钙的情况下的初始激活步骤导致放大的激活。本领域普通技术人员会很容易理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过根据制造商的说明书使用半自动“流过”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，BaxterCytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤之后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如，不含Ca2+、不含Mg2+的PBS，PlasmaLyte A或者其他有或没有缓冲液的盐水溶液。或者，可以去除单采样品中不需要的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一实施方案中，通过裂解红细胞并去除单核细胞，例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗，从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过正或负选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3x28)-缀合的珠(如
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M-450 CD3/CD28 T)一起孵育足以正选择期望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一实施方案中，时间段为30分钟至36小时或更长。技术人员会认识到，在本发明的上下文中还可以使用多轮选择。
通过负选择富集T细胞群可以用针对负选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，通过抗CD25缀合的珠或其他相似的选择方法去除T调节细胞。
各种方法可用于将CAR构建体引入T细胞，包括基于非病毒的DNA转染、基于转座子的系统、基于病毒的系统和基于RNA的系统。基于非病毒的DNA转染具有低插入诱变的风险。基于转座子的系统可以比不含整合元件的质粒更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易产生，有效且永久地转导T细胞，并且从整合原代人T细胞的角度初步证明是安全的。慢病毒载体也能有效且永久地转导T细胞，但制造成本更高。它们还可能比基于逆转录病毒的系统更安全。
在本发明的一实施方案中，用编码CAR的核酸离体或体内转染T细胞或T细胞祖细胞，以提供遗传修饰以表达CAR的T细胞。
CAR T细胞可以在体内产生，因此使用靶向T细胞的纳米颗粒，几乎是瞬时的。例如，基于聚(β-氨基酯)的纳米颗粒可以与抗CD3e f(ab)片段偶联，以结合T细胞上的CD3。与T细胞结合后，这些纳米颗粒被内吞。由于包含含有微管相关序列(MTAS)和核定位信号(NLS)的肽，它们的内容物，例如编码抗肿瘤抗原CAR的质粒DNA，可以会定向到T细胞核。包含CAR基因表达盒侧翼的具有反向重复(IR)的转座子和编码高活性转座酶的单独质粒，可以允许将CAR载体有效整合到染色体中。允许在纳米颗粒输注后体内产生CAR T细胞的此类系统描述于Smith et al.(2017)Nat.Nanotechnol.12:813-820。
另一种可能是使用CRISPR/Cas9方法有意将CAR编码序列放置在特定基因座。例如，可以将现有的T细胞受体(TCR)敲除，而敲入CAR并将其置于内源性启动子的动态调节控制之下，否则会弱化TCR的表达；参见，例如Eyquem et al.(2017)Nature543:113-117。
在本发明所有方面的一实施方案中，遗传修饰以表达CAR的T细胞被编码CAR的核酸稳定或瞬时转染。因此，编码CAR的核酸整合或不整合到T细胞的基因组中。
在本发明所有方面的一实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自要治疗的受试者。在本发明所有方面的一实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自与要治疗的受试者不同的受试者。
在本发明所有方面的一实施方案中，T细胞对于要治疗的受试者可以是自体的、同种异体的或同基因的。T细胞可以体外进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)。
在本发明所有方面的一实施方案中，灭活遗传修饰以表达CAR的T细胞的内源性T细胞受体和/或内源性HLA的表达。
T细胞的激活和扩增
无论在对T细胞进行遗传修饰以表达期望的CAR之前或之后，可以利用本领域已知的方法激活和扩增T细胞。
一般来说，通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增本发明的T细胞。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群，如通过与固定在表面上抗CD3抗体或其抗原结合片段或者抗CD2抗体接触，或者通过与钙离子载体(ionophore)结合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合所述辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。
在某些实施方案中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例如，提供每种信号的试剂可以在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，可以将试剂偶联至相同表面(即，以“顺式”形式)或偶联至不同表面(即，以“反式”形式)。或者，可以将一种试剂偶联至表面，而另一种试剂在溶液中。在一实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合至细胞表面，而提供初级激活信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。
在一实施方案中，将两种试剂固定在珠上，在相同珠上，即“顺式”，或者固定至不同的珠，即，“反式”。作为示例，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种试剂共同固定至相同的珠。在一实施方案中，结合至珠的CD3:CD28抗体的比例为100:1至1:100。
1:500至500:1的颗粒比细胞的比例可以用来刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒比细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小珠仅可以结合很少细胞，而较大的珠可以结合许多。在某些实施方案中，细胞比颗粒的比例为1:100至100:1，并且在进一步的实施方案中，该比例包含1:9至9:1。
适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可能包含增殖和活力必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或者技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、plasmanate以及还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。将靶细胞维持在支持生长必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
治疗应用
本发明涵盖包含本发明的CAR分子的细胞(例如，T细胞)，例如，用编码本发明的CAR的逆转录病毒如慢病毒载体(LV)转导。因此，在某些情况下，转导的T细胞可以引发CAR介导的T细胞应答。
本发明提供CAR将原代(primary)T细胞的特异性重新定向至肿瘤抗原CLDN6的用途。因此，本发明还提供一种在哺乳动物中刺激针对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药表达本发明的CAR的T细胞的步骤，其中所述CAR包含与作为预定靶标的CLDN6特异性相互作用的结合部分。
在一实施方案中，本发明包括一种细胞疗法，其中将T细胞遗传修饰以表达本发明的CAR，并且将CAR T细胞输注给有此需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR T细胞能够在体内复制，导致长期持续存在，这可以导致持续的肿瘤控制。
在一实施方案中，本发明的CAR T细胞可以经历强大的体内T细胞扩增并且可以持续很长时间。在另一实施方案中，本发明的CAR T细胞进化为特异性记忆T细胞，其可以被重新激活以抑制任何额外的肿瘤形成或生长。
可以治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可以包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴系统恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤和恶性疾病，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
实体瘤是异常的组织块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤的实例，如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴系统恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称作多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一实施方案中，可以治疗的癌症是表达CLDN6的癌症，如本文描述的那些。
在本发明的一实施方案中，细胞分离自哺乳动物(优选人)，并且用表达本文公开的CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以向哺乳动物受者给药CAR修饰的细胞以提供治疗益处。哺乳动物受者可以是人，并且CAR修饰的细胞对于受者可以是自体的。或者，细胞对于受者可以是同种异体的、同基因的或异种的。
本发明的CAR修饰的细胞可以单独给药，或者与其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群)组合给药。在一实施方案中，将本发明的CAR修饰的细胞与同源抗原分子或编码同源抗原分子的核酸(特别是RNA)组合给药。同源抗原分子可以是CLDN6、重组CLDN6、CLDN6片段或任何前述的变体。在一实施方案中，给药编码同源抗原分子(例如，CLDN6、重组CLDN6、CLDN6片段或任何前述的变体)的核酸，特别是RNA。优选地，在给药本发明的CAR修饰的细胞和编码同源抗原分子的核酸的受试者的细胞中表达编码同源抗原分子的核酸，以提供同源抗原分子用于CAR抗原结合结构域结合。在一实施方案中，CAR抗原结合结构域的同源抗原分子在细胞表面表达。在一实施方案中，在受试者的细胞中瞬时表达编码同源抗原分子的核酸。在一实施方案中，编码同源抗原分子的核酸是RNA。优选地，使本发明的CAR修饰的细胞与同源抗原分子接触导致细胞的扩增和/或激活。
适合根据本发明使用的肽和蛋白抗原通常包括含有本发明的CAR的CLDN6抗原结合结构域结合的表位的肽或蛋白。肽或蛋白或表位可以源自CLDN6。例如，肽或蛋白抗原或者肽或蛋白抗原内包含的表位可以是CLDN6或者CLDN6的片段或变体。
根据本发明提供给受试者的肽和蛋白抗原(通过给药肽和蛋白抗原或者编码肽和蛋白抗原的核酸，特别是RNA)，即疫苗抗原，优选导致给药CAR修饰的细胞以及抗原或核酸的受试者中CAR修饰的细胞的刺激、引发和/或扩增。所述刺激、引发和/或扩增的CAR修饰的细胞优选针对CLDN6靶抗原，特别是由患病细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即，疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可以包含疾病相关抗原，或者其片段或变体。在一实施方案中，这样的片段或变体在免疫上等同于疾病相关抗原。在本公开的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”表示导致CAR修饰的细胞的刺激、引发和/或扩增的物质，刺激、引发和/或扩增的CAR修饰的细胞靶向疾病相关抗原，特别是当在患病细胞、组织和/或器官表面上表达时。因此，根据本公开给药的疫苗抗原可以对应于或可以包含疾病相关抗原，可以对应于或可以包含疾病相关抗原的片段，或者可以对应于或可以包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果根据本公开给药的疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可以包含疾病相关抗原的表位或与疾病相关抗原的表位同源的序列，其中CAR修饰的细胞结合所述表位。因此，根据本公开，抗原可以包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开的“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够刺激、引发和/或扩增CAR修饰的细胞的抗原片段。优选疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供相关表位用于CAR修饰的细胞的CAR中存在的CLDN6抗原结合结构域结合。还优选疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)在细胞(如抗原呈递细胞)的表面上表达，以便提供相关表位用于CAR结合。根据本发明的疫苗抗原可以是重组抗原。
术语“免疫学等同”表示免疫学等同的分子，例如免疫学等同的氨基酸序列，其表现出相同或基本上相同的免疫学性质和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如，对于免疫学作用的类型。在本公开的上下文中，优选对于抗原或抗原变体的免疫学作用或性质使用术语“免疫学等同”。例如，如果氨基酸序列在暴露于与参考氨基酸序列结合的CAR修饰的细胞或表达参考氨基酸序列的细胞时，诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，特别是CAR修饰的细胞的刺激、引发和/或扩增，则所述氨基酸序列在免疫学上等同于参考氨基酸序列，如CLDN6。因此，免疫学上等同于抗原的分子，就CAR修饰的细胞的刺激、引发和/或扩增而言，表现出与CAR修饰的细胞所靶向的抗原相同或基本相同的性质和/或发挥相同或基本相同的作用。
如本文所用，“激活”或“刺激”指已充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能相伴。其中，术语“激活的T细胞”是指经历细胞分裂的T细胞。
术语“引发”指T细胞第一次与其特异性抗原接触并导致分化为效应T细胞的过程。
术语“克隆扩增”或“扩增”指其中特定实体倍增的过程。在本公开的上下文中，该术语优选用于免疫应答的上下文中，其中淋巴细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。
根据本发明，特别优选以编码抗原的RNA形式给药同源抗原。在给药RNA之后，至少一部分RNA被递送至靶细胞。在一实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一实施方案中，RNA由靶细胞翻译以产生编码的肽或蛋白。一些实施方案涉及将RNA靶向递送至某些组织。在一实施方案中，递送涉及靶向淋巴系统，尤其是次级淋巴器官，更具体地脾。在一实施方案中，靶细胞为脾细胞。在一实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一实施方案中，靶细胞为脾中的树突细胞。
“淋巴系统”是循环系统的一部分，并且是免疫系统的重要部分，包括携带淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管传导网络和循环淋巴组成。初级或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官，包括淋巴结和脾，维持成熟的幼稚淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
RNA可以通过所谓的lipoplex制剂递送至脾，其中RNA与包含阳离子脂质和任选存在的额外或辅助脂质的脂质体结合以形成可注射的纳米颗粒制剂。脂质体可以通过将脂质的乙醇溶液注射到水或合适的水相中来获得。RNA lipoplex颗粒可以通过将脂质体与RNA混合来制备。靶向脾的RNA lipoplex颗粒描述于WO 2013/143683，其援引加入本文。已经发现，具有净负电荷的RNA lipoplex颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在给药RNA lipoplex颗粒之后，脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA lipoplex颗粒可用于在脾中表达RNA。在一实施方案中，在给药RNAlipoplex颗粒之后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生RNA积累和/或RNA表达。在一实施方案中，在给药RNA lipoplex颗粒之后，在抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA lipoplex颗粒可以用于在此类抗原呈递细胞中表达RNA。在一实施方案中，抗原呈递细胞为树突细胞和/或巨噬细胞。
在本公开的上下文中，术语“RNA lipoplex颗粒”涉及含有脂质，特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体与带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNAlipoplex颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子脂质(例如，DOTMA)和额外的脂质(例如，DOPE)合成。在一实施方案中，RNA lipoplex颗粒为纳米颗粒。
如本文所用，“阳离子脂质”指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用将带负电荷的RNA与脂质基质结合。通常，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头部通常带有正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于，1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氮鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium)(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在具体实施方案中，阳离子脂质为DOTMA和/或DOTAP。
可以加入额外的脂质以调整RNA lipoplex颗粒的整体正负电荷比和物理稳定性。在某些实施方案中，额外的脂质为中性脂质。如本文所用，“中性脂质”指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于，1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在具体的实施方案中，额外的脂质为DOPE、胆固醇和/或DOPC。
在某些实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含阳离子脂质和额外的脂质。在示例性实施方案中，阳离子脂质为DOTMA，并且额外的脂质为DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比为约10:0-约1:9、约4:1-约1:2或约3:1-约1:1。在具体的实施方案中，摩尔比可为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外脂质的摩尔比为约2:1。
在一实施方案中，本文所述的RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200nm-约1000nm、约200nm-约800nm、约250-约700nm、约400-约600nm、约300nm-约500nm或约350nm-约400nm。在具体的实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约250nm-约700nm。在另一实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约300nm-约500nm。在示例性实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约400nm。
本公开的RNA lipoplex颗粒的电荷是存在于至少一种阳离子脂质中的电荷与存在于RNA中的电荷之和。电荷比是存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷之比。存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷的电荷比通过以下等式计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷的总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷的总数)]。
在生理pH下本文所述的靶向脾的RNA lipoplex颗粒优选具有净负电荷，例如约1.9:2-约1:2的正电荷与负电荷的电荷比。在具体的实施方案中，在生理pH值下，RNAlipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。
CAR修饰的细胞和本文所述的其他物质可以以药物组合物或药物的形式给药，用于治疗或预防性治疗，并且可以任何合适的药物组合物的形式给药。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效物质的制剂，优选包含药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。所述药物组合物用于通过向受试者给药所述药物组合物来治疗、预防或降低疾病或病症的严重性。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。
本公开的药物组合物可以包含一种或多种佐剂，或者可以与一种或多种佐剂一起给药。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括一组异质的化合物，例如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、矿物化合物(例如，明矾)、细菌产物(例如，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素、趋化因子。趋化因子可以为IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。其他已知的佐剂有氢氧化铝、弗氏佐剂或油，例如
Figure BDA0003286339920000381
ISA51。用于本公开的其他合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。
本公开的药物组合物通常以“药学有效量”和“药学可接受的制剂”应用。
术语“药学可接受的”指不与药物组合物的活性成分的作用相互作用的材料的无毒性。
术语“药学有效量”或“治疗有效量”指单独或与其他剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应也可以是延迟所述疾病或所述疾病状况的发作或预防所述疾病或所述疾病状况的发作。本文所述组合物的有效量会取决于待治疗的疾病状况、疾病的严重性、患者的个体参数，包括年龄、生理状况、大小和体重、治疗持续时间、伴随的治疗类型(如果存在)、具体给药途径以及类似因素。因此，本文所述组合物的给药剂量可取决于各种此类参数。在初始剂量患者的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的给药途径实现有效的更高剂量)。
本公开的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂以及任选存在的其他治疗剂。在一实施方案中，本公开的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开的药物组合物的合适防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文所用的术语“赋形剂”指可以存在于本公开的药物组合物中但并非活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或稀释剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载剂”指可以是天然、合成、有机、无机的组分，其中结合活性组分以促进、增强或使得能给药药物组合物。本文使用的载体可以是一种或多种适合向受试者给药的相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载剂包括但不限于无菌水、林格(Ringer)溶液、林格乳酸溶液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，尤其是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一实施方案中，本公开的药物组合物包含等渗盐水。
用于治疗用途的药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro edit.1985)。
药物载剂、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准药物实践进行选择。
在一实施方案中，本文所述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌肉内给药。在某些实施方案中，药物组合物配制为局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠给药，其涉及通过胃肠道吸收，或肠胃外给药。如本文所用，“肠胃外给药”指以除通过胃肠道以外的任何方式给药，例如通过静脉内注射。在优选的实施方案中，药物组合物配制为全身给药。在另一优选实施方案中，全身给药通过静脉内给药进行。组合物可以直接注射入肿瘤或淋巴结中。
本文所用的术语“共给药”指将不同化合物或组合物向相同患者给药的过程。例如，本文所述的CAR修饰的细胞和抗原或编码其的核酸可以同时、基本上同时或顺序给药。如果给药顺序进行，可以在给药抗原或编码其的核酸之前或之后给药CAR修饰的细胞。如果给药同时进行，CAR修饰的细胞和抗原或编码其的核酸不需要在相同组合物中给药。CAR修饰的细胞和抗原或编码其的核酸可以给药一次或多次，并且每种组分的给药次数可以相同或不同。此外，CAR修饰的细胞和抗原或编码其的核酸不需要在相同部位给药。
术语“疾病”指影响个体身体的异常状况。疾病通常解释为与特定症状和指征相关的医学状况。疾病可能最初由外源因素引起，如感染性疾病，也可能由内部功能障碍引起，如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用于指导致受折磨的个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡的任何状况，或对与个体接触的个体造成类似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，它有时包括伤害、残疾、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其他情况下和出于其他目的，这些可以视为可区分的类别。疾病通常不仅会影响个体的身体，还会影响情绪，因为感染和生活在许多疾病中会改变一个人对生活的看法和一个人的个性。
在本上下文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗性干预”涉及为了对抗疾病状况如疾病或病症的目的而管理和护理受试者。该术语旨在包括针对受试者所患的给定病症的全谱治疗，例如给药治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延迟疾病、病症或疾病状况的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或疾病状况，以及预防疾病状况，其中预防理解为为了对抗疾病、疾病状况或病症而对个体进行管理和护理，并且包括给药活性化合物以预防症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体的疾病，阻止或减缓个体的疾病的发展，抑制或减缓个体的疾病的发展，降低个体症状的频率或严重性，和/或降低目前或以前患有疾病的个体中的复发。
术语“预防治疗”或“预防性治疗”涉及旨在防止个体发生疾病的任何治疗。术语“预防治疗”或“预防性治疗”在本文中可以互换使用。
术语“个体”和“受试者”在本文中可以互换使用。他们指人或其他哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)，其可以患有或易患疾病或病症(例如癌症)，但可能或可能未患有疾病或病症。在许多实施方案中，个体为人。除非另有说明，术语“个人”和“受试者”不表示特定年龄，因此涵盖成人、老人、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”为“患者”。
术语“患者”指进行治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。
由于产生的协同效果，癌症治疗中的联合策略可以是期望的，这可以比单一治疗方法的影响更强。在一实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起给药。如本文所用，“免疫治疗剂”涉及可以参与激活特定免疫应答和/或免疫效应子功能的任何物质。本公开考虑使用抗体作为免疫治疗剂。不希望受理论束缚，抗体能够通过各种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体为单克隆抗体。单克隆抗体可以经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。可与本公开联合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号中)的非限制性实例包括：阿巴伏单抗(Abagovomab)(CA-125)、阿昔单抗(Abciximab)(CD41)、阿德木单抗(Adecatumumab)(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)(CEA)、阿麦妥单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安莫单抗(Anatumomab mafenatox)(TAG-72)、阿泊珠单抗(Apolizumab)(HLA-DR)、阿西莫单抗(Arcitumomab)(CEA)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(Bavituximab)(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(Bectumomab)(CD22)、贝利木单抗(Belimumab)(BAFF)、贝伐单抗(Bevacizumab)(VEGF-A)、Bivatuzumab mertansine(CD44v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin)(CD30TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansin)(黏蛋白(mucin)CanAg)、雷坎妥组单抗(Cantuzumab ravtansine)(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)(前列腺癌细胞)、卡芦单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(Catumaxomab)(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(Cetuximab)(EGFR)、泊西他组单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(Cixutumumab)(IGF-1受体)、Claudiximab(紧密连接蛋白)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、可那木单抗(Conatumumab)(TRAIL-R2)、达西珠单抗(Dacetuzumab)(CD40)、Dalotuzumab(胰岛素样生长因子I受体)、地舒单抗(Denosumab)(RANKL)、地莫单抗(Detumomab)(B-淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(Ecromeximab)(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(Edrecolomab)(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(SLAMF7)、依那妥组单抗(Enavatuzumab)(PDL192)、恩妥昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(Epratuzumab)(CD22)、厄妥索单抗(Ertumaxomab)(HER2/neu、CD3)、埃达组单抗(Etaracizumab)(整合素ανβ3)、法妥组单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、非拉妥组单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、法兰妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、非苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、加尼妥单抗(Ganitumab)(IGF-I)、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)(CD33)、吉伏组单抗(Gevokizumab)(ILΙβ)、吉妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、Glembatumumab vedotin(GPNMB)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(CD20)、艾芦库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、Igovoma(CA-125)、雷英妥昔单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin)(CD22)、伊匹单抗(Ipilimumab)(CD152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)(CEA)、来沙木单抗(Lexatumumab)(TRAIL-R2)、利韦单抗(Libivirumab)(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(Lintuzumab)(CD33)、莫星-洛沃妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、卢卡木单抗(Lucatumumab)(CD40)、鲁昔单抗(Lumiliximab)(CD23)、马帕木单抗(Mapatumumab)(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(Matuzumab)(EGFR)、美泊利单抗(Mepolizumab)(IL5)、米拉组单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(Mitumomab)(GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、Moxetumomab pasudotox(CD22)、他那可单抗(Nacolomabtafenatox)(C242 antigen)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomab estafenatox)(5T4)、Namatumab(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(EGFR)、纳武利尤单抗(Nivolumab)(IgG4)、奥法木单抗(Ofatumumab)(CD20)、奥拉木单抗(Olaratumab)(PDGF-R a)、奥那妥组单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、Oportuzumab monatox(EpCAM)、奥戈伏单抗(Oregovomab)(CA-125)、奥塞芦单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(Panitumumab)(EGFR)、Patritumab(HER3)、Pemtumoma(MUC1)、帕妥珠单抗(Pertuzuma)(HER2/neu)、平妥莫单抗(Pintumomab)(腺癌抗原)、普利木单抗(Pritumumab)(波形蛋白(vimentin))、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷曲妥单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(Rafivirumab)(狂犬病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(Rituximab)(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙马组单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)(FAP)、塞妥昔单抗(Siltuximab)(IL6)、他贝芦单抗(Tabalumab)(BAFF)、Tacatuzumab tetraxetan(α-胎蛋白)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)(CD 19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(腱生蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、Ticilimumab(CTLA-4)、替加组单抗(Tigatuzumab)(TRAIL-R2)、TNX-650(IL13)、托西莫单抗(Tositumomab)(CD20)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、曲美木单抗(Tremelimumab)(CTLA-4)、西莫白介素单抗(Tucotuzumabcelmoleukin)(EpCAM)、Ublituximab(MS4A1)、Urelumab(4-1BB)、伏洛昔单抗(Volociximab)(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(Votumumab)(肿瘤抗原CTAA16.88)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)(EGFR)和Zanolimumab(CD4)。
本文引用的文件和研究并不意图承认上述任何一项是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有声明均基于申请人可获得的信息，但并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
实施例
下面结合实验例对本发明作进一步详细说明。提供这些实施例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不意图进行限制。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为包括由于本文提供的教导而变为明显的任何和所有变化。
无需进一步说明，认为本领域普通技术人员可以利用前述说明和以下说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。因此，以下实施例具体指出了本发明的优选实施方案，但不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：材料和方法
本文使用的技术和方法在本文中描述或以本身已知的方式和如描述的方式进行，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.。除非特别说明，包括使用试剂盒和试剂在内的所有方法均根据制造商的信息进行。
CAR构建体
γ-逆转录病毒自灭活(SIN)载体pES.12-6用于在内部真核启动子(人延伸因子1-α启动子的短无内含子形式(EFS–213/+31))的控制下，在人T细胞中稳定过表达CLDN6-CAR-BBz。载体骨架在5'和3'-LTR以及包装区(psi和psi+)处包含R-和U5-区域的MLV野生型序列。消除3'-LTR的U3区中的增强子元件(包括CAAT-Box)，并突变TATA-Box序列以防止转录起始。土拨鼠肝炎病毒(WHV)的转录后调控元件(PRE)的截短形式用于防止不想要的病毒蛋白的表达。CLDN6-CAR-BBz包含人IgG的信号肽、CLDN6特异性抗体IMAB206(GanymedPharmaceuticals)的单链Fv片段，在重链(VH)和轻链(VL)之间具有(G4S)3接头，VL链在VL的46位(序列表中VL的45位)含有半胱氨酸至丝氨酸的取代。scFv片段与人CD8α铰链和跨膜区融合，然后是人4-1BB和人CD3ζ(Q14K)信号传导部分。
细胞系和试剂
表达人CLDN6的畸胎瘤细胞系PA-1-SC12_A0201_luc_gfp在补充有10％(v/v)FCS(Biochrom)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、1mM MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)和2％(v/v)碳酸氢钠溶液(Gibco)的MEM-GlutaMAX培养基中培养。该细胞系过表达HLA-A*0201、萤光素酶和GFP。
卵巢癌细胞系OV-90-SC12在41.5％(v/v)MCDB 105培养基(Sigma-Aldrich)、41.5％(v/v)Medium 199(Sigma Aldrich)中培养，其补充有15％(v/v)FCS和2％(v/v)7.5％碳酸氢钠溶液。
人黑素瘤细胞系SK-MEL-37的培养基包含DMEM GlutaMAXTM(Gibco)，其补充有10％(v/v)FCS。
MDA-MB-231的培养基包含88％(v/v)RPMI 1640GlutaMAXTM(Gibco)，并补充有10％FCS、1mM丙酮酸钠、1mM MEM非必需氨基酸溶液。
人腺癌细胞系23132-87和人黑素瘤细胞系MEL-526在补充有10％(v/v)热灭活FCS的90％(v/v)RPMI 1640GlutaMAXTM(Gibco)中培养。
HEK-293的培养基包含90％(v/v)伊格尔最低必需培养基(EMEM)(ATCC)和10％(v/v)FCS。
SKOV-3在补充有10％(v/v)FCS的90％(v/v)McCoy's 5A培养基(ATCC)中培养。
人卵巢细胞系NIH-OVCAR-3在80％(v/v)RPMI 1640GlutaMAXTM(Gibco，Cat-No.61870)中培养，其补充有20％(v/v)FCS和0.1％(w/v)胰岛素(Sigma-Aldrich)。
人肿瘤细胞系LCLC-103H、COLO-699-N、JAR和NEC-8在补充有10％(v/v)FCS的90％(v/v)RPMI 1640GlutaMAXTM(Gibco)中培养。
每2或3天进行细胞系的接种和/或分裂(split)。
外周血单个核细胞(PBMC)和树突细胞(DC)
通过
Figure BDA0003286339920000441
-Hypaque(1.077g/mL Amersham Biosciences)密度梯度离心法从血沉棕黄层分离PBMC。用抗CD14微珠(Miltenyi Biotec)富集单个核细胞。通过在由RPMI1640GlutaMAXTM、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和5％(v/v)热灭活人AB血清(均来自Invitrogen，Karlsruhe，Germany)组成，补充有1000U/mLh GM-CSF(Essex，Lucerne，Switzerland)和1000U/mL h IL-4(Strathmann Biotech，Hamburg，Germany)的DC培养基中培养来分化未成熟的DC(iDC)。
T细胞的转导
通过使用
Figure BDA0003286339920000442
Human T-Expander CD3/CD28 CTS对CD3+/CD28high+ T细胞进行磁性分离，从PBMC富集T细胞。将细胞用3:1的珠比CD3+ T细胞的比例进行培养，并使用CTS DynaMag磁体进行分离。在450U/mL rh IL-7和50U/mL rh IL-15(均来自MiltenyiBiotec)的存在下，将富集的T细胞在补充有5％(v/v)人血清的X-VIVO 15培养基中培养。三天后，使用磁体去除CD3/CD28珠，并在终浓度为25μg/mL的
Figure BDA0003286339920000443
-A的存在下，用逆转录病毒载体转导预激活的T细胞。细胞在完全培养基中扩增至第7天或第10天，并直接用于评估CAR表面表达、T细胞表型和效应子功能或冷冻保存。
体外培养细胞的流式细胞术分析
使用Alexa-Fluor-647偶联的独特型特异性抗体(Ganymed Pharmaceuticals)分析转导的CAR的细胞表面表达，所述抗体识别所有CLDN6-CAR构建体中包含的scFv片段。通过用Alexa-Fluor647偶联的CLDN6特异性抗体IMAB027(Ganymed Pharmaceuticals)染色来分析靶细胞上的CLDN6表面表达。使用FACSDivaTM软件(BD Biosciences)，在FACSCantoTMII流式细胞仪上进行流式细胞术测量，并使用
Figure BDA0003286339920000444
V10(treestar inc.)进行分析。
定量实时PCR(qRT-PCR)
使用
Figure BDA0003286339920000445
Mini Kit(QIAGEN)从指定的细胞系分离总RNA。对于RNA逆转录以获得用于qRT-PCR的cDNA，使用具有gDNA Eraser(TAKARA)的PrimeScriptTM RT反应试剂盒，从1μg总RNA开始。使用QuantiTect
Figure BDA0003286339920000446
Green PCR试剂盒(QIAGEN)和以下引物(5’-3’)进行定量实时PCR：CLDN6-正向：CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG；CLDN6-反向：AAG GAG GGCGAT GAC ACA GAG；HPRT1-正向：TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA；HPRT1-反向：GGT CCT TTTCAC CAG CAA GCT(退火温度：62℃)。
xCELLigence细胞毒性试验
为了评估CAR介导的细胞毒性，使用xCELLigence系统(OMNI Life Science)。根据供应商的说明进行细胞指数(CI)阻抗测量。为每个肿瘤细胞系确定导致指数生长曲线的最佳细胞密度。将靶细胞以每孔2-104个细胞的浓度接种在E-plate 96 PET(ACEABiosciences Inc.)中。24h后，以200μL的最终体积加入不同数量的CAR转导的T细胞，并通过xCELLigence系统每30min监测，持续长达48h。
百分比特异性溶解计算如下：
(CI Lmin–CI样品)/CI Lmin×100
标准偏差计算如下：
100×(CI样品/CI Lmin)×{√[(CI样品/CI样品的STDEV)2+(CI Lmin/CI Lmin的STDEV)2]}
在将细胞与表达对照抗原(例如，eGFP、对照-CAR)的效应T细胞孵育后，评估与最小溶解(Lmin)对应的最大细胞指数。
CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)增殖测定
为了确定抗原特异性刺激后增殖T细胞的百分比，将表达CAR的T细胞用1.6μM的荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)在37℃(避光)下标记10min。为了去除任何游离染料，将纯FCS添加到细胞中并再孵育5分钟。将细胞洗涤，重新悬浮在培养基中，并且在96孔圆底板中，于总体积为200μL的DC培养基中，使用不同的效应物比靶标(E:T)比例与靶细胞共培养。共培养5天后，将细胞用荧光染料偶联的抗体染色，所述抗体例如针对CD4、CD8和CAR。基于细胞分裂后子细胞内CFSE荧光逐渐减半，使用BD FACSCantoTM II流式细胞仪(Becton Dickinson)，通过流式细胞术分析增殖T细胞的百分比。
球体测定
Figure BDA0003286339920000451
离心后，肿瘤球通过在
Figure BDA0003286339920000452
Ultra-Low Attachment 96圆底孔板中，于MEM-GlutaMAX培养基中，每孔培养1x104个PA1-SC12-A2-eGFP细胞达48h而产生，所述培养基补充有10％(v/v)FCS、1％(v/v)Na-Pyruvat、1％(v/v)MEM NEAA和2％(v/v)Na-Bicarbonat。添加CAR T细胞(1x105/孔)，并以4倍放大倍率和300ms的曝光时间对表达eGFP的肿瘤球成像，以在IncuCyte Zoom Live-content成像系统(Essen Bioscience)中，于37℃，5％CO2下，检测绿色荧光。图像每小时采集，持续10天。使用IncuCyte分析软件对数据进行分析，以检测和量化总绿色目标的积分强度(GCU xμm2/图像)。使用IncuCyte分析软件绘制每个时间点绿色目标计数的平均值和SD。
体外转录的(IVT)mRNA的产生
编码抗原的mRNA的体外转录基于pST1-T7-GG-hAg-MCS-2hBg-A30LA70质粒和衍生DNA-构建体。除了全长ORF之外，这些质粒构建体包含5’人α-珠蛋白、两个连续的3′人β-珠蛋白UTR和100个核苷酸的poly(A)尾，在70个核苷酸后有接头。如Holtkamp S.et al.(2006)Blood 108(13):4009-17所述，通过体外转录产生编码抗原的mRNA。所有描述的mRNA构建体的体外转录在BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH进行。
脂质体配制的编码抗原的IVT RNA(RNA(LIP))的产生和树突细胞的体外转染
先前在Kranz et al(2016)Nature 534(7607):396-401中描述了编码抗原的IVTRNA与脂质体的复合。使用的阳离子DOTMA和RNA的电荷比为1.3:2。除了DOTMA以外，脂质部分包含辅助脂质DOPE，摩尔比为2:1 DOTMA/DOPE。
动物实验技术
动物
9-21周龄的雌性免疫缺陷NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠用于体内研究。繁殖对购自Jackson实验室(Bar Harbour，ME，USA)并在BioNTech AG，Germany的动物设施中饲养。C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc小鼠购自Envigo Labs。在整个实验中使用年龄(8-10周龄)和性别(雄性或雌性)匹配的动物。同类系C57Bl/6-Thy1.1小鼠在BioNTech AG，Germany的动物设施中饲养。所有实验均在无特定病原体(SPF)条件下，根据德国动物实验规定进行。
肿瘤细胞的植入
将5x10^6个OV90-SC12或5x10^5个CT26肿瘤细胞皮下注射(在100μL PBS中)至小鼠的右侧背部。使用卡尺并代入式V＝1/2(长x宽2)来确定肿瘤生长监测和体积计算。在CAR工程化的人T细胞的过继性转移之前，使用Microsoft Excel的Daniels′s XL Toolbox插件将荷瘤分层以实现不同治疗组之间的巨大肿瘤体积分布。
人T细胞的过继性细胞转移(ACT)
将不同量的γ-逆转录病毒转导的总人T细胞(表达CAR或GFP转基因的T细胞的数量和频数在各自的图中示出)在200μL PBS中静脉内注射至眼球后丛中。根据实验设置，将转导的T细胞在体外激活和转导过程后直接使用，或者将冷冻保存的转导的T细胞解冻，并在用PBS洗涤2次之后分别直接过继转移至小鼠中。实验中使用的每种T细胞产物的活力>90％。
体内血液中人CAR T细胞的监测
在指定的时间点，从眼眶后静脉取出50μL外周血并收集到含有肝素的反应管(Sarstedt)中。使用BD FACS裂解液(BD)裂解红细胞。使用hCD45-PE-Cy7(HI30，BD)、hCD4-APC-Cy7(OKT4，BioLegend)、hCD8-BV421(RPA-T8，BD)和Alexa-Fluor 647-缀合的独特型特异性抗体(Ganymed Pharmaceuticals)分析转移的人T细胞表面上的CAR表达。使用7-AAD(Beckmann Coulter)从分析中区分死细胞。在FACSCantoTM II流式细胞仪上，使用FACSDivaTM软件(BD Biosciences)进行流式细胞术测量，并且使用
Figure BDA0003286339920000471
V10(Treestarinc.)进行分析。
用于过继性T细胞转移的CAR T细胞的逆转录病毒操作和制备
通过DynabeadsTM Mouse T-Activator CD3/CD28以1:1的珠比T细胞比例(Invitrogen)，在5ng/mL重组人(rh)IL-7和5ng/mL rh IL-15(Miltenyi Biotec)的存在下，分离并预激活幼稚
Figure BDA0003286339920000472
C57Bl/6-Thy1.1+或Balb/c-Thy1.1+的脾细胞。对于小鼠细胞的转导，根据制造商的说明书(Takara Bio Inc.，Otsu，Japan)，将MLV-E假型逆转录病毒上清液装载至RetroNectin(2μg/cm2)包被的非组织培养处理的孔板上，进行3个重复循环的病毒装载和离心(1,300xg，15℃，15min)以增加结合。预激活后24h，已将0.5-0.6x106个细胞/cm2离心(300xg，37℃，1h)至病毒颗粒包被的孔上。过夜培养之后，用新鲜病毒颗粒包被的平板重复离心转导。预激活后72h，从培养物去除DynabeadsTM Mouse T-Activator CD3/CD28，并且在5ng/mL rh IL-7和5ng/mL rh IL-15的存在下扩增细胞。Ficoll清洗之后，将细胞用PBS洗涤两次以去除血清蛋白，然后准备用于过继性细胞转移(ACT)。将基于pES12.6的逆转录病毒载体用于转导，其包含编码的CLDN6-CAR-BBz以及增强的萤火虫萤光素酶(effLuc；Rabinovich et al.BA,PNAS(2008)PNAS 105(38):14342-6)和eGFP(增强的绿色荧光蛋白)报告基因，使用2A-剪接元件(Szymczak et al.AL,Nature Biotechnology,(2004)Nat Biotechnol.22(5):589-94)分别表达。小鼠T细胞的过继性T细胞转移和RNA(LIP)疫苗接种
将γ-逆转录病毒转导的CAR同类系Thy1.1+ T细胞分别静脉内(i.v.)转移至全身照射(XRAD320)的C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc或BALB/c供体小鼠中。随后，在ACT后的不同时间点，将小鼠用F12:RNA比例为1.3:2的编码抗原的RNA(LIP)静脉内(i.v.)疫苗接种。通过全身生物发光成像分析CAR体内扩增，并且通过肿瘤监测分析抗肿瘤效力。
体内萤光素酶成像(BLI)
通过使用IVIS Lumina成像系统(Caliper Life Sciences)的体内生物发光成像评价CAR-effLuc-GFP转导的T细胞的扩增和分布。简单地说，在转导的T细胞的过继性转移后的指定时间点，i.p.注射D-萤光素水溶液(80mg/kg体重；Perkin Elmer)。5min后，定量发射的光子(1min的积分时间，分档8)。使用IVIS Living Image 4.0软件，将所关注的区域(ROI)中的体内生物发光定量为总通量(光子/sec)。源自动物中萤光素酶表达细胞的透射光强度以灰度图像表示，其中黑色是强度最低的，而白色至深灰色是最强的生物发光信号。在LED弱光照明下获得小鼠的灰度参考图像。使用Living Image 4.0软件叠加图像。
数据的统计分析和描述
所有结果均以技术重复的平均值+/-SD或生物重复的平均值+/-SEM表示。每个实验的图形描述中说明了重复样品的数量。未配对的双尾学生t-检验用于两组的曲线下面积(AUC)比较。所有统计分析均利用GraphPad PRISM 6.04进行。***P≤0.001，****P≤0.0001。
实施例2：CLDN6特异性CAR的生成和体外表征
对于先导结构选择，我们生成了不同CAR骨架，它们全部共享源自CLDN6特异性抗体IMAB206-C46S的相同scFv片段，但是它们的铰链和共刺激结构域不同(图1A)。因为已显示4-1BB共刺激提高CAR T细胞的持久性和抗肿瘤效力，我们包括了含有4-1BB内结构域的第二代和第三代CAR骨架。可选地或额外地，并入修饰的CD28结构域(Kofler D.M.et al.,(2011)Molecular Therapy 19(4),760–767)已知在不存在激动性CD28配体如B7.1和B7.2的情况下递送CD28介导的共刺激至工程化的T细胞。通过修饰的IgG Fc(Hombach A.etal.,(2010)Gene Therapy 17,1206–1213)或CD8α铰链区，将scFv片段融合至4-1BB或CD28共刺激结构域。
不同的CLDN6-CAR在体外广泛表征，因为它们具有灵敏和特异性的识别并杀伤表达CLDN6的肿瘤细胞的潜力。在其他实验中，利用CAR转导的T细胞与表达eGFP的PA1肿瘤球组合进行肿瘤球测定。事实上，使用
Figure BDA0003286339920000481
实时成像可以检测到，与携带CD28结构域的CAR相比，通过包含CAR的4-1BB，表达CLDN6的肿瘤球的溶解加速(图1B)。
基于不同功能表征研究的结果总结，我们选择CLDN6-CAR-CD8h-BBz作为临床前和临床测试的先导结构，因为我们可以证实对CLDN6的高度特异性和灵敏的识别以及工程化的CAR T细胞的存活和重复刺激的高潜力。重要的是，这种CAR骨架已成功用于若干CD19-CAR T细胞试验。为了将我们的CLDN6-CAR稳定整合至T细胞基因组中，我们选择γ-逆转录病毒自灭活(SIN)载体pES12.6用于将治疗性CLDN6-CAR稳定整合至T细胞基因组中(Loewet al.,Gene Therapy(2010)17,272–280)。
实施例3：CLDN6-CAR-BBz的灵敏度
为了更详细地分析CAR介导的识别的灵敏度，进行了CLDN6-RNA滴定实验。为此，用滴定量的CLDN6-RNA转染CLDN6阴性肺癌细胞系Colo699-N，并且通过xCELLigence细胞毒性测定评价CLDN6-CAR介导的靶细胞溶解。在用CLDN6-CAR和CLDN6特异性抗体染色之后，通过流式细胞术评价转导的T细胞上的CLDN6-CAR表面表达(图2A)和转染的Colo699-N细胞上的CLDN6蛋白表达水平(图2B)。可以观察到表达CLDN6-CAR的T细胞对CLDN6-RNA转染的靶细胞的特异性杀伤取决于用于转染Colo699-N细胞的CLDN6-RNA剂量，如通过流式细胞术评价的，该剂量与靶细胞表面上CLDN6分子的数量相关(图2C)。如果仅转染0.01μg CLDN6-RNA之后在靶细胞表面上表达极低数量的CLDN6分子，这通过流式细胞术很难检测到，CAR T细胞甚至仍介导溶解。
实施例4：CLDN6-CAR-BBz的安全性
为了评价CLDN6-CAR-BBz的安全性，进行了细胞系筛选测定。为此，将CLDN6-CAR-BBz转导的T细胞(图3A)与一组不同组织来源的CLDN6阳性和CLDN6阴性肿瘤细胞系(图3B)一起培养，并且通过xCELLigence细胞毒性测定分析对靶细胞的识别和溶解(图3C)。平行地，分别通过qRT-PCR和流式细胞术评价靶细胞系中的CLDN6-mRNA和蛋白表达水平(图3D、E)。可以证明对靶细胞系的识别和溶解与CLDN6mRNA和蛋白表达水平严格相关。
实施例5：CAR T细胞的增殖
CLDN6-CAR-BBz工程化的T细胞的抗肿瘤效力的重要先决条件是它们在患者体内增殖和持续存在的能力。为了分析CLDN6-CAR T细胞是否响应iDC中异位表达的CLDN6有效增殖，进行了基于CFSE的体外共培养测定。将CLDN6-CAR转导的T细胞用CFSE标记，并与用滴定量的编码CLDN6或对照抗原的RNA lipoplex(RNA(LIP))转染的自体iDC共培养。通过流式细胞术验证CLDN6-CAR在T细胞上的表面表达和CLDN6在靶细胞上的表面表达(图4A、B)。共培养5天后，通过流式细胞术分析CFSE标记的表达CAR的CD4+和CD8+ T细胞的抗原特异性增殖(图4C)。
CLDN6-CAR介导的剂量依赖性增殖与转染的CLDN6-RNA(LIP)的量相关，而如果用对照RNA(LIP)转染iDC，则只可以观察到背景增殖。这些数据证实抗原特异性刺激后诱导了CLDN6-CAR-BBz T细胞的有效抗原特异性扩增。
实施例6：CLDN6-CAR-BBz的体内抗肿瘤效力
在体外证实CAR介导的抗原特异性效应功能诱导之后，在晚期异种移植肿瘤模型中体内研究人CLDN6-CAR-BBz T细胞的治疗潜力。为此，将免疫缺陷的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下植入内源性表达CLDN6的人卵巢癌细胞(OV90)。然后用i.v.给药的单剂量的1x107个CLDN6-CAR或eGFP转导的T细胞(约5x108个T细胞/kg)治疗OV90荷瘤NSG小鼠(图5A)。CLDN6-CAR在约16-18％的人CD4+和CD8+ T细胞上表达(图5B)。值得注意的是，CLDN6-CAR T细胞的过继性转移导致大肿瘤完全消退，在过继性转移当天平均肿瘤体积为170mm3，而在对照组中未观察到抗肿瘤效果(图5C)。这种显著的抗肿瘤效果与治疗的小鼠外周血中CLDN6-CAR-BBz T细胞的持续存在相关(图5D)。
实施例7：短期和长期培养的CAR T细胞的体外功能性
因为高质量、临床级CAR T细胞产品的可重复制造是临床测试的先决条件，所以对GMP制造工艺优化以实现高转导效率以及足够数量和质量的CLDN6-CAR表达T细胞。还通过将转导次数从2次减少至1次并将离体培养时间从10天缩短至7天简化了转导程序。已显示与长期扩增、耗竭的T细胞相比，短期培养的T细胞表现出提高的效力(PMID:30030295)。因此，缩短培养时间不仅节省时间和成本，而且最重要的是应当导致工程化的T细胞在患者体内扩增和持续存在的潜力增强。
为了比较短期(7天)和长期(10天)培养的CLDN6-CAR-BBz T细胞的体外抗肿瘤效力，进行了长期球体实验。通过流式细胞术对CAR表面表达的评价显示几乎可比的CAR表达水平，而在培养7天的T细胞样品中，CAR阳性T细胞的频数略低(图6A)。为了分析重复杀伤的可能性，将CAR T细胞与表达CLDN6和eGFP的PA1-SC12-A2-eGFP肿瘤球共培养，并且利用
Figure BDA0003286339920000501
系统，基于eGFP信号，实时监测肿瘤球的杀伤。在完全根除肿瘤球之后，添加新的肿瘤球(图6B)。可以证明短期培养的CAR T细胞具有与长期培养的T细胞可比的重复杀伤潜力。
实施例8：解冻的GMP制造的CAR T细胞的体外功能性
因为用于临床用途的GMP转导过程产生冷冻保存的CAR T细胞产品，所以验证在GMP设施中工程化的解冻的CLDN6-CAR-BBz T细胞的抗肿瘤潜力具有明显的重要性。此外，因为可以缩短最终GMP制造过程(在第7天而不是第10天收获)，所以必须通过进行体内研究来评价最终方案中的这种修改。最重要的是，解冻的人CLDN6-CAR-BBz T细胞证明与新鲜产生的CAR T细胞可比的显著抗肿瘤效果，并且在卵巢癌异种移植模型中根除平均肿瘤体积为160mm3的晚期肿瘤(图7A)。此外，在这个实验中比较了在第7天或第10天收获的表现出相似CAR表面表达(图7B)的CAR T细胞的抗肿瘤效力(图7C)。与长期肿瘤球实验结果相关，两种CAR T细胞产品以可比的动力学介导完全的肿瘤排斥。两种产品的抗肿瘤反应与过继性转移后两周外周血中CLDN6-CAR-BBz T细胞的持久性相关(图7D)。
实施例9：CLDN6-CAR-BBz转导的T细胞的持久性增加
过继性转移的肿瘤反应性T细胞疗法的临床成功也与这些细胞在体内的持久性正相关(Robbins et al.(2004)J Immunol.173(12):7125-30,Huang et al.(2005)28(3):258-67)。因此我们分析了原位抗原暴露是否可以增强CLDN6-CAR-BBz T细胞在体内的持久性。因为异种移植模型不足以研究CAR T细胞的长期持久性，这是由于人T细胞对小鼠组织的移植物抗宿主病以及缺少竞争性内源免疫细胞，所以在小鼠同基因小鼠模型中进行CLDN6-CAR-BBz T细胞的持久性研究。因此，将共表达萤光素酶的CLDN6-CAR-BBz CAR转导的小鼠T细胞过继性转移至轻度刺激(2.5Gy)的小鼠中，然后重复给药编码CLDN6或对照抗原的RNA(LIP)，并且通过生物发光成像顺序监测CAR T细胞群的扩增(图8A)。
在体内重复疫苗接种脂质体配制的CAR抗原之后，CLDN6-CAR-BBz T细胞能够在体内持续存在(超过3个月)。在对照组中CART细胞随着时间消失，而抗原特异性重新刺激的CAR T细胞在每次RNA(LIP)治疗后增殖，即使在3°和4°加强轮(round)后3-4周治疗暂停后(图8B和C)。这些数据证明BioNTech’s RNA(LIP)技术通过提供自然的原位共刺激来支持足够的CLDN6-CAR-BBz T细胞激活和增殖，这也导致体内扩增的CLDN6-CAR-BBz T细胞的持久性增加。
实施例10：体内扩增的CLDN6-CAR-BBz T细胞的抗肿瘤活性提高
证明CAR介导的抗原特异性扩增和持久性之后，问题出现了：与未扩增的对应物相比，那些体内扩增的CLDN6-CAR-BBz T细胞是否也表现出增强的抗肿瘤潜力。为了这个目的，用中等剂量的1x106 CLDN6-CAR-BBz或对照-CAR-BBz转导的小鼠T细胞(3-4x105个表达CAR的T细胞)治疗接种CLDN6dim–表达结肠癌细胞系CT26的Balb/c小鼠。i.v.给药CAR T细胞之后，小鼠接受额外的疫苗接种，用编码全长CLDN6或全长对照抗原的20μg RNA(LIP)(图9A)进行。在用CLDN6-RNA(LIP)治疗的对照-CAR-BBz治疗的动物中未观察到抗肿瘤效应，当用中等剂量的CLDN6-CAR-BBz T细胞联合不相关的ctrl RNA(LIP)治疗时，仅可以实现轻微的肿瘤消退。但是，接受中等CAR T细胞剂量连同CLDN6-RNA(LIP)疫苗接种的组合以实现CLDN6-CAR-BBz T细胞的体内扩增的小鼠表现出显著增强的肿瘤消退(图9B)。
实施例11:恢复低剂量体内扩增的CAR T细胞的抗肿瘤效力
除了基于RNA(LIP)的体内CAR T细胞扩增改善持续抗肿瘤反应的潜力，还可以显示这项技术非常适合恢复不足的CAR T细胞剂量的抗肿瘤潜力。用比肿瘤排斥所需剂量低10倍的CAR T细胞剂量治疗荷瘤小鼠(图10A)。虽然在用对照RNA(LIP)治疗的小鼠中观察到肿瘤生长，但是在初始移植后接受编码CAR抗原的RNA(LIP)的所有动物均表现出肿瘤排斥(图10C)。因此，疫苗接种后外周血中移植的CAR T细胞频数显著更高(图10D)。通过用RNA(LIP)额外治疗来补偿移植后不足的CAR T细胞剂量以实现体内扩增对于至少两种不同的情况非常有用：1)GMP制造的CAR T细胞产品产量低(例如由于初始单采术(apheresis)中淋巴细胞计数低或其他非影响原因)，或者2)通过减少起始CAR T细胞剂量来避免SAE(特别是，如果已知所需的CAR引起毒性或在首次人剂量递增研究的情况下)。
本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容均整体援引加入本文。虽然本发明已参考特定实施方案公开，但是很明显本领域其他技术人员可以设计本发明的其他实施方案和变化而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在解释为包括所有这类实施方案和等同变化。
序列表
<110> 生物技术细胞和基因治疗公司
<120> 用于治疗表达CLDN6的癌症的嵌合抗原受体修饰的细胞
<130> 674-260 PCT2
<150> PCT/EP2019/053156
<151> 2019-02-08
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val
20 25 30
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Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
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65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu
85 90 95
Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser
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Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly
180 185 190
Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val
210 215 220
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> VARIANT
<222> (143)..(143)
<223> 人紧密连接蛋白6 I143V多态性
<400> 2
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<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH序列
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL序列
<400> 4
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20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL序列
<400> 6
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
20 25 30
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Cys Ile Tyr Ser
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL序列
<400> 8
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
20 25 30
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH序列
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Leu Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL序列
<400> 10
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His
20 25 30
Trp Phe Gln Leu Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Tyr Pro Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu
<400> 11
Xaa Gly Xaa Val Xaa
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu
<400> 12
Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu
<400> 13
Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu
<400> 14
Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸，优选芳香族氨基酸，更
优选Phe或Tyr，最优选Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸，优选Leu或Phe，更优选Leu
<400> 15
Ala Arg Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR1序列
<400> 16
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VH CDR2序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 任何氨基酸，优选Thr、Ser或Ile，更优选Thr
<400> 17
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Xaa
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Asn，更优选Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸，优选Tyr、Ser、Ile、Asn或Thr，更
优选Tyr、Ser或Asn，最优选Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Tyr，更优选Tyr
<400> 18
Arg Xaa Xaa Xaa Pro
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Asn，更优选Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选Tyr、Ser、Ile、Asn或Thr，更
优选Tyr、Ser或Asn，最优选Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Tyr，更优选Tyr
<400> 19
Gln Arg Xaa Xaa Xaa Pro Pro
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL CDR3序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Asn，更优选Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 任何氨基酸，优选Tyr、Ser、Ile、Asn或Thr，更
优选Tyr、Ser或Asn，更优选Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Tyr，更优选Tyr
<400> 20
Gln Gln Arg Xaa Xaa Xaa Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL CDR1序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 任何氨基酸，优选Ser或Asn，更优选Ser
<400> 21
Ser Ser Val Xaa Tyr
1 5
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL CDR2序列
<400> 22
Ser Thr Ser
1
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL序列
<400> 23
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
20 25 30
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Gly Ile Tyr Ser
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体VL序列
<400> 24
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
20 25 30
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr Ser
35 40 45
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG的信号肽
<400> 25
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS接头
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8铰链结构域
<400> 27
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 28
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8跨膜结构域
<400> 28
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 29
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8铰链和跨膜结构域
<400> 29
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 30
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB信号传导结构域
<400> 30
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3zeta信号传导结构域
<400> 31
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 32
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 铰链-Ch2-CD3 Fc结构域
<400> 32
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys
225 230 235
<210> 33
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28跨膜和信号传导结构域
<400> 33
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28跨膜结构域
<400> 34
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 35
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CLDN6 scFv
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser
130 135 140
Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser
145 150 155 160
Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys
165 170 175
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Val Ala Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn
210 215 220
Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
225 230 235 240
Ser Asp Pro Ala
<210> 36
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CLDN6-CAR
<400> 36
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser
145 150 155 160
Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
165 170 175
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr
180 185 190
Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
245 250 255
Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 37
cttatctcct tcgcagtgca g 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 38
aaggagggcg atgacacaga g 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 39
tgacactggc aaaacaatgc a 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 40
ggtccttttc accagcaagc t 21

Claims (67)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含：
i)CLDN6抗原结合结构域；
ii)跨膜结构域；和
iii)胞内结构域，其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
2.权利要求1的CAR分子，其中所述CLDN6抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域或骆驼科VHH结构域。
3.权利要求1或2的CAR分子，其中所述CLDN6抗原结合结构域包含scFv。
4.权利要求1-3中任一项的CAR分子，其中所述CLDN6抗原结合结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或其功能性变体。
5.权利要求1-4中任一项的CAR分子，其中所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其功能性变体。
6.权利要求1-5中任一项的CAR分子，其不包含其他共刺激结构域。
7.权利要求1-6中任一项的CAR分子，其中所述CD3-ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其功能性变体。
8.权利要求1-7中任一项的CAR分子，其中所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAMl(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C或其功能性变体。
9.权利要求1-8中任一项的CAR分子，其中所述跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
10.权利要求1-9中任一项的CAR分子，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其功能性变体。
11.前述权利要求中任一项的CAR分子，其中所述抗原结合结构域通过铰链结构域连接至所述跨膜结构域。
12.权利要求11的CAR分子，其中所述铰链结构域为CD8α铰链结构域。
13.权利要求11或12的CAR分子，其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或其功能性变体。
14.权利要求1-13中任一项的CAR分子，其包含：
i)CLDN6抗原结合结构域；
ii)CD8α铰链结构域；
iii)CD8α跨膜结构域；和
iv)胞内结构域，其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
15.权利要求1-14中任一项的CAR分子，其进一步包含前导序列。
16.权利要求1-15中任一项的CAR分子，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其功能性变体。
17.一种核酸，其编码权利要求1-16中任一项的CAR分子。
18.权利要求17的核酸，其为DNA或RNA。
19.一种载体，其包含权利要求17或18的核酸。
20.权利要求19的载体，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
21.权利要求19或20的载体，其进一步包含启动子。
22.权利要求21的载体，其中所述启动子选自EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
23.一种免疫效应细胞，其包含：
权利要求1-16中任一项的CAR分子；
权利要求17或18的核酸；或者
权利要求19-22中任一项的载体。
24.权利要求23的免疫效应细胞，其为遗传修饰的以表达CAR。
25.权利要求23或24的免疫效应细胞，其选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
26.权利要求23-25中任一项的免疫效应细胞，其为CD8+T细胞。
27.权利要求23-26中任一项的免疫效应细胞，其为人细胞。
28.一种免疫效应细胞群，其包含多种权利要求23-27中任一项的免疫效应细胞。
29.权利要求23-27中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28的免疫效应细胞群，其中所述细胞缺乏功能性TCR或功能性HLA的表达，或者具有功能性TCR或功能性HLA的低表达。
30.一种制备免疫效应细胞或免疫效应细胞群的方法，其包括在一定条件下将权利要求17或18的核酸或者权利要求19-22中任一项的载体引入免疫效应细胞，从而表达所述CAR分子。
31.一种用于在受试者中刺激针对表达CLDN6的靶细胞群或组织的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者提供有效量的权利要求23-27和29中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28或29的免疫效应细胞群。
32.一种治疗患有与CLDN6表达相关的疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者提供有效量的权利要求23-27和29中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28或29的免疫效应细胞群。
33.权利要求32的方法，其中所述与CLDN6表达相关的疾病选自与CLDN6表达相关的增殖性疾病、癌前疾病状况、癌症和非癌症相关的适应症。
34.权利要求33的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾细胞癌和膀胱癌。
35.一种在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，其包括向所述受试者提供有效量的权利要求23-27和29中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28或29的免疫效应细胞群。
36.权利要求35的方法，其中所述肿瘤为表达CLDN6的肿瘤。
37.权利要求31-36中任一项的方法，其中所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群为所述受试者自体的或同种异体的。
38.权利要求31-37中任一项的方法，所述方法进一步包括给药增加所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群的效力的物质。
39.权利要求38的方法，其中所述物质选自以下的一种或多种：
蛋白磷酸酶抑制剂；
激酶抑制剂；
细胞因子；
免疫抑制剂分子的抑制剂；或
降低TREG细胞的水平或活性的物质。
40.权利要求31-39中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
使所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群与结合所述CLDN6抗原结合结构域的同源抗原分子接触。
41.权利要求40的方法，其中所述同源抗原分子选自CLDN6或其片段或者CLDN6或CLDN6片段的变体。
42.权利要求40或41的方法，其中使所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群与所述同源抗原分子在一定条件下接触，从而发生所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群的扩增和/或激活。
43.权利要求40-42中任一项的方法，其中使所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群与所述同源抗原分子接触的步骤体内或离体进行。
44.权利要求40-43中任一项的方法，其包括以下步骤：
向所述受试者给药所述同源抗原分子或编码其的核酸。
45.权利要求44的方法，其中在所述受试者的细胞中表达编码所述同源抗原分子的核酸以提供所述同源抗原分子。
46.权利要求45的方法，其中在所述细胞的表面表达所述同源抗原分子。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其中在所述受试者的细胞中瞬时表达编码所述同源抗原分子的核酸。
48.权利要求44-47中任一项的方法，其中编码所述同源抗原分子的核酸为RNA。
49.权利要求31-48中任一项的方法，其中全身性给药所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群和/或所述同源抗原分子或编码其的核酸。
50.权利要求49的方法，其中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，编码所述同源抗原分子的核酸在脾中表达。
51.权利要求49或50的方法，其中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，编码所述同源抗原分子的核酸在抗原呈递细胞中表达，优选地在专职抗原呈递细胞中表达。
52.权利要求51的方法，其中所述抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。
53.权利要求49-52中任一项的方法，其中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生编码所述同源抗原分子的核酸的表达。
54.权利要求49-53中任一项的方法，其中，在全身性给药编码所述同源抗原分子的核酸后，脾中的编码所述同源抗原分子的核酸的表达是肺中的表达量的至少5倍。
55.权利要求44-54中任一项的方法，其中编码所述同源抗原分子的核酸配制在递送媒介物中。
56.权利要求55的方法，其中所述递送媒介物包括颗粒。
57.权利要求55或56的方法，其中所述递送媒介物包含至少一种脂质。
58.权利要求57的方法，其中所述至少一种脂质包含至少一种阳离子脂质。
59.权利要求57或58的方法，其中所述脂质与编码所述同源抗原分子的核酸形成复合物和/或包裹编码所述同源抗原分子的核酸。
60.权利要求57-59中任一项的方法，其中所述脂质包含于囊泡中，所述囊泡包裹编码所述同源抗原分子的核酸。
61.权利要求44-60中任一项的方法，其中编码所述同源抗原分子的核酸配制于脂质体中。
62.权利要求23-27和29中任一项的免疫效应细胞、权利要求28或29的免疫效应细胞群或者权利要求30-61中任一项的方法，其中所述免疫效应细胞或免疫效应细胞群为表达CAR的免疫效应细胞或表达CAR的免疫效应细胞群。
63.权利要求1-16中任一项的CAR分子、权利要求17或18的核酸、权利要求19-22中任一项的载体、权利要求23-27、29和62中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28、29和62中任一项的免疫效应细胞群，用作药物。
64.权利要求1-16中任一项的CAR分子、权利要求17或18的核酸、权利要求19-22中任一项的载体、权利要求23-27、29和62中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28、29和62中任一项的免疫效应细胞群，用于治疗表达CLDN6的疾病。
65.一种试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项的CAR分子、权利要求17或18的核酸、权利要求19-22中任一项的载体、权利要求23-27、29和62中任一项的免疫效应细胞或者权利要求28、29和62中任一项的免疫效应细胞群。
66.权利要求65的试剂盒，其进一步包含结合所述CLDN6抗原结合结构域的同源抗原分子或编码其的核酸。
67.权利要求65或66的试剂盒，其进一步包含所述试剂盒用于权利要求30-62中任一项的方法的说明书。
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