JP2017533702A - 生体分子の免疫細胞への送達 - Google Patents

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Abstract

免疫細胞の細胞質ゾルに抗原等の化合物を優先的に送達するための方法及びデバイス。この方法は、標的免疫細胞を含む細胞懸濁液をマイクロ流体デバイスに通し、懸濁液を送達される化合物またはペイロードと接触させることを含む。【選択図】図２０

Description

関連出願
本発明は、２０１４年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／０７３，５４８号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の優先権の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
連邦支援
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金番号ＧＭ１０１４２０、ＡＩ１１２５２１、ＡＩ１１１５９５、及びＡＩ０６９２５９の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、材料の細胞への送達に関する。
配列表の参照
本出願は、「３８１７２−５０８００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称であり、サイズが２．３１キロバイトである、２０１５年１０月３０日にＩＢＭ−ＰＣマシンフォーマット（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓとのオペレーティングシステムとの互換性を持つ）で作成されたファイルに存在するヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列を参照により組み込んでいる。これは、本出願の一部として２０１５年１０月３０日に提出されたテキストファイルに含まれている。
多糖類、タンパク質、または核酸等の巨大分子の細胞質への送達は、研究または治療目的のために細胞機能を一時的にまたは永久に変えることができる。しかしながら、一次免疫細胞、特に休止リンパ球への細胞内送達のための既存の技術には制限がある。エレクトロポレーション（電気穿孔法）は、かなりの細胞傷害性をもたらす。ウイルスベクターは、休止中のリンパ球に感染することができない。細胞膜貫通（または形質導入）ペプチドは、一次リンパ球を効率的にトランスフェクト（形質移入）しない。抗体−薬物複合体及びコンジュゲートは、各細胞タイプに対して特定の抗体を必要とし、異なるペイロードを運ぶためには異なるデザインを必要とする。さらに、それらは生産するには高価であり、潜在的に免疫原性である。アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラＲＮＡは、毒性または免疫活性化を伴わずにインビボでの標的遺伝子ノックダウンを引き起こすことが示されているが、小さなＲＮＡを送達するためにのみ使用されており、それぞれの目的の細胞に対して特異的な標的アプタマーを特定する必要がある。ナノ粒子及びリポソームに基づく技術の進歩により、樹状細胞及び単球／マクロファージ等の貪食抗原提示細胞に対する薬物及び抗原の細胞内送達が改善されたが、リンパ球には効果的ではなかった。これらの方法のほとんどは、ペイロードのエンドソーム取り込みをもたらし、ペイロードのごくわずかな部分（約１〜２％と見積もられる）のみがエンドソームから生物活性のために輸送を必要とする細胞質ゾルに逃れる。これらの技術の多くはまた、細胞機能に影響を及ぼし得る、細胞内の非生分解性パッケージングまたは送達材料の蓄積をもたらす。従って、免疫細胞への様々な巨大分子の効率的かつ非毒性的送達が可能な代替技術が必要とされている。
本発明は、免疫細胞への化合物または組成物の送達に関連する以前の問題への解決策を提供する。本発明の以前には、化合物、例えばタンパク質、核酸、炭水化物の導入は困難で、また非効率的に発生し、及び／または毒性化合物またはウイルスベクターのような望ましくない媒介物質の存在を必要とした。本発明によれば、免疫細胞機能を操作する方法は、免疫細胞の細胞質を取り囲む膜を一時的に破壊することによる化合物の細胞内送達を含む。例えば、免疫細胞の細胞質ゾルに化合物を優先的に送達するための、ウイルスベクターを用いない方法は、標的免疫細胞を含む細胞懸濁液をマイクロ流体デバイスに通し、懸濁液を化合物（複数可）またはペイロードと接触させるステップを包含する。デバイスは、１０〜６０μｍの狭窄長と３〜８μｍ、例えば３〜４μｍまたは４μｍの狭窄幅とを含む。
例えば、デバイスは、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含む。ナイーブＴ細胞及びＢ細胞に関連する好ましい実施形態では、このデバイスは、約１０、１５、２０、２５、３０、または１０〜３０μｍの長さ、約３、３．５、４または３〜４μｍの幅、約１５、２０、２５、または１５〜２５μｍの深さ、及び／または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または５〜１５度の角度を有する狭窄部を含む。
狭窄部を通過した後、免疫細胞に送達される化合物の量は、非免疫細胞に送達される化合物の量よりも、または細胞搾りの非存在下に、例えばエンドサイトーシスのみによって、免疫細胞に送達される量と比較して、少なくとも１０％（例えば、２０％、５０％、２倍、５倍、１０倍、またはそれ以上）多い。例えば、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、または樹状細胞を含む。ペイロードを優先的に免疫細胞に送達するために、例示的なデバイスは、それを通して細胞が通過する、３０μｍの狭窄長及び４μｍの狭窄幅を含む１つ以上のチャネルによって特徴づけられる。
細胞処理の間、０〜４５℃の温度、例えば０〜２５℃が使用される。例えば、ナイーブＴ細胞、Ｂ細胞及び／または単球の処理は、４〜８℃の温度、例えば氷上で実施される。別の例では、樹状細胞、活性化Ｔ細胞及び／または活性化Ｂ細胞は、２０〜２５℃の温度、例えば典型的な環境室温でデバイスを用いて処理される。
ペイロードは、免疫細胞の細胞質に送達しようとするどのような分子または化合物をも含む。例えば、化合物は、抗原、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または真菌抗原等の疾患関連抗原を含む。抗原は、精製されていてもよいし、他の成分との混合物中に存在していてもよく、例えば、腫瘍細胞溶解物等の細胞溶解物または対象（例、感染症に罹患している対象）由来の生検感染したまたは疾患に罹患した組織の溶解物に存在する。いくつかの例において、抗原は、完全な、全長（または未処理）タンパク質抗原、例えば、７、８、９または１０個のアミノ酸の長さを超えるタンパク質またはペプチドを含む。他の積み荷分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、コーディングオリゴヌクレオチドまたは非コーディングオリゴヌクレオチド等の核酸、並びに小分子プローブ等の小分子が挙げられる。ＤＮＡ等の核酸、例えばプラスミド等の発現ベクターも、ウイルスベクターを必要とせずにこの方法で送達される。
いくつかの例では、免疫細胞は活性化状態と比較すると休止状態にある。例えば、細胞は、以下のマーカー、すなわちＣＤ２５、ＫＬＲＧ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＭＨＣ−１、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１及びＣＸＣＲ５の発現により、特徴づけられ、これらのそれぞれは操作され得る（記載された方法を用いて免疫細胞に分子を導入することによって増加または減少し得る）。細胞懸濁液は、処理された細胞、例えば再懸濁された軟膜（バフィコート）細胞（分画された白血球）または全血を含む。ナイーブ免疫細胞、例えばＴ細胞は、（活性化細胞と比較して）ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、及びＣＴＬＡ−４の発現レベルが比較的低いこと、及びＣＣＲ７のレベルの比較的高いことによって特徴付けられる。
化合物を、非免疫細胞と比較して、免疫細胞に優先的に送達するためのデバイスは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネル、例えば注射器の形態のもの、または、複数のチャンネル、例えばマイクロチップまたはマイクロ流体デバイスの形態のもの、を含む。例えば、チャネルは、３０μｍの狭窄長さと４μｍの狭窄幅とを含む。
本発明はまた、化合物の細胞内送達による免疫細胞機能の操作方法であって、その送達が免疫細胞の細胞質を取り囲む膜を一時的に破壊し、細胞質ゾルに抗原を送達することによって調節（仲介）される当該方法を含む。例えば、抗原は２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸より大きい長さを含み、且つ免疫細胞は抗原を１１個のアミノ酸の長さより小さいペプチドに加工する。次いで、細胞は、免疫細胞の表面に、より短い、処理されたペプチド、抗原のクラスＩ組織適合性抗原に制限処理された形態を提示する。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞へのクラスＩ提示のために処理されたＭＨＣ／ＨＬＡのペプチドは８〜１０残基の範囲にあり、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはヘルパー細胞へのＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩＩ提示のために処理されたペプチドは１４〜２０残基の範囲である。８残基より短いペプチド（例えば、２、３、４、５、６または７残基）は、他のＴ細胞型またはＮＫ細胞への提示に有用である。
例えば、細胞膜は、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を介して免疫細胞を通すことによって破壊される。細胞の圧窄により細胞質ゾルに送達される抗原は、完全長の未処理タンパク質またはペプチドであり、これらは抗原提示細胞による抗原提示のための組織適合性抗原との結合に適したサイズ／長さに加工されなければならない。免疫細胞機能を操作する方法は、抗原負荷免疫細胞をエフェクターＴ細胞と接触させ、細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を活性化させることをさらに含むことができる。いくつかの例において、圧搾された抗原負荷免疫細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞またはマクロファージを含む。他の例では、圧搾された抗原負荷免疫細胞はＴ細胞を含む。いずれの場合においても、圧搾された抗原負荷免疫細胞は、圧搾の非存在下、例えば、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシス単独による取り込みで、同じ抗原またはペイロードと接触した免疫細胞と比較して、少なくとも１０％、２５％、５０％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、またはそれより大きい抗原または他のペイロード組成物を含む。
免疫細胞の機能、活性または活性化状態はこのような処理の後に変更される。例えば、Ｔ細胞上に抗原提示表現型を付与する方法は、Ｔ細胞を上記のようなマイクロ流体デバイスに通すことによって、抗原、例えば、未処理のタンパク質全体またはその断片をＴ細胞の細胞質ゾルに送達することによって実施される。例えば、デバイスは、約２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、Ｔ細胞は、マイクロ流体デバイスを通過した後、Ｔ細胞の表面上にクラスＩ組織適合性抗原−制限処理された形態の抗原を含む。方法は、第１の（狭窄された抗原負荷された）Ｔ細胞を、さらに、クラスＩ組織適合抗原制限細胞傷害性Ｔ細胞表現型を含む第２のＴ細胞に、接触させることを含み得る。例示的な抗原は、１種以上の腫瘍抗原、例えば、腫瘍生検溶解物のような腫瘍抗原の混合物、またはウイルス抗原を含む。このような抗原負荷Ｔ細胞の産生は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するためにインビトロ及び／またはインビボで使用される。従って、抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化するための、細胞を圧搾された抗原負荷Ｔ細胞の使用が本発明に包含される。例えば、そのようなＴ細胞は、送達／負荷された抗原に依存して、腫瘍細胞を死滅させること及び／またはウイルス感染細胞を死滅させることによって臨床利益をもたらす。
本明細書に記載の組成物は精製される。精製された化合物は、少なくとも６０重量％（乾燥重量）の目的の化合物である。調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の目的の化合物であることが好ましい。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析等の任意の適当な標準的方法によって測定される。例えば、化合物、例えばタンパク質抗原は、天然に存在する１種以上の化合物から分離されている。細胞の場合、精製された集団は、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の選択された細胞タイプである。特定の細胞型を精製または富化する方法は周知であり、細胞選別機等のデバイスを用いたサイズまたは細胞表面マーカー発現による分離が挙げられる。
本発明の他の特長及び利点は、その好ましい実施形態の以下の説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
図１Ａは送達システムを示す一連の図である。システムをセットアップするために、各マイクロ流体チップが、ポリカーボネート流体リザーバとのインターフェースを可能にするホルダに取り付けられる。システムを操作するために、送達される巨大分子を細胞と混合し、約３０〜１５０μｌの体積でデバイスリザーバに装填し、次いで流れがマイクロ流体チャネルを通るように誘導するために圧力源に接続する。図１Ｂは、細胞変形及びペイロード送達を示す図である。細胞がチャネルを通って流れる時、それらは狭窄部で変形し、膜破壊をもたらす。流体中の巨大分子は、次いで破壊された膜を通って拡散し、膜が修復された後も細胞内に閉じ込められたままである。これらの数字は、細胞の圧搾による送達を示す。 図２Ａ及びＢは、ネズミ免疫細胞へのデキストラン及び抗体送達を示すヒストグラム及び棒グラフである。図２Ａは、ＡＰＣ標識ＩｇＧ１を送達するためにＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅデバイスによって処理されたＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）の代表的なヒストグラムを示す。図２Ｂは、送達効率を示す。全ての結果は、処理の１時間以内にフローサイトメトリーによって測定した。死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウム染色によって除外した。図２Ｂのデータ（平均±標準偏差）は３回の独立した実験からのものである。未処理の細胞は、デバイスに通されなかったか、または生体分子に曝露されなかった。「デバイスなし」試料は、生体分子と共にインキュベートされたが、デバイスによって処理されなかった。この対照は、表面結合、エンドサイトーシス及び他のバックグラウンド効果を説明するように意図されている。 図３Ａ〜図３Ｄは、ヒト免疫細胞へのデキストラン、抗体及びｓｉＲＮＡの送達を示すグラフである。図３Ａにおいて、ヒトＴ細胞及びＭＤＤＣを、カスケードブルー標識３ｋＤａデキストラン、フルオレセイン標識７０ｋＤａデキストラン及びＡＰＣ標識ＩｇＧ１の送達について試験した。３０−４（Ｔ細胞）及び１０−７（ＭＤＤＣ）デバイス（左）及び複数のデバイスデザイン（右）の複製についての代表ヒストグラムを表示する。図３Ｂは、それぞれＣＤ４＋Ｔ細胞及びＭＤＤＣにおけるＣＤ４及びＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質レベルのｓｉＲＮＡ媒介（仲介）ノックダウンを示す。異なるｓｉＲＮＡ濃度及びデバイス設計を試験して、用量または狭窄サイズに対するノックダウン依存性を評価した。図３Ｃは、ヒト調節性Ｔ細胞も３０−４デバイスによる処理に応答してＣＤ４発現の有意なノックダウンを示したことを示す。死んだ細胞は、送達またはノックダウン分析のためには除外された。図３Ｄは、Ｔ細胞におけるデバイス性能とＡｍａｘａによるヌクレオフェクションとの比較を示す。ＣＤ４に対するｓｉＲＮＡの送達７２時間後のタンパク質発現が、２つの系について示されている。２つの方法による処理後の細胞生存率も示されている。 図４Ａ〜４Ｂは、内因性及びウイルス性遺伝子の標的化ノックダウンによるＨＩＶ感染の阻害を示すグラフである。図Ａでは、感染後ｐ２４時間に処理したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ感染レベルの指標としてｐ２４抗原の細胞内染色を用いた。これらの試験では、ｖｉｆ及び／またはｇａｇ、ｓｉＲＮＡは感染の２４時間前に送達され、一方ＣＤ４ｓｉＲＮＡは感染４８時間前に送達された。図４Ｂは、実験条件の繰り返し（最小Ｎ＝４）にわたるｐ２４抗原染色の中央蛍光強度を示す。データは、平均＋１標準誤差として表される。 ワクチン接種方法の図である。 マウス初代免疫細胞への３ｋＤａ及び７０ｋＤａのデキストラン及び抗体の取り込みを示す一連の折れ線グラフである。送達効率値を計算するために使用されるゲーティングが示されている。これらのデータは、図２に示された実験に対応する。灰色で塗りつぶしたヒストグラムは未処理細胞を表し、黒色は、物質に曝露されたが、デバイスで処理されなかった細胞を表し、赤色は、標的生体分子の存在下でデバイスにより処理された細胞を表す。 図２に示された実験に対応する細胞生存率データを示す一連の棒グラフである。＊＊＊は、３０−４デバイスで処理した細胞の生存率を、デバイス無しまたは未処理の場合と比較するとｐ＜０．００１を示した。このデバイスで処理したＢ細胞及び骨髄細胞の生存率の変化は、未処理またはデバイス無しの場合と有意に異ならなかった。 骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）へのデキストラン及び抗体の送達を示す一連のグラフである。骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ含有培地中で８日間インキュベートすることにより、Ｃ５７ＢＬ６マウスからＢＭＤＣを生じさせた。カスケードブルー標識３ｋＤａデキストラン、フルオレセイン標識７０ｋＤａデキストラン、及びＡＰＣ標識ＩｇＧ１を、２つのデバイス設計、１０−６及び３０−６を用いて送達した。 抗体とデキストランの送達の相関を示すグラフである。物質とのインキュベーション（即ちデバイスなし（黒い点；左下））と比較した３０−４デバイス（灰色の点；中央、右上）を用いたＴ細胞へのデキストラン（３ｋＤａ及び７０ｋＤａ）及び抗体の送達。 ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の生存率を示す棒グラフである。デバイスを通過する細胞は、未処理対照と比較して生存率が低下したが、ヌクレオフェクションを受けた細胞よりも良好な生存率を有する。一元配置ＡＮＯＶＡに続いてＢｏｎｅｆｅｒｒｏｎｉ検定を用いて統計的有意性を計算した。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。比較の他の群は有意に異なる生存率を示さなかった（即ち、未処理または３０−４と比較して１０−４、及びヌクレオフェクションと比較してと比較して３０−４）。 ヒトＭＤＤＣについて異なるデバイス設計を試験した結果の、送達（上）及び生存率（下）を示す一連の棒グラフである。カスケードブルー標識３ｋＤａデキストラン、フルオレセイン標識７０ｋＤａデキストラン、及びＡＰＣ標識ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を、６つの異なるデバイス設計を用いそしてＡｍａｘａヌクレオフェクションを用いて送達した。生存率及び送達結果を処理直後に測定した。 Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ６４７標識ｓｉＲＮＡ及び３ｋＤａカスケードブルー標識デキストランが、１０−４ｉデバイスによってヒトＣＤ４Ｔ細胞、及び３０−５ｘ５ｉデバイスによってマウスＢ細胞に同時に送達されたことを示す一連のグラフである。データは、２つの物質の送達が密接に相関することを示している。この結果は、提案された拡散送達機構と一致している。即ち、送達効率は、化学構造よりもむしろ物質サイズに主に依存する。 ＣＤ４５ＲＡ発現を示すグラフである。ＣＤ４５ＲＡに対するｓｉＲＮＡを、１０−４デバイスによりヒトＴ細胞に送達した。ノックダウンは、処理７２時間後にフローサイトメトリーにより測定した。 （送達後４８時間のＰＣＲによって測定された）ＣＤ４ｍＲＮＡノックダウンを示す棒グラフである。 フローサイトメトリーによって測定された処理後２週間にわたるＣＤ４＋ヒトＴ細胞におけるＣＤ４の発現レベルを示す一連の棒グラフである。ＣＤ３レベルも対照遺伝子として測定した。 モデル積み荷であるデキストランのヒト単球への送達を示す一連のグラフである。単球はヒト血液由来であった。カスケードブルー標識３ｋＤａデキストラン及びフルオレセイン標識７０ｋＤａデキストランを、２つの異なる動作圧力で４つの異なるデバイス設計を用いて送達した。０ｐｓｉの場合は、デキストランに暴露のみされたがデバイスによって処理されなかった対照に対応する。生存率は、ヨウ化プロピジウム染色により測定した。 ヒトＢ細胞へのデキストランの送達を示す一連のグラフである。Ｂ細胞はヒト血液由来であった。カスケードブルー標識３ｋＤａデキストラン及びフルオレセイン標識２ＭＤａデキストランを、２つの異なる動作圧力で５つの異なるデバイス設計を用いて送達した。０ｐｓｉの場合は、デキストランに暴露のみされたがデバイスによって処理されなかった対照に対応する。生存率は、ヨウ化プロピジウム染色により測定した。 処理後７２時間のＤＣ−ＳＩＧＮの測定されたタンパク質レベルを示す棒グラフである。タンパク質ノックダウンは、６つの異なるデバイス設計にわたって測定され、ヌクレオフェクションと比較された。対照ｓｉＲＮＡ送達の場合でさえ、ヌクレオフェクションはＤＣ−ＳＩＧＮの約５０％非特異的ノックダウンを引き起こすように見えることに留意されたい。これはエレクトロポレーション処理によるオフターゲット効果、即ち細胞、特に標的タンパク質の損傷をもたらす細胞の電場への曝露は、タンパク質を標的とするｓｉＲＮＡの非存在下での発現レベルの測定低下をもたらすことを示し得る。これらの結果は、非特異的（オフターゲット）効果に関連するエレクトロポレーション／ヌクレオフェクション法と比較して、膜変形方法がより特異的であることを示している。 不透過性Ａｌｅｘａ−４８８標識１０ｋＤａデキストラン色素の全血中細胞への送達に関するデータを示す一連のグラフである。蛍光標識した色素を全血と混合し、全血＋標識した色素の混合物をデバイスに通し、次いでＲＢＣ溶解後のＦＡＣＳによる血液細胞への送達を測定した。結果は、色素が細胞にうまく送達され、「細胞不透過性」として特徴付けられた積み荷化合物が、細胞の圧搾を用いて効果的に免疫細胞に送達されることを実証している。送達プロセスが全血で機能することは驚くべきことである。全血は、精製（例えば、末梢血単核細胞の赤血球からの分別または分離）せずに操作することが非常に困難であるが、本明細書に開示されるデバイスは、全血で免疫細胞に化合物をうまく送達することができる。非限定的な例については、図３３及び図３４を参照。 微小流体膜破壊システムの図である。 図２１Ａ〜２１Ｂは、Ｏｐｔｉｍｅｍ緩衝液中、１２０ｐｓｉで１０−４チップを送達した１日後のｍＲＮＡ発現を示すドットプロットである。 図２２Ａはダイアグラムであり、図２２Ｂは異なるチップ角度での、様々な圧力における１０ｋＤａのＡｌｅｘａ４８８標識デキストランの送達を示す棒グラフである。括弧内の数字は狭窄角である。チップ角範囲は０〜１８０度、例えば１１〜１０５度である。概略図はチップの角度を示す。深さパラメータは、２μｍ〜１ｍｍの範囲、例えば約２０μｍであり、米国特許公開第２０１４０２８７５０９号（本明細書中に参照により組み込まれる）にさらに記載されている。例示的なパラメータには、ナイーブＴ細胞及びＢ細胞について０〜３０μｍの長さ／３〜４μｍの幅／２０μｍの深さ／１１度の角度が含まれる。 ＮＫ細胞及びｐＤＣへの転写因子送達を示す折れ線グラフである。Ｏｃｔ４ｍＲＮＡ発現を、Ｏｃｔ４組換えタンパク質の脾臓マウスＮＫ細胞への送達の４時間後に測定した。これらのデータは、転写因子が活性であり、内因性Ｏｃｔ４の発現を誘導することができることを示している。Ｏｃｔ４転写因子は、ｉＰＳ生成に必要な４つの因子（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、Ｓｏｘ２）の１つであり、それ自体に対して正のフィードバック制御を行う。活性Ｏｃｔ４タンパク質の送達は、Ｏｃｔ４ｍＲＮＡ発現を増加させる。活性転写因子の送達は、タンパク質ベースの方法のための再プログラミングプロセスにおける重要なステップである。これらの方法は、ウイルス及びＤＮＡベースのシステムよりも統合のリスクを最小限に抑えるので、多くの利点を有する。 図２４Ａ〜Ｂは、圧搾に応答して正常なＤＣ機能の阻害の検出が観察されなかったことを示す折れ線グラフである。図２４Ａ：圧搾することによる処理の後、抗原エンドサイトーシスのみの処理後にＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で培養された脾臓ＤＣ、及び未処理細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を上方制御する能力において検出可能な差異を示さなかった。非刺激エンドサイトーシス条件及び４℃に維持された未処理細胞を対照として使用した。図２４Ｂ：ＣＤ４５共通遺伝子マウス由来の脾臓ＤＣを、ＬＰＳ（１ｕｇ／ｍｌ）と共にＣ５７ＢＬ６マウスの足蹠に注射し、注射後１８時間で排液リンパ節に回収した。リンパ節ホーミング能力（帰巣性）に有意差が検出されなかった。 図２５Ａ〜２５Ｄは、膜変形デバイスシステム及び方法の使用が、他の抗原送達アプローチと比較してより有効な抗原提示をもたらすことを示すグラフである。図２５Ａ：皮下ＤＣワクチン接種に応答して養子移入されたＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞のインビボ増殖。デバイスで処理したＢＭＤＣ（０．１ｍｇ／ｍ１のＯｖａ）は、抗原をエンドサイトーシスさせたものと比較して、Ｔ細胞増殖において有意な増加（Ｐ＜０．０００１）を示した。図２５Ｂ：Ｏｖａ発現メラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞溶解物で処理したＢＭＤＣと共インキュベートしたＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞のインビトロ増殖。％は、１０−６Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅデバイスによる処理の前にＢＭＤＣ細胞懸濁液に添加された細胞溶解物の画分を示す。ＣＤ８Ｔ細胞を、ＡＰＣと接触させる前にカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。それらが増殖すると、ＣＦＳＥ色素は娘細胞の間に分布し、細胞あたりの蛍光強度が低下する。未増殖Ｔ細胞は高いＣＦＳＥ強度を保持する。図２５Ｃ：抗原特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８Ｔ細胞の画分を測定すること。これらの実験において、マウスは、養子移入されたＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の非存在下でＯｖａに対してワクチン接種された。ワクチン接種の７日後にワクチン接種したマウスの脾臓を単離し、インビトロにてＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＯＶＡエピトープ）でそれらを再刺激することによって、内因性抗原特異的応答を測定した。抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞は再刺激に応答してＩＦＮγを分泌する。図２５Ｄは、２つの異なるデバイス設計（０．１ｍｇ／ｍｌ Ｏｖａ）で処理したＢ細胞と共インキュベートしたＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞のインビトロ増殖。これらの実験では、ＣｐＧをアジュバントとして使用した。 インビボでのＣＦＳＥ増殖アッセイの結果を示すグラフである。このグラフは、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を測定している。ＣＤ８Ｔ細胞が活性化され、マウスにおいて増殖するにつれて、それらはＣＦＳＥ色素を希釈し、より低い蛍光強度を有する。この場合、デバイスまたは陽性対照によって処理されたドナーＴ細胞は、受容マウスにおいてはるかに大きなＣＤ８Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらした。それに反して、エンドサイトーシス対象は、最小の効果しか示さない。 抗原処理した野生型Ｔ細胞によるワクチン接種に応答したマウスにおける抗原特異的ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の増殖を示す一連のヒストグラムである。Ｔ細胞増殖応答はＣＦＳＥ染色によって測定され、染色は細胞が増殖するにつれて希釈される。強度が低いほど応答が大きいことを示し、強度のピークが高いほど応答がない／より少ないことを示す。各縦列は、同じマウス由来のリンパ節及び脾臓での実験の繰り返しを表す。実験の各縦列には３匹のマウス（合計９匹のマウス）が含まれた。 図２８Ａ〜Ｂは、ＤＱ−ＯＶＡ＋３ｋＤａ−デキストラン＋Ｔ細胞の両方におけるゲーティングを示すヒストグラムである。 抗原提示細胞としてのマウスＴ細胞の使用を示す棒グラフである。未処理オボアルブミン抗原を負荷するために細胞を圧搾して処理したＴ細胞を、ＯＴ−１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞株）と共に培養し、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９を評価した。 抗原提示細胞としてのＢ細胞の圧搾媒介性の産生を行い、特徴付けるための例示的な手順の概略図である。 細胞圧搾されたＢ細胞が強力なＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導したことを示す一連のヒストグラムである。 細胞圧搾した樹状細胞（ＯＶＡが送達された）がガンマインターフェロンを分泌することを示す一連のヒストグラムである。 改変されていない全血におけるヒトＢ及びＴ細胞への１０ｋＤａ物質の直接送達を示すデータ及び漫画を示す。 全血における生存率及び送達効率を示すグラフである。
ベクターを含まないマイクロ流体送達プラットフォーム（ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅ）は、最小限の細胞傷害性で、一次免疫細胞、例えばマウス、ヒト、の細胞質ゾルに巨大分子を直接送達するために使用される。このアプローチの基礎を成す原理は、標的細胞の急速な機械的変形または圧搾による一時的な膜破壊であり、これは、液体媒体中の巨大分子の拡散による取り込みを可能にし、続いて細胞膜修復が行なわれる（例えば、米国特許公開第２０１４０２８７５０９を参照、これは本明細書に参照により組み込まれる）。マイクロ流体デザインのライブラリーを使用して、デキストランポリマー、抗体及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等の試験化合物の取り込みを、初代ヒト及びマウスＴ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、及び樹状細胞＋に送達した。この結果は、様々な異なる、サイズ及び種類の巨大分子を送達するためのプラットフォームの有用性を実証している。異なる細胞クラスの細胞（直径８〜３０μｍ）、異なる形態、異方性及び膜の柔軟性を有する異なるクラスの免疫細胞への物質の効率的な送達には、異なる細胞型について特定の条件の特定を必要とした。セルの圧搾のためには、狭窄部の幅が重要なパラメータであり、幾何学要素、速度、バッファ、及び温度等の他のパラメータも、積み荷の送達に影響する可能性がある。ナイーブＴ細胞またはＢ細胞への積み荷の送達のための例示的な狭窄幅は、３〜４μｍの範囲である。活性化されたＴ細胞またはＢ細胞への送達のためには、４〜６μｍ、樹状細胞への送達のためには、６〜８μｍである。
ｓｉＲＮＡの送達は、強力な遺伝子ノックダウンをもたらした。さらに、抗ウイルスｓｉＲＮＡのＣＤ４＋Ｔ細胞への送達は、ＨＩＶ複製を阻害し、マイクロ流体に基づく送達の機能的有用性を実証した。同様に、樹状細胞及びＢ細胞への抗原性タンパク質の送達は、インビトロ及びインビボで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のより有効な抗原提示及びより大きな活性化／増殖をもたらした。生存率の低下を最小限に抑えて堅牢な細胞内に送達するためのプラットフォームを提供することで、細胞の圧搾は、研究及び臨床応用のための免疫細胞機能を探索し、制御するための柔軟で有用なツールであることを示している。
一次免疫細胞、特に休止リンパ球への、タンパク質及びｓｉＲＮＡ等の生体分子の細胞内送達は困難となっている。本明細書に記載のベクター無しのマイクロ流体プラットフォームは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、及び樹状細胞等の免疫細胞への、巨大分子の細胞内送達を導く、細胞の急速な機械的変形による一時的な膜破壊を引き起こす。１６のマイクロ流体デバイス設計のライブラリーが、ヒト及びマウスの免疫細胞にデキストランポリマー、ｓｉＲＮＡ及び抗体を送達する能力について試験された。送達された物質の活性は、ＣＤ４５、ＤＣ−ＳＩＧＮ、及びＣＤ４タンパク質のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを測定することによって確認された。ウイルスベクターも電場も必要としないマイクロ流体送達は、エレクトロポレーションと同等またはより良好な送達をもたらし、細胞傷害性もより少なかった。疾患適用におけるこの技術の有用性は、ウイルスのｖｉｆ及びｇａｇ遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡで処理された初代ヒトＣＤ４Ｔ細胞において、ＨＩＶウイルス複製を阻害することによって示された。従って、ベクターを用いないマイクロ流体送達は、これまで技術者にとって困難であった細胞（例えば、一次免疫細胞）への巨大分子の細胞質送達の障害を克服する方法を提供するものである。このため、本方法及びデバイスは、免疫細胞機能の操作に有用である。
ある特定の態様では、本開示は、免疫細胞を含む細胞懸濁液をマイクロ流体デバイスに通し、懸濁液を化合物と接触させることを含む、化合物を免疫細胞の細胞質ゾルに優先的に送達する方法に関するものであり、このデバイスは、約２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍまたは２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、免疫に送達される化合物の量は非免疫細胞に送達されるものより少なくとも１０％大きい。ある特定の態様では、本開示は、免疫細胞を含む細胞懸濁液を、マイクロ流体デバイスに通し、懸濁液を化合物と接触させることを含む、化合物を免疫細胞の細胞質ゾルに送達する方法に関するものであり、このデバイスは約２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、または２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含む。
「細胞が圧搾された」という用語は、狭窄部を含むマイクロ流体デバイスに細胞懸濁液を通過させることを含む方法を指す。いくつかの実施形態において、細胞懸濁液は、マイクロ流体デバイスを通過する前、同時、またはその後に、化合物と接触する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、デバイスを通過することなく、化合物と接触した免疫細胞と比較して、デバイスを通過後、化合物を少なくとも１０％、２５％、５０％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、またはそれより多く含む。
免疫細胞機能の操作
膜の一体性を一時的に破壊または変形させることによって免疫細胞の細胞内空間に物質を送達することにより、内部機構を調べて特徴づけることができ、それらの機能を多様な用途に操作または変更することができる。
細胞の機能を操作し、及び／またはその内部作用を理解する有効な方法は、物質（例えば、生物活性分子）を細胞に導入し、細胞内プロセスを直接操作することである。本明細書に記載の方法は、細胞が存在する媒体の内容を操作すること及び／または表面受容体との結合を介してシグナル伝達することに主として焦点を絞った既存または以前のアプローチと比較して利点を有する。免疫細胞への細胞内送達は、既存の技術または以前の技術を使用する際の重大な課題である。本明細書に記載のＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅプラットフォームは、免疫細胞に多様な物質を送達し、インビボ及びインビトロで細胞機能に影響を及ぼす能力を示した。これらの方法は、臨床使用のために免疫細胞機能（例えば、養子免疫伝達療法）をプログラムする（または再プログラムする）ために有用である。さらに、この方法は、薬物標的を同定及び／または診断のために免疫学的機構を試験及び解明するために有用である。
本発明の態様は、化合物が全血中に留まる間に化合物が免疫細胞（例えば、ヒトＢ及びＴ細胞）に送達され得るという驚くべき発見に関する。全血は、精製することなく、例えば、赤血球から末梢血単核細胞の分別または分離すること無く操作することが困難である。しかしながら、本明細書で開示されるデバイス及び方法は、全血内の免疫細胞に化合物を送達する。本発明は、異種混合物（免疫細胞、赤血球、血漿／血清）を細胞圧搾デバイスに通す前に、免疫細胞を全血から分離する必要なく、免疫細胞への化合物の送達を可能にする。この注目すべき結果は、重要な技術的利点を有し、場合によっては、患者のベッドサイド治療を可能にするだけでなく、例えば戦場などの細胞分画が利用できない状況で細胞を処理する能力を付与できる。例えば、対象は、全血を除去し、本発明のデバイスを介して処理した後、例えば連続プロセスで、再注入することができる。免疫細胞の単離または富化は必要ではないので、細胞の操作が少なくて済み、細胞は人工媒体等の媒体を用いて処理する必要はない。さらに、高レベルの生存率を維持しながら、全血中の免疫細胞を高効率で処理することができる。例えば、図３３及び図３４を参照。
前述の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、細胞懸濁液は哺乳動物細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は混合細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は全血である。いくつかの実施形態において、細胞懸濁液は、軟膜細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液はリンパ液である。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、末梢血単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、精製された細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、初代細胞または細胞株細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は血液細胞である。いくつかの実施形態では、血液細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ＮＫＴ細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球または好中球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞及びＢ細胞等の適応免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は自然免疫細胞である。例示的な自然免疫細胞には、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、ＩＬＣ３）、好塩基球、好酸球、肥満細胞、ＮＫ細胞、好中球及び単球が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫細胞はメモリー細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は初代ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、サルまたはウサギ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は非哺乳動物細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ニワトリ、カエル、昆虫または線虫細胞である。
いくつかの例では、免疫細胞は、活性化状態と比較して休止状態にあり、例えば、活性化状態にある細胞は、休止状態の同じ表現型の細胞と比較して、より大きな直径を一般に含む。例えば、細胞は、以下のマーカー、すなわちＣＤ２５、ＫＬＲＧ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１及びＣＸＣＲ５の発現により特徴づけられ、それらの各々は、調節され得る（記載された方法を用いて免疫細胞に分子を導入することによって増加または減少され得る）。いくつかの実施形態において、免疫細胞への化合物の送達により、免疫細胞上で１つ以上のマーカーの発現が増加する。いくつかの実施形態において、免疫細胞への化合物の送達により、免疫細胞上で１つ以上のマーカーの発現が減少する。いくつかの実施形態では、免疫細胞への化合物の送達により、１つ以上のマーカーの発現が増加し、１つ以上のマーカーの発現が免疫細胞で減少する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はナイーブ免疫細胞である。ナイーブ免疫細胞、例えばＴ細胞は、活性化免疫細胞の発現レベルと比較して、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、及びＣＴＬＡ−４の発現レベルが比較的低く、且つＣＣＲ７の発現レベルが比較的高い（活性化細胞に比較して）ことにより特徴づけられる。
本主題の態様は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関する。ＭＨＣの主要な機能は、病原体に由来するペプチド断片に結合し、適切なＴ細胞による認識のために細胞表面にそれらを提示することである。ヒトにおいては、ＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡ（ＨＬＡ―Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ）は、細胞内部からペプチドを表す。例えば、細胞がウイルスに感染している場合、ＨＬＡ系はウイルスの断片を細胞の表面に持ち込み、免疫系によって細胞を破壊することができるようにする。これらのペプチドは、プロテアソーム中で分解された消化されたタンパク質から産生される。一般的に、またＭＨＣ−１に関して、これらの特定のペプチドは、約８〜１０個のアミノ酸の長さの小さなポリマーである。ＭＨＣクラスＩによって提示される外来抗原は、細胞を破壊するキラーＴ細胞（ＣＤ８陽性または細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる）を引き付ける。ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡ（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲ）は、細胞外からＴリンパ球への抗原を表す。これらの特定の抗原は、Ｔヘルパー細胞の増殖を刺激し、次にそれは抗体産生Ｂ細胞を刺激してその特異抗原に対する抗体を産生する。自己抗原は調節性Ｔ細胞によって抑制される。
ある特定の態様において、本開示は、化合物または組成物を細胞に送達するための方法に関する。いくつかの実施形態では、化合物は単一の化合物である。いくつかの実施形態では、化合物は化合物の混合物である。いくつかの実施形態では、化合物は核酸を含む。いくつかの実施形態では、化合物は核酸である。例示的な核酸には、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞内の核酸と相同である。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞内の核酸に対して異種である。いくつかの実施形態では、化合物はプラスミドである。いくつかの実施形態では、核酸は治療用核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は治療用ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、核酸は、レポーターまたは選択マーカーをコードする。例示的なレポーターマーカーには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、エクオリン（ａｕｑｕｏｒｉｎ）、ベータガラクトシダーゼ、ユーロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｇｅｎ）ＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＵＭＴ）及びルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーには、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びチミジンキナーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、化合物は、ＭＨＣ複合体をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、化合物は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ複合体をコードする核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、キメラ抗原受容体、例えば、キメラＴ細胞受容体、をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は組換えＴ細胞受容体をコードする。例えば、キメラ抗原レセプターをコードする核酸は、ＣＡＲ−Ｔの発現を維持するために、ウイルスを含まない方法で、即ち、細胞圧搾で、Ｔ細胞に導入される。例えば、ＤＮＡの導入は、ウイルス粒子を使用せずに達成される。しかしながら、核酸構築物は、組込みを助け得るか、または染色体外の核酸として維持され得るウイルスゲノム要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、化合物はタンパク質またはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、化合物はタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、治療用タンパク質、抗体、融合タンパク質、抗原、合成タンパク質、レポーターマーカー、または選択マーカーである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＥリコンビナーゼ等の遺伝子編集タンパク質またはヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、抗体薬物複合体等のキメラタンパク質薬物、或いはＧＳＴまたはストレプトアビジンでタグ付けされたタンパク質等の組換え融合タンパク質を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、化合物は転写因子である。例示的な転写因子としては、Ｏｃｔ５、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３、及びＲＯＲγｔが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸はトランスポゾンである。トランスポゾン、すなわち転移因子は、それ自体をゲノム内の別の位置に挿入するＤＮＡ断片である。
いくつかの実施形態では、化合物は抗原を含む。いくつかの実施形態では、化合物は抗原である。抗原は、細胞または抗体媒介免疫応答のような特異的免疫応答を刺激する物質である。抗原は、特定の抗原、またはＭＨＣ／ＨＬＡヘテロ二量体のような抗原提示分子に特異的であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等の免疫細胞によって発現される受容体に結合する。抗原−受容体結合は、その後、細胞活性化、サイトカイン産生、細胞遊走、細胞傷害性因子分泌、及び抗体産生等の下流の免疫エフェクター経路に導く細胞内シグナル伝達経路を引き起こす。いくつかの実施形態では、化合物は疾患関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、細菌、真菌、ウイルスまたはアレルゲン等の外来の起源に由来する。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍細胞または自己タンパク質（即ち自己抗原）等の内部供給源に由来する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍溶解物中に存在する。自己抗原は、生物自体の細胞上に存在する抗原である。自己抗原は、通常、免疫応答を刺激しないが、Ｉ型糖尿病または関節リウマチ、多発性硬化症（及び他の脱髄疾患）等の自己免疫疾患の状況では刺激し得る。いくつかの実施形態では、抗原はネオ抗原である。ネオ抗原は、正常なヒトゲノムには存在しないが、新規タンパク質配列を形成する腫瘍特異的ＤＮＡ修飾の結果として発がん細胞内に生成される。典型的なウイルス抗原には、ＨＩＶ抗原、エボラ抗原、ＨＰＶ抗原、及びＥＢＶ抗原が含まれ、それらは、混合物として精製または送達されるか、或いは死滅または弱毒化されたウイルスまたはウイルス断片として送達される。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６のがん遺伝子Ｅ６及びＥ７に由来する。いくつかの実施形態において、化合物は、未知の病原体に感染した組織由来の細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、脂質、糖脂質、または多糖類などの非タンパク質抗原である。
いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、レポーターまたは選択マーカーである。例示的なレポーターマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、エクオリン（ａｕｑｕｏｒｉｎ）、ベータガラクトシダーゼ、ユーロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｇｅｎ）ＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＵＭＴ）及びルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーとしては、限定されないが、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びチミジンキナーゼが挙げられる。
いくつかの実施形態では、化合物は小分子を含む。いくつかの実施形態では、化合物は小分子である。例示的な小分子としては、蛍光マーカー、色素、医薬品、代謝物、または放射性ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬品は治療薬及び／または細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、化合物はナノ粒子を含む。ナノ粒子の例としては、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、ナノシェル、デンドリマー、及びポソームが挙げられる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、治療用分子を含有するか、または治療用分子に（共有結合的または非共有結合的に）結合している。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ等の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、蛍光または放射性標識などの標識を含む。
本発明の態様は、細胞内抗体の送達の改善に関する。細胞内抗体の非限定的な例は、１９９９年１２月２１日に発行された米国特許第６，００４，９４０号；２００１年１２月１１日に発行された米国特許第６，３２９，１７３号；２０１０年６月１０日に公開された米国特許公開第２０１０／０１４３３７１号；及び２００６年２月１６日に公開された米国特許公開第２００６／００３４８３４号に記載されており、これらの各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。細胞内抗体の有用性に影響を及ぼす制限は、全血中内の細胞を含み、目的の細胞中に細胞内抗体発現させることとなっている。本発明はこの制限を克服し、単離された抗体または抗体をコードする構築物を免疫細胞の細胞質ゾルに送達することを可能にする。
本発明は、完全なモノクローナル抗体の送達だけでなく、免疫的に活性な抗体断片、例えばＦａｂまたは（Ｆａｂ）２断片、操作された単鎖Ｆｖ分子、またはキメラ分子、例えば、一方の抗体（例えばマウス起源の抗体）の結合特異性及び他の抗体（例えばヒト起源の抗体）の残存部分を含む抗体である。別の例において、キメラ分子は、ＣＤ３−ゼータ膜貫通及びエンドドメインに融合したモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してゼータシグナルを伝達する。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変部分は、可撓性リンカーにより融合されてｓｃＦｖを形成する。このｓｃＦｖの前に、新生タンパク質を小胞体に、その後に表面発現に導くためのシグナルペプチドがある。柔軟なスペーサーは、抗原結合を可能にするためにｓｃＦｖが異なる方向に配向させる。膜貫通ドメインは、通常、細胞内に突出して所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの元の分子に由来する典型的な疎水性アルファヘリックスである。そのようなキメラ抗原レセプターは、本明細書に記載のマイクロ流体圧搾方法を用いてＴ細胞に送達される。
いくつかの実施形態において、化合物は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、化合物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合物である。抗原結合に際して、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、サイトカインまたは細胞溶解分子の放出等の免疫細胞における活性化関連応答を開始することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、キメラＴ細胞抗原受容体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、化合物はＴ細胞機能を増強する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞機能を増強する化合物は、免疫チェックポイント経路阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント経路阻害剤としては、限定されないが、プログラム死１経路阻害剤、プログラム死リガンド１経路阻害剤、及び抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４経路阻害剤が挙げられる。例えば、免疫チェックポイント経路阻害剤は、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４シグナル伝達に関与するチロシンホスファターゼであるＳＨＰ２を標的とすることができる。
いくつかの実施形態では、化合物は、蛍光標識された分子を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、蛍光タグ付き分子、例えば、パシフィックブルー、Ａｌｅｘａ２８８、Ｃｙ５、またはカスケードブルー等の蛍光色素標識分子である。いくつかの実施形態では、化合物は、放射性ヌクレオチド、デキストラン粒子、磁気ビーズ、または不透過性色素である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＰａｃＢｌｕｅで標識された３ｋＤａのデキストラン粒子である。いくつかの実施形態において、化合物は、Ａｌｅｘａ４８８で標識された１０ｋＤａのデキストラン粒子である。いくつかの実施形態では、化合物は小分子フルオロフォア標識タンパク質である。いくつかの実施形態において、化合物は、Ａ１ｅｘａ６４７で標識された小分子である。いくつかの実施形態では、化合物はウイルスまたはウイルス様粒子を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは治療用ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子は、治療用ポリペプチド等の治療用分子をコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は寛容誘発因子を含む。いくつかの実施形態では、化合物はアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、化合物は分化因子を含む。Ｔ細胞の分化及び／または活性化／成熟を促進するためにＴ細胞の細胞質ゾルに送達される例示的な分化因子としては、Ｔ−ｂｏｘ転写因子Ｔ−ｂｅｔ及びＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）、ＮＦκＢ及び／またはフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）が挙げられる。
細胞内送達のための例示的な化合物及び組成物には、以下が含まれる。
・核酸、特に：化学的、生物学的または他の方法で修飾された、ＤＮＡ（プラスミドまたは他のオリゴ）及びＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ）。タンパク質：例えば、抗体、阻害剤、酵素（例えば、キナーゼ）、転写因子、リボソーム、抗原、細胞溶解物。
・ペプチド：長鎖（１００〜１０，０００アミノ酸）及び短鎖（１〜１００アミノ酸）。ナノマテリアル：例えば、脂質ベースのナノ粒子、ポリマーナノ粒子、カーボンナノチューブ、量子ドット、金属ナノ粒子（金を含む）。
・ウイルス：ウイルス（またはウイルス様粒子）の細胞質送達により、そうでなければ感染に耐性のある、細胞のための遺伝子送達が成功する。複製不能ウイルスの使用は、細胞機能を操作するための追加の手段である。
・他の物質：ポリマー、色素、ＴｒｉｓＮＴＡ、小分子薬、アジュバント、プローブ。
・上記のいずれかの組み合わせの混合物。
化合物／組成物が送達される例示的な細胞型（すべての適応性免疫細胞及び自然免疫細胞）の情報は、以下を含む：
・すべての哺乳動物種、例えば、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、サル。
・Ｂ細胞（例えば、ナイーブＢ細胞、形質芽球）。
・Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｍ、Ｔｅｍ、Ｔｃｍ）。
・樹状細胞（例えば、ｐＤＣ、単球由来ＤＣ、ｃＤＣ、ＣＤ８＋ＤＣ、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ、
・単球、マクロファージ。
・好中球、ＮＫ細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、ＩＬＣ３）、好塩基球、顆粒球及び肥満細胞。
・前駆細胞（造血幹細胞、ＣＬＰ、間葉系幹細胞）。
免疫細胞抗原提示の操作
本開示のある特定の態様は、免疫細胞の細胞質を取り囲む膜を一時的に破壊し、細胞質ゾルに抗原を送達することにより化合物の細胞内送達を含む免疫細胞機能を操作する方法に関する。いくつかの実施形態では、抗原は、７、８、９または１０個のアミノ酸を超える長さを含み、且つ免疫細胞は抗原を処理し、抗原のクラスＩ組織適合抗原で制限処理された形態を免疫細胞の表面に提示する。
本開示のある特定の態様は、狭窄部を含むマイクロ流体デバイスを介して免疫細胞を通過させ、免疫細胞を化合物と接触させることにより、化合物の細胞内送達を含む免疫細胞機能を操作する方法に関する。いくつかの実施形態では、化合物は抗原を含み、免疫細胞は抗原を処理し、免疫細胞の表面上に抗原を提示する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の表面上に抗原のクラスＩ組織適合性抗原で制限処理された形態を示す。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の表面上の抗原のクラスＩＩ組織適合性抗原で制限処理された形態を示す。いくつかの実施形態において、細胞膜は、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を通って免疫細胞を通過させることによって破壊される。いくつかの実施形態では、抗原は、完全長の処理されていないタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞をエフェクターＴ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させ、細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を活性化する。いくつかの実施形態では、免疫細胞をエフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞と接触させ、ヘルパーＴ細胞免疫応答を活性化する。いくつかの実施形態では、免疫細胞をエフェクターＴ細胞と接触させ、寛容原性Ｔ細胞免疫応答を活性化する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞、樹状細胞またはマクロファージを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞を含む。
本開示のある特定の態様は、Ｔ細胞上に抗原提示表現型を付与するための方法であって、Ｔ細胞をマイクロ流体デバイスに通すことにより、Ｔ細胞の細胞質ゾルに未処理抗原全体を送達するステップを含み、デバイスは、直径２μｍ〜１０μｍの狭窄部を含み、Ｔ細胞は、マイクロ流体デバイスを通過した後に、免疫細胞の表面上に抗原のクラスＩ組織適合性抗原で制限処理された形態を含む。本開示のある特定の態様は、Ｔ細胞上に抗原提示表現型を付与する方法に関し、この方法は、Ｔ細胞をマイクロ流体デバイスに通すことによって、Ｔ細胞の細胞質ゾルに未処理抗原全体を送達するステップを含み、デバイスは、直径２μｍ〜１０μｍの狭窄部を含み、Ｔ細胞が、マイクロ流体デバイスを通過した後に免疫細胞の表面上に抗原のクラスＩＩ組織適合性抗原で制限処理された形態を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原またはウイルス抗原を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、クラスＩ組織適合抗原制限細胞傷害性Ｔ細胞表現型を含む第２のＴ細胞とさらに接触する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、クラスＩＩ組織適合抗原で制限されたヘルパーＴ細胞表現型を含む第２のＴ細胞とさらに接触する。
本開示のある特定の態様は、抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化するために細胞圧搾した抗原負荷Ｔ細胞を使用すること関する。本開示のある特定の態様は、抗原に特異的なヘルパーＴ細胞応答を活性化するために細胞圧搾抗原負荷Ｔ細胞を使用することに関する。本開示のある特定の態様は、抗原に特異的な寛容原性Ｔ細胞応答を誘導するために、細胞圧搾抗原負荷Ｔ細胞を使用することに関する。
免疫細胞ホーミングの操作
本開示のある特定の態様は、免疫細胞にホーミング表現型を付与するための方法であって、免疫細胞をマイクロ流体デバイスに通すことによって化合物をＴ細胞の細胞質ゾルに送達することを含む方法に関し、ここでこのデバイスは、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、この化合物は、ホーミング表現型の発現を免疫細胞に付与する。例えば、送達された化合物は、ホーミングを特定の部位に導き、相反するケモカイン受容体の発現を下方制御するケモカイン受容体の発現を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、化合物は核酸を含む。いくつかの実施形態では、化合物は核酸である。例示的な核酸としては、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化合物はタンパク質またはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、化合物はタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＥリコンビナーゼ等の遺伝子編集タンパク質またはヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、化合物は転写因子である。例示的な転写因子としては、Ｏｃｔ５、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３及びＲＯＲγｔが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、転写因子はＭＨＣ複合体の細胞発現を誘導する。
いくつかの実施形態では、化合物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、化合物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合物である。抗原が関与すると、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、特定の組織または生理学的位置への、ホーミング等の免疫細胞における活性化関連応答を開始することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、キメラＴ細胞抗原受容体である。
寛容性のための免疫細胞の操作
本開示のある特定の態様は、寛容原性表現型を免疫細胞に付与する方法であって、免疫細胞をマイクロ流体デバイスに通すことによってＴ細胞の細胞質ゾルに化合物を送達することを含む方法に関し、このデバイスは、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、この化合物は免疫細胞の寛容原性表現型を有する細胞への分化を誘導する。いくつかの実施形態では、化合物は核酸を含む。いくつかの実施形態では、化合物は核酸である。例示的核酸には、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡが含まれるが、これらに限定されるのものではない。
本開示のある特定の態様は、記載された方法に従って修飾された免疫細胞を患者に導入することによって患者を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫抑制療法に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、細胞を患者から単離し、本明細書に記載の方法に従って修飾し、患者に戻す。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤がさらに患者に投与される。
カミカゼ免疫細胞の操作
本開示のある特定の態様は、免疫細胞をマイクロ流体デバイスに通すことによってＴ細胞の細胞質ゾルに自己増幅ＲＮＡを送達することを含む、カミカゼ免疫細胞を作製するための方法に関し、デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を有し、自己増幅ＲＮＡは、コードされたタンパク質の連続生産をコードする。いくつかの実施形態では、化合物は核酸を含む。いくつかの実施形態では、化合物は核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）である。
ワクチン開発のための抗原のスクリーニング
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って修飾された免疫細胞は、ワクチン開発のための抗原をスクリーニングするために使用される。例えば、腫瘍細胞溶解物を、抗原提示細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞に、本明細書に記載の圧搾法を用いて送達する。ＡＰＣを患者由来のＴ細胞またはＴ細胞クローン／株と共にインキュベートして、ワクチン候補抗原を特定する。別のアプローチでは、腫瘍溶解物を負荷したＡＰＣによって処理され提示された抗原は、質量分析によって特定される。このようにして特定された抗原は、その後、ワクチン接種のために使用される。
免疫細胞輸送
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載の方法に従ってＴ細胞に標識を送達し、標識Ｔ細胞を患者に投与することを含む、患者内のＴ細胞輸送を決定する方法に関し、患者内のＴ細胞輸送は、標識されたＴ細胞を検出することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識または放射性標識である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞輸送は腫瘍に輸送することである。例えば、Ｔ細胞は、患者から単離され、同位体をＴ細胞に送達するためにマイクロ流体デバイスを通過させて、患者に注射し戻すことができる。次に、ＰＥＴスキャン等のイメージング方法を使用して、標識を検出し、身体を通してのＴ細胞の輸送を追跡することができる。
ワクチンの抗原提示
このシステムは、免疫細胞に対して優先的にタンパク質の送達を可能にするので、目的の標的に対する患者（ヒト、マウス、非ヒト霊長類等）のワクチン接種に使用するため、そのような細胞を操作することが有用である。標的細胞（例えば、ＤＣ、Ｔ細胞またはＢ細胞）の細胞質ゾルに特定の抗原タンパク質（または抗原タンパク質の混合物、タンパク質＋アジュバントの混合物、またはタンパク質断片に対応するペプチド）を直接送達することにより、抗原のＭＨＣクラスＩ提示が誘導され、続いて標的疾患、例えばがんまたはウイルス感染のような病原性微生物感染、に対するＣＤ８Ｔ細胞媒介免疫を誘導する。このプロセスにおけるアジュバントの任意の使用は、応答を増強する（例えば、アジュバント因子の存在下で細胞の有効性またはインキュベートを増強する物質の同時送達）。本発明に先立って、操作するのが困難または不可能であった免疫細胞を操作する能力は、本発明以前には不可能であった治療及び予防ワクチンの適用を、特にがん及びＨＩＶのような現在困難な疾患に対して可能にする。他の現れる形態は、細胞がより長い間抗原を提示することができるように、細胞生存を増強するための材料を同時送達すること；同時に複数の抗原に対するワクチン接種；アジュバント効果を提供し、免疫応答を増強するための活性化因子の送達（または曝露）と組み合わせたワクチン接種；及び／または細胞溶解物を抗原源として使用する迅速応答ワクチン、を含む。後者の例（新たな未知の病原体／疾患に対するワクチン接種）では、感染した細胞またはがん性の細胞が患者から、例えば組織サンプリングまたは生検により、採取され、そしてこれらの細胞の溶解物は、上記の方法を用いて免疫細胞に送達される。このアプローチは、抗原の識別を先験的に知らずに、未知の疾患に関連する抗原に対する免疫応答を引き起こす。
ワクチンアジュバント
アジュバントまたは免疫応答活性化剤／増強剤は、ワクチン抗原に対する免疫細胞、例えばＴ細胞の応答の誘出を促進するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫細胞がマイクロ流体デバイスを通過した後、免疫細胞をアジュバントと接触させる。例えば、細胞は、マイクロ流体デバイスを通過した後約５分〜約２時間、或いはこれらの間の任意の時間または範囲でアジュバントと接触させる。例えば、マイクロ流体デバイスを通過した後、約５分〜約１．５時間、約５分〜約１時間、約５分〜約４５分、約５分〜約３０分、約５分〜約１５分、または約５分〜約１０分、細胞をアジュバントと接触させる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスを通過した後約１０分〜約２時間、約１５分〜約２時間、約３０分〜約２時間、約４５分〜約２時間、約１時間〜約２時間、または約１．５時間〜約２時間、細胞をアジュバントと接触させる。ミョウバンまたは油中水型エマルジョン（例えば、フロイントの不完全アジュバント及びＭＦ５９（登録商標））等の古典的なアジュバントに加えて、パターン認識受容体（ＰＲＲ）のリガンド等の他のアジュバントは、先天性免疫を誘導することによって作用し、ＡＰＣを標的にし、その結果、適応免疫応答に影響を及ぼす。ほぼ全てのＰＲＲファミリーのメンバーがアジュバントの標的である。これらとしては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）及びＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）が挙げられる。これらは異なる転写因子の活性化につながる異なるアダプター分子を含む経路を介してシグナル伝達する。転写因子（ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３）は、免疫応答のプライミング（刺激）、拡大及び分極において重要な役割を果たすサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する。ＮＬＲＰ３及びＮＬＲＣ４等のＮＬＲファミリーのいくつかのメンバーの活性化は、前炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−１８の誘導に関与する、インフラマソームと呼ばれるタンパク質複合体の形成を誘発する。ＮＬＲＰ３及びＮＬＲＣ４インフラマソームは、ある種のアジュバントによって誘発された先天性免疫に関与しているが、それらの作用機構は不明である。
単独または様々な製剤と一緒の、ＰＲＲに対する天然リガンドまたは合成アゴニスト。ＰＲＲ活性化は、病原体を除去する宿主の能力を増加させる前炎症性サイトカイン／ケモカイン及びＩ型ＩＦＮの産生を刺激する。ワクチン製剤中の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の取り込みは、ワクチン特異的応答の誘導を改善し、促進する。ミョウバンまたは古典的エマルジョンアジュバントと組み合わせて使用されるＰＡＭＰＳは、Ｔｈ１応答に対する免疫応答を促進するのに有用である。
ＴＬＲ３及びＲＬＲリガンド。大部分のウイルスの複製の間に産生される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、自然免疫の強力な誘導物質である。ポリ（Ｉ：Ｃ）等のｄｓＲＮＡの合成類似体は、アジュバントとして有用である。これらはＴＬＲ３及びＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ−５を介して作用し、ＩＬ−１２及びＩ型ＩＦＮ産生を誘導し、ＭＨＣクラスＩＩ分子への抗原交差提示を促進し、細胞傷害性Ｔ細胞の生成を改善する。
ＴＬＲ４リガンド。ＴＬＲ４のリガンドである細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）は、長い間、強力なアジュバントとして認識されてきたが、それらの発熱活性は、それらの臨床的使用を妨げた。より毒性の低い誘導体の開発には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）が含まれる。ＭＰＬＡはアジュバントとして有用であり、Ｔｈ１応答に対する免疫応答を促進する。
ＴＬＲ５リガンド。ＴＬＲ５リガンドであるバクテリアのフラジェリンは、強力なＴ細胞抗原であり、ワクチンアジュバントとしての可能性を有している。他のＴＬＲアゴニストとは異なり、フラジェリンは強いＴｈ１応答よりもむしろ混合されたＴｈ１及びＴｈ２応答を生成する傾向がある。フラジェリンは、抗原と混合されたアジュバント、または組換えワクチン抗原と融合したアジュバントとして使用することができる。
ＴＬＲ７／８リガンド。一本鎖ウイルスＲＮＡの認識に特化したこれらのリガンドも有用なワクチンアジュバントである。例えば、イミダゾキノリン（即ち、イミキモド、ガーディキモド 及びＲ８４８）は、樹状細胞の複数のサブセットにおいてＴＬＲ７／８を活性化し、ＩＦＮ−α及びＩＬ−１２の産生をもたらし、従って、Ｔｈ１応答を促進する合成化合物（ｃｏｍｐｏｎｄ）である。
ＴＬＲ９リガンド。特定のＣｐＧモチーフ（ＯＤＮ １８２６及びＯＤＮ ２００６等のＣｐＧ ＯＤＮ）を含むオリゴデオキシヌクレオチドは、ＴＬＲ９によって認識される。これらは、抗体産生を増強するだけでなく、Ｔｈ１に対するＴｈ細胞応答を駆動／促進し、Ｔｈ２応答から遠ざける。
ＮＯＤ２リガンド。ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）等の細菌細胞壁の断片は、周知のアジュバントである。ＭＤＰは、ＮＯＤ２及びＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を誘発する。
これらのクラスのアジュバント、例えばＰＲＲ経路のモジュレーターは、強い細胞媒介免疫を誘導する能力のためにワクチンにおいて有用である。好ましいアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、Ｒ８４８、リポ多糖（ＬＰＳ）、ｒｈＩＬ−２、抗ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１２、及び／または二環式ヌクレオチドが挙げられる。
免疫療法のためのＴ細胞の操作
本開示のある特定の態様は、記載された方法に従って修飾された免疫細胞を患者に導入することにより患者を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は免疫療法に使用するためのものである。例えば、Ｔ細胞に多様な物質の送達を可能にすることにより、Ｔ細胞機能は目的の疾患を標的とするように操作される。例えば、目的の抗原を標的とするＴＣＲのためのキメラ抗原レセプターまたはＤＮＡ／ｍＲＮＡを送達することにより、疾患抗原に対して特異的であり、キラー（及び／またはヘルパー）Ｔ細胞応答を促すＴ細胞が生成される。ＮＦ−κＢ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−３、Ｂｃｌ−ｘｌ、ＣＤ３／ＣＤ２８の上方制御因子、ＣｐＧ、Ｒ８４８、ＰＤ−１のサプレッサー、ＰＤＬ−１の抑制遺伝子（サプレッサー）、ＣＴＬＡ−４のサプレッサー等の他の物質が送達され、細胞活性及び生存を増強する。
例えば、現在の養子Ｔ細胞移植療法における１つの一般の課題は、活性化Ｔ細胞が腫瘍の免疫抑制微小環境に曝され、消耗／アネルギーになり、これによりその効力を最小化することである。記載される方法を用いた細胞内送達は、免疫抑制経路を破壊するために使用され［例えば、免疫抑制遺伝子ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ１−１、ＰＤ１−２またはｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンの欠失、または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）等の既知の方法を用いた小分子阻害剤／抗体に基づく抑制、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に基づくアプローチ）］、これにより、これらのＴ細胞が腫瘍環境においてそれらの高度に活性化されたキラー状態を保持することを可能にする。さらに、このアプローチは、Ｔ細胞を、その表現型への分化を駆動するための適切な因子の同時送達によって記憶細胞になるよう誘導するために使用される（従って、より良好な長期間の保護を提供する）。従来の養子移入では、患者の体内に導入されたＴ細胞は、増殖のために、すでに活性化された半排出状態にある。本明細書に記載の方法は、その表現型をナイーブ状態にリセットするために使用される。従って、細胞は、移入後にインビボでのより多くの増殖が可能となり、もはや枯渇した表現型を有することはない。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で抗原特異的Ｔ細胞を産生させるために使用される。例えば、抗原は、ＤＣ等の免疫細胞に送達され、次いで、抗原が負荷された免疫細胞は、患者由来Ｔ細胞と一緒に培養され、インビトロでそれらを活性化する。次いで、これらのＴ細胞は、患者に再注入される前にさらなる刺激によって拡大され得る。
寛容性のための抗原提示：
細胞提示抗原に対する寛容性を誘導するために、細胞は、胸腺間質リンパ球ポエチン、デキサメタゾン、ビタミンＤ、レチノイン酸、ラパマイシン、アスピリン、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン−１０または血管作動性腸管ペプチド等の寛容原と抗原と一緒に接触し、代わりに寛容性を誘発するであろう。
腫瘍及びＴ細胞寛容性
腫瘍微小環境において、腫瘍反応性Ｔ細胞は寛容化され得る。これは、腫瘍発生に関連する他の細胞の寛容原性活性を含む複数の抑制機構に起因する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７，１７８：１２６８−１２７６；Ｐｒｏｂｓｔら，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，６：２８０−２８６）。ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１等のチェックポイント受容体を介してシグナル伝達を遮断する抗体ベースの薬物は、原発性及び転移性疾患の両方において抗腫瘍応答をもたらしている。チェックポイント遮断に応答する悪性腫瘍は、高い突然変異頻度を有し、がん抗原に反応するＴ細胞によって浸潤される（Ｔａｎｅｊａ、Ｊ Ｕｒｏｌ ２０１２，１８８：２１４８−２１４９；Ｂｒａｈｍｅｒら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２，３６６：２４５５−２４６５；Ｗｏｌｃｈｏｋら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３，３６９：１２２−１３３）。このアプローチはある特定の適応症には成功しているが、複数の阻害性チェックポイント表面受容体の存在は、免疫療法に利用可能な現在限定された機能遮断抗体のパネルの適用を弱体化させ得る。さらに、複数の遮断抗体を用いた全身治療の必要性は、毒性を増加させ得（Ｒｉｂａｓら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３，３６８：１３６５−１３６６；Ｗｅｂｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ ２０１３、１１９：１６７５−１６８２）、特に、組み合せて用いられた時に毒性を増加させ得る（Ｐｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１５，３３：１９７４−１９８２及びＧａｏら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１５に概説されている）。本発明のいくつかの態様において、患者の転帰における劇的な改善が、腫瘍反応性Ｔ細胞のみにおいて阻害経路を抑制することにより達成される。非限定的な例において、これは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、組換えＴＣＲ及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞等の養子移入アプローチで使用されるＴ細胞内の阻害経路の遺伝子ノックダウンまたはノックアウトを阻害または可能にすることによって成し遂げられ得る。
ＳＨＰ２は、Ｔ細胞における活性化に際して、ＴＣＲシグナル伝達を減衰させ、次にがん細胞に対するＴ細胞応答を減衰させる遍在性チロシンホスファターゼである。いくつかの免疫チェックポイント受容体によるＳＨＰ２を介してのシグナル伝達は、Ｔ細胞活性を減少させる。ＳＨＰ２を活性化する阻害性受容体としては、限定されないが、ＰＤ−１（Ｙｏｋｏｓｕｋａら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１２，２０９：１２０１−１２１７）、ＣＴＬＡ ４（Ｍａｒｅｎｇｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７２：１１７０−１１７３）、ＢＴＬＡ（Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３，４：６７０−６７９）及びＬＡＩＲ−１（Ｌｅｂｂｉｎｋら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４，１７２：５５３５−５５４３）（Ｎｉｒｓｃｈｌら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１３、１９：４９１７−４９２４でも見られる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍反応性Ｔ細胞におけるＳＨＰ２の遺伝子不活性化またはダウンレギュレーション（例えば、ＲＮＡ干渉を用いる）は、いくつかの阻害性チェックポイント受容体のシグナル伝達をブロックするのと同様の抗腫瘍応答を与える。このような実施形態は、他の抗腫瘍免疫療法と組み合わせて、スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）、ＳＨＰ−１及び−２を含むチロシンホスファターゼの薬理学的阻害剤の治療的使用よりも利点（副作用の低減等）を有し得る（Ｙｉら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１１，２：１１５５−１１６４；Ｎａｉｎｇら，Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１，２：８１−８９；Ｐａｔｈａｋら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１，１６７：３３９１−３３９７）。ＳＨＰ２はＴ細胞外因性の役割を果たすことが示されており、Ｔ細胞に対するこの分子の阻害は、その機能の全身的阻害に関連するいかなる潜在的副作用も排除することができる。さらに、Ｔ細胞における単一の細胞内シグナル伝達分子の遺伝的破壊またはダウンレギュレーションを介して複数の阻害シグナル伝達経路を標的とすることによって、Ｔ細胞養子移入及びシステムチェックポイント遮断の組み合わせよりも大きな効力が達成される。いくつかの実施形態では、タンパク質または核酸、例えばｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤、抗体、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼを、免疫細胞、例えばＴ細胞、に送達して、Ｔ細胞の挙動または機能を修飾するためにＳＨＰ２のような遺伝子産物の遺伝子または活性の発現を調節する。例えば、Ｓｈｐｔ障害ＣＤ８Ｔ細胞は、非障害細胞よりも腫瘍進行を制御する効力がより高い。
以前のアプローチに関連するＴ細胞にいて遺伝子発現を調節するとの課題は、本明細書に記載のＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅデバイス及び方法を使用して克服された。ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅデバイスの非限定的な態様は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの講演（Ｓｈａｒｅｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３、１１０：２０８２−２０８７）及びＮａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｌｅｅら，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０１２，１２：６３２２−６３２７）に記載されており、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅ技術は、細胞が狭窄部を通過して膜を一時的に破壊し、標的物質の細胞質への輸送を可能にするように、細胞を急速に変形させることができる微小流体チップを含むことができる。さらに、電場の必要性をなくすことにより（例えば、いくつかの実施形態では、デバイス及び方法は、細胞の電界への曝露または適用を含まない）または潜在的に毒性のある外因性物質をなくすことにより、ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅ技術は細胞毒性及びオフターゲット効果の可能性を最小限にする。本明細書に記載のマイクロ流体デザイン及び治療プロセスは、様々ながんの症状に対してより効果的に操作されるＴ細胞療法を生み出すことができる。
免疫抑制のためのＴ細胞の操作
自己免疫性疾患は、しばしば健康な組織に損傷を与える自己反応性免疫細胞を含む。Ｔ細胞へのＦｏｘＰ３（及び／または他の因子）の細胞内送達が、自己免疫に対抗するための制御性Ｔ細胞を生じさせるために使用される。これらのＴｒｅｇは、広範な全身免疫抑制のため、または自己抗原特異的Ｔ細胞をＴｒｅｇ表現型に再プログラムするために産生される。後者は、自己免疫を永続させ、それらの活性の局所的抑制を誘導する細胞と同じ標的部位へのＴｒｅｇホーミングをもたらす。
自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）
自己増幅ＲＮＡは、目的のタンパク質を発現するだけでなく、宿主ゲノムへの組み込みの危険性を伴わず細胞質内でその配列を複製するので、独自の能力を提供する。従って、自己増幅ＲＮＡの免疫細胞への導入は、免疫細胞機能を操作するのに有用である。いくつかの具体的な現れの形態としては、カミカゼ免疫細胞、タンパク質送達の代替、または細胞機能の継続的な調節が挙げられ、それぞれが以下に記載される。
カミカゼ免疫細胞
上記のものと同様のワクチン接種または免疫抑制戦略のために、目的の抗原をコードするｓａＲＮＡを、所望の位置にある免疫細胞に送達する。例えば、ｓａＲＮＡをコードするがん抗原のＴ細胞（またはＢ細胞、単球、ＤＣまたはマクロファージ）への送達及びそれらの細胞の患者への注入は、Ｔ細胞における抗原の迅速な産生と、迅速なｓａＲＮＡ複製に起因するこれらＴ細胞の最終的な死とをもたらす。標的抗原を負荷したこれらの死滅するＴ細胞の爆発は、感染をシミュレートし、標的組織中の先天性細胞による物質の取り込みをもたらし、標的抗原に対するワクチン応答を感作する。標的組織、アジュバントの存在、及び患者の全体的な炎症状態に依存して、この戦略を用いて寛容性も誘導する。寛容を誘導するために、前記カミカゼ細胞は、寛容誘発因子及び抗原を放出するように操作されるか、またはＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−１０等の寛容誘発因子と接触させる。例えば、カミカゼＴ細胞またはＢ細胞には、寛容原性である因子（例えば、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の分泌）をも発現しながら、所望の抗原を過剰発現するｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｓａＲＮＡを負荷することができる。これらの細胞は、その後、死滅する前にリンパ系器官に移動して、抗原及び寛容原性因子を環境に放出し、標的抗原に対する寛容性を誘導するのを助ける。これは、自己反応性エフェクターＴ細胞を排除するのに役立ち、自己反応性に対して保護することができるＴ ｒｅｇの産生を促進する。１つの非限定的な例において、このアプローチは、関節リウマチ抗原を用いて使用される。
タンパク質送達の代替法
ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは発現ベクター、例えばプラスミドは、タンパク質送達のパルスではなく、持続した時間のワクチン治療のための連続的なタンパク質産生を提供する。
細胞機能の連続的な調節
一例としてＴ細胞養子免疫伝達療法を使用すると、より良好なＴ細胞療法の開発は、免疫抑制経路の阻害剤をコードするｓａＲＮＡを用いることによって達成される。ｓａＲＮＡはまた、刺激タンパク質を発現して、Ｔ細胞活性化及び／または抗アポトーシスタンパク質の高い状態を維持して生存を延長するためにも使用される。抑制インヒビターの非限定的な例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４を遮断する任意の物質または他のチェックポイント阻害剤が挙げられる。ＩＬ−２、ＮＦ−Ｋｂ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２等を発現して、高Ｔ細胞活性を維持することができ、Ｂｃｌ２及びＢｃｌｘ１のようなタンパク質は生存延長に役立ち得る。
免疫細胞機能の再プログラミング
免疫細胞は、自己細胞の供給源として使用される。細胞は、数多くの疾患治療機能を実行するように再プログラムされる。例えば、関節炎の場合、物質をＴ細胞に送達して、関節ホーミングフェノタイプの発現を誘導し、症状を緩和する因子（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１１、ＴＧＦｂ、レチノイン酸、及びチェックポイント覚醒剤）の放出をプログラミングし、或いは、パーキンソン病の場合には、材料をＴ細胞またはＢ細胞に送達して脳ホーミング受容体の発現を誘導し、患者の転帰を改善する因子の分泌を誘導する。関節炎に関して、炎症誘発性サイトカインを除去することも有用であり、例えば、ＩＬ−２に対して高い親和性を有するＴ細胞は、自己反応性エフェクター細胞が必要とするサイトカインを吸収する。
本明細書に記載のデータを作成するために、以下の材料及び方法を使用した。
ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅマイクロ流体デバイス
ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅプラットフォームは、３つの主要成分、すなわちａ）並列に複数のチャネルを含み、各々が少なくとも１つの狭窄点を含むシリコン及びガラスのマイクロ流体チップ、ｂ）チップとインターフェースし、細胞懸濁液を負荷／収集することを可能にするリザーバシステム、ｃ）リザーバを加圧し、チップを通る流体の流れを容易にするための圧力調整システム、からなる。典型的なワークフロー（図１Ａ）において、標的送達材料を所望の細胞（懸濁液中）と混合し、それらをリザーバ（貯蔵器）に装填する。次に、圧力配管がリザーバに接続され、チャンバが所望のレベルで加圧されて流体の流れが開始される。処理後、細胞をアウトプットリザーバから収集し、所望の温度である時間、例えば少なくとも１、２、３、４、５分またはそれ以上インキュベートすることができ、さらなる処理の前に適切な膜回収を保証する。
ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅデバイス及び関連する手術器具は、ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡから入手した。デバイスは、製造業者のプロトコルに従って組み立てられ、使用された。Ｓｈａｒｅｉ， Ａ．， Ｎ． Ｃｈｏ， Ｓ． Ｍａｏ， Ｅ． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｐｏｃｅｖｉｃｉｕｔｅ， Ａ． Ａｄａｍｏ， Ｊ． Ｚｏｌｄａｎ， Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ，及びＫ． Ｆ． Ｊｅｎｓｅｎ．２０１３。Ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ ａｓ ａ ｒｏｂｕｓｔ， ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ：ｅ５０９８０。
例えば、個々のＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅデバイス及び関連するリザーバシステムを、無菌性を維持するために７０％エタノール中に保持した。各実験について、所望のＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅデバイスをリザーバに接続し、７０μｌのＰＢＳを用いて、細胞試料と共に使用する前にシステムをフラッシュした。
送達実験の間、標的細胞、デバイス＋リザーバ、及び収集プレートは、氷上（Ｔ細胞及びＢ細胞）または室温（樹状細胞）で維持される。細胞（ＰＢＳまたはインキュベート培地中の２×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌの濃度で）を、所望の濃度で標的送達物質と混合してから、流体リザーバに加える。圧力配管が接続され、システムが所望の動作圧力に設定され、流れは、サンプルを含むリザーバを加圧することによって開始される。チップを通過した後、細胞を収集リザーバから集め、９６ウェルプレートに移す。このプロセスは任意に繰り返される。目詰まりを最小限に抑えるために、チップ内の流れの方向はサンプル間で交互に行われる。培地を添加する前に試料は氷上で５分間インキュベートされ、さらなる処理のために移される。
ＣＡＲ Ｔ細胞
がん特異抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞を修飾（改変）することにより、免疫検出を回避するであろう腫瘍細胞を認識して殺傷するように細胞をプライミングすることができる。このプロセスは、患者のＴ細胞を抽出し、それらをＣＡＲの遺伝子でトランスフェクトし、次にトランスフェクトされた細胞を患者に再注入することを含む。
これらの人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、またはＣＡＲとしても知られている）は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する操作がなされた受容体である。典型的には、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用される。本発明以前では、核酸コード配列の導入は、一般にレトロウイルスベクターによって促進された。本明細書に記載の方法は、ウイルスベクターを利用しないか、またはそれを含まない。コード配列またはタンパク質ＣＡＲは、ウイルスベクターを必要とすること無く、記載のデバイスで細胞を圧搾することを用いて、Ｔ細胞等の免疫細胞の細胞質ゾルに送達される。
治療用途では、末梢血から患者のＴ細胞を得て（そして場合によっては濃縮または精製し）、特定のがん関連抗原に特異的な人工的（キメラ）受容体を発現するように修飾する。修飾後、Ｔ細胞はがんを認識して死滅させる。例えば、例示的なＣＡＲは、Ｂ細胞悪性腫瘍において発現される抗原であるＣＤ１９を認識する。ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を修飾した後、修飾Ｔ細胞を患者に再注入する。操作された細胞はがん性細胞を認識して死滅させる。このような治療は、ＡＬＬ、非ホジキンリンパ腫、及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に使用されており、白血病、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ球性白血病）等の血液感染性がん、並びに固形がんを含むどのようなタイプのがんの治療にも適当である。本明細書に記載の細胞処理方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するための優れたプロセスを示している。
自己Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞に、腫瘍細胞上の特異的抗原を認識する能力を与えるＣＡＲタンパク質を発現する。そのような腫瘍関連抗原は同定されており、当該分野で公知である（下記の表参照）。次に、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を実験室で拡大（増殖）させ、その後ＣＡＲ Ｔ細胞の拡大集団を患者に注入する。Ｔ細胞は、患者の体内で増殖し、その表面に腫瘍関連抗原を有するがん細胞を認識し、結合し、殺す。任意に、プログラム死−１（ＰＤ−１）阻害剤またはリガンド（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤及び／または抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４抗ＣＴＬＡ４薬等の免疫チェックポイント阻害剤をＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせることもできる。
腫瘍の治療
化合物または組成物を細胞質ゾルに導入するために上記のように処理された免疫細胞は、例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発して腫瘍を殺すまたは腫瘍の増殖を阻害することによって、腫瘍を治療するために使用される。本方法のデバイス及び方法は、腫瘍細胞特異的／腫瘍関連抗原またはその混合物、例えば腫瘍生検細胞溶解物調製物を免疫細胞に導入するので、本方法はどのような腫瘍型にも適用可能である。例えば、腫瘍の種類としては、米国でまん延している膀胱がん、乳がん、結腸及び直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がんが挙げられる。（米国がん学会：Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ、２０１５，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５。オンラインで入手可能）。処理された免疫細胞を使用して治療される他の腫瘍の種類には、脳（膠芽細胞腫）、肝臓（肝細胞がん）、並びに原発腫瘍の部位または組織とは異なる体内の解剖学的部位または組織に生じる転移性のがんが含まれる。
好ましい実施形態では、腫瘍は、膵臓がん、卵巣がん、メラノーマ、肺がん、神経膠腫または神経膠芽細胞腫である。いくつかの実施形態では、特定の患者の腫瘍が標的とされる。例えば、患者からの腫瘍溶解物は、細胞の圧搾を用いて免疫細胞に送達される抗原として使用され得る。
腫瘍細胞抗原
精製された腫瘍関連抗原または腫瘍細胞溶解物（抗原の異種混合物）は、細胞の圧搾を用いて免疫細胞に送達される抗原として使用される。腫瘍細胞溶解物は、腫瘍と診断された、及び／または病理学的悪性腫瘍の治療が予定されている、対象から得られた腫瘍細胞株または腫瘍生検組織から産生される。腫瘍細胞溶解産物の産生は当該分野で公知である。このような腫瘍溶解物調製物は、免疫細胞の細胞質ゾルへの細胞圧搾に基づく送達に使用するのに適している
例えば、腫瘍組織を対象から切除し、組織を細かく切り刻む。腫瘍細胞を処理、例えば、分画、濃縮、または精製／単離する。非固形腫瘍、血液由来腫瘍（原発性または転移性）、または細胞系、濃縮された細胞）の場合、細胞は体液、例えば末梢血から得られ、任意に濃縮または精製されて、非腫瘍細胞から腫瘍細胞に濃縮される。腫瘍細胞（または腫瘍細胞に富化された細胞の集団）は、腫瘍細胞溶解物を得るために処理される（例えば、Ｈａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ Ｓｅｐ；３１（７）：６２０−６３２に記載されている）。例えば、細胞を凍結融解サイクル（例えば、１、２、３、４、５、１０またはそれ以上の凍結／融解サイクル）にかける。任意に、ステップには、患者特異的腫瘍細胞抗原の混合物を得るために、固体破片の除去及び濾過（例えば、０．２ミクロンフィルター）が含まれる。
非限定的な例では、液体窒素を用いて複数回（例えば４回）連続して凍結／解凍サイクルを行うことにより細胞を溶解させる。次いで、細胞を約１０、１５または２０秒間超音波処理した後、１０００ｇで遠心分離して不溶性破片を除去する。その後、上清を溶解物送達に使用する。任意に、免疫細胞への送達の前に、溶解物から脂質及び／または核酸を除去する。アジュバントが、ＡＰＣ機能を増強するために送達前に任意に添加される。
いくつかの実施形態において、溶解物中のがん抗原の割合を選択的に増加させるために、アクチンのような一般的内因性タンパク質が除去される。いくつかの実施態様では、穏やかな界面活性剤が溶解した細胞組成物に添加され、タンパク質が、細胞による提示のための送達または処理が困難となる凝集物の形成を防ぐのに役立つ。
自己腫瘍細胞溶解物はまた、商業的に入手可能なデバイス／方法、例えばｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を用いて生成することもできる。
腫瘍関連抗原は当該分野で公知であり、このような抗原は生化学的に精製され、組み換え発現され、及び／またはそうでなければ精製／単離され得る。そのような抗原の例を以下の表に示す。


他の精製された腫瘍抗原は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｇｉｒｅｓ及びＢａｒｂａｒａ Ｓｅｌｉｇｅｒ編集、２００９、ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．，ＫＧａＡ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
ウイルス抗原
ウイルス関連抗原は、細胞の圧搾を用いて免疫細胞に送達され得る。ウイルス関連抗原は当技術分野で公知であり、このような抗原は生化学的に精製され、組換え発現され、及び／またはそうでなければ精製／単離され得る。ウイルス抗原の例を以下の表に示す。
細菌抗原
細菌抗原もまた、細胞圧搾を用いて免疫細胞に送達され得る。好ましい実施形態では、細菌抗原は、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．）、マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）（例えば結核菌）またはリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等の細胞内細菌と関連している。
本明細書に記載のデータを生成するために、以下の材料及び方法を使用した。
マウス免疫細胞単離
Ｔ細胞及びＢ細胞を、製造者の指示（ネガティブ選択技術）に基づいて、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）の細胞特異的単離キットの既知の方法を用いて、野生型Ｃ５７ＢＬ／Ｊマウスの脾臓から単離した。単球／マクロファージを、チオグリコール酸溶液１ｍｌの腹腔内注射の３日後に野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの腹腔から単離した。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）のＳｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＤ１１ｂ陽性選択キットを用いて、製造者の指示に基づいて細胞を精製した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％抗生物質／抗真菌剤、０．５％ベータ−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するグルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、ＵＳＡ製）。
ヒト初代Ｔ細胞及び単球由来樹状細胞
ヒトＰＢＭＣを、既知の方法、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、全血から密度勾配遠心分離を用いて分離した。ＣＤ１４＋Ｔ細胞を、ＣＤ１４及びＣＤ４磁気マイクロビーズ（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いてＰＢＭＣのＣＤ１４陰性画分から分離した。１０％ヒト血清（ＡＢ）（ＧｅｍＣｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン・スルフェート（Ｈ１０培地）を含み、５ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）が追加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ、ＶＡ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）において、Ｔ細胞を培養し、細胞活性化を行わずに細胞生存率を維持した。抗ＣＤ１４磁気マイクロビーズ（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて末梢血単核細胞から選択されたＣＤ１４陽性単球からヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）を調製し、１００ｎｇ／ｍｌインターロイキン−４及び５０ｎｇ／ｍｌ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で６日間培養した。
細胞トランスフェクション
ヒトＣＤ４５ ｓｉＲＮＡ：センス５’−ＡＦ４８８ＣＵＧＧＣＵＧＡＡＵＵＵＣＡＧＡＧＣＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）、ヒトＣＤ４ ｓｉＲＮＡ：センス５’−ＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＵＣＣＵＣＡＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号２）（Ａｌｎｙｌａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ） ；ｖｉｆ ｓｉＲＮＡ：センス５’−ＣＡＧＡＵＧＧＣＡＧＧＵＧＡＵＧＡＵＵＧＴ−３’、（配列番号３）ｇａｇ ｓｉＲＮＡ：センス５’−ＧＡＵＵＧＵＡＣＵＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＵ−３’（配列番号４）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１：３５０−３５６）；（ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）；コントロール・スクランブルｓｉＲＮＡ：５’−ＧＣＣＡＡＧＣＡＣＣＧＡＡＧＵＡＡＡＵＵＵ−３’（配列番号５）、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ ｓｉＲＮＡ：センス５’−ＧＧＡＡＣＵＧＧＣＡＣＧＡＣＵＣＣＡＵＵＵ−３’（配列番号６）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）。
ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）
記載されたエレクトロポレーション実験では、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ Ｉｎｃ．、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を製造業者の推奨に従って使用した。ヒトＴ細胞の実験は、ヒトＴ細胞キットを用いて、ヒトの非刺激Ｔ細胞、高い生存率、Ｕ−０１４についてのプログラムを使用して行った。ヒトＭＤＤＣについては、ＭＤＤＣ用のヒト樹状細胞キットを用いてヒト樹状細胞Ｕ−００２用プログラムを使用した。簡潔には、２×１０６個の細胞を２００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含む１００μｌのヌクレオフェクション溶液中に懸濁させ、機械によってヌクレオフェクトした。タンパク質送達を試験するために、Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ及びヌクレオフェクション実験の両方にＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１（ｃｌ．ＭＯＰＣ−２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を０．０２ｍｇ／ｍＬで用いた。また、３ｋＤａカスケードブルー標識デキストラン及び７０ｋＤフルオレセイン標識デキストランを０．２ｍｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で使用した。
調節性Ｔ細胞
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を単離し、公知の方法を用いて増殖させた。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ濃縮キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた密度遠心分離によって健康な個体の末梢血からＣＤ４＋Ｔ細胞富化ＰＢＭＣを単離し、抗ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４−ＦＩＴＣ 、ＣＤ２５−ＡＰＣ及びＣＤ１２７−ＰＥで標識した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ Ｔｒｅｇを、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆マイクロビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激し、ＩＬ−２（３００Ｕ／ｍＬ）で培養した。
培養７日目に、ｓｉＲＮＡ送達のために、Ｔｒｅｇを洗浄し、１．０×１０７細胞／ｍｌでＸ−ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）媒体のみに再懸濁させた。１条件につき１．０×１０６個の細胞を使用した。ＣＤ４ ｓｉＲＮＡ（５’−ＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＵＣＣＵＣＡＧＵ−３’（配列番号７）、Ａｌｎｙｌａｍ）及び対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＥＮＯＭＥ非標的ｓｉＲＮＡ Ｐｏｏｌ＃１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、１００ｐｓｉで３０−４チップデザインにて１μＭで使用した。
ｓｉＲＮＡ送達の２日後、細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び抗ＣＤ４−ＡＰＣで染色した。データをＬＳＲ２フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
フローサイトメトリー
抗ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、抗ＣＤ４−ＡＰＣ、抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（抗Ｍ１／７０）、抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣを用いてマウス細胞を染色した。死んだ細胞を排除するためにヨウ化プロピジウムを用いた。データは、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ、ＬＳＲ ＩＩ、またはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。
ヒト細胞を、下記の抗体、すなわちＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製の抗ＣＤ３−ＡＰＣ（ｃｌ．ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ７（ｃｌ．ＨＩ１００）及び抗ＣＤ４−ＡＦ４８８（ｃｌ．ＯＫＴ４）、並びに抗ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＰＣ（ｃｌ．９Ｅ９Ａ８）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で染色した。Ｓｙｔｏｘ ｂｌｕｅ及び７−ＡＡＤ（７−ＡｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ）死滅染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて死んだ細胞を排除した。データをＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。
ＨＩＶ感染及び細胞内ｐ２４抗原染色
一次ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０−４チップを用いて５μＭｓｉＲＮＡで処理した。ＣＤ４のノックダウンのために、ｓｉＲＮＡは感染の４８時間前に送達され、ウイルス遺伝子ｖｉｆ及びｇａｇを標的とするｓｉＲＮＡは感染の２４時間前に送達された。次いで、細胞を５μｇ／ｍｌのＰｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）で一晩刺激し、ＨＩＶＩＩＢ（４００ｎｇ／ｍｌ ｐ２４）を用いて２×１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレートにおいてＨＩＶＩＩＩＢに感染させた。ＨＩＶ ＩＩＩＢは、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラムから得られ、ウイルスストックは、以前に記載されたように調製された（１８）。感染は、５μｇ／ｍｌのポリブレン及び１２００ｘｇのスピノキュレーションの３７℃で２時間での添加により増強された（１９）。Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抗ｐ２４ ＫＣ５７−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて２４時間後に細胞内ｐ２４抗原染色を行い、フローサイトメトリーにより分析した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴ細胞から全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ及びランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてコピーＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲは、ＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｍｉｘ及びＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて行った。プライマーは以下の通りであった：Ｇａｐｄｈフォワード：５’−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号８）、Ｇａｐｄｈリバース：５’−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号９）、ＣＤ４フォワード：５’−ＧＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号１０）、ＣＤ４リバース：５’−ＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＡＡＣＣＴ−３’（配列番号１１）。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の多重比較試験と共に、複数の群を比較するときに実施され、或いは、両側スチューデントＴ検定を、２グループを比較する時に用いた。＊、＊＊及び＊＊＊は、ＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉのＭｕｌｔｉｐｌｅ比較試験を使用した場合の０．０５，０．０１及び０．００１未満のＰ値を示し、＃＃＃は、両側スチューデントＴ検定を使用した場合の０．００１未満のＰ値を示す。別段の指示がない限り、データは平均±１標準偏差として表される。
機械膜破壊による送達
試験したマイクロ流体デバイスは、狭窄長（１０〜５０μｍ）、幅（４〜９μｍ）及びチャネル当たりの狭窄部数（１〜５狭窄部）を変化させた４５〜７５の平行なマイクロ流体チャネルを含んでいた。（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０：２０８２−２０８７；Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｎａｎｏ ｔｏ ｍａｃｒｏ ６：４７０−４７５）。
マイクロ流体チップを動作させるために必要なシステムは、流体リザーバをシリコン及びガラスデバイスに固定する取り付け部品と、システムを通って流体を駆動するために使用されるガス圧を制御する圧力調整システムとを含んでいた。いくつかの実施形態では、デバイスは、マイクロ流体チャネルを通る流れを誘導するためのシリンジまたは圧力源を含む。
操作手順を図１Ａに示す。細胞がマイクロ流体チャネルを通って流れると（図１Ｂ）、チャネル内の狭窄点に到達し（処理される細胞の大多数の直径の約５０％未満）、急速な機械的変形を生じる（標的の細胞の狭窄点の例示的寸法は下記の通りである：細胞または圧搾の、Ｔ細胞（休止：７〜８μｍ、活性化：７〜１５μｍ）、マクロファージ（休止及び活性化：１０〜３０μｍ）、樹状細胞（休止及び活性化：１０〜３０μｍ）。チャネルの狭窄が適切な大きさになると、変形は細胞膜を一時的に破壊する（例えば、変形プロセスは０．１μ秒〜１ｍ秒を要するが、膜破壊は最大５分間で開いたままになることができる）。その後、周囲の緩衝液中に存在する巨大分子は、それらが膜破壊を通過するのに十分小さい場合、細胞の細胞質ゾルに入る。約５分以内に膜が完全性を回復し、細胞によって取り込まれた巨大分子は細胞の細胞質ゾルに閉じ込められたままである。送達効率及び細胞生存率に影響を及ぼす重要なパラメータとして、以前の研究は、狭窄長（Ｌ）、幅（Ｗ）及び流体速度（Ｖ、流体速度は動作圧力によって決定される）を特定した（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ１１０：２０８２−２０８７）。
１６の異なる狭窄設計のライブラリーを、異なる流れ条件下で試験した。試験したデバイスデザインのライブラリー。最初の数字は狭窄部の長さを示し、その後の数字は狭窄部の幅を示す。複数の同一の狭窄部が連続している場合は、狭窄の数が続く「ｘ」で示される。例えば、１０−５−４−５は３つの１０μｍの長さの狭窄部を含み、幅は５μｍ、４μｍ、及び５μｍである。１０−４ｘ５は１０μｍの長さの５つの狭窄部を含み、それぞれ４μｍの幅を有する。

これらの可変量は、巨大分子送達を最適化し、細胞毒性を最小限にするために、圧力の変化（流速の変化）及び温度の変化を含む。全ての試験された緩衝液（ＰＢＳ、ＰＢＳ＋２％血清、完全培地、及び全ヒト血液）は、システムに適合していることが分かり、生理学的に適合する液体または溶液は、送達デバイス及びプロセスを通して細胞を懸濁させるのに適していることを示している。
３０−５ｘ５、１０−４ｘ２、１０−５−４−５、１０−６−４−６、３０−５−４−５、及び１０−４ｘ５デザインもマウス及びヒトＴ細胞について試験したが、いずれも３０−４の性能より優れたものはなかった。

いくつかの実施形態において、デバイスは、約５μｍ〜約５０μｍの狭窄長、またはそれらの間の任意の長さまたは範囲の長さ範囲を含む。例えば、狭窄の長さは、約５μｍ〜約４０μｍ、約５μｍ〜約３０μｍ、約５μｍ〜約２０μｍ、または約５μｍ〜約１０μｍの範囲である。いくつかの実施形態において、狭窄の長さは、約１０μｍ〜約５０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約３０μｍ〜約５０μｍ、または約４０μｍ〜約５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、狭窄の深さは約２ｕｍ〜約２００ｕｍ、またはそれらの間の任意の深さまたはこれらの間の深さ範囲である。例えば、狭窄の深さは、約２μｍ〜約１５０μｍ、約２μｍ〜約１００μｍ、約２μｍ〜約５０μｍ、約２μｍ〜約２５μｍ、約２μｍ〜約１５μｍ、または約２μｍ〜約１０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、狭窄の深さは、約１０μｍ〜約２００μｍ、約２５μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、または約１５０μｍ〜約２００μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、狭窄部の入口または出口部分の角度は、約０度〜約９０度の範囲、またはそれらの間の任意の角度またはこれらの間の角度範囲である。例えば、角度は、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または以上である。いくつかの実施形態では、圧力は約５０ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉの範囲、またはそれらの間の任意の圧力またはそれらの間の圧力範囲である。例えば、圧力は、約５０ｐｓｉ〜約１５０ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ〜約１２５ｐｓｉ、約５０ｐｓｉ〜約１００ｐｓｉ、または約５０ｐｓｉ〜約７５ｐｓｉの範囲である。いくつかの実施形態において、圧力は、約７５ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、約１２５ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、約１５０ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉ、または約１７５ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉの範囲である。いくつかの実施形態では、デバイスは、約２μｍ〜約１０μｍの間の狭窄幅またはそれらの間の任意の幅またはこれらの間の幅範囲を含む。例えば、狭窄幅は、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、または約７μｍのいずれか１つであり得る。
一次マウス細胞への送達
一次免疫細胞への細胞内送達を可能にするこのプラットフォームの可能性を評価するために、マウスＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球／マクロファージを、蛍光標識デキストラン（３及び７０及び２，０００ｋＤａ）、及び抗体（約１５０ｋＤａ）の存在下にマイクロ流体デバイスに通した。これらの物質は、それぞれ小分子、多糖類、及びタンパク質のモデルとして選択された。細胞タイプごとに、少なくとも４つのデバイス設計と２つの動作圧力が試験された。収縮の大きさの最初の選択は、細胞株、初代線維芽細胞及び胚性幹細胞での作業によって導かれた。（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０：２０８２−２０８７）。具体的には、狭窄部の幅は、標的細胞の平均直径の約５０％であるように選択された。リンパ球及び骨髄細胞では、３０−４デザイン（すなわち、狭窄は長さ３０μｍ及び幅４μｍを有する）を使用した送達が最も効果的であった（図２Ａ〜Ｃ）。
生体分子の送達（図２Ａ〜Ｃ及び図６）及び細胞生存率（図７）を、処理後１〜２時間のフローサイトメトリーによって測定した。図２Ａ〜Ｃは、抗体送達の代表的なヒストグラム（Ａ）、独立した実験における３ｋＤａデキストラン、７０ｋＤａデキストラン及び抗体の送達効率（Ｂ）及び代表的な中央強度データ（Ｃ）を示す。送達効率（バックグラウンドを超える蛍光を有する生細胞のパーセンテージとして定義される）及びメジアン蛍光強度を送達の主要尺度として用いた。３ｋＤａのデキストランは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞のそれぞれ６６．２±１３．４％、６７．５±１３．９％、及び８０．８±３．４６％に送達された。より大きな７０ｋＤａのデキストラン及びＡｂの取り込みは、予想通り３ｋＤａデキストランの取り込みよりも効率が悪く、より小さな分子がより効率的に送達されることを示唆している。Ｂ細胞または骨髄細胞ではなくＴ細胞の細胞生存率は、未処理細胞またはデバイス無しと比較して幾分損なわれた。このデバイスで処理されたＢ細胞及び骨髄細胞の生存率の変化は、未処理またはデバイス無しの細胞と有意な差はなかった。骨髄由来樹状細胞は、より大きなサイズのために６μｍより大きい狭窄幅を使用して、生存能力の喪失が制限されたデキストラン及び抗体を取り込んだ（図８）。デキストラン（３ｋＤａ及び７０ｋＤａ）及び抗体の同時送達は、これらの分子の送達が比例すること、すなわち抗体を受けた細胞もまた比較量のデキストラン分子を受けたことを示した（図９）。
ヒト免疫細胞への送達
ヒト免疫細胞に対するこのアプローチの適用性を調べるために、Ｔ細胞について４〜６μｍ及び単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）について６〜９μｍの範囲の狭窄幅を有するデバイス設計を試験した。異なる生体分子に対する抗体送達及び効率データの代表的なヒストグラムを図３Ａに示す。最も効果的な設計は、３ｋＤａのデキストランをＴ細胞の７０％±９％（４μｍの狭窄サイズ）及びＭＤＤＣ（７μｍの狭窄サイズ）の６０％±４．５％に送達した（図３Ａ）。７０ｋＤａのデキストランをＴ細胞の７１％±１１％及びＭＤＤＣの４０％±１４％に送達し、タンパク質（抗体）をＴ細胞の６５％±１５％及びＭＤＤＣの３８％±７％に送達した。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ（ＣＤ４５ＲＡ ｓｉＲＮＡ−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８）の送達も同様の結果を与えた（図１２、１３）。
タンパク質ノックダウンを試験するために、ヒトＣＤ４またはＣＤ４５ＲＡに対するｓｉＲＮＡを血液由来のＴ細胞に送達し、５，１及び０．２μＭのｓｉＲＮＡを用いて処理して７２時間後にタンパク質レベルの用量依存性ノックダウンを観察したが、対照ｓｉＲＮＡは有意な効果を示さなかった（図３Ｂ、図１２、１３）。処理後４８時間でｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合、ＣＤ４ ｍＲＮＡも減少した（図１４）。５μＭのＣＤ４ ｓｉＲＮＡで処理したＴ細胞におけるＣＤ４ノックダウンの耐久性も試験した。ノックダウンは約１０日間続いた（図１４）。樹状細胞マーカーＤＣ−ＳＩＧＮを標的とするｓｉＲＮＡの送達もまた、異なるデバイス設計を用いてＭＤＤＣにおけるＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質発現において有意な配列特異的ノックダウンをもたらした。異なるデバイス設計におけるノックダウンのレベルは、デキストラン／Ａｂ送達効率と相関していた。ＣＤ４ Ｔ細胞及びＭＤＤＣについての独立した実験からのタンパク質発現及びコンパイルされたノックダウンデータの代表的なヒストグラムを図３Ｂに示す。このアプローチはまた、ヒト制御性Ｔ細胞（図３Ｃ）、Ｂ細胞及び単球（図１６、１７、１８）に適用可能であることも分かった。
マイクロ流体デバイスの性能をヌクレオフェクション（エレクトロポレーションに基づく核酸送達アプローチ）と比較するために、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞をＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅプラットフォームまたはヌクレオフェクションマシンにより平行してｓｉＲＮＡで処理し、タンパク質ノックダウンを７２時間後にフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ４ノックダウンの程度は２つの間で類似していた（図３Ｄ）が、ヌクレオフェクション後のＴ細胞生存率はマイクロ流体デバイスで処理した細胞よりも有意に悪かった（Ｐ＜０．０５）。標識されたデキストラン及びタンパク質の送達のための２つのプラットフォームの効率を比較した。ＭＤＤＣとの関連で、変形デバイスの性能とヌクレオフェクションとの比較は、Ｔ細胞と同様の結果をもたらした。具体的には、最良のマイクロ流体デバイス（Ｔ細胞の場合３０−４、ＭＤＤＣの場合１０−６）は、細胞生存率及び送達において優位性を示した（図１８）。２つの技術間のｓｉＲＮＡノックダウン効率の比較もまた、細胞圧搾がオフターゲット効果を減少させ（図１９）、長期生存率を改善することを示した。
初代ヒトＴ細胞におけるＨＩＶ−１感染の阻害
マイクロ流体アプローチが、ウイルス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達することによってヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ感染及び複製を阻害するのに有用であるかどうかを決定するために試験を行った。以前にウイルス複製を抑制することを示したｖｉｆ及びｇａｇに対するｓｉＲＮＡを、ＨＩＶ感染２４時間前に細胞に送達した。陽性対照として、ＨＩＶ受容体ＣＤ４を標的とするｓｉＲＮＡを使用した。ＣＤ４ｓｉＲＮＡを感染の４８時間前に送達して、表面ＣＤ４レベルの低下を確実にし、従って感染を阻害した。ＨＩＶ複製は、細胞内ｐ２４抗原を染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって測定した。独立した感染実験の代表的なヒストグラム及び集計結果を図４Ａ〜Ｂに示す。ｖｉｆ及びｇａｇ標的化ｓｉＲＮＡで処理されたＴ細胞において、ｐ２４抗原の有意な減少が、別々にまたは組み合わせて観察された（ｐ＜０．０１）。阻害効果は、ＣＤ４ノックダウン（ｐ＜０．０５）により誘導されたものよりも大きかった（図４Ａ〜Ｂ）。
細胞形状変化デバイスを用いた免疫細胞への化合物の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）細胞質ゾルの送達
免疫細胞への巨大分子の細胞内送達は、本発明より以前には多大な課題であった。本明細書に示される結果は、マウスやヒトの免疫細胞のような真核細胞に小分子だけでなく大型の巨大分子も送達するベクターフリー膜破壊技法の有用性を示している。結果は、免疫細胞はこれらの細胞の細胞質に組成物を送達する他の技術にとって扱いにくいため、特に臨床用途に関連して驚くべきことである。本明細書に記載のデータは、（ｉ）多様な生物学的に関連する巨大分子（多糖類、タンパク質、及び核酸）を送達する能力；（ｉｉ）最も臨床的に関連する免疫細胞サブセット（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ、単球／マクロファージ）における有効性（図２Ａ〜Ｃ及び図３Ａ〜Ｄ）；（ｉｉｉ）ベクター物質及び電場からの独立性、従ってエンドサイトーシスの捕捉及びエレクトロポレーションレベルの毒性に関連するいくつかの課題を克服すること；及び（ｉｖ）複数の種類の巨大分子の標的細胞への同時送達（図２Ｃ、９、１２、１３）を示す。
これらの驚くべき顕著な利点は、前に予測できなかった免疫細胞操作及び臨床応用を可能にする。例えば、このシステムは、ペプチドまたはタンパク質ベースの治療薬を、既存の方法（例えば電気穿孔）が限られた有効性しか示さなかった物質であるリンパ球に送達するためのプラットフォームとして役立つ。このシステムの同時送達特性は、複数の治療候補を並行してスクリーニングしてスクリーニングプロセスを加速し、相補的効果を特定することができる可能性があり、有用である。さらに、トレーサーとして類似のサイズの標識分子を使用することにより、非標識標的物質の送達効率を独立してモニターすることが可能となる。このシステムを用いて、量子ドット等の他の造影剤も送達することができ、生細胞における分子相互作用の直接観察を容易にし、生物学的プロセスのより深い理解を増加させる。
非限定的な例では、量子ドットまたは磁性ナノ粒子を送達して、移動した免疫細胞のインビボ・イメージングを容易にする。例えば、ＭＲＩは、磁性粒子を負荷した養子移入（適合移植）されたＴ細胞の局在を検出することができる。
狭窄部の形状、温度、動作圧力及び緩衝液組成等のシステムパラメータへの送達性能の依存性は、免疫細胞または免疫細胞の混合物、例えば全血中の細胞、への化合物／組成物の送達のために調整される。例えば、免疫細胞のための例示的なデバイスパラメータには、Ｔ細胞（３０−４休止、１０−４活性化）、Ｂ細胞（３０−４休止、１０−４活性化）、マクロファージ（１０−６）、樹状細胞（１０−６）、並びに白血球画分／軟膜細胞または全血球等の混合物、を含む。全ての狭窄設計の範囲は、２〜１０μｍ幅、０．１〜９０μｍ長さである。従って、他の細胞型について確立された設計ルールを使用してデバイスアーキテクチャ及び操作プロトコルを開発することによって、標的のリンパ球及び骨髄細胞集団におけるプラットフォームの性能を最適化することができる。例えば、より長く狭い狭窄部を有するデバイスを製造することにより、送達効率を高めることができる。システムの処理能力は、現在１００，０００〜１，０００，０００細胞／秒であるが、デバイスあたりの並列チャネル数を増やすか、動作圧力を上げることによって増加させることもできる。いくつかの実施形態では、処理能力を増加させるために、チャネルの深さを増加させるか、または追加のチャネルを並列に追加する。動作圧力は、デバイスの設計によって変動しうる。ある実施形態において、圧力は１ｐｓｉ〜１０００ｐｓｉである。
ｖｉｆ及びｇａｇノックダウン試験は、細胞表現型を変えて、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）複製のような疾患関連生物学的プロセスに影響を与えるこのアプローチの可能性を実証する（図４Ａ、Ｂ）。この結果は、このアプローチによる疾病治療の有用性及び疾患メカニズムの研究（例えば、特定の遺伝子に対するウイルス複製の依存性）の有用性を実証するだけでなく、潜在的に有毒な送達ベクターを使用せずに、特異的な宿主細胞機能／経路を標的化することにより臨床使用のための免疫細胞を操作することも実証する。圧搾によって送達されるタンパク質転写因子、例えばＩＲＦ５を、ヒトｐＤＣ中のＩＦＮ−α産生を増加させるために使用することができ、圧搾によって送達されるタンパク質もまた機能的で細胞表現型に影響を及ぼし得ることが実証される。従って、この細胞内送達系は、細胞外抗体及びサイトカインに基づくアプローチの能力を超える能力を有する免疫細胞操作のために有用である。
本明細書に記載のデータは、（本発明以前の）技術者には困難であり、化合物／組成物の細胞質送達を達成することが困難であった免疫細胞の細胞質送達に対するウイルスベクター無しのマイクロ流体アプローチの驚くべき有効性を示す。このデータは、さらに、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）、及び樹状細胞への、多糖類、タンパク質及び核酸を含む様々な巨大分子の送達を促進するこのアプローチの能力をさらに示す。送達された物質の機能性は、５つの異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに基づくノックダウン研究において確認された。最後に、ＨＩＶ感染試験は、細胞表現型を変えて、感染症の抑制のためにウイルス複製に影響を及ぼすこのアプローチの有用性を強調している。本明細書に記載されるベクター無しの送達系は、免疫細胞の機能を操作し、及び／またはそれらの表現型、機能、活性化状態を変化させるための安全で信頼性の高い有効な方法を提供する。
未確認病原体に対する迅速な応答のワクチン系
感染性病原体は、兵士にも一般市民にも同様に重大な脅威をもたらす。潜在的な生物学的攻撃や流行性ウイルスの進化を防ぐために、頑強で迅速応答の予防接種能力を開発しなければならない。最先端の技術で、毒性のある菌株を科学者が分離して特徴付けることができたとしても、効果的なワクチンを開発するには長い年月と数十億ドルかかることがある。エボラやＨＩＶ等の多くの致命的な病原体は、何十年もの研究にもかかわらず、現代のワクチン接種法では対応できない。本発明は、本明細書に記載のベクター無しの細胞内送達プラットフォームを使用して個々の免疫細胞を直接操作することにより、病原体に対する迅速応答、多標的、個別保護のための方法及びデバイスを提供している。この方法は、新たに感染した個体を同定してから数時間以内に地域の危険性のある集団に効果的にワクチン接種することを可能にし、以下の表３に示すように以前のアプローチに比べていくつかの優位性を有する。

個体のＡＰＣ（例えば、Ｂ細胞、ＤＣ及び再プログラミングされたＴ細胞）の細胞質への抗原性タンパク質の直接送達は、弱毒化ウイルスベクターの同定及び開発の必要性を排除するとともに、ウイルスエスケープを弱めるために必要な多標的免疫応答を誘導することにより、より効果的な保護を提供する。この現場展開可能なワクチン接種プラットフォームは、数ヶ月／年ではなく、数時間以内に大流行に対処する。
病原体が個体で疑われる場合、まず感染組織の生検を行う。病原体を含むこの組織は溶解され、分子成分（即ち抗原）は無傷のままであるが、病原体は溶解プロセスのために不活性化される。次いで、この抗原混合物は、健康な個体の免疫細胞に、それらの血液を取り込み、それらの細胞をマイクロ流体細胞内送達デバイス（３）に通して運ぶことによって、送達され、その後血液流に再導入する。この送達プロセスは、病原体関連抗原を、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び単球を含む血液中の常在ＡＰＣの細胞質に導入する。その後、抗原断片をＭＨＣ−Ｉによって提示し、疾患特異的細胞傷害性Ｔ細胞ＣＴＬの活性化を促進して保護する。溶解は、感染生検（単一の生検から複数の健康な患者のための用量を生成する）を得てから１〜２時間以内に完了することができ、健康な患者のその後の接種には、１人あたり５分未満が必要である。（図５）さらに、病原体が特徴付けられている場合、例えば、ＨＩＶまたはエボラの場合、細胞溶解物を、化学的に規定された抗原源としての合成ペプチドに置き換えることができ、従って溶解物の使用を取り巻く潜在的な安全性の懸念が排除される。
従来の高価な複数年の開発プロセスが人命の実質的な損失につながる場合に、迅速応答ワクチンプラットフォームは、様々な生物学的脅威に対する第一線の防御を提供する。ワクチン接種に対するこのアプローチは、腫瘍学及び感染症治療にも適用可能である。
Ｂ細胞における細胞内抗原負荷のためのマイクロ流体圧搾
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、組織から外来または自己のタンパク質及びペプチドを捕捉し、適応免疫細胞を活性化して、これらの抗原に対する炎症性または寛容性免疫応答を生じさせる免疫細胞（樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞を含む）の多様なサブセットである。タンパク質は、それらの周囲の液相サンプリング、または外来微生物または死細胞破片の受容体媒介摂取を介して、インビボでＡＰＣによって摂取される。摂取されたタンパク質は、ペプチドフラグメント（抗原）に分解されるが、このペプチドフラグメントは、ＡＰＣ及び提示された抗原によって受け取られた特異的なシグナルに基づいてナイーブＴ細胞活性化を指示する、共刺激シグナルと共に処理されてＴ細胞に提示されるものである。Ｔ細胞活性化におけるこの重要な役割のために、抗原が負荷され、体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）で活性化された精製ＡＰＣは、培養物（例えば、養子Ｔ細胞療法のため）で機能性Ｔ細胞を拡大するために、またはインビボでの有効な細胞ワクチンとして、使用され得る。マイクロ流体システムを使用して、ＡＰＣの体外操作は、特異的タイプの免疫、特にがん及びＨＩＶ等の疾患（これらの疾患では、病原細胞の標的死滅が重大であり、そして内因性のＡＰＣ機能が活発に抑制される）において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するための代替アプローチとして有効であることが示された。有望な前臨床試験にもかかわらず、細胞ベースのワクチンの臨床的翻訳は、複数の制限によって妨げられてきた。免疫細胞の細胞質ゾルへ抗原を送達するためのマイクロ流体デバイス及び関連する方法は、以前のアプローチの多くの問題及び欠点を解決する。
細胞ベースのワクチンに関するこれまでの臨床研究は、樹状細胞（ＤＣ）、いわゆる「プロフェッショナル」ＡＰＣに焦点を当ててきたが、それはプライミングＣＴＬにおける効率、及びそれらの高度に活性な細胞外タンパク質取り込み及び抗原処理能力のためである。しかしながら、臨床使用のためのプラットフォームとして、ＤＣは、ヒト血中の相対的な不足、複雑なサブセットの異種性、短い寿命、及び増殖不能によって制限される。これらの課題は、他の細胞型へと導き、マクロファージ及びＢ細胞を含む細胞ベースのＡＰＣワクチンについても考慮されるようになった。Ｂ細胞は、リンパ球としての独特の性質及びＤＣの多くの制限を克服する可能性のために、この目的のための望ましい細胞集団である。例えば、Ｂ細胞は循環中に豊富であり（血液１ｍＬ当たり最大５０万細胞）、細胞活性化により増殖し、静脈内投与されると二次リンパ器官に効率的に戻る。
ＡＰＣとしてのＢ細胞のこれらの利点は、Ｔ細胞のプライミングのための抗原を獲得して処理するためのＢ細胞の能力の限界によって相殺される。Ｂ細胞は、遺伝的に再構成されたＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現し、ＢＣＲは、それらの標的抗原に結合すると、抗原取り込み及びＢ細胞活性化を促進する。Ｂ細胞はそれらのＢＣＲを介して抗原を内在化することができ、一次Ｔ細胞応答をプライミングするが、非特異的抗原（即ちＢＣＲによって認識されない抗原）の取り込みは、それらの周囲から抗原を効率的に飲作用および貪食するマクロファージ及びＤＣに比較して劣っている。さらに、ＣＴＬのプライミングは、通常、細胞質ゾル（ここではクラスＩ ＭＨＣプロセシング機構が主に存在する）に位置する抗原のみが負荷されるクラスＩ ＭＨＣ分子によるペプチドの提示によって起こる。対照的に、ＢＣＲを介してエンドリソゾームに取り込まれたタンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞への提示のためにＭＨＣクラスＩＩ提示経路に向けられる傾向がある。或いは、Ｂ細胞及び他のプロフェッショナルＡＰＣは、交差提示を介してクラスＩ ＭＨＣ分子にペプチドを負荷することができる（クラスＩペプチド−ＭＨＣ複合体がプロテアソームプロセッシングまたは液胞タンパク質分解を介してエンドサイトーシス抗原から産生されるプロセスである）が、このプロセスは一般に非常に非効率的である。
Ｂ細胞における抗原摂取及び交差提示を増加させる方法が開発されているが、これらの戦略は、エンドサイトーシス取り込みのための特異的受容体の標的化、非特異的エンドサイトーシスを増加させるためにＢ細胞を液相タンパク質曝露と組み合わせて活性化すること、免疫刺激複合体として抗原を送達すること、またはＢ細胞機能を誘導する融合タンパク質を生成することに大きく依存している。これらのアプローチは、抗原取り込みが、標的受容体を介してシグナル伝達することにより媒介されるＢ細胞状態において他の変化と結合し、これは抗原負荷及びＢ細胞活性化が別々に調節され得ないことを意味するとの事実によって制限される。例えば、休止Ｂ細胞は、自己免疫を処理する際に潜在的に有用な性質である、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に対して寛容性であることが示されており、Ｂ細胞の活性化はこのような適用において問題となる。ＤＮＡ、ＲＮＡ３３、または抗原をコードするウイルスベクターによるＢ細胞のトランスフェクションもまた有望とされているが、エレクトロポレーションの毒性、ウイルスベクターパッケージング能力、形質導入効率、安定性、及び抗ベクター耐性等の多くの問題によって制限されている。本明細書に記載の方法は、初期のアプローチのこれらの欠点に対する解決策を提供する。
Ｂ細胞がマイクロ流体デバイスのマイクロスケールチャネルの狭窄部を通過する際（機械的破壊）に、全タンパク質、即ち未処理抗原、の一時的なプラズマ原形質膜破壊／摂動による生Ｂ細胞への直接細胞質ゾル送達が達成される。十分に定義され、当該技術分野において承認されているモデル抗原であるオボアルブミン（ＯＶＡ）を使用して、この方法による全タンパク質の送達は、休止Ｂ細胞でさえインビトロ及びインビボの両方においてエフェクターＣＴＬの強固なプライミングを誘発することを可能にした。ＭＨＣクラスＩによる全タンパク質送達及び抗原提示のこの方法は、抗原負荷をＢ細胞活性化プロセスから切り離すＢ細胞における最初の抗原送達方法であり、これら２つのプロセスが免疫原性または寛容原性ワクチン用に個別に調整されるのを可能にする。細胞の圧搾は、インビトロでのＣＴＬ増殖のために自己Ｂ細胞をプライミングする代替のモジュラープラットフォームを提供し、ならびにＢ細胞ベースのワクチンの開発を促進する。
抗原提示に関するデータを生成するために、以下の材料及び方法を使用した。
試薬。ＴＲＩＴＣ−及びカスケードブルー−標識３ｋＤａデキストランはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＦＩＴＣ標識４０ｋＤａデキストランはＣｈｏｎｄｒｅｘから購入した。モデル抗原の、低エンドトキシンオボアルブミンタンパク質はＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（ＣｐＧ Ｂ）、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３９５（ＣｐＧ Ｃ）、及びＬＰＳ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＬＰＳ）は全てＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ／ｍｅｇａＣＤ４０Ｌは、Ａｄｉｐｏｇｅｎ及びＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
細胞の単離。免疫細胞または免疫細胞のサブセットを単離／浄化または富化するための方法及び手順は、当該分野で周知である。ヒトのための、例えば、末梢血単核細胞は、静脈穿刺により全血から取得され、及び免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージのサブセットは標準的なプロトコルを使用して分離される。骨髄はまた、免疫細胞の供給源としても使用される。
本明細書に記載の実施例におけるＢ細胞単離のために、脾臓をマウスから採取し、７０μｍの細胞ストレーナーにてすりつぶした。赤血球を溶解し、Ｂ細胞分離キット、マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて製造者の指示に従って、細胞懸濁液からＢ細胞を単離した。単離後、Ｂ細胞懸濁液はフローサイトメトリーで測定して、９５％超のＢ２２０＋であった。Ｄ８＋Ｔ細胞の単離のために、脾臓及び鼠径リンパ節を採取し、すりつぶした。赤血球溶解後、ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キット、マウス（Ｍｉｌｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、製造者の指示に従ってＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キットで単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離は、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、マウス（Ｍｉｌｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて脾臓及び鼠径リンパ節の懸濁液で行った。Ｔ細胞は、ＣＤ８ａまたはＣＤ４染色及びフローサイトメトリーによって測定して、一貫して９０％超純粋であった。全ての細胞培養は、１μＬ／ｍＬの５５ｍＭβ−メルカプトエタノールを補充したＴ細胞培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、１Ｘピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ）中で行った。
細胞を圧搾することによるタンパク質送達。マイクロフルイディクスデバイス及び圧力システムであるＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅ（ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、休止中のＢ細胞への全タンパク質抗原の送達を行った。用いたチップ設計は、３０−４×１、１０−４×１、及び３０−５×５を含み、Ｘ−Ｙ×Ｚは、長さＸμｍ及び直径ＹμｍのＺの連続狭窄チャネルを示す。Ｂ細胞を、１００μｇ／ｍＬのオボアルブミン、０．３ｍｇ／ｍＬのＴＲＩＴＣまたはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識した３ｋＤａのデキストラン、または０．３ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識した４０ｋＤａのデキストランを含む媒体中で５×１０６細胞／ｍＬに懸濁し、氷上に置いた。マイクロ流体チップ及びホルダーセットも冷えるまで氷水浴中に置いた。細胞懸濁液を、１２０ｐｓｉにて２００μＬアリコートでデバイスに送った。エンドサイトーシス対照Ｂ細胞は、ＯＶＡを有する媒体中で同じように調製されたが、マイクロ流体デバイスを通過しなかった。抗原負荷後、細胞を室温で５分間静置し、ＰＢＳで２回洗浄した。送達効率を評価するために、抗原または他の送達されたものの取り込みをフローサイトメトリー（蛍光標識組成物の検出）によって測定した。
インビトロ細胞培養、活性化及び増殖アッセイ。インビトロでの機械化されたＢ細胞の活性化を特徴付けるために、ＳＱＺデバイス通過した細胞及びエンドサイトーシス対照細胞を、５μＭＣｐＧＢ、５μＭＣｐＧ Ｃ、または１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳで、５×１０５細胞／ｍＬで９６ウェルＵ底プレートにてインキュベートした。２４時間及び４８時間でフローサイトメトリーを行い、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＭＨＣクラスＩ、及びＭＨＣクラスＩＩの細胞表面レベルを測定した。インビトロ増殖アッセイのために、精製されたＳＩＩＮＦＥＫＬオボアルブミンペプチド特異的ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋（ＭＨＣクラス１限定）またはＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ限定）を１０７細胞／ｍＬで懸濁させ、ＣＦＳＥ（５μＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分間標識した。１回の洗浄後、Ｔ細胞及びＢ細胞を、９６ウェルＵ底プレート中の２００μＬのＴ細胞培地中に１：０．８の比でプレーティングした。ＣｐＧ Ｂ、ＣｐＧ Ｃ、またはＬＰＳを適切なウェルに添加し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１つのビーズ／Ｔ細胞で陽性対照ウェルに添加した。サイトカイン分析のための上清収集及びＴ細胞増殖を評価するためのフローサイトメトリーを第２日及び第４日に行った。
インビボ増殖アッセイ。−１日目に、ＣＦＳＥ（５μＭ）で標識した１０６ＯＴ−Ｉ Ｔｈｙ１．１ ＣＤ８＋休止Ｔ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼窩後方（ｒ．ｏ．）に注射した。翌日（０日目）に、動物に、ｒ．ｏ．において、前日にマイクロフルイディクスＳＱＺデバイスを使用してＯＶＡを負荷し、５μＭのＣｐＧ Ｂと共に一晩インキュベートしたか、または注入の直前に機械的破壊によってＯＶＡを負荷し、いかなるＴＬＲリガンドに曝露されなかった１〜３百万のＣＤ４５．１＋Ｂ細胞を注入した。４日目に動物を剖検し、これらの脾臓、鼠径リンパ節及び頸部リンパ節を摘出した。臓器を細胞ストレーナーですりつぶした。単一細胞懸濁液をマウス抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートして非特異的抗体結合を減少させ、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗Ｂ２２０−ＰＥ−Ｃｙ７、抗ＣＤ４５．１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ 、及び抗Ｔｈｙ１．１−ＡＰＣ−Ｃｙ７で染色した。細胞数及び／またはＣＦＳＥ希釈を決定するためのフローサイトメトリーは、既知の方法を用いて行った。
機械的破壊（マイクロ流体細胞圧搾）は巨大分子の迅速かつ効率的な送達を可能にする
抗原を用いてＢ細胞を負荷するための機械的破壊のプロセスは、本明細書に記載のデバイスを用いて達成された。生細胞を、シリコンデバイス内の平行なマイクロ流体チャネルに通した；各チャネルにおいて、１つ以上の狭窄部が、デバイスを通過する細胞の膜に一時的な細孔または乱れを生じさせる。周囲の流体中に存在する巨大分子積み荷は、この過渡的乱れ／膜破壊の間に細胞内に拡散し、細胞内負荷をもたらす。機械的破壊は、原発性ネズミＢ細胞を含む多種多様な細胞型への巨大分子の細胞質送達を促進するために有効である。長さ３０μｍ及び幅５μｍの寸法を有する５つの連続した狭窄部で効率的な送達が達成された。Ｂ細胞へのタンパク質送達及びその後の抗原提示のための機械的破壊パラメータを個別化するのを促進するために、デバイス設計を変更することができる（平行狭窄チャネルの数を７５に増やし、侵入領域を長くする、可逆性等）。最適化予備実験は、１２０ｐｓｉで作動する３０−４×１マイクロ流体チップ（長さ３０μｍ、直径４μｍのチャンネル当たり１つの狭窄）が、５×１０６Ｂ細胞／ｍＬの濃縮イオンで効率的な送達及び高い細胞生存率の両方を有するマウスＢ細胞の機械的破壊のための効果的なチップ設計であることを示した。本明細書には他の構成、例えば３０−５×５対３０−４×１が記載されている。この圧力の細胞は、約１００万個／秒の速度でデバイスを通過した。マイクロ流体圧搾は、エンドサイトーシスと比較してデキストランの取り込みを大きく向上させ、内在化が３及び４０ｋＤａのデキストランについて、それぞれ約６５倍及び約２５倍に増加した。これは、両方のデキストランについて全細胞の７５〜９０％への送達を示し、それに対し、エンドサイトーシスによる休止Ｂ細胞は１０％未満の検出可能な量の積み荷である。機械的破壊後の回収細胞の生存率は、エンドサイトーシス対照と同様に約９５％であった。これらの使い捨てマイクロ流体チップを通過できる最大数の細胞の容量は、１デバイスあたり１００万〜５００万細胞の範囲であったが、デバイスは、詰まるまで複数のアリコートの細胞（１回運転あたり１００万の細胞）で運転され、所与の実験において各個々のデバイスを通過する細胞の最大数はしばしば５００万個をかなり超える細胞であった。最初の運転からデバイスが詰まるまでの送達細胞のパーセンテージの変動が低く、デバイス内変動が最小であることが示された。同じ実験セッション内の複数のデバイスの送達性能（デバイス間のばらつき）は非常に一貫していた。いくつかの用途では、より多くのＢ細胞数、異なる細胞密度でのマイクロ流体デバイスの有効性を必要とすることがあることを認識する。細胞内デキストラン送達の効率は、少なくとも５０×１０６細胞／ｍＬまでは、細胞濃度とはほとんど無関係であり、強固な拡張性の可能性を示している。
増強された抗原提示細胞として機能するように処理されたＢ細胞を示す概略図を図３０に示す。
全タンパク質で圧搾されたポリクローナルＢ細胞が、インビトロでエフェクターサイトカインを分泌する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大する
機械的破壊が細胞質クラス１ ＭＨＣ抗原プロセシング及び提示機構へのタンパク質の送達を促進し得るかどうかを決定するために、周囲の培地中において過剰のモデルタンパク質オボアルブミン（ＯＶＡ）の存在下に細胞をマイクロ流体デバイスに通すことにより、ＯＶＡを休止した精製ポリクローナルＢ細胞に送達するよう、前述の最適条件を利用した。その後、圧搾されたＢ細胞を、ＭＨＣクラスＩ制限ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なトランスジェニックＴ細胞受容体を有するＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞と、Ｂ細胞活性化刺激としてのＣｐＧの存在下または非存在下に共培養した。ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞でのＣＦＳＥ希釈を、フローサイトメトリーで分析し、Ｂ細胞提示抗原に応答するＴ細胞の増殖／拡大を評価した。細胞の圧搾による全タンパク質のＢ細胞への送達は、インビトロでの強力なＭＨＣクラスＩ抗原提示及び抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングを可能にすることが見出された。本明細書に記載されるような細胞の圧搾は、主に抗原を細胞質ゾルに向かわせ、ＭＨＣクラスＩＩ負荷が生じるエンドソーム区画には誘導しない。これと一致して、データは、休止中でもＣｐＧ活性化され機械穿孔された（ｍｅｃｈａｎｏ−ｐｏｒａｔｅｄ）Ｂ細胞も、４日間の共培養の後にＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞を拡大できないことを示した。Ｂ細胞プライミングＣＤ８＋Ｔ細胞集団の機能性を、共培養の２日目及び４日目のエフェクター分子の分泌を測定することにより評価した。エンドサイトーシスによって抗原を負荷したＢ細胞は基礎細胞レベルのサイトカインを産生したが、圧搾により抗原を負荷したＢ細胞は、休止していても活性化していても、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの実質量を分泌させるためにＴ細胞をプライミング（ｐｒｉｍｅ）した。
圧搾されたＢ細胞は、インビボで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングする
さらに、インビトロ抗原特異的Ｔ細胞増殖プラットフォームでは、記載されたように処理されたＢ細胞は、細胞ワクチンとして使用するための樹状細胞の代替物として有用である。インビボの性能を評価するために、コンジェニックマーカーとしてＴｈｙ１．１を発現するＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原提示のレポーターとして受容マウスに養子移入した。１日後、機械破壊抗原負荷直後に休止Ｂ細胞を注入したか、または続いてインビトロにおいてＣｐＧで２４時間活性化された機械破壊負荷Ｂ細胞を注入した。エンドサイトーシスによって抗原を負荷した休止Ｂ細胞を、直ちに、またはＣｐＧで２４時間の活性化後のいずれかで、対照として用いた。Ｂ細胞移植の４日後、マウスを犠牲にし、脾臓及び鼠径リンパ節をフローサイトメトリーによりＯＴ−Ｉ増殖について分析した。インビトロの結果と一致して、機械穿孔されたＢ細胞は、養子移入されたＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の分裂を誘発することができたが、エンドサイトーシス対照は基礎分裂のみを示した。ＣｐＧ活性化及び休止圧搾Ｂ細胞の両方が、脾臓におけるＯＴ−Ｉ増殖を引き起こした（それぞれ、ＳＱＺ対エンドサイトーシスを比較して、ｐ＜０．００１及びｐ＝０．００１の注入ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の約４５％及び約３５％分裂）。エンドサイトーシスＢ細胞と比較して、同様にＣｐＧ活性化Ｂ細胞及び休止圧搾Ｂ細胞もリンパ節における向上したＯＴ−Ｉ増殖を誘発した（それぞれ、ＣｐＧ Ｂ及び休止圧搾Ｂ細胞による、注入されたＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の約４０％及び約３５％の分裂；休止時とＣｐＧの両方についてＳＱＺ対エンドサイトーシスを比較する。ｐ＜０．００１）。エンドサイトーシス対照は、リンパ節で約４％のベースライン分割を示した。これらの結果は、マイクロ流体機械破壊によって負荷されたＢ細胞が細胞ワクチンにおいて有用であることを示した。
結果は、応答するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態を評価する実験によりさらに確認された（図２９）。
従って、本明細書に記載の特定の抗原を負荷したＢ細胞は、細胞ベースのワクチンのためのＡＰＣとして、及び抗原特異的Ｔ細胞の増殖のための自己試薬として、有用であり、樹状細胞に対して、特にそれらの末梢血からの多数の入手可能性、及び実質的に培養においてさらに拡大されるそれらの能力について、顕著な優位性を有する。本発明以前に、Ｂ細胞における、特にクラスＩ ＭＨＣ提示のための効率的な抗原負荷の方法は、インビトロまたはインビボのためのＡＰＣとしてのポリクローナルＢ細胞の開発に対する主要な障壁であった。本明細書に記載されるデバイス及び方法は、休止または活性化Ｂ細胞の細胞質ゾルへのタンパク質抗原の直接的で強固な負荷及び天然の全タンパク質由来のペプチドのＭＨＣクラスＩ提示に導くマイクロ流体ベースの機械的変形及び受動拡散を用いる簡単なアプローチを提示する。機械的破壊によって与えられる利点は、処理、操作または処理なしの天然タンパク質の送達、プロセスの急速な性質、比較的高い送達能率及び機能的結果、並びにプログラミング刺激または受容体ターゲティング等の細胞生物学から分離された休止細胞に、物質を送達する能力等、多数含む。
処理及びＭＨＣクラスＩ提示のために全天然タンパク質またはポリペプチドを直接細胞質ゾルに送達する能力は、天然の抗原処理後に複数のペプチドの偏りのない提示を可能にする。微小流体細胞圧搾デバイスはまた、腫瘍溶解物、例えば、腫瘍生検溶解物、または他の複合タンパク質源を含む、タンパク質の混合物、の送達を可能にする。タンパク質が、細胞活性化状態とは独立してＭＨＣクラスＩプロセシングのために送達されたという前述の実証は、このアプローチの大きな利点であり、このアプローチはタンパク質負荷及び細胞プログラミングの分離を可能にし、各成分の独立した調節を容易にする。
例示的な設計は、７５の平行狭窄チャネルを含む。しかしながら、チャネル数の増加または複数のデバイスの並列動作により、スループットが飛躍的に向上する。このアプローチ（例えば、全実験時間が２時間未満でデバイスを通過する流速約１×１０６細胞／秒）による使用の容易さ及び迅速な処理は、時間の短縮及び細胞ベースの治療薬に必要な調達等の臨床翻訳の利益を提供する。
ＡＰＣとしてＢ細胞を使用すると、単回投与細胞ワクチンを調製するのに必要な患者の血液の量は、ＤＣベースのアプローチと比較して大幅に低減される。エンドサイトーシスまたはピノサイトーシス等の細胞摂取プロセスによるタンパク質負荷に要する時間は回避される。インビトロでの結果は、エフェクターＣＴＬの拡大のための代替プラットフォームとしてのＢ−ＡＰＣの有意な可能性を示し、圧搾されたＢ細胞もインビボで有効なＡＰＣとして機能した。この方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成に役立つＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原提示経路の両方を同時に負荷するのに有用でもある
Ｂ細胞によるクラスＩ制限抗原処理及び提示
従って、Ｂ細胞を、細胞を圧搾処理して、インビトロ及びインビボの両方で抗原特異的Ｔ細胞をプライミングする自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を得た。このマイクロスケール細胞の圧搾プロセスは、原形質膜に一時的な乱れまたは細孔を生じさせ、機械的破壊を介して周囲の媒体からＢ細胞への全タンパク質の細胞内送達を可能にする。休止Ｂ細胞及び活性化Ｂ細胞の両方が、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなく、専ら抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に機械的破壊により送達される抗原を処理し、提示する。圧搾したＢ細胞は、グランザイムＢ及びインターフェロン−γを含む細胞溶解性機能にとって重要なエフェクターサイトカインを産生するインビトロで多数のエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングし、拡大した。圧搾された抗原負荷Ｂ細胞はまた、マウスに養子移入された場合、インビボで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライミングすることができた。これらのデータは、機械破壊／膜攪乱が、Ｂ細胞抗原負荷、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミング、及びＢ細胞活性化からの抗原取り込みの分離に有用であり、また非常に効率的な方法であることを実証している。
免疫刺激または寛容のための抗原提示細胞としてのＴ細胞
本発明以前には、免疫刺激または寛容のための抗原提示は、一般に、例えばＢ細胞、樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞と呼ばれる、選択されたサブセットの細胞の範囲であると仮定され、そして免疫刺激または寛容性を促進する点で抗原を処理及び提示するのに必要な機構が欠如していると推定されたため、Ｔ細胞は含まれなかった。細胞のデバイス及び圧搾媒介抗原負荷は、Ｔ細胞の細胞質ゾルに抗原性タンパク質を直接送達することによって、このような処理をされた細胞に抗原提示表現型を付与するという驚くべき発見をもたらした。
本方法は、以前に報告されていないやり方でＴ細胞免疫応答をインビボで調節する。モデル抗原であるオボアルブミンを、Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅデバイスプラットフォームを用いてネズミ一次Ｔ細胞に送達し、細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定するために宿主に注入した。抗原が負荷されたＴ細胞は、フローサイトメトリーにより測定して、かなりのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じさせることができ、外部の機構（例えば、細胞の圧搾）によって抗原が負荷されたＴ細胞は、実際にその表面にエピトープ（抗原決定基）を提示し、他のＴ細胞と通信し、測定可能な免疫応答を生成することができることを示した。この応答は対照よりも有意に高く、樹状細胞等のプロフェッショナルＡＰＣを用いた実験で観察された応答に匹敵した。
この発見は予想外であり、免疫学及び免疫療法の分野にとって非常に意義深い、なぜならＴ細胞を治療及び研究用途のための有効な抗原提示物質として使用できることを実証しているからである。本発明の前には、ＤＣがこの使用のために広く受け入れられている唯一の細胞であったが、上記のように、細胞圧搾アプローチは、この目的のためにＢ細胞の迅速かつ効率的かつ大いに向上した産生に有用である。Ｔ細胞はＤＣよりも豊富で、より入手可能であるため、より高い臨床効率をもたらし、現時点では高価で製造が困難な細胞ワクチンの適用に、より広い影響を容易にもたらす。従って、Ｔ細胞は、現在、臨床的及び研究的用途のために、任意のタイプの抗原、目的（寛容原性対免疫刺激性）、注射経路の提示のための抗原提示細胞として使用することができる。
細胞圧搾法を用いて未処理の全抗原で処理したマウスＴ細胞は、抗原提示細胞として機能する（図２９）。マウスＴ細胞をマウス脾臓から単離し、例示的な０−３及び３０−４デバイス構成を用いてＯＶＡ濃度（２５０，５０，１０ｕｇ／ｍ１ ＯＶＡ）にて、ＲＰＭＩにおいてＴ細胞にＯＶＡを送達した。次いで、これらのＴ細胞をＯＴ−Ｉ Ｔ細胞（ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドエピトープ特異的）と共に培養し、活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９を評価した。その結果は、未処理の全抗原、例えば完全長オボアルブミンを、細胞圧搾を用いて細胞質ゾルに送達したＴ細胞が、驚くほど効果的に、特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を提示し、活性化するように機能することを示している。
さらなるデータは、血液から単離された初代ヒトＴ細胞へのＤＱ−Ｏｖａ（ＤＱ（商標）オボアルブミン、カタログ番号Ｄ−１２０５３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）の送達を示す（図２８Ａ及びＢ）。ＤＱ卵子は、タンパク質が処理されている場合にはＦＩＴＣチャネル上で蛍光を発するが、タンパク質が細胞によって処理されない場合には蛍光を発しない、オボアルブミンタンパク質の化学的に複合体化されたバージョンである。従って、デバイス処理の場合のＦＩＴＣシグナルの出現は、細胞がＤＱ−Ｏｖａ抗原で処理されたことを示し、さらに製造抗原提示Ｔ細胞（ＡＰＣとしてのＴ細胞）が、上記のマウス系に加えてヒト系においても機能するとの観察を支持している。いくつかの実験では、パシフィック青色チャネル上で蛍光を発する３ｋＤａのデキストラン色素が同時送達された。結果は、ＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞との間のＯｖａ処理の相違を示し、且つエンドサイトーシス対照と比較して劇的な改善を示す。これらのデータは、抗原がＴ細胞の細胞質ゾルに直接送達される場合に、抗原処理がヒトＴ細胞によって行われることを示している。ＤＱ−Ｏｖａ抗原がその蛍光特性を変化させることを示すデータは、抗原がヒトＴ細胞で処理されており、それ故、組織適合抗原によってＴエフェクター細胞に提示されることを示している。
またエピトープ特異的Ｔ細胞の活性化が、インビボでで実証された。図２６は、インビボでのＣＦＳＥ増殖アッセイ（抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖）の結果を示す。ＣＤ８Ｔ細胞を活性化し、マウスで増殖すると、それらはＣＦＳＥ色素を希釈し、より低い蛍光強度を有する。この場合、デバイスまたは陽性対照によって処置されたドナーＴ細胞は、受容マウスにおいて有意により高いＣＤ８Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらした。それに反して、エンドサイトーシス対照は、最小の効果しか示さない。
また抗原処理された野生型Ｔ細胞でのワクチン接種に応答するマウスにおける抗原特異的ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の増殖が、インビボで実証された（図２７）。Ｔ細胞増殖応答は、ＣＦＳＥ染色によって測定した。染色は、細胞が増殖するにつれて希釈される；従って、強度が低いほど応答が大きいことを示し、強度のピークが高いほど応答がない／少ないことを示す。各縦列は、同じマウス由来のリンパ節及び脾臓を有する実験の繰り返しを表す。実験の各縦列には３匹のマウスが含まれていた（計９匹のマウス）。
以下に記載される材料及び方法が、上記の免疫刺激または寛容のための抗原提示細胞としてのＴ細胞に関するデータを作成するために使用された。
実験予定表。以下の実験予定表が使用された：
０日目：ＣＦＳＥ／ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１Ｔ細胞をナイーブＢ６宿主に注入する。
１日目：Ｔ細胞ＡＰＣＳ（Ｔｃ−ＡＰＣ）に抗原を送達し、Ｂ６宿主にＴｃ−ＡＰＣ及びＡＰＣ対照を注入する。
５／６日目：免疫化マウスの脾臓及びリンパ節を採取し、フローサイトメトリーを介してＴ細胞の増殖を分析する。
Ｔ細胞単離（養子移入のため）。材料：１００ｕｍファルコン細胞ストレーナー；７０ｕｍファルコン細胞ストレーナー；アンモニウム−クロリド−カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液；ＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）；ＭＡＣＳ細胞分離カラム。Ｔ細胞培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ、ペンストレップ（ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ）、１×ピルビン酸ナトリウム、５０ｕＭのｂ−メルカプトエタノール）；ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中の２ｍＭ ＥＤＴＡ）。方法：脾臓及び皮膚排出リンパ節を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上のＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１ Ｒａｇ ２−／−マウスから採取し、湿潤１００ｕｍ細胞ストレーナーを通して５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブにすりつぶして入れた。フィルターをＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。上清を吸引し、続いて３ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液を加えて赤血球を溶解させた。１２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で反応を停止させ、次いで５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。細胞ペレットを、１×１０７個の細胞あたり４０ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、次いで７０ｕｍの細胞ストレーナーを通して５０ｍＬのファルコンチューブに濾過した。１×１０７細胞あたり１０ｕＬのＣＤ８ａ＋Ｔ細胞抗体カクテルを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。１×１０７個の細胞当たり３０ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、次いで１×１０７細胞あたり２０ｕＬのストレプトアビジンビーズを添加し、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を８００ｒｃｆで５分間スピンダウンし、上清を吸引し、次いで３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液、続いて７０ｕｍの細胞ストレーナー上の３ｍＬの細胞懸濁液を１５ｍＬのファルコンチューブに通すことにより細胞分離カラムを調製した。カラムを３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、プールされたフロースルーを５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。上清を吸引し、濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞をＴ細胞培地に懸濁させた。９０％超の純度を、ＣＤ８ａを染色し、フローサイトメトリーで分析することによって確認した。
ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット／ＣＦＳＥ標識。材料：ＤＭＳＯ中のＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）；ＤＭＳＯ中のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）；精製ＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１ ＣＤ８＋Ｔ細胞；無菌ＰＢＳ；無菌胎児ウシ血清。方法：ＯＴ−Ｉ ＣＤ４５．１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記のように富化し、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中の２．５ｍＬの温ＰＢＳに懸濁した。ＤＭＳＯ中のＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＶｉｏｌｅｔまたはＣＦＳＥを１０ｕＭの温ＰＢＳに溶解し、次いで２．５ｍＬを細胞懸濁液に添加した（最終濃度５ｕＭ）。細胞を３７℃の温水浴に１０分間放置した後、７ｍＬのＰＢＳを加えて反応を停止させた。滅菌ガラスピペットを用いて２ｍＬのＦＢＳを底に層状にし、次いで５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。上清を吸引し、細胞を１０ｍＬのＰＢＳで再度洗浄し、次いで５００ｒｃｆで回転させ、１００ｕｌのＰＢＳあたり２ｘ１０７個の細胞で再懸濁させた。
Ｔ細胞単離（Ｔｃ−ＡＰＣとして）。材料：１００ｕｍファルコン細胞ストレーナー；７０ｕｍファルコン細胞ストレーナー；ＡＣＫ溶解緩衝液；Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＭＡＣＳ細胞分離カラム；Ｔ細胞培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ、ペン−ストレップ（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）、１×ピルビン酸ナトリウム、５０ｕｍのｂ−メルカプトエタノール）；ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中の２ｍＭ ＥＤＴＡ）。方法：脾臓及び皮膚排出リンパ節をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから採取し、湿潤１００ｕｍ細胞ストレーナーを通して５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブにすりつぶして入れた。フィルターをＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。上清を吸引し、続いて３ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液を加えて赤血球を溶解させた。反応を１２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で停止させ、次いで５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。細胞ペレットを、１×１０７個の細胞あたり４０ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、次いで７０ｕｍの細胞ストレーナーを通して５０ｍＬのファルコンチューブに濾過した。１×１０７個の細胞当たり２０ｕＬのＰａｎ Ｔ細胞抗体カクテルを加え、氷上で１０分間インキュベートした。１×１０７細胞当たり３０ｕＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、次いで、１×１０７個の細胞当たり２０ｕＬのストレプトアビジンビーズを添加し、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を８００ｒｃｆで５分間スピンダウンし、上清を吸引し、次いで３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液、続いて７０ｕｍの細胞ストレーナー上の３ｍＬの細胞懸濁液を１５ｍＬのファルコンチューブに通すことによって細胞分離カラムを調製した。カラムを３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、プールされたフロースルーを５００ｒｃｆで４分間スピンダウンした。上清を吸引し、濃縮したＴ細胞をＴ細胞培地に懸濁させた。９０％超の純度を、ＣＤ３ｅを染色し、フローサイトメトリーで分析することによって確認した。
インビトロでのＴ細胞抗原送達及び活性化。材料：精製Ｔ細胞；Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ ３０−４チップ；Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅデバイス；リポ多糖類（ＬＰＳ）；Ｔ細胞培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ、ペン−ストレップ（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）、１×ピルビン酸ナトリウム、５０ｕＭのｂ−メルカプトエタノール）；ＯＶＡタンパク質；ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド。方法：精製Ｔ細胞を、１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳを含むＴ細胞培地中で氷上において３０分間インキュベートした。Ｔ細胞をＴ細胞培地で２回洗浄し、５００ｒｃｆで４分間スピンダウンし、次いで氷上で０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍ１ ＯＶＡまたは１ｕｇ／ｍＬ ＳＩＩＮＦＥＫＬのいずれかとインキュベートした。Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅデバイスを標準的なプロトコルに従って３０−４チップで組み立て、２００ｕＬのＴ細胞培地を各チップに１００ＰＳＩで流した。Ｔ細胞の半分を１００ＰＳＩでＣｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅデバイスに通し、残りの半分を氷上に残した（エンドサイトーシスの場合）。フロースルーを９６ウェルプレートに集め、氷上に１５分間放置して細胞膜を修復した。細胞を３５０ＲＣＦで１０分間スピンダウンし、上清をフリックした。宿主への注射前に、細胞を１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳ中で１０分間再活性化した。
患者の免疫細胞の富化（濃縮）
細胞の圧搾はまた、後で患者に戻すために生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で患者由来の免疫細胞を富化または拡大するために有用である。例えば、抗原は、機械的破壊を介して抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ）の細胞質ゾルに送達される。これらの抗原提示細胞は、その表面にＭＨＣ／ＨＬＡヘテロダイマーという観点で処理された抗原を処理して提示し、Ｔ細胞を刺激し及び拡大する。Ｔ細胞の拡大された集団は、その後、治療免疫応答を増大させるために患者に再注入される。例えば、抗原は、抗腫瘍応答を増強するための腫瘍抗原（または溶解物）である。あるいは、微生物感染症を増強するための抗原または細菌もしくはウイルス抗原（またはそれらの断片もしくは弱毒化もしくは死滅した細菌細胞またはウイルス粒子）。別の例では、抗原は、寛容化された免疫細胞の集団を寛容化させてその後に膨張させて患者に再注入して戻し、異常な（例えば自己免疫の）応答を下方制御するための寛容原（上記のような）と共に提示される自己抗原である。
抗原提示細胞としてのＴ細胞の使用
抗体治療薬を使用して患者のＴ細胞の活性化に基づくがん免疫療法は、高頻度の突然変異を有し、且つ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する既存のＴ細胞応答を有するこれらの適応症において成功していることを示している（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１５；２７：４５０−４６１；Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１０；３６３：７１１−７２３；Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１５；１６１：１８５−１８６）。多くのがんは突然変異の頻度が低く、自発的Ｔ細胞応答の率も低いので、がんワクチンの使用はＴＡＡに対するＴ細胞応答を増強するのに役立つかもしれない（Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１５；１２５：３４０１−３４１２）。がんワクチンは、単独療法（Ｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０；７０：８３３９−８３４６；Ｋａｎｔｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１０；３６３：４１１−４２２）として、チェックポイント封鎖と組み合わせて、（Ａｇａｒｗａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１２；３５：３８５−３８９）、または養子Ｔ細胞療法と組み合わせて（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；６４：６７８３−６７９０）使用される可能性がある
前臨床では、がんワクチン接種のためにプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いる戦略は、抗原パルス樹状細胞（ＤＣ）が腫瘍に対して防御免疫を生成し得ることを実証している（Ｃｅｌｌｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６；１８３： ２８３−２８７；Ｍａｙｏｒｄｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９５；１：１２９７−１３０２；７４８９４１２；Ｆｌａｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；２４：６０５−６１０）。様々なタイプのがんで行われた臨床研究（Ｎｅｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９８；４：３２８−３３２；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６；５６：２４７９−２４８３；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９６；２： ５２−５８；Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３：２４１１−２４１９；Ｍｏｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；５：１３３１−１３３８；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：８４２−８４７）は、単球由来ＤＣはヒトにおいて抗原特異的免疫を誘発することができるが、臨床応答は低いことを示唆している。例えば、最初のＦＤＡ承認のＤＣベースのがんワクチン（Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）は、ホルモン不応性前立腺がん患者において４ヶ月の生存期間延長を示した（Ｋａｎｔｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１０；３６３：４１１−４２２；Ｈｉｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ２００９；１１５：３６７０−３６７９）。このワクチンの臨床的利点が低い理由を説明する仮説の中で、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ ＤＣに抗原を負荷する手順は、ＭＨＣクラスＩとＩＩの両方を提示するのではなく、主にＭＨＣクラスＩＩ抗原提示をもたらしたからかもしれない。このように、低細胞傷害性Ｔ細胞活性は、この製品の弱い効力に関与している可能性がある。
ＴＡＡのＤＣへの送達のために開発された方法は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ組織適合性分子の両方での最適な抗原提示のためにＣｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅプラットフォームを利用する。既存の抗原負荷技術の制限に対処することにより、本明細書に記載の方法は、インビボでより強力な細胞傷害性及びヘルパーＴ細胞応答をもたらす。このプラットフォームは、膜を一時的に破壊し、標的物質の細胞質への輸送を可能にするために、狭窄部を通過する際に細胞を急速に変形させることができるマイクロ流体チップを含む。電界または外因性エンハンサーまたは担体物質の必要性を排除することによって、記載された方法は、細胞毒性及びオフターゲット効果の可能性を最小限にする。
ウイルス性またはネオ抗原を標的とすること
自己寛容を自己抗原に誘導することができるので、治療用ワクチン接種は、今やネオ（ｎｅｏ）（Ｇｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１５；１２５：３４１３−３４２１；Ｇｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１４；５１５：５７７−５８１；Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１４；５１５：５７２−５７６；Ｑｕａｋｋｅｌａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２；１１４：７７−１０６；Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２；７２：１０８１−１０９１）及びウイルス抗原（Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１５；１２５：３４０１−３４１２；Ｑｕａｋｋｅｌａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２；１１４：７７−１０６）を標的とすることが好ましい。
抗原を同定及び評価するために、これらの２つのがんタンパク質の全長を表し、そして前臨床モデル及び前前立腺がんの患者において応答を示した、ＨＰＶ１６（ＨＰＶ１６−ＳＬＰ）のがん遺伝子Ｅ６及びＥ７の９つの合成長期重複ペプチド（ＳＬＰ）のカクテルが、免疫応答を評価するために使用される。Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅプラットフォームを使用して、ＨＰＶ１６−ＳＬＰカクテルをＤＣに負荷することにより、ペプチドをＭＨＣクラスＩ及びＩＩ提示経路の両方に導き、これによりＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の抗原特異的な拡大を誘導する。このように、このアプローチは、ＨＬＡ特異的な短いペプチドの限界を克服し、より効果的な治療を可能にする多重エピトープ応答を促す。
ヒト及びマウスＤＣに対するＨＰＶ１６−ＳＬＰのＣｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ：ＨＰＶ１６−ＳＬＰカクテルをヒトＤＣ及びマウスＤＣに送達するために異なるＣｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ（細胞圧搾）条件を試験する。狭窄長さ、狭窄幅、狭窄の数及び狭窄部に向かう角度において変化を有するチップ設計が評価される。プロセスパラメータに関しては、細胞濃度、送達媒体、送達媒体中のペプチド濃度、処理温度、動作圧力及びチップを通過する回数を調査する。最適化プロセスのための実験的アプローチはまた、細胞へのペプチド送達の量を示すＨＰＶ１６−ＳＬＰペプチドカクテルの蛍光標識も含む。さらに、ペプチドの最適なプロセシング及び提示は、フローサイトメトリーによってＴＣＲ特異的四量体を有する提示ペプチドを検出することにより、クラスＩ及びＩＩとの関連において説明される。このアプローチは、交差提示のためのＨＬＡ特異的クラスＩ短ペプチドを有するＤＣの負荷と比較される。
この試験は、ＨＰＶ１６−ＳＬＰペプチド抗原または抗原の混合物、例えばウイルス抗原のカクテル（例えば、長いペプチドの効率的処理ための、及びＡＰＣ、例えば、樹状細胞による抗原の負荷のための条件を含む）でヒト及びネズミＤＣを効率的に負荷するチップ設計及び送達条件を特定する。
抗原特異的Ｔ細胞を拡大するためのＨＰＶ１６−ＳＬＰ圧搾ＤＣの効能のインビトロ及びインビボ評価
抗原特異的Ｔ細胞を拡大させる能力についていくつかの条件下でペプチドカクテルを負荷したＤＣの機能を試験する。例えば、抗原特異的Ｔ細胞は、ＨＰＶ１６−ＳＬＰ及びＣｐＧでマウスを免疫することによって誘導される。追加免疫の８日後、Ｔ細胞を免疫化マウスの脾臓から単離し、抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を引き起こす負荷細胞の能力を決定するために、ＨＰＶ１６−ＳＬＰ負荷ＤＣとの共培養に使用する。ヒト負荷ＤＣを試験するために、ＨＰＶ１６に反応性のヒトＴ細胞クローンを使用して、いくつかの条件下でＨＰＶ１６−ＳＬＰカクテルを負荷したヒトＤＣと共培養する。抗原特異的Ｔ細胞拡大及びサイトカイン産生を評価する。ヒト及び／またはマウス負荷ＤＣが機能的であり、抗原特異的Ｔ細胞を拡大することができるか否かを、インビトロで試験される。ＨＬＡ特異的クラスＩ短ペプチドを負荷したＤＣを対照として使用する。ＨＬＡ適合Ｔ細胞は応答物として使用される。
その後、インビボでＨＰＶ−１６に対して抗腫瘍応答を生じさせるＣｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ ＤＣベースのワクチンの有効性を試験するために、マウスにＨＰＶ１６−ＳＬＰ負荷ＤＣをワクチン接種し、ＴＣ１腫瘍（ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７を有するＣ５７ＢＬ／６マウスのレトロウイルスで形質導入された肺線維芽細胞、及びｃ−Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子）で攻撃した。攻撃したマウスの生存率が読取り値である。
これらの試験は、Ｃｅｌｌｓｑｕｅｅｚｅ技術で作製されたＤＣベースのワクチンが、インビボで防御的抗腫瘍Ｔ細胞応答及び／または抗ウイルス応答を誘発することを示す。
他の実施形態
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用したすべての米国特許及び公開または非公開の米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用したすべての公開外国特許及び特許出願は、全て参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用した他の公開文献、文書、原稿及び科学文献は、全て参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され説明されたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなしに、形態及び詳細において様々な変更を行うことができることは、当業者に理解されるであろう。

Claims (122)

  1. 化合物を免疫細胞の細胞質ゾルに優先的に送達する方法であって、前記免疫細胞を含む細胞懸濁液を、マイクロ流体デバイスに通すこと、及び前記懸濁液を前記化合物と接触させることを含み、前記デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、且つ前記免疫細胞に送達される化合物の量が非免疫細胞に送達される量より少なくとも１０％大きい、前記方法。
  2. 化合物を免疫細胞の細胞質ゾルに送達する方法であって、前記免疫細胞を含む細胞懸濁液を、マイクロ流体デバイスに通すこと、及び前記懸濁液を前記化合物と接触させることを含み、前記デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含む、前記方法。
  3. 前記免疫細胞の細胞質ゾルに送達する前に、同時に、または後に、前記懸濁液を化合物と接触させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記免疫細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、自然リンパ細胞、または樹状細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記化合物が疾患関連抗原を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記化合物が腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、自己抗原、または真菌抗原を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記腫瘍抗原が、肝臓がん抗原、肺がん抗原、膀胱がん抗原、乳がん抗原、結腸がん抗原、直腸がん抗原、子宮内膜がん抗原、腎がん抗原、白血病抗原、肺がん抗原、メラノーマ抗原、非ホジキンリンパ腫抗原、膵臓がん抗原、前立腺がん抗原、甲状腺がん抗原、卵巣がん抗原、または子宮がん抗原である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記腫瘍抗原が、腫瘍溶解物である、請求項６に記載の方法。
  9. 前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ抗原、エボラ抗原、ＨＰＶ抗原、またはＥＢＶ抗原である、請求項６に記載の方法。
  10. 前記化合物がキメラ抗原受容体を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記化合物がキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記化合物がＴ細胞機能を向上させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. Ｔ細胞機能を向上させる前記化合物が免疫チェックポイント経路阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記化合物が未知の病原体に感染した組織由来の細胞溶解物を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記化合物が腫瘍細胞溶解物を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記化合物が寛容因子を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記化合物がアジュバントを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記化合物が核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記核酸がｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記核酸がプラスミドである、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記核酸がトランスポゾンである、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記化合物がタンパク質またはペプチドを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記タンパク質がＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＥリコンビナーゼを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記タンパク質が転写因子を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記化合物がウイルスまたはウイルス様粒子である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記核酸がＭＨＣ複合体をコードする、請求項２０に記載の方法。
  28. 前記免疫細胞が、前記デバイスを通過することなく化合物と接触した免疫細胞に比べて、前記デバイスを通過した後には、少なくとも１０％、２５％、５０％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍またはそれ以上の前記化合物を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記免疫細胞が活性状態と比較して休止状態にある、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記休止状態が、前記免疫細胞上のＣＤ２５、ＫＬＲＧ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１及びＣＸＣＲ５のいずれか１種から選択される１種以上のマーカーの発現により特徴づけられる、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記１種以上のマーカーの発現が、前記化合物を前記免疫細胞に送達することにより調節することができる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記調節が１種以上のマーカーの減少した発現である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記調節が１種以上のマーカーの増加した発現である、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記調節が１種以上のマーカーの増加した発現及び１種以上のマーカーの減少した発現である、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記免疫細胞がナイーブ免疫細胞である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記ナイーブ免疫細胞が、活性化免疫細胞による発現レベルに比べて、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、及びＣＴＬＡ−４のいずれか１種から選択されるマーカーの発現のより低いレベルであり、且つＣＣＲ７のより高い発現であることにより特徴づけられる、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記免疫細胞が記憶細胞である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記細胞懸濁液が全血を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記細胞懸濁液が軟膜細胞を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記細胞懸濁液が混合細胞集団を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記細胞懸濁液が精製された細胞集団を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記細胞懸濁液が哺乳類細胞を含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記細胞懸濁液が、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、サル、またはラット細胞を含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記細胞懸濁液が非哺乳類細胞を含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記細胞懸濁液がニワトリ、カエル、昆虫または線虫細胞を含む、請求項１〜４２または４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記マイクロ流体デバイスが３０μｍの狭窄長及び４μｍの狭窄幅を含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 当該方法が０℃〜４５℃の間で行われる、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 非免疫細胞と比較して免疫細胞に化合物を優先的に送達する、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを含むデバイスであって、前記チャンネルが３０μｍの狭窄長及び４μｍの狭窄幅を含む、前記デバイス。
  49. 非免疫細胞と比較して免疫細胞に化合物を優先的に送達する、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを含むデバイスであって、前記チャンネルが３μｍの狭窄幅を含む、前記デバイス。
  50. 非免疫細胞と比較して免疫細胞に化合物を優先的に送達する、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを含むデバイスであって、前記チャンネルが４μｍの狭窄幅を含む、前記デバイス。
  51. 非免疫細胞と比較して免疫細胞に化合物を優先的に送達する、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを含むデバイスであって、前記チャンネルが５μｍの狭窄幅を含む、前記デバイス。
  52. 非免疫細胞と比較して免疫細胞に化合物を優先的に送達する、少なくとも１つのマイクロ流体チャンネルを含むデバイスであって、前記チャンネルが６μｍの狭窄幅を含む、前記デバイス。
  53. 前記デバイスがマイクロ流体チャンネルを介して流れを誘発するシリンジまたは圧力源を含む、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載のデバイス。
  54. 免疫細胞機能の操作方法であって、前記免疫細胞の細胞質を取り囲む膜を一時的に破壊し、前記細胞質ゾルに抗原を送達することにより化合物を細胞内送達することを含む前記方法。
  55. 前記抗原が、７、８、９、または１０個のアミノ酸より大きい長さを含み、前記免疫細胞が前記抗体を処理して、前記免疫細胞の表面上に前記抗原のクラスＩ組織適合性抗原制限処理された形態を表示する、請求項５４に記載の方法。
  56. 免疫細胞機能の操作方法であって、化合物の、免疫細胞を、狭窄部を含むマイクロ流体デバイスに通し、そして前記免疫細胞を前記化合物と接触させることによる、細胞内送達を含む、前記方法。
  57. 前記化合物が抗体を含み、そして前記免疫細胞が前記抗体を処理して、前記免疫細胞の表面に前記抗体を表示する、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記免疫細胞が、前記免疫細胞の表面上に前記抗原のクラスＩ組織適合性抗原制限処理された形態を表示する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記免疫細胞が、前記免疫細胞の表面上に前記抗原のクラスＩＩ組織適合性抗原制限処理された形態を表示する、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記化合物が分化因子を含む、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記膜が、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄に前記免疫細胞を通すことにより破壊される、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記抗体が、完全長未処理タンパク質を含む、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  63. さらに、前記免疫細胞をエフェクターＴ細胞と接触させること、及び細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を活性化することを含む、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  64. さらに、前記免疫細胞をエフェクターＴ細胞と接触させること、及びヘルパーＴ細胞免疫応答を活性化することを含む、請求項５４〜５７及び５９のいずれか１項に記載の方法。
  65. さらに、前記免疫細胞をエフェクターＴ細胞と接触させること、及び寛容原性Ｔ細胞免疫応答を活性化することを含む、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記免疫細胞がＢ細胞、樹状細胞またはマクロファージを含む、請求項５４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記免疫細胞がＴ細胞を含む、請求項５４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
  68. Ｔ細胞上に抗原提示表現型を付与する方法であって、Ｔ細胞の細胞質ゾルに、前記Ｔ細胞をマイクロ流体デバイスに通すことにより、未処理の抗原全体を送達することを含み、前記デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、そして前記Ｔ細胞が、前記マイクロ流体デバイスを通過した後に、前記免疫細胞の表面上に前記抗原のクラスＩ組織適合性抗原制限処理された形態を含む、前記方法。
  69. Ｔ細胞上に抗原提示表現型を付与する方法であって、Ｔ細胞の細胞質ゾルに、前記Ｔ細胞をマイクロ流体デバイスに通すことにより、未操作の抗原全体を送達することを含み、前記デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、そして前記Ｔ細胞が、前記マイクロ流体デバイスを通過した後に、前記免疫細胞の表面上に前記抗原のクラスＩＩ組織適合性抗原制限処理された形態を含む、前記方法。
  70. 前記抗体が腫瘍抗体またはウイルス抗体を含む、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. さらに、前記Ｔ細胞を第２のＴ細胞と接触させることを含み、前記第２のＴ細胞がクラスＩ組織適合抗原制限された細胞傷害性Ｔ細胞表現型を含む、請求項６８に記載の方法。
  72. さらに、前記Ｔ細胞を第２のＴ細胞と接触させることを含み、前記第２のＴ細胞がクラスＩＩ組織適合抗原制限されたヘルパーＴ細胞表現型を含む、請求項６９に記載の方法。
  73. 細胞圧搾抗原負荷Ｔ細胞の、前記抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化するための使用。
  74. 細胞圧搾抗原負荷Ｔ細胞の、前記抗原に特異的なヘルパーＴ細胞応答を活性化するための使用。
  75. 細胞圧搾抗原負荷Ｔ細胞の、前記抗原に特異的な寛容原性Ｔ細胞応答を誘導するための使用。
  76. 前記免疫細胞がさらに寛容原と接触する、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記寛容原は、胸腺間質性リンパ球新生因子、デキサメタゾン、ビタミンＤ、レチノイン酸、ラパマイシン、アスピリン、トランスフォーミング成長因子ベータ、インターロイキン−１０、または血管作動性腸管ペプチドである、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記免疫細胞がさらにアジュバントと接触する、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記免疫細胞が、マイクロ流体デバイスを通過した後、さらにアジュバントと接触する、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記アジュバントは、トール様受容体リガンドまたはアゴニスト、ＮＯＤ様受容体アゴニスト、ＲＩＧ−Ｉ様受容体アゴニスト、Ｃ型レクチン受容体アゴニスト、または水酸化アルミニウムを含む、請求項７８または７９に記載の方法。
  81. 前記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、Ｒ８４８、リポ多糖体（ＬＰＳ）、ｒｈＩＬ−２、抗ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１２、及び／または二環式ヌクレオチドを含む請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 免疫細胞にホーミング表現型を付与する方法であって、前記免疫細胞をマイクロ流体デバイスに通すことにより化合物をＴ細胞の細胞質ゾルに送達することを含み、前記デバイスが、２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、そして前記化合物が前記免疫細胞にホーミング表現型の発現を付与する、前記方法。
  83. 前記化合物が核酸を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記核酸がｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記核酸がプラスミドである、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記化合物がタンパク質またはペプチドを含む、請求項８２に記載の方法。
  87. 前記タンパク質がＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＥリコンビナーゼを含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記タンパク質が転写因子である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記化合物がキメラ抗原受容体を含む、請求項８２に記載の方法。
  90. 前記キメラ抗原受容体がキメラＴ細胞受容体である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記核酸がキメラ抗原受容体をコードする、請求項８３に記載の方法。
  92. 前記核酸が組み換えＴ細胞受容体をコードする、請求項８３に記載の方法。
  93. 免疫細胞に寛容原性表現型を付与する方法であって、前記免疫細胞をマイクロ流体デバイスに通すことによりＴ細胞の細胞質ゾルに化合物を送達することを含み、前記デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、そして前記化合物が、免疫細胞の寛容原性表現型を有する細胞への分化を誘導する、前記方法。
  94. 前記化合物が核酸を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記核酸がｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記核酸がプラスミドである、請求項９４に記載の方法。
  97. 前記化合物がタンパク質またはペプチドを含む、請求項９３に記載の方法。
  98. 前記タンパク質がＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＥリコンビナーゼを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記タンパク質が転写因子である、請求項９７に記載の方法。
  100. カミカゼ免疫細胞を生じさせる方法であって、前記免疫細胞をマイクロ流体デバイスに通すことによりＴ細胞の細胞質ゾルに自己増幅ＲＮＡを送達することを含み、前記デバイスが２μｍ〜１０μｍの直径の狭窄部を含み、そして前記自己増幅ＲＮＡが、コードされたタンパク質の連続産生をコードする、前記方法。
  101. 前記免疫細胞を、マイクロ流体デバイスに通す前に、同時に、または後に前記化合物と接触させることを含む、請求項８２〜１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記免疫細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、または樹状細胞を含む、請求項８２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記免疫細胞が、前記デバイスを通過することなく化合物と接触した免疫細胞に比べて、前記デバイスを通過した後には、少なくとも１０％、２５％、５０％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍またはそれ以上の前記化合物を含む、請求項８２〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記細胞懸濁液が全血を含む、請求項８２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記細胞懸濁液が軟膜細胞を含む、請求項８２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記細胞懸濁液が混合細胞集団を含む、請求項８２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記細胞懸濁液が精製された細胞集団を含む、請求項８２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記細胞懸濁液が哺乳類細胞を含む、請求項８２〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記細胞懸濁液が、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、サル、またはラット細胞を含む、請求項８２〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記細胞懸濁液が非哺乳類細胞を含む、請求項８２〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記細胞懸濁液がニワトリ、カエル、昆虫または線虫細胞を含む、請求項８２〜１０７及び１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記マイクロ流体デバイスが３０μｍの狭窄長及び４μｍの狭窄幅を含む、請求項８２〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
  113. 前記方法が０℃〜４５℃の間で行われる、請求項８２〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. 請求項１〜４３、４６〜１０９、１１２及び１１３のいずれか１項に記載の方法に従い修飾された免疫細胞を患者に導入することにより患者を治療する方法。
  115. 前記免疫細胞が免疫療法に使用される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記免疫細胞が免疫抑制療法に使用される、請求項１１４に記載の方法。
  117. さらに、患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、請求項１１４に記載の方法。
  118. 細胞を患者から単離し、請求項１〜４３、４６〜１０９、１１２及び１１３のいずれか１項に記載の方法に従い修飾し、そして前記患者に戻す、請求項１１４に記載の方法。
  119. 請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の方法に従い修飾された免疫細胞の、ワクチン開発のために抗原をスクリーニングするための使用。
  120. 患者内のＴ細胞輸送を決定する方法であって、請求項１または２に記載の方法に従いＴ細胞に標識を送達すること、及び前記標識Ｔ細胞を患者に投与することを含み、前記患者内へのＴ細胞輸送を、前記標識Ｔ細胞を検出することにより決定することができる、前記方法。
  121. 前記標識は、蛍光標識または放射性標識である、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記Ｔ細胞輸送は、腫瘍への輸送である、請求項１２０または１２１に記載の方法。
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