KR20210121106A - 무핵 세포-유래된 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포를 함유하는 세포 현탁액을 압박부를 통해 통과시킴으로써 생성되고, 여기서 압박부는 투입 무핵 세포를 변형시키고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 개체에게 전달되고, 항원은 면역원성 환경에 전달되고 그에서 프로세싱되어, 질환을 치료하고/거나, 질환을 예방하고/거나, 개체를 항원에 대해 백신접종한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 62/797,185, 2019년 1월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 62/797,187, 2019년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/933,301, 및 2019년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/933,302의 우선권을 주장하며, 이들의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 일반적으로 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 전달함으로써 면역 반응을 자극하는 방법 또는 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및/또는 아주반트로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시킴으로써 무핵 세포에 전달된다.
면역계 및 외래 물질에 대한 면역 반응의 복잡성은 생체내 항원-특이적 면역 반응을 촉발시키기 위한 효과적인 접근법의 개발을 어렵게 만든다. 항원-특이적 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 작용제, 예컨대 소분자 및 폴리펩티드- 및/또는 뉴클레오티드-기반 백신의 계속된 개발 외에도, 이러한 작용제와 함께 사용하기 위한 운반체 전략은 전달 및 면역 반응을 최적화하기 위한 추가의 개발을 필요로 한다. 중합체-기반 운반체, 입자 운반체, 리포솜, 및 세포-기반 소포, 예컨대 적혈구로부터 유래된 것들을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 운반체는 여전히 생체내 항원-특이적 면역 반응을 촉발시키기 위한 그들의 사용을 제한하는 어려움에 직면한다. 예를 들어, 적혈구가 불규칙한 형상이고 (양요형), 무핵이고, 전사적으로 불활성인 것을 고려하면, 운반체로서 적혈구의 사용은 항원성 물질을 회합하는 적혈구의 조작과 연관된 어려움으로 인해 곤란하다. 그 결과, 표준 형질감염 기법은 작동하지 않는다. 이들 어려움을 극복하기 위해, 면역 반응을 촉발시키기 위한 운반체로서 적혈구를 사용하는 방법은 성숙적혈구의 표면에 물질을 접합시키는 것에 초점을 맞추었다. 예를 들어, 문헌 [Lorentz et al., Sci. Adv, l:el5001122015]; [Grimm et al., Sci Rep, 5, 2015]; 및 [Kontos et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110, 2013]을 참조한다. 표면 접합을 사용한 초기 작업은 제1형 당뇨병의 모델 항원 및 마우스 모델로 유망한 결과를 나타내었지만, (a) 부착을 위한 화학적으로 변형된 항원에 대한 필요; (b) 로딩을 위한 제한된 표면적; 및 (c) 면역원성을 포함하여 일부 상당한 결점을 갖는다.
화합물을 세포에 전달하기 위해 미세유체 압박부를 사용하는 방법을 기재하고 있는 참고문헌은 WO2013059343, WO2015023982, WO2016070136, WO2016077761, 및 WO/2017/192785를 포함한다.
특허 출원 및 공보를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
발명의 간단한 요약
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원을 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 아주반트를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 항원을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원 및 아주반트를 전달하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여된다. 일부 측면에서, 본 발명은 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 소포외 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 소포외 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 질환-연관된 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 소포외 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 소포외 아주반트는 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 질환은 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 자가성이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 제약 제형 중에 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 전신으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 복강내로 투여된다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 치료제와 조합으로 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역 체크포인트 억제제 및/또는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IFN-α, IFN-γ, IL-2, IL-10, 또는 IL-15 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 및 BTLA 중 어느 하나에 표적화된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 이중특이적 작용제; 예를 들어, 시토카인 성분 및 표적화 성분을 포함하는 이중특이적 작용제이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 작용제는 표적화 성분 및 분자를 위한 트랩, 예컨대 TGFb를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 화학요법 또는 방사선 요법과 조합으로 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 제시를 개선시키는 (예를 들어, CD40 또는 Ox40L), T 세포 증식을 개선시키는, 및/또는 종양 미세환경을 개선시키는 (예를 들어, ICOS) 1종 이상의 작용제와 조합으로 개체에게 투여된다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD-1 제한된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포-유래된 소포에 전달된다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀(HILTONOL)®), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 지질다당류 (LPS)이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 저분자량 폴리 I:C이다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 망상적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 인간 세포이다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉된다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판-유래된 소포이다. 일부 실시양태에서, 적혈구-유래된 소포는 성숙적혈구-유래된 소포, 또는 망상적혈구-유래된 소포이다.
상기 무핵 세포-유래된 소포의 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD-1 제한된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포-유래된 소포에 전달된다.
상기 무핵 세포-유래된 소포의 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드 및/또는 LPS이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 저분자량 폴리 I:C이다.
상기 무핵 세포-유래된 소포의 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 망상적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 인간 세포이다.
상기 무핵 세포-유래된 소포의 일부 실시양태에서, 포유동물에의 투여 후의 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 포유동물에의 투여 후의 투입 무핵 세포의 반감기에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량은 투입 무핵 세포의 헤모글로빈 함량에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산은 투입 무핵 세포의 ATP 생산에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 구형 형태학을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구 고스트이다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일은 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%는 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 대식세포 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직 또는 세포는 간 또는 비장 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 그의 표면 상에 CD47을 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 유지된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 200 mOsm 내지 400 mOsm에서 유지된다.
상기 무핵 세포-유래된 소포의 일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉된다.
일부 측면에서, 본 발명은 복수의 본원에 기재된 바와 같은 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 항원을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법을 제공한다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판 유래된 소포이다. 일부 실시양태에서, 적혈구-유래된 소포는 성숙적혈구-유래된 소포 또는 망상적혈구-유래된 소포이다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD-1 제한된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포-유래된 소포에 전달된다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 저분자량 폴리 I:C이다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 망상적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 인간 세포이다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물에의 투여 후의 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 포유동물에의 투여 후의 투입 무핵 세포의 반감기에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량은 투입 무핵 세포의 헤모글로빈 함량에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산은 투입 무핵 세포의 ATP 생산에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 구형 형태학을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구 고스트이다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일은 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%는 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포는 수지상 세포 또는 대식세포 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직 또는 세포는 간 또는 비장 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 그의 표면 상에 CD47을 포함한다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 유지된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지된다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉된다.
본 개시내용은, 한 측면에서, 기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소됨, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적혈구 또는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 성숙적혈구 또는 망상적혈구이다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 모 무핵 세포에 비해 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 초과 감소된다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간 세포이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 1분, 약 2분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 10일, 약 25일, 약 50일, 약 75일, 약 100일, 약 120일 미만이다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에 비해 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99% 또는 약 100% 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에서의 헤모글로빈의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%이다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 형태학에 있어서 구형이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구 고스트 (RBC 고스트)이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99%, 약 100% 또는 약 100% 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 의해 생산된 ATP의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 미만에서 ATP를 생산한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 ATP를 생산하지 않는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포의 흡수에 비해 간 또는 비장에서 또는 포식 세포 또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 그의 표면 상에 CD47을 포함한다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 모 무핵 세포로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm에서 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 모 무핵 세포를 포함하는 현탁액을 세포 변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 무핵 세포의 섭동을 유발하고; 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 탑재물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 소분자, 복합체, 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 탑재물이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 탑재물과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 탑재물을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 아주반트를 포함하고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함하고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 면역관용성 인자가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 면역관용성 인자와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에, 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에, 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 탑재물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 이식편 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 항원은 바이러스, 바이러스 입자, 또는 바이러스 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 지질다당류 (LPS)이다.
본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 복수의 본원의 기재에 따른 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포의 집단으로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 적혈구 또는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 성숙적혈구 또는 망상적혈구이다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 순환 반감기는 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 순환 반감기는 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 초과 감소된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 인간 세포이고, 여기서 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 순환 반감기는 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 10일 미만이다.
일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 적혈구이고, 여기서 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99% 또는 약 100% 감소된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에서의 헤모글로빈의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%이다.
일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과는 형태학에 있어서 구형이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과는 모 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 여기서 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과는 적혈구 고스트이다.
일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포는 표면 포스파티딜세린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%는 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%는 복수의 모 무핵 세포를 포함하는 조성물에 비해 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99%, 약 100% 또는 약 100% 초과 더 높은 표면 포스파티딜세린 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%는 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 ATP 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%는 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 의해 생산된 ATP 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 미만에서 ATP를 생산한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포는 ATP를 생산하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 모 무핵 세포는 조성물의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않았다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 모 무핵 세포로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm에서 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 투입 모 무핵 세포를 포함하는 현탁액을 세포 변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 무핵 세포의 섭동을 유발하고; 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 탑재물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 치료 탑재물이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 소분자, 복합체, 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 탑재물이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 탑재물과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 탑재물을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 아주반트를 포함하고, 여기서 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함하고, 여기서 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 면역관용성 인자가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 면역관용성 인자와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부는 복수의 미세기둥 사이에, 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에, 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부 크기는 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 투입 모 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 제조하는데 사용되는 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 조성물의 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 이식편 용해물이다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 조성물의 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 복수의 항원을 포함하고, 여기서 복수의 항원은 무핵 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 조성물의 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다.
본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고, 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부는 복수의 미세기둥 사이에, 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에, 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부 크기는 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 투입 모 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 세포 현탁액은 탑재물이 세포에 진입하도록, 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 탑재물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법에 사용되는 탑재물은 치료 탑재물이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물 소분자, 복합체, 또는 나노입자이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 항원 및/또는 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 항원 및/또는 면역관용성 인자이다.
본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 무핵 세포-유래된 소포는 치료 탑재물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 여기서 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 개체는 자가면역 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 자가면역 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함한다.
본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은, 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 예방 방법에 사용되는 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이고, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다.
도 1a는 각각의 조건에 대한 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같은 항원-특이적 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 1b는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 항-CD28 단독 (SIINFEKL 없음)으로의 자극은 음성 대조군 (정사각형 점)으로서 사용되는 반면, PMA/이노마이신에 의한 비특이적 자극은 양성 대조군 (삼각형 점)으로서 사용된다. 도 1c는 각각의 조건에 대한 ICS에서의 각각의 세포의 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 측정된 바와 같은 각각의 세포에서의 IFN-γ의 양을 나타낸다. 도 1d는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 항-CD28 단독 (SIINFEKL 없음)으로의 자극은 음성 대조군 (정사각형 점)으로서 사용되는 반면, PMA/이노마이신에 의한 비특이적 자극은 양성 대조군 (삼각형 점)으로서 사용된다. 도 1e는 각각의 조건에 대한 ICS에서의 각각의 세포의 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 측정된 바와 같은 각각의 세포에서의 IL-2의 양을 나타낸다.
도 2a는 각각의 조건에 대한 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같은 항원-특이적 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2b는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2c는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2b 및 2c 둘 다에 대해, 항-CD28 단독 (SIINFEKL 없음)으로의 자극은 음성 대조군 (정사각형 점)으로서 사용되는 반면, PMA/이노마이신에 의한 비특이적 자극은 양성 대조군 (삼각형 점)으로서 사용된다.
도 3a는 각각의 조건에 대한 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같은 항원-특이적 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 3b는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 3c는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 3b 및 3c 둘 다에 대해, 항-CD28 단독 (SIINFEKL 없음)으로의 자극은 음성 대조군 (정사각형 점)으로서 사용되는 반면, PMA/이노마이신에 의한 비특이적 자극은 양성 대조군 (삼각형 점)으로서 사용된다.
도 4는 압박부 매개된 전달 (SQZ)에 의해 프로세싱된 적혈구 유래된 소포 대 비프로세싱된 투입 적혈구의 락테이트 수준을 나타낸다.
도 5a는 비처리된 RBC (Untrtd), D-FITC와 함께 인큐베이션된 RBC (No SQZ), 뿐만 아니라 SQZ를 사용하여 로딩된 D-FITC를 갖는 RBC-유래된 소포 (SQZ)에 대한, 명시야 현미경검사, 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet) 염색 (CT)에 대한 형광 현미경검사 뿐만 아니라 FITC 표지된 덱스트란 (D-FITC)에 대한 형광 현미경검사로부터의 화상을 나타낸다. 도 5b는 비처리된 RBC (Untrt), D-FITC와 함께 인큐베이션된 RBC (No SQZ), 뿐만 아니라 SQZ를 사용하여 로딩된 D-FITC를 갖는 RBC-유래된 소포 (SQZ)에 대한 포스파티딜세린 염색의 수준을 나타낸다.
도 6a는 SQZ-프로세싱에 의해 생성된 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 6b는 시간 경과에 따른 별개로 표지된 RBC 및 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 순환 수준을 나타낸다. 도 6c는 마우스 내로 주사된 RBC 및 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 혼합물의 유동 플롯에서의 전방 및 측방 산란을 나타낸다.
도 7a는 비처리된 RBC (NC), 및 각각 10psi 및 12 psi의 압력에서 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 원심분리 후의 세포 펠릿 및 상청액의 외관을 나타낸다. 도 7b는 비처리된 RBC (NC), 10psi 및 12 psi의 압력에서 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포, 및 물에 희석된 RBC (용해 대조군)에 대한 헤모큐(HemoCue)® 시스템에 의해 측정된 바와 같은 헤모글로빈의 소실 (용혈)을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 B9-23과 함께 인큐베이션된 RBC 및 B9-23으로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포 (SQZ)에서의, 각각 2가지 헤모글로빈 펩티드의 액체 크로마토그래피/질량 분광법에 의해 정량화된 바와 같은 헤모글로빈의 소실 (용혈)을 나타낸다.
도 9는 SQZ-프로세싱에서의 다양한 압박부 폭 및 운전 압력 하의 RBC-유래된 소포의 SQZ-매개된 유도에서의 고스트 형성의 백분율을 나타낸다.
도 10은 수용자 마우스에서의 비프로세싱된 뮤린 RBC 및 SQZ-프로세싱된 뮤린 RBC 소포의 생체내 존속을 나타낸다.
도 11a는 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 내재화에 관여하는 기관을 나타낸다. 도 11b는 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 내재화에 관여하는 간 및 비장 내의 세포 유형을 나타낸다.
도 12a는 OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 OVA-특이적 CD4+ T 세포 증식의 증식을 나타낸다. 도 12b는 OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 OVA-특이적 CD8+ T 세포 증식의 증식을 나타낸다.
도 13은 (i) 폴리 I:C 단독, (ii) OVA 단독, 또는 (iii) OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 투여된 마우스에 대한 생체외 SIINFEKL 재-자극 시의 내인성 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다.
도 14는 (i) 폴리 I:C 단독, (ii) E7 단독, 또는 (iii) E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 마우스에 대한 생체외 E7 재-자극 시의 내인성 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다.
도 15는 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 상이한 프라이밍 및 부스팅 투여 처방으로 처리된 마우스에 대한 E7-특이적 CD8+ T 세포의 정량화를 나타낸다.
도 16a 및 16b는 E7-양성 종양을 받는 뮤린 모델에서의 각각 종양 성장 및 생존에 대한 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 예방적 투여의 효과를 나타낸다.
도 17a 및 17b는 E7-양성 종양을 갖는 뮤린 모델에서의 각각 종양 성장 및 생존에 대한 상이한 투여량에서의 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 치료적 투여의 효과를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 E7-양성 종양을 갖는 뮤린 모델에서의 각각 종양 성장 및 생존에 대한 상이한 투여 처방으로의 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 치료적 투여의 효과를 나타낸다.
도 19a 내지 19d는 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 항원-특이적 면역 반응, 구체적으로 E7-양성 종양을 갖는 뮤린 모델이 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 투여된 경우, E7 양성 종양 내로의 CD8+ T 세포의 동원 (도 19a), E7에 특이적인 종양 내의 CD8+ T 세포의 백분율 (도 19b), 종양에서의 E7-특이적 CD8+ T 세포 대 조절성 T 세포의 비 (도 19c), 및 E7-특이적 CD8+ T 세포 대 종양 중량의 상관관계 (도 19d)를 나타낸다.
도 20a 내지 20c는 인간 RBC-유래된 소포가 E7-SLP (탑재물)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱에 의해 생성된 경우, 각각 고스트 형성, 탑재물 전달의 효율, 및 표면 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
도 21은 37℃에서의 및 0℃에서의 인간 단핵구-유래된 수지상 세포에 의한 인간 RBC-유래된 소포의 내재화를 나타낸다.
도 22는 CMV 항원, 및 외인성 아주반트로 로딩된 인간 RBC-유래된 소포와 공동-배양된 경우, CMV 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산 및 분비를 나타낸다.
도 23a 내지 23c는 뮤린 RBC-유래된 소포가 SQZ-프로세싱에 의해 생성된 경우, 각각 고스트 및 비-고스트 집단에서의 탑재물 전달의 효율, 고스트 형성, 및 표면 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
도 24a는 바이러스 캡시드에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 24b는 나이브 마우스, SNYNKSVNV와 함께 인큐베이션된 RBC로 처리된 마우스 (펩티드), 또는 SNYNKSVNV-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ)의 비장세포에서의 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 24c는 43일의 과정에 걸친 펩티드 군 및 SQZ 군에서의 마우스에 대한 혈청 중의 루시페라제 수준을 나타낸다.
도 25a는 항체에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 25b는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은, 제20일에 대조군 마우스, 유리 래트 IgG2b로 주사된 마우스, 및 래트 IgG2b로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 주사된 마우스 (SQZ)에 대한 혈청 중의 순환 래트 IgG2b의 수준을 나타낸다. 도 25c는 제76일에 대조군, 유리 래트 IgG2b, 및 SQZ 군에서의 마우스에 대한 혈청 중의 순환 래트 IgG2b의 수준을 나타낸다.
도 26a는 B9-23에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 26b는 대조군 마우스, HEL-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ HEL), 또는 Ins B9-23-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ FAM)의 비장세포에서의 AAV-NL 바이러스로의 재-자극 후의 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 또는 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 26c는 1040-p31에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도26d는 대조군 마우스 및 1040-31-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ)에서 측정된 혈청 혈당의 수준을 나타낸다. 도 26e는 혈청 혈당 측정으로부터 결정된 바와 같은 대조군 마우스 및 SQZ 마우스에 대한 질환 발병을 나타낸다.
도 2a는 각각의 조건에 대한 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같은 항원-특이적 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2b는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2c는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 2b 및 2c 둘 다에 대해, 항-CD28 단독 (SIINFEKL 없음)으로의 자극은 음성 대조군 (정사각형 점)으로서 사용되는 반면, PMA/이노마이신에 의한 비특이적 자극은 양성 대조군 (삼각형 점)으로서 사용된다.
도 3a는 각각의 조건에 대한 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같은 항원-특이적 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 3b는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 3c는 OVA 에피토프 SIINFEKL로의 재-자극 (원형 점) 후의 각각의 조건에 대한 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 3b 및 3c 둘 다에 대해, 항-CD28 단독 (SIINFEKL 없음)으로의 자극은 음성 대조군 (정사각형 점)으로서 사용되는 반면, PMA/이노마이신에 의한 비특이적 자극은 양성 대조군 (삼각형 점)으로서 사용된다.
도 4는 압박부 매개된 전달 (SQZ)에 의해 프로세싱된 적혈구 유래된 소포 대 비프로세싱된 투입 적혈구의 락테이트 수준을 나타낸다.
도 5a는 비처리된 RBC (Untrtd), D-FITC와 함께 인큐베이션된 RBC (No SQZ), 뿐만 아니라 SQZ를 사용하여 로딩된 D-FITC를 갖는 RBC-유래된 소포 (SQZ)에 대한, 명시야 현미경검사, 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet) 염색 (CT)에 대한 형광 현미경검사 뿐만 아니라 FITC 표지된 덱스트란 (D-FITC)에 대한 형광 현미경검사로부터의 화상을 나타낸다. 도 5b는 비처리된 RBC (Untrt), D-FITC와 함께 인큐베이션된 RBC (No SQZ), 뿐만 아니라 SQZ를 사용하여 로딩된 D-FITC를 갖는 RBC-유래된 소포 (SQZ)에 대한 포스파티딜세린 염색의 수준을 나타낸다.
도 6a는 SQZ-프로세싱에 의해 생성된 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 6b는 시간 경과에 따른 별개로 표지된 RBC 및 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 순환 수준을 나타낸다. 도 6c는 마우스 내로 주사된 RBC 및 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 혼합물의 유동 플롯에서의 전방 및 측방 산란을 나타낸다.
도 7a는 비처리된 RBC (NC), 및 각각 10psi 및 12 psi의 압력에서 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 원심분리 후의 세포 펠릿 및 상청액의 외관을 나타낸다. 도 7b는 비처리된 RBC (NC), 10psi 및 12 psi의 압력에서 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포, 및 물에 희석된 RBC (용해 대조군)에 대한 헤모큐(HemoCue)® 시스템에 의해 측정된 바와 같은 헤모글로빈의 소실 (용혈)을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 B9-23과 함께 인큐베이션된 RBC 및 B9-23으로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포 (SQZ)에서의, 각각 2가지 헤모글로빈 펩티드의 액체 크로마토그래피/질량 분광법에 의해 정량화된 바와 같은 헤모글로빈의 소실 (용혈)을 나타낸다.
도 9는 SQZ-프로세싱에서의 다양한 압박부 폭 및 운전 압력 하의 RBC-유래된 소포의 SQZ-매개된 유도에서의 고스트 형성의 백분율을 나타낸다.
도 10은 수용자 마우스에서의 비프로세싱된 뮤린 RBC 및 SQZ-프로세싱된 뮤린 RBC 소포의 생체내 존속을 나타낸다.
도 11a는 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 내재화에 관여하는 기관을 나타낸다. 도 11b는 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 내재화에 관여하는 간 및 비장 내의 세포 유형을 나타낸다.
도 12a는 OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 OVA-특이적 CD4+ T 세포 증식의 증식을 나타낸다. 도 12b는 OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 OVA-특이적 CD8+ T 세포 증식의 증식을 나타낸다.
도 13은 (i) 폴리 I:C 단독, (ii) OVA 단독, 또는 (iii) OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 투여된 마우스에 대한 생체외 SIINFEKL 재-자극 시의 내인성 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다.
도 14는 (i) 폴리 I:C 단독, (ii) E7 단독, 또는 (iii) E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 마우스에 대한 생체외 E7 재-자극 시의 내인성 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다.
도 15는 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 상이한 프라이밍 및 부스팅 투여 처방으로 처리된 마우스에 대한 E7-특이적 CD8+ T 세포의 정량화를 나타낸다.
도 16a 및 16b는 E7-양성 종양을 받는 뮤린 모델에서의 각각 종양 성장 및 생존에 대한 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 예방적 투여의 효과를 나타낸다.
도 17a 및 17b는 E7-양성 종양을 갖는 뮤린 모델에서의 각각 종양 성장 및 생존에 대한 상이한 투여량에서의 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 치료적 투여의 효과를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 E7-양성 종양을 갖는 뮤린 모델에서의 각각 종양 성장 및 생존에 대한 상이한 투여 처방으로의 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 치료적 투여의 효과를 나타낸다.
도 19a 내지 19d는 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에 의해 유도된 항원-특이적 면역 반응, 구체적으로 E7-양성 종양을 갖는 뮤린 모델이 E7 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 투여된 경우, E7 양성 종양 내로의 CD8+ T 세포의 동원 (도 19a), E7에 특이적인 종양 내의 CD8+ T 세포의 백분율 (도 19b), 종양에서의 E7-특이적 CD8+ T 세포 대 조절성 T 세포의 비 (도 19c), 및 E7-특이적 CD8+ T 세포 대 종양 중량의 상관관계 (도 19d)를 나타낸다.
도 20a 내지 20c는 인간 RBC-유래된 소포가 E7-SLP (탑재물)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱에 의해 생성된 경우, 각각 고스트 형성, 탑재물 전달의 효율, 및 표면 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
도 21은 37℃에서의 및 0℃에서의 인간 단핵구-유래된 수지상 세포에 의한 인간 RBC-유래된 소포의 내재화를 나타낸다.
도 22는 CMV 항원, 및 외인성 아주반트로 로딩된 인간 RBC-유래된 소포와 공동-배양된 경우, CMV 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산 및 분비를 나타낸다.
도 23a 내지 23c는 뮤린 RBC-유래된 소포가 SQZ-프로세싱에 의해 생성된 경우, 각각 고스트 및 비-고스트 집단에서의 탑재물 전달의 효율, 고스트 형성, 및 표면 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
도 24a는 바이러스 캡시드에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 24b는 나이브 마우스, SNYNKSVNV와 함께 인큐베이션된 RBC로 처리된 마우스 (펩티드), 또는 SNYNKSVNV-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ)의 비장세포에서의 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 24c는 43일의 과정에 걸친 펩티드 군 및 SQZ 군에서의 마우스에 대한 혈청 중의 루시페라제 수준을 나타낸다.
도 25a는 항체에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 25b는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은, 제20일에 대조군 마우스, 유리 래트 IgG2b로 주사된 마우스, 및 래트 IgG2b로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 주사된 마우스 (SQZ)에 대한 혈청 중의 순환 래트 IgG2b의 수준을 나타낸다. 도 25c는 제76일에 대조군, 유리 래트 IgG2b, 및 SQZ 군에서의 마우스에 대한 혈청 중의 순환 래트 IgG2b의 수준을 나타낸다.
도 26a는 B9-23에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 26b는 대조군 마우스, HEL-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ HEL), 또는 Ins B9-23-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ FAM)의 비장세포에서의 AAV-NL 바이러스로의 재-자극 후의 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 또는 IL-2 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 도 26c는 1040-p31에 대한 생체내 항원-의존적 내성이 SQZ-로딩된 항원을 갖는 무핵 세포-유래된 소포에 의해 유도되는지를 결정하는 실험의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도26d는 대조군 마우스 및 1040-31-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ)에서 측정된 혈청 혈당의 수준을 나타낸다. 도 26e는 혈청 혈당 측정으로부터 결정된 바와 같은 대조군 마우스 및 SQZ 마우스에 대한 질환 발병을 나타낸다.
상세한 설명
본 출원은 무핵 세포 및/또는 무핵 세포-유래된 소포가 항원, 아주반트, 또는 치료제 중 1종 이상으로 로딩되고/거나 그와 혼합된 것인 무핵 세포-유래된 소포 (예컨대 투입 무핵 세포로부터 제조된 것들)를 포함하여 무핵 세포, 및 그의 조성물을 제공한다. 본 출원은 또한 본원에 기재된 압박부-매개된 전달 (SQZ)을 통해 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법 및 그의 사용 방법을 제공한다. 본 출원은 본원에 기재된 압박부-매개된 전달 (SQZ)을 통해 생성된 무핵 세포-유래된 소포를 사용하여 개체에서 면역 반응을 자극하는 및 질환을 치료하고/거나 예방하는 방법을 추가로 제공한다.
본 출원의 개시내용은, 적어도 부분적으로, 투입 무핵 세포가 압박부-매개된 전달 (SQZ)에 의해 프로세싱되어 무핵 세포-유래된 소포를 생성할 수 있다는 발견에 기반한다. 본 출원의 개시내용은 또한, 적어도 부분적으로, 항원(들) 및/또는 아주반트(들)를 갖는 무핵 세포-유래된 소포 (무핵 세포-유래된 소포 내에 캡슐화되든 그렇지 않든)가 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 발견에 기반한다.
본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원 및/또는 아주반트를 전달하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 특정 측면은 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 섭동된 투입 무핵 세포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 또한 무핵 세포-유래된 소포에 전달된다. 다른 실시양태에서, 아주반트는 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포와 조합으로 개체에게 전신으로 투여된다.
특정 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 출원은 무핵 세포-유래된 소포가 탑재물, 예컨대 항원, 아주반트, 또는 면역관용성 인자 중 임의의 1종 이상으로 로딩된 것인 무핵 세포-유래된 소포 (예컨대 모 무핵 세포로부터 제조된 것들), 및 그의 조성물을 제공한다. 본 출원은 또한 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포의 조성물의 제조 방법 및 그의 사용 방법을 제공한다.
본 출원의 개시내용은 또한, 적어도 부분적으로, 탑재물, 예컨대 항원(들) 및/또는 아주반트(들)를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 발견에 기반한다. 본 출원의 개시내용은 또한, 적어도 부분적으로, 항원(들) 및/또는 아주반트(들)로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물의 보다 높은 용량이 보다 큰 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다는 발견에 기반한다. 더욱이, 본 출원의 개시내용은, 적어도 부분적으로, 생체내 항원-특이적 면역 반응이 조성물의 아주반트; 무핵 세포-유래된 소포에 캡슐화된 탑재물, 예컨대 항원의 양; 및/또는 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물의 투여에 사용되는 투여 전략에 기반하여 조정될 수 있다는 발견에 기반한다. 본 출원의 개시내용은 또한, 적어도 부분적으로, 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 하나 이상의 선택 특성을 갖는 조성물 내에서, 무핵 세포-유래된 소포, 예컨대 무핵 세포-유래된 소포의 집단을 생성하기 위해 활성적으로 조정될 수 있다는 발견에 기반한다. 그 안에 바람직한 양 및/또는 특성의 무핵 세포-유래된 소포를 갖는 무핵 세포-유래된 소포의 조성물의 생성은 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포로부터 제조되는 경우, 제조 파라미터 중 하나 이상을 조정함으로써 달성된다.
따라서, 일부 측면에서, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포가 본원에서 제공된다: (a) 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소됨, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 복수의 임의의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은, 아주반트와 혼합된 복수의 임의의 무핵 세포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고, 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 본원에 개시된 조성물을 제조하는 방법, 예를 들어, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 사용 방법은 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 사용 방법은 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법이다.
정의
본 명세서를 해석하는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 때마다, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함할 것이며, 그 역도 마찬가지이다. 하기 제시된 임의의 정의가 본원에 참고로 포함되는 임의의 문서와 상충하는 경우, 제시된 정의가 지배할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 달리 지시되지 않는 한, 복수 언급대상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "함유하는", 및 "포함하는(including)", 및 다른 유사한 형태, 및 그의 문법적 등가물은 의미에 있어서 등가인 것으로 의도되며, 이들 단어 중 어느 하나에 이어지는 항목 또는 항목들이 이러한 항목 또는 항목들의 완전한 열거인 것으로 의미되거나, 단지 열거된 항목 또는 항목들에 제한되는 것으로 의미되지 않는다는 점에서 개방 말단인 것으로 의도된다. 예를 들어, 성분 A, B, 및 C를 "포함하는" 물품은 성분 A, B, 및 C로 이루어질 (즉, 이를 단지 함유할) 수 있거나, 성분 A, B, 및 C 뿐만 아니라 하나 이상의 다른 성분을 함유할 수 있다. 따라서, "포함하다" 및 그의 유사한 형태, 및 그의 문법적 등가물은 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"의 실시양태의 개시내용을 포함하는 것으로 의도되고 이해된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 그 범위 및 그 언급된 범위에서의 임의의 다른 언급되거나 개재하는 값의 상한 및 하한 사이의 하한의 단위의 1/10까지 각각의 개재하는 값은 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계를 조건으로 본 개시내용 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계의 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외한 범위는 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 실시양태를 포함한다 (및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "무핵 세포"는 핵을 결여한 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 혈소판, 적혈구 (RBC), 예컨대 성숙적혈구 및 망상적혈구를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 망상적혈구는 전형적으로 인간 신체에서 적혈구의 약 1%를 포함하는 미숙한 (예를 들어, 아직 양요형이 아닌) 적혈구이다. 망상적혈구는 또한 무핵이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 무핵 세포 (예를 들어, RBC, 망상적혈구, 및/또는 혈소판)의 풍부화된 (예를 들어, 자연에서 발견될 것보다 총 세포 집단의 더 큰 백분율을 포함함), 정제된, 또는 단리된 (예를 들어, 그들의 천연 환경으로부터, 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로) 집단의 처리 및/또는 프로세싱에 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 RBC (예를 들어, 성숙적혈구 또는 망상적혈구), 혈소판 뿐만 아니라 다른 혈액 세포를 함유하는 전혈의 처리 및/또는 프로세싱에 사용된다. 이들 세포 유형의 정제 또는 풍부화는 공지된 방법, 예컨대 적모세포 및 성숙적혈구 전구체의 밀도 구배 시스템 (예를 들어, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)), 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자기 세포 분류, 또는 시험관내 분화를 사용하여 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "소포"는 지질 이중층에 의해 에워싸인 액체를 포함하는 구조를 지칭한다. 일부 예에서, 지질 이중층은 천연 존재 지질 조성물로부터 근원된다. 일부 예에서, 지질 이중층은 세포막으로부터 근원될 수 있다. 일부 예에서, 소포는 다양한 종류의 실체, 예컨대 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 예에서, 소포는 기원하는 실체로부터의 분자 (예컨대 세포내 단백질 또는 막 성분)를 보유할 수 있다. 예를 들어, 적혈구로부터 유래된 소포는 적혈구 및/또는 적혈구의 막 성분에 있었던 임의의 수의 세포내 단백질을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 소포는 바람직한 탑재물 외에도 세포내로 임의의 수의 분자를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "탑재물"은 무핵 세포-유래된 소포 (예를 들어, RBC-유래된 소포) 내로 전달되고 있는, 예컨대 그에 로딩되고 있는 물질을 지칭한다. "탑재물", "화물", "전달 물질", 및 "화합물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 단백질, 소분자, 핵산 (예를 들어, RNA 및/또는 DNA), 지질, 탄수화물, 거대분자, 비타민, 중합체, 형광 염료 및 형광단, 탄소 나노튜브, 양자 점, 나노입자, 및 스테로이드를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 단백질 또는 소분자 약물을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "기공"은 제한 없이, 물질 내의 구멍, 파열부, 공동, 구경, 파단부, 틈, 또는 천공부를 포함하여 개구를 지칭한다. 일부 예에서, (지시되는 경우) 상기 용어는 본 개시내용의 표면 내의 기공을 지칭한다. 다른 예에서, (지시되는 경우) 기공은 세포막 중의 기공을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "막"은 기공을 함유하는 선택적 장벽 또는 쉬트를 지칭한다. 상기 용어는 경계 또는 라이닝으로서 작용하는 유연한 쉬트-유사 구조를 포함한다. 일부 예에서, 상기 용어는 기공을 함유하는 표면 또는 필터를 지칭한다. 이 용어는 용어 "세포막"과는 별개이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "필터"는 기공을 통한 선택적 통과를 허용하는 다공성 물품을 지칭한다. 일부 예에서 상기 용어는 기공을 함유하는 표면 또는 막을 지칭한다.
그것이 핵산 서열, 예컨대 코딩 서열 및 제어 서열에 관한 것일 때 용어 "이종"은 특정한 세포와 통상적으로 함께 연결되지 않는, 및/또는 그와 통상적으로 연관되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 구축물 또는 벡터의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 연관되어 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 또는 그에 부착된 핵산의 절편이다. 예를 들어, 핵산 구축물의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과 연관되어 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구축물 (예를 들어, 천연 유전자와는 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포에 통상적으로 존재하지 않는 구축물로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적상 이종으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본원에 사용된 바와 같은 이종 DNA를 발생시키지 않는다.
그것이 아미노산 서열, 예컨대 펩티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 관한 것일 때 용어 "이종"은 특정한 세포와 통상적으로 함께 연결되지 않는, 및/또는 그와 통상적으로 연관되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 펩티드 서열의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 연관되어 발견되지 않는 또 다른 아미노산 분자 내의 또는 그에 부착된 아미노산의 절편이다. 예를 들어, 펩티드 구축물의 이종 영역은 자연에서 펩티드의 아미노산 서열과 연관되어 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹된 펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이종 펩티드 서열의 또 다른 예는 펩티드 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구축물 (예를 들어, 천연 유전자로부터 코딩된 것과는 상이한 아미노산을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포에 통상적으로 존재하지 않는 아미노산 구축물을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적상 이종으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본원에 사용된 바와 같은 이종 펩티드를 발생시키지 않는다.
세포와 관련하여 작용제, 예컨대 항원 또는 아주반트에 관하여 사용되는 경우 용어 "외인성"은 세포외 공간으로부터 (즉, 세포 외부로부터) 전달된 작용제를 지칭한다. 세포는 이미 존재하는 작용제를 가질 수 있거나 그렇지 않을 수 있으며, 외인성 작용제가 전달된 후에 작용제를 생산할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동종"은 동일한 유기체로부터 유래된 분자를 지칭한다. 일부 예에서 상기 용어는 주어진 유기체 내에서 통상적으로 발견되거나 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "치료하는"은 임상적 결과를 포함하여 유익하거나 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 바람직한 임상적 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 질환으로부터 발생하는 1종 이상의 증상을 경감시키는 것, 질환의 정도를 감소시키는 것, 질환을 안정화시키는 것 (예를 들어, 질환의 악화를 방지하거나 지연시키는 것), 질환의 확산 (예를 들어, 전이)을 방지하거나 지연시키는 것, 질환의 재발을 방지하거나 지연시키는 것, 질환의 진행을 지연시키거나 감속시키는 것, 질환 상태를 개선시키는 것, 질환의 완화 (부분적 또는 전체적)를 제공하는 것, 질환을 치료하는데 요구되는 1종 이상의 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 질환의 진행을 지연시키는 것, 삶의 질을 증가시키거나 개선시키는 것, 증체량을 증가시키는 것, 및/또는 생존을 연장시키는 것. 또한 "치료"에 의해 포함되는 것은 암의 병리학적 결과 (예컨대, 예를 들어, 종양 부피)의 감소이다. 본 발명의 방법은 치료의 이들 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조정하다"는 특정한 표적의 존재, 또는 활성을 변화시키거나, 변경시키거나, 다양화하거나, 다르게는 변형시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 조정하는 것은 면역 반응을 변화시키거나, 변경시키거나, 다양화하거나, 다르게는 변형시키는 것을 발생시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현을 조정하는 것은 핵산의 전사의 변화, mRNA 풍부도의 변화 (예를 들어, mRNA 전사를 증가시키는 것), mRNA의 분해의 상응하는 변화, mRNA 번역의 변화 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "억제하다"는 특정한 표적의 존재, 또는 활성을 차단하거나, 감소시키거나, 제거하거나, 다르게는 길항작용하는 작용을 지칭할 수 있다. 억제는 부분적 억제 또는 완전한 억제를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 억제하는 것은 면역 반응의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 발생시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현이 억제는 핵산의 전사의 감소, mRNA 풍부도의 감소 (예를 들어, mRNA 전사를 침묵시키는 것), mRNA의 분해, mRNA 번역의 억제, 유전자 편집 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질의 발현의 억제는 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 감소, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 감소, 단백질의 번역의 억제, 단백질의 안정성의 감소 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "저해하다"는 특정한 표적의 존재, 또는 활성을 감소시키거나(decreasing), 감소시키거나(reducing), 금지하거나, 제한하거나, 줄이거나, 다르게는 감소시키는(diminishing) 작용을 지칭할 수 있다. 저해는 부분적 저해 또는 완전한 저해를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 저해하는 것은 면역 반응을 감소시키거나, 감소시키거나, 금지하거나, 제한하거나, 줄이거나, 다르게는 감소시키는 것을 발생시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현의 저해는 핵산의 전사의 감소, mRNA 풍부도의 감소 (예를 들어, mRNA 전사를 침묵시키는 것), mRNA의 분해, mRNA 번역의 억제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질의 발현의 저해는 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 감소, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 감소, 단백질의 번역의 감소, 단백질의 안정성의 감소 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "향상시키다"는 특정한 표적의 존재, 또는 활성을 개선시키거나, 신장시키거나, 고조시키거나, 다르게는 증가시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 향상시키는 것은 면역 반응을 개선시키거나, 신장시키거나, 고조시키거나, 다르게는 증가시키는 것을 발생시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현을 향상시키는 것은 핵산의 전사의 증가, mRNA 풍부도의 증가 (예를 들어, mRNA 전사를 증가시키는 것), mRNA의 분해의 감소, mRNA 번역의 증가 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질의 발현을 향상시키는 것은 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 증가, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 증가, 단백질의 번역의 증가, 단백질의 안정성의 증가 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도하다"는 결과를 개시하거나, 촉진시키거나, 자극하거나, 확립하거나, 다르게는 생성하는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 유도하는 것은 바람직한 면역 반응을 개시하거나, 촉진시키거나, 자극하거나, 확립하거나, 다르게는 생성하는 것을 발생시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현을 유도하는 것은 핵산의 전사의 개시, mRNA 번역의 개시 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질의 발현을 유도하는 것은 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 증가, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 증가, 단백질의 번역의 증가, 단백질의 안정성의 증가 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하여 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트 기 (전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있는 바와 같음), 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복 단위, 예컨대 N-(2-아미노에틸)-글리신을 포함할 수 있다 (즉, 펩티드 핵산). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 합성 서브유닛, 예컨대 포스포르아미데이트의 중합체를 포함할 수 있으며, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트 (P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는 상보적 가닥을 합성하고, 가닥을 적절한 조건 하에서 어닐링함으로써, 또는 상보적 가닥을 적절한 프라이머로 DNA 폴리머라제를 사용하여 데 노보 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 얻어질 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용되며, 최소 길이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 폴리펩티드는 짧은 펩티드를 포함한다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 전장 단백질 및 그의 단편 둘 다는 상기 정의에 의해 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 바람직한 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가, 및 치환 (일반적으로 성질상 보존적)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 의도적일 수 있거나, 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이 우연적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아주반트"는 면역 반응을 조정하고/거나 발생시키는 물질을 지칭한다. 일반적으로, 아주반트는 항원 단독에 비해 항원에 대한 면역 반응의 향상을 실행하기 위해 항원과 함께 투여된다. 다양한 아주반트는 본원에 기재된다.
용어 "CpG 올리고데옥시뉴클레오티드" 및 "CpG ODN"은 포스페이트에 의해 분리된 시토신 및 구아닌의 디뉴클레오티드 (또한 본원에서 "CpG" 디뉴클레오티드, 또는 "CpG"로 지칭됨)를 함유하는 DNA 분자를 지칭한다. 본 개시내용의 CpG ODN은 적어도 1개의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유한다. 즉, CpG 디뉴클레오티드에서 시토신은 메틸화되지 않는다 (즉, 5-메틸시토신이 아니다). CpG ODN은 부분적 또는 완전한 포스포로티오에이트 (PS) 백본을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는" 또는 "약리학상 혼화성"은 생물학적으로 또는 다르게는 비바람직하지 않은 물질을 의미하며, 예를 들어, 물질은 임의의 유의한 비바람직한 생물학적 효과를 유발하거나, 그것이 함유되는 조성물의 다른 성분 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학적 및 제조 시험의 요구되는 표준을 충족시켰고/거나, 미국 식품의약청에 의해 제조된 불활성 성분 가이드 상에 포함된다.
본원에 기재된 구조적 및 기능적 특징 중 임의의 것에 대해, 이들 특징을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "미세유체 시스템"은 낮은 부피 (예를 들어, m\L, nL, pL, fL)의 유체가 작은 부피의 액체의 별개의 처리를 달성하도록 프로세싱되는 시스템을 지칭한다. 본원에 기재된 특정 실행은 다중화, 자동화, 및 고 처리량 스크리닝을 포함한다. 유체 (예를 들어, 완충액, 용액, 탑재물-함유 용액, 또는 세포 현탁액)는 이동되거나, 혼합되거나, 분리되거나, 다르게는 프로세싱될 수 있다. 본원에 기재된 특정 실시양태에서, 미세유체 시스템은 완충액에 현탁된 세포에 기계적 압박을 적용하여, 탑재물 또는 화합물이 세포의 시토졸에 진입하는 것을 허용하는 세포에서 섭동 (예를 들어, 구멍)을 유도하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "압박부"는 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분에 의해 한정된 미세유체 채널의 부분을 지칭할 수 있고, 여기서 중심점은 폭, 길이, 및 깊이에 의해 한정된다. 다른 예에서, 압박부는 기공을 지칭할 수 있거나, 기공의 부분일 수 있다. 기공은 표면 (예를 들어, 필터 및/또는 막) 상에 함유될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "압박부의 폭"은 중심점에서의 미세유체 채널의 폭을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 6μm 미만의 폭을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 압박부는 약 0.6 μm, 0.7 μm, 0.8 μm, 0.9 μm, 1.0 μm, 1.5 μm, 또는 2 μm 중 임의의 것 미만일 수 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm 미만의 폭을 갖는다. 본 발명의 특정 측면에서, 압박부는 약 0.5 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 압박부는 약 3 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 압박부는 약 2 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 추가의 측면에서, 압박부는 약 3.9 μm 이하의 폭을 갖는다. 추가의 측면에서, 압박부는 약 3.9 μm 이하의 폭을 갖는다. 추가의 측면에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 특정 실시양태에서, 압박부는 단일 세포가 한 번에 압박부를 통해 통과하도록 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 "압박부의 길이"는 중심점에서의 미세유체 채널의 길이를 지칭한다. 본 발명의 특정 측면에서, 압박부의 길이는 약 30 μm 이하이다. 일부 실시양태에서, 압박부의 길이는 약 10 μm 내지 약 30 μm이다. 특정 실시양태에서, 압박부의 길이는 약 10 μm 내지 약 20 μm이다. 예를 들어, 압박부의 길이는 약 10 μm 및 약 30 μm 사이의 모든 정수, 소수, 및 분수를 포함하여, 약 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 20 μm, 또는 25 μm 중 임의의 것일 수 있다. 압박부의 길이는 세포가 압박부 아래에 있는 시간의 길이를 증가시키도록 다양할 수 있다 (예를 들어, 보다 큰 길이는 주어진 유속에서 보다 긴 압박부 시간을 발생시킨다). 압박부의 길이는 세포가 압박부 아래에 있는 시간의 길이를 감소시키도록 다양할 수 있다 (예를 들어, 보다 짧은 길이는 주어진 유속에서 보다 짧은 압박부 시간을 발생시킨다).
본원에 사용된 바와 같은 "압박부의 깊이"는 중심점에서의 미세유체 채널의 깊이를 지칭한다. 압박부의 깊이는 압박부 폭의 조정과 유사하게, 보다 긴밀한 압박부를 제공하고, 그에 의해 전달을 향상시키도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압박부의 깊이는 약 1 μm 및 약 1 mm 사이의 모든 정수, 소수, 및 분수를 포함하여, 약 1 μm 내지 약 1 mm이다. 일부 실시양태에서, 깊이는 약 20 μm이다. 일부 실시양태에서 깊이는 채널 전반에 걸쳐 균일하다. 특정 실시양태에서, 깊이는 압박부의 지점에서 감소되어 세포의 보다 큰 압박을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 깊이는 압박부의 지점에서 증가되어 세포의 보다 적은 압박을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 압박부의 깊이는 압박부의 폭보다 크다. 특정 실시양태에서, 압박부의 깊이는 압박부의 폭보다 작다. 일부 실시양태에서, 압박부의 깊이 및 압박부의 폭은 동등하다.
일부 실시양태에서, 미세유체 장치의 치수는 압박부의 길이, 압박부의 폭, 및 직렬로 압박부의 수에 의해 나타내어진다. 예를 들어, 30 μm의 압박부 길이, 5 μm의 폭, 및 직렬로 5개의 압박부를 갖는 미세유체 장치는 본원에서 30 x 5 x 5 (압박부의 L x W x #)로 나타내어진다.
일부 실시양태에서, 미세유체 시스템은 적어도 1개의 압박부를 포함하는 적어도 1개의 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 시스템은 각각 적어도 1개의 압박부를 포함하는 다수의 미세유체 채널을 포함한다. 예를 들어, 미세유체 시스템은 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 500, 500, 1000, 10000 내지 20,000 등의 모든 정수를 포함하여, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 20,000개 또는 그 초과의 미세유체 채널을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 각각 1개의 압박부를 포함하는 다수의 미세유체 채널은 병렬로 배열된다. 특정 측면에서, 각각 1개의 압박부를 포함하는 다수의 미세유체 채널은 직렬로 선형으로 배열된다. 본 발명의 특정 측면에서, 미세유체 시스템은 다수의 압박부를 포함하는 1개의 미세유체 채널을 포함한다. 예를 들어, 1개의 미세유체 채널은 2, 3, 4, 5, 10, 20개, 또는 그 초과의 압박부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 시스템은 다수의 압박부를 포함하는 다수의 미세유체 채널을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 다수의 압박부를 포함하는 다수의 미세유체 채널은 병렬로 배열된다. 본 발명의 일부 측면에서, 다수의 압박부를 포함하는 다수의 미세유체 채널은 직렬로 선형으로 배열된다.
입구 부분은 채널의 직경이 얼마나 빠르게 압박부의 중심점을 향해 감소하는지를 증가시키거나 감소시키도록 다양할 수 있는 "압박부 각도"를 포함할 수 있다. 압박부 각도는 세포가 그를 통해 통과하고 있는 동안 미세유체 시스템의 클로깅을 최소화하도록 다양할 수 있다. 예를 들어, 압박부 각도는 1 내지 140 도일 수 있다. 특정 실시양태에서, 압박부 각도는 1 내지 90 도일 수 있다. 출구 부분은 또한 비-층류를 발생시킬 수 있는 와류/소용돌이의 가능성을 감소시키는 각도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 출구 부분의 각도는 1 내지 140 도일 수 있다. 특정 실시양태에서, 출구 부분의 각도는 1 내지 90 도일 수 있다.
미세유체 채널, 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분의 횡단면은 다양할 수 있다. 다양한 횡단면의 비-제한적 예는 원형, 타원형, 길쭉한 슬릿, 정사각형, 육각형, 또는 삼각형 횡단면을 포함한다.
무핵 세포 (예를 들어, RBC)가 본원에 기재된 미세유체 채널을 통해 통과하는 속도는 또한 세포에의 전달 물질의 전달을 제어하도록 다양화될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널을 통한 세포의 속도를 조정하는 것은 변형력이 세포에 인가되는 시간의 양을 다양하게 수 있으며, 변형력이 얼마나 급속하게 세포에 인가되는지를 다양하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널을 통한 세포의 속도를 조정하는 것은 압력이 세포에 인가되는 시간의 양을 다양하게 할 수 있으며, 압력이 얼마나 급속하게 세포에 인가되는지를 다양하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 적어도 0.1 mm/s의 속도로 미세유체 시스템을 통해 통과할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 세포는 그 안의 모든 정수 및 소수를 포함하여, 0.1 mm/s 내지 5 m/s의 속도로 미세유체 시스템을 통해 통과할 수 있다. 다른 추가의 실시양태에서, 세포는 그 안의 모든 정수 및 소수를 포함하여, 10 mm/s 내지 500 mm/s의 속도로 미세유체 시스템을 통해 통과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 5 m/s 초과의 속도로 시스템을 통해 통과할 수 있다.
세포는 압력의 인가에 의해 압박부를 통해 이동된다 (예를 들어, 밀려난다). 일부 실시양태에서, 상기 압력은 세포 운전기에 의해 인가된다. 본원에 사용된 바와 같은 세포 운전기는 압박부를 통해 세포를 운전하기 위해 완충액 또는 용액에 압력 또는 힘을 인가하는 장치 또는 성분이다. 일부 실시양태에서, 압력은 유입구에서 세포 운전기에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진공 압력은 유출구에서 세포 운전기에 의해 인가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 운전기는 약 10 내지 약 150 psi, 예컨대 약 10 내지 약 90 psi의 압력을 공급하도록 적응된다. 추가의 실시양태에서, 세포 운전기는 120 psi의 압력을 인가하도록 적응된다. 특정 실시양태에서, 세포 운전기는 압력 펌프, 가스 실린더, 컴프레서, 진공 펌프, 시린지 펌프, 연동 펌프, 피펫, 피스톤, 모세관 작용기, 인간 심장, 인간 근육, 중력, 미세유체 펌프, 및 시린지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 세포 운전기에 의해 인가된 압력에 대한 변형은 또한 세포가 미세유체 채널을 통해 통과하는 속도에 영향을 미친다 (예를 들어, 압력의 양의 증가는 증가된 세포 속도를 발생시킬 것이다). 세포 (예를 들어, 무핵 세포)가 압박부를 통해 통과하는 경우, 그의 막은 섭동되어 막에서 일시적 붕괴를 유발하고, 주위의 매질에 존재하는 탑재물의 흡수를 발생시킨다. 본원에 사용된 바와 같은 이들 일시적 붕괴는 "섭동"으로 지칭된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 섭동은 물질이 세포의 외부로부터 세포 내로 이동하는 것을 허용하는 세포에서의 돌파구이다. 섭동의 비-제한적 예는 구멍, 파열부, 공동, 구경, 기공, 파단부, 틈, 또는 천공부를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 섭동 (예를 들어, 기공 또는 구멍)은 다량체성 기공 구조, 예컨대 상보체 또는 박테리아 용혈에 의해 생성된 것을 형성하는 단백질 서브유닛의 어셈블리의 결과로서 형성되지 않는다.
개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법
무핵 세포-유래된 소포 내로 항원을 전달하는 방법
특정 측면에서, 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원을 전달하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 아주반트를 전달하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 항원을 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원 및 아주반트를 전달하는 방법이 제공된다.
면역 반응을 자극하는 방법
특정 측면에서, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 세포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 소포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법은 항원에 대한 기존의 면역 반응을 향상시킨다.
특정 측면에서, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 세포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 소포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 개체에서 항원에 대한 기존의 면역 반응을 자극하는 방법은 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다.
개체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법
특정 측면에서, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 세포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 소포외 아주반트이다.
다른 측면에서, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 세포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 소포외 아주반트이다.
다른 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 질환-연관된 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 방법은 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 세포외 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 전신 아주반트는 소포외 아주반트이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 질환은 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암, 자궁경부암, 자궁암, 직장암, 음경암, 난소암, 고환암, 골암, 연조직암, 피부암 (흑색종), 위암, 장암, 결장암, 전립선암, 유방암, 식도암, 간암, 폐암, 췌장암, 뇌암, 또는 혈액암 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환은 HPV, EBV, HIV, HBV, RSV, 또는 KSHV 중 1종 이상과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환-연관된 항원은 HPV 항원 또는 HPV-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 HPV-16 또는 HPV-18 항원이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 HPV E6 항원 또는 HPV E7 항원이다. 일부 실시양태에서, HPV-연관된 질환은 HPV-연관된 암이다. 일부 실시양태에서, HPV-연관된 암은 자궁경부암, 항문암, 구인두암, 질암, 음문암, 음경암, 피부암 또는 두경부암이다. 일부 실시양태에서, HPV-연관된 질환은 HPV-연관된 감염성 질환이다. 일부 실시양태에서, HPV-연관된 질환은 보통 사마귀, 발바닥 사마귀, 편평 사마귀, 항문성기 사마귀, 항문 병변, 표피형성이상, 초점성 상피 과형성, 구강 유두종, 사마귀성 낭종, 후두 유두종증, 편평 상피내 병변 (SIL), 자궁경부 상피내 신생물 (CIN), 음문 상피내 신생물 (VIN) 및 질 상피내 신생물 (VAIN)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 질환-연관된 항원은 EBV 항원 또는 EBV-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, EBV 항원 또는 EBV-연관된 항원은 EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LP, LMP-1, LMP-2A, LMP-2B 또는 EBER 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 연관된 질환은 EBV-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, EBV-연관된 질환은 다발성 경화증 (MS)이다. 일부 실시양태에서, 질환-연관된 항원은 인간 CMV (HCMV) 항원 또는 HCMV-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 균주 메를린(Merlin), 톨레도(Toledo), 다비스(Davis), Esp, Kerr, 스미스(Smith), TB40E, TB40F, AD169 또는 토운(Towne) HCMV 중 임의의 것으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HCMV 항원 또는 HCMV-연관된 항원은 pUL48, pUL47, pUL32, pUL82, pUL83, 및 pUL99, pUL69, pUL25, pUL56, pUL94, pUL97, pUL144 또는 pUL128 중 1종 이상으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 연관된 질환은 HCMV-연관된 질환이다. 다른 실시양태에서, 질환-연관된 항원은 HIV 항원 또는 HIV-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 HIV-연관된 질환이다. 기회 감염은 HIV를 갖는 사람을 포함하여 약화된 면역계를 갖는 개체에서 보다 빈번히 발생하고 보다 중증인 감염이다. 일부 실시양태에서, HIV-연관된 질환은 기회 감염이며, 이는 기관지, 기관, 식도, 또는 폐의 칸디다증; 침습성 자궁경부암; 콕시디오이데스진균증; 크립토코쿠스증; 만성 장 크립토스포리디움증, 시토메갈로바이러스 질환; HIV-관련된 뇌병증; HSV-관련된 만성 궤양 또는 기관지염, 폐렴, 또는 식도염; 히스토플라스마증; 만성 장 이소스포라증; 카포시 육종; 림프종; 결핵; 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 복합체 (MAC); 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii) 폐렴 (PCP); 재발성 폐렴; 진행성 다초점성 백질뇌병증; 재발성 살모넬라(Salmonella) 패혈증; 뇌의 톡소플라스마증; 및 HIV에 기인한 소모 증후군을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 도입함으로써 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 자가성 세포이다. 예를 들어, 투입 무핵 세포는 개체 (예를 들어, 환자)로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 동일한 개체 내로 다시 도입된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 자가성이다. 다른 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 동종이계 세포이다. 예를 들어, 무핵 세포는 상이한 개체 (예를 들어, 공여자)로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 다수의 개체로부터의 투입 무핵 세포의 풀은 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 무핵 세포-유래된 소포의 풀은 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 개체로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 무핵 세포-유래된 소포는 상이한 개체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포의 집단은 개체 (환자) 또는 상이한 개체로부터 단리되고, 압박부를 통해 통과되어 항원 및/또는 아주반트의 전달을 달성하고, 그 후 무핵 세포-유래된 소포의 집단은 치료적 반응을 증강시키기 위해 환자 내로 재-주입된다.
일부 측면에서, 본 발명은 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 도입함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 이러한 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 도입하는 다수의 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 초과 중 임의의 것의) 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 초과 개체에게 투여함으로써 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포의 임의의 2회의 연속적 투여 사이의 시간의 지속기간은 적어도 약 1일 (예컨대 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함하여, 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 그 초과 중 임의의 것)이다.
일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 개체로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 동일한 개체 (예를 들어 환자) 내로 다시 도입된다. 예를 들어, 투입 무핵 세포의 집단은 개체로부터 단리되고, 압박부를 통해 통과되어 항원 및/또는 아주반트의 전달을 달성하고, 생성된 무핵 세포 유래된 소포는 그 후 치료 면역 반응을 증강시키기 위해 개체 내로 재-주입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 개체로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포 유래된 소포는 개체 내로 다시 도입된다. 예를 들어, 투입 무핵 세포의 집단은 개체로부터 단리되고, 압박부를 통해 통과되어 항원 및/또는 아주반트의 전달을 달성하고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 그 후 개체에서 면역 반응을 자극하고/거나 향상시키기 위해 개체 내로 재-주입된다.
일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 보편적인 혈액 공여자 (예를 들어 O- 혈액 공여자)로부터 단리되고, 그 후 나중의 압박부-매개된 전달을 위해 저장되고/거나 동결된다. 일부 실시양태에서, 항원은 개체로부터 단리되고, 보편적인 공여자로부터 단리된 투입 무핵 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 혈액 공여자로부터 단리되고, 그 후 나중의 압박부 매개된 전달 (SQZ)을 위해 저장되고/거나 동결된다. 일부 실시양태에서, 항원은 개체로부터 단리되고, 혈액 공여자로부터 단리된 투입 무핵 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 상기 기재된 압박부-매개된 전달에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 개체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 저장되고/거나 동결된다 (예를 들어, 나중의 치료를 위해). 일부 실시양태에서, 개체는 혈액 공여자에 대해 매칭된 혈액 유형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 상기 기재된 압박부-매개된 전달에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 개체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 개체는 혈액 공여자에 대해 매칭된 혈액 유형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 혈액 공여자에 대해 미스매칭된 혈액 유형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 도입함으로써 개체에서 질환을 예방하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 자가성 세포이다. 예를 들어, 투입 무핵 세포는 개체 (예를 들어, 환자)로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 동일한 개체 내로 다시 도입된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 자가성이다. 다른 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 동종이계 세포이다. 예를 들어, 무핵 세포는 상이한 개체 (예를 들어, 공여자)로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 다수의 개체로부터의 투입 무핵 세포의 풀은 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 무핵 세포-유래된 소포의 풀은 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 개체로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 무핵 세포-유래된 소포는 상이한 개체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포의 집단은 개체 (환자) 또는 상이한 개체로부터 단리되고, 압박부를 통해 통과되어 항원 및/또는 아주반트의 전달을 달성하고, 그 후 무핵 세포-유래된 소포의 집단은 예방적 반응을 증강시키기 위해 환자 내로 재-주입된다.
일부 실시양태에서, 예방 방법은 본원에 기재된 바와 같은 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 다수의 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 초과 중 임의의 것의) 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 초과 투여함으로써 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포의 임의의 2회의 연속적 투여 사이의 시간의 지속기간은 적어도 약 1일 (예컨대 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함하여, 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 그 초과 중 임의의 것)이다.
일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 도입함으로써 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 자가성 세포이다. 예를 들어, 투입 무핵 세포는 개체 (예를 들어, 환자)로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 동일한 개체 내로 다시 도입된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 자가성이다. 다른 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 동종이계 세포이다. 예를 들어, 무핵 세포는 상이한 개체 (예를 들어, 공여자)로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 생성된 무핵 세포-유래된 소포는 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 다수의 개체로부터의 투입 무핵 세포의 풀은 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 무핵 세포-유래된 소포의 풀은 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 개체로부터 단리되고, 개시된 방법에 따라 프로세싱되고, 무핵 세포-유래된 소포는 상이한 개체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포의 집단은 개체 (환자) 또는 상이한 개체로부터 단리되고, 압박부를 통해 통과되어 항원 및/또는 아주반트의 전달을 달성하고, 그 후 무핵 세포-유래된 소포의 집단은 예방적 반응을 유도하기 위해 환자 내로 재-주입된다.
일부 실시양태에서, 백신접종은 본원에 기재된 바와 같은 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 다수의 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 초과 중 임의의 것의) 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시켜 무핵 세포-유래된 소포를 형성함으로써 생성된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 초과 투여함으로써 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포의 임의의 2회의 연속적 투여 사이의 시간의 지속기간은 적어도 약 1일 (예컨대 이들 값 사이의 임의의 범위를 포함하여, 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 그 초과 중 임의의 것)이다.
상기 기재된 방법 중 임의의 것은 시험관내에서, 생체외에서, 또는 생체내에서 수행된다. 생체내 적용을 위해, 장치는 혈관 내강, 예를 들어, 동맥 또는 정맥 중의 인-라인 스텐트에서 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자 세포의 생체외 처리 및 환자 내로의 세포의 즉각적인 재도입을 위해 침대곁 시스템의 일부로서 사용된다. 이러한 방법은 개체에서 면역 반응을 향상시키고/거나 자극하는 수단으로서 채용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 최소로 훈련된 기술자로 전형적인 병원 실험실에서 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자 작동 치료 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 인-라인 혈액 처리 시스템을 사용하여 실행되고, 여기서 혈액은 환자로부터 직접적으로 전환되고, 압박부를 통해 통과되고, 혈액 중의 무핵 세포로부터 유래된 소포의 형성 및 혈액 중의 무핵 세포-유래된 소포에의 항원 및/또는 아주반트의 전달을 발생시키고, 처리 후에 환자 내로 다시 직접적으로 수혈된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 제약 제형 중에 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 전신으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 복강내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 치료제와 조합으로 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료제는 면역 체크포인트 억제제, 및/또는 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 IFN-α, IFN-γ, IL-2 (그의 천연 또는 변형된 형태 중 임의의 것), IL-10, 또는 IL-15 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역요법의 1종 이상의 형태이다. 면역요법은 모노클로날 항체, 면역 체크포인트 억제제, 시토카인, 암을 치료하는 백신, 및 입양 세포 전달을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 면역요법의 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1종 이상의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 및 BTLA 중 어느 하나에 표적화된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 이중특이적 작용제; 예를 들어, 시토카인 성분 및 표적화 성분을 포함하는 이중특이적 작용제이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 화학요법 또는 방사선 요법과 조합으로 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 제시를 개선시키고/거나, T 세포 증식을 개선시키고/거나, 종양 미세환경을 개선시키는 1종 이상의 작용제와 조합으로 개체에게 투여된다.
무핵 세포
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 무핵 세포는 핵을 결여한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 비-포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 닭, 개구리, 곤충, 어류, 또는 선충 세포이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포는 적혈구이다. 적혈구 (RBC)는 산소-운반체 생체분자 헤모글로빈이 풍부한 세포질을 갖는 유연성 및 계란형 양요형 원반이다. RBC는 인간 신체 전반에 걸쳐 산소 전달 및 이산화탄소 제거를 위한 주요 수단으로서 기능한다. RBC는 최대 120일 동안 순환에서 머무를 수 있으며, 그 후 이들은 간 및 비장에서의 청소를 통해 신체로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 RBC에 대한 전구체이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 망상적혈구이다. 망상적혈구는 무핵의 미숙한 (아직 양요형이 아닌) 적혈구이며, 전형적으로 인간 신체에서 적혈구의 약 1%를 포함한다. 성숙한 적혈구는 또한 성숙적혈구로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 혈소판이다. 혈소판(thrombocyte)으로도 지칭되는 혈소판은 그의 기능이 혈액 응고를 포함하는 혈액의 성분이다. 혈소판은 2 내지 3 μm의 직경의 양볼록형 원반모양 (렌즈-형상) 구조이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키고/거나, 항원에 대한 면역 반응을 자극한다. 간 및 비장의 면역원성 환경에서 청소될 수 있는 세포자멸사체, 예컨대 무핵 세포-유래된 소포로부터 유래된 항원은 T 세포의 활성화를 통해 항원에 대한 면역 반응을 자극하고/거나 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원-특이적이다. 무핵 세포-유래된 소포, 예컨대 적혈구-유래된 소포는 제한된 수명을 가지며, 자기-복구가 불가능하여, 세포자멸사와 유사한 프로세스인 적혈구포식작용을 유발하고, 이는 혈류로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 후속 제거를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경 내에서 무핵 세포-유래된 소포의 적혈구포식작용 시 방출될 수 있으며, 여기서 이는 이어서 항원-제시 세포에 의해 탐식되고, 프로세싱되고, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 항원-제시 세포에 의해 포식작용되고, 항원은 이어서 항원-제시 세포에 의해 프로세싱되고, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 거주자 대식세포에 의해 포식작용되고, 항원은 이어서 거주자 대식세포에 의해 프로세싱되고, 제시된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에 함유된 항원은 이어서 제시된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원-특이적이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 면역원성 환경을 생성하거나 촉진시키고, 여기서 상기 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, 면역 자극은 복수의 항원에 대한 면역 반응의 자극을 포함하여 다중-특이적이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 압박부를 통해 통과시키고, 여기서 상기 압박부가 투입 무핵 세포를 변형시키고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하도록 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 면역원성 환경을 생성하거나 촉진시키고, 여기서 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 면역 자극은 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극은 복수의 항원에 대한 면역 반응의 자극을 포함하여 다중-특이적이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 특정 실시양태에서, 방법은 제1 투입 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 압박부를 통해 통과시키고, 여기서 상기 압박부가 세포를 변형시키고, 그에 의해 항원이 제1 투입 무핵 세포를 섭동시키는 것으로부터 유래된 소포에 진입하도록 제1 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하고, 제2 투입 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 압박부를 통해 통과시키고, 여기서 상기 압박부가 제2 투입 무핵 세포를 변형시키고, 그에 의해 아주반트가 제2 투입 무핵 세포를 섭동시키는 것으로부터 유래된 소포에 진입하도록 제2 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하고, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포 및 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포를 개체 내로 도입하고, 그에 의해 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 항원을 포함하고, 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 면역원성 환경을 생성하거나 촉진시키고, 여기서 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포 및 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 세포는 동시에 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포 및 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 세포는 순차적으로 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포의 도입 전에 개체에게 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포의 도입 전 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 중 임의의 것 초과에 개체에게 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포의 도입 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 중 임의의 것 초과에 개체에게 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포의 도입 전에 개체에게 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포의 도입 전 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 중 임의의 것 초과에 개체에게 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포는 제1 투입 무핵 세포로부터 유래된 소포의 도입 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 중 임의의 것 초과에 개체에게 도입된다. 일부 실시양태에서, 면역 자극은 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극은 복수의 항원에 대한 면역 반응의 자극을 포함하여 다중-특이적이다.
일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 증가된 T 세포 반응을 포함한다. 예를 들어, 증가된 T 세포 반응은 제한 없이, 증가된 T 세포 활성화 또는 증식, 증가된 T 세포 생존, 또는 증가된 세포 기능성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가된 T 세포 반응은 증가된 T 세포 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 T 세포 반응은 증가된 T 세포 생존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 T 세포 반응은 증가된 T 세포 증식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 T 세포 반응은 증가된 T 세포 기능성을 포함한다. 예를 들어, 증가된 T 세포 기능성은 제한 없이, 조정된 시토카인 분비, 염증의 부위로의 증가된 T 세포 이동, 및 증가된 T 세포 세포독성 활성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 증가된 염증성 시토카인 생산 및/또는 분비, 및/또는 감소된 항-염증성 시토카인 생산 및/또는 분비를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 인터류킨-1 (IL-1), IL-2, IL-12, 및 IL-18, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 (IFN-γ), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로부터 선택되는 1종 이상의 염증성 시토카인의 증가된 생산 및/또는 분비를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α 및 전환 성장 인자-베타 (TGF-β)로부터 선택되는 1종 이상의 항-염증성 시토카인의 감소된 생산 및/또는 분비를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 T 세포 표현형의 변화를 포함한다. 예를 들어, T 세포 상태는 조절성 (Treg) 또는 항-염증성 표현형에서 염증유발성 표현형으로 변화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 T 세포의 비-특이적 활성화를 저해하며, 이는 그렇지 않다면 이어서 세포 사멸을 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 저해된 Treg 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극된 및/또는 향상된 면역 반응은 증가된 B 세포 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 B 세포 반응은 증가된 항체 생산을 포함한다.
무핵 세포-유래된 소포
일부 측면에서, 본 출원은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 항원을 포함한다.
특정 측면에서, a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 제공된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판-유래된 소포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 성숙적혈구-유래된 소포 또는 망상적혈구-유래된 소포이다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 무핵 세포는 핵을 결여한다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 비-포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 닭, 개구리, 곤충, 어류, 또는 선충 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 적혈구에 대한 전구체이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 망상적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 혈소판이다.
일부 실시양태에서, 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나, 항원에 대한 면역 반응을 유도한다. 간 및 비장의 면역원성 환경에서 청소될 수 있는 적혈구포식체, 예컨대 무핵 세포-유래된 소포로부터 유래된 항원은 T 세포의 활성화를 통해 항원에 대한 면역 반응을 자극하고/거나 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원-특이적이다. 무핵 세포-유래된 소포, 예컨대 RBC-유래된 소포는 제한된 수명을 가지며, 자기-복구가 불가능하여, 세포자멸사와 유사한 프로세스인 적혈구포식작용을 유발하고, 이는 혈류로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제거를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경 내에서 무핵 세포-유래된 소포의 적혈구포식작용 시 방출될 수 있으며, 여기서 이는 이어서 항원-제시 세포에 의해 탐식되고, 프로세싱되고, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포는 항원-제시 세포, 예컨대 대식세포에 의해 포식작용되고, 항원은 이어서 항원-제시 세포에 의해 프로세싱되고, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원-제시 세포는 거주자 대식세포이다.
일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 망상적혈구이다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 세포, 예컨대 무핵 세포, 예를 들어, 적혈구, 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Franco, R. S., Transfus Med Hemother, 39, 2012]을 참조한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 코호트 표지화 기법 또는 무작위 표지화 기법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 표지화하고, 세포 또는 세포를 재주입하고, 재주입 시 소멸을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 또는 모 무핵 세포 또는 투입 또는 모 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 반감기를 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 50% 초과, 예컨대 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것 초과 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 50% 내지 약 99.9%, 예컨대 약 70% 내지 약 99.9%, 약 85% 내지 약 99.9%, 또는 약 95% 내지 약 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 10일 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 0.5분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 인간 세포이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 10일 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 인간 세포이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 0.5분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 중 임의의 것 미만이다.
일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 세포, 예컨대 무핵 세포, 예를 들어, 적혈구, 또는 무핵 세포-유래된 소포, 예를 들어, 적혈구-유래된 소포의 헤모글로빈 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Chaudhary, R., J Blood Med, 8, 2017]을 참조한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 대사 전구체 또는 생성물을 측정하여 헤모글로빈의 전환율을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1종 이상의 헤모글로빈-유래된 (Hb) 펩티드를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 수준을 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 또는 모 무핵 세포 또는 투입 또는 모 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 헤모글로빈의 수준을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포는 모 무핵 세포에 비해 세포내 성분의 소실, 예컨대 수준의 감소를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 50% 내지 약 99.9%, 예컨대 약 70% 내지 약 99.9%, 약 85% 내지 약 99.9%, 또는 약 95% 내지 약 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 헤모글로빈이 없다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에서의 헤모글로빈 수준의 약 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 1종 이상의 헤모글로빈 (Hb) 펩티드의 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 1종 이상의 Hb 펩티드의 수준은 투입 무핵 세포에 비해 약 50% 내지 약 99.9%, 예컨대 약 70% 내지 약 99.9%, 약 85% 내지 약 99.9%, 또는 약 95% 내지 약 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 1종 이상의 Hb 펩티드의 수준은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 형태학은 투입 또는 모 무핵 세포의 그것으로부터 조정된다. 형태학은 예를 들어, 세포 또는 세포-유래된 소포의 형상, 구조, 기하학, 강도, 형태, 평활도, 조도, 원형성, 부피, 표면적, 및/또는 크기의 분류에 관한 것이다. 형태학을 결정하는 (예컨대 측정하는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Boutros et al., Cell, 163, 2015]; [Girasole, M. et al., Biochim Biophys Acta Biomembr, 1768, 2007]; 및 [Chen et al., Comput Math Methods Med, 2012]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 형태학을 결정하는 방법은 고-함량 영상화를 포함한다. 예를 들어, 세포의 형태학은 훽스트(Hoechst) 염료로의 염색, 이어서 자동화 고-함량 영상 분석에 의해 평가될 수 있다. 다른 예에서, 형태학은 유동 세포계측법으로부터 전방 및 측방 산란 플롯의 이동을 통해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 형태학에 있어서 구형이다. 일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 형태학을 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 또는 모 무핵 세포 또는 투입 또는 모 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 형태학을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 감소된, 예컨대 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%,96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것 초과 감소된 양요형 형상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 실질적으로 구형 형태학을 포함하여 구형 형태학을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 구형 형태학은 정성적으로 평가된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 구형 형태학은 정량적으로 평가된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 감소된, 예컨대 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 중 임의의 것 초과 감소된 표면적 대 부피 비를 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 복수의 직경 측정의 각각의 직경 측정 사이의 변동은 약 50% 미만, 예컨대 약 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 미만이고, 여기서 복수의 직경 측정은 무핵 세포-유래된 소포의 상이한 점에서 직경을 측정하는 적어도 2개의 직경 측정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 현탁액 중의 무핵 세포-유래된 소포의 가장 작은 치수, 예컨대 직경은 약 5 μm 내지 약 7.25 μm, 예컨대 약 6 μm 내지 약 7 μm, 또는 약 6.25 μm 내지 약 6.75 μm 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 현탁액 중의 무핵 세포-유래된 소포의 가장 작은 치수, 예컨대 직경은 적어도 약 5 μm, 예컨대 적어도 약 5.25 μm, 5.5 μm, 5.75 μm, 6 μm, 6.25 μm, 6.5 μm, 6.75 μm, 7 μm, 또는 7.25 μm 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 현탁액 중의 무핵 세포-유래된 소포의 가장 큰 치수, 예컨대 직경은 약 5 μm 내지 약 7.25 μm, 예컨대 약 6 μm 내지 약 7 μm, 또는 약 6.25 μm 내지 약 6.75 μm 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 현탁액 중의 무핵 세포-유래된 소포의 가장 큰 치수, 예컨대 직경은 약 7.25 μm 이하, 예컨대 약 7 μm, 6.75 μm, 6.5 μm, 6.25 μm, 6 μm, 5.75 μm, 5.5 μm, 5.25 μm, 또는 5 μm 중 임의의 것 이하이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소됨, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 실시양태에서, 투입 또는 모 무핵 세포는 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구 고스트 (RBC 고스트)이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 특성의 획득, 예컨대 수준의 증가를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준을 갖는다. 외부 세포막 상의 포스파티딜세린 노출은 세포자멸사의 특징이며, 탐식을 촉진시키는 방식으로 포식세포 상의 수용체에 의해 인식된다. 세포, 예컨대 무핵 세포, 예를 들어, 적혈구, 또는 무핵 세포-유래된 소포의 포스파티딜세린 수준 (예컨대 표면 포스파티딜세린 수준)을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Morita, S., et al., J Lipid Res, 53, 2012]; [Kay, J. G. et al., Sensors (Basel), 11, 2011]; 및 [Fabisiak JP et al., Methods Mol Biol, 1105, 2014]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 포스파티딜세린 수준을 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 또는 모 무핵 세포 또는 투입 또는 모 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 포스파티딜세린 수준을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 단위 부피 당 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 단위 부피 당 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 단위 표면적 당 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 단위 표면적 당 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 막 인지질의 단위 당 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 막 인지질의 단위 당 약 1.5배 초과 더 많은, 예컨대 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 또는 25배 중 임의의 것 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200% 중 임의의 것 또는 그 초과의 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 50% 내지 약 200% 더 많은, 예컨대 약 50% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 또는 약 75% 내지 약 125% 중 임의의 것 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 단위 부피 당 그의 표면 상에 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200% 중 임의의 것 또는 그 초과의 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 단위 부피 당 그의 표면 상에 약 50% 내지 약 200% 더 많은, 예컨대 약 50% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 또는 약 75% 내지 약 125% 중 임의의 것 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 단위 표면적 당 그의 표면 상에 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200% 중 임의의 것 또는 그 초과의 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 단위 표면적 당 그의 표면 상에 약 50% 내지 약 200% 더 많은, 예컨대 약 50% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 또는 약 75% 내지 약 125% 중 임의의 것 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 막 인지질의 단위 당 그의 표면 상에 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200% 중 임의의 것 또는 그 초과의 포스파티딜세린을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 막 인지질의 단위 당 그의 표면 상에 약 50% 내지 약 200% 더 많은, 예컨대 약 50% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 또는 약 75% 내지 약 125% 중 임의의 것 더 많은 포스파티딜세린을 갖는다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 총 막 포스파티딜세린의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 중 임의의 것 초과가 무핵 세포-유래된 소포에서 외부 막 첨판 상에 국재화된다. 일부 실시양태에서, 총 막 포스파티딜세린의 50% 초과가 무핵 세포-유래된 소포에서 외부 막 첨판 상에 국재화된다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 표면 상에 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200% 중 임의의 것 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일은 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 표면 상에 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 50배, 또는 100배 중 임의의 것 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 중 어느 하나는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 추가의 변형에 의해 증가된다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포-유래된 소포가 간 및 비장에서의 청소 전에 혈류에서 순환하는 시간을 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 변형에 의해 추가로 감소된다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포가 간 및 비장에서의 청소 전에 혈류에서 순환하는 시간을 감소시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 상의 인지질의 변경된 비는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 상의 다른 인지질에 대한 포스파티딜세린의 증가된 비는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 감소시킨다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 상의 포스파티딜세린의 존재는 예컨대 표면 포스파티딜세린을 증가시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용함으로써 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 감소시키도록 추가로 증가될 수 있다 (문헌 [Hamidi et al., J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60] 참조). 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 지질 또는 인지질과 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 화학물질, 예컨대 비스(술포숙신이미딜)수베레이트 또는 다른 가교제에 의해 처리된다. 다른 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 포스파티딜세린은 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 증가시키도록 감소될 수 있다. 플립파제는 형질막에서 외부 표면으로부터 시토졸 표면으로 인지질을 수송하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 플립파제로 처리된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 포스파티딜세린을 절단하는 효소로 처리된다. 포스파티딜세린을 절단하는 효소의 비-제한적 예는 포스파티딜세린 카르복실라제이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 시간 경과에 따른 감소된 ATP 생산, 또는 세포내 ATP의 수준을 갖는다. 세포, 예컨대 무핵 세포, 예를 들어, 적혈구, 또는 무핵 세포-유래된 소포의 ATP (예컨대 시간 경과에 따른 감소된 ATP 생산, 또는 세포내 ATP의 수준)를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Morciano, G. et al., Nat Protoc, 12, 2017]을 참조한다. 일부 실시양태에서, ATP 생산은 대리물 또는 마커, 예컨대 락테이트 생산을 통해 측정된다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산을 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 또는 모 무핵 세포 또는 투입 또는 모 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 ATP 생산을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 및 대조군 사이의 ATP 생산의 비교를 허용하는 ATP 생산을 측정하는 방법은 샘플 및 대조군의 ATP 생산을 유사한 조건 하에서 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산 또는 세포내 ATP 수준을 측정하는 방법은 제1 시간 및 제2 시간에서 무핵 세포-유래된 소포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 집단의 ATP 생산 또는 세포내 ATP 수준을 측정하고 (여기서 제1 시간은 제2 시간 전임), 제1 시간 및 제2 시간으로부터의 결과를 비교하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 의해 생산된 ATP의 수준의 약 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 중 임의의 것 미만에서 ATP를 생산한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 ATP를 생산하지 않는다.
일부 실시양태에서, ATP 생산은 락테이트 검정에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포 대 무핵 세포-유래된 소포의 대사 활성, 예컨대 ATP 생산을 측정하기 위해, 해당작용의 수준은 락테이트 생산의 수준을 형광 효소 검정을 사용하여 모니터링함으로써 시간 경과에 따라 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 투입 무핵 세포를 아데닌을 갖는 시트레이트-포스페이트-덱스트로스 (dCPDA-1) 완충액에 10억개의 세포/mL로 재현탁시키고, 모델 항원 및/또는 아주반트 (20 μg/mL에서)를 실온에서 SQZ (50 psi에서 2.2 μm 압박부 폭)를 통해 전달하여 무핵 세포-유래된 소포를 생성한다. 그 후, 무핵 세포-유래된 소포, 뿐만 아니라 비프로세싱된 투입 무핵 세포를 37℃에서 지시된 시점 동안 인큐베이션하고, 상청액을 수집한다. 투입 무핵 세포 대 무핵 세포-유래된 소포에 의해 생산된 락테이트의 수준을 정량화하기 위해, 락테이트-글로(Lactate-Glo) 검정 (프로메가(Promega))을 사용하여 채용하여 각각의 시점으로부터 상청액을 검정한다. 간략하게, 상청액을 불활성화 및 중화 단계로 처리한 후, 형광 락테이트 검출 시약을 첨가한다. 형광을 블랭크 대조군에 대해 정규화하고, 상청액 중의 절대 락테이트 수준을 락테이트 표준 곡선 (0.1 내지 10 μM)을 사용하여 결정한다. 일부 실시양태에서, 절대 락테이트 수준은 약 0 μM 내지 약 200 μM, 예컨대 약 0.01 μM 내지 약 10 μM, 약 0.01 μM 내지 약 중 임의의 것이다.
일부 측면에서, 본 출원은 무핵 세포-유래된 소포가 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 하나 이상을 갖는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 측면에서, 본 출원은 무핵 세포-유래된 소포가 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 2개 이상을 갖는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 측면에서, 본 출원은 무핵 세포-유래된 소포가 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 3개 이상을 갖는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 측면에서, 본 출원은 무핵 세포-유래된 소포가 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 4개 이상을 갖는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 측면에서, 본 출원은 무핵 세포-유래된 소포가 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 갖는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포를 제공한다: (a) 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 모 무핵 세포의 흡수에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록, 예컨대 흡수를 증가시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 각각의 조직에서의 모 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 흡수를 향상시키도록, 예컨대 흡수를 증가시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 각각의 포식 세포에서의 모 무핵 세포의 흡수에 비해 포식 세포 또는 항원-제시 세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포에서 흡수를 향상시키도록, 예컨대 흡수를 증가시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 지방 조직 대식세포, 단핵구, 쿠퍼 세포, 부비강 조직구, 폐포 대식세포, 조직 대식세포, 미세아교세포, 호프바우어 세포, 사구체내 간질 세포, 파골세포, 상피모양 세포, 적색 속질 대식세포, 복막 대식세포, 또는 리소맥(LysoMac)이다. 일부 실시양태에서, 항원-제시 세포는 전문적 항원-제시 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원-제시 세포는 비-전문적 항원-제시 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원-제시 세포는 수지상 세포, 또는 대식세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 간 및/또는 비장에서 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의해 청소되고, 그에 의해 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 통해서를 포함하여 항원 제시를 발생시킨다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 50배, 약 100배, 약 200배, 약 500배, 또는 약 1000배 중 어느 하나 초과 향상된 조직 또는 세포에서의 흡수의 속도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포는 대식세포 및/또는 수지상 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포에 비해 간, 비장 또는 대식세포에서 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 향상된 흡수를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 폐에서 청소되지 않는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 간 및/또는 비장에서 대식세포에 의해 청소되고, 그에 의해 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 통해서를 포함하여 항원 제시를 발생시킨다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형된 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 50배, 약 100배, 약 200배, 약 500배, 또는 약 1000배 중 어느 하나 초과 향상된 조직 또는 세포에서의 흡수의 속도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 포식 세포 및/또는 항원 제시 세포는 대식세포 및/또는 수지상 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 간, 비장 또는 대식세포에서 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 투입 또는 모 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 폐에서 청소되지 않는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 간 및/또는 비장에서 대식세포에 의해 청소되고, 그에 의해 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 통해서를 포함하여 항원 제시를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 그의 표면 상에 CD47을 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는다. 특정 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 열-처리되거나 열-충격화되지 않는다. 특정 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 화학물질, 예컨대 비스(술포숙신이미딜)수베레이트 또는 다른 가교제에 의해 처리되지 않는다. 특정 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 이온운반체 또는 다른 이온 수송체를 발현하거나 함유하도록 추가로 변형되지 않는다. 특정 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항체, 예컨대 항-TER119와 회합되지 않는다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 유지된다. 추가의 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm에서 유지된다. 추가의 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 약 200 mOsm 내지 약 800 mOsm에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 300 mOsm, 약 300 mOsm 내지 약 400 mOsm, 약 400 mOsm 내지 약 500 mOsm, 약 500 mOsm 내지 약 600 mOsm, 약 600 mOsm 내지 약 700 mOsm, 약 700 mOsm 내지 약 800 mOsm, 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm, 약 400 mOsm 내지 약 600 mOsm, 또는 약 600 mOsm 내지 약 800 mOsm 중 어느 하나에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 투입 또는 모 무핵 세포로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm, 예컨대 약 200 mOsm 내지 약 300 mOsm, 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm, 약 200 mOsm 내지 약 500 mOsm, 약 300 mOsm 내지 약 500 mOsm 또는 약 350 mOsm 내지 약 450 mOsm 중 임의의 것에서 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지되었다.
일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 및/또는 후에 항원과 접촉된다.
본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
항원 및 아주반트
본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 추가의 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 개체의 생검으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 병원체, 예컨대 박테리아 또는 바이러스에 의해 감염된 개체의 생검으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양을 함유하는 개체의 생검으로부터 유래된다 (즉, 종양 생검 용해물). 따라서, 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 이식편 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 이식된 기관의 생검으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 면역원성 에피토프를 포함하는 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환에 걸린 세포로부터 단리된 펩티드 또는 mRNA로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환에 걸린 세포에서 이소적으로 발현되거나 과발현된 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 신항원, 예를 들어, 암-연관된 신항원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 네오에피토프, 예를 들어, 암-연관된 네오에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 비-자기 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 돌연변이되거나 다르게는 변경된 자기 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 이종 펩티드 서열에 융합된 면역원성 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 면역원성 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프의 일부는 동일한 공급원으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프의 일부는 동일한 바이러스 항원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프의 전부는 동일한 공급원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 동일한 공급원으로부터 유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 복수의 상이한 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10가지 중 임의의 것의 상이한 유형의 항원은 무핵 세포에 전달된다.
본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 비-단백질 항원이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원, 예컨대 다당류이다. 일부 실시양태에서, 항원은 당지질이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원은 전체 미생물, 예컨대 무손상 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 외래 공급원, 예컨대 박테리아, 진균, 바이러스, 또는 알레르겐으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 예를 들어, 항원은 치료제 또는 표적화 펩티드와 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 면역원성 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이고, 면역원성 에피토프는 면역원성 펩티드 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N-말단 플랭킹 폴리펩티드 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드에 융합된다. 일부 실시양태에서, N-말단 플랭킹 폴리펩티드 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드에 융합된 면역원성 펩티드 에피토프는 비-천연 발생 서열이다. 일부 실시양태에서, N-말단 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드는 비-천연이다. 일부 실시양태에서, N-말단 플랭킹 폴리펩티드 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드에 융합된 면역원성 펩티드 에피토프는 합성이다. 일부 실시양태에서, N-말단 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드 (SLP)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, N-말단 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드는 질환-연관된 면역원성 SLP로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 면역원성 에피토프를 포함하고, MHC 부류 I-제한된 펩티드 및 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 항원 제시 세포에 의해 흡수되고, 항원은 항원 제시 세포에 의해 1종 이상의 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 1종 이상의 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 항원은 CD-1 제한된 항원이다. 일부 실시양태에서, CD-1 제한된 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 면역원성 에피토프를 포함하고, 복수의 CD-1 제한된 항원으로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 항원 제시 세포에 의해 흡수되고, 항원은 항원 제시 세포에 의해 1종 이상의 CD-1 제한된 항원으로 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 면역원성 에피토프를 포함하고, (a) MHC 부류 I-제한된 펩티드; (b) MHC 부류 II-제한된 펩티드; 또는 (c) CD-1 제한된 항원 중 1종 이상으로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프의 일부는 동일한 공급원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프의 전부는 동일한 공급원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 동일한 공급원으로부터 유래되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 개체에의 투여 후, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 다른 면역원성 에피토프 중 임의의 것에 대한 개체에서의 면역 반응을 감소시키지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I: C (저 및/또는 고분자량), 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드 및/또는 지질다당류 (LPS)이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 저분자량 폴리 I:C이다. 일부 실시양태에서, CpG ODN은 약 50개 이하의 (예컨대 약 45, 40, 35, 30, 25, 20개, 또는 그 미만 중 임의의 것 이하의) 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, CpG ODN은 부류 A CpG ODN, 부류 B CpG ODN, 또는 부류 C CpG ODN이다. 일부 실시양태에서, CpG ODN은 미국 가출원 US 62/641,987에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 복수의 상이한 CpG ODN을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 부류 A, 부류 B, 및 부류 C CpG ODN 중으로부터 선택되는 복수의 상이한 CpG ODN을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 아주반트, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중 임의의 것의 상이한 유형의 아주반트는 무핵 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및/또는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 약 1 pM 내지 약 10 mM의 농도로 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 약 1 pM 내지 약 10 mM의 농도로 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 약 0.1 μM 내지 약 10 mM의 농도로 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 약 0.1 μM 내지 약 10 mM의 농도로 아주반트를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 중의 아주반트의 농도는 약 1 pM, 약 10 pM, 약 100 pM, 약 1 nM, 약 10 nM, 약 100 nM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 중의 아주반트의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 중의 항원의 농도는 약 1 pM, 약 10 pM, 약 100 pM, 약 1 nM, 약 10 nM, 약 100 nM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 중의 항원의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 중의 항원의 농도는 약 1 pM 내지 약 10 pM, 약 10 pM 내지 약 100 pM, 약 100 pM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 중의 아주반트의 농도는 약 1 pM 내지 약 10 pM, 약 10 pM 내지 약 100 pM, 약 100 pM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 아주반트 대 항원의 몰 비는 약 10000:1 내지 약 1:10000 중 임의의 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 아주반트 대 항원의 몰 비는 약 10000:1, 약 1000:1, 약 100:1, 약 10:1, 약 1:1, 약 1:10, 약 1:100, 약 1:1000, 또는 약 1:10000 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 a) 항원, b) 아주반트, 및/또는 c) 항원 및 아주반트를 포함하는 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 추가적인 작용제를 포함하지 않는 상응하는 무핵 세포-유래된 소포에 비해 무핵 세포-유래된 소포의 기능을 향상시키는 추가적인 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 안정화제 또는 보조-인자이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 알부민이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 마우스, 소, 또는 인간 알부민이다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 2가 금속 양이온, 글루코스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민, 또는 EDTA이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 1종 이상의 치료제를 추가로 포함한다.
다른 탑재물
일부 실시양태에서, 탑재물은 면역관용성 인자이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 소분자, 복합체 (예컨대 단백질-기반 복합체, 핵산 복합체, 단백질-단백질 복합체, 핵산-핵산 복합체, 또는 단백질-핵산 복합체), 나노입자, 바이러스, 또는 바이러스 입자이다.
일부 실시양태에서, 탑재물은 우리카제 (반-합성 형태, 예를 들어, 페글로티카제를 포함함), 글루코세레브로시다제 (예를 들어, 이미글루세라제, 벨라글루세라제 알파, β-글루코시다제), 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타제 (TNSALP) (예를 들어, 아스포타제 알파), 리소좀산 리파제 (예를 들어, 세벨리파제 알파), 알파-글루코시다제 (예를 들어, 알글루코시다제 알파), α-L-이두로니다제 (예를 들어, 이아로니다제), 이두로네이트 술파타제 (예를 들어, 이두르술파제), 헤파란 술페이트, 케라틴 술페이트, 콘드로이틴 6-술페이트 (예를 들어, 엘로술파제 알파), N-아세틸갈락토스아민-4-술파타제 (예를 들어, 갈술파제), β-글루쿠로니다제, 히알루로니다제, α-갈락토시다제 A (예를 들어, 아갈시다제 베타), 페닐알라닌 히드록실라제, 중간-쇄 아실-CoA 데히드로게나제, 글리아딘, 아세틸콜린 수용체 및 수용체-연관된 단백질, 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR), 데스모글레인 1 및 3, 아쿠아포린 4, GADD65, 인슐린, 프로-인슐린, 및 프리-프로-인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 탑재물이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 탑재물과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 탑재물을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항원에 대한 면역 반응의 저해를 향상시키고/거나, 항원에 대한 내성의 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항원-제시 세포에 의한 항원의 면역관용성 제시를 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α, 또는 TGF-β이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 탄수화물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제한 없이, mRNA, DNA, miRNA, 또는 siRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역관용성 인자는 염증성 유전자의 발현을 넉 다운시키는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 NF-κB에 결합하고 NF-κB 활성화 및 하류 신호전달을 방지하는 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 소분자이다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역조정성 작용제 (예컨대 면역자극성 작용제 (예를 들어, 공동자극성 분자), 면역저해성 작용제, 또는 염증성 또는 항-염증성 분자)의 발현 및/또는 활성을 조정한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역자극성 작용제 (예를 들어, 공동자극성 분자)의 발현 및/또는 활성을 억제하고/거나, 면역저해성 분자의 발현 및/또는 활성을 향상시키고/거나, 염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 억제하고/거나, 항-염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자의 활성을 억제한다. 공동자극성 분자 및 그들의 리간드 사이의 상호작용은 최적 T 세포 증식 및 분화를 자극하는 TCR 신호전달을 지속시키고 통합하는데 중요하다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자의 발현을 감소시킨다. 항원-제시 세포 상에 발현되는 예시적인 공동자극성 분자는 제한 없이, CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79, Ox40 또는 ICOS 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동자극성 분자는 CD80 또는 CD86이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자를 발현하거나 그의 발현을 조정하는 핵산의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자를 발현하거나 그의 발현을 조정하는 핵산을 결실시킨다. 일부 실시양태에서, 공동자극성 분자를 발현하거나 그의 발현을 조정하는 핵산의 결실은 유전자 편집을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자를 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자를 억제하는 siRNA이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자의 발현을 저해하는 전사 조절제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자의 발현을 저해하는 단백질 억제제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자의 저해제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자를 분해시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 파괴를 위해 공동자극성 분자를 표지화한다. 예를 들어, 면역관용성 인자는 공동자극성 분자의 편재화를 향상시키고, 그에 의해 이를 파괴를 위해 표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 발현 및/또는 활성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 면역저해성 분자는 공동-억제성 분자, 전사 조절제, 또는 면역저해성 분자이다. 공동-억제성 분자는 림프구의 활성화를 음성적으로 조절한다. 예시적인 공동-억제성 분자는 제한 없이, PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, 이뮤노글로불린-유사 전사체 (ILT) 수용체 (ILT2, ILT3, ILT4), FasL, CTLA4, CD39, CD73, 및 B7-H4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-억제성 분자는 PD-L1 또는 PD-L2이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 발현을 향상시킬 수 있는 전사 조절제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 발현을 증가시키는 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 인핸서를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 공동-억제성 분자의 억제제를 억제한다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 예시적인 면역저해성 분자는 제한 없이, 아르기나제-1 (ARG1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 유도성 질소-산화물 신타제 (iNOS), 질소 산화물 (NO), 질소-산화물 신타제 2 (NOS2), 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP), 혈관 장 펩티드 (VIP), 간세포 성장 인자 (HGF), 전환 성장 인자-β (TGF-β), IFN-α, IL-4, IL-10, IL-13, 및 IL-35를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역저해성 분자는 NO 또는 IDO이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 발현을 향상시키는 전사 조절제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 발현을 향상시키는 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 인핸서를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 면역저해성 분자의 음성 조절제를 억제한다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 염증성 분자는 염증성 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자를 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 염증성 전사 인자는 NF-KB, 인터페론 조절성 인자 (IRF), 또는 JAK-STAT 신호전달 경로와 연관된 분자이다. NF-κB 경로는 시토카인, 케모카인, 및 부착 분자를 포함하여 염증유발성 유전자의 발현을 매개하는 원형적인 염증유발성 신호전달 경로이다. 인터페론 조절성 인자 (IRF)는 염증유발성 유전자의 발현을 조절할 수 있는 전사 인자의 패밀리를 구성한다. JAK-STAT 신호전달 경로는 세포외 시토카인 신호로부터 핵으로 정보를 전송하여, 면역 세포 증식 및 분화에 관여하는 유전자의 DNA 전사 및 발현을 발생시킨다. JAK-STAT 시스템은 세포 표면 수용체, 야누스 키나제 (JAK), 및 신호 전달제 및 전사의 활성화제 (STAT) 단백질로 이루어진다. 예시적인 JAK-STAT 분자는 제한 없이, JAKl, JAK2, JAK 3, Tyk2, STATI, STAT2, STAT3, STAT4, STATS (STAT5A 및 STAT5B), 및 STAT6을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 시토카인 신호전달의 저해제 (SOCS) 단백질의 발현을 향상시킨다. SOCS 단백질은 JAK-STAT 경로를 통한 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자를 코딩하는 핵산의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자를 코딩하는 핵산을 결실시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자의 발현을 저해하는 전사 조절제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자의 발현을 저해하는 단백질 억제제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 염증성 전사 인자의 저해제를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 항-염증성 분자는 항-염증성 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 전사 인자를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 전사 인자의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 전사 인자를 코딩하는 핵산의 발현을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 전사 인자의 발현을 저해하는 전사 조절제의 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 전사 인자의 발현을 저해하는 단백질 억제제의 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 항-염증성 전사 인자의 인핸서를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 핵산이다. 예시적인 핵산은 제한 없이, 재조합 핵산, DNA, 재조합 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, siRNA, mRNA, saRNA, miRNA, lncRNA, tRNA, gRNA, 및 shRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 세포 중의 핵산에 대해 동종이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 세포 중의 핵산에 대해 이종이다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 치료 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 치료 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 siRNA, mRNA, miRNA, lncRNA, tRNA, 또는 shRNA를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 면역관용성 인자는 염증성 유전자의 발현을 넉 다운시키는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 NF-κB에 결합하고 NF-κB 활성화 및 하류 신호전달을 방지하는 DNA 서열이다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 치료 단백질, 항체, 융합 단백질, 항원, 합성 단백질, 리포터 마커, 또는 선택가능한 마커이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 유전자-편집 단백질 또는 뉴클레아제, 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가 뉴클레아제, CRE 리콤비나제, 트랜스포사제, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CAS9 효소), DNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 또는 인테그라제 효소이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 제한 없이, 키메라 단백질 드래그, 예컨대 항체 약물 접합체 또는 재조합 융합 단백질, 예컨대 GST 또는 스트렙타비딘으로 태그부착된 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 전사 인자이다. 예시적인 전사 인자는 제한 없이, Oct4, Sox2, c-Myc, Klf-4, T-bet, GATA3, FoxP3, 및 RORγt를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α, 또는 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 펩티드 핵산 (PNA)이다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 단백질-핵산 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 단백질-핵산 복합체이다. 일부 실시양태에서, 단백질-핵산 복합체, 예컨대 군집화된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)-Cas9는 게놈 편집 적용에 사용된다. 이들 복합체는 비특이적 DNA 절단 뉴클레아제와 조합으로 서열-특이적 DNA-결합 도메인을 함유한다. 이들 복합체는 특이적 유전자의 서열을 첨가하거나, 파괴하거나, 변화시키는 것을 포함하여, 표적화된 게놈 편집을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 불능화된 Cas9 (dCas9)는 표적 유전자의 전사를 차단하거나 유도하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA 및 공여자 DNA를 함유한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 공여자 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 복합체는 공동자극성 분자 (예를 들어, CD80 및/또는 CD86)의 발현을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 소분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역관용성 인자는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 공동자극성 분자의 활성을 억제하고/거나, 공동-억제성 분자의 활성을 향상시키고/거나, 염증성 분자의 활성을 억제한다. 예시적인 소분자는 제한 없이, 제약 작용제, 대사물, 또는 방사성핵종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 작용제는 치료 약물 및/또는 세포독성 작용제이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 나노입자를 포함한다. 나노입자의 예는 금 나노입자, 양자 점, 탄소 나노튜브, 나노쉘, 덴드리머, 및 리포솜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 치료 분자를 함유하거나 그에 연결된다 (공유적으로 또는 비공유적으로). 일부 실시양태에서, 나노입자는 핵산, 예컨대 mRNA 또는 cDNA를 함유한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 유전 물질, 예컨대 DNA를 조정하는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 유전자 편집 성분, 예컨대 CRISPR 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 RNA를 조정하는, 예컨대 RNA 종의 존재를 감소시키는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 siRNA를 포함한다.
무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법
특정 측면에서, a) 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
특정 측면에서, a) 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 아주반트를 포함한다.
특정 측면에서, a) 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구-유래된 소포, 또는 혈소판-유래된 소포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 성숙적혈구-유래된 소포 또는 망상적혈구-유래된 소포이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 비-포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 닭, 개구리, 곤충, 어류, 또는 선충 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 RBC에 대한 전구체이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 망상적혈구이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 혈소판이다.
일부 실시양태에서, 면역원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나, 항원에 대한 면역 반응을 유도한다. 간 및 비장의 면역원성 환경에서 청소될 수 있는 적혈구포식체, 예컨대 무핵 세포-유래된 소포로부터 유래된 항원은 T 세포의 활성화를 통해 항원에 대한 면역 반응을 자극하거나 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원-특이적이다. 무핵 세포-유래된 소포, 예컨대 RBC-유래된 소포는 제한된 수명을 가지며, 자기-복구가 불가능하여, 세포자멸사와 유사한 프로세스인 적혈구포식작용을 유발하고, 이는 혈류로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제거를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 환경 내에서 무핵 세포-유래된 소포의 적혈구포식작용 시 방출될 수 있으며, 여기서 이는 이어서 항원-제시 세포에 의해 탐식되고, 프로세싱되고, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포는 항원-제시 세포, 예컨대 대식세포에 의해 포식작용되고, 항원은 이어서 항원 제시 세포에 의해 프로세싱되고, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원 제시 세포는 거주자 대식세포이다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포에 비해 감소된다. 세포, 예컨대 무핵 세포, 예를 들어, 적혈구, 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Franco, R. S., Transfus Med Hemother, 39, 2012]을 참조한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 코호트 표지화 기법 또는 무작위 표지화 기법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 표지화하고, 세포 또는 소포를 재주입하고, 재주입 시 소멸을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 무핵 세포 또는 투입 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 반감기를 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포에 비해 약 50% 초과, 예컨대 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 임의의 것 초과 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 투입 무핵 세포에 비해 약 50% 내지 약 99.9%, 예컨대 약 70% 내지 약 99.9%, 약 85% 내지 약 99.9%, 또는 약 95% 내지 약 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 순환 반감기는 투입 무핵 세포에 비해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 0.5분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포는 인간 세포이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 인간 세포이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기는 약 0.5분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 또는 100일 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포는 적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 무핵 세포에 비해 감소된다. 세포, 예컨대 무핵 세포, 예를 들어, 적혈구, 또는 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Chaudhary, R., J Blood Med, 8, 2017]을 참조한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 대사 전구체 또는 생성물을 측정하여 헤모글로빈의 전환율을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 수준을 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 무핵 세포 또는 투입 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 헤모글로빈 수준을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포에 비해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 무핵 세포에 비해 약 50% 내지 약 99.9%, 예컨대 약 70% 내지 약 99.9%, 약 85% 내지 약 99.9%, 또는 약 95% 내지 약 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 무핵 세포에 비해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준은 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포에서의 헤모글로빈 수준의 약 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포의 형태학은 투입 무핵 세포의 그것으로부터 조정된다. 형태학은 예를 들어, 세포 또는 세포-유래된 소포의 형상, 구조, 기하학, 강도, 형태, 평활도, 조도, 원형성, 부피, 표면적 및/또는 크기의 분류에 관한 것이다. 형태학을 결정하는 (예컨대 측정하는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Boutros et al., Cell, 163, 2015]; [Girasole, M. et al., Biochim Biophys Acta Biomembr, 1768, 2007]; 및 [Chen et al., Comput Math Methods Med, 2012]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 형태학을 결정하는 방법은 고-함량 영상화를 포함한다. 예를 들어, 세포의 형태학은 훽스트 염료로의 염색, 이어서 자동화 고-함량 영상 분석에 의해 평가될 수 있다. 다른 예에서, 형태학은 유동 세포계측법으로부터 전방 및 측방 산란 플롯의 이동을 통해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 형태학에 있어서 구형이다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 포함된 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포의 형태학을 측정하는 방법은 적절한 참조 대조군(들), 예컨대 투입 무핵 세포 또는 투입 무핵 세포의 집단을 포함하는 대조군의 형태학을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 투입 무핵 세포에 비해 감소된, 예컨대 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 중 임의의 것 초과 감소된 양요형 형상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 투입 (예를 들어, 모) 무핵 세포는 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 적혈구 고스트 (RBC 고스트)이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 추가의 변형에 의해 증가된다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포-유래된 소포가 간 및 비장에서의 청소 전에 혈류에서 순환하는 시간을 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기는 변형에 의해 추가로 감소된다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포가 비장에서의 청소 전에 혈류에서 순환하는 시간을 감소시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 상의 인지질의 변경된 비는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 상의 다른 인지질에 대한 포스파티딜세린의 증가된 비는 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 감소시킨다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 상의 포스파티딜세린의 존재는 예컨대 표면 포스파티딜세린을 증가시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용함으로써, 무핵 세포의 반감기를 감소시키도록 추가로 증가될 수 있다 (문헌 [Hamidi et al., J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60] 참조). 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 지질 또는 인지질과 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 화학물질, 예컨대 비스(술포숙신이미딜)수베레이트 또는 다른 가교제에 의해 처리된다. 다른 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 표면 포스파티딜세린은 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 증가시키도록 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 플립파제로 처리된다. 일반적으로, 플립파제는 형질막에서 외부 첨판으로부터 시토졸 첨판으로 인지질을 수송하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 개체에의 전달 전에 포스파티딜세린을 절단하는 효소로 처리된다. 포스파티딜세린을 절단하는 효소의 비-제한적 예는 포스파티딜세린 카르복실라제이다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소됨, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 유지된다. 추가의 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 200 mOsm 내지 400 mOsm에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 200 mOsm 내지 600 mOsm에서 유지된다. 추가의 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 공정 전반에 걸쳐 200 mOsm 내지 800 mOsm에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 오스몰농도는 200 mOsm 내지 300 mOsm, 300 mOsm 내지 400 mOsm, 400 mOsm 내지 500 mOsm, 500 mOsm 내지 600 mOsm, 600 mOsm 내지 700 mOsm, 700 mOsm 내지 800 mOsm 중 임의의 것에서 유지된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따르면, 무핵 세포-유래된 소포는 추가적인 작용제를 포함하지 않는 상응하는 무핵 세포-유래된 소포에 비해 무핵 세포-유래된 소포의 기능을 향상시키는 추가적인 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 안정화제 또는 보조-인자이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 알부민이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 마우스, 소, 또는 인간 알부민이다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 2가 금속 양이온, 글루코스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민, 또는 EDTA이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 1종 이상의 치료제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함하고, 여기서 무핵 세포-유래된 소포는 a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 면역관용성 인자가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 면역관용성 인자와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 1개 이상의 이동가능한 플레이트에 의해 형성된다.
일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다.
일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포의 직경, 예컨대 현탁액 중의 무핵 세포의 가장 큰 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포의 직경, 예컨대 현탁액 중의 무핵 세포의 가장 큰 직경의 약 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 10% 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.1 μm 내지 약 4 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 3 μm, 약 1.75 μm 내지 약 2.5 μm, 또는 약 2 μm 내지 약 2.5 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 3 μm, 2.5 μm, 2 μm, 1.5 μm, 1 μm, 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 1.8 μm, 1.9 μm, 2 μm, 2.1 μm, 2.2 μm, 2.3 μm, 2.4 μm, 2.5 μm 또는 2.6 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다.
일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 150 psi, 예컨대 약 30 psi 내지 약 60 psi, 약 10 psi 내지 약 40 psi, 약 50 psi 내지 약 90 psi 중 임의의 것의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 적어도 약 5 psi, 10 psi, 15 psi, 20 psi, 25 psi, 30 psi, 35 psi, 40 psi, 45 psi, 50 psi, 55 psi, 60 psi, 65 psi, 70 psi, 75 psi, 80 psi, 85 psi, 90 psi, 95 psi, 100 psi, 105 psi, 110 psi, 115 psi, 120 psi, 125 psi, 130 psi, 135 psi, 140 psi, 145 psi, 또는 150 psi 중 임의의 것의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 적어도 약 5 psi 및 약 150 psi, 145 psi, 140 psi, 135 psi, 130 psi, 125 psi, 120 psi, 115 psi, 110 psi, 105 psi, 100 psi, 95 psi, 90 psi, 85 psi, 80 psi, 75 psi, 70 psi, 65 psi, 60 psi, 55 psi, 50 psi, 45 psi, 40 psi, 35 psi, 30 psi, 25 psi, 20 psi, 또는 15 psi 중 임의의 것 미만의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다.
일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 적어도 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로 및 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로, 및 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 활성화 항원 운반체 (AAC)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 내성화를 위한 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 내성화 항원 운반체 (TAC)이다.
조성물
일부 측면에서, 본 출원은 복수의 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물이 하기 특성 중 임의의 하나 이상을 갖는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐 중 하나 이상을 포함하여, 하나 이상의 선택 특성을 갖는 조성물 내의 무핵 세포-유래된 소포의 바람직한 프로파일을 생성하도록 활성적으로 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 미세유체 압박부의 사용을 포함하여, 본원에 기재된 제조 방법을 사용하여 모 무핵 세포로부터 제조되고, 여기서 압박부 치수, 모 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시키는 속도, 압박부 구조 (예를 들어, 웨어(Weir) 구조 및 크기), 프로세싱 시간, 압력, 및 완충액 조성을 포함하여, 제조 방법의 파라미터는 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 생산하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 압박부 치수, 모 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시키는 속도, 압박부 구조 (예를 들어, 웨어 구조 및 크기), 프로세싱 시간, 압력, 및 완충액 조성을 포함하여, 파라미터의 세트를 선택하여 조성물을 생산하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 압박부 치수, 모 무핵 세포를 압박부를 통해 통과시키는 속도, 압박부 구조 (예를 들어, 웨어 구조 및 크기), 프로세싱 시간, 압력, 및 완충액 조성을 포함하여, 파라미터의 세트를 사용하여 조성물을 생산하는 것을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 압박부 치수, 예를 들어, 약 2.2 μm 또는 약 2.5 μm, 및 압력, 예를 들어, 약 30 psi 또는 약 50 psi를 포함하는 파라미터의 세트를 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 약 2.2 μm의 압박부 치수 및 약 30 psi의 압력을 포함하는 파라미터의 세트를 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 약 2.2 μm의 압박부 치수 및 약 50 psi의 압력을 포함하는 파라미터의 세트를 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 약 2.5 μm의 압박부 치수 및 약 30 psi의 압력을 포함하는 파라미터의 세트를 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, 선택 특성의 바람직한 프로파일을 갖는 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물은 약 2.5 μm의 압박부 치수 및 약 50 psi의 압력을 포함하는 파라미터의 세트를 사용하여 제조된다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류로부터의 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유동물로부터의 무핵 세포이다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 혈소판이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 성숙적혈구이다. 일부 실시양태에서, 적혈구는 망상적혈구이다.
일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 순환 반감기는 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 순환 반감기는 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 순환 반감기는 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 순환 반감기는 모 무핵 세포에 비해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 90% 중 임의의 것 초과 감소된다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간 세포이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 순환 반감기는 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 10일 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 인간 세포이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 순환 반감기는 약 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 10일 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에 비해 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에 비해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 중 임의의 것만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것의 헤모글로빈 수준은 모 무핵 세포에서의 헤모글로빈의 수준의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 모 무핵 세포에 비해 조정된 형태학을 갖는다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 형태학에 있어서 구형이다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 모 무핵 세포에 비해 감소된, 예컨대 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과 감소된 양요형 형상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 적혈구 고스트이다.
일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 표면 포스파티딜세린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 복수의 모 무핵 세포를 포함하는 조성물에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200% 중 임의의 것 초과 더 높은 표면 포스파티딜세린 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 모 무핵 세포에 의해 생산되는 ATP의 수준의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 중 임의의 것 미만에서 ATP를 생산한다. 일부 실시양태에서, 샘플 및 대조군의 ATP 생산은 유사한 조건 하에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것은 ATP를 생산하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 2개를 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 3개를 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 4개를 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성 중 임의의 5개를 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 조성물이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 하기 특성을 포함하는 것인, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 및 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물의 하나 이상의 특성은 그로부터 무핵 세포-유래된 소포가 제조된 모 무핵 세포의 집단에 대한 비교에 기반한다. 일부 실시양태에서, 비교는 모 무핵 세포의 집단에 대해 측정된 평균 값에 기반한다. 일부 실시양태에서, 비교는 모 무핵 세포의 집단에 대해 측정된 값의 범위에 기반한다. 일부 실시양태에서, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포의 집단으로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물이 제공된다: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 하기 중 하나 이상, 예컨대 전부로 처리되지 않았다: (a) 열 프로세싱됨, 예컨대 열-처리되거나 열-충격화됨, (b) 화학적으로 처리됨, 및 (c) 저장성 또는 고장성 조건으로 처리됨.
일부 실시양태에서, 오스몰농도는 모 무핵 세포로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm에서, 예컨대 약 200 mOsm 내지 약 300 mOsm, 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm, 약 200 mOsm 내지 약 500 mOsm, 약 300 mOsm 내지 약 500 mOsm 또는 약 350 mOsm 내지 약 450 mOsm 중 임의의 것에서 유지되었다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 200 mOsm and 약 400 mOsm에서 유지되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 투입 모 무핵 세포를 포함하는 현탁액을 세포 변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 무핵 세포의 섭동을 유발하고; 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다. 일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 탑재물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 치료 탑재물이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 항원이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 면역관용성 인자이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 소분자, 복합체 (예컨대 단백질-기반 복합체, 핵산 복합체, 단백질-단백질 복합체, 핵산-핵산 복합체, 또는 단백질-핵산 복합체), 또는 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 탑재물이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 탑재물과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 탑재물을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원, 예컨대 본원에 기재된 임의의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 예컨대 본원에 기재된 임의의 항원으로부터 선택되는 복수의 상이한 유형의 항원 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5가지 상이한 유형의 항원)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트, 예컨대 본원에 기재된 임의의 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 예컨대 본원에 기재된 임의의 아주반트로부터 선택되는 복수의 상이한 유형의 아주반트 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5가지 상이한 유형의 아주반트)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 면역관용성 인자, 예컨대 본원에 기재된 임의의 면역관용성 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 예컨대 본원에 기재된 임의의 면역관용성 인자로부터 선택되는 복수의 상이한 유형의 면역관용성 인자 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5가지 상이한 유형의 면역관용성 인자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 아주반트 및 면역관용성 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 항원, 아주반트, 및 면역관용성 인자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포는 활성화 항원 운반체 (AAC)이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 이식된 조직 용해물이다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS이다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 아주반트를 포함하고, 여기서 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원 및 면역관용성 인자를 포함하고, 여기서 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 면역관용성 인자가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 면역관용성 인자와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 1개 이상의 이동가능한 플레이트에 의해 형성된다.
일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다.
일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포의 직경, 예컨대 무핵 세포의 가장 큰 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포의 직경, 예컨대 무핵 세포의 가장 큰 직경의 약 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 10% 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.1 μm 내지 약 4 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 3 μm, 약 1.75 μm 내지 약 2.5 μm, 또는 약 2 μm 내지 약 2.5 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 3 μm, 2.5 μm, 2 μm, 1.5 μm, 1 μm, 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 1.8 μm, 1.9 μm, 2 μm, 2.1 μm, 2.2 μm, 2.3 μm, 2.4 μm, 2.5 μm 또는 2.6 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다.
일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 150 psi, 예컨대 약 30 psi 내지 약 60 psi, 약 10 psi 내지 약 40 psi, 약 50 psi 내지 약 90 psi 중 임의의 것의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 적어도 약 5 psi, 10 psi, 15 psi, 20 psi, 25 psi, 30 psi, 35 psi, 40 psi, 45 psi, 50 psi, 55 psi, 60 psi, 65 psi, 70 psi, 75 psi, 80 psi, 85 psi, 90 psi, 95 psi, 100 psi, 105 psi 110 psi, 115 psi, 120 psi, 125 psi, 130 psi, 135 psi, 140 psi, 145 psi, 또는 150 psi 중 임의의 것의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 모 무핵 세포는 적어도 약 5 psi 및 약 150 psi, 145 psi, 140 psi, 135 psi, 130 psi, 125 psi, 120 psi, 115 psi, 110 psi, 105 psi, 100 psi, 95 psi, 90 psi, 85 psi, 80 psi, 75 psi, 70 psi, 65 psi, 60 psi, 55 psi, 50 psi, 45 psi, 40 psi, 35 psi, 30 psi, 25 psi, 20 psi, 또는 15 psi 중 임의의 것 미만의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다.
일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 적어도 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로 및 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로, 및 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 500,000개, 예컨대 적어도 약 100만 (M), 1.5M, 2M, 2.5M, 3M, 3.5M, 4M, 4.5M, 5M, 5.5M, 6M, 6.5M, 7M, 7.5M, 8M, 8.5M, 9M, 9.5M, 10억 (B), 1.1B, 1.2B, 1.3B, 1.4B, 1.5B, 10B, 100B, 또는 1조 (T)개 중 임의의 것의 무핵 세포-유래된 소포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 약 500,000개, 예컨대 적어도 약 100만 (M), 1.5M, 2M, 2.5M, 3M, 3.5M, 4M, 4.5M, 5M, 5.5M, 6M, 6.5M, 7M, 7.5M, 8M, 8.5M, 9M, 9.5M, 10억 (B), 1.1B, 1.2B, 1.3B, 1.4B, 또는 1.5B, 10B, 100B, 또는 1조 (T)개 중 임의의 것의 무핵 세포 및 아주반트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 25% 내지 약 80%, 예컨대 약 25% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 55%, 약 35% 내지 약 65%, 또는 약 45% 내지 약 70% 중 임의의 것의 적혈구용적률 (Ht) 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 20% 초과, 예컨대 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 또는 80% 중 임의의 것 초과의 적혈구용적률 (Ht) 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 80% 미만, 예컨대 약 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20% 중 임의의 것 미만의 적혈구용적률 (Ht) 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 또는 80% 중 임의의 것의 적혈구용적률 (Ht) 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 멸균 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것에 따르면, 조성물은 1종 이상의 추가적인 작용제를 갖지 않는 무핵 세포 및/또는 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 상응하는 조성물에 비해 무핵 세포 및/또는 무핵 세포-유래된 소포에 대한 고스트 형성 및/또는 생존성 및/또는 기능을 향상시키고/거나, 예컨대 투여를 위한 유용성을 제공하는 1종 이상의 추가적인 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 안정화제 또는 보조-인자이다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 완충액이다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 포유동물에의 투여에 적합한 완충액이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 알부민이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 마우스, 소, 또는 인간 알부민이다. 일부 실시양태에서, 추가적인 작용제는 2가 금속 양이온, 글루코스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민, 또는 EDTA이다.
세포-변형 압박부
본원에 기재된 방법 중 임의의 것 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 압박부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 복수의 압박부를 포함한다. 다수의 압박부는 미세유체 채널 내에 병렬로 및/또는 직렬로 정치될 수 있다. 따라서 일부 실시양태에서, 복수의 압박부는 직렬로 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 복수의 미세기둥에 의해; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트에 의해 형성된다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 세포-변형 압박부를 함유하는 예시적인 미세유체 채널은 WO2013059343에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 기공을 갖는 예시적인 표면은 WO2017041050에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 루멘을 포함하고, 완충액에 현탁된 투입 무핵 세포가 통과할 수 있도록 구성되고, 여기서 미세유체 채널은 압박부를 포함한다. 미세유체 채널은 규소, 금속 (예를 들어, 스테인레스 스틸), 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, PET, PETG), 세라믹, 유리, 결정질 기질, 비정질 기질, 또는 중합체 (예를 들어, 폴리-메틸 메타크릴레이트 (PMMA), PDMS, 시클릭 올레핀 공중합체 (COC) 등)를 포함하여, 다수의 물질 중 어느 하나로 제조될 수 있다. 미세유체 채널의 제작은 드라이 에칭, 습식 에칭, 포토리소그래피, 사출 성형, 레이저 삭마, 또는 SU-8 마스크를 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 압박부는 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 압박부의 길이, 깊이, 및 폭은 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포 또는 투입 무핵 세포의 클러스터의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포 (예를 들어, RBC)의 최소 횡단면 거리의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포의 직경, 예컨대 현탁액 중의 무핵 세포의 가장 큰 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 세포의 직경, 예컨대 현탁액 중의 무핵 세포의 가장 큰 직경의 약 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 10% 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 7 μm, 약 6 μm, 약 5 μm, 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 1.6 μm, 약 1.8 μm, 약 2.0 μm, 약 2.2 μm, 약 2.4 μm, 약 2.6 μm, 약 2.8 μm, 또는 약 3.0 μm 중 어느 하나의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.1 μm 내지 약 4 μm, 예컨대 약 1 μm 내지 약 3 μm, 약 1.75 μm 내지 약 2.5 μm, 또는 약 2 μm 내지 약 2.5 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 4 μm, 3.5 μm, 3 μm, 2.5 μm, 2 μm, 1.5 μm, 1 μm, 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 1.8 μm, 1.9 μm, 2 μm, 2.1 μm, 2.2 μm, 2.3 μm, 2.4 μm, 2.5 μm 또는 2.6 μm 중 임의의 것의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다.
일부 적용에서, 압박부 폭은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 적용에서, 압박부 폭은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 감소될 수 있다. 일부 적용에서, 압박부 길이는 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 적용에서, 압박부 길이는 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 10 psi, 약 10 psi 내지 약 20 psi, 약 20 psi 내지 약 30 psi, 약 30 psi 내지 약 40 psi, 약 40 psi 내지 약 50 psi, 약 50 psi 내지 약 60 psi, 약 60 psi 내지 약 70 psi, 약 70 psi 내지 약 80 psi, 약 80 psi 내지 약 90 psi, 약 90 psi 내지 약 100 psi, 약 100 psi 내지 약 110 psi, 약 110 psi 내지 약 120 psi, 약 120 psi 내지 약 130 psi, 약 130 psi 내지 약 140 psi, 약 140 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 150 psi 내지 약 200 psi 중 어느 하나의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 150 psi, 예컨대 약 30 psi 내지 약 60 psi, 약 10 psi 내지 약 40 psi, 약 50 psi 내지 약 90 psi 중 임의의 것의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적어도 약 5 psi, 10 psi, 15 psi, 20 psi, 25 psi, 30 psi, 35 psi, 40 psi, 45 psi, 50 psi, 55 psi, 60 psi, 65 psi, 70 psi, 75 psi, 80 psi, 85 psi, 90 psi, 95 psi, 100 psi, 105 psi, 110 psi, 115 psi, 120 psi, 125 psi, 130 psi, 135 psi, 140 psi, 145 psi, 또는 150 psi 중 임의의 것의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 모 무핵 세포는 적어도 약 5 psi 및 약 150 psi, 145 psi, 140 psi, 135 psi, 130 psi, 125 psi, 120 psi, 115 psi, 105 psi, 100 psi, 95 psi, 90 psi, 85 psi, 80 psi, 75 psi, 70 psi, 65 psi, 60 psi, 55 psi, 50 psi, 45 psi, 40 psi, 35 psi, 30 psi, 25 psi, 20 psi, 또는 15 psi 중 임의의 것 미만의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 적용에서, 압력은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압력은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 증가될 수 있다. 채널, 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분의 횡단면은 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 횡단면은 형상에 있어서 원형, 타원형, 길쭉한 슬릿, 정사각형, 육각형, 또는 삼각형일 수 있다. 입구 부분은 압박부 각도를 한정하고, 여기서 압박부 각도는 채널의 클로깅을 감소시키도록 최적화되고, 세포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 향상된 전달을 위해 최적화된다. 출구 부분의 각도는 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 출구 부분의 각도는 비-층류를 발생시킬 수 있는 와류의 가능성을 감소시키도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 입구 부분 및/또는 출구 부분의 벽은 선형이다. 다른 실시양태에서, 입구 부분 및/또는 출구 부분의 벽은 만곡된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 및/또는 후에 항원과 접촉된다.
본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과되고, 여기서 압박부는 투입 무핵 세포를 변형시키고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 투입 무핵 세포에 진입하도록 투입 무핵 세포의 섭동을 유발한다. 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 기공을 갖는 예시적인 표면은 WO2017041050에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 압박부 크기는 무핵 세포의 함수이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10% 내지 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 압박부 크기는 현탁액 중의 투입 무핵 세포 (예를 들어, 무핵 세포, 예컨대 RBC)의 최소 횡단면 거리의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 최적 압박부 크기 또는 압박부 폭은 적용 및/또는 세포 유형에 기반하여 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 7 μm, 약 6 μm, 약 5 μm, 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm (이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함)의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 7 μm, 약 6 μm, 약 5 μm, 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 약 0.25 μm, 또는 약 0.1 μm 중 임의의 것 미만의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 1.6 μm, 약 1.8 μm, 약 2.0 μm, 약 2.2 μm, 약 2.4 μm, 약 2.6 μm, 약 2.8 μm, 또는 약 3.0 μm 중 어느 하나의 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 압박부는 약 2.2 μm의 폭을 갖는다. 일부 적용에서, 압박부 폭은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 적용에서, 압박부 폭은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 감소될 수 있다. 일부 적용에서, 압박부 길이는 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 적용에서, 압박부 길이는 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 증가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 10 psi, 약 10 psi 내지 약 20 psi, 약 20 psi 내지 약 30 psi, 약 30 psi 내지 약 40 psi, 약 40 psi 내지 약 50 psi, 약 50 psi 내지 약 60 psi, 약 60 psi 내지 약 70 psi, 약 70 psi 내지 약 80 psi, 약 80 psi 내지 약 90 psi, 약 90 psi 내지 약 100 psi, 약 100 psi 내지 약 110 psi, 약 110 psi 내지 약 120 psi, 약 120 psi 내지 약 130 psi, 약 130 psi 내지 약 140 psi, 약 140 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 150 psi 내지 약 200 psi 중 어느 하나의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 압력은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압력은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통과하기 전에, 공동으로, 및/또는 후에 항원과 접촉된다.
본원에 개시된 바와 같은 표면은 다수의 물질 중 어느 하나로 제조되고, 다수의 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 필터는 접선 유동 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 스폰지 또는 스폰지-유사 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 표면은 매트릭스이다.
일부 실시양태에서, 표면은 구불구불한 경로 표면이다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 경로 표면은 셀룰로스 아세테이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 제한 없이, 합성 또는 천연 중합체, 폴리카르보네이트, 규소, 유리, 금속, 합금, 셀룰로스 니트레이트, 은, 셀룰로스 아세테이트, 나일론, 폴리에스테르, 폴리에테르술폰, 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리프로필렌, PVDF, 폴리테트라플루오르에틸렌, 혼합 셀룰로스 에스테르, 자기, 및 세라믹으로부터 선택되는 물질을 포함한다.
본원에 개시된 표면은 관련 기술분야에 공지된 임의의 형상; 예를 들어 3차원 형상을 가질 수 있다. 표면의 2차원 형상은 제한 없이, 원형, 타원형, 둥근형, 정사각형, 별-형상, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 또는 팔각형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 형상에 있어서 둥근형이다. 일부 실시양태에서, 표면 3차원 형상은 원통형, 원뿔형, 또는 입방형이다.
표면은 다양한 횡단면 폭 및 두께를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면 횡단면 폭은 약 1 mm 내지 약 1 m 또는 그 사이의 임의의 횡단면 폭 또는 횡단면 폭의 범위이다. 일부 실시양태에서, 표면은 한정된 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 균일하다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 가변적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표면의 부분은 표면의 다른 부분보다 더 두껍거나 더 얇다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 약 1% 내지 약 90% 또는 그 사이의 임의의 백분율 또는 백분율의 범위만큼 다양하다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 0.01 μm 내지 약 5 mm의 두께 또는 그 사이의 임의의 두께 또는 두께의 범위이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 압박부는 기공이거나, 기공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 기공은 표면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 기공의 횡단면 폭은 처리되는 세포의 유형과 관련된다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 처리되는 투입 무핵 세포 또는 투입 무핵 세포의 클러스터의 현탁액 중의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 투입 무핵 세포가 기공을 통해 통과할 때 섭동되도록 하는 것이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 투입 무핵 세포의 직경보다 작다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 무핵 세포의 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 투입 무핵 세포의 직경의 약 10% 내지 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 투입 무핵 세포 직경의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 최적 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 적용 및/또는 세포 유형에 기반하여 다양할 수 있다. 일부 적용에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 적용에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 약 0.1 μm 내지 약 4 μm이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 약 0.25 μm 내지 약 4 μm이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 약 0.25 μm, 또는 약 0.1 μm이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 약 0.25 μm, 또는 약 0.1 μm 중 임의의 것 이하이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 약 1.6 μm, 약 1.8 μm, 약 2.0 μm, 약 2.2 μm, 약 2.4 μm, 약 2.6 μm, 약 2.8 μm, 또는 약 3.0 μm 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 기공 크기 또는 기공 횡단면 폭은 약 2.2 μm이다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 기공을 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 10 psi, 약 10 psi 내지 약 20 psi, 약 20 psi 내지 약 30 psi, 약 30 psi 내지 약 40 psi, 약 40 psi 내지 약 50 psi, 약 50 psi 내지 약 60 psi, 약 60 psi 내지 약 70 psi, 약 70 psi 내지 약 80 psi, 약 80 psi 내지 약 90 psi, 약 90 psi 내지 약 100 psi, 약 100 psi 내지 약 110 psi, 약 110 psi 내지 약 120 psi, 약 120 psi 내지 약 130 psi, 약 130 psi 내지 약 140 psi, 약 140 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 150 psi 내지 약 200 psi 중 어느 하나의 범위의 압력 하에서 기공을 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 압력은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 조정하도록 다양화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압력은 투입 무핵 세포로부터의 고스트 형성의 상대량을 증가시키도록 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 기공을 통해 통과하기 전에, 공동으로, 및/또는 후에 항원과 접촉된다.
기공 통로의 입구 및 출구는 다양한 각도를 가질 수 있다. 기공 각도는 무핵 세포가 통과하고 있는 동안 기공의 클로깅을 최소화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 입구 또는 출구 부분의 각도는 약 0 내지 약 90도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입구 또는 출구 부분은 90도 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공은 동일한 입구 및 출구 각도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기공은 상이한 입구 및 출구 각도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기공 모서리는 평활하고, 예를 들어 둥근형이거나 만곡된다. 평활한 기공 모서리는 울퉁불퉁한 것, 솟은 부분, 또는 고르지 않은 부분이 없이 연속적이고, 평평하고, 고른 표면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 기공 모서리는 샤프하다. 샤프한 기공 모서리는 뾰족하거나 급격한 각도에서인 얇은 모서리를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기공 통로는 곧다. 곧은 기공 통로는 만곡부, 굽힙부, 각도, 또는 다른 불규칙한 것을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 기공 통로는 만곡된다. 만곡된 기공 통로는 구부려지거나 곧은 선으로부터 벗어난다. 일부 실시양태에서, 기공 통로는 다수의 만곡부, 예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 만곡부를 갖는다.
기공은 2차원 또는 3차원 형상을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 형상을 가질 수 있다. 기공 형상 (예를 들어, 횡단면 형상)은 제한 없이, 원형, 타원형, 둥근형, 정사각형, 별-형상, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 및 팔각형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공의 횡단면은 형상에 있어서 둥근형이다. 일부 실시양태에서, 기공의 3차원 형상은 원통형 또는 원뿔형이다. 일부 실시양태에서, 기공은 세로홈의 입구 및 출구 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 기공 형상은 주어진 표면 내에서 기공 중에서 균질하다 (즉, 일관되거나 규칙적이다). 일부 실시양태에서, 기공 형상은 주어진 표면 내에서 기공 중에서 이질적이다 (즉, 혼합되거나 다양화된다).
본원에 기재된 표면은 다양한 총 기공 수를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공은 총 표면적의 약 10% 내지 약 80%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 1.0x105 내지 약 1.0x1030개의 총 기공 또는 그 사이의 임의의 수 또는 수의 범위를 함유한다. 일부 실시양태에서, 표면은 mm2 표면적 당 약 10 내지 약 1.0x1015개의 기공을 포함한다.
기공은 주어진 표면 내에서 다수의 방식으로 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공은 주어진 표면 내에서 병렬로 분포된다. 한 이러한 예에서, 기공은 동일한 방향으로 나란히 분포되고, 주어진 표면 내에서 동일한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 기공 분포는 질서있거나 균질하다. 한 이러한 예에서, 기공은 규칙적인 체계적인 패턴으로 분포되거나, 주어진 표면 내에서 동일한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 기공 분포는 무작위하거나 이질적이다. 한 이러한 예에서, 기공은 불규칙한 무질서한 패턴으로 분포되거나, 주어진 표면 내에서 상이한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 다수의 표면은 직렬로 분포된다. 다수의 표면은 표면 크기, 형상, 및/또는 조도에 있어서 균질하거나 이질적일 수 있다. 다수의 표면은 균질하거나 이질적인 기공 크기, 형상, 및/또는 수를 갖는 기공을 추가로 함유할 수 있으며, 그에 의해 상이한 유형의 무핵 세포 내로의 다양한 항원 및/또는 아주반트의 동시 전달을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 개별적인 기공은 균일한 폭 치수 (즉, 기공 통로의 길이를 따라 일정한 폭)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개별적인 기공은 가변적인 폭 (즉, 기공 통로의 길이를 따라 증가하거나 감소하는 폭)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주어진 표면 내의 기공은 동일한 개별적인 기공 깊이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 주어진 표면 내의 기공은 상이한 개별적인 기공 깊이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기공은 서로에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, 기공은 거리에 의해 서로로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 기공은 약 0.001 μm 내지 약 30 mm의 거리 또는 그 사이의 임의의 거리 또는 거리의 범위에 의해 서로로부터 분리된다.
일부 실시양태에서, 표면은 물질로 코팅된다. 물질은 제한 없이, 테플론(Teflon), 접착성 코팅, 계면활성제, 단백질, 부착 분자, 항체, 항응고제, 세포 기능을 조정하는 인자, 핵산, 지질, 탄수화물, 나노입자, 또는 막횡단 단백질을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 물질로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 물질은 표면에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 물질은 표면에 비-공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 표면 분자는 무핵 세포가 기공을 통해 통과할 때 방출된다.
일부 실시양태에서, 표면은 변형된 화학적 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면은 친수성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 소수성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 하전된다. 일부 실시양태에서, 표면은 양으로 및/또는 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 표면은 일부 영역에서는 양으로 하전되고, 다른 영역에서는 음으로 하전될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 전체 양성 또는 전체 음성 전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면은 평활하거나, 전자연마되거나, 거칠거나, 플라즈마 처리되거나 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 쯔비터이온 또는 양극성 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 플라즈마 처리된다.
일부 실시양태에서, 표면은 보다 큰 모듈 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 시린지, 예컨대 플라스틱 또는 유리 시린지 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 플라스틱 필터 홀더 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 피펫 팁 내에 함유된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과되고, 여기서 압박부는 투입 무핵 세포를 변형시키고, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트가 투입 무핵 세포에 진입하도록 세포의 섭동을 유발하고, 여기서 투입 무핵 세포에서의 섭동은 물질이 세포 외부로부터 투입 무핵 세포 내로 이동하는 것을 허용하는 투입 무핵 세포에서의 돌파구 (예를 들어, 구멍, 파열부, 공동, 구경, 기공, 파단부, 틈, 천공부)이다. 변형은 예를 들어, 기계적 압박 및/또는 전단력에 의해 유도된 압력에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섭동은 무핵 세포 막 내의 섭동이다. 일부 실시양태에서, 섭동은 일시적이다. 일부 실시양태에서, 세포 섭동은 약 1.0x10-9초 내지 약 24시간, 또는 그 사이의 임의의 시간 또는 시간의 범위만큼 지속된다. 일부 실시양태에서, 세포 섭동은 약 1.0x10-9초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 약 1분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 20시간, 또는 약 20시간 내지 약 24시간 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 세포 섭동은 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-2, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-3, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-4, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-5, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-6, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-7, 또는 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-8초 중 어느 하나 사이에서 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 세포 섭동은 약 1.0x10-8 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-7 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-6 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-5 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-4 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-3 내지 약 1.0x10-1, 또는 약 1.0x10-2 내지 약 1.0x10-1초 중 어느 하나 동안 지속된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포 섭동 (예를 들어, 기공 또는 구멍)은 다량체성 기공 구조, 예컨대 상보체 또는 박테리아 용혈에 의해 생성된 것을 형성하는 단백질 서브유닛의 어셈블리의 결과로서 형성되지 않는다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 압박부를 통해 통과하는 투입 무핵 세포 및/또는 세포의 섭동과 동시에 일어난다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후에 일어난다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 수 분 정도에 일어난다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 적어도 약 30분에 일어난다. 예를 들어, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 30분에 일어난다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 10분, 약 1.0x10-2초 내지 약 5분, 약 1.0x10-2초 내지 약 1분, 약 1.0x10-2초 내지 약 50초, 약 1.0x10-2초 내지 약 10초, 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 0.1초에 일어난다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-1초 내지 약 10분, 약 1초 내지 약 10분, 약 10초 내지 약 10분, 약 50초 내지 약 10분, 약 1분 내지 약 10분, 또는 약 5분 내지 약 10분에 일어난다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 생성된 무핵 세포-유래된 소포에서의 섭동은 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 5분 정도 내에 교정된다.
무핵 세포로부터의 고스트 형성은 실체 형상이 보다 구형 형태학을 향해 변화하는 경우 일어나며, 그의 원래 세포질 구조 및 함량의 일부의 소실에 의해 달성될 수 있다. RBC 고스트 및 성숙적혈구 고스트 형성은 관련 기술분야에 공지된 현상이다. 일부 실시양태에서, 압박부를 통해 통과한 후의 고스트 형성은 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 압박부를 통해 통과한 후의 고스트 형성은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 일부 실시양태에서, 고스트 형성은 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 적어도 약 10일에 측정된다. 예를 들어, 고스트 형성은 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 약 1분 내지 약 30분, 또는 약 30분 내지 약 2시간에 측정된다. 일부 실시양태에서, 고스트 형성은 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 2시간, 약 1.0x10-2초 내지 약 1시간, 약 1.0x10-2초 내지 약 30분, 약 1.0x10-2초 내지 약 1분, 약 1.0x10-2초 내지 약 30초, 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 0.1초에 측정된다. 일부 실시양태에서, 고스트 형성은 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 1.5시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 30분 내지 약 2시간, 약 15분 내지 약 2시간, 약 1분 내지 약 2시간, 약 30초 내지 약 2시간, 또는 약 1초 내지 약 2시간에 측정된다. 일부 실시양태에서, 고스트 형성은 세포가 압박부를 통해 통과한 후 약 2시간 내지 약 5시간, 약 5시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 또는 약 24시간 내지 약 10일에 측정된다.
다수의 파라미터는 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 임의의 것에 따른 무핵 세포-유래된 소포에의 항원 및/또는 아주반트의 전달에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원 및/또는 아주반트와 접촉된다. 투입 무핵 세포는 전달되는 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 용액에 현탁된 압박부를 통해 통과할 수 있지만, 항원 및/또는 아주반트는 투입 무핵 세포가 압박부를 통해 통과한 후에 세포 현탁액에 첨가되어 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달되는 항원 및/또는 아주반트는 압박부 상에 코팅된다. 일부 실시양태에서, 전달되는 항원 및/또는 아주반트는 표면 상에 코팅된다. 일부 실시양태에서, 전달되는 항원 및/또는 아주반트는 기공 상에 코팅된다. 일부 실시양태에서, 전달되는 항원 및/또는 아주반트는 필터 상에 코팅된다.
무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 전달에 영향을 줄 수 있는 파라미터의 예는 압박부의 치수, 압박부의 입구 각도, 압박부의 표면 특성 (예를 들어, 조도, 화학적 변형, 친수성, 소수성 등), 작동 유속 (예를 들어, 압박부를 통한 세포 수송 시간), 투입 무핵 세포 농도, 세포 현탁액 중의 항원 및/또는 아주반트의 농도를 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 압박부를 통해 통과한 후 무핵 세포-유래된 소포가 회수되거나 인큐베이션되는 시간의 양은 세포 내로의 전달되는 항원 및/또는 아주반트의 통과에 영향을 미칠 수 있다. 무핵 세포-유래된 소포 내로의 항원 및/또는 아주반트의 전달에 영향을 주는 추가적인 파라미터는 압박부에서의 투입 무핵 세포의 속도, 압박부에서의 전단 속도, 투입 무핵 세포 현탁액의 점도, 유속에 대해 수직인 속도 성분, 및 압박부에서의 시간을 포함할 수 있다. 이러한 파라미터는 항원 및/또는 아주반트의 전달을 제어하도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포 농도는 약 10개 내지 적어도 약 1012개의 소포/mL의 범위 또는 그 사이의 임의의 농도 또는 농도의 범위이다. 일부 실시양태에서, 전달되는 항원 및/또는 아주반트의 농도는 약 10 ng/mL 내지 약 1 g/mL의 범위 또는 그 사이의 임의의 농도 또는 농도의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달되는 항원 및/또는 아주반트의 농도는 약 1 pM 내지 적어도 약 2 M의 범위 또는 그 사이의 임의의 농도 또는 농도의 범위일 수 있다. 세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)은 면역 반응을 자극하고/거나 향상시키기 위한 항원 및/또는 아주반트의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용액은 등오스몰농도 또는 등장성이다.
본 개시내용의 방법에 사용되는 온도는 무핵 세포 유래된-소포에서의 항원 및/또는 아주반트 전달 및/또는 고스트 형성에 영향을 미치도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 수행된다. 예를 들어, 방법은 실온 (예를 들어, 약 20℃), 생리학적 온도 (예를 들어, 약 37℃), 생리학적 온도 초과 (예를 들어 약 37℃ 내지 45℃ 또는 그 초과 초과), 또는 감소된 온도 (예를 들어, 약 -5℃ 내지 약 4℃), 또는 이들 예시적인 온도 사이의 온도에서 수행될 수 있다.
다양한 방법은 압박부를 통해 현탁액 중의 투입 무핵 세포를 운전하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 압력은 입구 측 상의 펌프 (예를 들어, 가스 실린더, 또는 컴프레서)에 의해 인가될 수 있고/거나, 진공은 출구 측 상의 진공 펌프에 의해 인가될 수 있고/거나, 모세관 작용은 튜브를 통해 인가될 수 있고/거나, 시스템은 중력 공급될 수 있다. 유동 시스템에 기반한 이동은 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 시린지 펌프, 연동 펌프, 수동 시린지 또는 피펫, 피스톤 등). 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 양성 압력 또는 음성 압력에 의해 압박부를 통해 통과된다. 따라서 본원에 기재된 방법 또는 무핵 세포-유래된 소포 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 입구 측으로부터 양성 압력에 의해 압박부를 통해 통과된다. 추가의 실시양태에서, 양성 압력은 펌프를 사용하여 인가된다. 일부 실시양태에서, 양성 압력은 가스 실린더 또는 컴프레서를 사용하여 인가된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 특정 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 약 5 psi 내지 약 10 psi, 약 10 psi 내지 약 20 psi, 약 20 psi 내지 약 30 psi, 약 30 psi 내지 약 40 psi, 약 40 psi 내지 약 50 psi, 약 50 psi 내지 약 60 psi, 약 60 psi 내지 약 70 psi, 약 70 psi 내지 약 80 psi, 약 80 psi 내지 약 90 psi, 약 90 psi 내지 약 100 psi, 약 100 psi 내지 약 110 psi, 약 110 psi 내지 약 120 psi, 약 120 psi 내지 약 130 psi, 약 130 psi 내지 약 140 psi, 약 140 psi 내지 약 150 psi, 또는 약 150 psi 내지 약 200 psi 중 어느 하나의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 일정한 압력 또는 가변적인 압력에 의해 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 압력은 시린지를 사용하여 인가된다. 일부 실시양태에서, 압력은 펌프를 사용하여 인가된다. 일부 실시양태에서, 펌프는 연동 펌프 또는 격막 펌프이다. 일부 실시양태에서, 압력은 진공을 사용하여 인가된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 관성력에 의해 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 원심력에 의해 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 모세관 압력에 의해 압박부를 통해 통과된다. 일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포는 세포 운전기를 사용한 압력의 인가에 의해 압박부를 통해 이동된다 (예를 들어, 밀려난다). 본원에 사용된 바와 같은 세포 운전기는 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 운전하기 위해 현탁액에 압력 또는 힘을 인가하는 장치 또는 성분이다. 특정 실시양태에서, 세포 운전기는 압력 펌프, 가스 실린더, 컴프레서, 진공 펌프, 시린지 펌프, 연동 펌프, 피펫, 피스톤, 모세관 작용기, 인간 심장, 인간 근육, 중력, 미세유체 펌프, 및 시린지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 유체 유동은 투입 무핵 세포를 압박부를 통해 지향시킨다. 일부 실시양태에서, 유체 유동은 세포가 압박부를 통해 통과하기 전의 난류이다. 난류는 주어진 지점에서의 속도가 규모 및 방향에 있어서 변덕스럽게 변화하는 유체 유동이다. 일부 실시양태에서, 압박부를 통한 유체 유동은 층류이다. 층류는 모든 지점에서의 유동의 방향이 일정하게 잔류하는 고상 경계 부근의 유체에서의 중단되지 않는 유동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 유동은 세포가 압박부를 통해 통과한 후에 난류이다. 세포가 압박부를 통해 통과하는 속도는 다양화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 균일한 세포 속도로 압박부를 통해 통과한다. 일부 실시양태에서, 세포는 변동하는 세포 속도로 압박부를 통해 통과한다.
세포 현탁액은 세포의 혼합된 또는 정제된 집단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 혼합된 세포 집단, 예컨대 전혈이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 혼합된 세포 집단, 예컨대 무핵 세포의 혼합된 집단이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 정제된 세포 집단, 예컨대 무핵 세포의 정제된 집단이다.
세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)은 면역 반응을 자극하고/거나 향상시키기 위한 항원 및/또는 아주반트의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 전혈을 포함한다. 대안적으로, 세포 현탁액은 혈액 이외의 생리학적 염수 용액 또는 생리학적 매질 중의 세포의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용액은 세포 배양 배지, PBS, 염, 당, 성장 인자, 동물 유래된 생성물, 벌크화 물질, 계면활성제, 윤활제, 비타민, 아미노산, 단백질, 세포 주기 억제제, 및/또는 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 DMEM, 옵티-MEM™, IMDM, 또는 RPMI이다. 추가적으로, 용액 완충액은 예를 들어, 표면의 클로깅을 감소시키거나 제거하고, 투입 세포 생존성을 개선시키도록 디자인될 수 있는 1종 이상의 윤활제 (플루로닉 또는 다른 계면활성제)를 포함할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 제한 없이, 폴록사머, 폴리소르베이트, 당 또는 당 알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 동물 유래된 혈청, 및 알부민 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용액은 등오스몰농도 또는 등장성이다. 일부 실시양태에서, 수용액은 혈장을 포함한다.
특정 유형의 세포를 갖는 일부 구성에서, 투입 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포는 무핵 세포-유래된 소포의 내부에의 화합물의 전달을 돕는 1종 이상의 용액에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비프로세싱된 및 비처리된 투입 무핵 세포에 비해 세포골격 구조의 전부 또는 본질적으로 전부를 보유한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 비프로세싱된 및 비처리된 투입 무핵 세포의 세포골격 구조의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99.5% 중 어느 하나를 보유한다. 일부 실시양태에서, 용액은 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제는 라트룬쿨린 A, 시토칼라신, 및/또는 콜키신이다. 예를 들어, 투입 무핵 세포 또는 무핵 세포-유래된 소포는 액틴 세포골격을 해중합하기 위해 전달 전에 1시간 동안 해중합 용액, 예컨대 라트룬쿨린 A (0.1μg/ml)에서 인큐베이션될 수 있다. 추가적인 예로서, 세포는 미세관 망상체를 해중합하기 위해 전달 전에 2시간 동안 10μM 콜키신 (시그마(Sigma))에서 인큐베이션될 수 있다.
일부 실시양태에서, 투입 무핵 세포 집단은 개시된 방법에 사용하기 전에 풍부화된다. 예를 들어, 투입 무핵 세포는 체액, 예를 들어, 말초 혈액으로부터 얻어지고, 무핵 세포를 농축시키기 위해 임의로 풍부화되거나 정제된다. 세포는 제한 없이, 자기 세포 분리, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 또는 밀도 구배 원심분리를 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 풍부화될 수 있다.
세포 현탁액의 점도는 또한 본원에 개시된 방법에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 점도는 약 8.9x10-4 Pa·s 내지 약 4.0x10-3 Pa·s의 범위 또는 그 사이의 임의의 값 또는 값의 범위이다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 8.9x10-4 Pa·s 내지 약 4.0 x10-3 Pa·s, 약 8.9x10-4 Pa·s 내지 약 3.0 x10-3 Pa·s, 약 8.9x10-4 Pa·s 내지 약 2.0 x10-3 Pa·s, 또는 약 8.9x10-3 Pa·s 내지 약 1.0 x10-3 Pa·s 중 어느 하나의 범위이다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 0.89 cP 내지 약 4.0 cP, 약 0.89 cP 내지 약 3.0 cP, 약 0.89 cP 내지 약 2.0 cP, 또는 약 0.89 cP 내지 약 1.0 cP 중 어느 하나의 범위이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 점도가 전단 변형의 조건 하에서 감소하는 전단 담화 효과가 관찰된다. 점도는 제한 없이, 제한 없이, 점도계, 예컨대 유리 모세관 점도계, 또는 유량계를 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 점도계는 하나의 유동 조건 하에서 점도를 측정하는 반면, 유량계는 유동 조건에 따라 다양한 점도를 측정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 점도는 전단 담화 용액, 예컨대 혈액에 대해 측정된다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 측정된다. 예를 들어, 점도는 실온 (예를 들어, 약 20℃), 생리학적 온도 (예를 들어, 약 37℃), 생리학적 온도 초과 (예를 들어, 약 37℃ 내지 45℃ 또는 그 초과 초과), 감소된 온도 (예를 들어, 약 -5℃ 내지 약 4℃), 또는 이들 예시적인 온도 사이의 온도에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다 (예컨대 최초 접촉된다). 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 적어도 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로 및 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 압박부를 통해 통과하기 전에, 압박부를 통해 통과하는 것과 공동으로, 및 압박부를 통해 통과한 후에 탑재물과 접촉된다.
일부 실시양태에서, 탑재물은 치료 탑재물이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 항원이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 아주반트이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 면역관용성 인자이다. 일부 실시양태에서, 탑재물은 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 소분자, 복합체 (예컨대 단백질-기반 복합체, 핵산 복합체, 단백질-단백질 복합체, 핵산-핵산 복합체, 또는 단백질-핵산 복합체), 또는 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 항원, 예컨대 본원에 기재된 임의의 항원과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 예컨대 본원에 기재된 임의의 항원으로부터 선택되는 복수의 상이한 유형의 항원 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5가지 상이한 유형의 항원)과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 아주반트, 예컨대 본원에 기재된 임의의 아주반트와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 예컨대 본원에 기재된 임의의 아주반트로부터 선택되는 복수의 상이한 유형의 아주반트 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5가지 상이한 유형의 아주반트)와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 면역관용성 인자, 예컨대 본원에 기재된 임의의 면역관용성 인자와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 예컨대 본원에 기재된 임의의 면역관용성 인자로부터 선택되는 복수의 상이한 유형의 면역관용성 인자 (예컨대 2, 3, 4, 또는 5가지 상이한 유형의 면역관용성 인자)와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 항원 및 아주반트와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 아주반트 및 면역관용성 인자와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 항원 및 면역관용성 인자와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원, 아주반트, 및 면역관용성 인자를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 용해물은 종양 용해물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 이식편 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 핵산은 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 나노입자와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 무핵 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS이다.
추가적인 사용 방법
일부 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 및/또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 무핵 세포-유래된 소포 및/또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 치료 탑재물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 탑재물은 항원, 아주반트, 및 면역관용성 인자 중 임의의 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포는 항원, 아주반트, 및 면역관용성 인자 중 임의의 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 무핵 세포 및 아주반트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암, 감염성 질환, 또는 바이러스-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 효소 대체 요법 (ERT)에 의해 치료가능하다; 예를 들어, 고셰병. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 제I형 고셰병, 통풍, 저인산증, 리소좀산 리파제 결핍증, 폼페병, MPS IH (헐러 증후군), MPS II (헌터 증후군), MPS III A, B, C 및 D (산필리포 증후군 A, B, C, D), MPS IV A, B (모르퀴오 증후군), MPV VI (마로토-라미 증후군), MPS VII (슬라이 증후군), MPS IX (나토윅츠 증후군), 파브리 증후군, PKU 증후군, 중간-쇄 아실-CoA 데히드로게나제 결핍증 (MCADD), 셀리악병, 중증 근육무력증, 그레이브스병, 보통 천포창, 시각 신경척수염 (NMO), 또는 제I형 당뇨병이다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암, 자궁경부암, 자궁암, 직장암, 음경암, 난소암, 고환암, 골암, 연조직암, 피부암 (예를 들어, 흑색종), 위암, 장암, 결장암, 전립선암, 유방암, 식도암, 간암, 폐암, 췌장암, 뇌암, 또는 혈액암이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 통풍이고, 탑재물은 우리카제, 예를 들어, 반-합성 형태, 예컨대 페글로티카제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 제I형 고셰병이고, 탑재물은 글루코세레브로시다제, 예를 들어, 이미글루세라제, 벨라글루세라제 알파, 또는 β-글루코시다제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 저인산증이고, 탑재물은 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타제 (TNSALP), 예를 들어, 아스포타제 알파이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 리소좀산 리파제 결핍증이고, 탑재물은 리소좀산 리파제, 예를 들어, 세벨리파제 알파이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 폼페병이고, 탑재물은 알파-글루코시다제, 예를 들어, 알글루코시다제 알파이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPS IH (헐러 증후군), IH/S (헐러-샤이에 증후군), 또는 IS (샤이에, 일명 MPS V)이고, 탑재물은 α-L-이두로니다제, 예를 들어, 이아로니다제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPS II (헌터 증후군)이고, 탑재물은 이두로네이트 술파타제, 예를 들어, 이두르술파제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPS III A, B, C 또는 D (산필리포 증후군 A, B, C, 또는 D이고), 탑재물은 헤파란 술페이트이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPS IV A, B (모르퀴오 증후군)이고, 탑재물은 케라틴 술페이트 또는 콘드로이틴 6-술페이트, 예를 들어, 엘로술파제 알파이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPV VI (마로토-라미 증후군)이고, 탑재물은 N-아세틸갈락토스아민-4-술파타제, 예를 들어, 갈술파제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPS VII (슬라이 증후군)이고, 탑재물은 β-글루쿠로니다제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 MPS IX (나토윅츠 증후군)이고, 탑재물은 히알루로니다제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 파브리 증후군이고, 탑재물은 α-갈락토시다제 A, 예를 들어, 아갈시다제 베타이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 PKU 증후군이고, 탑재물은 페닐알라닌 히드록실라제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 중간-쇄 아실-CoA 데히드로게나제 결핍증 (MCADD)이고, 탑재물은 중간-쇄 아실-CoA 데히드로게나제이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 셀리악병이고, 탑재물은 글리아딘이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 중증 근육무력증이고, 탑재물은 아세틸콜린 수용체 및 수용체-연관된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 그레이브스병이고, 탑재물은 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR)이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 보통 천포창이고, 탑재물은 데스모글레인 1 및 3이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 시각 신경척수염 (NMO)이고, 탑재물은 아쿠아포린 4이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 제I형 당뇨병이고, 탑재물은 GADD65, 인슐린, 프로-인슐린, 또는 프리-프로-인슐린이다.
일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 EBV-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 EBV-연관된 질환이고, 항원은 EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LP, LMP-1, LMP-2A, LMP-2B, 및 EBER 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, EBV-연관된 질환은 다발성 경화증 (MS)이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 HIV-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, HIV-연관된 질환은 기회 감염이고, 이는 기관지, 기관, 식도, 또는 폐의 칸디다증; 침습성 자궁경부암; 콕시디오이데스진균증; 크립토코쿠스증; 만성 장 크립토스포리디움증, 시토메갈로바이러스 질환; HIV-관련된 뇌병증; HSV-관련된 만성 궤양 또는 기관지염, 폐렴, 또는 식도염; 히스토플라스마증; 만성 장 이소스포라증; 카포시 육종; 림프종; 결핵; 미코박테리움 아비움 복합체 (MAC); 뉴모시스티스 카리니이 폐렴 (PCP); 재발성 폐렴; 진행성 다초점성 백질뇌병증; 재발성 살모넬라 패혈증; 뇌의 톡소플라스마증; 및 HIV에 기인한 소모 증후군을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 HPV이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 HPV이고, 항원은 E7에 대한 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 HPV이고, 항원은 E6에 대한 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 HBV-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 RSV-연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 바이러스-연관된 질환은 KSHV-연관된 질환이다.
일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다.
일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 개체는 자가면역 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 자가면역 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 면역관용성 인자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 갖고, 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 다발성 경화증 (MS)을 갖고, 탑재물은 EBV 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 HIV를 갖고, 탑재물은 HIV-연관된 질환, 예컨대 기회 감염을 치료하기 위한 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 또 다른 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 1종 이상의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 치료제는 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 및/또는 조성물을 개체에게 투여하기 전에, 그와 공동으로, 또는 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역 체크포인트 억제제, 또는 시토카인 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 및 BTLA 중 어느 하나에 표적화된다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IFN-γ, IFN-α, IL-10, IL-15, 또는 IL-2 및 그의 변형된 형태이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 면역관용성 시토카인, 예컨대 IL-10, TGF-B, 및 IL-2의 내성 유도 형태이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역관용성 작용제, 예컨대 라파마이신이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 방사선요법을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 면역 반응을 저해하고/거나 내성을 유도하는 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응 및/또는 유도된 내성은 감소된 자가면역 반응을 포함한다. 예를 들어, 감소된 자가면역 반응은 제한 없이, 제I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증, 면역 성분을 가질 수 있는 신경변성 질환, 예컨대 시각 신경척수염 (NMO) 알츠하이머병, ALS, 헌팅톤병, 및 파킨슨병, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌병, 크론병, 또는 궤양성 결장염과 연관된 항원에 대한 감소된 면역 반응 또는 유도된 내성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응 및/또는 유도된 내성은 감소된 알레르기 반응을 포함한다. 예를 들어, 감소된 알레르기 반응은 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염 (건초열), 또는 식품 알레르기과 연관된 항원에 대한 감소된 면역 반응 또는 유도된 내성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소된 알레르기성 반응은 셀리악병과 연관된 항원에 대한 감소된 면역 반응 또는 유도된 내성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 이식된 조직과 연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응 및/또는 유도된 내성은 이식된 조직에 대한 감소된 면역 반응 또는 유도된 내성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스와 연관된다. 일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응 및/또는 유도된 내성은 바이러스에 대한 감소된 병원성 면역 반응 또는 유도된 내성을 포함한다. 예를 들어, 병원성 면역 반응은 특정 바이러스 감염에 의해 생성된 시토카인 폭풍을 포함할 수 있다. 시토카인 폭풍은 시토카인 및 백혈구 사이의 양성 피드백 루프로 이루어진 잠재적으로 치명적인 면역 반응이다.
일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응은 치료제에 대한 감소된 면역 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 응고 인자이다. 예시적인 응고 인자는 제한 없이, 인자 VIII 및 인자 IX를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항체이다. 예시적인 치료 항체는 제한 없이, 항-TNFα, 항-VEGF, 항-CD3, 항-CD20, 항-IL-2R, 항-Her2, 항-RSVF, 항-CEA, 항-IL-1β, 항-CD15, 항-미오신, 항-PSMA, 항-40 kDa 당단백질, 항-CD33, 항-CD52, 항-IgE, 항-CD11a, 항-EGFR, 항-C5, 항-α-4 인테그린, 항-IL-12/IL-23, 항-IL-6R, 및 항-RANKL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 성장 인자이다. 예시적인 치료 성장 인자는 제한 없이, 에리트로포이에틴 (EPO) 및 거대핵세포 분화 및 성장 인자 (MDGF)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 호르몬이다. 예시적인 치료 호르몬은 제한 없이, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 및 난포 자극 호르몬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 재조합 시토카인이다. 예시적인 치료 재조합 시토카인은 제한 없이, IFNβ, IFNα, 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응은 치료 비히클에 대한 감소된 면역 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 비히클은 유전자 요법에 사용되는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 바쿨로바이러스, 포진 바이러스, 또는 레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료 비히클은 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 치료 비히클은 나노입자이다. 일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응은 바이러스 캡시드; 예를 들어, AAV 캡시드 (예를 들어, AAV VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 단백질)에 대한 감소된 면역 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 치료 비히클에 대한 감소된 면역 반응은 바이러스의 임의의 혈청형; 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh8, 또는 AAVrh10 (그러나, 이에 제한되지는 않음)에 대해 지정된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 바이러스 캡시드에 대한 감소된 면역 반응은 보다 높은 초기 투여량, 반복 투여, 보다 긴 반감기, 및 보다 긴 발현, 예를 들어, AAV 치료 비히클의 반복 투여 중 하나 이상을 허용한다.
일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응은 치료 비히클 (예를 들어, 유전자 요법 비히클)에 의해 발현된 트랜스진 생성물에 대한 감소된 면역 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 저해된 면역 반응은 AAV 유전자 요법 벡터에 의해 발현된 트랜스진 생성물에 대한 감소된 면역 반응을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료 방법은 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 및/또는 조성물의 1개 이상의 용량, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 중 임의의 것의 용량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 및/또는 조성물의 1년 당 최대 12개의 용량, 예컨대 1년 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 중 임의의 것의 용량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 용량은 치료 과정에 걸쳐 균일한 또는 비-균일한 간격으로, 예컨대 예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4,일, 5일, 6일, 1주, 또는 2주 중 임의의 것의 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 용량은 치료 과정에 걸쳐 투여되고, 여기서 제1 용량 및 제2 용량 사이의 간격은 약 1주 내지 약 1년, 예컨대 약 2주 내지 약 1개월, 약 2주 내지 약 3개월, 약 2주 내지 약 4개월, 약 2주 내지 약 6개월, 약 2주 내지 약 9개월, 또는 약 2주 내지 약 12개월 중 임의의 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 무핵 세포-유래된 소포 및/또는 조성물 중 임의의 것을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포-유래된 소포는 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 여기서 탑재물은 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이고, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 감염성 질환을 갖고, 여기서 탑재물은 항원 및 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다.
시스템 및 키트
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 압박부, 세포 현탁액, 및 화합물을 포함하는 시스템을 제공한다. 시스템은 세포-변형 압박부를 제공하기 위한 미세유체 채널 또는 기공을 갖는 표면, 세포 현탁액, 세포 섭동, 전달 파라미터, 화합물, 및/또는 적용 등을 포함하여, 상기 개시된 방법에 대해 기재된 임의의 실시양태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-변형 압박부는 투입 무핵 세포에의 항원 및/또는 아주반트의 전달을 위한 크기이다. 일부 실시양태에서, 전달 파라미터, 예컨대 작동 유속, 세포 농도, 항원 및/또는 아주반트 농도, 압박부에서의 세포의 속도, 및 세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)은 항원 및/또는 아주반트에 대한 면역 반응의 최대 자극 또는 향상을 위해 최적화된다.
또한, 면역 반응을 자극하거나 향상시키기 위한 무핵 세포-유래된 소포에 항원 및/또는 아주반트를 전달하는데 사용하기 위한 키트 또는 제조품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 적합한 패키징에 본원에 기재된 조성물 (예를 들어 미세유체 채널 또는 기공을 함유하는 표면, 세포 현탁액, 및/또는 화합물)을 포함한다. 적합한 패키징 물질은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 바이알 (예컨대 밀봉된 바이알), 용기, 앰풀, 보틀, 자, 가요성 패키징 (예를 들어, 밀봉된 마일러 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이들 제조품은 추가로 멸균되고/거나 밀봉될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 방법의 성분을 포함하는 키트를 제공하며, 면역 반응을 자극하거나 향상시키기 위해 상기 방법을 수행하기 위한 지시서(들)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 지시서; 예를 들어, 면역 반응을 자극하거나 향상시키기 위한 지시서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하여, 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태
실시양태 1. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원을 전달하는 방법.
실시양태 2. 투입 무핵 세포가 아주반트를 추가로 포함하는 것인 실시양태 1의 방법.
실시양태 3. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 아주반트를 전달하는 방법.
실시양태 4. 투입 무핵 세포가 항원을 추가로 포함하는 것인 실시양태 3의 방법.
실시양태 5. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원 및 아주반트를 전달하는 방법.
실시양태 6. 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
실시양태 7. 방법이 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 실시양태 6의 방법.
실시양태 8. 아주반트가 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여되는 것인 실시양태 7의 방법.
실시양태 9. 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 6 내지 8 중 어느 하나의 방법.
실시양태 10. 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
실시양태 11. 방법이 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 실시양태 10의 방법.
실시양태 12. 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여되는 것인 실시양태 11의 방법.
실시양태 13. 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법.
실시양태 14. 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법.
실시양태 15. 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법.
실시양태 16. 방법이 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 실시양태 13 내지 15 중 어느 하나의 방법.
실시양태 17. 아주반트가 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여되는 것인 실시양태 16의 방법.
실시양태 18. 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 13 내지 17 중 어느 하나의 방법.
실시양태 19. 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법.
실시양태 20. 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법.
실시양태 21. 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법.
실시양태 22. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법.
실시양태 23. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법.
실시양태 24. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법.
실시양태 25. 방법이 소포외 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 실시양태 19 내지 24 중 어느 하나의 방법.
실시양태 26. 소포외 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여되는 것인 실시양태 25의 방법.
실시양태 27. 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 19 내지 24 중 어느 하나의 방법.
실시양태 28. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 질환-연관된 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법.
실시양태 29. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법.
실시양태 30. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고; c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법.
실시양태 31. 방법이 소포외 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 실시양태 28 내지 30 중 어느 하나의 방법.
실시양태 32. 소포외 아주반트가 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여되는 것인 실시양태 31의 방법.
실시양태 33. 질환이 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환인 실시양태 13 내지 32 중 어느 하나의 방법.
실시양태 34. 무핵 세포-유래된 소포가 개체에 대해 자가성인 실시양태 6 내지 33 중 어느 하나의 방법.
실시양태 35. 무핵 세포-유래된 소포가 개체에 대해 동종이계인 실시양태 6 내지 33 중 어느 하나의 방법.
실시양태 36. 무핵 세포-유래된 소포가 제약 제형 중에 있는 것인 실시양태 6 내지 35 중 어느 하나의 방법.
실시양태 37. 무핵 세포-유래된 소포가 전신으로 투여되는 것인 실시양태 6 내지 36 중 어느 하나의 방법.
실시양태 38. 무핵 세포-유래된 소포가 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 복강내로 투여되는 것인 실시양태 6 내지 37 중 어느 하나의 방법.
실시양태 39. 무핵 세포-유래된 소포가 치료제와 조합으로 개체에게 투여되는 것인 실시양태 6 내지 38 중 어느 하나의 방법.
실시양태 40. 치료제가 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여되는 것인 실시양태 39의 방법.
실시양태 41. 치료제가 면역 체크포인트 억제제 및/또는 시토카인인 실시양태 39 또는 40의 방법.
실시양태 42. 시토카인이 IFN-α, IFN-γ, IL-2 또는 IL-15 중 1종 이상인 실시양태 41의 방법.
실시양태 43. 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 및 BTLA 중 어느 하나에 표적화되는 것인 실시양태 41의 방법.
실시양태 44. 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 43 중 어느 하나의 방법.
실시양태 45. 항원이 CD-1 제한된 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 43 중 어느 하나의 방법.
실시양태 46. 항원이 질환-연관된 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 45 중 어느 하나의 방법.
실시양태 47. 항원이 종양 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 46 중 어느 하나의 방법.
실시양태 48. 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 47 중 어느 하나의 방법.
실시양태 49. 용해물이 종양 용해물인 실시양태 48의 방법.
실시양태 50. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 46 중 어느 하나의 방법.
실시양태 51. 항원이 미생물인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 46 중 어느 하나의 방법.
실시양태 52. 항원이 폴리펩티드인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 50 중 어느 하나의 방법.
실시양태 53. 항원이 지질 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 50 중 어느 하나의 방법.
실시양태 54. 항원이 탄수화물 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 50 중 어느 하나의 방법.
실시양태 55. 항원이 변형된 항원인 실시양태 1, 2, 또는 4 내지 54 중 어느 하나의 방법.
실시양태 56. 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 55의 방법.
실시양태 57. 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 56의 방법.
실시양태 58. 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 55의 방법.
실시양태 59. 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 55의 방법.
실시양태 60. 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 55의 방법.
실시양태 61. 복수의 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 전달되는 것인 실시양태 1 내지 60 중 어느 하나의 방법.
실시양태 62. 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 지질다당류 (LPS)인 실시양태 2 내지 5, 7 내지 12, 16 내지 21, 25 내지 61 중 어느 하나의 방법.
실시양태 63. 아주반트가 저분자량 폴리 I:C인 실시양태 62의 방법.
실시양태 64. 투입 무핵 세포가 적혈구인 실시양태 1 내지 63 중 어느 하나의 방법.
실시양태 65. 적혈구가 성숙적혈구인 실시양태 1 내지 63 중 어느 하나의 방법.
실시양태 66. 적혈구가 망상적혈구인 실시양태 1 내지 63 중 어느 하나의 방법.
실시양태 67. 투입 무핵 세포가 혈소판인 실시양태 1 내지 63 중 어느 하나의 방법.
실시양태 68. 투입 무핵 세포가 포유동물 세포인 실시양태 1 내지 67 중 어느 하나의 방법.
실시양태 69. 투입 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 실시양태 1 내지 68 중 어느 하나의 방법.
실시양태 70. 투입 무핵 세포가 인간 세포인 실시양태 1 내지 68 중 어느 하나의 방법.
실시양태 71. 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 실시양태 1 내지 70 중 어느 하나의 방법.
실시양태 72. 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 실시양태 71의 방법.
실시양태 73. 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 실시양태 72의 방법.
실시양태 74. 압박부가 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 실시양태 1 내지 73 중 어느 하나의 방법.
실시양태 75. 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 실시양태 1 내지 70 중 어느 하나의 방법.
실시양태 76. 기공이 표면에 함유되는 것인 실시양태 75의 방법.
실시양태 77. 표면이 필터인 실시양태 76의 방법.
실시양태 78. 표면이 막인 실시양태 76의 방법.
실시양태 79. 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수인 실시양태 1 내지 76 중 어느 하나의 방법.
실시양태 80. 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 실시양태 1 내지 79 중 어느 하나의 방법.
실시양태 81. 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 1 내지 79 중 어느 하나의 방법.
실시양태 82. 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 1 내지 79 중 어느 하나의 방법.
실시양태 83. 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 1 내지 79 중 어느 하나의 방법.
실시양태 84. 투입 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 실시양태 1 내지 83 중 어느 하나의 방법.
실시양태 85. 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 실시양태 1 내지 84 중 어느 하나의 방법.
실시양태 86. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 87. 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 86의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 88. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 89. 투입 무핵 세포가 항원을 포함하는 것인 실시양태 88의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 90. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및 b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 91. 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판-유래된 소포인 실시양태 86 내지 90 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 92. 적혈구-유래된 소포가 성숙적혈구-유래된 소포, 또는 망상적혈구-유래된 소포인 실시양태 91의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 93. 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 92 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 94. 항원이 CD-1 제한된 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 92 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 95. 항원이 질환-연관된 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 94 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 96. 항원이 종양 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 95 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 97. 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 96 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 98. 용해물이 종양 용해물인 실시양태 97의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 99. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 95 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 100. 항원이 미생물인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 95 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 101. 항원이 폴리펩티드인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 99 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 102. 항원이 지질 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 99 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 103. 항원이 탄수화물 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 99 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 104. 항원이 변형된 항원인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 103 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 105. 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 104의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 106. 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 105의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 107. 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 104의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 108. 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 104의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 109. 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 104의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 110. 복수의 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 전달되는 것인 실시양태 86, 87, 또는 89 내지 109 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 111. 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드 및/또는 LPS인 실시양태 87 내지 110 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 112. 아주반트가 저분자량 폴리 I:C인 실시양태 111의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 113. 투입 무핵 세포가 적혈구인 실시양태 86 내지 112 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 114. 투입 무핵 세포가 성숙적혈구인 실시양태 86 내지 112 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 115. 투입 무핵 세포가 망상적혈구인 실시양태 86 내지 112 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 116. 투입 무핵 세포가 혈소판인 실시양태 86 내지 112 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 117. 투입 무핵 세포가 포유동물 세포인 실시양태 86 내지 116 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 118. 투입 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 실시양태 86 내지 117 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 119. 투입 무핵 세포가 인간 세포인 실시양태 86 내지 117 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 120. 포유동물에의 투여 후의 무핵 세포-유래된 소포의 반감기가 포유동물에의 투여 후의 투입 무핵 세포의 반감기에 비해 감소되는 것인 실시양태 86 내지 119 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 121. 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량이 투입 무핵 세포의 헤모글로빈 함량에 비해 감소되는 것인 실시양태 86 내지 115, 또는 117 내지 120 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 122. 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산이 투입 무핵 세포의 ATP 생산에 비해 감소되는 것인 실시양태 86 내지 120 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 123. 무핵 세포-유래된 소포가 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 실시양태 113, 114, 117 내지 122 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포: (a) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기; (b) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준; (c) 구형 형태학; (d) 투입 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, (e) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
실시양태 124. 투입 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는 것인 실시양태 113, 114, 117 내지 122 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 125. 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구 고스트인 실시양태 113, 114, 117 내지 122 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 126. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는 것인 실시양태 86 내지 125 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 127. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일이 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 실시양태 86 내지 126 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 128. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%가 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 실시양태 86 내지 127 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 129. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타내는 것인 실시양태 86 내지 128 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 130. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 향상된 흡수를 나타내는 것인 실시양태 129의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 131. 무핵 세포-유래된 소포가 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 실시양태 86 내지 130 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 132. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 실시양태 131의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 133. 무핵 세포-유래된 소포가 그의 표면 상에 CD47을 포함하는 것인 실시양태 86 내지 132 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 134. 무핵 세포-유래된 소포가 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는 것인 실시양태 86 내지 133 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 135. 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 유지되는 것인 실시양태 86 내지 134 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 136. 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 200 mOsm 내지 400 mOsm에서 유지되는 것인 실시양태 86 내지 135 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 137. 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 실시양태 86 내지 136 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 138. 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 실시양태 137의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 139. 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 실시양태 138의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 140. 압박부가 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 실시양태 86 내지 139 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 141. 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 실시양태 86 내지 136 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 142. 기공에 표면에 함유되는 것인 실시양태 141의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 143. 표면이 필터인 실시양태 142의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 144. 표면이 막인 실시양태 142의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 145. 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수인 실시양태 86 내지 144 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 146. 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 실시양태 86 내지 144 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 147. 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 86 내지 146 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 148. 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 86 내지 147 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 149. 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 86 내지 147 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 150. 투입 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 실시양태 86 내지 149 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 151. 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 실시양태 86 내지 150 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 152. 복수의 실시양태 86 내지 151 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물.
실시양태 153. 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 실시양태 152의 조성물.
실시양태 154. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법.
실시양태 155. 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 154의 방법.
실시양태 156. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법.
실시양태 157. 투입 무핵 세포가 항원을 포함하는 것인 실시양태 156의 방법.
실시양태 158. a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것을 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법.
실시양태 159. 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판 유래된 소포인 실시양태 154 내지 158 중 어느 하나의 방법.
실시양태 160. 적혈구-유래된 소포가 성숙적혈구-유래된 소포 또는 망상적혈구-유래된 소포인 실시양태 159의 방법.
실시양태 161. 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 160 중 어느 하나의 방법.
실시양태 162. 항원이 CD-1 제한된 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 160 중 어느 하나의 방법.
실시양태 163. 항원이 질환-연관된 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 162 중 어느 하나의 방법.
실시양태 164. 항원이 종양 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 163 중 어느 하나의 방법.
실시양태 165. 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 164 중 어느 하나의 방법.
실시양태 166. 용해물이 종양 용해물인 실시양태 165의 방법.
실시양태 167. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 163 중 어느 하나의 방법.
실시양태 168. 항원이 미생물인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 163 중 어느 하나의 방법.
실시양태 169. 항원이 폴리펩티드인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 167 중 어느 하나의 방법.
실시양태 170. 항원이 지질 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 167 중 어느 하나의 방법.
실시양태 171. 항원이 탄수화물 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 167 중 어느 하나의 방법.
실시양태 172. 항원이 변형된 항원인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 171 중 어느 하나의 방법.
실시양태 173. 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 172의 방법.
실시양태 174. 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 173의 방법.
실시양태 175. 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 174의 방법.
실시양태 176. 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 175의 방법.
실시양태 177. 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 176의 방법.
실시양태 178. 복수의 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 전달되는 것인 실시양태 154, 155 또는 157 내지 177 중 어느 하나의 방법.
실시양태 179. 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS인 실시양태 155 내지 178 중 어느 하나의 방법.
실시양태 180. 아주반트가 저분자량 폴리 I:C인 실시양태 179의 방법.
실시양태 181. 투입 무핵 세포가 적혈구인 실시양태 154 내지 180 중 어느 하나의 방법.
실시양태 182. 투입 무핵 세포가 성숙적혈구인 실시양태 154 내지 181 중 어느 하나의 방법.
실시양태 183. 투입 무핵 세포가 망상적혈구인 실시양태 154 내지 181 중 어느 하나의 방법.
실시양태 184. 투입 무핵 세포가 혈소판인 실시양태 154 내지 180 중 어느 하나의 방법.
실시양태 185. 투입 무핵 세포가 포유동물 세포인 실시양태 154 내지 184 중 어느 하나의 방법.
실시양태 186. 투입 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 실시양태 154 내지 185 중 어느 하나의 방법.
실시양태 187. 투입 무핵 세포가 인간 세포인 실시양태 154 내지 185 중 어느 하나의 방법.
실시양태 188. 포유동물에의 투여 후의 무핵 세포-유래된 소포의 반감기가 포유동물에의 투여 후의 투입 무핵 세포의 반감기에 비해 감소되는 것인 실시양태 154 내지 187 중 어느 하나의 방법.
실시양태 189. 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량이 투입 무핵 세포의 헤모글로빈 함량에 비해 감소되는 것인 실시양태 181 내지 183, 또는 185 내지 188 중 어느 하나의 방법.
실시양태 190. 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산이 투입 무핵 세포의 ATP 생산에 비해 감소되는 것인 실시양태 181 내지 189 중 어느 하나의 방법.
실시양태 191. 무핵 세포-유래된 소포가 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 실시양태 181 내지 182 또는 185 내지 190 중 어느 하나의 방법: (a) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기; (b) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준; (c) 구형 형태학; (d) 투입 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, (e) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
실시양태 192. 투입 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는 것인 실시양태 181 내지 182 또는 185 내지 191 중 어느 하나의 방법.
실시양태 193. 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구 고스트인 실시양태 181 내지 182 또는 185 내지 192 중 어느 하나의 방법.
실시양태 194. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는 것인 실시양태 154 내지 193 중 어느 하나의 방법.
실시양태 195. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일이 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 실시양태 154 내지 194 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 196. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%가 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 실시양태 154 내지 195 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 197. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타내는 것인 실시양태 154 내지 196 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 198. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 향상된 흡수를 나타내는 것인 실시양태 197의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 199. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 실시양태 154 내지 198 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 200. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 실시양태 199의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 201. 무핵 세포-유래된 소포가 그의 표면 상에 CD47을 포함하는 것인 실시양태 154 내지 200 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 202. 무핵 세포-유래된 소포가 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는 것인 실시양태 154 내지 201 중 어느 하나의 방법.
실시양태 203. 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 유지되는 것인 실시양태 154 내지 202 중 어느 하나의 방법.
실시양태 204. 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지되는 것인 실시양태 154 내지 203 중 어느 하나의 방법.
실시양태 205. 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 실시양태 154 내지 204 중 어느 하나의 방법.
실시양태 206. 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 실시양태 205의 방법.
실시양태 207. 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 실시양태 206의 방법.
실시양태 208. 압박부가 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 실시양태 154 내지 207 중 어느 하나의 방법.
실시양태 209. 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 실시양태 154 내지 208 중 어느 하나의 방법.
실시양태 210. 기공이 표면에 함유되는 것인 실시양태 209의 방법.
실시양태 211. 표면이 필터인 실시양태 210의 방법.
실시양태 212. 표면이 막인 실시양태 210의 방법.
실시양태 213. 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수인 실시양태 154 내지 212 중 어느 하나의 방법.
실시양태 214. 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 실시양태 154 내지 213 중 어느 하나의 방법.
실시양태 215. 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 154 내지 214 중 어느 하나의 방법.
실시양태 216. 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 154 내지 215 중 어느 하나의 방법.
실시양태 217. 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 154 내지 215 중 어느 하나의 방법.
실시양태 218. 투입 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 실시양태 154 내지 217 중 어느 하나의 방법.
실시양태 219. 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 실시양태 154 내지 218 중 어느 하나의 방법.
실시양태 220. 실시양태 154 내지 219 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단을 포함하는 조성물.
실시양태 301. 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포: (a) 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소됨, (b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준, (c) 구형 형태학, (d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는 (e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산.
실시양태 302. 모 무핵 세포가 포유동물 세포인 실시양태 301의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 303. 모 무핵 세포가 인간 세포인 실시양태 301 또는 302의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 304. 모 무핵 세포가 적혈구 또는 혈소판인 실시양태 301 내지 303 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 305. 적혈구가 성숙적혈구 또는 망상적혈구인 실시양태 304의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 306. 포유동물에서의 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소되는 것인 실시양태 301 내지 305 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 307. 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 초과 감소되는 것인 실시양태 306의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 308. 모 무핵 세포가 인간 세포이고, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기가 약 1분, 약 2분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 10일, 약 25일, 약 50일, 약 75일, 약 100일, 약 120일 미만인 실시양태 307의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 309. 모 무핵 세포가 적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준이 모 무핵 세포에 비해 감소되는 것인 실시양태 301 내지 308 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 310. 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준이 모 무핵 세포에 비해 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99% 또는 약 100% 감소되는 것인 실시양태 309의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 311. 무핵 세포-유래된 소포에서의 헤모글로빈 수준이 모 무핵 세포에서의 헤모글로빈의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%인 실시양태 309의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 312. 모 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 형태학에 있어서 구형인 실시양태 301 내지 311 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 313. 모 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는 것인 실시양태 301 내지 311 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 314. 모 무핵 세포가 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구 고스트 (RBC 고스트)인 실시양태 301 내지 311 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 315. 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준을 갖는 것인 실시양태 301 내지 312 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 316. 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는 것인 실시양태 315의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 317. 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99%, 약 100% 또는 약 100% 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는 것인 실시양태 315의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 318. 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 갖는 것인 실시양태 301 내지 317 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 319. 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 의해 생산된 ATP의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 미만의 수준에서 ATP를 생산하는 것인 실시양태 318의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 320. 무핵 세포-유래된 소포가 ATP를 생산하지 않는 것인 실시양태 319의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 321. 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 실시양태 301 내지 20 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 322. 무핵 세포-유래된 소포가 모 무핵 세포의 흡수에 비해 간 또는 비장에서 또는 포식 세포 또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 실시양태 321의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 323. 무핵 세포-유래된 소포가 그의 표면 상에 CD47을 포함하는 것인 실시양태 301 내지 320 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 324. 모 무핵 세포가 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않은 것인 실시양태 301 내지 319 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 325. 오스몰농도가 모 무핵 세포로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 유지된 것인 실시양태 301 내지 324 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 326. 오스몰농도가 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm에서 유지된 것인 실시양태 325의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 327. 오스몰농도가 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지된 것인 실시양태 325 또는 326의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 328. 무핵 세포-유래된 소포가 투입 모 무핵 세포를 포함하는 현탁액을 세포 변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 무핵 세포의 섭동을 유발하고; 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 301 내지 327 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 329. 무핵 세포-유래된 소포가 탑재물을 포함하는 것인 실시양태 301 내지 328 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 330. 탑재물이 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 소분자, 복합체, 나노입자인 실시양태 329의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 331. 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 탑재물이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 탑재물과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 탑재물을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 329의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 332. 무핵 세포-유래된 소포가 항원을 포함하는 것인 실시양태 301 내지 331 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 333. 무핵 세포-유래된 소포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 301 내지 332 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 334. 무핵 세포-유래된 소포가 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함하는 것인 실시양태 301 내지 332 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 335. 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 332의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 336. 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 333의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 337. 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 333의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 338. 무핵 세포-유래된 소포가 항원 및 면역관용성 인자를 포함하고, 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 면역관용성 인자가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 면역관용성 인자와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 334의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 339. 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 실시양태 328 내지 338 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 340. 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 실시양태 339의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 341. 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 실시양태 340의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 342. 압박부가 복수의 미세기둥 사이에, 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에, 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 실시양태 328 내지 341 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 343. 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 실시양태 328 내지 338 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 344. 기공이 표면에 함유되는 것인 실시양태 343의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 345. 표면이 필터인 실시양태 344의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 346. 표면이 막인 실시양태 344의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 347. 압박부 크기가 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 실시양태 328 내지 346 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 348. 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 328 내지 346 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 349. 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 328 내지 346 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 350. 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 328 내지 346 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 351. 투입 모 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 실시양태 328 내지 350 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 352. 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 탑재물과 접촉되는 것인 실시양태 328 내지 351 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 353. 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 실시양태 332 내지 352 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 354. 항원이 질환-연관된 항원인 실시양태 332 내지 353 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 355. 항원이 종양 항원인 실시양태 332 내지 354 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 356. 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 실시양태 332 내지 354 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 357. 항원이 이식편 용해물로부터 유래되는 것인 실시양태 356의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 358. 용해물이 종양 용해물인 실시양태 356의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 359. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 332 내지 358 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 360. 바이러스 항원이 바이러스, 바이러스 입자, 또는 바이러스 캡시드인 실시양태 359의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 361. 항원이 미생물인 실시양태 332 내지 354 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 362. 항원이 폴리펩티드인 실시양태 332 내지 361 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 363. 항원이 지질 항원인 실시양태 332 내지 361 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 364. 항원이 탄수화물 항원인 실시양태 332 내지 361 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 365. 항원이 변형된 항원인 실시양태 332 내지 361 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 366. 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 365의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 367. 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 366의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 368. 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 366의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 369. 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 366의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 370. 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 366의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 371. 복수의 항원이 무핵 세포에 전달되는 것인 실시양태 332 내지 370 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 372. 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 지질다당류 (LPS)인 실시양태 333, 336, 337, 및 339 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 373. 복수의 실시양태 301 내지 372 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물.
실시양태 374. 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
실시양태 375. 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포의 집단으로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
실시양태 376. 모 무핵 세포가 포유동물 세포인 실시양태 374 또는 375의 조성물.
실시양태 377. 모 무핵 세포가 인간 세포인 실시양태 374 내지 376 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 378. 모 무핵 세포가 적혈구 또는 혈소판인 실시양태 374 내지 377 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 379. 적혈구가 성숙적혈구 또는 망상적혈구인 실시양태 378의 조성물.
실시양태 380. 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 순환 반감기가 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소되는 것인 실시양태 374 내지 378 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 381. 포유동물에서의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 순환 반감기가 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 초과 감소되는 것인 실시양태 380의 조성물.
실시양태 382. 모 무핵 세포가 인간 세포이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 순환 반감기가 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 10일 미만인 실시양태 381의 조성물.
실시양태 383. 모 무핵 세포가 적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 헤모글로빈 수준이 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소되는 것인 실시양태 374 내지 382 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 384. 무핵 세포-유래된 소포의 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 헤모글로빈 수준이 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99% 또는 약 100% 감소되는 것인 실시양태 383의 조성물.
실시양태 385. 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20%의 헤모글로빈 수준이 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에서의 헤모글로빈의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%인 실시양태 384의 조성물.
실시양태 386. 모 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 형태학에 있어서 구형인 실시양태 374 내지 385 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 387. 모 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는 것인 실시양태 374 내지 385 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 388. 모 무핵 세포가 적혈구 또는 성숙적혈구이고, 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 적혈구 고스트인 실시양태 374 내지 386 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 389. 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 표면 포스파티딜세린을 포함하는 것인 실시양태 374 내지 388 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 390. 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준을 포함하는 것인 실시양태 374 내지 389 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 391. 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 복수의 모 무핵 세포를 포함하는 조성물에 비해 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 99%, 약 100% 또는 약 100% 초과 더 높은 표면 포스파티딜세린 수준을 갖는 것인 실시양태 390의 조성물.
실시양태 392. 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 ATP 생산을 갖는 것인 실시양태 374 내지 391 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 393. 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포 또는 모 무핵 세포의 집단의 평균에 의해 생산되는 ATP의 수준의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 미만에서 ATP를 생산하는 것인 실시양태 392의 조성물.
실시양태 394. 무핵 세포-유래된 소포가 ATP를 생산하지 않는 것인 실시양태 393의 조성물.
실시양태 395. 모 무핵 세포가 조성물의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않은 것인 실시양태 374 내지 393 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 396. 오스몰농도가 모 무핵 세포로부터의 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 유지된 것인 실시양태 301 내지 324 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 397. 오스몰농도가 약 200 mOsm 내지 약 600 mOsm에서 유지된 것인 실시양태 396의 조성물.
실시양태 398. 오스몰농도가 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지된 것인 실시양태 396 또는 397의 조성물.
실시양태 399. 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 투입 모 무핵 세포를 포함하는 현탁액을 세포 변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 무핵 세포의 섭동을 유발하고; 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 374 내지 398 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 400. 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 탑재물을 포함하는 것인 실시양태 374 내지 399 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 401. 탑재물이 치료 탑재물인 실시양태 400의 조성물.
실시양태 402. 탑재물이 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물 소분자, 복합체, 나노입자인 실시양태 400의 조성물.
실시양태 403. 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 탑재물이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 탑재물과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 탑재물을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 402의 조성물.
실시양태 404. 무핵 세포-유래된 소포가 항원을 포함하는 것인 실시양태 374 내지 403 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 405. 무핵 세포-유래된 소포가 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 374 내지 404 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 406. 무핵 세포-유래된 소포가 항원 및 면역관용성 인자를 포함하는 것인 실시양태 374 내지 404 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 407. 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 404의 조성물.
실시양태 408. 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 405의 조성물.
실시양태 409. 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 항원 및 아주반트를 포함하고, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 405의 조성물.
실시양태 410. 조성물이 항원 및 면역관용성 인자를 포함하고, 조성물의 무핵 세포-유래된 소포가 (a) 투입 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 면역관용성 인자가 통과하기에 충분히 큰 투입 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고; (b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 면역관용성 인자가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 면역관용성 인자와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 것인 실시양태 406의 조성물.
실시양태 411. 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 실시양태 399, 403, 및 407 내지 410 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 412. 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 실시양태 384의 조성물.
실시양태 413. 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 실시양태 412의 조성물.
실시양태 414. 압박부가 복수의 미세기둥 사이에, 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에, 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 실시양태 400 내지 413 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 415. 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 실시양태 399, 403, 및 407 내지 410 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 416. 기공이 표면에 함유되는 것인 실시양태 415의 조성물.
실시양태 417. 표면이 필터인 실시양태 416의 조성물.
실시양태 418. 표면이 막인 실시양태 416의 조성물.
실시양태 419. 압박부 크기가 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 실시양태 399 내지 418 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 420. 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 399 내지 419 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 421. 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 399 내지 420 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 422. 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 399 내지 420 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 423. 투입 모 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 실시양태 399 내지 422 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 424. 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 실시양태 399 내지 423 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 425. 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 실시양태 404 내지 424 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 426. 항원이 질환-연관된 항원인 실시양태 404 내지 425 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 427. 항원이 종양 항원인 실시양태 404 내지 426 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 428. 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 실시양태 404 내지 427 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 429. 용해물이 이식편 용해물인 실시양태 428의 조성물.
실시양태 430. 용해물이 종양 용해물인 실시양태 428의 조성물.
실시양태 431. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 404 내지 426 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 432. 항원이 미생물인 실시양태 404 내지 426 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 433. 항원이 폴리펩티드인 실시양태 404 내지 432 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 434. 항원이 지질 항원인 실시양태 404 내지 433 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 435. 항원이 탄수화물 항원인 실시양태 404 내지 433 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 436. 항원이 변형된 항원인 실시양태 404 내지 433 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 437. 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 436의 조성물.
실시양태 438. 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 437의 조성물.
실시양태 439. 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 437의 조성물.
실시양태 440. 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 437의 조성물.
실시양태 441. 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 실시양태 437의 조성물.
실시양태 442. 복수의 항원이 무핵 세포에 전달되는 것인 실시양태 404 내지 441 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 443. 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS인 실시양태 405, 408, 409, 및 411 내지 442 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 444. 조성물이 제약 조성물인 실시양태 373 내지 443 중 어느 하나의 조성물.
실시양태 445. 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고, 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법: (a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐, (b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐, (c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐, (d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임, (e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는 (f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐.
실시양태 446. 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 실시양태 445의 방법.
실시양태 447. 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 실시양태 446의 방법.
실시양태 448. 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 실시양태 447의 방법.
실시양태 449. 압박부가 복수의 미세기둥 사이에, 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에, 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 실시양태 445 내지 448 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포.
실시양태 450. 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 실시양태 446 또는 447의 방법.
실시양태 451. 기공이 표면에 함유되는 것인 실시양태 450의 방법.
실시양태 452. 표면이 필터인 실시양태 451의 방법.
실시양태 453. 표면이 막인 실시양태 451의 방법.
실시양태 454. 압박부 크기가 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 실시양태 445 내지 453 중 어느 하나의 방법.
실시양태 455. 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 445 내지 454 중 어느 하나의 방법.
실시양태 456. 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 445 내지 454 중 어느 하나의 방법.
실시양태 457. 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 실시양태 445 내지 454 중 어느 하나의 방법.
실시양태 458. 투입 모 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 150 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 실시양태 445 내지 457 중 어느 하나의 방법.
실시양태 459. 상기 세포 현탁액이 탑재물이 세포에 진입하도록 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 탑재물과 접촉되는 것인 실시양태 445 내지 458 중 어느 하나의 방법.
실시양태 460. 탑재물이 치료 탑재물인 실시양태 459의 방법.
실시양태 461. 탑재물이 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물 소분자, 복합체, 또는 나노입자인 실시양태 459 또는 460의 방법.
실시양태 462. 탑재물이 항원 및/또는 아주반트인 실시양태 459 내지 461 중 어느 하나의 방법.
실시양태 463. 탑재물이 항원 및/또는 면역관용성 인자인 실시양태 459 내지 461 중 어느 하나의 방법.
실시양태 464. 실시양태 301 내지 372 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
실시양태 465. 실시양태 373 내지 444 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
실시양태 466. 무핵 세포-유래된 소포가 치료 탑재물을 포함하는 것인 실시양태 464 또는 465의 방법.
실시양태 467. 개체가 암을 갖고, 탑재물이 항원을 포함하는 것인 실시양태 466의 방법.
실시양태 468. 개체가 암을 갖고, 탑재물이 항원 및 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 466 또는 467의 방법.
실시양태 469. 항원이 종양 항원인 실시양태 467 또는 468의 방법.
실시양태 470. 개체가 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 갖고, 탑재물이 항원을 포함하는 것인 실시양태 466의 방법.
실시양태 471. 개체가 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환을 갖고, 탑재물이 항원 및 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 466 또는 470의 방법.
실시양태 472. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 471의 방법.
실시양태 473. 개체가 자가면역 질환을 갖고, 탑재물이 항원을 포함하는 것인 실시양태 466의 방법.
실시양태 474. 개체가 자가면역 질환을 갖고, 탑재물이 항원 및/또는 면역관용성 인자를 포함하는 것인 실시양태 466 또는 473의 방법.
실시양태 475. 실시양태 301 내지 372 중 어느 하나의 무핵 세포-유래된 소포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법.
실시양태 476. 실시양태 373 내지 444 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법.
실시양태 477. 무핵 세포-유래된 소포가 항원을 포함하는 것인 실시양태 475 또는 476의 방법.
실시양태 478. 개체가 암을 갖고, 탑재물이 항원 및 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 475 또는 476의 방법.
실시양태 479. 질환 또는 장애가 암이고, 항원이 종양 항원인 실시양태 477 또는 478의 방법.
실시양태 480. 개체가 감염성 질환을 갖고, 탑재물이 항원을 포함하는 것인 실시양태 477 또는 478의 방법.
실시양태 481. 개체가 감염성 질환을 갖고, 탑재물이 항원 및 아주반트를 포함하는 것인 실시양태 477 또는 478의 방법.
실시양태 482. 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 실시양태 481의 방법.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하는 목적을 위해 주어지며, 본 개시내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의미되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 목적을 수행하고, 언급된 목표 및 이점, 뿐만 아니라 본원에 내재하는 그러한 목적, 목표 및 이점을 얻도록 잘 적응됨을 용이하게 인식할 것이다. 청구항의 범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 개시내용의 정신 내에 포함되는 그 안의 변화 및 다른 용도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다.
실시예 1
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
생체내 항원-특이적 면역 반응을 결정하기 위해, 표 1에서의 조건에 따라 처리된 세포-유래된 소포, 예컨대 모델 항원 및/또는 아주반트로 로딩된 적혈구-유래된 소포를 마우스에게 투여하고, 그 후 항원-특이적 T 세포의 수 및 염증성 시토카인, IFN-γ 및 IL-2의 수준을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 구체적으로, 적혈구 (RBC)를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, 표 1에 상세화된 군 A 내지 H (5마리의 마우스/군)에 따라, 유리 Ova (10 μg/마우스) 및/또는 폴리 I:C (25 μg/마우스)로의 전신 처리와 함께 또는 없이, 형광-태그부착된 IgG 항체 (IgG488, 20 μg/mL), Ova 단백질 (200 μg/mL), 및/또는 폴리이노신산:폴리시티딜산 (폴리 I:C) (300 μg/mL)으로 세포내로 로딩하였다. 표 1에서, RBC 뒤의 괄호 안의 조건은 세포내 화물을 지시하고, RBC 뒤의 괄호 밖의 조건은 전신으로 공동-투여되었다 (즉, 세포내 화물이 아님).
RBC로 투여된 군은 1억 5천만 (M)개의 RBC의 용량을 받았다. 음성 대조군 동물은 Ova (200 μg/mL)와 함께 인큐베이션되고, 세척되고, 유리 폴리 I:C로 마우스 내로 공동-주사되거나 (엔도 + 폴리 I:C) (군 A); 항체 단독으로 로딩되거나 (RBC (IgG488) (군 B); 항체 및 항원으로 로딩된 (RBC (IgG488+Ova) (군 D) 150M개의 RBC를 받았다. 양성 대조군 동물은 항체 단독으로 로딩되고, 유리 Ova 및 폴리 I:C로 공동-투여된 150M개의 RBC (RBC (IgG488) + Ova + 폴리 I:C) (군 C); 또는 Ova의 최소 에피토프 (SIINFEKL - 1 μg/mL)로 펄싱된 1M개의 수지상 세포 (DC) (군 H)를 받았다. 제0일에, 각각의 처리 조건에 대해 각각의 조성물을 수용자 C57BL/6J 마우스에게 입양 전달하였다. 제7일에, 하기 설명에 따라, 비장을 수확하고, Ova-특이적 사량체에 대해 SIINFEKL (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ 및 IL-2에 대해 세포내 시토카인 염색 (ICS)으로 처리하였다.
표 1. 처리 군.
*RBC 뒤의 괄호 안의 조건은 세포내 화물을 지시하고; RBC 뒤의 괄호 밖의 조건은 전신으로 공동-투여되었다.
결과
항원-특이적 T 세포의 수를 상기 논의된 바와 같이 사량체 염색을 통해 측정하였다. 군 F (RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C), 군 G (RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C)), 및 양성 대조군 펄싱된 DC (군 H)는 Ova-반응성 T 세포의 통계적으로 유의한 증가를 유도하였다 (도 1a). 이들 데이터는 아주반트가 공동-캡슐화되거나 전신으로 투여되면서, 항원 및 아주반트가 사량체 염색에 의해 결정된 바와 같은 항원-특이적 반응을 유도할 것에 대한 요구가 있음을 나타내었다. IFN-γ를 갖는 세포의 백분율은 군 F (RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C) 및 군 H (펄싱된 DC)에서 유의하게 증가된 반면, 또한 군 G (RBC (IgG488+Ova+폴리 I:C))에서 약간 통계적으로 비유의한 증가가 있었다 (도 1b). 세포 당 IFN-γ의 양은 IFN-γ+ 세포의 %에서 관찰된 바와 같이 동일한 군에서 통계적으로 유의한 방식으로 증가한 반면 (군 F 및 H), 또한 군 C (RBC (IgG488) + Ova + 폴리 I:C) 및 군 G (RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C)에서 유의한 증가가 있었다 (도 1c). IFN-γ로 관찰된 경향과 유사하게, IL-2+ 세포의 백분율은 펄싱된 DC (군 H) 및 RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C (군 F)에서 단지 유의하게 증가되었다 (도 1d). 세포 당 IL-2의 수준은 펄싱된 DC (군 H) 및 RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C (군 F), 뿐만 아니라 RBC (IgG488) + Ova + 폴리 I:C (군 C) 및 RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C) (군 G) 조건에서 유의하게 증가되었으며, 이는 세포 당 IFN-γ의 양으로 관찰된 것과 동일한 경향이다 (도 1e). 함께 취해져, 이들 데이터는 무핵 세포-유래된 소포가 항원 및 아주반트 (캡슐화되거나 그렇지 않음)에 대한 요구를 가지면서, 항원-특이적 반응을 유도할 수 있으며, 가장 양호한 반응은 RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C 조건 (군 F)에서 관찰되었음을 나타낸다. 모든 비교는 엔도 + 폴리 I:C 음성 대조군 (군 A)에 대해 이루어졌다 (5마리의 마우스/군, *P<0.05, **P<0.01, #P<0.005).
실시예 2
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 상이한 용량이 다양한 수준의 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 구체적으로, 로딩된 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 보다 높은 용량은 보다 큰 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.
물질 및 방법
생체내 항원-특이적 면역 반응을 결정하기 위해, 표 2에서의 조건에 따라 처리된 세포-유래된 소포, 예컨대 모델 항원 및/또는 아주반트로 로딩된 적혈구-유래된 소포를 마우스에게 투여하고, 그 후 항원-특이적 T 세포의 수 및 염증성 시토카인, IFN-γ 및 IL-2의 수준을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 구체적으로, 적혈구 (RBC)를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, 표 2에 상세화된 군 (5마리의 마우스/군)에 따라, 유리 Ova (10 μg/마우스) 및/또는 폴리 I:C (25 μg/마우스)로의 전신 처리와 함께 또는 없이, 형광-태그부착된 IgG 항체 (IgG488, 20 μg/mL), Ova 단백질 (200 μg/mL) 및/또는 폴리 I:C (300 μg/mL)로 로딩하였다. 표 2에서 RBC 뒤의 괄호 안의 조건은 세포내 화물을 지시하고, RBC 뒤의 괄호 밖의 조건은 전신으로 공동-투여되었다 (즉, 세포내 화물이 아님).
로딩된 및 전신으로 투여된 유리 항원 및 아주반트의 다양한 조합을 비교하였다. 음성 대조군 동물은 Ova (200 μg/mL)와 함께 인큐베이션되고, 세척되고, 유리 폴리 I:C로 마우스 내로 공동-주사된 (엔도 + 폴리 I:C) 150M개의 적혈구를 받았다 (군 I). 양성 대조군 동물은 Ova의 최소 에피토프 (SIINFEKL - 1 μg/mL)로 펄싱된 1M개의 수지상 세포 (DC)를 받았다 (군 N). 제0일에, 로딩된 무핵 세포-유래된 소포, 인큐베이션된 적혈구, 또는 수지상 세포를 수용자 C57BL/6J 마우스에 입양 전달하였다. 제7일에, 비장을 수확하고, Ova-특이적 사량체에 대해 SIINFEKL (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ 및 IL-2에 대해 세포내 시토카인 염색 (ICS)으로 처리하였다.
표 2. 처리 군.
*RBC 뒤의 괄호 안의 조건은 세포내 화물을 지시하고; RBC 뒤의 괄호 밖의 조건은 전신으로 공동-투여되었다.
결과
RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C (군 K) 및 양성 대조군 펄싱된 DC (군 N)는 Ova-반응성 T 세포의 통계적으로 유의한 증가를 유도하였다 (도 2a). 무핵 세포-유래된 소포가 단지 항체만을 함유하였고, 유리 Ova 및 폴리 I:C로 공동-투여된 조건 (RBC (IgG488) + Ova + 폴리 I:C; 군 J), 뿐만 아니라 항체, Ova, 및 폴리 I:C를 함유하는 소포 (RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C))는 1억5천만개의 세포/동물 (군 L) 및 10억 (B)개의 세포/동물 (군 M) 둘 다에서 Ova-특이적 T 세포의 백분율의 약간 그러나 통계적으로 비유의한 증가를 나타내었다 (도 2a). 흥미롭게도, 로딩된 소포의 보다 높은 용량 (1B개의 RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C) (군 M))은 보다 낮은 150M개의 용량 (군 L)에 비해 더 낮은 내인성 반응을 발생시켰다. IFN-γ+ 세포의 백분율은 사량체 데이터와 유사하게 경향화되었으며, 단지 펄싱된 DC 양성 대조군 (군 N) 및 RBC (IgG488 + Ova) + 폴리 I:C (군 K) 조건만이 IFN-γ+ 세포의 비율의 유의한 증가를 발생시켰다 (도 2b). 또한, RBC의 보다 낮은 용량 (IgG488 + Ova + 폴리 I:C) (군 L)에서 IFN-γ+ 세포의 백분율의 약간의 증가가 있었지만, 이는 유의하지 않았다 (도 2b). 그러나, IL-2+ 세포의 백분율은 양성 대조군에서 단지 유의하게 증가하였다 (도 2c). 함께 취해져, 이들 데이터는 가장 양호한 반응이 항원 및 유리 폴리 I:C의 전신 공동-투여로 로딩된 소포로 얻어졌으며, 예상치 않게, 항원 + 아주반트 로딩된 소포의 보다 높은 용량 (1B개) (군 M)이 보다 낮은 내인성 반응을 발생시켰음을 나타낸다. 모든 비교는 엔도 + 폴리 I:C 음성 대조군 (군 I)에 대해 이루어졌다 (5마리의 마우스/군, *P<0.05, **P<0.01, #P<0.005).
실시예 3
이 실시예는, 부분적으로, 생체내 항원-특이적 면역 반응에 대한 상이한 아주반트 또는 투여 전략을 사용하는 것의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
생체내 항원-특이적 면역 반응을 결정하기 위해, 표 3에서의 조건에 따라 처리된 세포-유래된 소포, 예컨대 모델 항원 및/또는 아주반트로 로딩된 적혈구-유래된 소포를 마우스에게 투여하고, 그 후 항원-특이적 T 세포의 수 및 염증성 시토카인, IFN-γ 및 IL-2의 수준을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 구체적으로, 적혈구를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, 표 3에 상세화된 바와 같은 군 (5마리의 마우스/군)에 따라, 형광-태그부착된 IgG 항체 (IgG488, 20 μg/mL), Ova 단백질 (200 μg/mL) 및/또는 아주반트 (어느 하나의 폴리 I:C (300 또는 3000 μg/mL), 지질다당류 (LPS, 300 μg/mL), 또는 R848 (100 μg/mL))로 다양한 용량 및 프라임-부스트 스케줄에서 로딩하였다.
표 3. 처리 군.
*RBC 뒤의 괄호 안의 조건은 세포내 화물을 지시하고; RBC 뒤의 괄호 밖의 조건은 전신으로 공동-투여되었다.
음성 대조군 동물은 Ova (200 μg/mL)와 함께 인큐베이션되고, 세척되고, 유리 폴리 I:C로 마우스 내로 공동-주사된 적혈구를 받았다 (엔도 + 폴리 I:C) (군 O). 제0일에, RBC-로딩된 무핵 세포-유래된 소포, 인큐베이션된 적혈구 또는 수지상 세포를 수용자 C57BL/6J 마우스에 입양 전달하였다. 제2일에, 군 R (RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C) + 부스트)은 150M개의 RBC (Ova + 폴리 I:C) 로딩된 소포의 제2 (부스트) 용량을 받았다. 제7일에, 비장을 수확하고, Ova-특이적 사량체에 대해 SIINFEKL (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ 및 IL-2에 대해 세포내 시토카인 염색 (ICS)으로 처리하였다.
결과
항원-특이적 T 세포의 수를 사량체 염색에 의해 측정하였으며, 단지 군 R, 부스팅된 조건 (RBC (IgG488 + Ova + 폴리 I:C) + 부스트) 및 군 S, 고 용량 아주반트 (RBC (IgG488 + Ova + 고 용량 폴리 I:C))만이 엔도 대조군에 비해 Ova-반응성 T 세포의 통계적으로 유의한 증가를 생성하였다 (도 3a). 사량체 염색으로 관찰된 경향은 ICS에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ에 대해 양성인 세포의 백분율에 의해 추가로 뒷받침되었으며, 동일한 조건은 대조군에 비해 IFN-γ의 %의 통계적으로 유의한 증가를 생성하였다 (도 3b). 이 경향은 또한 IL-2 ICS를 통한 부스팅된 조건에 대해 관찰되었지만, 고 용량 폴리 I:C 조건은 단지 IL-2+ 세포의 비율의 보통의 통계적으로 비유의한 증가를 발생시켰다 (도 3c). 함께 취해져, 이들 데이터는 아주반트 폴리 I:C를 사용하는 것이 가장 높은 내인성 반응을 발생시켰으며, 제2일에 제2 부스터의 사용은 심지어 Ova 및 10배 더 높은 용량의 폴리 I:C를 포함하는 소포의 단일 투여에 비해 훨씬 더 높은 반응을 발생시켰음을 나타낸다. 모든 비교는 엔도 + 폴리 I:C 음성 대조군 (군 O)에 대해 이루어졌다 (5마리의 마우스/군, *P<0.05, **P<0.01, #P<0.005).
실시예 4
그들의 무핵 세포-유래된 소포 대응물에 비해 정상적인 무핵 세포의 대사 활성을 결정하기 위해, RBC 및 RBC-유래된 소포의 해당작용의 수준은 형광 효소 검정을 사용하여 락테이트 생산의 수준을 모니터링함으로써 시간 경과에 따라 간접적으로 측정될 수 있다. RBC 대사 활성은 해당작용을 통한 락테이트의 생성에 의해 측정될 수 있다. 미토콘드리아 없이, 해당작용은 RBC가 외부 막 첨판 상의 포스파티딜세린을 세포내 막 첨판으로 다시 플립하는데 요구되는 ATP를 만드는 유일한 방법이다. ATP의 결여는 RBC가 세포 표면 포스파티딜세린을 기저 수준으로 다시 되돌릴 수 없음을 의미한다.
물질 및 방법
인간 RBC를 피콜(Ficoll) 분리에 의해 전혈로부터 얻고, 10억개의 세포/mL로 아데닌을 갖는 시트레이트-포스페이트-덱스트로스 (dCPDA-1) 완충액에 재현탁시키고, 형광-표지된 래트 IgG (20 μg/mL)를 실온에서 SQZ (50 psi에서 2.2 μm 압박부 폭)를 통해 전달하여 IgG를 포함하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 지시된 시점 동안 인큐베이션하고, 상청액을 수집하였다. RBC 및 RBC-유래된 소포에 의해 생산된 락테이트의 수준을 정량화하기 위해, 락테이트-글로 검정 (프로메가)을 채용하여 각각의 시점으로부터의 상청액을 검정하였다. 간략하게, 상청액을 불활성화 및 중화 단계로 처리한 후, 형광 락테이트 검출 시약을 첨가하였다. 형광을 블랭크 대조군에 대해 정규화하고, 상청액에서의 절대 락테이트 수준을 락테이트 표준 곡선 (0.1 내지 10 μM)을 사용하여 결정하였다.
결과
SQZ에 의해 생성된 인간 RBC-유래된 소포는 4시간 및 21시간 둘 다에서 유의하게 더 낮은 수준의 락테이트 생산을 나타내었다 (도 4). 4시간에서, SQZ에 의해 생성된 RBC-유래된 소포 (SQZ)는 비처리된 RBC (No SQZ)에 비해 락테이트 생산의 ∼5배 감소를 가졌으며, 이는 감소된 대사 활성 및 ATP 생성을 지시한다 (좌측 막대, #P<0.005). 심지어 연장된 회수 시간 (21시간) 후, SQZ에 의해 생성된 RBC-유래된 소포 (SQZ)는 No SQZ에 비해 유의하게 더 낮은 (2배; 우측 막대, *P<0.05) 양의 락테이트 생산을 가졌다. 함께 취해져, 이들 데이터는 SQZ에 의해 로딩된 RBC-유래된 소포가 유의하게 변경된 대사 잠재성을 가짐을 나타낸다.
실시예 5
이 실시예는, 부분적으로, 무핵 세포-유래된 소포의 형태학 및 표면 포스파티딜세린 수준에 대한 SQZ-매개된 로딩의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
무핵 세포-유래된 소포의 형태학 및 표면 포스파티딜세린 수준에 대한 SQZ-매개된 전달의 영향을 정량화하기 위해, 적혈구 (RBC)-유래된 소포를 형광-태그부착된 항원으로 로딩하고, 수용자 마우스 내로 주사하고, 이어서 시간 경과에 따라 계열 채혈하였다. 그 후, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 혈액에서의 형광 신호의 존속으로부터 결정하였다. 구체적으로, 적혈구 (RBC)를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, 비처리된 채 방치하거나 (Untrtd), 형광-태그부착된 (D-FITC) 3 kDa 덱스트란 (200 μg/mL- No SQZ)의 존재 하에서 인큐베이션하거나, SQZ-매개된 로딩에 의해 프로세싱하여 덱스트란으로 로딩된 RBC-유래된 소포를 생성하였다 (SQZ). 각각의 조건에 의해 생성된 세포 또는 소포를 셀트레이스 바이올렛®(CT), 막 표지화 염료로 염색하였다. 각각의 조건으로부터의 샘플을 이미지스트림(ImageStream)® 분석에 의해 평가하여 형태학적 변화를 결정하였다.
형태학 및 표면 포스파티딜세린 수준에 대한 SQZ-매개된 전달의 영향을 정량화하기 위해, 상기 제조된 덱스트란 인큐베이션된 RBC를 CaCl2 완충액 (0.4 mM)을 함유하는 RPMI에서 37℃에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션하고, 이어서 포스파티딜세린 표면 제시를 유도하는 것으로 공지된 조건인 이노마이신 (8 μM)으로 30분 동안 처리하였다 (양성 대조군, +ctrl을 발생시킴). 그 후, Untrt, +ctrl 및 No SQZ 샘플로부터의 세포, 뿐만 아니라 SQZ-로딩된 소포 (SQZ)를 아넥신(Annexin) V로 염색하고, 표면 포스파티딜세린의 수준을 유동 세포계측법에 의해 병렬로 측정하였다.
결과
이미지스트림 분석의 결과는 비처리된 채 방치된 (Untrt) 또는 SQZ의 부재 하에서 덱스트란과 함께 인큐베이션된 (No SQZ) RBC가 명시야 하에서 화상화된 경우 RBC와 통상적으로 연관된 양요형 형상을 유지하였음을 나타낸다 (도 5a). 그러나, SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포는 형태학에 있어서 뚜렷한 변화를 나타내었으며, 이는 명시야 화상화에 의해 나타내어진 바와 같은 일반적으로 보다 구형 형상을 나타내었다. 추가적으로, 단지 SQZ-로딩된 소포 (SQZ)만이 형광-태그부착된 덱스트란 (D-FITC)으로부터의 형광 신호를 나타내었지만, 비처리된 (Untrtd) 또는 인큐베이션된 RBC (No SQZ)는 그렇지 않았으며, 이는 전달이 단지 SQZ-매개된 로딩으로만 달성되었음을 지시한다. 모든 조건에서의 샘플은 지질 이중층의 존재를 나타내는 셀트레이스 바이올렛®에 대해 양성이었다.
상기 기재된 RBC 또는 RBC-유래된 소포를 또한 RBC-유래된 소포에서의 막 스크램블링의 마커인 표면 포스파티딜세린 수준에 대해 시험하였다 (도 5b). 비처리된 (Untrt) 및 인큐베이션된 RBC (No SQZ)와 비교할 경우, SQZ-로딩된 소포 (SQZ)는 유의하게 더 높은 수준의 포스파티딜세린 염색을 나타내었으며, SQZ 프로세싱이 없는 RBC에 대해 <5%에 비해, SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에서 아넥신 V에 대해 양성인 세포는 >80%였다. SQZ 조건에서의 보다 높은 수준의 표면 포스파티딜세린에 대해 양성인 세포의 백분율은 양성 대조군 (+ctrl)으로 나타난 것들과 유사하였다. 전체적으로, 이들 데이터는 SQZ-매개된 전달이 표면 포스파티딜세린 수준을 유의하게 증가시키면서, RBC-유래된 소포의 효율적인 로딩, 투입 RBC로부터의 형태학의 주목할 만한 조정을 발생시켰음을 지시한다.
실시예 6
이 실시예는, 부분적으로, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기에 대한 SQZ-매개된 로딩의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기에 대한 SQZ-매개된 전달의 영향을 정량화하기 위해, 적혈구-유래된 소포를 형광-태그부착된 항원으로 로딩하고, 수용자 마우스 내로 주사하고, 이어서 시간 경과에 따라 계열 채혈하였다. 그 후, 무핵 세포-유래된 소포의 반감기를 혈액에서의 형광 신호의 존속으로부터 결정하였다. 구체적으로, 도 6a에 개요된 바와 같이, 적혈구 (RBC)를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, SQZ 로딩으로 프로세싱하여 형광-태그부착된 Ova 단백질 (Ova-647 - 200 μg/mL)을 갖는 RBC-유래된 소포를 생성하였다 (3마리의 마우스/군). 0분에서, Ova-로딩된 RBC-유래된 소포 (2억개의 소포/동물)를 CFSE로 염색하였다. 비-SQZ 대조군으로서 사용된 동등한 양의 RBC를 셀트레이스 바이올렛으로 염색하였다. CFSE-염색된 OVA-로딩된 RBC-유래된 소포 및 셀트레이스 바이올렛-염색된 RBC를 혼합하고, 수용자 C57BL/6J 마우스에 입양 전달하였다. 5, 30, 60 및 240분에, 혈액을 각각의 마우스의 꼬리 정맥으로부터 수집하고, 순환하는 형광-태그부착된 RBC-유래된 소포 뿐만 아니라 바이올렛 염색된 RBC의 수를 유동 세포계측법에 의해 정량화하였다.
결과
순환에서의 CFSE 양성 RBC-유래된 소포 (항원으로 SQZ-로딩됨)의 수준은 제1 시점 (5분)까지 유의하게 강하하였으며, 15분까지 거의 비검출가능하였다 (도 6b). 그러나, SQZ-프로세싱되지 않았지만, 셀트레이스 바이올렛®으로 로딩된 RBC는 플롯팅된 시간 과정에 걸쳐 유사한 수준에서 지속하였다 (도 6b). 반복된 채혈을 플롯팅된 시간 초과로 수행하였으며, SQZ 프로세싱된 RBC-유래된 소포 및 비-SQZ RBC 둘 다의 상대적 수준이 약 1시간 후에 일반적으로 안정한 반면, 그러나 최대 8주 검색된 데이터를 사용하여, SQZ 프로세싱된 RBC-유래된 소포 및 비-SQZ RBC 둘 다에 대한 반감기를 나타내었다. 상대적으로 짧게 생존한 RBC-유래된 소포는 14.3분의 반감기를 가진 반면, SQZ-프로세싱 없이 표지된 RBC는 7661분 (∼5일)의 반감기를 가졌다. 수용자 마우스 내로 주사된 RBC/RBC-유래된 소포의 혼합물의 유동 플롯 다이아그램을 도 6c에 나타낸다. 이 전방 대 측방 산란 플롯은 또한 형태학의 변화를 나타내는 실체의 정량화를 제공하였다. 그래프의 상부 우측 사분면에서의 세포의 보다 큰 백분율은 비 SQZ-프로세싱된 RBC를 나타낸 반면, SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 보다 작은 집단은 좌측 상의 클러스트에 나타내어졌다. 이는 또한 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 형태학이 SQZ-프로세싱되지 않은 RBC의 그것으로부터 유의하게 변경되었다는 발견을 예시한다. 함께 취해져, 이들 데이터는 RBC-유래된 소포가 SQZ-프로세싱되지 않은 RBC보다 유의하게 더 빨리 청소되었으며, 2가지는 유동 세포계측법에 의해 형태학적으로 주목할 만하게 상이하였음을 나타내었다.
실시예 7
이 실시예는, 부분적으로, 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량에 대한 SQZ-매개된 로딩의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 (Hb) 함량에 대한 SQZ-매개된 전달의 영향을 정량화하기 위해, RBC-유래된 소포를 다양한 조건 하에서 SQZ-프로세싱에 의해 생성하고, 투입 RBC의 그것에 비해 잔류하는 헤모글로빈의 양을 헤모큐® 시스템을 사용하여 정량화하였다. 구체적으로, RBC를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, 비처리된 채 방치하거나 (NC - 음성 대조군), 물에 1:20 희석된 용액에서 인큐베이션하거나 (95 μL 물 중 5 μL 혈액 - 용해 대조군), 2가지 상이한 압력 (10 및 12 psi)에서 SQZ-프로세싱하였다. 원심분리 후, 용혈 (Hb의 소실)의 양을 하기 식에 따라 전체 세포 현탁액 중의 그것 대비 상청액 중의 Hb의 농도를 결정함으로써 헤모큐® 시스템을 사용하여 결정하였다: % 용혈 = ([유리 Hb]/[총 Hb])*100.
결과
원심분리 후, SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포가 유의한 용혈 (Hb의 소실)을 발생시켰으며, 이는 비-SQZ 프로세싱된 RBC로 관찰된 바와 같은 강렬하게 적색 세포 펠릿을 갖는 본질적으로 투명한 상청액에 비해, RBC-유래된 소포 상청액의 확산된 적색 색상으로부터 용이하게 관찰되었음이 육안으로 명백하였다 (도 7a). 헤모큐® 시스템을 사용하여 정량화하는 경우, 용해 대조군은 8% 용혈을 나타낸 반면, SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포의 둘 다의 조건 (10 및 12 psi에서)은 대략 3% 용혈을 나타내었다. 그에 비해, SQZ에 의해 프로세싱되지 않은 RBC는 단지 0.2% 용혈을 등록하였다 (도 7b). 함께 취해져, 이들 데이터는 Hb 수준이 비처리된 투입 RBC에 비해 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포에서 감소하였음을 나타낸다.
실시예 8
이 실시예는, 부분적으로, 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량에 대한 SQZ-매개된 로딩의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 (Hb) 함량에 대한 SQZ-매개된 전달의 영향을 정량화하기 위해, RBC-유래된 소포를 다양한 조건 하에서 SQZ-프로세싱에 의해 생성하고, 투입 RBC의 그것에 비해 잔류하는 헤모글로빈의 양을 LC/MS에 의해 정량화하였다. 구체적으로, RBC를 NOD 공여자 마우스로부터 얻고, PBS 중 FAM-태그부착된 인슐린 B9-23 펩티드 (75 μM)와 함께 인큐베이션하거나 (엔도 대조군), SQZ-매개된 로딩을 통해 프로세싱하여 인슐린 B9-23 펩티드로 로딩된 RBC-유래된 소포를 생성하였다 (SQZ). 그 후, 엔도 대조군 또는 SQZ로부터의 샘플 (5E7 내지 1.5E8개의 세포 또는 소포/반복실험 샘플로부터)을 표준 펩티드 변성, 환원, 알킬화 및 트립신화 (DRAT) 절차로 처리한 후, 액체 크로마토그래피/질량 분광법 분석 (LC/MS)으로 처리하였다. 유도체화 후, 샘플을 역상 LC를 사용하여 구동시키고, 2가지 공지된 헤모글로빈 펩티드 (Hb 펩티드 #1- FLASVSTVLTSK; Hb 펩티드 #2 - VGAHAGEYGAEALER)의 수준을 각각의 피크에 대한 곡선하 면적을 계산함으로써 정량화하였다.
결과
LC/MS 분석은 SQZ-프로세싱되지 않은 RBC (엔도 대조군)가 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포보다 거의 10배 더 많은 Hb 함량을 가졌음을 나타내었다 (2회의 기술적 반복실험/샘플; 별개로 나타내어짐). 엔도 대조군 및 SQZ 사이에서 관찰된 경향은 둘 다의 Hb 펩티드에 대해 관찰되었으며, SQZ 샘플에서 Hb 함량의 >80% 상대적 감소를 가졌다 (도 8a 내지 8b). 함께 취해져, 이들 데이터는 RBC가 SQZ-프로세싱되어 RBC-유래된 소포가 된 경우 그들의 비프로세싱된 RBC 대응물에 비해 유의한 양의 Hb가 소실되었음을 나타낸다.
실시예 9
이 실시예는, 부분적으로, 무핵 세포-유래된 소포의 유도에 있어서 고스트 형성에 대한 SQZ-매개된 로딩에서의 압박부 크기 및 압력의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
무핵 세포-유래된 소포의 유도에 있어서 고스트 형성에 대한 SQZ-매개된 로딩에서의 압박부 폭 및 압력의 영향을 정량화하기 위해, RBC-유래된 소포를 다양한 압박부 폭 및 압력 조건 하에서 SQZ-프로세싱에 의해 생성하고, 고스트 형성의 양을 유동 세포계측법에 의해 정량화하였다. 구체적으로, 적혈구 (RBC; 100M개의 세포/mL)를 C57BL/6J 공여자 마우스로부터 얻고, 희석된 CPDA-1 용액 중 형광-태그부착된 Ova (10 μg/mL)와 함께 인큐베이션하거나 (엔도), 2가지 상이한 압박부 직경 (2.2 μm 또는 2.5 μm) 및 2가지 상이한 운전 압력 (30 및 50 psi)의 조합을 사용하여 Ova로 SQZ-로딩하였다. 그 후, 고스트 형성의 양을 유동 세포계측법에 의해 결정하였다. 비-고스트 및 고스트 소포 프로파일은 도 6c에서 이전에 예시되었다.
결과
SQZ 프로세싱에서 압박부 폭 및/또는 압력을 변경시킴으로써, RBC-유래된 소포의 SQZ-로딩으로부터 발생하는 고스트 형성의 상대량을 조정할 수 있다. 예상된 바와 같이, SQZ-프로세싱되지 않은 RBC (엔도)는 매우 낮은 백분율의 고스트 형성 (∼5%)을 나타내었다. 시험된 모든 SQZ 조건은 엔도에 비해 유의하게 더 높은 백분율의 고스트 형성을 발생시켰다 (P<0.005) (도 9). 2.5μm 압박부 폭으로, 30 psi 운전 압력에서의 SQZ-프로세싱은 ∼60% 고스트 형성을 발생시켰지만, 50 psi 운전 압력에서의 SQZ-프로세싱의 경우 고스트 형성은 >90%까지 증가되었다 (P<0.05) (도 8). 추가적으로, 보다 좁은 압박부 폭 (2.2 μm)을 사용한 SQZ-프로세싱에서의 고스트 형성은 또한 30psi의 동일한 운전 압력이 인가된 경우 보다 넓은 압박부 폭 (2.5 μm, ∼60% 고스트 형성)에 비해 더 높은 백분율의 고스트 형성 (>90% 고스트 형성)을 발생시켰다 (P<0.05) (도 9). 함께 취해져, 이들 데이터는 운전 압력 또는 압박부 폭을 변경시킴으로써, SQZ-로딩 무핵 세포-유래된 소포로부터의 고스트 형성의 백분율이 활성적으로 조정될 수 있음을 나타낸다.
실시예 10
이 실시예는, 부분적으로, 무핵 세포-유래된 소포의 순환 반감기에 대한 SQZ-매개된 로딩의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
SQZ-프로세싱된 무핵 세포의 순환 동역학을 결정하기 위해, 뮤린 RBC를 먼저 PKH-26으로 표지하고, 그 후 SQZ-프로세싱으로 처리하여 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 그 후, RBC-유래된 소포를 마우스 내로 주사하고 (2마리의 마우스 각각에 대해 10억개의 소포), 형광 (PHK-26) 표지하고, SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포를 투여 후 24시간의 과정에 걸쳐 뮤린 혈액에서 추적하였다. 구체적으로, 소포를 투여 후 0분, 15분, 30분, 1시간, 4시간, 및 24시간에 형광을 통해 측정하였다.
또 다른 세트의 마우스를 SQZ-프로세싱으로 처리되지 않은 형광 표지된 RBC로 주사하였다 (3마리의 마우스 각각에 대해 10억개의 세포). 형광 (PHK-26) 표지된 비프로세싱된 RBC를 투여 후 24시간의 과정에 걸쳐 뮤린 혈액에서 추적하였다. 구체적으로, 비프로세싱된 RBC를 투여 후 0분, 15분, 30분, 1시간, 4시간, 및 24시간에 형광을 통해 측정하였다.
마우스 혈류에서의 형광 (PKH-26) 표지된 RBC-유래된 소포 및 비프로세싱된 RBC 대응물의 존속을 유동 세포계측법에 의해 검정된 바와 같이 형광에 의해 결정하였다.
결과
도 10에 나타내어진 바와 같이, SQZ-프로세싱된 RBC 유래된-소포는 혈액으로부터 급속하게 청소되었다. 구체적으로, 대부분의 RBC-유래된 소포는 60분 내에 혈액으로부터 청소되었으며, ∼10분의 순환 반감기를 가졌다. 그에 비해, 비프로세싱된 RBC는 실험의 지속기간 (72시간) 동안 혈류에 존속하였다. 함께 취해져, 이들 데이터는 RBC-유래된 소포가 SQZ-프로세싱되지 않은 RBC보다 유의하게 더 빨리 청소되었음을 나타내었다.
실시예 11
SQZ-프로세싱된 무핵 세포-유래된 소포가 CD8+ T-세포 반응을 유발하는 메커니즘을 평가하기 위해, 생체내에서 무핵 세포-유래된 소포의 흡수에 관여하는 세포 유형 및 기관을 조사하였다. 이 실시예는, 부분적으로, 정맥내 주사 후 SQZ-프로세싱된 무핵 세포-유래된 소포의 즉각적인 흡수에 관여하는 세포 유형 및 기관을 입증한다.
물질 및 방법
C57BL/6J 마우스를 더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory)로부터 얻고, 그로부터 20마리의 암컷을 백신접종을 위한 수용자 마우스로서 사용하고, 10마리의 암컷을 공여자 마우스로서 사용하였다. 공여자 마우스로부터 추출된 RBC를 PKH-26으로 형광 표지하고, 이어서 항원 (E7 SLP) 및 아주반트 (폴리 I:C)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 E7-로딩된 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 수용자 마우스의 제1 군을 E7 및 폴리 I:C를 함유하는 형광 표지된 RBC-유래된 소포로 주사하였다. 수용자 마우스의 대조군을 PBS로 주사하였다 (대조군).
주사 후 1시간에, 주사된 마우스의 간, 폐, 비장, 및 골수를 수확하고, 표지된 SQZ-프로세싱된 RBC-유래된 소포의 존재에 대해 조사하였다. 수확된 간 및 비장으로부터, 세포를 추출하고, 대식세포 (MØ; CD45+, F4/80+, CD11b-/low), 수지상 세포 (DC; CD45+, F4/80-, CD11chi, MHC-IIhi) 및 B 세포 (CD45+, F4/80-,CD19+, FSClo, SSClo)를 유동 세포계측법을 통한 그들의 형광 표지에 의해 검정된 바와 같이, RBC-유래된 소포의 흡수에 대해 분석하였다.
결과
도 11a에 나타내어진 바와 같이, SQZ-프로세싱된 RBC 소포는 주로 간 및 비장에서 흡수되었으며, 골수 및 폐에서는 덜 흡수되었다. 도 11b에 나타내어진 바와 같이, 간 및 비장에서, SQZ-프로세싱된 RBC 소포는 주로 대식세포 (MØ) 및 수지상 세포에 의해 탐식되었다. PBS로 주사된 마우스로부터의 비장 또는 간-유래된 세포에서 관찰된 배경 신호는 검출의 역치 미만이었다.
실시예 12
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 생체내 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
제0일에, 10마리의 암컷 OT-I 마우스 및 10마리의 암컷 OT-II 마우스를 희생시켰다. 비장 및 림프절 (서혜부, 액와, 상완, 경부, 및 장간막)을 수확하고, 그로부터 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 항원-특이적 CD8+ T 세포를 OT-I 마우스 세포로부터 면역-자기적으로 분리하였다. 항원-특이적 CD4+ T 세포를 OT-II 마우스 세포로부터 면역-자기적으로 분리하였다. OVA-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 CFSE로 염색한 후, CD45.1 마우스 내로 주사하였으며, 여기서 2.5M개의 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중 어느 하나를 각각 마우스 당 투여하였다.
제1일에, RBC를 3마리의 안락사된 B6 마우스로부터의 뮤린 혈액으로부터 단리하고, 뮤린 RBC를 OVA (200 μM) 및 폴리 I:C (1 mg/ml)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 항원 및 아주반트를 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 이어서, CFSE-표지된 OT-I CD8+ T 세포 또는 OT-II CD4+ T 세포로 이전에 투여된 CD45.1 마우스를 PBS로 (대조군) 또는 250M개의 로딩된 RBC-유래된 소포로 주사하였다.
제4일에, CFSE-표지된 OVA-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 투여되고, 이어서 (i) PBS; 또는 (ii) OVA 및 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포 중 어느 하나로 주사된 마우스를 희생시키고, 그들의 비장을 수확하였다. 수확된 비장을 필터를 통한 통과에 의해 수동으로 해리시키고, CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 유동 세포계측법을 통해 CSFE 희석에 의해 측정하였다.
결과
도 12a 및 12b에 나타내어진 바와 같이, OVA 및 폴리 I:C로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스는 대조군에 비해 유의한 CFSE 희석에 의해 나타내어진 바와 같이, 각각 왕성한 OT-I CD4+ T 세포 및 OT-II CD8+ T 세포 증식을 나타내었다. 이들 결과는 로딩된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 생체내에서 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 지시한다.
실시예 13
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 내인성 항원-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
제0일에, RBC를 3마리의 안락사된 B6 마우스로부터의 뮤린 혈액으로부터 단리하고, 뮤린 RBC를 분배시키고, (i) OVA (200 μM); 또는 (ii) 폴리 I:C (1 mg/ml); 또는 (iii) OVA 및 폴리 I:C 둘 다의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 항원 및/또는 아주반트를 함유하는 각각의 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 이어서, CD45.1 마우스를 PBS로 (대조군) 또는 항원 및/또는 아주반트로 로딩된 250M개의 각각의 RBC-유래된 소포로 주사하였다.
제7일에, PBS로, 또는 각각의 RBC-유래된 소포로 투여된 마우스를 희생시키고, 그들의 비장세포를 수확하였다. 비장세포를 SIINFEKL로 재자극하고, CD44에 대한 염색 및 IFN-감마에 대한 세포내 시토카인 염색으로 처리하여 임의의 내인성 T 세포 활성화를 검출하였다.
결과
도 13에 나타내어진 바와 같이, 항원 (OVA) 단독 또는 아주반트 (폴리 I:C) 단독 중 어느 하나로 로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스는 CD8+ T 세포의 활성화를 나타내지 않은 반면, OVA 및 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스는 SIINFEKL로의 재-자극 시 총 내인성 CD8+ T 세포 집단 중에서 CD44hi 및 IFNγ+ 세포의 백분율의 유의한 증가에 의해 나타내어진 바와 같이, 왕성한 OVA-특이적 T 세포 증식을 나타내었다. 이들 결과는 항원 및 아주반트 둘 다로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 내인성 항원-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 지시한다.
실시예 14
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 내인성 항원-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
제0일에, RBC를 13마리의 안락사된 B6 공여자 마우스의 뮤린 혈액으로부터 피콜 구배 절차를 사용하여 단리하고, 10억개/mL의 세포 농도를 갖는 RBC 현탁액을 제조하였다. RBC 현탁액을 4개의 군으로 분배시키고, 이를 (i) 아주반트 (폴리 I:C) 단독, (ii) 항원 (E7 SLP) 단독, 또는 (iii) 항원 및 아주반트 (E7 SLP + 폴리 I:C)의 존재 하에서 2.2 μm 직경 압박부로 50 psi에서 SQZ-프로세싱하여 각각의 탑재물을 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다.
이어서, CD45.1 마우스를 PBS로 (대조군), 또는 항원 및/또는 아주반트로 로딩된 2억5천만개의 각각의 RBC-유래된 소포로 안와후로 (RO) 주사하였다.
제7일에, 마우스를 희생시키고, 그들의 비장세포를 수확하였다. 비장세포를 E7 펩티드로 재-자극하고, CD44에 대한 염색 및 IFN-감마에 대한 세포내 시토카인 염색으로 처리하여 임의의 내인성 T 세포 활성화를 검출하였다.
결과
도 14에 나타내어진 바와 같이, 항원 (E7) 단독 또는 아주반트 (폴리 I:C) 단독 중 어느 하나로 로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스는 CD8+ T 세포의 활성화를 나타내지 않은 반면, E7 및 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스는 E7 펩티드로의 재-자극 시 총 CD8+ T 세포 집단 중에서 CD44hi 및 IFNγ+ 세포의 백분율의 유의한 증가에 의해 나타내어진 바와 같이, 왕성한 E7-특이적 T 세포 증식을 나타내었다. 이들 결과는 항원 및 아주반트 둘 다로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 내인성 항원-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 지시한다.
실시예 15
이 실시예는, 부분적으로, 생체내 항원-특이적 면역 반응에 대한 항원-로딩된 무핵 세포-유래된 소포의 상이한 프라이밍 및 부스팅 처방을 사용하는 것의 효과를 입증한다.
RBC를 13마리의 안락사된 B6 공여자 마우스의 뮤린 혈액으로부터 피콜 구배 절차를 사용하여 단리하고, 생성된 RBC 현탁액을 항원 및 아주반트 (100μM E7 SLP + 1mg/mL 폴리 I:C)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 항원 및 아주반트를 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다.
제0일에, CD45.1 마우스를 마우스 당 2억5천만개의 소포로, PBS로 (대조군) 또는 항원 및 아주반트로 로딩된 RBC-유래된 소포로 (프라임) 안와후로 (RO) 주사하였다. 로딩된 RBC-유래된 소포의 프라이밍 투여를 받은 마우스의 하위세트는 (i) 제2일에 로딩된 RBC-유래된 소포의 부스팅 용량 (2일 부스트); 또는 (ii) 제2일 및 제7일에 로딩된 RBC-유래된 소포의 2개의 부스팅 용량 (7일 부스트)을 추가로 받았다.
최종 면역화에 이어서 제7일 (프라임 및 PBS 대조군에 대해 제7일; 2일 부스트에 대해 제9일, 7일 부스트에 대해 제14일)에, 각각의 마우스를 희생시키고, 그들의 비장세포를 수확하였다. 비장세포를 CD44 및 E7-특이적 사량체 염색으로 처리하고, 유동 세포계측법을 통해 측정하여, 내인성 E7-특이적 T 세포의 활성화를 검출하였다.
결과
도 15에 나타내어진 바와 같이, E7 및 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스는 총 CD8+ T 세포 집단 중에서 CD44hi 및 사량체+ 세포의 백분율의 상당한 증가에 의해 나타내어진 바와 같이, CD8+ T 세포 활성화를 나타내었다. 또한, 내인성 T 세포 활성화의 유도는 마우스가 E7 및 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 추가적인 부스팅 용량을 받았을 때 더욱 더 왕성한 것으로 관찰되었다 (도 15). 이들 결과는 항원 및 아주반트 둘 다로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 내인성 항원-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 유도가 프라임-및-부스트 투여 처방을 사용함으로써 향상될 수 있음을 지시한다.
실시예 16
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 종양 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 종양에 대한 예방적 면역화로서 사용될 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
암컷 C57BL/6J 마우스를 더 잭슨 래버러토리로부터 얻고, 백신접종을 위한 수용자 마우스 뿐만 아니라 공여자 마우스로서 사용하였다. 제0일에, RBC를 공여자 마우스로부터 추출하고, 100μM E7 SLP 및 1mg/mL 폴리 I:C의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 종양 항원 및 아주반트를 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 그 후, 수용자 마우스를 (i) PBS, 또는 (ii) 종양 항원 및 아주반트를 함유하는 2억5천만개의 RBC-유래된 소포로 투여하였다.
면역화 후 7일 (제7일)에, 마우스를 HPV E7을 발현하는 TC-1 종양 세포로 우측 뒤쪽 옆구리에 피하로 삽입하였다. 그 후, TC-1 종양 성장을 주 당 2회 측정하고, 41일 동안 비처리된 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다. 종양 크기를 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정하였다. 마우스 체중 및 생존을 60일에 걸쳐 기록하였다.
결과
도 16a에 나타내어진 바와 같이, 종양 성장은 종양이 줄어들지 않게 성장한 대조군 마우스에 비해, E7+폴리 I:C-로딩된 소포로 처리된 마우스에서 완전히 억제되었다. 도 16b에 나타내어진 바와 같이, PBS-처리된 마우스 중 어느 것도 (0마리/10마리) 제41일 후에 생존하지 않은 반면 (중위 생존 = 34일), E7+폴리 I:C-로딩된 소포로 예방적으로 면역화된 모든 마우스 (10마리/10마리)는 적어도 60일 동안 종양 없이 잔류하였다. 이들 데이터는 종양 항원 및 아주반트로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 HPV-연관된 암의 예방적 모델에서 효과적으로 종양 성장을 예방하고, 생존을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 17
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 종양 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가 종양에 대한 치료적 면역화로서 사용될 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
암컷 C57BL/6J 마우스를 더 잭슨 래버러토리로부터 얻고, 백신접종을 위한 수용자 마우스 뿐만 아니라 공여자 마우스로서 사용하였다.
제0일에, 수용자 마우스를 HPV E7을 발현하는 TC-1 종양 세포로 피하로 삽입하였다. 제10일에, RBC를 공여자 마우스로부터 추출하고, 100μM E7 SLP 및 1mg/mL LMW 폴리 I:C의 존재 하에서 2.2 μm 직경 압박부로 50 psi에서 SQZ-프로세싱하여 종양 항원 및 아주반트를 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 이어서, 수용자 마우스를 (i) 비처리된 채로 방치/PBS로 투여하거나 (대조군); (ii) 10억개, 2억5천만개, 또는 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포 중 어느 하나의 용량을 투여하였다.
TC-1 종양 성장을 종양 삽입 후 1주에 시작하여 주 당 2회 측정하고, 41일 동안 비처리된 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다. 종양 크기를 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정하였다. 마우스 체중 및 생존을 50일에 걸쳐 기록하였다.
물질 및 방법
도 17a에 나타내어진 바와 같이, 종양 성장은 종양이 줄어들지 않게 성장한 대조군 마우스에 비해, 10억개 또는 2억5천만개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스에서, 및 또한 주목할 만하게 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스에서 유의하게 억제되었다. 도 17b에 나타내어진 바와 같이, 대조군 마우스 중 어느 것도 제41일 후에 생존하지 않은 반면 (중위 생존 = 32.5일), 10억개 또는 2억5천만개의 E7+폴리 I:C-로딩된 소포로 치료적으로 면역화된 마우스의 절반 초과가 적어도 41일 동안 생존가능하였으며, 치료 효능은 투여된 소포의 용량과 상관되었다 (투여된 1억개의 소포에 대해 중위 생존 = 39.5일; 투여된 2억5천만개의 소포에 대해 46일; 투여된 10억개의 소포에 대해 46일에서 중위 생존에 도달하지 않았음). 이들 데이터는 종양 항원 및 아주반트로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 HPV-연관된 암의 치료적 모델에서 종양 퇴행을 유도하고, 생존을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 18
이 실시예는, 부분적으로, 종양에 대한 치료적 면역화로서의 효능에 대한 항원-로딩된 무핵 세포-유래된 소포의 상이한 프라이밍 및 부스팅 처방을 사용하는 것의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
암컷 C57BL/6J 마우스를 더 잭슨 래버러토리로부터 얻고, 백신접종을 위한 수용자 마우스 뿐만 아니라 공여자 마우스로서 사용하였다.
제0일에, 수용자 마우스를 HPV E7을 발현하는 TC-1 종양 세포로 피하로 삽입하였다.
RBC를 공여자 마우스로부터 추출하고, 100μM E7 SLP 및 1mg/mL LMW 폴리 I:C의 존재 하에서 2.2 μm 직경 압박부로 50 psi에서 SQZ-프로세싱하여 종양 항원 및 아주반트를 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 이어서, 수용자 마우스를 (i) 비처리된 채 방치/PBS로 투여하거나 (대조군); (ii) 제10일에 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 용량 (프라임)을 투여하거나; (iii) 각각 제10일 및 제12일에 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 용량을 투여하거나 (프라임/부스트); (iv) 각각 제10일, 제12일 및 제14일에 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 용량을 투여하였다 (프라임/부스트/부스트).
TC-1 종양 성장을 종양 삽입 후 1주에 시작하여 주 당 2회 측정하고, 41일 동안 비처리된 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다. 종양 크기를 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정하였다. 마우스 체중 및 생존을 50일에 걸쳐 기록하였다.
결과
도 18a에 나타내어진 바와 같이, 종양 성장은 대조군 마우스에 비해 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 1개의 용량으로 처리된 마우스 (프라임)에서 주목할 만하게 억제되었으며; 마우스가 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 추가적인 부스팅 용량으로 처리된 경우 (프라임/부스트, 프라임/부스트/부스트), 종양 퇴행은 보다 유의하였다. 도 18b에 나타내어진 바와 같이, 모든 대조군 마우스는 41일에서 죽은 반면 (중위 생존 = 32.5일), 마우스의 ∼30%는 제41일에 1억개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포의 1개의 치료 용량으로 생존하였다 (프라임) (중위 생존 = 39.5일). 추가의 부스팅 용량은 제41일에 생존을 유의하게 증가시켰으며, 로딩된 소포의 2개의 용량을 받은 마우스 (프라임/부스트)에 대해 50% 초과의 생존 및 로딩된 소포의 3개의 용량을 받은 마우스 (프라임/부스트/부스트)에 대해 100% 생존을 가졌다 (둘 다에 대해 중위 생존 = 52일). 이들 데이터는 종양 항원 및 아주반트로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 HPV-연관된 암의 치료적 모델에서 종양 퇴행을 유도하고, 생존을 향상시킬 수 있으며, 종양 퇴행 및 생존은 추가의 부스팅 처방으로 개선될 수 있음을 나타낸다.
실시예 19
이 실시예는, 부분적으로, SQZ-로딩된 무핵 세포-유래된 소포로의 면역화 후 TC-1 종양의 종양 미세환경에서의 E7-특이적 CD8+ T 세포의 양, 및 종양 성장 모델에서의 종양 청소와 E7-특이적 CD8+ T 세포의 상관관계를 입증한다.
물질 및 방법
암컷 C57BL/6J 마우스를 더 잭슨 래버러토리로부터 얻고, 백신접종을 위한 수용자 마우스 뿐만 아니라 공여자 마우스로서 사용하였다.
제0일에, 수용자 마우스를 HPV E7을 발현하는 TC-1 종양 세포 (100 μL의 PBS 중 50k/마우스)로 피하로 삽입하였다.
제14일에, RBC를 공여자 마우스로부터 추출하고, (i) 1mg/mL 폴리 I:C 단독; 또는 (ii) 100μM E7 SLP 및 1mg/mL 폴리 I:C의 존재 하에서 2.2 μm 직경 압박부로 50 psi에서 SQZ-프로세싱하여 종양 항원 및/또는 아주반트를 함유하는 RBC-유래된 소포를 생성하였다. 이어서, 수용자 마우스를 (i) PBS로 투여하거나 (대조군); (ii) 2억5천만개의 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 투여하거나; (iii) 2억5천만개의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 투여하였다.
제21일 및 제26일 (면역화 후 7 및 12일)에, 종양을 절제하고, 칭량하고, 그로부터 각각의 단일-세포 현탁액을 생성하였다. 단일-세포 현탁액을 유동 세포계측법에 의해 총 CD8+ T 세포, 조절성 T 세포 (CD45+, B220-, CD11b-, CD4+, FoxP3+), 및 항원-특이적 종양-침윤 림프구 (TIL)에 대해 평가하였다.
결과
도 19a에서 보여지는 바와 같이, E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포로 면역화된 마우스는 면역화 후 7일 및 12일 (즉, 종양 삽입 후 제21일 및 제26일) 둘 다에 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스 및 대조군 마우스에 비해 종양에서의 CD8+ T 세포의 백분율의 유의한 증가를 가졌다. E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포를 받은 마우스에서, 이들 CD8+ T 세포의 대다수는 사량체 염색에 의해 결정된 바와 같이 E7 항원에 대해 특이적이었다 (CD8+ 집단의 >70%) (도 19b). 각각의 소포에 의한 조절성 T 세포 활성화의 상대량을 조사하기 위해, 종양에서의 E7-특이적 사량체 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 또한 종양에서의 조절성 T 세포의 양에 대해 정규화하였으며 (도 19c), 결과는 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포로의 면역화가 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포 또는 PBS로의 투여와 비교할 때, 면역화 후 종양 미세환경에서 조절성 T 세포에 비해 E7-특이적 CD8+ T 세포 (TIL)의 존재를 보다 유의하게 증가시켰음을 입증한다. 도 19d에 나타내어진 바와 같이, E7 특이적 CD8+ T 세포 (TIL)에서의 양은 또한 종양 중량과 반대로 상관되는 것으로 관찰되었으며, 이는 종양 퇴행이 E7-특이적 CD8+ T 세포의 유입과 상관될 것임을 입증한다. 이들 데이터는 TC-1 마우스 종양 모델에서의 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포로의 면역화가 종양을 침윤하는 E7-특이적 CD8+ T 세포의 유의한 증가를 발생시켰음을 입증한다. 종양 부피의 상관된 감소 (도 19d)와 결합된 E7-특이적 CD8+ T 세포의 증가 (도 19a 내지 19c)는 E7 + 폴리 I:C-로딩된 RBC-유래된 소포가 E7-특이적 이펙터 CD8+ T 세포를 확장시킴으로써 종양 부하를 감소시켰음을 뒷받침하였다.
실시예 20
이 실시예는, 부분적으로, 인간 무핵 세포-유래된 소포에서의 탑재물 전달, 고스트 형성 및 표면 포스파티딜세린 수준에 있어서의 SQZ-매개된 프로세싱의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
인간 적혈구 (RBC)를 건강한 공여자로부터 얻고, 생성된 RBC 현탁액 (20억개/mL)을 비처리된 채 방치하거나 (No SQZ-세포), 형광-태그부착된 E7 SLP (항원) 및 폴리 I:C (아주반트)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 (60 psi, 2.2 μm 직경 압박부) 항원 및 아주반트로 로딩된 인간 RBC-유래된 소포 (H-SQZ-소포)를 생성하였다.
SQZ-매개된 전달의 효능을 정량화하기 위해, No-SQZ-세포 및 H-SQZ-소포를 유동 세포계측법에 의해 형광-태그부착된 E7 SLP의 존재에 대해 측정하였다.
고스트 형성을 정량화하기 위해, 실시예 6 및 도 6c에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, No-SQZ-세포 및 H-SQZ-소포를 유동 세포계측법으로 처리하고, 전방 산란 및 측방 산란에 대해 분석하였다.
표면 포스파티딜세린 수준에 대한 SQZ-매개된 프로세싱의 영향을 정량화하기 위해, 실시예 5에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, No-SQZ-세포 및 H-SQZ-소포를 아넥신 V로 염색하고, 표면 포스파티딜세린의 수준을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다.
결과
도 20a에 나타내어진 바와 같이, 인간 RBC의 SQZ-프로세싱은 그의 대다수가 고스트 프로파일을 나타낸 RBC-유래된 소포 (H-SQZ-소포)를 발생시켰다. 대조적으로, 비처리된 인간 RBC (No SQZ-세포)의 매우 낮은 비율이 고스트 프로파일을 나타내었다. 더욱이, 도 20b에 나타내어진 바와 같이, 탑재물의 존재 하에서의 인간 RBC의 SQZ-프로세싱은 높은 백분율의 생성된 RBC-유래된 소포 (H-SQZ-소포)의 효과적인 전달을 나타내었다. 도 20c에 나타내어진 바와 같이, 인간 RBC의 SQZ-프로세싱은 그의 대다수가 표면 포스파티딜세린을 나타낸 (아넥신 V+) RBC-유래된 소포 (H-SQZ-소포)를 발생시켰다. 대조적으로, 비처리된 인간 RBC (No SQZ-세포)의 매우 낮은 비율이 표면 포스파티딜세린을 나타내었다.
실시예 21
SQZ-프로세싱된 인간 무핵 세포-유래된 소포가 항원 제시 및 CD8+ T-세포 반응의 활성화를 발생시키는 메커니즘을 평가하였다. 항원 제시 세포에 의한 무핵 세포-유래된 소포의 흡수의 동역학을 이해하는 것은 중요하다. 이 실시예는, 부분적으로, 시험관내에서 SQZ-프로세싱된 인간 무핵 세포-유래된 소포를 내재화하는데 있어서 인간 단핵구-유래된 수지상 세포 (MoDC)의 효율을 입증한다.
물질 및 방법
인간 적혈구 (RBC)를 건강한 공여자로부터 얻고, 생성된 RBC 현탁액 (20억개/mL)을 PKH-26으로 형광 표지하고, 비처리된 채 방치하거나, E7 SLP의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 (60 psi, 2.2 μm 직경 압박부) 항원으로 로딩된 인간 RBC-유래된 소포 (H-SQZ-소포)를 생성하였다. SQZ-프로세싱된 인간 무핵 세포-유래된 소포를 내재화하는데 있어서의 MoDC의 효능을 정량화하기 위해, MoDC를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 37℃ 또는 0℃ (얼음 상)에서 소포 농도의 스펙트럼에서 H-SQZ-소포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, MoDC를 단리하고, 유동 세포계측법에 의해 형광의 증가에 대해 분석하였다.
결과
도 21에 나타내어진 바와 같이, H-SQZ 소포와 함께 인큐베이션된 경우, MoDC는 0℃에서보다 37℃에서 H-SQZ-소포의 내재화에 있어서 유의하게 더 효율적이었다. 또한, H-SQZ-소포의 내재화는 시딩된 MoDC의 웰 당 적어도 1억개의 소포까지 H-SQZ 소포 농도에 의존적인 것으로 관찰되었다.
실시예 22
이 실시예는, 부분적으로, 로딩된 항원 및 아주반트를 포함하는 인간 무핵 세포-유래된 소포가 시험관내에서 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 입 증한다.
물질 및 방법
인간 적혈구 (RBC)를 건강한 공여자로부터 얻고, 생성된 RBC 현탁액 (20억개/mL)을 CMV 항원 (pp65)의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 CMV 항원 pp65로 로딩된 인간 RBC-유래된 소포 (H-SQZ-CMV-소포)를 생성하였다. pp65-특이적 CD8+ 반응자 T 세포를 외인성 아주반트 (10 μg/mL 폴리 I:C) 및 (i) 배지 (음성 대조군), (ii) pp65 펩티드 (양성 대조군), 또는 (iii) H-SQZ-CMV-소포 중 어느 하나와 공동-배양하고; 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 상청액을 각각의 조건으로부터 수확하고, IFN-γ 생산의 수준을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 22에 나타내어진 바와 같이, CMV 항원-특이적 CD8+ 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ 생산 및 분비는 배지와 함께 인큐베이션된 반응자 T 세포 (음성 대조군)에 대한 최소 IFN-γ 분비에 비해, H-SQZ-CMV-소포 또는 CMV 항원 펩티드와 공동-배양된 경우 (양성 대조군) 유의하게 증가되었다. 이들 결과는 로딩된 항원 및 아주반트를 포함하는 인간 무핵 세포-유래된 소포가 시험관내에서 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 지시한다.
실시예 23
이 실시예는, 부분적으로, 뮤린 무핵 세포-유래된 소포에서의 탑재물 전달, 고스트 형성 및 표면 포스파티딜세린 수준에 있어서의 SQZ-매개된 프로세싱의 효과를 입증한다.
물질 및 방법
RBC를 안락사된 B6 공여자 마우스의 뮤린 혈액으로부터 피콜 구배 절차를 사용하여 단리하고, 10억개/mL의 세포 농도를 갖는 RBC 현탁액을 제조하였다. 생성된 RBC 현탁액을 (i) 형광-표지된 OVA 또는 형광-표지된 IgG와 함께 인큐베이션하거나 (비프로세싱된 RBC; No SQZ), (ii) 형광-표지된 OVA 또는 형광-표지된 IgG의 존재 하에서 SQZ-프로세싱하여 각각의 탑재물로 로딩된 인간 RBC-유래된 소포를 생성하였다 (SQZ).
SQZ-매개된 전달의 효능을 정량화하기 위해, 비프로세싱된 RBC (No SQZ) 및 SQZ-프로세싱된 RBC 소포 (SQZ)를 유동 세포계측법에 의해 형광-태그부착된 탑재물의 존재에 대해 측정하였다.
고스트 형성에 대해 정량화하기 위해, 실시예 6 및 도 6c에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 비프로세싱된 RBC (No SQZ) 및 SQZ-프로세싱된 RBC 소포 (SQZ)를 유동 세포계측법으로 처리하고, 전방 산란 및 측방 산란에 대해 분석하였다.
표면 포스파티딜세린 수준에 대한 SQZ-매개된 프로세싱의 영향을 정량화하기 위해, 실시예 5에 기재된 바와 같은 절차를 사용하여, 비프로세싱된 RBC (No SQZ) 및 SQZ-프로세싱된 RBC 소포 (SQZ)를 아넥신 V로 염색하고, 표면 포스파티딜세린의 수준을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다.
결과
도 23a에 나타내어진 바와 같이, 탑재물의 존재 하에서의 뮤린 RBC의 SQZ-프로세싱은 생성된 RBC-유래된 소포 (SQZ)의 높은 백분율 (∼80%)로 OVA 또는 IgG 중 어느 하나의 효과적인 전달을 나타내었다. 도 23b에 나타내어진 바와 같이, 뮤린 RBC의 SQZ-프로세싱은 그의 대다수가 고스트 프로파일을 나타낸 RBC-유래된 소포를 발생시켰다. 대조적으로, 비프로세싱된 RBC (No SQZ)의 매우 낮은 비율이 고스트 프로파일을 나타내었다. 더욱이, 도 23c에 나타내어진 바와 같이, 비프로세싱된 RBC (No SQZ) 또는 RBC-유래된 소포 (SQZ)로부터의 고스트 및 비-고스트 집단을 표면 포스파티딜세린 수준에 대해 분석하였다. 비프로세싱된 RBC에서의 고스트 집단의 대략 25%가 표면 포스파티딜세린을 나타낸 반면, RBC-유래된 소포 내의 고스트 집단의 거의 전부는 표면 포스파티딜세린을 나타내었다. 한편, 비프로세싱된 RBC에서의 비-고스트 집단의 사실상 어느 것도 표면 포스파티딜세린을 나타내지 않은 반면, RBC-유래된 소포에서의 비-고스트 집단의 약 15%가 표면 포스파티딜세린을 나타내었다.
실시예 24
이 실시예는, 부분적으로, 바이러스 캡시드에 대한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하는 SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포의 능력을 입증한다.
물질 및 방법
바이러스 캡시드에 대한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하는 SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포의 능력을 결정하기 위해, 바이러스 및 AAV2 최소 에피토프로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 동물로부터의 비장세포의 반응을 IFN-γ ICS에 의해 측정하였다. 구체적으로, 제0일에, C57BL/6J 수용자 마우스를 모두 안와후로 (RO) 투여된, AAV2 GFP 바이러스 (GFP-발현 AAV2 바이러스; 1E12개의 바이러스 입자/100 μL PBS 중 mL/마우스; 20마리의 마우스/군) 또는 PBS 단독 (5마리의 마우스/군)으로 주사하였다. 제7일 및 제11일에, 마우스를 AAV2 캡시드에 대한 면역원성 펩티드 (SNYNKSVNV, 200 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 RBC (펩티드) 또는 SNYNKSVNV로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포 (SQZ)로 주사하였다 (100M개/마우스). 제15일에, 마우스를 각각 AAV2 나노룩(NanoLuc) 바이러스 (가용성 루시페라제 발현 AAV2 바이러스; 1E12개의 바이러스 입자/100 μL PBS 중 mL/마우스; 20마리의 마우스/군) 또는 PBS 단독 (5마리의 마우스)으로 RO로 주사하였다. 투여된 제2 바이러스를 초기 바이러스 투여로부터의 GFP 트랜스진에 대한 임의의 면역 반응을 회피하기 위해 상이한 트랜스진으로 표지하였다. 제22일, 제29일, 제36일, 제43일에, 100 내지 200 μL의 혈액을 뺨 채혈을 통해 수집하고, 혈청에서의 루시페라제 수준을 분광광도법에 의해 측정하였다. 추가적으로, 제43일에, 마우스를 희생시키고, 그들의 비장을 수확하고, 단리하고, 항원성 펩티드로 재-자극하였으며; 시토카인 IFN-γ의 수준을 세포내 시토카인 염색 (ICS) 및 유동 세포계측법에 의해 측정하였다 (도 24a).
결과
AAV2-NL로의 자극 시 나이브 동물에서 관찰된 IFN-γ 반응이 없었던 반면, SNYNKSVNV-인큐베이션된 RBC로 처리된 마우스 (펩티드)에서는 IFN-γ 수준의 유의한 증가가 관찰된 반면 (P<0.005, 나이브에 비해), SNYNKSVNV로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ)는 나이브 동물의 그것과 유사한 AAV2 펩티드에 대한 최소 면역 반응을 나타내었으며 (도 24b), 이는 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포가 로딩된 항원에 특이적인 시토카인 반응을 감소시킬 수 있음을 지시한다. 더욱이, 혈청 루시페라제 측정은 인큐베이션된 RBC로 처리된 마우스 (펩티드)가 시험된 시간 과정에 걸쳐 루시페라제의 측정가능한 수준을 나타내지 않았음을 나타내었으며, 이는 AAV2에 대한 내성이 이들 동물에서 유도되지 않았고, AAV2-NL의 반복 투여가 트랜스진 발현을 발생시키지 않았음을 시사한다. 그에 비해, SQZ-로딩된 RBC 소포로 처리된 마우스는 혈청 루시페라제 수준의 100 내지 200% 증가를 나타내었으며 (펩티드에 비해 #P<0.005), 이는 AAV2에 대한 내성이 반복 투여 시 AAV-NL의 성공적인 발현을 허용하였음을 지시한다 (도 24c). 함께 취해져, 이들 데이터는 바이러스 캡시드 항원으로 로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 바이러스 항원-특이적 면역 내성을 유도하여, 치료제 AAV 벡터의 반복된 투여를 허용하였다는 관찰을 뒷받침한다.
실시예 25
이 실시예는, 부분적으로, 항체에 대한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하는 SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포의 능력을 입증한다.
물질 및 방법
항체에 대한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하는 SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포의 능력을 결정하기 위해, 래트 항체 (IgG2b)를 IgG2b로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스에게 반복적으로 투여하고, 순환 항체의 수준을 시간 경과에 따라 정량화하였다. 구체적으로, 제-6일 및 제-2일에, C57BL/6J 수용자 마우스를 (i) PBS로 (대조군; 5마리의 마우스/군), (ii) 유리 래트 IgG2b (200 μg/mL; 5마리의 마우스/군)으로 또는 (iii) SQZ에 의해 래트 IgG2b로 로딩된 RBC-유래된 소포 (100M개/마우스; 10마리의 마우스/군)로 주사하였다. 래트 IgG2b의 후속 IV 주사를 도 25a에 예시된 스케줄에 따라 제0일 내지 제14일 및 제63일 내지 제70일에 반복적으로 수행하고, 혈청에서의 순환 래트 IgG2b의 수준을 제20일 및 제76일에 ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 25b 및 25c에 나타내어진 바와 같이, 단지 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스만이 순환에서 래트 IgG의 검출가능한 수준의 통계적으로 유의한 증가로부터 관찰된 바와 같이, 래트 IgG에 대한 감소된 면역 반응을 나타내었다. 이 증가된 순환 래트 IgG는 보다 이른 시점에서 관찰되었으며 (20일; #P<0.005) (도 25b), 심지어 70일에 걸친 보다 긴 치료 처방 후에도 유지되었다 (76일; *P<0.05) (도 25c). 함께 취해져, 데이터는 SQZ-로딩된 무핵 세포-유래된 소포가 연장된 기간 동안 항-약물 항체 반응을 극복하기 위한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하여, 잠재적으로 면역원성 생물제제의 반복된 투여를 가능하게 하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 26
이 실시예는, 부분적으로, 제1형 당뇨병 (T1D)과 연관된 항원에 대한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하는 SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포의 능력을 입증한다.
물질 및 방법
당뇨병 연관된 항원에 대한 생체내 항원-의존적 내성을 유도하는 SQZ-로딩된 항원을 함유하는 무핵 세포-유래된 소포의 능력을 결정하기 위해, T1D의 2가지 상이한 동물 모델을 채용하였다: 인슐린 B9-23 (Ins B9-23) 모델 및 BDC2.5 전달 모델.
Ins B9-23 모델에 대해, Ins B9-23에 대한 내성화의 규모를 Ins B9-23 펩티드로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스의 비장세포에서 Ins B9-23 펩티드로의 재-자극 후의 시토카인 생산에 의해 결정하였다. 구체적으로, 제0일에, NOD 마우스를 (i) 비히클 (대조군), (ii) 대조군 펩티드로 로딩된 RBC-유래된 소포 (200 μL 중 1B개의 세포/동물) (SQZ HEL; 80 μM) 또는 (iii) 형광-태그부착된 Ins B9-23으로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포 (SQZ FAM; 75 μM) 중 어느 하나로 처리하였다. 제7일에, 마우스를 Ins B9-23 및 완전 프로인트 아주반트 (1 mg/mL - 100 μL)의 1:1 에멀젼으로 챌린지하였다. 제14일에, 서혜부 림프절을 수확하고, Ins B9-23으로 재-챌린지하고, 세포내 시토카인 염색 (ICS)을 IFN-γ 및 IL-2에 대해 수행하고, 유동 세포계측법에 의해 측정하였다 (도 26a).
BDC2.5 전달 모델에 대해, 내성화의 규모를 펩티드 미모토프 1040-p31로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 동물에서의 T1D 발병의 지연에 의해 측정하였다. 구체적으로, T1D의 급속한 발병을 유도하기 위해, 림프절을 먼저 암컷 BDC2.5 공여자 마우스로부터 수확하고 (3M개의 세포/mL), 아세틸화 p31 펩티드 (D10v2 중 500 nM)로 3일 동안 배양함으로써 활성화시켰다. 그 후, 제-1일에, BDC2.5 T 세포를 배양된 림프절로부터 수확하고, NOD/SCID 수용자 마우스 내로 입양 전달하였다 (1E6개의 세포/마우스; 5마리의 마우스/군). 제0일에, 적혈구를 NOD/SCID 공여자 마우스로부터 수확하고, 1040-p31 미모토프 펩티드로 SQZ-로딩하고, 로딩된 RBC-유래된 소포 (SQZ; 1B개의 세포/마우스) 또는 비히클 (대조군; 200 μL PBS)을 수용자 NOD/SCID 마우스 내로 주사하였다. 혈액을 마우스로부터 매일 채혈하고, 혈당의 순환 양을 정량화하였다 (도 26c). 당뇨병 발병은 2회의 연속적 측정에 의해 등록된 혈당의 >250 mg/dL을 갖는 것으로 정의되었다. 동물을 45일의 기간 동안, 또는 질환 발병까지 (어느 것이든 먼저 발생한 것) 모니터링하였다.
결과
Ins B9-23 모델에 대해, 결과는 SQZ HEL 마우스 (#P<0.005) 또는 나이브 마우스 (대조군) (#P<0.005)에 비해, Ins B9-23으로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스 (SQZ FAM)로부터의 재-자극된 비장세포에서 염증성 시토카인 IFN-γ 및 IL-2의 수준의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다 (도 26b). 이 결과는 T1D 관련 항원으로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스에서의 항원-특이적 시토카인 반응의 유의한 감소를 지시하였다.
BDC2.5 전달 모델에 대해, 질환의 발병은 대조군 처리된 동물에 비해, 1040-p31로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스에서 평균 약 35일 지연되었다 (도 26d, 도 26e). 이 지연된 발병은 1040-p31로 SQZ-로딩된 RBC-유래된 소포로 처리된 마우스에서의 1040-p31에 대한 증가된 내성을 지시하였다.
함께 취해져, 이들 데이터는 RBC-유래된 소포에의 자가면역-관련 자가항원의 SQZ-매개된 전달이 면역 반응 및 자가면역 질환의 발병을 예방하는데 사용될 수 있다는 발견을 뒷받침한다.
Claims (228)
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원을 전달하는 방법. - 제1항에 있어서, 투입 무핵 세포가 아주반트를 추가로 포함하는 것인 방법.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 아주반트를 전달하는 방법. - 제3항에 있어서, 투입 무핵 세포가 항원을 추가로 포함하는 것인 방법.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 무핵 세포-유래된 소포 내로 항원 및 아주반트를 전달하는 방법. - 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법. - 제6항에 있어서, 방법이 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 아주반트가 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여되는 것인 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 방법.
- 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법. - 제10항에 있어서, 방법이 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여되는 것인 방법.
- 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법. - 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법. - 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법. - 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 아주반트가 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 전신으로 투여되는 것인 방법.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 방법.
- 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 치료하는 방법. - 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하고, 질환-연관된 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체에서 질환을 예방하는 방법. - 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포가
a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법. - a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고;
c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법. - a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고;
c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법. - a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고;
c) 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것
을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법. - 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 소포외 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 소포외 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여되는 것인 방법.
- 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 방법.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 질환-연관된 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고;
c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 상태를 개선시키는 것인 개체에서 질환을 치료하는 방법. - a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고;
c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 질환-연관된 항원에 대한 면역 반응이 질환의 발달을 예방하는 것인 개체에서 질환을 예방하는 방법. - a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하고;
c) 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 개체에게 투여하는 것
을 포함하는, 개체를 항원에 대해 백신접종하는 방법. - 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 소포외 아주반트를 개체에게 전신으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제31항에 있어서, 소포외 아주반트가 무핵 세포 유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여되는 것인 방법.
- 제13항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관된 질환인 방법.
- 제6항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 개체에 대해 자가성인 방법.
- 제6항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 개체에 대해 동종이계인 방법.
- 제6항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 제약 제형 중에 있는 것인 방법.
- 제6항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 전신으로 투여되는 것인 방법.
- 제6항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 복강내로 투여되는 것인 방법.
- 제6항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 치료제와 조합으로 개체에게 투여되는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 치료제가 무핵 세포-유래된 소포 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여되는 것인 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 치료제가 면역 체크포인트 억제제 및/또는 시토카인인 방법.
- 제41항에 있어서, 시토카인이 IFN-α, IFN-γ, IL-2 또는 IL-15 중 1종 이상인 방법.
- 제41항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 및 BTLA 중 어느 하나에 표적화되는 것인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 CD-1 제한된 항원인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 질환-연관된 항원인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 항원인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 용해물이 종양 용해물인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 미생물인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 폴리펩티드인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 지질 항원인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 탄수화물 항원인 방법.
- 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 변형된 항원인 방법.
- 제55항에 있어서, 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제56항에 있어서, 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 전달되는 것인 방법.
- 제2항 내지 제5항, 제7항 내지 제12항, 제16항 내지 제21항, 및 제25항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀(HILTONOL)®), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 지질다당류 (LPS)인 방법.
- 제62항에 있어서, 아주반트가 저분자량 폴리 I:C인 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 적혈구인 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구가 성숙적혈구인 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구가 망상적혈구인 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 혈소판인 방법.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 방법.
- 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 인간 세포인 방법.
- 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 방법.
- 제71항에 있어서, 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 방법.
- 제72항에 있어서, 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 방법.
- 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 방법.
- 제75항에 있어서, 기공이 표면에 함유되는 것인 방법.
- 제76항에 있어서, 표면이 필터인 방법.
- 제76항에 있어서, 표면이 막인 방법.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수인 방법.
- 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 방법.
- 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 방법.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고;
그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포. - 제86항에 있어서, 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고;
그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포. - 제88항에 있어서, 투입 무핵 세포가 항원을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하는 단계; 및
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포. - 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판-유래된 소포인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제91항에 있어서, 적혈구-유래된 소포가 성숙적혈구-유래된 소포, 또는 망상적혈구-유래된 소포인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 CD-1 제한된 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 질환-연관된 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제97항에 있어서, 용해물이 종양 용해물인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 미생물인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 폴리펩티드인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 지질 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 탄수화물 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 변형된 항원인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제104항에 있어서, 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제105항에 있어서, 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제104항에 있어서, 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제104항에 있어서, 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제104항에 있어서, 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항, 제87항, 및 제89항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 전달되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제87항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드 및/또는 LPS인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제111항에 있어서, 아주반트가 저분자량 폴리 I:C인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 적혈구인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 성숙적혈구인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 망상적혈구인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 혈소판인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 포유동물 세포인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 인간 세포인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에의 투여 후의 무핵 세포-유래된 소포의 반감기가 포유동물에의 투여 후의 투입 무핵 세포의 반감기에 비해 감소되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제115항, 및 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량이 투입 무핵 세포의 헤모글로빈 함량에 비해 감소되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산이 투입 무핵 세포의 ATP 생산에 비해 감소되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제113항, 제114항, 및 제117항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포:
(a) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기;
(b) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준;
(c) 구형 형태학;
(d) 투입 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준,
(e) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산. - 제113항, 제114항, 및 제117항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제113항, 제114항, 및 제117항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구 고스트인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일이 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%가 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제129항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 향상된 흡수를 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 비변형된 무핵 세포-유래된 소포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제131항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 그의 표면 상에 CD47을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 유지되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 200 mOsm 내지 400 mOsm에서 유지되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제137항에 있어서, 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제138항에 있어서, 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제141항에 있어서, 기공이 표면에 함유되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제142항에 있어서, 표면이 필터인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제142항에 있어서, 표면이 막인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제86항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 복수의 제86항 내지 제151항 중 어느 한 항의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물.
- 제152항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것
을 포함하는, 항원을 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법. - 제154항에 있어서, 투입 무핵 세포가 아주반트를 포함하는 것인 방법.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것
을 포함하는, 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법. - 제156항에 있어서, 투입 무핵 세포가 항원을 포함하는 것인 방법.
- a) 투입 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고;
b) 무핵 세포-유래된 소포를 항원 및 아주반트가 무핵 세포-유래된 소포에 진입하는 것을 허용하는 충분한 시간 동안 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 그에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 것
을 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 무핵 세포-유래된 소포를 생성하는 방법. - 제154항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구-유래된 소포 또는 혈소판 유래된 소포인 방법.
- 제159항에 있어서, 적혈구-유래된 소포가 성숙적혈구-유래된 소포 또는 망상적혈구-유래된 소포인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 MHC 부류 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 부류 II-제한된 펩티드로 프로세싱될 수 있는 것인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 CD-1 제한된 항원인 방법
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 질환-연관된 항원인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 항원인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 용해물로부터 유래되는 것인 방법.
- 제165항에 있어서, 용해물이 종양 용해물인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 미생물인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 폴리펩티드인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 지질 항원인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 탄수화물 항원인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 변형된 항원인 방법.
- 제172항에 있어서, 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제173항에 있어서, 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제174항에 있어서, 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제175항에 있어서, 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제176항에 있어서, 변형된 항원이 나노입자와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
- 제154항, 제155항 및 제157항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 항원이 무핵 세포-유래된 소포에 전달되는 것인 방법.
- 제155항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG ODN, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, 폴리리신 및 카르복시메틸셀룰로스로 안정화된 폴리이노신산-폴리시티딜산 (힐토놀®), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및/또는 LPS인 방법.
- 제179항에 있어서, 아주반트가 저분자량 폴리 I:C인 방법.
- 제154항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 적혈구인 방법.
- 제154항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 성숙적혈구인 방법.
- 제154항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 망상적혈구인 방법.
- 제154항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 혈소판인 방법.
- 제154항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
- 제154항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 방법.
- 제154항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 인간 세포인 방법.
- 제154항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에의 투여 후의 무핵 세포-유래된 소포의 반감기가 포유동물에의 투여 후의 투입 무핵 세포의 반감기에 비해 감소되는 것인 방법.
- 제181항 내지 제183항, 및 제185항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포의 헤모글로빈 함량이 투입 무핵 세포의 헤모글로빈 함량에 비해 감소되는 것인 방법.
- 제181항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포의 ATP 생산이 투입 무핵 세포의 ATP 생산에 비해 감소되는 것인 방법.
- 제181항, 제182항 및 제185항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 방법:
(a) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기;
(b) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준;
(c) 구형 형태학;
(d) 투입 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준,
(e) 투입 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산. - 제181항, 제182항 및 제185항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 성숙적혈구이고, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 감소된 양요형 형상을 갖는 것인 방법.
- 제181항, 제182항 및 제185항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 적혈구 고스트인 방법.
- 제154항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 그의 표면 상에 약 1.5배 초과 더 많은 포스파티딜세린을 갖는 것인 방법.
- 제154항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일이 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 평균 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제154항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 공정에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단 프로파일의 적어도 50%가 투입 무핵 세포에 비해 표면 상에 더 높은 포스파티딜세린 수준을 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제154항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 향상된 흡수를 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제197항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 향상된 흡수를 나타내는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제154항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포에 비해 조직 또는 세포에서 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제199항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 투입 무핵 세포의 흡수에 비해 간 및/또는 비장에서 또는 포식 세포 및/또는 항원-제시 세포에 의한 흡수를 향상시키도록 변형되는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제154항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 그의 표면 상에 CD47을 포함하는 것인 무핵 세포-유래된 소포.
- 제154항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 무핵 세포-유래된 소포가 무핵 세포-유래된 소포의 제조 동안 (a) 열 프로세싱되지 않고/거나, (b) 화학적으로 처리되지 않고/거나, (c) 저장성 또는 고장성 조건에 적용되지 않는 것인 방법.
- 제154항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 유지되는 것인 방법.
- 제154항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액의 오스몰농도가 공정 전반에 걸쳐 약 200 mOsm 내지 약 400 mOsm에서 유지되는 것인 방법.
- 제154항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 방법.
- 제205항에 있어서, 미세유체 채널이 복수의 압박부를 포함하는 것인 방법.
- 제206항에 있어서, 복수의 압박부가 직렬로 및/또는 병렬로 배열되는 것인 방법.
- 제154항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 복수의 미세기둥 사이에; 어레이에 구성된 복수의 미세기둥 사이에; 또는 1개 이상의 이동가능한 플레이트 사이에 있는 것인 방법.
- 제154항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 기공이거나, 기공 내에 함유되는 것인 방법.
- 제209항에 있어서, 기공이 표면에 함유되는 것인 방법.
- 제210항에 있어서, 표면이 필터인 방법.
- 제210항에 있어서, 표면이 막인 방법.
- 제154항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 함수인 방법.
- 제154항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부 크기가 현탁액 중의 투입 무핵 세포의 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 방법.
- 제154항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 폭을 갖는 것인 방법.
- 제154항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 폭을 갖는 것인 방법.
- 제154항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 압박부가 약 2.2 μm의 폭을 갖는 것인 방법.
- 제154항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 무핵 세포가 약 10 psi 내지 약 90 psi의 범위의 압력 하에서 압박부를 통해 통과되는 것인 방법.
- 제154항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 현탁액이 압박부를 통해 통과하기 전에, 공동으로, 또는 후에 항원과 접촉되는 것인 방법.
- 제154항 내지 제219항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 무핵 세포-유래된 소포의 집단을 포함하는 조성물.
- 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 무핵 세포-유래된 소포:
(a) 포유동물에서의 순환 반감기가 모 무핵 세포에 비해 감소됨,
(b) 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준,
(c) 구형 형태학,
(d) 모 무핵 세포에 비해 증가된 표면 포스파티딜세린 수준, 또는
(e) 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산. - 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물:
(a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐,
(b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐,
(c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐,
(d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임,
(e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는
(f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐. - 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포의 집단으로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물:
(a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 약 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐,
(b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐,
(c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐,
(d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임,
(e) 조성물 중의 조성물 소포 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는
(f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포의 집단의 평균에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐. - 모 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 압박부를 통해 통과시키고 - 여기서 압박부의 직경은 현탁액 중의 모 무핵 세포의 직경의 함수이고, 그에 의해 탑재물이 통과하기에 충분히 큰 모 무핵 세포의 섭동을 유발하여 무핵 세포-유래된 소포를 형성하고, 그에 의해 무핵 세포-유래된 소포를 생산하는 것을 포함하는,
하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 모 무핵 세포로부터 제조된 복수의 무핵 세포-유래된 소포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법:
(a) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 포유동물에서의 순환 반감기를 가짐,
(b) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 가짐,
(c) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 구형 형태학을 가짐,
(d) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 RBC 고스트임,
(e) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 더 높은 수준의 포스파티딜세린을 가짐, 또는
(f) 조성물 중의 무핵 세포-유래된 소포의 20% 초과가 모 무핵 세포에 비해 감소된 ATP 생산을 가짐. - 제221항의 무핵 세포-유래된 소포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- 제222항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- 제221항의 무핵 세포-유래된 소포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법.
- 제222항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법.
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