CN113614237A - 无核细胞源性疫苗 - Google Patents

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H·伯恩斯坦
J·B·吉尔伯特
F·摩尔
D·布里奇恩
L·卡塞罗
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Abstract

本发明提供了用于刺激对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使含有输入的无核细胞的细胞悬液通过缩窄部而产生，其中所述缩窄部使所述输入的无核细胞变形，从而引起所述细胞的扰动以形成无核细胞源性囊泡，如此使得抗原和/或佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，将所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡递送至个体，并且将所述抗原递送至免疫原性环境并在其中加工以治疗疾病、预防疾病、和/或给个体接种针对抗原的疫苗。

Description

无核细胞源性疫苗
相关申请
本申请要求2019年1月25日提交的美国临时申请号62/797,185、2019年1月25日提交的美国临时申请号62/797,187、2019年11月8日提交的美国临时申请号62/933,301和2019年11月8日提交的美国临时申请号62/933,302的权益，将其各自的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开文本总体上涉及通过将无核细胞源性囊泡递送至个体来刺激免疫反应或治疗癌症、传染病或病毒相关疾病的方法，其中无核细胞源性囊泡负载有抗原和/或佐剂。在一些实施方案中，抗原和/或佐剂经由使细胞悬液通过细胞变形缩窄部而被递送至无核细胞。
背景技术
免疫系统的复杂性和对异物的免疫反应使得开发用于触发体内抗原特异性免疫反应的有效方法具有挑战性。除了持续开发能够触发抗原特异性免疫反应的试剂(如小分子和基于多肽和/或核苷酸的疫苗)之外，还需要进一步开发与此类试剂一起使用的载体策略以优化递送和免疫反应。本领域已知的载体(包括基于聚合物的载体、颗粒载体、脂质体和基于细胞的囊泡(如来源于红细胞的那些))仍然面临限制其用于触发体内抗原特异性免疫反应的用途的挑战。例如，考虑到红细胞形状不规则(双凹)、无核和转录失活，由于与处理红细胞以缔合抗原性物质相关的挑战，因此使用红细胞作为载体是困难的。因此，标准转染技术不起作用。为了克服这些挑战，使用红细胞(red blood cell)作为用于触发免疫反应的载体的方法集中在将材料缀合到红血球(erythrocyte)表面。参见，例如Lorentz等人,Sci.Adv,l:el5001122015；Grimm等人,Sci Rep,5,2015；以及Kontos等人,Proc Natl AcadSci USA,110,2013。使用表面缀合的初步工作示出了模型抗原和1型糖尿病小鼠模型的有希望的结果，但有一些明显的缺点，包括：(a)需要化学修饰的抗原进行附着；(b)有限的表面积用于负载；以及(c)免疫原性。
描述使用微流体缩窄部以将化合物递送至细胞的方法的参考文献包括WO2013059343、WO 2015023982、WO 2016070136、WO 2016077761和WO/2017/192785。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其全文并入。
发明内容
在一些方面，本发明提供了用于将抗原递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的(例如母体)无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞进一步包含佐剂。
在一些方面，本发明提供了用于将佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞进一步包含抗原。
在一些方面，本发明提供了用于将抗原和佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，本发明提供了用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。在一些方面，本发明提供了用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善疾病的状况，并且其中包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。
在一些方面，本发明提供了用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防疾病的发展，并且其中包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，本发明提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善疾病的状况，并且其中包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防疾病的进展，并且其中包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善疾病的状况，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防疾病的发展，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用囊泡外佐剂。在一些实施方案中，囊泡外佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在一些方面，本发明提供了用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善疾病的状况，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使疾病相关抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防疾病的发展，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，本发明提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用囊泡外佐剂。在一些实施方案中，囊泡外佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
在上述方面的一些实施方案中，疾病是癌症、传染病或病毒相关疾病。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对个体而言是自体的。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对于个体是同种异体的。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在药物配制品中。在一些实施方案中，全身施用无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，静脉内、动脉内、皮下、肌内或腹膜内施用无核细胞源性囊泡。
在上述方面的一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡与治疗剂组合施用于个体。在一些实施方案中，治疗剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，治疗剂是免疫检查点抑制剂和/或细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-10或IL-15中的一种或多种。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向以下中的任一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)和BTLA。在一些实施方案中，治疗剂是双特异性药剂；例如，包含细胞因子组分和靶向组分的双特异性药剂。在一些实施方案中，双特异性药剂包含靶向组分和针对诸如TGFb等分子的陷阱。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡与化学疗法或放射疗法组合施用于个体。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡与一种或多种改善抗原呈递(例如，CD40或Ox40L)、改善T细胞增殖、和/或改善肿瘤微环境(例如，ICOS)的药剂组合施用于个体。
在上述方面的一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞源性囊泡。
在上述方面的一些实施方案中，佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure BDA0003275917030000071
咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。在一些实施方案中，佐剂是低分子量的poly I:C。
在上述方面的一些实施方案中，输入的无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，红细胞是红血球。在一些实施方案中，红细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是血小板。在一些实施方案中，输入的无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是人类细胞。
在上述方面的一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，缩窄部尺寸随悬液中输入的无核细胞的直径而变。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是悬液中输入的无核细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、约3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，所述细胞悬液在通过缩窄部之前、同时或之后与抗原接触。
在一些方面，本发明提供了包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。在一些方面，本发明提供了包含佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含抗原。在一些方面，本发明提供了包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施方案中，红细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在上述无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞源性囊泡。
在上述无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure BDA0003275917030000091
咪喹莫特、瑞喹莫德和/或LPS。在一些实施方案中，佐剂是低分子量的poly I:C。
在上述无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，输入的无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球。在一些实施方案中，输入的无核细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是血小板。在一些实施方案中，输入的无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是人类细胞。
在上述无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，与施用于哺乳动物后输入的无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物后无核细胞源性囊泡的半衰期降低。在一些实施方案中，与输入的无核细胞的血红蛋白含量相比，无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量降低。在一些实施方案中，与输入的无核细胞的ATP产生相比，无核细胞源性囊泡的ATP产生减少。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡表现出球形形态。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球，并且其中与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红细胞血影。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在组织或细胞中的摄取。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取。在一些实施方案中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包含树突细胞或巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，组织或细胞包括肝或脾中的一种或多种。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
在一些实施方案中，在制备无核细胞源性囊泡期间，无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施方案中，在整个过程中维持细胞悬液的渗量。在一些实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在200mOsm和400mOsm之间。
在上述无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，缩窄部尺寸随悬液中输入的无核细胞的直径而变。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是悬液中输入的无核细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，所述细胞悬液在通过缩窄部之前、同时或之后与抗原接触。
在一些方面，本发明提供了包含多个如本文所述的无核细胞源性囊泡的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，本发明提供了用于产生包含抗原的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在一些方面，本发明提供了用于产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含抗原。
在一些方面，本发明提供了用于产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施方案中，红细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞源性囊泡。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure BDA0003275917030000121
咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。在一些实施方案中，佐剂是低分子量的poly I:C。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，输入的无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球。在一些实施方案中，输入的无核细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是血小板。在一些实施方案中，输入的无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是人类细胞。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，与施用于哺乳动物后输入的无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物后无核细胞源性囊泡的半衰期降低。在一些实施方案中，与输入的无核细胞的血红蛋白含量相比，无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量降低。在一些实施方案中，与输入的无核细胞的ATP产生相比，无核细胞源性囊泡的ATP产生减少。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡表现出球形形态。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球，并且其中与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红细胞血影。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强在组织或细胞中的摄取。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取。在一些实施方案中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包含树突细胞或巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，组织或细胞包括肝或脾中的一种或多种。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，在制备无核细胞源性囊泡期间，无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施方案中，在整个过程中维持细胞悬液的渗量。在一些实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
在上述用于产生无核细胞源性囊泡的方法的一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，缩窄部尺寸随悬液中输入的无核细胞的直径而变。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是悬液中输入的无核细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，所述细胞悬液在通过缩窄部之前、同时或之后与抗原接触。
在一方面，本公开文本提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些实施方案中，母体无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，母体无核细胞是人类细胞。在一些实施方案中，母体无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施方案中，红细胞是红血球或网织红细胞。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。
在一些实施方案中，母体无核细胞是人类细胞，并且其中无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天、约25天、约50天、约75天、约100天、约120天。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红细胞，其中与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平是母体无核细胞中血红蛋白水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红血球，并且其中无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。在一些实施方案中，母体无核细胞是红血球，并且其中与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红细胞或红血球，并且其中无核细胞源性囊泡是红细胞血影(RBC血影)。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或大于约100％的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡产生的ATP低于由母体无核细胞产生的ATP水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡不产生ATP。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强在组织或细胞中的摄取。在一些实施方案中，与母体无核细胞的摄取相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强在肝或脾中的摄取或者被吞噬细胞或抗原呈递细胞的摄取。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
在一些实施方案中，在制备无核细胞源性囊泡期间，母体无核细胞未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施方案中，在由母体无核细胞制备无核细胞源性囊泡期间维持渗量。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：使包含输入的母体无核细胞的悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过，从而产生无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物、纳米颗粒。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与有效载荷孵育足够的时间以允许有效载荷进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含有效载荷的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含佐剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和/或致耐受性因子。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和佐剂，其中无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子，其中无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和致耐受性因子通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和致耐受性因子孵育足够的时间以允许抗原和致耐受性因子进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和致耐受性因子的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间、位于以阵列配置的多个微柱之间、或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约150psi的压力下使输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞悬浮在通过缩窄部之前、同时或之后与有效载荷接触。
在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，抗原源自移植体裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，病毒抗原是病毒、病毒颗粒或病毒衣壳。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。
在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞。
在一些实施方案中，佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。
在另一方面，本公开文本提供了组合物，所述组合物包含多个根据本公开文本所述的无核细胞源性囊泡。
在另一方面，本公开文本提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)与母体无核细胞群相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在另一方面，本公开文本提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞群制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于约20％的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是人类细胞。在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施方案中，红细胞是红血球或网织红细胞。
在一些实施方案中，与母体无核细胞或母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中20％的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞或母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中20％的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是人类细胞，并且其中组合物中20％的无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天。
在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是红细胞，并且其中与母体无核细胞或母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中20％的无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平降低。
在一些实施方案中，与母体无核细胞或母体无核细胞群的平均水平相比，无核细胞源性囊泡的组合物中20％的无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。在一些实施方案中，组合物中20％的无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平为母体无核细胞中的血红蛋白水平或母体无核细胞群的平均水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。
在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是红血球，并且其中组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是红血球，并且其中与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞是红细胞或红血球，并且其中组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含表面磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与母体无核细胞或母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中20％的无核细胞源性囊泡具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与包含多个母体无核细胞的组合物相比，组合物中20％的无核细胞源性囊泡具有高出约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或大于约100％的表面磷脂酰丝氨酸水平。
在一些实施方案中，与母体无核细胞或母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中20％的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。在一些实施方案中，组合物中20％的无核细胞源性囊泡产生的ATP低于母体无核细胞产生的ATP水平或母体无核细胞群的平均水平约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡不产生ATP。
在一些实施方案中，用于制备组合物的母体无核细胞在制备组合物期间未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施方案中，在由母体无核细胞制备无核细胞源性囊泡期间维持渗量。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：使包含输入的母体无核细胞的悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过，从而产生无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是治疗性有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物、纳米颗粒。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与有效载荷孵育足够的时间以允许有效载荷进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含有效载荷的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原。在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含佐剂。在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原和佐剂，其中组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子，其中组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和致耐受性因子通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和致耐受性因子孵育足够的时间以允许抗原和致耐受性因子进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和/或致耐受性因子的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，用于制备组合物的微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部位于多个微柱之间、位于以阵列配置的多个微柱之间、或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，用于制备组合物的孔包含在表面中。在一些实施方案中，用于制备组合物的表面是过滤器。在一些实施方案中，用于制备组合物的表面是膜。在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部的尺寸为细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。在一些实施方案中，用于制备组合物的缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约150psi的压力下使用于制备组合物的输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，用于制备组合物的细胞悬浮在通过缩窄部之前、同时或之后与抗原接触。
在一些实施方案中，组合物中的抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物是移植体裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。
在一些实施方案中，组合物中的抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含多种抗原，其中所述多种抗原被递送至无核细胞。
在一些实施方案中，组合物中的佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。
在一些实施方案中，组合物是药物组合物。
在另一方面，本公开文本提供了制造包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有更高水平的磷脂酰丝氨酸，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生；所述方法包括使包含母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中母体无核细胞的直径而变，从而引起母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡，从而产生无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部位于多个微柱之间、位于以阵列配置的多个微柱之间、或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的孔包含在表面中。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的表面是过滤器。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的表面是膜。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部的尺寸为细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约150psi的压力下使本文所述的制造方法中使用的输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在通过缩窄部之前、同时或之后使本文所述的制造方法中使用的细胞悬液与有效载荷接触，如此使得有效载荷进入细胞。
在一些实施方案中，本文所述的制造方法中使用的有效载荷是治疗性有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物或纳米颗粒。在一些实施方案中，有效载荷是抗原和/或佐剂。在一些实施方案中，有效载荷是抗原和/或致耐受性因子。
在另一方面，本公开文本提供了用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的无核细胞源性囊泡。在另一方面，本公开文本提供了用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法中使用的无核细胞源性囊泡包含治疗性有效载荷。在一些实施方案中，个体患有癌症并且其中有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有癌症并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，个体患有传染病或病毒相关疾病并且其中有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有传染病或病毒相关疾病并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，个体患有自身免疫性疾病并且其中有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有自身免疫性疾病并且其中有效载荷包含抗原和/或致耐受性因子。
在另一方面，本公开文本提供了用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的无核细胞源性囊泡。在另一方面，本公开文本提供了用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，本文所述的预防方法中使用的无核细胞源性囊泡包含抗原。在一些实施方案中，个体患有癌症并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，疾病或障碍是癌症并且抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，个体患有传染病并且其中有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有传染病并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
附图说明
图1A显示每种条件下如通过四聚体染色所测量的抗原特异性T细胞的百分比。图1B显示在用OVA表位SIINFEKL(圆点)重新刺激后，每种条件下如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的IFN-γ阳性细胞的百分比。将仅用抗CD28(不含SIINFEKL)进行的刺激用作阴性对照(方点)，而PMA/离子霉素进行的非特异性刺激用作阳性对照(三角形点)。图1C显示每种条件下各个细胞中IFN-γ的量，如通过ICS中各个细胞的平均荧光强度(MFI)所测量的。图1D显示在用OVA表位SIINFEKL(圆点)重新刺激后，每种条件下如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的IL-2阳性细胞的百分比。将仅用抗CD28(不含SIINFEKL)进行的刺激用作阴性对照(方点)，而PMA/离子霉素进行的非特异性刺激用作阳性对照(三角形点)。图1E显示每种条件下各个细胞中IL-2的量，如通过ICS中各个细胞的平均荧光强度(MFI)所测量的。
图2A显示每种条件下如通过四聚体染色所测量的抗原特异性T细胞的百分比。图2B显示在用OVA表位SIINFEKL(圆点)重新刺激后，每种条件下如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的IFN-γ阳性细胞的百分比。图2C显示在用OVA表位SIINFEKL(圆点)重新刺激后，每种条件下如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的IL-2阳性细胞的百分比。对于图2B和2C，将仅用抗CD28(不含SIINFEKL)进行的刺激用作阴性对照(方点)，而PMA/离子霉素进行的非特异性刺激用作阳性对照(三角形点)。
图3A显示每种条件下如通过四聚体染色所测量的抗原特异性T细胞的百分比。图3B显示在用OVA表位SIINFEKL(圆点)重新刺激后，每种条件下如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的IFN-γ阳性细胞的百分比。图3C显示在用OVA表位SIINFEKL(圆点)重新刺激后，每种条件下如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的IL-2阳性细胞的百分比。对于图3B和3C，将仅用抗CD28(不含SIINFEKL)进行的刺激用作阴性对照(方点)，而PMA/离子霉素进行的非特异性刺激用作阳性对照(三角形点)。
图4显示通过收缩介导的递送而加工的红细胞源性囊泡(SQZ)相比于未加工的输入的红细胞的乳酸水平。
图5A显示针对未处理的RBC(Untrtd)、与D-FITC一起孵育的RBC(非SQZ)以及具有使用SQZ加载的D-FITC的红细胞源性囊泡(SQZ)，来自明场显微镜、用于CellTrace Violet染色(CT)的荧光显微镜、以及用于FITC标记的右旋糖酐(D-FITC)的荧光显微镜的图像。图5B显示未处理的RBC(Untrt)、与D-FITC一起孵育的RBC(非SQZ)、以及具有使用SQZ加载的D-FITC的RBC源性囊泡(SQZ)的磷脂酰丝氨酸染色水平。
图6A显示用于确定由SQZ加工产生的无核细胞源性囊泡的循环半衰期的实验的代表性示意图。图6B显示单独标记的RBC和SQZ加载的RBC源性囊泡随时间的循环水平。图6C显示注射到小鼠体内的RBC和SQZ加载的RBC源性囊泡的混合物在流式图中的前向和侧向散射。
图7A显示在离心未处理的RBC(NC)以及分别在10psi和12psi的压力下进行SQZ加工的RBC源性囊泡之后，细胞沉淀和上清液的外观。图7B显示未处理的RBC(NC)、在10psi和12psi的压力下进行SQZ加工的RBC源性囊泡以及在水中稀释的RBC(裂解对照)的如通过
Figure BDA0003275917030000261
系统所测量的血红蛋白损失(溶血)。
图8A和8B显示如通过分别在与B9-23一起孵育的RBC(Endo对照)和SQZ负载有B9-23的RBC源性囊泡(SQZ)中的2种血红蛋白肽的液相色谱/质谱法所定量的血红蛋白损失(溶血)。
图9显示在SQZ加工中在各种缩窄部宽度和驱动压力下，在RBC源性囊泡的SQZ介导的衍生中血影形成的百分比。
图10显示未加工的鼠RBC和SQZ加工的鼠RBC囊泡在受体小鼠中的体内持久性。
图11A显示参与SQZ加工的RBC源性囊泡的内化的器官。图11B显示参与SQZ加工的RBC源性囊泡的内化的肝和脾内的细胞类型。
图12A显示由SQZ负载有OVA和Poly I:C的RBC源性囊泡诱导的OVA特异性CD4+T细胞增殖的增殖。图12B显示由SQZ负载有OVA和Poly I:C的RBC源性囊泡诱导的OVA特异性CD8+T细胞增殖的增殖。
图13显示对于由SQZ负载有(i)仅Poly I:C、(ii)仅OVA、或(iii)OVA和Poly I:C的RBC源性囊泡诱导施用的小鼠，在离体SIINFEKL重新刺激后内源性CD8+T细胞的响应。
图14显示对于由SQZ负载有(i)仅Poly I:C、(ii)仅E7、或(iii)E7和Poly I:C的RBC源性囊泡诱导的小鼠，在离体E7重新刺激后内源性CD8+T细胞的响应。
图15显示对于用不同的初免和加强给药方案的SQZ负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡处理的小鼠，E7特异性CD8+T细胞的定量。
图16A和16B显示预防性施用SQZ负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡分别对接受E7阳性肿瘤的鼠模型中的肿瘤生长和存活的影响。
图17A和17B显示治疗性施用不同剂量的SQZ负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡分别对携带E7阳性肿瘤的鼠模型中的肿瘤生长和存活的影响。
图18A和18B显示治疗性施用不同给药方案的SQZ负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡分别对携带E7阳性肿瘤的鼠模型中的肿瘤生长和存活的影响。
图19A-19D显示当向携带E7阳性肿瘤的鼠模型施用SQZ负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡时，由SQZ负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡诱导的抗原特异性免疫反应，特别是CD8+T细胞募集到E7阳性肿瘤中(图19A)、肿瘤内对E7具有特异性的CD8+T细胞的百分比(图19B)、肿瘤中E7特异性CD8+T细胞与调节性T细胞的比率(图19C)、以及E7特异性CD8+T细胞与肿瘤重量的相关性(图19D)。
图20A-20C分别显示在E7-SLP(有效载荷)存在下通过SQZ加工产生人RBC源性囊泡时的血影形成、有效载荷递送效率和表面磷脂酰丝氨酸水平。
图21显示人单核细胞源性树突细胞在37℃和0℃对人RBC源性囊泡的内化作用。
图22显示当与负载有CMV抗原和外源性佐剂的人RBC源性囊泡共培养时，由CMV抗原特异性CD8+T细胞进行的IFN-γ产生和分泌。
图23A-23C分别显示当通过SQZ加工产生鼠RBC源性囊泡时的有效载荷递送效率、血影形成以及血影和非血影群体中的表面磷脂酰丝氨酸水平。
图24A显示以下实验的代表性示意图，所述实验用于确定对病毒衣壳的体内抗原依赖性耐受性是否由具有SQZ负载的抗原的无核细胞源性囊泡诱导。图24B显示IFN-γ阳性细胞在初试小鼠、用与SNYNKSVNV(肽)一起孵育的RBC处理的小鼠或用负载SNYNKSVNV的RBC源性囊泡(SQZ)处理的小鼠的脾细胞中的百分比，如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的。图24C显示肽组和SQZ组中的小鼠在43天的过程中的血清萤光素酶水平。
图25A显示以下实验的代表性示意图，所述实验用于确定对抗体的体内抗原依赖性耐受性是否由具有SQZ负载的抗原的无核细胞源性囊泡诱导。图25B显示对照小鼠、注射有游离大鼠IgG2b的小鼠以及注射有SQZ负载有大鼠IgG2b的RBC源性囊泡(SQZ)的小鼠在第20天的血清循环大鼠IgG2b水平，如通过ELISA所测定的。图25C显示在对照、游离大鼠IgG2b和SQZ组中的小鼠在第76天的血清循环大鼠IgG2b水平。
图26A显示以下实验的代表性示意图，所述实验用于确定对B9-23的体内抗原依赖性耐受性是否由具有SQZ负载的抗原的无核细胞源性囊泡诱导。图26B显示在用AAV-NL病毒重新刺激后，IFN-γ或IL-2阳性细胞在对照小鼠、用负载有HEL的RBC源性囊泡(SQZ HEL)处理的小鼠、或用负载有Ins B9-23的RBC源性囊泡(SQZ FAM)处理的小鼠的脾细胞中的百分比，如通过细胞内细胞因子染色(ICS)所测量的。图26C显示以下实验的代表性示意图，所述实验用于确定对1040-p31的体内抗原依赖性耐受性是否由具有SQZ负载的抗原的无核细胞源性囊泡诱导。图26D显示在对照小鼠和用负载有1040-31的RBC源性囊泡(SQZ)处理的小鼠中测量的血清血糖水平。图26E显示对照小鼠和SQZ小鼠的疾病发作，如从血清血糖测量所确定的。
具体实施方式
本申请提供了无核细胞，包括无核细胞源性囊泡(如由输入的无核细胞制备的那些)，及其组合物，其中无核细胞和/或无核细胞源性囊泡负载和/或混合有抗原、佐剂或治疗剂中的一种或多种。本申请还提供了经由本文所述的缩窄部介导的递送(SQZ)产生无核细胞源性囊泡的方法及其使用方法。本申请进一步提供了使用经由本文所述的缩窄部介导的递送(SQZ)产生的无核细胞源性囊泡刺激免疫反应和治疗和/或预防个体中的疾病的方法。
本申请的公开文本至少部分基于以下发现：输入的无核细胞可以由缩窄部介导的递送(SQZ)进行加工以产生无核细胞源性囊泡。本申请的公开文本还至少部分基于以下发现：具有一种或多种抗原和/或佐剂(无论是否包封在无核细胞源性囊泡内)的无核细胞源性囊泡可以诱导体内抗原特异性免疫反应。
本发明提供了用于将抗原和/或佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和/或佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和/或佐剂孵育足够的时间以允许抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡。
本公开文本的某些方面涉及用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将受扰动的输入的无核细胞与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，佐剂也被递送至无核细胞源性囊泡。在其他实施方案中，将佐剂与包含抗原的无核细胞源性囊泡的组合全身施用至个体。
在某些方面，本发明提供了包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和/或佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和/或佐剂孵育足够的时间以允许抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。
在某些方面，本发明提供了用于产生包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和/或佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和/或佐剂孵育足够的时间以允许抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些方面，本申请提供了无核细胞源性囊泡(如由母体无核细胞制备的那些)及其组合物，其中无核细胞源性囊泡负载有有效载荷，如抗原、佐剂或致耐受性因子中的任何一种或多种。本申请还提供了制造本文所述的无核细胞源性囊泡的组合物的方法及其使用方法。
本申请的公开文本还至少部分基于以下发现：包含含有有效载荷(如一种或多种抗原和/或佐剂)的无核细胞源性囊泡的组合物可以诱导体内抗原特异性免疫反应。本申请的公开文本还至少部分基于以下发现：更高剂量的包含负载有一种或多种抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡的组合物可以诱导更大的体内抗原特异性免疫反应。此外，本申请的公开文本至少部分基于以下发现：体内抗原特异性免疫反应可基于以下各项被调节：组合物中的佐剂；包封在无核细胞源性囊泡中的有效载荷(如抗原)的量；和/或用于施用包含无核细胞源性囊泡的组合物的给药策略。本申请的公开文本还至少部分基于以下发现：可以主动调整包含多个无核细胞源性囊泡的组合物以在具有一种或多种选择特性的组合物中产生无核细胞源性囊泡，如无核细胞源性囊泡群。例如，当由母体无核细胞制备无核细胞源性囊泡时，通过调整一个或多个制备参数来实现其中具有无核细胞源性囊泡的所需量和/或性质的无核细胞源性囊泡的组合物的产生。
因此，在一些方面，本文提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在另一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含多个本文所述的任何无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在另一方面，本文提供了组合物，所述组合物包含多个如本文所述的混合有佐剂的任何无核细胞。
在另一方面，本文提供了制造本文公开的组合物的方法，例如，制造包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有更高水平的磷脂酰丝氨酸，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于20％的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生；所述方法包括使包含母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中母体无核细胞的直径而变，从而引起母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡，从而产生无核细胞源性囊泡。
在另一方面，本文提供了本文所述的任何组合物的使用方法。在一些实施方案中，使用方法是用于治疗有需要的个体的疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的任何无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，使用方法是用于预防有需要的个体的疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的任何无核细胞源性囊泡。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。在下文阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献发生冲突的情况下，应该以阐述的定义为准。
如本文所用，除非另外指示，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
如本文所用的术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”以及其他类似形式及其语法等效词旨在在含义上是等效的并且是开放式的，即这些词中的任何一个之后的一个或多个物品并不意味着是此类一个或多个物品的详尽列表，或并不意味着仅限于所列出的一个或多个物品。例如，“包含”组分A、B和C的物品可以由(即仅含有)组分A、B和C组成，或者可以不仅含有组分A、B和C，而且可以含有一种或多种其他组分。因此，目的是并理解“包含”以及其类似形式及其语法等效词包括“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方案的公开。
在提供值范围的情況下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限值和下限值之间的为下限值的单位的十分之一的每个中间值以及所述的范围内的任何其他所述的或中间值涵盖在本公开文本内，受限于在所述的范围中的任何具体排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的任一个或两个限值的范围也被包括在本公开文本之内。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，“无核细胞”是指缺少细胞核的细胞。此类细胞可包括但不限于血小板、红细胞(RBC)(如红血球和网织红细胞)。网织红细胞是未成熟的(例如，尚未双凹的)红细胞，通常占人体红细胞的约1％。网织红细胞也是无核的。在某些实施方案中，本文所述的系统和方法用于处理和/或加工富集的(例如，占总细胞群的百分比大于在自然界中发现的)、纯化的或分离的(例如，从它们的自然环境，以基本上纯的或均质的形式)无核细胞(例如，RBC、网织红细胞、和/或血小板)群。在某些实施方案中，本文所述的系统和方法用于处理和/或加工含有RBC(例如，红血球或网织红细胞)、血小板以及其他血细胞的全血。这些细胞类型的纯化或富集使用已知方法完成，所述已知方法例如密度梯度系统(例如，Ficoll-Hypaque)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁性细胞分选、或成红细胞和类红细胞前体的体外分化。
如本文所用的术语“囊泡”是指包含被脂质双层包围的液体的结构。在一些例子中，脂质双层源自天然存在的脂质组分。在一些例子中，脂质双层可源自细胞膜。在一些例子中，囊泡可源自各种实体，如细胞。在此类例子中，囊泡可以保留来自原始实体的分子(如细胞内蛋白质或膜组分)。例如，源自红细胞的囊泡可含有任何数量的在红细胞和/或红细胞膜组分中的细胞内蛋白质。在一些例子中，除了所需的有效载荷外，囊泡还可包含任意数量的细胞内分子。
如本文所用，“有效载荷”是指被递送至(如加载到)无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)中的物质。“有效载荷”、“货物”、“递送材料”和“化合物”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，有效载荷可以指蛋白质、小分子、核酸(例如，RNA和/或DNA)、脂质、糖类、大分子、维生素、聚合物、荧光染料和荧光团、碳纳米管、量子点、纳米颗粒和类固醇。在一些实施方案中，有效载荷可以指蛋白质或小分子药物。在一些实施方案中，有效载荷可以包含一种或多种化合物。
如本文所用的术语“孔”是指开口，包括但不限于材料内的洞、撕裂、腔、孔口、断裂、间隙或穿孔。在一些例子中，(在指示的情况下)所述术语是指本公开文本的表面内的孔。在其他例子中，(在指示的情况下)孔可以指细胞膜中的孔。
如本文所用的术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。所述术语包括充当边界或衬里的柔韧的片状结构。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或过滤器。所述术语不同于术语“细胞膜”。
如本文所用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或膜。
术语“异源的”当其涉及核酸序列(如编码序列和控制序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞缔合的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或与其附接的核酸区段，所述核酸区段在自然界中未发现与另一分子缔合。例如，核酸构建体的异源区域可以包括如下编码序列，所述编码序列侧接在自然界中未发现与所述编码序列缔合的序列。异源编码序列的另一个例子是如下构建体，其中编码序列自身在自然界中未被发现(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被细胞中通常不存在的构建体转化的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不产生异源DNA。
术语“异源的”当其涉及氨基酸序列(如肽序列和多肽序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞缔合的序列。因此，肽序列的“异源”区域是在另一个氨基酸分子内或与其附接的氨基酸区段，所述氨基酸区段在自然界中未发现与另一分子缔合。例如，肽构建体的异源区域可以包括如下肽的氨基酸序列，所述肽的氨基酸序列侧接在自然界中未发现与所述肽的氨基酸序列缔合的序列。异源肽序列的另一个例子是如下构建体，其中肽序列自身在自然界中未被发现(例如，具有与天然基因所编码不同的氨基酸的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被表达在细胞中通常不存在的氨基酸构建体的载体转化的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不产生异源肽。
术语“外源”在关于涉及细胞的药剂(如抗原或佐剂)使用时，是指从细胞外间隙(即，从细胞外部)递送的药剂。细胞可能具有或可能不具有已经存在的药剂，并且在已递送外源药剂之后可能产生或可能不产生所述药剂。
如本文所用的术语“同源的”是指源自相同生物体的分子。在一些例子中，所述术语是指在给定生物体内通常发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减小疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的传播(例如，转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分的或全部的)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，提高或改善生活质量，增加体重和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(例如像肿瘤体积)。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
如本文所用，术语“调节”可以指改变(changing)、变更(altering)、变化(varying)或以其他方式修饰特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫反应可以指导致改变、变更、变化或以其他方式修饰免疫反应的任何行为。在其他例子中，调节核酸的表达可包括但不限于核酸转录的改变、mRNA丰度的改变(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的相应改变、mRNA翻译的改变等。
如本文所用，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫反应可以是指导致免疫反应的阻断、减少、消除或任何其他拮抗的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的抑制可包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，使mRNA转录沉默)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制、基因编辑等。在其他例子中，对蛋白质表达的抑制可包括但不限于编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的降低、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的降低等。
如本文所用，术语“阻抑”可以指降低、减少、禁止、限制、减低、或以其他方式削弱特定靶标的存在或活性的行为。阻抑可以指部分阻抑或完全阻抑。例如，阻抑免疫反应可以指导致降低、减少、禁止、限制、减低、或以其他方式削弱免疫反应的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的阻抑可包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在其他例子中，对蛋白质表达的阻抑可包括但不限于编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的降低、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的降低等。
如本文所用，术语“增强”可以指提高、加强、强化或以其他方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫反应可以指导致提高、加强、强化或以其他方式增加免疫反应的任何行为。在其他例子中，增强核酸的表达可包括但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的减少、mRNA翻译的增加等。在其他例子中，增强蛋白质的表达可包括但不限于编码蛋白质的核酸转录的增加、编码蛋白质的mRNA稳定性的增加、蛋白质翻译的增加、蛋白质稳定性的增加等。
如本文所用，术语“诱导”可以指引发、激励、刺激、建立或以其他方式产生结果的行为。例如，诱导免疫反应可以指导致引发、激励、刺激、建立或以其他方式产生所希望的免疫反应的任何行为。在其他例子中，诱导核酸表达可包括但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。在其他例子中，诱导蛋白质表达可包括但不限于编码蛋白质的核酸转录的增加、编码蛋白质的mRNA稳定性的增加、蛋白质翻译的增加、蛋白质稳定性的增加等。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA；基因组DNA；cDNA；DNA-RNA杂合体；或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的或生化修饰的非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现的)、或经修饰或经取代的糖或磷酸基团。多核苷酸的骨架可包含通过肽键(即，肽核酸)连接的重复单元，如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸。可替代地，多核苷酸的骨架可包含合成亚基(如氨基磷酸酯)的聚合物，并因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，双链多核苷酸可以从化学合成的单链多核苷酸产物，通过合成互补链并在适当的条件下使这些链退火或者通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链来获得。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。因此，如本文所用，多肽包括短肽。氨基酸残基的此类聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，用于本发明的目的，“多肽”是指相对于天然序列包括修饰(如缺失、添加和取代)的蛋白质(通常在本质上是保守的)，只要所述蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫反应的物质。通常，与单独的抗原相比，将佐剂与抗原结合给予以实现针对抗原的免疫反应的增强。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡聚脱氧核苷酸”和“CpG ODN”是指DNA分子，其含有被磷酸酯隔开的胞嘧啶和鸟嘌呤的二核苷酸(在本文中也称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开文本的CpGODN含有至少一种未甲基化的CpG二核苷酸。也就是说，CpG二核苷酸中的胞嘧啶没有被甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)骨架。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”意指不是生物学上或在其他方面不希望的材料，例如所述材料可以掺入给予患者的药物组合物中而不引起任何显著的不希望的生物学作用或以有害方式与其所处组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和制造测试的要求标准和/或包括在美国食品和药物管理局编写的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
对于本文描述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域已知的。
如本文所用，“微流体系统”是指其中加工低容量(例如，m\L、nL、pL、fL)流体以实现小体积液体的离散处理的系统。本文所述的某些实施方式包括多路复用、自动化和高通量筛选。可以移动、混合、分离或以其他方式加工流体(例如，缓冲液、溶液、含有有效载荷的溶液或细胞悬液)。在本文所述的某些实施方案中，微流体系统用于对悬浮在缓冲液中的细胞施加诱导细胞中的扰动的机械缩窄部(例如，洞)，从而允许有效载荷或化合物进入细胞的细胞溶质中。
如本文所用，“缩窄部”可以指由入口部分、中心点和出口部分限定的微流体通道的一部分，其中中心点由宽度、长度和深度限定。在其他例子中，缩窄部可以指孔或者可以是孔的一部分。孔可以含有在表面(例如，过滤器和/或膜)上。
如本文所用，“缩窄部的宽度”是指微流体通道在中心点的宽度。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为小于约6μm。例如，在一些实施方案中，缩窄部可以小于约0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.5μm或2μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为小于约4μm。在本发明的某些方面，缩窄部的宽度在约0.5μm和约4μm之间。在另外的实施方案中，缩窄部的宽度在约3μm和约4μm之间。在另外的实施方案中，缩窄部的宽度在约2μm和约4μm之间。在另外的方面，缩窄部的宽度为约3.9μm或更小。在另外的方面，缩窄部的宽度为约3.9μm或更小。在另外的方面，缩窄部的宽度为约2.2μm。在某些实施方案中，配置缩窄部使得单个细胞一次性通过缩窄部。
如本文所用，“缩窄部的长度”是指微流体通道在中心点的长度。在本发明的某些方面，缩窄部的长度为约30μm或更小。在一些实施方案中，缩窄部的长度在约10μm和约30μm之间。在某些实施方案中，缩窄部的长度在约10μm和约20μm之间。例如，缩窄部的长度可以为约11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、20μm或25μm中的任何一个，包括约10μm和约30μm之间的所有整数、小数和分数。缩窄部的长度可以变化以增加细胞处于缩窄部的时间长度(例如，在给定的流速下，更长的长度导致更长的缩窄时间)。缩窄部的长度可以变化以减少细胞处于缩窄部的时间长度(例如，在给定的流速下，更短的长度导致更短的缩窄时间)。
如本文所用，“缩窄部的深度”是指微流体通道在中心点的深度。缩窄部的深度可以调节以提供更紧的缩窄部，从而增强输送，这类似于缩窄部宽度的调节。在一些实施方案中，缩窄部的深度在约1μm和约1mm之间，包括在约1μm和约1mm之间的所有整数、小数和分数。在一些实施方案中，深度为约20μm。在一些实施方案中，整个通道的深度是均匀的。在某些实施方案中，在缩窄点处减小深度以导致细胞的更大缩窄。在一些实施方案中，在缩窄点处增加深度以导致细胞的更小缩窄。在一些实施方案中，缩窄部的深度大于缩窄部的宽度。在某些实施方案中，缩窄部的深度小于缩窄部的宽度。在一些实施方案中，缩窄部的深度和缩窄部的宽度相等。
在一些实施方案中，微流体装置的尺寸由缩窄部的长度、缩窄部的宽度和串联的缩窄部的数量表示。例如，具有30μm的长度、5μm的宽度的缩窄部和5个串联缩窄部的微流体装置在本文中表示为30x 5x 5(缩窄部的L x W x#)。
在一些实施方案中，微流体系统包含含有至少一个缩窄部的至少一个微流体通道。在一些实施方案中，微流体系统包含各自含有至少一个缩窄部的多个微流体通道。例如，微流体系统可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000、10,000、20,000个或更多的微流体通道，包括从10至50、50至100、100至500、500、1000、10000至20,000等的所有整数。在某些方面，各自包含一个缩窄部的多个微流体通道并联排列。在某些方面，各自包含一个缩窄部的多个微流体通道线性串联排列。在本发明的某些方面，微流体系统包含含有多个缩窄部的一个微流体通道。例如，一个微流体通道可以包含2、3、4、5、10、20或更多个缩窄部。在一些实施方案中，微流体系统包含含有多个缩窄部的多个微流体通道。在本发明的一些方面，包含多个缩窄部的多个微流体通道并联排列。在本发明的一些方面，包含多个缩窄部的多个微流体通道线性串联排列。
入口部分可以具有“缩窄角度”，所述“缩窄角度”可以变化以增加或减小通道的直径朝向缩窄部的中心点减小的速度。缩窄角度可以变化以使细胞通过时微流体系统的堵塞降至最低。例如，缩窄角度可以在1和140度之间。在某些实施方案中，缩窄角度可以在1和90度之间。出口部分还可以具有角度以减少可能导致非层流的湍流/涡流的可能性。例如，出口部分的角度可以在1和140度之间。在一些实施方案中，出口部分的角度可以在1和90度之间。
微流体通道的截面、入口部分、中心点和出口部分可以变化。各种截面的非限制性例子包括环形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形截面。
也可以改变无核细胞(例如，RBC)通过本文所述的微流体通道的速度以控制递送材料向细胞的递送。例如，调节细胞通过微流体通道的速度可以改变向细胞施加变形力的时间量，并且可以改变向细胞施加变形力的速度。在一些实施方案中，调节细胞通过微流体通道的速度可以改变向细胞施加压力的时间量，并且可以改变向细胞施加压力的速度。在一些实施方案中，细胞能以至少0.1mm/s的速率通过微流体系统。在另外的实施方案中，细胞能以0.1mm/s和5m/s之间的速率(包括其中的所有整数和小数)通过微流体系统。在仍另外的实施方案中，细胞能以10mm/s和500mm/s之间的速率(包括其中的所有整数和小数)通过微流体系统。在一些实施方案中，细胞能以大于5m/s的速率通过系统。
通过施加压力使细胞移动(例如，推动)通过缩窄部。在一些实施方案中，使用细胞驱动器施加所述压力。如本文所用，细胞驱动器是向缓冲液或溶液施加压力或力以驱动细胞通过缩窄部的装置或组件。在一些实施方案中，压力可由细胞驱动器在入口处施加。在一些实施方案中，真空压力可由细胞驱动器在出口处施加。在某些实施方案中，细胞驱动器适于提供约10至约150psi(如约10至约90psi)的压力。在另外的实施方案中，细胞驱动器适于施加120psi的压力。在某些实施方案中，细胞驱动器选自压力泵、气瓶、压缩机、真空泵、注射泵、蠕动泵、移液管、活塞、毛细管作用器、人类心脏、人类肌肉、重力、微流体泵和注射器。对细胞驱动器施加的压力的修改也会影响细胞通过微流体通道的速度(例如，压力量的增加将导致细胞速度增加)。当细胞(例如，无核细胞)通过缩窄部时，细胞膜受到扰动，导致膜暂时破裂，并导致周围介质中存在的有效载荷被摄取。如本文所用，这些暂时破裂被称为“扰动”。由本文所述的方法产生的扰动是细胞中的缺口，其允许来自细胞外的材料移动到细胞内。扰动的非限制性例子包括洞、撕裂、腔、孔口、孔、断裂、间隙或穿孔。由本文所述的方法产生的扰动(例如，孔或洞)不是由于蛋白质亚基组装形成多聚体孔结构(如由补体或细菌溶血素产生的)而形成。
用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法
用于将抗原递送至无核细胞源性囊泡的方法
在某些方面，提供了用于将抗原递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；以及将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡进一步包含佐剂。在一些实施方案中，输入的无核细胞进一步包含佐剂。
在某些方面，提供了用于将佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；以及将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡进一步包含抗原。在一些实施方案中，输入的无核细胞进一步包含抗原。
在某些方面，提供了用于将抗原和佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；以及将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。
用于刺激免疫反应的方法
在某些方面，提供了用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是细胞外佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是囊泡外佐剂。在一些实施方案中，刺激个体对抗原的免疫反应的方法增强了对抗原的预先存在的免疫反应。
在某些方面，提供了用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是细胞外佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是囊泡外佐剂。在一些实施方案中，刺激个体对抗原的预先存在的免疫反应的方法增强了对抗原的免疫反应。
用于治疗或预防个体中的疾病的方法
在某些方面，提供了用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善疾病的状况，并且其中包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防疾病的发展，并且其中包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是细胞外佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是囊泡外佐剂。
在其他方面，提供了用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善疾病的状况，并且其中包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防疾病的进展，并且其中包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善疾病的状况，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防疾病的发展，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是细胞外佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是囊泡外佐剂。
在其他方面，提供了用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善疾病的状况，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使疾病相关抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些方面，提供了用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防疾病的发展，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在某些方面，提供了用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体全身施用佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是细胞外佐剂。在一些实施方案中，全身佐剂是囊泡外佐剂。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，疾病是癌症、传染病或病毒相关疾病。在一些实施方案中，癌症包括以下中的一种或多种：头颈癌、宫颈癌、子宫癌、直肠癌、阴茎癌、卵巢癌、睾丸癌、骨癌、软组织癌、皮肤癌(黑色素瘤)、胃癌、肠癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、脑癌或血癌。在一些实施方案中，传染病或病毒相关疾病与HPV、EBV、HIV、HBV、RSV或KSHV中的一种或多种有关。在一些实施方案中，疾病相关抗原是HPV抗原或HPV相关抗原。在一些实施方案中，HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。在一些实施方案中，HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，HPV相关疾病是HPV相关癌症。在一些实施方案中，HPV相关癌症是宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。在一些实施方案中，HPV相关疾病是HPV相关传染病。在一些实施方案中，HPV相关疾病可以包括寻常疣、足底疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头瘤、疣状囊肿、喉乳头瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、子宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)和阴道上皮内瘤样病变(VAIN)。在某些实施方案中，疾病相关抗原是EBV抗原或EBV相关抗原。在一些实施方案中，EBV抗原或EBV相关抗原是以下中的一种或多种：EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B或EBER。在一些实施方案中，病毒相关疾病是EBV相关疾病。在一些实施方案中，EBV相关疾病是多发性硬化症(MS)。在一些实施方案中，疾病相关抗原是人CMV(HCMV)抗原或HCMV相关抗原。在一些实施方案中，抗原源自以下中的任何一种：Merlin、Toledo、Davis、Esp、Kerr、Smith、TB40E、TB40F、AD169或Towne HCMV菌株。在一些实施方案中，HCMV抗原或HCMV相关抗原源自以下中的一种或多种：pUL48、pUL47、pUL32、pUL82、pUL83和pUL99、pUL69、pUL25、pUL56、pUL94、pUL97、pUL144或pUL128。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HCMV相关疾病。在其他实施方案中，疾病相关抗原是HIV抗原或HIV相关抗原。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HIV相关疾病。机会性感染是在免疫系统较弱的个体(包括具有HIV的人)中更频繁发生且更严重的感染。在一些实施方案中，HIV相关疾病是机会性感染，其可包括但不限于：支气管、气管、食管或肺的念珠菌病；浸润性宫颈癌；球孢子菌病；隐球菌病；慢性肠道隐孢子虫病；巨细胞病毒病；HIV相关脑病；HSV相关的慢性溃疡或支气管炎、肺炎或食管炎；组织胞浆菌病；慢性肠道等孢球虫病；卡波西肉瘤；淋巴瘤；结核病；鸟分枝杆菌复合菌组病(Mycobacterium avium complex，MAC)；卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)；复发性肺炎；进行性多灶性白质脑病；复发性沙门氏菌败血症；脑弓形体病；以及由HIV引起的消耗综合征。
在一些实施方案中，提供了通过向个体引入包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡来治疗个体的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，输入的无核细胞是自体细胞。例如，将输入的无核细胞从个体(例如，患者)中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回同一个体中。因此，在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对个体而言是自体的。在其他实施方案中，输入的无核细胞是同种异体细胞。例如，将无核细胞从不同个体(例如，供体)中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回第一个体(例如，患者)中。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对于个体是同种异体的。在一些实施方案中，根据所公开的方法加工来自多个个体的输入的无核细胞库，并将无核细胞源性囊泡库引入第一个体(例如，患者)中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞从个体中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将无核细胞源性囊泡引入不同的个体中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞群从一个个体(患者)或不同个体分离，使其通过缩窄部以实现抗原和/或佐剂的递送，然后将无核细胞源性囊泡群重新注入患者体内以增强治疗性反应。
在一些方面，本发明提供了通过向个体引入包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡来治疗患者的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，治疗包括向个体引入此类无核细胞源性囊泡的多个(如2、3、4、5、6个或更多个中的任一个)步骤。例如，在一些实施方案中，提供了通过向个体施用包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡2、3、4、5、6次或更多次来治疗个体的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，细胞的任何两次连续施用之间的持续时间为至少约1天(如至少约2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，将输入的无核细胞从个体中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡引入回同一个体(例如，患者)中。例如，将输入的无核细胞群从个体中分离，使其通过缩窄部以实现抗原和/或佐剂的递送，然后将所得的无核细胞源性囊泡重新注入个体体内以增强治疗性免疫反应。在一些实施方案中，将输入的无核细胞从个体中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回个体中。例如，将输入的无核细胞群从个体中分离，使其通过缩窄部以实现抗原和/或佐剂的递送，然后将所得的无核细胞源性囊泡重新注入个体体内以刺激和/或增强个体的免疫反应。
在一些实施方案中，将输入的无核细胞从万能供血者(例如，O型供血者)中分离，然后储存和/或冷冻以用于稍后的缩窄部介导的递送。在一些实施方案中，将抗原从个体中分离并递送至从万能供血者分离的输入的无核细胞中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞从供血者中分离，然后储存和/或冷冻以用于稍后的收缩介导的递送(SQZ)。在一些实施方案中，将抗原从个体中分离并递送至从供血者分离的输入的无核细胞中。在一些实施方案中，包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过上述缩窄部介导的递送产生。在一些实施方案中，将包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡引入个体中。在一些实施方案中，储存和/或冷冻包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡(例如，用于随后的治疗)。在一些实施方案中，个体具有与供血者匹配的血型。在一些实施方案中，包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过上述缩窄部介导的递送产生。在一些实施方案中，将包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡引入个体中。在一些实施方案中，个体具有与供血者匹配的血型。在一些实施方案中，个体具有与供血者不匹配的血型。
在一些实施方案中，提供了通过向个体引入包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡来预防个体中的疾病的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，输入的无核细胞是自体细胞。例如，将输入的无核细胞从个体(例如，患者)中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回同一个体中。因此，在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对个体而言是自体的。在其他实施方案中，输入的无核细胞是同种异体细胞。例如，将无核细胞从不同个体(例如，供体)中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回第一个体(例如，患者)中。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对于个体是同种异体的。在一些实施方案中，根据所公开的方法加工来自多个个体的输入的无核细胞库，并将无核细胞源性囊泡库引入第一个体(例如，患者)中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞从个体中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将无核细胞源性囊泡引入不同的个体中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞群从一个个体(患者)或不同个体分离，使其通过缩窄部以实现抗原和/或佐剂的递送，然后将无核细胞源性囊泡群重新注入患者体内以增强预防性反应。
在一些实施方案中，预防方法包括向个体施用如本文所述的无核细胞源性囊泡的多个(如2、3、4、5、6个或更多个中的任一个)步骤。例如，在一些实施方案中，提供了通过向个体施用包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡2、3、4、5、6次或更多次来给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，细胞的任何两次连续施用之间的持续时间为至少约1天(如至少约2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，提供了通过向个体引入包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡来给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，输入的无核细胞是自体细胞。例如，将输入的无核细胞从个体(例如，患者)中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回同一个体中。因此，在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对个体而言是自体的。在其他实施方案中，输入的无核细胞是同种异体细胞。例如，将无核细胞从不同个体(例如，供体)中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将所得的无核细胞源性囊泡引入回第一个体(例如，患者)中。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡对于个体是同种异体的。在一些实施方案中，根据所公开的方法加工来自多个个体的输入的无核细胞库，并将无核细胞源性囊泡库引入第一个体(例如，患者)中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞从个体中分离、根据所公开的方法进行加工，并且将无核细胞源性囊泡引入不同的个体中。在一些实施方案中，将输入的无核细胞群从一个个体(患者)或不同个体分离，使其通过缩窄部以实现抗原和/或佐剂的递送，然后将无核细胞源性囊泡群重新注入患者体内以诱导预防性反应。
在一些实施方案中，疫苗接种包括向个体施用如本文所述的无核细胞源性囊泡的多个(如2、3、4、5、6个或更多个中的任一个)步骤。例如，在一些实施方案中，提供了通过向个体施用包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡2、3、4、5、6次或更多次来给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡通过使输入的无核细胞通过缩窄部形成无核细胞源性囊泡、如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡而产生。在一些实施方案中，细胞的任何两次连续施用之间的持续时间为至少约1天(如至少约2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。
以上所述的任何方法在体外、离体或体内进行。对于体内应用，所述装置可以植入血管内腔，例如动脉或静脉内的内嵌式支架。在一些实施方案中，所述方法用作床边系统的一部分，用于离体治疗患者细胞并且立即将所述细胞重新引入患者体内。此类方法可用作增强和/或刺激个体的免疫反应的手段。在一些实施方案中，所述方法可以在具有最低限度训练的技术人员的典型医院实验室中实施。在一些实施方案中，可以使用患者操作的治疗系统。在一些实施方案中，所述方法使用内嵌式血液处理系统实施，在所述系统中，血液直接从患者转移，使其通过缩窄部，导致源自血液中的无核细胞的囊泡的形成以及抗原和/或佐剂递送至无核细胞源性囊泡，并且治疗后直接输注回患者中。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在药物配制品中。在一些实施方案中，全身施用无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，静脉内、动脉内、皮下、肌内或腹膜内施用无核细胞源性囊泡。在某些实施方案中，将无核细胞源性囊泡与治疗剂组合施用于个体。在一些实施方案中，治疗剂在无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
在一些实施方案中，治疗剂是免疫检查点抑制剂和/或细胞因子。在一些实施方案中，治疗剂包含以下中的一种或多种：IFN-α、IFN-γ、IL-2(其天然形式或修饰形式中的任一种)、IL-10或IL-15。在一些实施方案中，治疗剂是一种或多种形式的免疫疗法。免疫疗法包括但不限于：单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、细胞因子、治疗癌症的疫苗和过继细胞转移。在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括施用免疫疗法。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向以下中的任一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)和BTLA。在一些实施方案中，治疗剂是双特异性药剂；例如，包含细胞因子组分和靶向组分的双特异性药剂。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡与化学疗法或放射疗法组合施用于个体。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡与一种或多种改善抗原呈递、改善T细胞增殖、和/或改善肿瘤微环境的药剂组合施用于个体。
无核细胞
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，输入的无核细胞是哺乳动物细胞。无核细胞缺少细胞核。在一些实施方案中，无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。在一些实施方案中，无核细胞是人类细胞。在一些实施方案中，无核细胞是非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，无核细胞是鸡、蛙、昆虫、鱼或线虫细胞。
在一些实施方案中，无核细胞是红细胞。红细胞(RBC)是有弹性的椭圆形双凹盘，其细胞质富含携带氧的生物分子血红蛋白。RBC用作整个人体中输送氧和清除二氧化碳的主要手段。RBC可以在循环中停留长达120天，之后它们会通过肝和脾的清除从体内移除。在一些实施方案中，无核细胞是RBC的前体。在一些实施方案中，无核细胞是网织红细胞。网织红细胞是无核的未成熟(尚未双凹的)红细胞，并且通常占人体红细胞的约1％。成熟的红细胞也称为红血球。在一些实施方案中，无核细胞是红血球。在一些实施方案中，无核细胞是血小板。血小板，也称为凝血细胞，是血液的一种成分，其功能涉及血液凝固。血小板是直径为2-3μm的双凸盘状(透镜状)结构。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中的呈递增强对抗原的免疫反应和/或刺激对抗原的免疫反应。源自凋亡小体(如无核细胞源性囊泡，其可以在肝和脾的免疫原性环境中清除)的抗原可以通过激活T细胞来刺激和/或增强对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗原特异性的。无核细胞源性囊泡(如红细胞源性囊泡)的寿命有限，无法自我修复，引起红细胞衰亡(eryptosis)(一种类似于细胞凋亡的过程)，这导致随后从血流中去除无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，抗原可以在无核细胞源性囊泡进行红细胞衰亡后于免疫原性环境内释放，随后在那里被抗原呈递细胞吞没、加工以及呈递。在一些实施方案中，包含抗原的无核细胞源性囊泡被抗原呈递细胞吞噬，随后抗原被抗原呈递细胞加工和呈递。在一些实施方案中，包含抗原的无核细胞源性囊泡被驻留型巨噬细胞吞噬，随后抗原被驻留型巨噬细胞加工和呈递。
在一些实施方案中，随后呈递包含在无核细胞源性囊泡中的抗原。在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中的呈递刺激对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中被加工。在一些实施方案中，免疫反应是抗原特异性的。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含佐剂。在一些实施方案中，佐剂产生或促进免疫原性环境，其中抗原在所述免疫原性环境中的呈递刺激对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，免疫刺激是多特异性的，包括对多种抗原的免疫反应的刺激。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法包括使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过缩窄部，其中所述缩窄部使输入的无核细胞变形，从而引起输入的无核细胞的扰动以形成无核细胞源性囊泡，如此使得抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中被呈递。在一些实施方案中，佐剂产生或促进免疫原性环境，其中抗原在免疫原性环境中的呈递刺激对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中被加工。在一些实施方案中，免疫刺激是抗原特异性的。在一些实施方案中，免疫刺激是多特异性的，包括对多种抗原的免疫反应的刺激。
在根据本文所述的任何方法的某些实施方案中，所述方法包括使包含第一输入的无核细胞的第一细胞悬液通过缩窄部，其中所述缩窄部使细胞变形，从而引起第一输入的无核细胞的扰动，如此使得抗原进入源自扰动第一输入的无核细胞的囊泡，使包含第二输入的无核细胞的第二细胞悬液通过缩窄部，其中所述缩窄部使第二输入的无核细胞变形，从而引起第二输入的无核细胞的扰动，如此使得佐剂进入源自扰动第二输入的无核细胞的囊泡，并且将源自第一输入的无核细胞的囊泡和源自第二输入的无核细胞的囊泡引入个体中，从而刺激对抗原的免疫反应。因此，在一些实施方案中，源自第一输入的无核细胞的囊泡包含抗原，并且源自第二输入的无核细胞的囊泡包含佐剂。在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中被呈递。在一些实施方案中，佐剂产生或促进免疫原性环境，其中抗原在免疫原性环境中的呈递刺激对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中被加工。在一些实施方案中，同时引入源自第一输入的无核细胞的囊泡和源自第二输入的无核细胞的囊泡。在一些实施方案中，顺序地引入源自第一输入的无核细胞的囊泡和源自第二输入的无核细胞的囊泡。在一些实施方案中，在引入源自第二输入的无核细胞的囊泡之前，将源自第一输入的无核细胞的囊泡引入个体中。在一些实施方案中，在引入源自第二输入的无核细胞的囊泡之前超过约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时中的任一个，将源自第一输入的无核细胞的囊泡引入个体中。在一些实施方案中，在引入源自第二输入的无核细胞的囊泡之前超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天中的任一个，将源自第一输入的无核细胞的囊泡引入个体中。在一些实施方案中，在引入源自第一输入的无核细胞的囊泡之前，将源自第二输入的无核细胞的囊泡引入个体中。在一些实施方案中，在引入源自第一输入的无核细胞的囊泡之前超过约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时中的任一个，将源自第二输入的无核细胞的囊泡引入个体中。在一些实施方案中，在引入源自第一输入的无核细胞的囊泡之前超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天中的任一个，将源自第二输入的无核细胞的囊泡引入个体中。在一些实施方案中，免疫刺激是抗原特异性的。在一些实施方案中，免疫刺激是多特异性的，包括对多种抗原的免疫反应的刺激。
在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括增加的T细胞反应。例如，增加的T细胞反应可包括但不限于增加的T细胞活化或增殖、增加的T细胞存活或增加的细胞功能。在一些实施方案中，增加的T细胞反应包括增加的T细胞活化。在一些实施方案中，增加的T细胞反应包括增加的T细胞存活。在一些实施方案中，增加的T细胞反应包括增加的T细胞增殖。在一些实施方案中，增加的T细胞反应包括增加的T细胞功能。例如，增加的T细胞功能可包括但不限于经调节的细胞因子分泌、增加的T细胞向炎症部位的迁移和增加的T细胞的细胞毒性活性。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括增加的炎性细胞因子产生和/或分泌、和/或减少的抗炎细胞因子产生和/或分泌。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括一种或多种炎性细胞因子的增加的产生和/或分泌，所述炎性细胞因子选自白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-12和IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素γ(IFN-γ)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括一种或多种抗炎细胞因子的减少的产生和/或分泌，所述抗炎细胞因子选自IL-4、IL-10、IL-13、IL-35、IFN-α和转化生长因子-β(TGF-β)。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括T细胞表型的变化。例如，T细胞状态可能从调节(Treg)或抗炎表型变为促炎表型。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应阻抑T细胞的非特异性激活，否则其随后可能导致细胞死亡。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括受阻抑的Treg反应。在一些实施方案中，经刺激和/或增强的免疫反应包括增加的B细胞反应。在一些实施方案中，增加的B细胞反应包括增加的抗体产生。
无核细胞源性囊泡
在一些方面，本申请提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在某些方面，提供了包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在某些方面，提供了包含佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含抗原。
在某些方面，提供了包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是哺乳动物细胞。无核细胞缺少细胞核。在一些实施方案中，输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是人类细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是鸡、蛙、昆虫、鱼或线虫细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红细胞的前体。在一些实施方案中，输入的无核细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是血小板。
在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中的呈递增强对抗原的免疫反应或诱导对抗原的免疫反应。源自红细胞衰亡小体(如无核细胞源性囊泡，其可以在肝和脾的免疫原性环境中清除)的抗原可以通过激活T细胞来刺激和/或增强对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗原特异性的。无核细胞源性囊泡(如RBC源性囊泡)的寿命有限，无法自我修复，引起红细胞衰亡(一种类似于细胞凋亡的过程)，这导致从血流中去除无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，抗原可以在无核细胞源性囊泡进行红细胞衰亡后于免疫原性环境内释放，随后在那里被抗原呈递细胞吞没、加工以及呈递。在一些实施方案中，含有抗原的无核细胞源性囊泡被抗原呈递细胞(如巨噬细胞)吞噬，随后抗原被抗原呈递细胞加工和呈递。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是驻留型巨噬细胞。
在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是血小板。在一些实施方案中，红细胞是红血球。在一些实施方案中，红细胞是网织红细胞。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。用于测量细胞(如无核细胞，例如红细胞)或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法是本领域已知的。参见例如Franco,RS,Transfus Med Hemother,39,2012。例如，在一些实施方案中，用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法包括群组标记技术或随机标记技术。在一些实施方案中，用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法包括标记、再输注细胞或囊泡、以及测量再输注后的消失。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或母体无核细胞或者输入的无核细胞或母体无核细胞群的对照)的半衰期。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％，如超过约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低约50％至约99.9％，如约70％至约99.9％、约85％至约99.9％、或约95％至约99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天或10天中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的循环半衰期为约0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天中的任一个。
在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是人类细胞，并且其中无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天或10天中的任一个。在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是人类细胞，并且其中无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天中的任一个。
在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红细胞，其中与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低。测量细胞(如无核细胞，例如红细胞)或无核细胞源性囊泡(例如红细胞源性囊泡)的血红蛋白水平的方法是本领域已知的。参见例如Chaudhary,R.,J Blood Med,8,2017。例如，在一些实施方案中，所述方法包括测量代谢前体或产物以确定血红蛋白的周转。在一些实施方案中，所述方法包括测量一种或多种血红蛋白衍生(Hb)肽。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或母体无核细胞或者输入的无核细胞或母体无核细胞群的对照)的血红蛋白水平。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞的特征在于细胞内组分的减少(例如水平降低)。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低约50％至约99.9％，如约70％至约99.9％、约85％至约99.9％、或约95％至约99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡不含血红蛋白。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平为输入的无核细胞或母体无核细胞中血红蛋白水平的约0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％中的任一个。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的一种或多种血红蛋白(Hb)肽的水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的一种或多种Hb肽的水平降低约50％至约99.9％，如约70％至约99.9％、约85％至约99.9％、或约95％至约99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的一种或多种Hb肽的水平降低约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。
在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红血球，并且其中无核细胞源性囊泡的形态由输入的无核细胞或母体无核细胞的形态调节。形态涉及例如细胞或细胞源性囊泡的形状、结构、几何形状、强度、形式、光滑度、粗糙度、圆形度、体积、表面积和/或大小的分类。用于确定(如测量)形态的方法是本领域已知的。参见例如Boutros等人,Cell,163,2015；Girasole,M.等人,Biochim Biophys Acta Biomembr,1768,2007；以及Chen等人,Comput Math Methods Med,2012。在一些实施方案中，用于确定形态的方法包括高内涵成像。例如，细胞形态可以通过用Hoechst染料染色、然后进行自动高内涵图像分析来评估。在其他例子中，形态可以通过来自流式细胞术的前向和侧向散射图的偏移来确定。在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红血球，并且其中无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红血球，并且其中与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的形态的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或母体无核细胞或者输入的无核细胞或母体无核细胞群的对照)的形态。
在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红血球，并且其中与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状，如减小超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的特征在于球形形态，包括基本上球形的形态。在一些实施方案中，定性评估无核细胞源性囊泡的球形形态。在一些实施方案中，定量评估无核细胞源性囊泡的球形形态。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的表面积与体积比，如减小超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的任一个。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的多个直径测量值的每个直径测量值之间的变化小于约50％，如小于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一个，其中多个直径测量值包括测量无核细胞源性囊泡的不同点处的直径的至少两个直径测量值。
在一些实施方案中，悬液中无核细胞源性囊泡的最小尺寸(如直径)为约5μm至约7.25μm，如约6μm至约7μm、或约6.25μm至约6.75μm中的任一个。在一些实施方案中，悬液中无核细胞源性囊泡的最小尺寸(如直径)为至少约5μm，如至少约5.25μm、5.5μm、5.75μm、6μm、6.25μm、6.5μm、6.75μm、7μm或7.25μm中的任一个。在一些实施方案中，悬液中无核细胞源性囊泡的最大尺寸(如直径)为约5μm至约7.25μm，如约6μm至约7μm、或约6.25μm至约6.75μm中的任一个。在一些实施方案中，悬液中无核细胞源性囊泡的最大尺寸(如直径)不大于约7.25μm，如不大于约7μm、6.75μm、6.5μm、6.25μm、6μm、5.75μm、5.5μm、5.25μm或5μm中的任一个。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡表现出以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些实施方案中，输入的无核细胞或母体无核细胞是红细胞或红血球，并且无核细胞源性囊泡是红细胞血影(RBC血影)。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞的特征在于特性的获得，如水平的增加。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。暴露于外细胞膜上的磷脂酰丝氨酸是细胞凋亡的标志，其被吞噬细胞上的受体以促进吞没的方式识别。测量细胞(如无核细胞，例如红细胞)或无核细胞源性囊泡的磷脂酰丝氨酸水平(如表面磷脂酰丝氨酸水平)的方法是本领域已知的。参见例如Morita,S.等人,J Lipid Res,53,2012；Kay,J.G.等人,Sensors(Basel),11,2011；以及Fabisiak JP等人,Methods Mol Biol,1105,2014。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的磷脂酰丝氨酸水平的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或母体无核细胞或者输入的无核细胞或母体无核细胞群的对照)的磷脂酰丝氨酸水平。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡每单位体积在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位体积在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡每单位表面积在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位表面积在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡每单位膜磷脂在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位膜磷脂在其表面上具有多出大于约1.5倍，如多出大于约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出约50％至约200％，如多出约50％至约100％、约100％至约200％、或约75％至约125％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位体积在其表面上具有多出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位体积在其表面上具有多出约50％至约200％，如多出约50％至约100％、约100％至约200％、或约75％至约125％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位表面积在其表面上具有多出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位表面积在其表面上具有多出约50％至约200％，如多出约50％至约100％、约100％至约200％、或约75％至约125％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位膜磷脂在其表面上具有多出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡每单位膜磷脂在其表面上具有多出约50％至约200％，如多出约50％至约100％、约100％至约200％、或约75％至约125％中的任一个的磷脂酰丝氨酸。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99.5％的总膜磷脂酰丝氨酸位于无核细胞源性囊泡的外膜小叶上。在一些实施方案中，大于50％的总膜磷脂酰丝氨酸位于无核细胞源性囊泡中的外膜小叶上。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出高出约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％中的任一个的平均磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出高出约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或100倍中的任一个的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任一个的群体分布显示出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。
在一些实施方案中，可以进一步修改无核细胞源性囊泡的半衰期。在一些实施方案中，通过进一步修改使无核细胞源性囊泡的半衰期增加。例如，可以修饰无核细胞源性囊泡以增加无核细胞源性囊泡在肝和脾中清除之前在血流中循环的时间。在一些实施方案中，通过修改使无核细胞源性囊泡的半衰期进一步降低。例如，可以修饰无核细胞源性囊泡以减少无核细胞在肝和脾中清除之前在血流中循环的时间。在一些实施方案中，在无核细胞源性囊泡表面上的磷脂的比例的改变降低了无核细胞源性囊泡的半衰期。在一些实施方案中，在无核细胞源性囊泡表面上的磷脂酰丝氨酸与其他磷脂的比率的增加降低了无核细胞源性囊泡的半衰期。例如，可以进一步增加无核细胞源性囊泡表面上的磷脂酰丝氨酸的存在以降低无核细胞源性囊泡的半衰期，如通过使用本领域已知的用于增加表面磷脂酰丝氨酸的任何方法所进行的(参见Hamidi等人,J.Control.Release,2007,118(2):145-60)。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前与脂质或磷脂一起孵育。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前用化学物质(如双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯或其他交联剂)处理。在其他实施方案中，可以减少无核细胞源性囊泡的表面磷脂酰丝氨酸以增加无核细胞源性囊泡的半衰期。翻转酶是质膜中将磷脂从外表面运输到胞质表面的酶。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前用翻转酶处理。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前用切割磷脂酰丝氨酸的酶处理。切割磷脂酰丝氨酸的酶的非限制性例子是磷脂酰丝氨酸羧化酶。
在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡随时间推移具有减少的ATP产生或细胞内ATP水平。测量细胞(如无核细胞，例如红细胞)或无核细胞源性囊泡的ATP(如随时间减少的ATP产生或细胞内ATP水平)的方法是本领域已知的。参见例如Morciano,G.等人,Nat Protoc,12,2017。在一些实施方案中，通过替代物或标记物(如乳酸产生)测量ATP产生。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的ATP产生的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或母体无核细胞或者输入的无核细胞或母体无核细胞群的对照)的ATP产生。在一些实施方案中，用于测量ATP产生的方法允许比较样品和对照之间的ATP产生，并且包括在相似条件下测量样品和对照的ATP产生。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞源性囊泡的ATP产生或细胞内ATP水平的方法包括测量无核细胞源性囊泡群中的无核细胞源性囊泡在第一次和第二次的ATP产生或细胞内ATP水平，其中第一次在第二次之前，并将第一次和第二次的结果进行比较。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡产生的ATP低于由输入的无核细胞或母体无核细胞产生的ATP水平的约0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡不产生ATP。
在一些实施方案中，通过乳酸测定来确定ATP产生。在一些实施方案中，为了测量输入的无核细胞与无核细胞源性囊泡的代谢活性(如ATP产生)，可以通过使用荧光酶促测定法监测乳酸产生水平来随时间间接测量糖酵解水平。例如，将输入的无核细胞以1十亿个细胞/mL重新悬浮在具有腺嘌呤的柠檬酸-磷酸-右旋糖(dCPDA-1)缓冲液中，并在室温下通过SQZ(2.2μm缩窄部宽度，在50psi下)递送模型抗原和/或佐剂(20μg/mL)以生成无核细胞源性囊泡。然后将无核细胞源性囊泡以及未加工的输入的无核细胞在37℃孵育指定的时间点，并收集上清液。为了定量输入的无核细胞与无核细胞源性囊泡产生的乳酸水平，可以使用乳酸-Glo测定法(Promega)来测定来自各个时间点的上清液。简而言之，在加入荧光乳酸检测试剂之前，对上清液进行灭活和中和步骤。将荧光相对于空白对照进行归一化，并使用乳酸标准曲线确定上清液中的绝对乳酸水平(0.1-10μM)。在一些实施方案中，绝对乳酸水平为约0μM至约200μM，如约0.01μM至约10μM、约0.01μM至约中的任一个。
在一些方面，本申请提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有如本文进一步描述的以下任何一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些方面，本申请提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有如本文进一步描述的以下任何两种或更多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些方面，本申请提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有如本文进一步描述的以下任何三种或更多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些方面，本申请提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有如本文进一步描述的以下任何四种或更多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些方面，本申请提供了由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有如本文进一步描述的以下特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些实施方案中，与母体无核细胞的摄取相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强在组织或细胞中的摄取(如增加摄取)。在一些实施方案中，与母体无核细胞在各自组织中的摄取相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强在肝和/或脾中的摄取(如增加摄取)。在一些实施方案中，与母体无核细胞在各自的吞噬细胞中的摄取相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强在吞噬细胞或抗原呈递细胞(如巨噬细胞或树突细胞)中的摄取(如增加摄取)。在一些实施方案中，巨噬细胞是脂肪组织巨噬细胞、单核细胞、枯否(Kupffer)细胞、窦组织细胞、肺泡巨噬细胞、组织巨噬细胞、小胶质细胞、霍夫鲍尔细胞、肾小球内系膜细胞、破骨细胞、类上皮细胞、红髓巨噬细胞、腹膜巨噬细胞或LysoMac。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是非专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被肝和/或脾中的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞清除，从而导致抗原呈递(包括通过CD8+和CD4+T细胞反应)。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，经修饰的无核细胞源性囊泡在组织或细胞中的摄取率提高超过约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍、约50倍、约100倍、约200倍、约500倍或约1000倍中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包含巨噬细胞和/或树突细胞。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡表现出在肝、脾或巨噬细胞中的摄取增强。在一些实施方案中，与输入的无核细胞或母体无核细胞的摄取相比，无核细胞源性囊泡表现出在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取增强。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在肺中未被清除。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被肝和/或脾中的巨噬细胞清除，从而导致抗原呈递(包括通过CD8+和CD4+T细胞反应)。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在组织或细胞中的摄取。在一些实施方案中，与未修饰的无核细胞源性囊泡相比，经修饰的无核细胞源性囊泡在组织或细胞中的摄取率提高超过约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍、约50倍、约100倍、约200倍、约500倍或约1000倍中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取。在一些实施方案中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包含巨噬细胞和/或树突细胞。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在肝、脾或巨噬细胞中的摄取。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被修饰以与输入的无核细胞或母体无核细胞的摄取相比增强在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在肺中未被清除。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡被肝和/或脾中的巨噬细胞清除，从而导致抗原呈递(包括通过CD8+和CD4+T细胞反应)。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
在一些实施方案中，在制备无核细胞源性囊泡期间，无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。在某些实施方案中，无核细胞源性囊泡未经热处理或热休克。在某些实施方案中，无核细胞源性囊泡未用化学物质(如双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯或其他交联剂)处理。在某些实施方案中，无核细胞源性囊泡未被进一步修饰以表达或含有离子载体或其他离子转运蛋白。在某些实施方案中，无核细胞源性囊泡不与诸如抗TER119等抗体相关联。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，在整个过程中维持细胞悬液的渗量。在另外的实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。在一些实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间。在另外的实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在约200mOsm和约800mOsm之间。在一些实施方案中，细胞悬液的渗量维持在以下任一项之间：约200mOsm和约300mOsm之间、约300mOsm和约400mOsm之间、约400mOsm和约500mOsm之间、约500mOsm和约600mOsm之间、约600mOsm和约700mOsm之间、约700mOsm和约800mOsm之间、约200mOsm和约400mOsm之间、约400mOsm和约600mOsm之间、或约600mOsm和约800mOsm之间。在一些实施方案中，在由输入的无核细胞或母体无核细胞制备无核细胞源性囊泡期间维持渗量。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间，如在约200mOsm和约300mOsm之间、约200mOsm和约400mOsm之间、约200mOsm和约500mOsm之间、约300mOsm和约500mOsm之间、或约350mOsm和约450mOsm之间中的任一个。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
在一些实施方案中，细胞悬液在通过缩窄部之前、同时和/或之后与抗原接触。
在根据本文所述的任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，提供了包含多个无核细胞源性囊泡的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
抗原和佐剂
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在另外的实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物源自个体的活体组织检查。在一些实施方案中，裂解物源自被病原体(如细菌或病毒)感染的个体的活体组织检查。在一些实施方案中，裂解物源自荷瘤个体的活体组织检查(即肿瘤活体组织检查裂解物)。因此，在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原源自移植体裂解物。在一些实施方案中，裂解物源自移植器官的活体组织检查。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含含有免疫原性表位的抗原。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原源自从患病细胞分离的肽或mRNA。在一些实施方案中，抗原源自在患病细胞中异位表达或过表达的蛋白质。在一些实施方案中，抗原源自新生抗原，例如，癌症相关的新生抗原。在一些实施方案中，抗原包含新表位，例如，癌症相关的新表位。在一些实施方案中，抗原是非自身抗原。在一些实施方案中，抗原是突变的或以其他方式改变的自身抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原包含与异源肽序列融合的免疫原性表位。在一些实施方案中，抗原包含多个免疫原性表位。在一些实施方案中，多个免疫原性表位中的一些源自同一来源。例如，在一些实施方案中，多个免疫原性表位中的一些源自同一病毒抗原。在一些实施方案中，多个免疫原性表位全部源自同一来源。在一些实施方案中，多个免疫原性表位均不源自同一来源。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含多种不同的抗原。在一些实施方案中，将多种抗原(如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同类型抗原中的任一种)递送至无核细胞。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，抗原是多肽抗原。在一些实施方案中，抗原是非蛋白质抗原。例如，在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原，如多糖。在一些实施方案中，抗原是糖脂。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，抗原是完整的微生物，如完整的细菌。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原源自外来来源，如细菌、真菌、病毒或过敏原。在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。例如，抗原可以与治疗剂或靶向肽融合。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原，其中所述抗原包含免疫原性表位。在一些实施方案中，抗原是多肽并且免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合的免疫原性肽表位是非天然存在的序列。在一些实施方案中，N末端和/或C末端侧翼多肽是非天然的。在一些实施方案中，与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合的免疫原性肽表位是合成的。在一些实施方案中，N末端和/或C末端侧翼多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施方案中，N末端和/或C末端侧翼多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原包含多种免疫原性表位，并且能够被加工成MHC I类限制性肽和MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，包含抗原的无核细胞源性囊泡被抗原呈递细胞摄取，并且抗原被抗原呈递细胞加工成一种或多种MHC I类限制性肽和/或一种或多种MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，CD-1限制性抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原包含多个免疫原性表位，并且能够被加工成多种CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，包含抗原的无核细胞源性囊泡被抗原呈递细胞摄取，并且抗原被抗原呈递细胞加工成一种或多种CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，抗原包含多个免疫原性表位，并且能够被加工成一种或多种(a)MHC I类限制性肽；(b)MHC II类限制性肽；或(c)CD-1限制性抗原。在一些实施方案中，多个免疫原性表位中的一些源自同一来源。在一些实施方案中，多个免疫原性表位全部源自同一来源。在一些实施方案中，多个免疫原性表位均不源自同一来源。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含多种含有多个免疫原性表位的抗原。在一些实施方案中，在向个体施用包含多种含有多个免疫原性表位的抗原的无核细胞源性囊泡后，所述多个免疫原性表位都没有降低个体对任何其他免疫原性表位的免疫反应。
在根据本文所述的任何方法或任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含佐剂。在一些实施方案中，佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C(低和/或高分子量)、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure BDA0003275917030000691
咪喹莫特、瑞喹莫德和/或脂多糖(LPS)。在一些实施方案中，佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，佐剂是低分子量的poly I:C。在一些实施方案中，CpG ODN的长度不超过约50个(如不超过约45、40、35、30、25、20、或更少中的任一个)核苷酸。在一些实施方案中，CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。在一些实施方案中，CpG ODN包含如美国临时申请US 62/641,987中披露的核苷酸序列。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含多种不同的CpG ODN。例如，在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含选自A类、B类和C类CpG ODN的多种不同的CpG ODN。在一些实施方案中，将多种佐剂(如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同类型佐剂中的任一种)递送至无核细胞。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和/或佐剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含浓度在约1pM和约10mM之间的抗原。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含浓度在约1pM和约10mM之间的佐剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含浓度在约0.1μM和约10mM之间的抗原。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含浓度在约0.1μM和约10mM之间的佐剂。例如，在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中佐剂的浓度是小于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中佐剂的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中抗原的浓度是小于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中抗原的浓度是以下中任何一个：在约1pM和约10pM之间、在约10pM和约100pM之间、在约100pM和约1nM之间、在约1nM和约10nM之间、在约10nM和约100nM之间、在约100nM和约1μM之间、在约1μM和约10μM之间、在约10μM和约100μM之间、在约100μM和约1mM之间、或在1mM和约10mM之间。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中佐剂的浓度是以下中任何一个：在约1pM和约10pM之间、在约10pM和约100pM之间、在约100pM和约1nM之间、在约1nM和约10nM之间、在约10nM和约100nM之间、在约100nM和约1μM之间、在约1μM和约10μM之间、在约10μM和约100μM之间、在约100μM和约1mM之间、或在1mM和约10mM之间。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中佐剂与抗原的摩尔比为约10000:1至约1:10000中的任一个。例如，在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中佐剂与抗原的摩尔比为约10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含复合物，所述复合物包含：a)抗原，b)佐剂，和/或c)抗原和佐剂。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡进一步包含另外的药剂，当与不包含另外的药剂的相应无核细胞源性囊泡相比，另外的药剂增强无核细胞源性囊泡的功能。在一些实施方案中，另外的药剂是稳定剂或辅因子。在一些实施方案中，药剂是白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，另外的药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡进一步包含一种或多种治疗剂。
其他有效载荷
在一些实施方案中，有效载荷是致耐受性因子。在一些实施方案中，有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物(如基于蛋白质的复合物、核酸复合物、蛋白质-蛋白质复合物、核酸-核酸复合物、或蛋白质-核酸复合物)、纳米颗粒、病毒或病毒颗粒。
在一些实施方案中，有效载荷选自尿酸酶(包括半合成形式，例如培戈洛酶(Pegloticase))、葡糖脑苷脂酶(例如伊米苷酶、维拉苷酶α(velaglucerase alfa)、β-葡糖苷酶)、组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)(例如阿福他酶α(Asfotase alfa))、溶酶体酸性脂肪酶(例如塞贝脂酶α(Sebelipase alfa))、α-葡糖苷酶(例如阿糖苷酶α)、α-L-艾杜糖苷酸酶(例如Iaronidase)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(例如艾杜硫酸酯酶)、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、6-硫酸软骨素(例如依罗硫酸酯酶α(elosulfase alfa))、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(例如加硫酶)、β-葡糖醛酸酶、透明质酸酶、α-半乳糖苷酶A(例如半乳糖苷酶β(agalsidase beta))、苯丙氨酸羟化酶、中链酰基-CoA脱氢酶、醇溶蛋白、乙酰胆碱受体和受体相关蛋白、促甲状腺激素受体(TSHR)、桥粒芯蛋白1和3、水通道蛋白4、GADD65、胰岛素、胰岛素原和前胰岛素原。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与有效载荷孵育足够的时间以允许有效载荷进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含有效载荷的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子。在一些实施方案中，致耐受性因子增强对抗原的免疫反应的抑制和/或增强对抗原的耐受性的诱导。在一些实施方案中，致耐受性因子可促进抗原呈递细胞对抗原的致耐受性呈递。在一些实施方案中，致耐受性因子包含多肽。在一些实施方案中，多肽是IL-4、IL-10、IL-13、IL-35、IFN-α或TGF-β。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽的片段。在一些实施方案中，多肽与糖类缀合。在一些实施方案中，致耐受性因子是核酸。在一些实施方案中，核酸可包括但不限于mRNA、DNA、miRNA或siRNA。例如，致耐受性因子可以包括siRNA以敲低炎症基因的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子是结合NF-κB并阻止NF-κB活化和下游信号传导的DNA序列。在一些实施方案中，致耐受性因子是小分子。
在一些实施方案中，致耐受性因子调节免疫调节剂(如免疫刺激剂(例如共刺激分子)、免疫抑制剂或炎性或抗炎分子)的表达和/或活性。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制免疫刺激剂(例如共刺激分子)的表达和/或活性、增强免疫抑制分子的表达和/或活性、抑制炎性分子的表达和/或活性、和/或增强抗炎分子的表达和/或活性。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制共刺激分子的活性。共刺激分子与其配体之间的相互作用对于维持和整合TCR信号传导以刺激最佳T细胞增殖和分化非常重要。在一些实施方案中，致耐受性因子降低共刺激分子的表达。在抗原呈递细胞上表达的示例性共刺激分子包括但不限于CD40、CD80、CD86、CD54、CD83、CD79、Ox40或ICOS配体。在一些实施方案中，共刺激分子是CD80或CD86。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制如下核酸的表达，所述核酸表达共刺激分子或调节共刺激分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子使如下核酸缺失，所述核酸表达共刺激分子或调节共刺激分子的表达。在一些实施方案中，通过基因编辑实现如下核酸的缺失，所述核酸表达共刺激分子或调节共刺激分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制共刺激分子。在一些实施方案中，致耐受性因子是抑制共刺激分子的siRNA。在一些实施方案中，致耐受性因子增加转录调节剂的活性，所述转录调节剂阻抑共刺激分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子增加蛋白抑制剂的活性，所述蛋白抑制剂阻抑共刺激分子表达的。在一些实施方案中，致耐受性因子包含编码共刺激分子抑制因子的核酸。在一些实施方案中，致耐受性因子降解共刺激分子。在一些实施方案中，致耐受性因子标记共刺激分子以进行破坏。例如，致耐受性因子可以增强共刺激分子的泛素化作用，从而靶向共刺激分子以进行破坏。
在一些实施方案中，致耐受性因子增强免疫抑制分子的表达和/或活性。在一些实施方案中，免疫抑制分子是共抑制分子、转录调节剂或免疫抑制分子。共抑制分子负向调节淋巴细胞的活化。示例性共抑制分子包括但不限于PD-L1、PD-L2、HVEM、B7-H3、TRAIL、免疫球蛋白样转录物(ILT)受体(ILT2、ILT3、ILT4)、FasL、CTLA4、CD39、CD73和B7-H4。在一些实施方案中，共抑制分子是PD-L1或PD-L2。在一些实施方案中，致耐受性因子增加共抑制分子的活性。在一些实施方案中，致耐受性因子增加共抑制分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子编码共抑制分子。在一些实施方案中，致耐受性因子增加共抑制分子的活性。在一些实施方案中，致耐受性因子增加转录调节剂的活性，所述转录调节剂可增强共抑制分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子增加多肽的活性，所述多肽增加共抑制分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子包含编码共抑制分子增强子的核酸。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制共抑制分子的抑制剂。
在一些实施方案中，致耐受性因子增加免疫抑制分子的表达和/或活性。示例性免疫抑制分子包括但不限于精氨酸酶-1(ARG1)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、前列腺素E2(PGE2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶2(NOS2)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、血管活性肠肽(VIP)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-β(ΤGF-β)、IFN-α、IL-4、IL-10、IL-13和IL-35。在一些实施方案中，免疫抑制分子是NO或IDO。在一些实施方案中，致耐受性因子编码免疫抑制分子。在一些实施方案中，致耐受性因子增加免疫抑制分子的活性。在一些实施方案中，致耐受性因子增加转录调节剂的活性，所述转录调节剂增强免疫抑制分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子增加多肽的活性，所述多肽增强免疫抑制分子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子包含编码免疫抑制分子增强子的核酸。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制免疫抑制分子的负调节剂。
在一些实施方案中，致耐受性因子抑制炎性分子的表达和/或活性。在一些实施方案中，炎性分子是炎性转录因子。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制炎性转录因子。在一些实施方案中，致耐受性因子降低炎性转录因子的表达。在一些实施方案中，炎性转录因子是NF-KB、干扰素调节因子(IRF)或与JAK-STAT信号传导通路相关的分子。NF-κΒ通路是一种典型的促炎信号传导通路，其介导促炎基因(包括细胞因子、趋化因子和粘附分子)的表达。干扰素调节因子(IRF)构成了一个转录因子家族，其可以调节促炎基因的表达。JAK-STAT信号传导通路将信息从细胞外细胞因子信号传递到细胞核，导致参与免疫细胞增殖和分化的基因的DNA转录和表达。JAK-STAT系统由细胞表面受体、Janus激酶(JAK)以及信号转导及转录激活蛋白(STAT)组成。示例性JAK-STAT分子包括但不限于JAKl、JAK2、JAK3、Tyk2、STATI、STAT2、STAT3、STAT4、STATS(STAT5A和STAT5B)和STAT6。在一些实施方案中，致耐受性因子增强细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)的表达。SOCS蛋白可以通过JAK-STAT通路抑制信号传导。在一些实施方案中，致耐受性因子抑制编码炎性转录因子的核酸的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子使编码炎性转录因子的核酸缺失。在一些实施方案中，致耐受性因子增加转录调节剂的活性，所述转录调节剂阻抑炎性转录因子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子增加蛋白抑制剂的活性，所述蛋白抑制剂阻抑炎性转录因子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子包含编码炎性转录因子抑制因子的核酸。
在一些实施方案中，致耐受性因子增强抗炎分子的表达和/或活性。在一些实施方案中，抗炎分子是抗炎转录因子。在一些实施方案中，致耐受性因子增强抗炎转录因子。在一些实施方案中，致耐受性因子增加抗炎转录因子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子增强编码抗炎转录因子的核酸的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子降低转录调节剂的活性，所述转录调节剂阻抑抗炎转录因子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子降低蛋白抑制剂的活性，所述蛋白抑制剂阻抑抗炎转录因子的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子包含编码抗炎转录因子增强子的核酸。
在一些实施方案中，致耐受性因子包含核酸。在一些实施方案中，致耐受性因子是核酸。示例性核酸包括但不限于重组核酸、DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、saRNA、miRNA、lncRNA、tRNA、gRNA和shRNA。在一些实施方案中，所述核酸与所述细胞中的核酸是同源的。在一些实施方案中，所述核酸与所述细胞中的核酸是异源的。在一些实施方案中，致耐受性因子是质粒。在一些实施方案中，所述核酸是治疗性核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码治疗性多肽。在一些实施方案中，致耐受性因子包含编码siRNA、mRNA、miRNA、lncRNA、tRNA或shRNA的核酸。例如，致耐受性因子可以包括siRNA以敲低炎症基因的表达。在一些实施方案中，致耐受性因子是结合NF-κB并阻止NF-κB活化和下游信号传导的DNA序列。
在一些实施方案中，致耐受性因子包含多肽。在一些实施方案中，致耐受性因子是多肽。在一些实施方案中，蛋白质或多肽是治疗性蛋白质、抗体、融合蛋白、抗原、合成蛋白、报道分子标记或选择性标记。在一些实施方案中，蛋白质是基因编辑蛋白或核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、CRE重组酶、转座酶、RNA引导的内切核酸酶(例如CAS9酶)、DNA引导的内切核酸酶、或整合酶。在一些实施方案中，融合蛋白可包括但不限于嵌合蛋白药物(如抗体药物缀合物)或重组融合蛋白(如用GST或链霉亲和素标记的蛋白质)。在一些实施方案中，化合物是转录因子。示例性转录因子包括但不限于Oct4、Sox2、c-Myc、Klf-4、T-bet、GATA3、FoxP3和RORγt。在一些实施方案中，多肽是IL-4、IL-10、IL-13、IL-35、IFN-α或ΤGFβ。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽的片段。在一些实施方案中，多肽是肽核酸(PNA)。
在一些实施方案中，致耐受性因子包含蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，致耐受性因子是蛋白质-核酸复合物。在一些实施方案中，在基因组编辑应用中使用蛋白质-核酸复合物，如规则间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas9。这些复合物含有序列特异性DNA结合结构域以及非特异性DNA切割核酸酶。这些复合物能够进行靶向基因组编辑，包括添加、破坏或改变特定基因的序列。在一些实施方案中，有缺陷的Cas9(dCas9)用于阻断或诱导靶基因的转录。在一些实施方案中，致耐受性因子含有Cas9蛋白以及指导RNA和供体DNA。在一些实施方案中，致耐受性因子包括编码Cas9蛋白的核酸以及指导RNA或供体DNA。在一些实施方案中，基因编辑复合物靶向共刺激分子(例如CD80和/或CD86)的表达。
在一些实施方案中，致耐受性因子包含小分子。在一些实施方案中，致耐受性因子是小分子。在一些实施方案中，小分子抑制共刺激分子的活性、增强共抑制分子的活性、和/或抑制炎性分子的活性。示例性小分子包括但不限于药学试剂、代谢物或放射性核素。在一些实施方案中，药学试剂是治疗性药物和/或细胞毒性剂。在一些实施方案中，化合物包含纳米颗粒。纳米颗粒的例子包括金纳米颗粒、量子点、碳纳米管、纳米壳、树状聚合物和脂质体。在一些实施方案中，纳米颗粒含有治疗性分子或(共价或非共价)连接治疗性分子。在一些实施方案中，纳米颗粒含有核酸，如mRNA或cDNA。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含细胞因子。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含用于调节遗传物质(如DNA)的试剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含基因编辑组分，如CRISPR组分。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含用于调节RNA(如减少RNA种类的存在)的试剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含siRNA。用于产生无核细胞源性囊泡的方法
在某些方面，提供了用于产生包含抗原的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的(例如母体)无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在某些方面，提供了用于产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的(例如母体)无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，输入的无核细胞包含佐剂。
在某些方面，提供了用于产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的(例如母体)无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，输入的(例如母体)无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是人类细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是鸡、蛙、昆虫、鱼或线虫细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是RBC的前体。在一些实施方案中，输入的无核细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，输入的无核细胞是血小板。
在一些实施方案中，抗原在免疫原性环境中的呈递增强对抗原的免疫反应或诱导对抗原的免疫反应。源自红细胞衰亡小体(如无核细胞源性囊泡，其可以在肝和脾的免疫原性环境中清除)的抗原可以通过激活T细胞来刺激或增强对抗原的免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗原特异性的。无核细胞源性囊泡(如RBC源性囊泡)的寿命有限，无法自我修复，引起红细胞衰亡(一种类似于细胞凋亡的过程)，这导致从血流中去除无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，抗原可以在无核细胞源性囊泡进行红细胞衰亡后于免疫原性环境内释放，随后在那里被抗原呈递细胞吞没、加工以及呈递。在一些实施方案中，含有抗原的无核细胞源性囊泡被抗原呈递细胞(如巨噬细胞)吞噬，随后抗原被抗原呈递细胞加工和呈递。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是驻留型巨噬细胞。
在一些实施方案中，与输入的(例如母体)无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。用于测量细胞(如无核细胞，例如红细胞)或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法是本领域已知的。参见例如Franco,RS,Transfus Med Hemother,39,2012。例如，在一些实施方案中，用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法包括群组标记技术或随机标记技术。在一些实施方案中，用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法包括标记、再输注细胞或囊泡、以及测量再输注后的消失。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的半衰期的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或输入的无核细胞群的对照)的半衰期。
在一些实施方案中，与输入的(例如母体)无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％，如超过约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低约50％至约99.9％，如约70％至约99.9％、约85％至约99.9％、或约95％至约99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天中的任一个。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的循环半衰期为约0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天中的任一个。
在一些实施方案中，输入的(例如母体)无核细胞是人类细胞，并且其中无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天中的任一个。在一些实施方案中，输入的无核细胞是人类细胞，并且其中无核细胞源性囊泡的循环半衰期为约0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天或100天中的任一个。
在一些实施方案中，输入的(例如母体)无核细胞是红细胞，其中与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低。测量细胞(如无核细胞，例如红细胞)或无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平的方法是本领域已知的。参见例如Chaudhary,R.,JBlood Med,8,2017。例如，在一些实施方案中，所述方法包括测量代谢前体或产物以确定血红蛋白的周转。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或输入的无核细胞群的对照)的血红蛋白水平。
在一些实施方案中，与输入(例如母体)无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低约50％至约99.9％，如约70％至约99.9％、约85％至约99.9％、或约95％至约99.9％中的任一个。在一些实施方案中，与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平为输入的(例如母体)无核细胞中血红蛋白水平的约0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％中的任一个。
在一些实施方案中，输入的(例如母体)无核细胞是红血球，并且其中无核细胞源性囊泡的形态由输入的无核细胞的形态调节。形态涉及例如细胞或细胞源性囊泡的形状、结构、几何形状、强度、形式、光滑度、粗糙度、圆形度、体积、表面积和/或大小的分类。用于确定(如测量)形态的方法是本领域已知的。参见例如Boutros等人,Cell,163,2015；Girasole,M.等人,Biochim Biophys Acta Biomembr,1768,2007；以及Chen等人,ComputMath Methods Med,2012。在一些实施方案中，用于确定形态的方法包括高内涵成像。例如，细胞形态可以通过用Hoechst染料染色、然后进行自动高内涵图像分析来评估。在其他例子中，形态可以通过来自流式细胞术的前向和侧向散射图的偏移来确定。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球，并且其中无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。在一些实施方案中，输入的无核细胞是红血球，并且其中与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。在一些实施方案中，本申请所涵盖的用于测量无核细胞或无核细胞源性囊泡的形态的方法包括测量一个或多个合适的参考对照(如包含输入的无核细胞或输入的无核细胞群的对照)的形态。
在一些实施方案中，输入的(例如母体)无核细胞是红血球，并且其中与输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状，如减小超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％中的任一个。
在一些实施方案中，输入的(例如母体)无核细胞是红细胞或红血球，并且其中无核细胞源性囊泡是红细胞血影(RBC血影)。
在一些实施方案中，可以进一步修改无核细胞源性囊泡的半衰期。在一些实施方案中，通过进一步修改使无核细胞源性囊泡的半衰期增加。例如，可以修饰无核细胞源性囊泡以增加无核细胞源性囊泡在肝和脾中清除之前在血流中循环的时间。在一些实施方案中，通过修改使无核细胞源性囊泡的半衰期进一步降低。例如，可以修饰无核细胞源性囊泡以减少无核细胞在脾中清除之前在血流中循环的时间。在一些实施方案中，在无核细胞源性囊泡表面上的磷脂的比例的改变降低了无核细胞源性囊泡的半衰期。在一些实施方案中，在无核细胞源性囊泡表面上的磷脂酰丝氨酸与其他磷脂的比率的增加降低了无核细胞源性囊泡的半衰期。例如，可以进一步增加无核细胞源性囊泡表面上的磷脂酰丝氨酸的存在以降低无核细胞的半衰期，如通过使用本领域已知的用于增加表面磷脂酰丝氨酸的任何方法所进行的(参见Hamidi等人,J.Control.Release,2007,118(2):145-60)。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前与脂质或磷脂一起孵育。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前用化学物质(如双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯或其他交联剂)处理。在其他实施方案中，可以减少无核细胞源性囊泡的表面磷脂酰丝氨酸以增加无核细胞源性囊泡的半衰期。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前用翻转酶处理。通常，翻转酶是质膜中将磷脂从外部小叶运输到胞质小叶的酶。在一些实施方案中，将无核细胞源性囊泡在递送给个体之前用切割磷脂酰丝氨酸的酶处理。切割磷脂酰丝氨酸的酶的非限制性例子是磷脂酰丝氨酸羧化酶。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡表现出以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，在整个过程中维持细胞悬液的渗量。在另外的实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在200mOsm和400mOsm之间。在一些实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在200mOsm和600mOsm之间。在另外的实施方案中，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在200mOsm和800mOsm之间。在一些实施方案中，细胞悬液的渗量维持在以下任一项之间：200mOsm和300mOsm之间、300mOsm和400mOsm之间、400mOsm和500mOsm之间、500mOsm和600mOsm之间、600mOsm和700mOsm之间、700mOsm和800mOsm之间。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，无核细胞源性囊泡进一步包含另外的药剂，当与不包含另外的药剂的相应无核细胞源性囊泡相比，另外的药剂增强无核细胞源性囊泡的功能。在一些实施方案中，另外的药剂是稳定剂或辅因子。在一些实施方案中，药剂是白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，另外的药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡进一步包含一种或多种治疗剂。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子，其中无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和致耐受性因子通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和致耐受性因子孵育足够的时间以允许抗原和致耐受性因子进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和致耐受性因子的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部由多个微柱形成。在一些实施方案中，在以阵列配置的多个微柱之间形成缩窄部。在一些实施方案中，缩窄部由一个或多个可移动板形成。
在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。
在一些实施方案中，缩窄部尺寸为细胞直径(如悬液中无核细胞的最大直径)的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为小于细胞直径(如悬液中无核细胞的最大直径)的约80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.1μm至约4μm，如约1μm至约3μm、约1.75μm至约2.5μm、或约2μm至约2.5μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、3μm、2.5μm、2μm、1.5μm、1μm、0.5μm、或约0.25μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm或2.6μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。
在一些实施方案中，在范围为约10psi至约150psi的压力下(如约30psi至约60psi、约10psi至约40psi、约50psi至约90psi中的任一个)使输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在至少约5psi、10psi、15psi、20psi、25psi、30psi、35psi、40psi、45psi、50psi、55psi、60psi、65psi、70psi、75psi、80psi、85psi、90psi、95psi、100psi、105psi、110psi、115psi、120psi、125psi、130psi、135psi、140psi、145psi或150psi中的任一个的压力下使输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在至少约5psi且小于约150psi、145psi、140psi、135psi、130psi、125psi、120psi、115psi、110psi、105psi、100psi、95psi、90psi、85psi、80psi、75psi、70psi、65psi、60psi、55psi、50psi、45psi、40psi、35psi、30psi、25psi、20psi或15psi中的任一个的压力下使输入的母体无核细胞通过缩窄部。
在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部之前与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部的同时与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部之后与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，细胞悬液至少在通过缩窄部的同时和通过缩窄部之后与有效载荷接触。在一些实施方案中，细胞悬液在通过缩窄部之前、通过缩窄部的同时和通过缩窄部之后与有效载荷接触。
在一些实施方案中，包含如本文所述的抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡是活化的抗原载体(AAC)。
在一些实施方案中，包含如本文所述的用于耐受化的抗原的无核细胞源性囊泡是耐受化的抗原载体(TAC)。
组合物
在一些方面，本申请提供了组合物，所述组合物包含多个本文所述的任何无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有以下任何一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，可以主动调整包含多个无核细胞源性囊泡的组合物以在具有一种或多种选择特性的组合物中产生无核细胞源性囊泡的期望分布，所述选择特性包括以下一种或多种：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，使用本文所述的制造方法(包括使用微流体缩窄部)由母体无核细胞制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物，其中选择制造方法的参数(包括缩窄部尺寸、母体无核细胞通过缩窄部的速度、缩窄部架构(例如堰结构和大小)、加工时间、压力和缓冲液组成)以产生包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物。在一些实施方案中，制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物的方法包括选择一组参数以产生组合物，这些参数包括缩窄部尺寸、母体无核细胞通过缩窄部的速度、缩窄部架构(例如堰结构和大小)、加工时间、压力和缓冲液组成。在一些实施方案中，制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物的方法包括使用一组参数以产生组合物，这些参数包括缩窄部尺寸、母体无核细胞通过缩窄部的速度、缩窄部架构(例如堰结构和大小)、加工时间、压力和缓冲液组成。
例如，在一些实施方案中，使用一组参数来制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物，这些参数包括缩窄部尺寸例如约2.2μm或约2.5μm，以及压力例如约30psi或约50psi。在一些实施方案中，使用一组参数来制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物，这些参数包括缩窄部尺寸为约2.2μm，以及压力为约30psi。在一些实施方案中，使用一组参数来制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物，这些参数包括缩窄部尺寸为约2.2μm，以及压力为约50psi。在一些实施方案中，使用一组参数来制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物，这些参数包括缩窄部尺寸为约2.5μm，以及压力为约30psi。在一些实施方案中，使用一组参数来制备包含多个具有选择特性的期望分布的无核细胞源性囊泡的组合物，这些参数包括缩窄部尺寸为约2.5μm，以及压力为约50psi。
在一些实施方案中，母体无核细胞是哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括但不限于来自人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物的细胞。在一些实施方案中，母体无核细胞是人类细胞。在一些实施方案中，母体无核细胞是来自哺乳动物的无核细胞，所述哺乳动物包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，母体无核细胞是血小板。在一些实施方案中，红细胞是红血球。在一些实施方案中，红细胞是网织红细胞。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中至少约75％，如至少约80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或90％中的任一个。在一些实施方案中，母体无核细胞是人类细胞，并且组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡的循环半衰期为少于约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天或10天中的任一个。在一些实施方案中，母体无核细胞是人类细胞，并且组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡的循环半衰期为约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天或10天中的任一个。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红细胞，并且与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中至少约75％，如至少约80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，无核细胞源性囊泡的组合物中20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的无核细胞衍生囊泡的血红蛋白水平降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％中的任一个。在一些实施方案中，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平是母体无核细胞中血红蛋白水平的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％中的任一个。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红血球，并且与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有经调节的形态。在一些实施方案中，母体无核细胞是红血球，并且组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。在一些实施方案中，母体无核细胞是红血球，并且与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的，如减少超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的双凹形状。
在一些实施方案中，母体无核细胞是红细胞或红血球，并且组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
在一些实施方案中，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡包含表面磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡包含增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与包含多个母体无核细胞的组合物相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有高出大于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％中的任一个的表面磷脂酰丝氨酸水平。
在一些实施方案中，与母体无核细胞相比，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。在一些实施方案中，组合物中至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡产生的ATP低于母体无核细胞产生的ATP水平约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％中的任一个。在一些实施方案中，在相似条件下测量样品和对照的ATP产生。在一些实施方案中，至少约20％，如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％不产生ATP。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下任何两种特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下任何三种特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下任何四种特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下任何五种特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有如本文进一步描述的以下特性：(a)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，以及(f)与母体无核细胞相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在本文所述的一些实施方案中，包含多个无核细胞源性囊泡的组合物的一种或多种特性基于与母体无核细胞群的比较，无核细胞源性囊泡是由所述母体无核细胞群制备的。在一些实施方案中，所述比较基于对母体无核细胞群所测量的平均值。在一些实施方案中，所述比较基于对母体无核细胞群所测量的值的范围。在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞群制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)组合物中大于20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)组合物中大于20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与母体无核细胞群的平均水平相比，组合物中大于20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中的任一个的无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
在一些实施方案中，在制备无核细胞源性囊泡期间，母体无核细胞未经历以下中的一项或多项，如全部项：(a)热加工，例如热处理或热休克，(b)化学处理，和(c)经受低渗或高渗条件。
在一些实施方案中，在由母体无核细胞制备无核细胞源性囊泡期间维持渗量。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间，如在约200mOsm和约300mOsm之间、约200mOsm和约400mOsm之间、约200mOsm和约500mOsm之间、约300mOsm和约500mOsm之间、或约350mOsm和约450mOsm之间中的任一个。在一些实施方案中，渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：使包含输入的母体无核细胞的悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过，从而产生无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是治疗性有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是抗原。在一些实施方案中，有效载荷是佐剂。在一些实施方案中，有效载荷是致耐受性因子。在一些实施方案中，有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物(如基于蛋白质的复合物、核酸复合物、蛋白质-蛋白质复合物、核酸-核酸复合物、或蛋白质-核酸复合物)或纳米颗粒。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与有效载荷孵育足够的时间以允许有效载荷进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含有效载荷的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原，如本文所述的任何抗原。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含多种不同类型的抗原(如2、3、4或5种不同类型的抗原)，如选自本文所述的任何抗原。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含佐剂，如本文所述的任何佐剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含多种不同类型的佐剂(如2、3、4或5种不同类型的佐剂)，如选自本文所述的任何佐剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含致耐受性因子，如本文所述的任何致耐受性因子。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含多种不同类型的致耐受性因子(如2、3、4或5种不同类型的致耐受性因子)，如选自本文所述的任何致耐受性因子。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含佐剂和致耐受性因子。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原、佐剂和致耐受性因子。
在一些实施方案中，包含如本文所述的抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡是活化的抗原载体(AAC)。
例如，在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物是移植组织裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞。在一些实施方案中，佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原孵育足够的时间以允许抗原进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与佐剂孵育足够的时间以允许佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原和佐剂，其中组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和佐剂孵育足够的时间以允许抗原和佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子，其中组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中缩窄部的直径随悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和致耐受性因子通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将无核细胞源性囊泡与抗原和致耐受性因子孵育足够的时间以允许抗原和致耐受性因子进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和致耐受性因子的无核细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部由多个微柱形成。在一些实施方案中，在以阵列配置的多个微柱之间形成缩窄部。在一些实施方案中，缩窄部由一个或多个可移动板形成。
在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。
在一些实施方案中，缩窄部尺寸为细胞直径(如无核细胞的最大直径)的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为小于细胞直径(如无核细胞的最大直径)的约80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.1μm至约4μm，如约1μm至约3μm、约1.75μm至约2.5μm、或约2μm至约2.5μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、3μm、2.5μm、2μm、1.5μm、1μm、0.5μm、或约0.25μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm或2.6μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。
在一些实施方案中，在范围为约10psi至约150psi的压力下(如约30psi至约60psi、约10psi至约40psi、约50psi至约90psi中的任一个)使输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在至少约5psi、10psi、15psi、20psi、25psi、30psi、35psi、40psi、45psi、50psi、55psi、60psi、65psi、70psi、75psi、80psi、85psi、90psi、95psi、100psi、105psi、110psi、115psi、120psi、125psi、130psi、135psi、140psi、145psi或150psi中的任一个的压力下使输入的母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在至少约5psi且小于约150psi、145psi、140psi、135psi、130psi、125psi、120psi、115psi、110psi、105psi、100psi、95psi、90psi、85psi、80psi、75psi、70psi、65psi、60psi、55psi、50psi、45psi、40psi、35psi、30psi、25psi、20psi或15psi中的任一个的压力下使输入的母体无核细胞通过缩窄部。
在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部之前与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部的同时与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部之后与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，细胞悬液至少在通过缩窄部的同时和通过缩窄部之后与有效载荷接触。在一些实施方案中，细胞悬液在通过缩窄部之前、通过缩窄部的同时和通过缩窄部之后与有效载荷接触。
在一些实施方案中，组合物包含至少约500,000个，如至少约1百万(M)、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、5.5M、6M、6.5M、7M、7.5M、8M、8.5M、9M、9.5M、1十亿(B)、1.1B、1.2B、1.3B、1.4B、1.5B、10B、100B或1万亿(T)个中的任一项的无核细胞细胞源性囊泡。
在一些实施方案中，组合物包含至少约500,000个，如至少约1百万(M)、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、5.5M、6M、6.5M、7M、7.5M、8M、8.5M、9M、9.5M、1十亿(B)、1.1B、1.2B、1.3B、1.4B或1.5B、10B、100B或1万亿(T)个中的任一项的无核细胞以及佐剂。
在一些实施方案中，组合物具有约25％至约80％，如约25％至约45％、约35％至约55％、约35％至约65％、或约45％至约70中的任一个的血细胞比容(Ht)水平。在一些实施方案中，组合物具有大于约20％，如大于约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一个的血细胞比容(Ht)水平。在一些实施方案中，组合物具有小于约80％，如小于约75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％中的任一个的血细胞比容(Ht)水平。在一些实施方案中，组合物具有约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一个的血细胞比容(Ht)水平。
在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物是无菌药物组合物。在根据本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种另外的药剂，与包含无核细胞和/或无核细胞源性囊泡、不具有一种或多种另外的药剂的相应组合物相比，所述另外的药剂增强血影形成和/或活力和/或功能、和/或提供(如用于施用)针对无核细胞和/或无核细胞源性囊泡的效用。在一些实施方案中，另外的药剂是稳定剂或辅因子。在一些实施方案中，另外的药剂是缓冲液。在一些实施方案中，另外的药剂是适合施用于哺乳动物的缓冲液。在一些实施方案中，药剂是白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，另外的药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。
细胞变形缩窄部
在根据本文所述的任何方法或任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，微流体通道包含多个缩窄部。可以在微流体通道内并联和/或串联放置多个缩窄部。因此，在一些实施方案中，多个缩窄部串联和/或并联排列。在一些实施方案中，缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，缩窄部由多个微柱形成；位于以阵列配置的多个微柱之间；或由一个或多个可移动板形成。用于在本文公开的方法中使用的含有细胞变形缩窄部的示例性微流体通道描述于WO2013059343中。在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。用于在本文公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO2017041050中。
在一些实施方案中，微流体通道包括内腔并且被配置成使得悬浮在缓冲液中的输入的无核细胞可以通过，其中所述微流体通道包括缩窄部。微流体通道可由多种材料中的任一种制成，这些材料包括硅、金属(例如，不锈钢)、塑料(例如，聚苯乙烯、PET、PETG)、陶瓷、玻璃、结晶基底、无定形基底、或聚合物(例如，聚-甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、环烯烃共聚物(COC)等)。微流体通道的制造可通过本领域已知的任何方法进行，包括干法蚀刻、湿法蚀刻、光刻、注射模制、激光烧蚀或SU-8掩模。
在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部包括入口部分、中心点和出口部分。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施方案中，缩窄部的直径随悬液中输入的无核细胞或输入的无核细胞簇的直径而变。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径为悬液中输入的无核细胞的直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为悬液中输入的无核细胞的直径的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为悬液中输入的无核细胞(例如RBC)的最小截面距离的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为细胞直径(如悬液中无核细胞的最大直径)的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为小于细胞直径(如悬液中无核细胞的最大直径)的约80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约7μm、约6μm、约5μm、约4μm、约3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm(包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约1.6μm、约1.8μm、约2.0μm、约2.2μm、约2.4μm、约2.6μm、约2.8μm、或约3.0μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.1μm至约4μm，如约1μm至约3μm、约1.75μm至约2.5μm、或约2μm至约2.5μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、3μm、2.5μm、2μm、1.5μm、1μm、0.5μm、或约0.25μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm或2.6μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。
在一些应用中，可以改变缩窄部宽度以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以减小缩窄部宽度以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以改变缩窄部长度以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以增加缩窄部长度以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。
在某些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约150psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约10psi、约10psi至约20psi、约20psi至约30psi、约30psi至约40psi、约40psi至约50psi、约50psi至约60psi、约60psi至约70psi、约70psi至约80psi、约80psi至约90psi、约90psi至约100psi、约100psi至约110psi、约110psi至约120psi、约120psi至约130psi、约130psi至约140psi、约140psi至约150psi、或约150psi至约200psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约150psi的压力下(如约30psi至约60psi、约10psi至约40psi、约50psi至约90psi中的任一个)使母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在至少约5psi、10psi、15psi、20psi、25psi、30psi、35psi、40psi、45psi、50psi、55psi、60psi、65psi、70psi、75psi、80psi、85psi、90psi、95psi、100psi、105psi、110psi、115psi、120psi、125psi、130psi、135psi、140psi、145psi或150psi中的任一个的压力下使母体无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在至少约5psi且小于约150psi、145psi、140psi、135psi、130psi、125psi、120psi、115psi、105psi、100psi、95psi、90psi、85psi、80psi、75psi、70psi、65psi、60psi、55psi、50psi、45psi、40psi、35psi、30psi、25psi、20psi或15psi中的任一个的压力下使母体无核细胞通过缩窄部。在一些应用中，可以改变压力以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些实施方案中，可以增加压力以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。通道的截面、入口部分、中心点和出口部分也可以变化。例如，截面的形状可以是环形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形。入口部分限定缩窄角度，其中所述缩窄角度被优化以减少通道的堵塞并且被优化用于增强抗原和/或佐剂向细胞内的递送。出口部分的角度也可以变化。例如，出口部分的角度被配置成减小可能导致非层流的湍流的可能性。在一些实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是线性的。在其他实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是弯曲的。在一些实施方案中，细胞悬液在通过缩窄部之前、同时和/或之后与抗原接触。
在根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过缩窄部，其中缩窄部使输入的无核细胞变形，从而引起输入的无核细胞的扰动，如此使得抗原和/或佐剂进入输入的无核细胞。在一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。用于在本文公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO 2017041050中。
在一些实施方案中，缩窄部尺寸随无核细胞而变。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为悬液中输入的无核细胞的直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为悬液中输入的无核细胞的直径的约10％至约70％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为悬液中输入的无核细胞的直径的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸为悬液中输入的无核细胞(例如无核细胞，如RBC)的最小截面距离的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。最佳缩窄部尺寸或缩窄部宽度可根据应用和/或细胞类型而变化。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约7μm、约6μm、约5μm、约4μm、约3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm(包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为小于约7μm、约6μm、约5μm、约4μm、约3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、约0.25μm、或约0.1μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约1.6μm、约1.8μm、约2.0μm、约2.2μm、约2.4μm、约2.6μm、约2.8μm、或约3.0μm中的任一个。在一些实施方案中，缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些应用中，可以改变缩窄部宽度以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以减小缩窄部宽度以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以改变缩窄部长度以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以增加缩窄部长度以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在某些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约150psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约10psi、约10psi至约20psi、约20psi至约30psi、约30psi至约40psi、约40psi至约50psi、约50psi至约60psi、约60psi至约70psi、约70psi至约80psi、约80psi至约90psi、约90psi至约100psi、约100psi至约110psi、约110psi至约120psi、约120psi至约130psi、约130psi至约140psi、约140psi至约150psi、或约150psi至约200psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，可以改变压力以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些实施方案中，可以增加压力以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些实施方案中，细胞悬液在通过缩窄部之前、同时和/或之后与抗原接触。
如本文公开的表面可由许多材料中的任何一种制成，并且采取许多形式中的任何一种。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，过滤器是切向流过滤器。在一些实施方案中，表面是海绵或海绵状基质。在一些实施方案中，表面是基质。
在一些实施方案中，表面是曲折的路径表面。在一些实施方案中，曲折的路径表面包含醋酸纤维素。在一些实施方案中，表面包含如下材料，所述材料选自但不限于合成或天然的聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合的纤维素酯、瓷和陶瓷。
本文公开的表面可以具有本领域中已知的任何形状；例如3维形状。表面的2维形状可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些实施方案中，表面的形状是圆形的。在一些实施方案中，表面3维形状是圆柱形、圆锥形或立方形的。
表面可以具有各种截面宽度和厚度。在一些实施方案中，表面截面宽度在约1mm和约1m之间或在其间的任何截面宽度或截面宽度范围。在一些实施方案中，表面具有限定的厚度。在一些实施方案中，表面厚度是均一的。在一些实施方案中，表面厚度是可变的。例如，在一些实施方案中，表面的一些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在一些实施方案中，表面厚度变化约1％至约90％或在其间的任何百分比或百分比范围。在一些实施方案中，表面的厚度在约0.01μm至约5mm之间或在其间的任何厚度或厚度范围。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，孔包含在表面中。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。孔的截面宽度与要处理的细胞类型有关。在一些实施方案中，孔径随悬液中要处理的输入的无核细胞或输入的无核细胞簇的直径而变。在一些实施方案中，孔径使得输入的无核细胞在通过孔时发生扰动。在一些实施方案中，孔径小于输入的无核细胞的直径。在一些实施方案中，孔径是无核细胞的直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，孔径是输入的无核细胞的直径的约10％至约70％。在一些实施方案中，孔径是输入的无核细胞直径的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。最佳孔径或孔截面宽度可以基于应用和/或细胞类型而变化。在一些应用中，可以改变孔径或孔截面宽度以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些应用中，可以减小孔径或孔截面宽度以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些实施方案中，孔径或孔横截面宽度为约0.1μm至约4μm。在一些实施方案中，孔径或孔横截面宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，孔径或孔横截面宽度为约4μm、约3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、约0.25μm、或约0.1μm。在一些实施方案中，孔径或孔横截面宽度为或小于约4μm、约3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、约0.25μm、或约0.1μm中的任一个。在一些实施方案中，孔径或孔横截面宽度为约1.6μm、约1.8μm、约2.0μm、约2.2μm、约2.4μm、约2.6μm、约2.8μm、或约3.0μm中的任一个。在一些实施方案中，孔径或孔横截面宽度为约2.2μm。在某些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过孔。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约150psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约10psi、约10psi至约20psi、约20psi至约30psi、约30psi至约40psi、约40psi至约50psi、约50psi至约60psi、约60psi至约70psi、约70psi至约80psi、约80psi至约90psi、约90psi至约100psi、约100psi至约110psi、约110psi至约120psi、约120psi至约130psi、约130psi至约140psi、约140psi至约150psi、或约150psi至约200psi的压力下使输入的无核细胞通过孔。在一些实施方案中，可以改变压力以调节由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些实施方案中，可以增加压力以增加由输入的无核细胞形成的血影的相对量。在一些实施方案中，细胞悬液在通过孔之前、同时和/或之后与抗原接触。
孔通道的入口和出口可以具有各种角度。可以选择孔角度以使无核细胞通过时孔的堵塞降至最低。例如，入口或出口部分的角度可以在约0度和约90度之间。在一些实施方案中，入口或出口部分可以大于90度。在一些实施方案中，孔具有相同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔具有不同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔边缘是光滑的，例如圆形的或弯曲的。光滑的孔边缘具有连续、平坦且均匀的表面，没有凸起、脊或不均匀的部分。在一些实施方案中，孔边缘是尖锐的。尖锐的孔边缘具有锐利的或锐角的薄边缘。在一些实施方案中，孔通道是直的。直的孔通道不含有曲线、弯曲、角度或其他不规则性。在一些实施方案中，孔通道是弯曲的。弯曲的孔通道是弯曲的或偏离直线。在一些实施方案中，孔通道具有多条曲线，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多条曲线。
孔可以具有本领域已知的任何形状，包括2维或3维形状。孔的形状(例如截面形状)可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，孔的截面的形状为圆形。在一些实施方案中，孔的3维形状是圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔具有带凹槽的入口和出口形状。在一些实施方案中，孔形状在给定表面内的孔之间是均匀的(即一致的或规则的)。在一些实施方案中，孔形状在给定表面内的孔之间是不均匀的(即混合的或变化的)。
本文所述的表面可以具有一系列总孔数。在一些实施方案中，孔涵盖总表面积的约10％至约80％。在一些实施方案中，表面含有约1.0x105至约1.0x1030个总孔或在其间的任何数字或数字范围。在一些实施方案中，表面每mm2表面积包含在约10和约1.0x1015个之间的孔。
孔可以在给定表面内以多种方式分布。在一些实施方案中，孔在给定表面内并联分布。在一个这样的例子中，孔在相同方向上并排分布并且在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是有序的或均匀的。在一个这样的例子中，孔以规则的系统的图案分布或在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是随机的或不均匀的。在一个这样的例子中，孔以不规则的无序的图案分布或在给定表面内以不同的距离分开。在一些实施方案中，多个表面串联分布。多个表面的表面尺寸、形状和/或粗糙度可以是均匀的或不均匀的。多个表面可以进一步包含具有均匀或不均匀的孔径、形状和/或数量的孔，从而能够将一系列抗原和/或佐剂同时递送至不同类型的无核细胞中。
在一些实施方案中，单个孔具有均一的宽度尺寸(即沿着孔通道的长度具有恒定的宽度)。在一些实施方案中，单个孔具有可变的宽度(即沿着孔通道的长度增大或减小的宽度)。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有相同的各自孔深度。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有不同的各自孔深度。在一些实施方案中，孔彼此之间紧邻。在一些实施方案中，孔彼此之间分开一段距离。在一些实施方案中，孔彼此之间分开约0.001μm至约30mm的距离或在其间的任何距离或距离范围。
在一些实施方案中，表面涂覆有材料。材料可选自本领域已知的任何材料，包括但不限于Teflon、胶粘涂层、表面活性剂、蛋白质、粘附分子、抗体、抗凝血剂、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、糖类、纳米颗粒或跨膜蛋白。在一些实施方案中，表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，材料共价附着于表面。在一些实施方案中，材料非共价附着于表面。在一些实施方案中，表面分子在无核细胞通过孔时被释放。
在一些实施方案中，表面具有经修饰的化学特性。在一些实施方案中，表面是亲水的。在一些实施方案中，表面是疏水的。在一些实施方案中，表面是带电的。在一些实施方案中，表面带正电和/或带负电。在一些实施方案中，表面可以在一些区域带正电并在其他区域带负电。在一些实施方案中，表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些实施方案中，表面可以是光滑的、电解抛光的、粗糙的或经等离子体处理的中的任一种。在一些实施方案中，表面包含两性离子或偶极化合物。在一些实施方案中，表面是经等离子体处理的。
在一些实施方案中，表面包含在较大的模块内。在一些实施方案中，表面包含在注射器(如塑料或玻璃注射器)内。在一些实施方案中，表面包含在塑料过滤器支架内。在一些实施方案中，表面包含在移液器尖端内。
在根据本文所述的任何方法或任何无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过缩窄部，其中缩窄部使输入的无核细胞变形，从而引起细胞的扰动，如此使得抗原和/或佐剂进入输入的无核细胞，其中输入的无核细胞中的扰动是输入的无核细胞中的缺口(例如，洞、撕裂、腔、孔口、孔、断裂、间隙或穿孔)，所述缺口允许来自细胞外部的材料移动到输入的无核细胞中。变形可以由例如通过机械应变和/或剪切力诱导的压力引起。在一些实施方案中，扰动是无核细胞膜内的扰动。在一些实施方案中，扰动是短暂的。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x10-9秒至约24小时或在其间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约16小时、约16小时至约20小时、或约20小时至约24小时。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x10-9至约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒中的任一个。在一些实施方案中，细胞扰动持续约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒中的任一个。由本文所述的方法产生的细胞扰动(例如，孔或洞)不是由于蛋白质亚基组装形成多聚体孔结构(如由补体或细菌溶血素产生的)而形成。
在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程与输入的无核细胞通过缩窄部和/或细胞的扰动同时发生。在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程发生在输入的无核细胞通过缩窄部之后。在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程发生在输入的无核细胞通过缩窄部之后大约几分钟。在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程发生在输入的无核细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至至少约30分钟。例如，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程发生在输入的无核细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约30分钟。在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程发生在输入的无核细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约10分钟、约1.0x10-2秒至约5分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约50秒、约1.0x10-2秒至约10秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x10-2秒至约0.1秒。在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入无核细胞源性囊泡的过程发生在输入的无核细胞通过缩窄部之后约1.0x10-1秒至约10分钟、约1秒至约10分钟、约10秒至约10分钟、约50秒至约10分钟、约1分钟至约10分钟、或约5分钟至约10分钟。在一些实施方案中，在输入的无核细胞通过缩窄部约五分钟内，对在输入的无核细胞通过缩窄部之后所得的无核细胞源性囊泡中的扰动进行校正。
当实体形状朝着更球形的形态改变时，无核细胞形成血影，并且其可能伴随着一些原始胞质结构和内容物的丢失。RBC血影和红血球血影的形成是本领域已知的现象。在一些实施方案中，通过缩窄部之后形成的血影为约5％至约100％。在一些实施方案中，通过缩窄部之后形成的血影为至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒到至少约10天测量血影形成。例如，在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟、或约30分钟至约2小时测量血影形成。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约2小时、约1.0x10-2秒至约1小时、约1.0x10-2秒至约30分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约30秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x10-2秒至约0.1秒测量血影形成。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时、或约1秒至约2小时测量血影形成。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时、或约24小时至约10天测量血影形成。
根据本文所述的任何方法或无核细胞源性囊泡，许多参数可以影响抗原和/或佐剂向无核细胞源性囊泡的递送。在一些实施方案中，包含输入的无核细胞的细胞悬液在通过缩窄部之前、同时或之后与抗原和/或佐剂接触。输入的无核细胞可以通过悬浮在包括待递送的抗原和/或佐剂的溶液中的缩窄部，尽管可以在输入的无核细胞通过缩窄部之后将抗原和/或佐剂添加到细胞悬液中以形成包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，将待递送的抗原和/或佐剂涂覆在缩窄部上。在一些实施方案中，将待递送的抗原和/或佐剂涂覆在表面上。在一些实施方案中，将待递送的抗原和/或佐剂涂覆在孔上。在一些实施方案中，将待递送的抗原和/或佐剂涂覆在过滤器上。
可能影响将抗原和/或佐剂递送到无核细胞源性囊泡中的参数的例子包括但不限于缩窄部的尺寸、缩窄部的入口角度、缩窄部的表面特性(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，通过缩窄部的细胞传输时间)、输入的无核细胞浓度、细胞悬液中抗原和/或佐剂的浓度，并且无核细胞源性囊泡在通过缩窄部之后回收或孵育的时间量可以影响递送的抗原和/或佐剂进入细胞的过程。影响抗原和/或佐剂向无核细胞源性囊泡内的递送的另外的参数可包括输入的无核细胞在缩窄部中的速度、缩窄部中的剪切速度、输入的无核细胞悬液的粘度、垂直于流速的速度分量、以及在缩窄部中的时间。可以设计此类参数来控制抗原和/或佐剂的递送。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡的浓度范围为约10个到至少约1012个囊泡/mL或在其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，待递送的抗原和/或佐剂的浓度范围可为约10ng/mL至约1g/mL或在其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，待递送的抗原和/或佐剂的浓度范围可为约1pM到至少约2M或在其间的任何浓度或浓度范围。细胞悬液的组成(例如，渗量、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可影响用于刺激和/或增强免疫反应的抗原和/或佐剂的递送。在一些实施方案中，水溶液是等渗的或等压的。
可以调节本公开文本的方法中使用的温度以影响无核细胞源性囊泡中的抗原和/或佐剂递送和/或血影形成。在一些实施方案中，所述方法在约-5℃和约45℃之间进行。例如，所述方法可以在以下温度进行：室温(例如约20℃)、生理温度(例如约37℃)、高于生理温度(例如高于约37℃至45℃或更高)、或降低的温度(例如约-5℃至约4℃)、或这些示例性温度之间的温度。
可以利用多种方法驱动悬液中的输入的无核细胞通过缩窄部。例如，可在入口侧通过泵(例如，气瓶或压缩机)施加压力，可在出口侧通过真空泵施加真空，可通过管施加毛细管作用，和/或系统可由重力进给。也可使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液器、活塞等)。在一些实施方案中，通过正压或负压使输入的无核细胞通过缩窄部。因此，在根据本文所述的任何一种方法或无核细胞源性囊泡的一些实施方案中，输入的无核细胞利用来自入口侧的正压通过缩窄部。在另外的实施方案中，使用泵施加正压。在一些实施方案中，使用气瓶或压缩机施加正压。在某些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约150psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在某些实施方案中，在范围为约5psi至约10psi、约10psi至约20psi、约20psi至约30psi、约30psi至约40psi、约40psi至约50psi、约50psi至约60psi、约60psi至约70psi、约70psi至约80psi、约80psi至约90psi、约90psi至约100psi、约100psi至约110psi、约110psi至约120psi、约120psi至约130psi、约130psi至约140psi、约140psi至约150psi、或约150psi至约200psi的压力下使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过恒定压力或可变压力使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，泵是蠕动泵或隔膜泵。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，通过重力使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过离心力使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过毛细管压力使输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过使用细胞驱动器施加压力来使输入的无核细胞移动(例如，推动)通过缩窄部。如本文所用，细胞驱动器是向悬液施加压力或力以驱动输入的无核细胞通过缩窄部的装置或组件。在某些实施方案中，细胞驱动器选自压力泵、气瓶、压缩机、真空泵、注射泵、蠕动泵、移液管、活塞、毛细管作用器、人类心脏、人类肌肉、重力、微流体泵和注射器。
在一些实施方案中，流体流动引导输入的无核细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之前，流体流动是湍流。湍流是一种流体流动，其中在给定点的速度在大小和方向上不规律地变化。在一些实施方案中，流过缩窄部的流体是层流。层流包括在固体边界附近的流体中的非中断流，其中在每个点的流动方向保持恒定。在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后，流体流动是湍流。细胞通过缩窄部的速度可以变化。在一些实施方案中，细胞以均一的细胞速度通过缩窄部。在一些实施方案中，细胞以波动的细胞速度通过缩窄部。
细胞悬液可以是混合或纯化的细胞群。在一些实施方案中，细胞悬液是混合的细胞群，如全血。在一些实施方案中，细胞悬液是混合的细胞群，如混合的无核细胞群。在一些实施方案中，细胞悬液是纯化的细胞群，如纯化的无核细胞群。
细胞悬液的组成(例如，渗量、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可影响用于刺激和/或增强免疫反应的抗原和/或佐剂的递送。在一些实施方案中，悬液包含全血。可替代地，细胞悬液是生理盐水溶液中或除血液之外的生理介质中的细胞混合物。在一些实施方案中，细胞悬液包含水溶液。在一些实施方案中，水溶液包含细胞培养基、PBS、盐、糖、生长因子、动物来源的产品、填充材料、表面活性剂、润滑剂、维生素、氨基酸、蛋白质、细胞周期抑制剂、和/或影响肌动蛋白聚合的药剂。在一些实施方案中，细胞培养基是DMEM、Opti-MEMTM、IMDM或RPMI。另外，溶液缓冲液可以包括一种或多种润滑剂(pluronic或其他表面活性剂)，其可被设计用于例如减少或消除对表面的堵塞并改善输入的细胞的活力。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖或糖醇(如甘露醇、山梨醇)、动物来源的血清、以及白蛋白。在一些实施方案中，水溶液是等渗的或等压的。在一些实施方案中，水溶液包括血浆。
在用某些类型的细胞进行的一些配置中，输入的无核细胞或无核细胞源性囊泡可以在一种或多种有助于将化合物递送至无核细胞源性囊泡内部的溶液中孵育。在一些实施方案中，与未加工和未处理的输入的无核细胞相比，无核细胞源性囊泡保留了全部或基本上全部的细胞骨架结构。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡保留了未加工和未处理的输入的无核细胞的细胞骨架结构的约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99.5％中的任一个。在一些实施方案中，溶液包含影响肌动蛋白聚合的药剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的药剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。例如，输入的无核细胞或无核细胞源性囊泡可以在递送前在解聚溶液如拉春库林A(0.lμg/ml)中孵育1小时以解聚肌动蛋白细胞骨架。作为另一个例子，细胞可以在递送前在10μM秋水仙碱(Sigma)中孵育2小时以解聚微管网络。
在一些实施方案中，将输入的无核细胞群在用于所公开的方法中之前进行富集。例如，输入的无核细胞获得自体液(例如外周血)，并且被任选地富集或纯化以浓缩无核细胞。可以通过本领域已知的任何方法来富集细胞，所述方法包括但不限于磁性细胞分离、荧光激活细胞分选(FACS)、或密度梯度离心。
细胞悬液的粘度也可以影响本文公开的方法。在一些实施方案中，细胞悬液的粘度范围为约8.9x10-4Pa·s至约4.0x10-3Pa·s或在其间的任何值或值的范围。在一些实施方案中，粘度范围为约8.9x10-4Pa·s至约4.0x10-3Pa·s、约8.9x10-4Pa·s至约3.0x10- 3Pa·s、约8.9x10-4Pa·s至约2.0x10-3Pa·s、或约8.9x10-3Pa·s至约1.0x10-3Pa·s之间的任一个。在一些实施方案中，粘度范围为约0.89cP至约4.0cP、约0.89cP至约3.0cP、约0.89cP至约2.0cP、或约0.89cP至约1.0cP之间的任一个。在一些实施方案中，观察到剪切稀化作用，其中细胞悬液的粘度在剪切应变条件下降低。可以通过本领域已知的任何方法来测量粘度，所述方法包括但不限于粘度计(如玻璃毛细管粘度计)或流变仪。粘度计在一种流动条件下测量粘度，而流变仪用于测量随流动条件变化的粘度。在一些实施方案中，测量剪切稀化溶液如血液的粘度。在一些实施方案中，在约-5℃和约45℃之间测量粘度。例如，在以下温度测量粘度：室温(例如约20℃)、生理温度(例如约37℃)、高于生理温度(例如高于约37℃至45℃或更高)、降低的温度(例如约-5℃至约4℃)或这些示例性温度之间的温度。
在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部之前与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部的同时与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，使细胞悬液在通过缩窄部之后与有效载荷接触(例如第一次接触)。在一些实施方案中，细胞悬液至少在通过缩窄部的同时和通过缩窄部之后与有效载荷接触。在一些实施方案中，细胞悬液在通过缩窄部之前、通过缩窄部的同时和通过缩窄部之后与有效载荷接触。
在一些实施方案中，有效载荷是治疗性有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷是抗原。在一些实施方案中，有效载荷是佐剂。在一些实施方案中，有效载荷是致耐受性因子。在一些实施方案中，有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物(如基于蛋白质的复合物、核酸复合物、蛋白质-蛋白质复合物、核酸-核酸复合物、或蛋白质-核酸复合物)或纳米颗粒。
在一些实施方案中，使细胞悬液与抗原(如本文所述的任何抗原)接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与多种不同类型的抗原(如2、3、4或5种不同类型的抗原，如选自本文所述的任何抗原)接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与佐剂(如本文所述的任何佐剂)接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与多种不同类型的佐剂(如2、3、4或5种不同类型的佐剂，如选自本文所述的任何佐剂)接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与致耐受性因子(如本文所述的任何致耐受性因子)接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与多种不同类型的致耐受性因子(如2、3、4或5种不同类型的致耐受性因子，如选自本文所述的任何致耐受性因子)接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与抗原和佐剂接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与佐剂和致耐受性因子接触。在一些实施方案中，使细胞悬液与抗原和致耐受性因子接触。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原、佐剂和致耐受性因子。
例如，在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原源自裂解物。在一些实施方案中，裂解物是肿瘤裂解物。在一些实施方案中，抗原源自移植体裂解物。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，抗原是微生物。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是脂质抗原。在一些实施方案中，抗原是糖类抗原。在一些实施方案中，将编码抗原的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，抗原是经修饰的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。在一些实施方案中，经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。在一些实施方案中，将多种抗原递送至无核细胞。在一些实施方案中，佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。
其他使用方法
在一些方面，本申请提供了使用本文所述的无核细胞源性囊泡和/或组合物的方法。
在一些实施方案中，本文提供了用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用本文所述的任何无核细胞源性囊泡和/或组合物。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含治疗性有效载荷。在一些实施方案中，治疗性有效载荷包含抗原、佐剂和致耐受性因子中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原、佐剂和致耐受性因子中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含无核细胞和佐剂。
在一些实施方案中，疾病或障碍是癌症、传染病或病毒相关疾病。在一些实施方案中，疾病可通过酶替代疗法(ERT)治疗；例如，戈谢病。在一些实施方案中，疾病或障碍是I型戈谢病，痛风，低磷酸酯酶症，溶酶体酸性脂肪酶缺乏症，庞贝病(Pompe disease)，MPS IH(赫尔勒综合征(Hurler syndrome))，MPS II(亨特综合征(Hunter syndrome))，MPS IIIA、B、C和D(沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)A、B、C、D)，MPS IV A、B(莫奎欧综合征(Morquio syndrome))，MPV VI(马-拉二氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome))，MPS VII(斯莱综合征(Sly syndrome))，MPS IX(纳托维奇综合征(Natowicz syndrome))，法布里综合征(Fabry syndrome)，PKU综合征，中链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)，乳糜泻，重症肌无力，格雷夫斯病，寻常型天疱疮，视神经脊髓炎(NMO)或I型糖尿病。在一些实施方案中，癌症是头颈癌、宫颈癌、子宫癌、直肠癌、阴茎癌、卵巢癌、睾丸癌、骨癌、软组织癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、胃癌、肠癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、脑癌或血癌。
在一些实施方案中，疾病或障碍是痛风，并且有效载荷是尿酸酶，例如半合成形式，如培戈洛酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是I型戈谢病，并且有效载荷是葡糖脑苷脂酶，例如伊米苷酶、维拉苷酶α或β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是低磷酸酯酶症，并且有效载荷是组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)，例如阿福他酶α。在一些实施方案中，疾病或障碍是溶酶体酸性脂肪酶缺乏症，并且有效载荷是溶酶体酸性脂肪酶，例如塞贝脂酶α。在一些实施方案中，疾病或障碍是庞贝病，并且有效载荷是α-葡糖苷酶，例如阿糖苷酶α。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPS IH(赫尔勒综合征)、IH/S(赫尔勒-施艾综合征(Hurler-Scheie syndrome))或IS(施艾症，又名MPS V)，并且有效载荷是α-L-艾杜糖苷酸酶，例如Iaronidase。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPS II(亨特综合征)，并且有效载荷是艾杜糖醛酸硫酸酯酶，例如艾杜硫酸酯酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPS IIIA、B、C或D(沙费利波综合征A、B、C或D)，并且有效载荷是硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPS IV A、B(莫奎欧综合征)，并且有效载荷是硫酸角质素或6-硫酸软骨素，例如依罗硫酸酯酶α。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPV VI(马-拉二氏综合征)，并且有效载荷是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，例如加硫酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPSVII(斯莱综合征)，并且有效载荷是β-葡糖醛酸酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是MPSIX(纳托维奇综合征)，并且有效载荷是透明质酸酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是法布里综合征，并且有效载荷是α-半乳糖苷酶A，例如半乳糖苷酶β。在一些实施方案中，疾病或障碍是PKU综合征，并且有效载荷是苯丙氨酸羟化酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是中链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)，并且有效载荷是中链酰基-CoA脱氢酶。在一些实施方案中，疾病或障碍是乳糜泻，并且有效载荷是醇溶蛋白。在一些实施方案中，疾病或障碍是重症肌无力，并且有效载荷是乙酰胆碱受体和受体相关蛋白。在一些实施方案中，疾病或障碍是格雷夫斯病，并且有效载荷是促甲状腺激素受体(TSHR)。在一些实施方案中，疾病或障碍是寻常型天疱疮，并且有效载荷是桥粒芯蛋白1和3。在一些实施方案中，疾病或障碍是视神经脊髓炎(NMO)，并且有效载荷是水通道蛋白4。在一些实施方案中，疾病或障碍是I型糖尿病，并且有效载荷是GADD65、胰岛素、胰岛素原或前胰岛素原。
在一些实施方案中，病毒相关疾病是EBV相关疾病。在一些实施方案中，病毒相关疾病是EBV相关疾病，并且抗原是以下中的一种或多种：EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B或EBER。在一些实施方案中，EBV相关疾病是多发性硬化症(MS)。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HIV相关疾病。在一些实施方案中，HIV相关疾病是机会性感染，其可包括但不限于：支气管、气管、食管或肺的念珠菌病；浸润性宫颈癌；球孢子菌病；隐球菌病；慢性肠道隐孢子虫病；巨细胞病毒病；HIV相关脑病；HSV相关的慢性溃疡或支气管炎、肺炎或食管炎；组织胞浆菌病；慢性肠道等孢球虫病；卡波西肉瘤；淋巴瘤；结核病；鸟分枝杆菌复合菌组病(MAC)；卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)；复发性肺炎；进行性多灶性白质脑病；复发性沙门氏菌败血症；脑弓形体病；以及由HIV引起的消耗综合征。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HPV。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HPV并且抗原诱导对E7的反应。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HPV并且抗原诱导对E6的反应。在一些实施方案中，病毒相关疾病是HBV相关疾病。在一些实施方案中，病毒相关疾病是RSV相关疾病。在一些实施方案中，病毒相关疾病是KSHV相关疾病。
在一些实施方案中，个体患有癌症并且有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有癌症并且有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，个体患有传染病或病毒相关疾病并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在一些实施方案中，个体患有自身免疫性疾病并且其中有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有自身免疫性疾病并且其中有效载荷包含抗原和致耐受性因子。
在一些实施方案中，个体患有传染病或病毒相关疾病并且有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有多发性硬化症(MS)并且有效载荷包含EBV抗原。在一些实施方案中，个体患有HIV并且有效载荷包含用于治疗HIV相关疾病(如机会性感染)的抗原。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向个体施用另一种治疗剂。在一些实施方案中，治疗方法进一步包括向个体施用一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，在向个体施用本文所述的无核细胞源性囊泡和/或组合物之前、同时或之后施用其他治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是免疫检查点抑制剂或细胞因子中的任一种。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向以下中的任一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)和BTLA。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ、IFN-α、IL-10、IL-15或IL-2及其修饰形式。在一些实施方案中，细胞因子是致耐受性细胞因子，如IL-10、TGF-B和诱导耐受形式的IL-2。在一些实施方案中，治疗剂是致耐受性剂，如雷帕霉素。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向个体施用放射疗法。
在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原和/或致耐受性因子以抑制免疫反应和/或诱导耐受。在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应和/或诱导的耐受性包括降低的自身免疫反应。例如，降低的自身免疫反应可包括但不限于针对与以下疾病相关的抗原的降低的免疫反应或诱导的耐受性：I型糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、可能具有免疫组分的神经退行性疾病(如视神经脊髓炎(NMO)、阿尔茨海默病、ALS、亨廷顿病和帕金森病)、全身性红斑狼疮、舍格伦病、克罗恩病或溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应和/或诱导的耐受性包括降低的过敏反应。例如，降低的过敏反应可以包括针对与过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎(花粉热)或食物过敏相关的抗原的降低的免疫反应或诱导的耐受性。在一些实施方案中，降低的过敏反应可包括针对与乳糜泻相关的抗原的降低的免疫反应或诱导的耐受性。在一些实施方案中，抗原是与移植组织相关的抗原。在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应和/或诱导的耐受性包括针对移植组织的降低的免疫反应或诱导的耐受性。在一些实施方案中，抗原与病毒相关。在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应和/或诱导的耐受性包括针对病毒的降低的致病性免疫反应或诱导的耐受性。例如，致病性免疫反应可以包括某些病毒感染产生的细胞因子风暴。细胞因子风暴是一种可能致命的免疫反应，其由细胞因子和白细胞之间的正反馈回路组成。
在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应包括针对治疗剂的降低的免疫反应。在一些实施方案中，治疗剂是凝血因子。示例性凝血因子包括但不限于因子VIII和因子IX。在一些实施方案中，治疗剂是抗体。示例性治疗性抗体包括但不限于抗TNFα、抗VEGF、抗CD3、抗CD20、抗IL-2R、抗Her2、抗RSVF、抗CEA、抗IL-1β、抗CD15、抗肌球蛋白、抗PSMA、抗40kDa糖蛋白、抗CD33、抗CD52、抗IgE、抗CD11a、抗EGFR、抗C5、抗α-4整合素、抗IL-12/IL-23、抗IL-6R和抗RANKL。在一些实施方案中，治疗剂是生长因子。示例性治疗性生长因子包括但不限于促红细胞生成素(EPO)和巨核细胞分化和生长因子(MDGF)。在一些实施方案中，治疗剂是激素。示例性治疗性激素包括但不限于胰岛素、人生长激素和促卵泡激素。在一些实施方案中，治疗剂是重组细胞因子。示例性治疗性重组细胞因子包括但不限于IFNβ、IFNα和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应包括针对治疗性媒介物的降低的免疫反应。在一些实施方案中，治疗性媒介物是病毒，如用于基因治疗的腺病毒、腺相关病毒(AAV)、杆状病毒、疱疹病毒或逆转录病毒。在一些实施方案中，治疗性媒介物是脂质体。在一些实施方案中，治疗性媒介物是纳米颗粒。在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应包括针对病毒衣壳(例如，AAV衣壳(例如，AAV VP1、VP2或VP3衣壳蛋白))的降低的免疫反应。在一些实施方案中，针对病毒治疗性媒介物的降低的免疫反应针对病毒的任何血清型；例如但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh8或AAVrh10。在一些实施方案中，例如针对病毒衣壳的降低的免疫反应允许以下中的一种或多种：更高的初始剂量、重复施用、更长的半衰期和更长的表达，例如重复给予AAV治疗性媒介物。
在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应包括针对由治疗性媒介物(例如基因治疗媒介物)表达的转基因产物的降低的免疫反应。在一些实施方案中，受阻抑的免疫反应包括针对由AAV基因治疗载体表达的转基因产物的降低的免疫反应。
在一些实施方案中，治疗方法包括向个体施用一个或多个剂量(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个剂量中的任一个)的本文所述的无核细胞源性囊泡和/或组合物。在一些实施方案中，治疗方法包括每年向个体施用多达12个剂量(如每年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个剂量中的任一个)的本文所述的无核细胞源性囊泡和/或组合物。在一些实施方案中，在治疗过程中以均匀或非均匀的间隔施用两个或更多个剂量，如间隔例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或2周中的任一个。在一些实施方案中，在治疗过程中施用两个或更多个剂量，其中第一剂量和第二剂量之间的间隔为约1周至约1年，如约2周至约1个月、约2周至约3个月、约2周至约4个月、约2周至约6个月、约2周至约9个月、或约2周至约12个月中的任一个。
在一些实施方案中，本文提供了用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括向个体施用本文所述的任何无核细胞源性囊泡和/或组合物。在一些实施方案中，无核细胞源性囊泡包含抗原。在一些实施方案中，个体患有癌症并且其中有效载荷包含佐剂。在一些实施方案中，个体患有癌症并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，疾病或障碍是癌症并且抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，个体患有传染病并且其中有效载荷包含抗原。在一些实施方案中，个体患有传染病并且其中有效载荷包含抗原和佐剂。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了系统，所述系统包含用于本文公开的方法中的缩窄部、细胞悬液和化合物。所述系统可以包括针对以上所公开的方法描述的任何实施方案，所述实施方案包括用于提供细胞变形缩窄部的微流体通道或具有孔的表面、细胞悬液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在一些实施方案中，细胞变形缩窄部的大小适于将抗原和/或佐剂递送至输入的无核细胞。在一些实施方案中，递送参数，如操作流速、细胞浓度、抗原和/或佐剂浓度、细胞在缩窄部中的速度和细胞悬液的组成(例如渗量、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)被优化以最大程度地刺激或增强对抗原和/或佐剂的免疫反应。
还提供了试剂盒或制品，所述试剂盒或制品用于将抗原和/或佐剂递送至用于刺激或增强免疫反应的无核细胞源性囊泡。在一些实施方案中，试剂盒包含在合适的包装中的本文所述的组合物(例如，微流体通道或含有孔的表面、细胞悬液、和/或化合物)。合适的包装材料是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可以进一步将这些制品灭菌和/或密封。
本公开文本还提供了包含本文所述方法中的组分的试剂盒，并且可以进一步包含用于执行所述方法以刺激或增强免疫反应的说明书。本文所述的试剂盒可以进一步包括其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和包装插页(其具有用于执行本文所述任何方法的说明书；例如，用于刺激或增强免疫反应的说明书)。
示例性实施方案
实施方案1.一种用于将抗原递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述输入的无核细胞进一步包含佐剂。
实施方案3.一种用于将佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案4.根据实施方案3所述的方法，其中所述输入的无核细胞进一步包含抗原。
实施方案5.一种用于将抗原和佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案6.一种用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用佐剂。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。
实施方案9.根据实施方案6-8中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
实施方案10.一种用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案11.根据实施方案10所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用佐剂。
实施方案12.根据实施方案11所述的方法，其中所述佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。
实施方案13.一种用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，并且其中所述包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案14.一种用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，并且其中所述包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案15.一种用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向所述个体施用包含所述抗原的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案16.根据实施方案13-15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用佐剂。
实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中所述佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。
实施方案18.根据实施方案13-17所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
实施方案19.一种用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，并且其中所述包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案20.一种用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防所述疾病的进展，并且其中所述包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案21.一种用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向所述个体施用包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
实施方案22.一种用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案23.一种用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案24.一种用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案25.根据实施方案19-24中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用囊泡外佐剂。
实施方案26.根据实施方案25所述的方法，其中所述囊泡外佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
实施方案27.根据实施方案19-24所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
实施方案28.一种用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使疾病相关抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案29.一种用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案30.一种用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案31.根据实施方案28-30中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用囊泡外佐剂。
实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中所述囊泡外佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
实施方案33.根据实施方案13-32中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症、传染病或病毒相关疾病。
实施方案34.根据实施方案6-33中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡对所述个体而言是自体的。
实施方案35.根据实施方案6-33中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡对所述个体而言是同种异体的。
实施方案36.根据实施方案6-35中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡在药物配制品中。
实施方案37.根据实施方案6-36中任一项所述的方法，其中全身施用所述无核细胞源性囊泡。
实施方案38.根据实施方案6-37中任一项所述的方法，其中静脉内、动脉内、皮下、肌内或腹膜内施用所述无核细胞源性囊泡。
实施方案39.根据实施方案6-38中任一项所述的方法，其中将所述无核细胞源性囊泡与治疗剂组合施用于所述个体。
实施方案40.根据实施方案39所述的方法，其中所述治疗剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
实施方案41.根据实施方案39或40所述的方法，其中所述治疗剂是免疫检查点抑制剂和/或细胞因子。
实施方案42.根据实施方案41所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-α、IFN-γ、IL-2或IL-15中的一种或多种。
实施方案43.根据实施方案41所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的任一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)和BTLA。
实施方案44.根据实施方案1、2或4-43中任一项所述的方法，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案45.根据实施方案1、2或4-43中任一项所述的方法，其中所述抗原是CD-1限制性抗原。
实施方案46.根据实施方案1、2或4-45中任一项所述的方法，其中所述抗原是疾病相关抗原。
实施方案47.根据实施方案1、2或4-46中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案48.根据实施方案1、2或4-47中任一项所述的方法，其中所述抗原源自裂解物。
实施方案49.根据实施方案48所述的方法，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
实施方案50.根据实施方案1、2或4-46中任一项所述的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施方案51.根据实施方案1、2或4-46中任一项所述的方法，其中所述抗原是微生物。
实施方案52.根据实施方案1、2或4-50中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽。
实施方案53.根据实施方案1、2或4-50中任一项所述的方法，其中所述抗原是脂质抗原。
实施方案54.根据实施方案1、2或4-50中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖类抗原。
实施方案55.根据实施方案1、2或4-54中任一项所述的方法，其中所述抗原是经修饰的抗原。
实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
实施方案58.根据实施方案55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
实施方案59.根据实施方案55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
实施方案60.根据实施方案55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
实施方案61.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，其中将多种抗原递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施方案62.根据实施方案2-5、7-12、16-21、25-61中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
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咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。
实施方案63.根据实施方案62所述的方法，其中所述佐剂是低分子量的poly I:C。
实施方案64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红细胞。
实施方案65.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述红细胞是红血球。
实施方案66.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述红细胞是网织红细胞。
实施方案67.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是血小板。
实施方案68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是哺乳动物细胞。
实施方案69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。
实施方案70.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是人类细胞。
实施方案71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
实施方案73.根据实施方案72所述的方法，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
实施方案74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。
实施方案75.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
实施方案76.根据实施方案75所述的方法，其中所述孔包含在表面中。
实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中所述表面是过滤器。
实施方案78.根据实施方案76所述的方法，其中所述表面是膜。
实施方案79.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸随悬液中所述输入的无核细胞的直径而变。
实施方案80.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸是悬液中所述输入的无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
实施方案81.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
实施方案82.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
实施方案83.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
实施方案84.根据实施方案1-83中任一项所述的方法，其中在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入的无核细胞通过所述缩窄部。
实施方案85.根据实施方案1-84中任一项所述的方法，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
实施方案86.一种包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案87.根据实施方案86所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
实施方案88.一种包含佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生所述包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案89.根据实施方案88所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞包含抗原。
实施方案90.一种包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案91.根据实施方案86-90中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。
实施方案92.根据实施方案91所述的无核细胞源性囊泡，其中所述红细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
实施方案93.根据实施方案86、87或89-92中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案94.根据实施方案86、87或89-92中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是CD-1限制性抗原。
实施方案95.根据实施方案86、87或89-94中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是疾病相关抗原。
实施方案96.根据实施方案86、87或89-95中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案97.根据实施方案86、87或89-96中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原源自裂解物。
实施方案98.根据实施方案97所述的无核细胞源性囊泡，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
实施方案99.根据实施方案86、87或89-95中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施方案100.根据实施方案86、87或89-95中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是微生物。
实施方案101.根据实施方案86、87或89-99中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是多肽。
实施方案102.根据实施方案86、87或89-99中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是脂质抗原。
实施方案103.根据实施方案86、87或89-99中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是糖类抗原。
实施方案104.根据实施方案86、87或89-103中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是经修饰的抗原。
实施方案105.根据实施方案104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
实施方案106.根据实施方案105所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
实施方案107.根据实施方案104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
实施方案108.根据实施方案104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
实施方案109.根据实施方案104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
实施方案110.根据实施方案86、87或89-109中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中将多种抗原递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施方案111.根据实施方案87-110中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure BDA0003275917030001291
咪喹莫特、瑞喹莫德和/或LPS。
实施方案112.根据实施方案111所述的无核细胞源性囊泡，其中所述佐剂是低分子量的poly I:C。
实施方案113.根据实施方案86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是红细胞。
实施方案114.根据实施方案86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是红血球。
实施方案115.根据实施方案86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是网织红细胞。
实施方案116.根据实施方案86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是血小板。
实施方案117.根据实施方案86-116中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是哺乳动物细胞。
实施方案118.根据实施方案86-117中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。
实施方案119.根据实施方案86-117中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是人类细胞。
实施方案120.根据实施方案86-119中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与施用于哺乳动物后所述输入的无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物后所述无核细胞源性囊泡的半衰期降低。
实施方案121.根据实施方案86-115或117-120中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的血红蛋白含量相比，所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量降低。
实施方案122.根据实施方案86-120中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的ATP产生相比，所述无核细胞源性囊泡的ATP产生降低。
实施方案123.根据实施方案113、114、117-122中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡表现出以下一种或多种特性：(a)与所述输入的无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低；(b)与所述输入的无核细胞相比，血红蛋白水平降低；(c)球形形态；(d)与所述输入的无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，(e)与所述输入的无核细胞相比，ATP产生减少。
实施方案124.根据实施方案113、114、117-122中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是红血球，并且其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
实施方案125.根据实施方案113、114、117-122所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
实施方案126.根据实施方案86-125中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。
实施方案127.根据实施方案86-126中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案128.根据实施方案86-127中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案129.根据实施方案86-128中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。
实施方案130.根据实施方案129所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的摄取相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取增强。
实施方案131.根据实施方案86-130中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在组织或细胞中的摄取。
实施方案132.根据实施方案131所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述输入的无核细胞的摄取相比增强在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。
实施方案133根据实施方案86-132中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
实施方案134.根据实施方案86-133中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在制所述无核细胞源性囊泡期间，所述无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。
实施方案135.根据实施方案86-134中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在整个过程中维持所述细胞悬液的渗量。
实施方案136.根据实施方案86-135所述的无核细胞源性囊泡，其中在整个过程中所述细胞悬液的渗量维持在200mOsm和400mOsm之间。
实施方案137.根据实施方案86-136中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
实施方案138.根据实施方案137所述的无核细胞源性囊泡，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
实施方案139.根据实施方案138所述的无核细胞源性囊泡，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
实施方案140.根据实施方案86-139中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。
实施方案141.根据实施方案86-136中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
实施方案142.根据实施方案141所述的无核细胞源性囊泡，其中所述孔包含在表面中。
实施方案143.根据实施方案142所述的无核细胞源性囊泡，其中所述表面是过滤器。
实施方案144.根据实施方案142所述的无核细胞源性囊泡，其中所述表面是膜。
实施方案145.根据实施方案86-144中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的尺寸随悬液中所述输入的无核细胞的直径而变。
实施方案146.根据实施方案86-144中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的尺寸是悬液中所述输入的无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
实施方案147.根据实施方案86-146中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
实施方案148.根据实施方案86-147中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
实施方案149.根据实施方案86-147中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
实施方案150.根据实施方案86-149中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入的无核细胞通过所述缩窄部。
实施方案151.根据实施方案86-150中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
实施方案152.一种组合物，所述组合物包含多个根据实施方案86-151中任一项所述的无核细胞源性囊泡。
实施方案153.根据实施方案152所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
实施方案154.一种用于产生包含抗原的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案155.根据实施方案154所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
实施方案156.一种用于产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案157.根据实施方案156所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含抗原。
实施方案158.一种用于产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案159.根据实施方案154-158中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。
实施方案160.根据实施方案159所述的方法，其中所述红细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
实施方案161.根据实施方案154、155或157-160中任一项所述的方法，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案162.根据实施方案154、155或157-160中任一项所述的方法，其中所述抗原是CD-1限制性抗原。
实施方案163.根据实施方案154、155或157-162中任一项所述的方法，其中所述抗原是疾病相关抗原。
实施方案164.根据实施方案154、155或157-163中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案165.根据实施方案154、155或157-164中任一项所述的方法，其中所述抗原源自裂解物。
实施方案166.根据实施方案165所述的方法，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
实施方案167.根据实施方案154、155或157-163中任一项所述的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施方案168.根据实施方案154、155或157-163中任一项所述的方法，其中所述抗原是微生物。
实施方案169.根据实施方案154、155或157-167中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽。
实施方案170.根据实施方案154、155或157-167中任一项所述的方法，其中所述抗原是脂质抗原。
实施方案171.根据实施方案154、155或157-167中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖类抗原。
实施方案172.根据实施方案154、155或157-171中任一项所述的方法，其中所述抗原是经修饰的抗原。
实施方案173.根据实施方案172所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
实施方案174.根据实施方案173所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
实施方案175.根据实施方案174所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
实施方案176.根据实施方案175所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
实施方案177.根据实施方案176所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
实施方案178.根据实施方案154、155或157-177中任一项所述的方法，其中将多种抗原递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施方案179.根据实施方案155-178中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure BDA0003275917030001351
咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。
实施方案180.根据实施方案179所述的方法，其中所述佐剂是低分子量的poly I:C。
实施方案181.根据实施方案154-180中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红细胞。
实施方案182.根据实施方案154-181中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红血球。
实施方案183.根据实施方案154-181中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是网织红细胞。
实施方案184.根据实施方案154-180中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是血小板。
实施方案185.根据实施方案154-184中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是哺乳动物细胞。
实施方案186.根据实施方案154-185中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。
实施方案187.根据实施方案154-185中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是人类细胞。
实施方案188.根据实施方案154-187中任一项所述的方法，其中与施用于哺乳动物后所述输入的无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物后所述无核细胞源性囊泡的半衰期降低。
实施方案189.根据实施方案181-183或185-188中任一项所述的方法，其中与所述输入的无核细胞的血红蛋白含量相比，所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量降低。
实施方案190.根据实施方案181-189中任一项所述的方法，其中与所述输入的无核细胞的ATP产生相比，所述无核细胞源性囊泡的ATP产生降低。
实施方案191.根据实施方案181-182或185-190中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡表现出以下一种或多种特性：(a)与所述输入的无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低；(b)与所述输入的无核细胞相比，血红蛋白水平降低；(c)球形形态；(d)与所述输入的无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，(e)与所述输入的无核细胞相比，ATP产生减少。
实施方案192.根据实施方案181-182或185-191中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红血球，并且其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
实施方案193.根据实施方案181-182或185-192所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
实施方案194.根据实施方案154-193中任一项所述的方法，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。
实施方案195.根据实施方案154-194中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案196.根据实施方案154-195中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案197.根据实施方案154-196中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。
实施方案198.根据实施方案197所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的摄取相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取增强。
实施方案199.根据实施方案154-198中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述输入的无核细胞相比增强在组织或细胞中的摄取。
实施方案200.根据实施方案199所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述输入的无核细胞的摄取相比增强在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。
实施方案201.根据实施方案154-200中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
实施方案202.根据实施方案154-201中任一项所述的方法，其中在制所述无核细胞源性囊泡期间，所述无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。
实施方案203.根据实施方案154-202中任一项所述的方法，其中在整个过程中维持所述细胞悬液的渗量。
实施方案204.根据实施方案154-203所述的方法，在整个过程中细胞悬液的渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
实施方案205.根据实施方案154-204中任一项所述的方法，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
实施方案206.根据实施方案205所述的方法，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
实施方案207.根据实施方案206所述的方法，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
实施方案208.根据实施方案154-207中任一项所述的方法，其中所述缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。
实施方案209.根据实施方案154-208中任一项所述的方法，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
实施方案210.根据实施方案209所述的方法，其中所述孔包含在表面中。
实施方案211.根据实施方案210所述的方法，其中所述表面是过滤器。
实施方案212.根据实施方案210所述的方法，其中所述表面是膜。
实施方案213.根据实施方案154-212中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸随悬液中所述输入的无核细胞的直径而变。
实施方案214.根据实施方案154-213中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸是悬液中所述输入的无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
实施方案215.根据实施方案154-214中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
实施方案216.根据实施方案154-215中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
实施方案217.根据实施方案154-215中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
实施方案218.根据实施方案154-217中任一项所述的方法，其中在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入的无核细胞通过所述缩窄部。
实施方案219.根据实施方案154-218中任一项所述的方法，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
实施方案220.一种组合物，所述组合物包含通过根据实施方案154-219中任一项所述的方法制备的无核细胞源性囊泡群。
实施方案301.一种由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有以下一种或多种特性：(a)与母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与母体无核细胞相比，ATP产生减少。
实施方案302.根据实施方案301所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是哺乳动物细胞。
实施方案303.根据实施方案301或302所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是人类细胞。
实施方案304.根据实施方案301-303中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是红细胞或血小板。
实施方案305.根据实施方案304所述的无核细胞源性囊泡，其中所述红细胞是红血球或网织红细胞。
实施方案306.根据实施方案301-305中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。
实施方案307.根据实施方案306所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％。
实施方案308.根据实施方案307所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是人类细胞，并且其中所述无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天、约25天、约50天、约75天、约100天、约120天。
实施方案309.根据实施方案301-308中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是红细胞，其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低。
实施方案310.根据实施方案309所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。
实施方案311.根据实施方案309所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平是所述母体无核细胞中血红蛋白水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。
实施方案312.根据实施方案301-311中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是红血球，并且其中所述无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。
实施方案313.根据实施方案301-311中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是红血球，并且其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
实施方案314.根据实施方案301-311中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述母体无核细胞是红细胞或红血球，并且其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞血影(RBC血影)。
实施方案315.根据实施方案301-312中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案316.根据实施方案315所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。
实施方案317.根据实施方案315所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或大于约100％的磷脂酰丝氨酸。
实施方案318.根据实施方案301-317中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述母体无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有降低的ATP产生。
实施方案319.根据实施方案318所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡产生的ATP低于由所述母体无核细胞产生的ATP水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。
实施方案320.根据实施方案319所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡不产生ATP。
实施方案321.根据实施方案301-20中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述母体无核细胞相比增强在组织或细胞中的摄取。
实施方案322.根据实施方案321所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述母体无核细胞的摄取相比增强在肝或脾中的摄取或被吞噬细胞或抗原呈递细胞的摄取。
实施方案323.根据实施方案301-320中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
实施方案324.根据301-319中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在制备所述无核细胞源性囊泡期间，所述母体无核细胞未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。
实施方案325.根据实施方案301-324中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在由所述母体无核细胞制备所述无核细胞源性囊泡期间维持渗量。
实施方案326.根据实施方案325所述的无核细胞源性囊泡，其中渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间。
实施方案327.根据实施方案325或326所述的无核细胞源性囊泡，其中渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
实施方案328.根据实施方案301-327中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：使包含输入的母体无核细胞的悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过，从而产生无核细胞源性囊泡。
实施方案329.根据实施方案301-328中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包含有效载荷。
实施方案330.根据实施方案329所述的无核细胞源性囊泡，其中所述有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物、纳米颗粒。
实施方案331.根据实施方案329所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述有效载荷孵育足够的时间以允许所述有效载荷进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述效载荷的无核细胞源性囊泡。
实施方案332.根据实施方案301-331中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原。
实施方案333.根据实施方案301-332中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包含佐剂。
实施方案334.根据实施方案301-332中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原和/或致耐受性因子。
实施方案335.根据实施方案332所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案336.根据实施方案333所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案337.根据实施方案333所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原和佐剂，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案338.根据实施方案334所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和致耐受性因子通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和致耐受性因子孵育足够的时间以允许所述抗原和致耐受性因子进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和致耐受性因子的无核细胞源性囊泡。
实施方案339.根据实施方案328-338中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
实施方案340.根据实施方案339所述的无核细胞源性囊泡，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
实施方案341.根据实施方案340所述的无核细胞源性囊泡，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
实施方案342.根据实施方案328-341中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部位于多个微柱之间、位于以阵列配置的多个微柱之间、或位于一个或多个可移动板之间。
实施方案343.根据实施方案328-338中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
实施方案344.根据实施方案343所述的无核细胞源性囊泡，其中所述孔包含在表面中。
实施方案345.根据实施方案344所述的无核细胞源性囊泡，其中所述表面是过滤器。
实施方案346.根据实施方案344所述的无核细胞源性囊泡，其中所述表面是膜。
实施方案347.根据实施方案328-346中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的尺寸是所述细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
实施方案348.根据实施方案328-346中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
实施方案349.根据实施方案328-346中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
实施方案350.根据实施方案328-346中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
实施方案351.根据实施方案328-350中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在范围为约10psi至约150psi的压力下使所述输入的母体无核细胞通过所述缩窄部。
实施方案352.根据实施方案328-351中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述有效载荷接触。
实施方案353.根据实施方案332-352中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案354.根据实施方案332-353中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是疾病相关抗原。
实施方案355.根据实施方案332-354中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案356.根据实施方案332-354中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原源自裂解物。
实施方案357.根据实施方案356所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原源自移植体裂解物。
实施方案358.根据实施方案356所述的无核细胞源性囊泡，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
实施方案359.根据实施方案332-358中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施方案360.根据实施方案359所述的无核细胞源性囊泡，其中所述病毒抗原是病毒、病毒颗粒或病毒衣壳。
实施方案361.根据实施方案332-354中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是微生物。
实施方案362.根据实施方案332-361中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是多肽。
实施方案363.根据实施方案332-361中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是脂质抗原。
实施方案364.根据实施方案332-361中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是糖类抗原。
实施方案365.根据实施方案332-361中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是经修饰的抗原。
实施方案366.根据实施方案365所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
实施方案367.根据实施方案366所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
实施方案368.根据实施方案366所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
实施方案369.根据实施方案366所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
实施方案370.根据实施方案366所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
实施方案371.根据实施方案332-370中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中将多种抗原递送至所述无核细胞。
实施方案372.根据实施方案333、336、337和339中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。
实施方案373.一种组合物，所述组合物包含多个根据实施方案301-372中任一项所述的无核细胞源性囊泡。
实施方案374.一种组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于约20％的所述无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)与所述母体无核细胞群相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
实施方案375.一种组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞群制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于约20％的所述无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或(f)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
实施方案376.根据实施方案374或375所述的组合物，其中所述母体无核细胞是哺乳动物细胞。
实施方案377.根据实施方案374-376中任一项所述的组合物，其中所述母体无核细胞是人类细胞。
实施方案378.根据实施方案374-377中任一项所述的组合物，其中所述母体无核细胞是红细胞或血小板。
实施方案379.根据实施方案378所述的组合物，其中所述红细胞是红血球或网织红细胞。
实施方案380.根据实施方案374-378中任一项所述的组合物，其中与所述母体无核细胞或所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中20％的所述无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低。
实施方案381.根据实施方案380所述的组合物，其中与所述母体无核细胞或所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中20％的所述无核细胞源性囊泡在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。
实施方案382.根据实施方案381所述的组合物，其中所述母体无核细胞是人类细胞，并且其中所述组合物中20％的所述无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天。
实施方案383.根据实施方案374-382中任一项所述的组合物，其中所述母体无核细胞是红细胞，并且其中与所述母体无核细胞或所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中20％的所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平降低。
实施方案384.根据实施方案383所述的组合物，其中与所述母体无核细胞或所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述无核细胞源性囊泡的组合物中20％的所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。
实施方案385.根据实施方案384所述的组合物，其中所述组合物中20％的所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白水平为所述母体无核细胞中的血红蛋白水平或所述母体无核细胞群的平均水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。
实施方案386.根据实施方案374-385中任一项所述的组合物，其中所述母体无核细胞是红血球，并且其中所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡在形态上是球形的。
实施方案387.根据实施方案374-385中任一项所述的组合物，其中所述母体无核细胞是红血球，并且其中与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
实施方案388.根据实施方案374-386中任一项所述的组合物，其中所述母体无核细胞是红细胞或红血球，并且其中所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
实施方案389.根据实施方案374-388中任一项所述的组合物，其中所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡包含表面磷脂酰丝氨酸。
实施方案390.根据实施方案374-389中任一项所述的组合物，其中与所述母体无核细胞或所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案391.根据实施方案390所述的组合物，其与包含多个母体无核细胞的组合物相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有高出约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或大于约100％的表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施方案392.根据实施方案374-391中任一项所述的组合物，其中与所述母体无核细胞或所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
实施方案393.根据实施方案392所述的组合物，其中所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡产生的ATP低于所述母体无核细胞产生的ATP水平或所述母体无核细胞群的平均水平约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％。
实施方案394.根据实施方案393所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡不产生ATP。
实施方案395.根据374-393中任一项所述的组合物，其中在制备所述组合物期间，所述母体无核细胞未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。
实施方案396.根据实施方案301-324中任一项所述的组合物，其中在由所述母体无核细胞制备所述无核细胞源性囊泡期间维持渗量。
实施方案397.根据实施方案396所述的组合物，其中渗量维持在约200mOsm和约600mOsm之间。
实施方案398.根据实施方案396或397所述的组合物，其中渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
实施方案399.根据实施方案374-398中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：使包含输入的母体无核细胞的悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过，从而产生无核细胞源性囊泡。
实施方案400.根据实施方案374-399中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡包含有效载荷。
实施方案401.根据实施方案400所述的组合物，其中所述有效载荷是治疗性有效载荷。
实施方案402.根据实施方案400所述的组合物，其中所述有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物、纳米颗粒。
实施方案403.根据实施方案402所述的组合物，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述有效载荷孵育足够的时间以允许所述有效载荷进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述有效载荷的无核细胞源性囊泡。
实施方案404.根据实施方案374-403中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原。
实施方案405.根据实施方案374-404中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包含佐剂。
实施方案406.根据实施方案374-404中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原和致耐受性因子。
实施方案407.根据实施方案404所述的组合物，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原的无核细胞源性囊泡。
实施方案408.根据实施方案405所述的组合物，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案409.根据实施方案405所述的组合物，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡包含抗原和佐剂，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施方案410.根据实施方案406所述的组合物，其中所述组合物包含抗原和致耐受性因子，其中所述组合物中的无核细胞源性囊泡通过以下方法制备，所述方法包括：(a)使包含输入的母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的母体无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和致耐受性因子通过从而形成无核细胞源性囊泡；和(b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和致耐受性因子孵育足够的时间以允许所述抗原和致耐受性因子进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含抗原和/或致耐受性因子的无核细胞源性囊泡。
实施方案411.根据实施方案399、403和407-410中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
实施方案412.根据实施方案384所述的组合物，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
实施方案413.根据实施方案412所述的组合物，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
实施方案414.根据实施方案400-413中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部位于多个微柱之间、位于以阵列配置的多个微柱之间、或位于一个或多个可移动板之间。
实施方案415.根据实施方案399、403和407-410中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
实施方案416.根据实施方案415所述的组合物，其中所述孔包含在表面中。
实施方案417.根据实施方案416所述的组合物，其中所述表面是过滤器。
实施方案418.根据实施方案416所述的组合物，其中所述表面是膜。
实施方案419.根据实施方案399-418中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的尺寸是所述细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
实施方案420.根据实施方案399-419中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
实施方案421.根据实施方案399-420中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
实施方案422.根据实施方案399-420中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
实施方案423.根据实施方案399-422中任一项所述的组合物，其中在范围为约10psi至约150psi的压力下使所述输入的母体无核细胞通过所述缩窄部。
实施方案424.根据实施方案399-423中任一项所述的组合物，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
实施方案425.根据实施方案404-424中任一项所述的组合物，其中所述抗原能够被加工为MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
实施方案426.根据实施方案404-425中任一项所述的组合物，其中所述抗原是疾病相关抗原。
实施方案427.根据实施方案404-426中任一项所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案428.根据实施方案404-427中任一项所述的组合物，其中所述抗原源自裂解物。
实施方案429.根据实施方案428所述的组合物，其中所述裂解物是移植体裂解物。
实施方案430.根据实施方案428所述的组合物，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
实施方案431.根据实施方案404-426中任一项所述的组合物，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施方案432.根据实施方案404-426中任一项所述的组合物，其中所述抗原是微生物。
实施方案433.根据实施方案404-432中任一项所述的组合物，其中所述抗原是多肽。
实施方案434.根据实施方案404-433中任一项所述的组合物，其中所述抗原是脂质抗原。
实施方案435.根据实施方案404-433中任一项所述的组合物，其中所述抗原是糖类抗原。
实施方案436.根据实施方案404-433中任一项所述的组合物，其中所述抗原是经修饰的抗原。
实施方案437.根据实施方案436所述的组合物，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
实施方案438.根据实施方案437所述的组合物，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
实施方案439.根据实施方案437所述的组合物，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
实施方案440.根据实施方案437所述的组合物，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
实施方案441.根据实施方案437所述的组合物，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
实施方案442.根据实施方案404-441中任一项所述的组合物，其中将多种抗原递送至所述无核细胞。
实施方案443.根据实施方案405、408、409和411-442中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。
实施方案444.根据实施方案373-443中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
实施方案445.一种制造包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述组合物具有一种或多种以下特性：(a)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，(b)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，(c)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有球形形态，(d)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是RBC血影，(e)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有更高水平的磷脂酰丝氨酸，或(f)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生；所述方法包括使包含所述母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中母体无核细胞的直径而变，从而引起所述母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡，从而产生无核细胞源性囊泡。
实施方案446.根据实施方案445所述的方法，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
实施方案447.根据实施方案446所述的方法，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
实施方案448.根据实施方案447所述的方法，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
实施方案449.根据实施方案445-448中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部位于多个微柱之间、位于以阵列配置的多个微柱之间、或位于一个或多个可移动板之间。
实施方案450.根据实施方案446或447所述的方法，其中所述缩窄部是孔或被包含在孔内。
实施方案451.根据实施方案450所述的方法，其中所述孔包含在表面中。
实施方案452.根据实施方案451所述的方法，其中所述表面是过滤器。
实施方案453.根据实施方案451所述的方法，其中所述表面是膜。
实施方案454.根据实施方案445-453中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸是所述细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
实施方案455.根据实施方案445-454中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
实施方案456.根据实施方案445-454中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
实施方案457.根据实施方案445-454中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
实施方案458.根据实施方案445-457中任一项所述的方法，其中在范围为约10psi至约150psi的压力下使所述输入的母体无核细胞通过所述缩窄部。
实施方案459.根据实施方案445-458中任一项所述的方法，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与有效载荷接触，如此使得所述有效载荷进入所述细胞。
实施方案460.根据实施方案459所述的方法，其中所述有效载荷是治疗性有效载荷。
实施方案461.根据实施方案459或460所述的组合物，其中所述有效载荷是多肽、核酸、脂质、糖类、小分子、复合物、或纳米颗粒。
实施方案462.根据实施方案459-461中任一项所述的方法，其中所述有效载荷是抗原和/或佐剂。
实施方案463.根据实施方案459-461中任一项所述的方法，其中所述有效载荷是抗原和/或致耐受性因子。
实施方案464.一种用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据实施方案301-372中任一项所述的无核细胞源性囊泡。
实施方案465.一种用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据实施方案373-444中任一项所述的组合物。
实施方案466.根据实施方案464或465所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡包含治疗性有效载荷。
实施方案467.根据实施方案466所述的方法，其中所述个体患有癌症并且其中所述有效载荷包含抗原。
实施方案468.根据实施方案466或467所述的方法，其中所述个体患有癌症并且其中所述有效载荷包含抗原和佐剂。
实施方案469.根据实施方案467或468中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案470.根据实施方案466所述的方法，其中所述个体患有传染病或病毒相关疾病并且其中所述有效载荷包含抗原。
实施方案471.根据实施方案466或470所述的方法，其中所述个体患有传染病或病毒相关疾病并且其中所述有效载荷包含抗原和佐剂。
实施方案472.根据实施方案471所述的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施方案473.根据实施方案466所述的方法，其中所述个体患有自身免疫性疾病并且其中所述有效载荷包含抗原。
实施方案474.根据实施方案466或473所述的方法，其中所述个体患有自身免疫性疾病并且其中所述有效载荷包含抗原和/或致耐受性因子。
实施方案475.一种用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据实施方案301-372中任一项所述的无核细胞源性囊泡。
实施方案476.一种用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据实施方案373-444中任一项所述的组合物。
实施方案477.根据实施方案475或476所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡包含抗原。
实施方案478.根据实施方案475或476所述的方法，其中所述个体患有癌症并且其中所述有效载荷包含抗原和佐剂。
实施方案479.根据实施方案477或478所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症并且所述抗原是肿瘤抗原。
实施方案480.根据实施方案477或478所述的方法，其中所述个体患有传染病并且其中所述有效载荷包含抗原。
实施方案481.根据实施方案477或478所述的方法，其中所述个体患有传染病并且其中所述有效载荷包含抗原和佐剂。
实施方案482.根据实施方案481所述的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
实施例
出于说明本公开文本的各种实施方案的目的给出以下实施例，而不意味着以任何方式限制本公开文本。本领域技术人员将容易理解，本公开文本很好地适用于实现该目的并获得所提及的目标和优点以及本文固有的那些目的、目标和优点。本领域技术人员将会想到包含在由权利要求的范围限定的本公开文本的精神内的其中的变化以及其他用途。
实施例1
该实施例部分证明了包含负载的抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导体内抗原特异性免疫反应。
材料和方法
为了确定体内抗原特异性免疫反应，将根据表1中的条件处理的细胞源性囊泡(如负载有模型抗原和/或佐剂的红细胞源性囊泡)施用于小鼠，然后通过流式细胞术测量抗原特异性T细胞的数量以及炎性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得红细胞(RBC)，并且根据表1中详述的组A-H(5只小鼠/组)，使其细胞内负载有荧光标记的IgG抗体(IgG488，20μg/mL)、Ova蛋白(200μg/mL)和/或聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly I:C)(300μg/mL)，在用或不用游离Ova(10μg/小鼠)和/或poly I:C(25μg/小鼠)进行全身处理的情况下。在表1中，RBC后面的括号中的条件表示细胞内货物，并且全身共同施用RBC后面的括号外的条件(即，不是细胞内货物)。
施用了RBC的组接受了150百万(M)RBC的剂量。阴性对照动物接受150M RBC：与Ova(200μg/mL)一起孵育，洗涤并与游离poly I:C共同注射到小鼠体内(Endo+poly I:C)(组A)；仅负载有抗体(RBC(IgG488)(组B)；或负载有抗体和抗原(RBC(IgG488+Ova)(组D)。阳性对照动物接受150M RBC：仅负载有抗体并与游离Ova和poly I:C共同施用(RBC(IgG488)+Ova+poly I:C)(组C)；或用Ova的最小表位(SIINFEKL–1μg/mL)进行脉冲处理的1M树突细胞(DC)(组H)。在第0天，将对应于每种处理条件的组合物过继转移至受体C57BL/6J小鼠中。在第7天，收获脾，并将其用针对Ova特异性四聚体的SIINFEKL(1μg/mL)重新刺激，并根据以下描述对IFN-γ和IL-2进行细胞内细胞因子染色(ICS)。
表1.处理组。
组 条件* 游离OVA/动物 游离Poly I:C/动物
A Endo+Poly I:C 0 25μg
B RBC(IgG488) 0 0
C RBC(IgG488)+OVA+Poly I:C 10μg 25μg
D RBC(IgG488+OVA) 0 0
E RBC(IgG488+Poly I:C) 0 0
F RBC(IgG488+OVA)+Poly I:C 0 25μg
G RBC(IgG488+OVA+Poly I:C) 0 0
H 经脉冲处理的DC 0 0
*RBC后面的括号中的条件表示细胞内货物；全身共同施用RBC后面的括号外的条件。
结果
通过如上所述的四聚体染色测量抗原特异性T细胞的数量。组F(RBC(IgG488+Ova)+poly I:C)、组G(RBC(IgG488+Ova+poly I:C))和阳性对照经脉冲处理的DC(组H)诱导Ova反应性T细胞的统计学显著增加(图1A)。这些数据表明需要抗原和佐剂(佐剂可共同包封或全身施用)来诱导如通过四聚体染色所确定的抗原特异性反应。在组F(RBC(IgG488+Ova)+poly I:C)和组H(经脉冲处理的DC)中，具有IFN-γ的细胞百分比显著增加；而在组G(RBC(IgG488+Ova+poly I:C))中也有轻微的统计学上不显著的增加(图1B)。相同组中每个细胞的IFN-γ量以统计学显著的方式增加，如IFN-γ+细胞的百分比所观察到的(组F和H)，而组C(RBC(IgG488)+Ova+poly I:C)和组G(RBC(IgG488+Ova+poly I:C)中也有显著增加(图1C)。与用IFN-γ所观察到的趋势相似，IL-2+细胞的百分比仅在经脉冲处理的DC(组H)和RBC(IgG488+Ova)+poly I:C(组F)中显著增加(图1D)。每个细胞的IL-2水平在经脉冲处理的DC(组H)和RBC(IgG488+Ova)+poly I:C(组F)以及RBC(IgG488)+Ova+poly I:C(组C)和RBC(IgG488+Ova+poly I:C)(组G)条件中显著增加，这与用每个细胞的IFN-γ量所观察到的趋势相同(图1E)。综上所述，这些数据表明，无核细胞源性囊泡可以诱导抗原特异性反应，其中需要抗原和佐剂(包封或未包封的)，并且在RBC(IgG488+Ova)+poly I:C(组F)中观察到最佳反应。所有比较均针对Endo+poly I:C阴性对照(组A)进行(5只小鼠/组，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.005)。
实施例2
该实施例部分证明了不同剂量的包含负载的抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导不同水平的体内抗原特异性免疫反应。具体地，更高剂量的包含负载的抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导更大的体内抗原特异性免疫反应。
材料和方法
为了确定体内抗原特异性免疫反应，将根据表2中的条件处理的细胞源性囊泡(如负载有模型抗原和/或佐剂的红细胞源性囊泡)施用于小鼠，然后通过流式细胞术测量抗原特异性T细胞的数量以及炎性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得红细胞(RBC)，并且根据表2中详述的各组(5只小鼠/组)，使其负载有荧光标记的IgG抗体(IgG488，20μg/mL)、Ova蛋白(200μg/mL)和/或poly I:C(300μg/mL)，在用或不用游离Ova(10μg/小鼠)和/或poly I:C(25μg/小鼠)进行全身处理的情况下。在表2中，RBC后面的括号中的条件表示细胞内货物，并且全身共同施用RBC后面的括号外的条件(即，不是细胞内货物)。
比较了负载的抗原和佐剂以及全身施用的游离抗原和佐剂的各种组合。阴性对照动物接受150M红细胞，这些红细胞与Ova(200μg/mL)一起孵育，洗涤并与游离poly I:C共同注射到小鼠体内(Endo+poly I:C)(组I)。阳性对照动物接受用Ova的最小表位(SIINFEKL–1μg/mL)进行脉冲处理的1M树突细胞(DC)(组N)。在第0天，将负载的无核细胞源性囊泡、孵育的红细胞、或树突细胞过继转移至受体C57BL/6J小鼠中。在第7天，收获脾，并将其用针对Ova特异性四聚体的SIINFEKL(1μg/mL)重新刺激，并对IFN-γ和IL-2进行细胞内细胞因子染色(ICS)。
表2.处理组。
Figure BDA0003275917030001581
*RBC后面的括号中的条件表示细胞内货物；全身共同施用RBC后面的括号外的条件。
结果
RBC(IgG488+Ova)+poly I:C(组K)和阳性对照经脉冲处理的DC(组N)诱导Ova反应性T细胞的统计学显著增加(图2A)。以下条件均表现出Ova特异性T细胞的百分比的轻微但在统计上不显著的增加：仅含有抗体并与游离Ova和poly I:C共同施用的无核细胞源性囊泡(RBC(IgG488)+Ova+poly I:C；组J)；以及含有抗体、Ova和poly I:C的囊泡(RBC(IgG488+Ova+poly I:C))，150百万个细胞/动物(组L)和1十亿(B)个细胞/动物(组M)(图2A)。有趣的是，相对于较低的150M剂量(组L)，较高剂量的负载的囊泡(1B RBC(IgG488+Ova+poly I:C)(组M))导致较低的内源性反应。IFN-γ+细胞的百分比倾向与与四聚体数据相似，只有经脉冲处理的DC阳性对照(组N)和RBC(IgG488+Ova)+poly I:C(组K)条件导致IFN-γ+细胞的比例显著增加(图2B)。在较低剂量的RBC(IgG488+Ova+poly I:C)(组L)中，IFN-γ+细胞的百分比也有轻微增加，但不显著(图2B)。然而，IL-2+细胞的百分比仅在阳性对照中显著增加(图2C)。综上所述，这些数据表明，用负载有抗原的囊泡并全身共同施用游离poly I:C获得了最佳反应，并且出乎意料的是，负载更高剂量的抗原+佐剂的囊泡(1B)(组M)导致较低的内源性反应。所有比较均针对Endo+poly I:C阴性对照(组I)进行(5只小鼠/组，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.005)。
实施例3
该实施例部分证明了使用不同佐剂或给药策略对体内抗原特异性免疫反应的影响。
材料和方法
为了确定体内抗原特异性免疫反应，将根据表3中的条件处理的细胞源性囊泡(如负载有模型抗原和/或佐剂的红细胞源性囊泡)施用于小鼠，然后通过流式细胞术测量抗原特异性T细胞的数量以及炎性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得红细胞，并且根据表3中详述的各组(5只小鼠/组)，以不同的剂量和初免-加强方案，使红细胞负载有荧光标记的IgG抗体(IgG488，20μg/mL)、Ova蛋白(200μg/mL)和/或佐剂(polyI:C(300或3000μg/mL)、脂多糖(LPS，300μg/mL)、或R848(100μg/mL))。
表3.处理组。
Figure BDA0003275917030001591
Figure BDA0003275917030001601
*RBC后面的括号中的条件表示细胞内货物；全身共同施用RBC后面的括号外的条件。
阴性对照动物接受红细胞，这些红细胞与Ova(200μg/mL)一起孵育，洗涤并与游离poly I:C共同注射到小鼠体内(Endo+poly I:C)(组O)。在第0天，将RBC负载的无核细胞源性囊泡、孵育的红细胞或树突细胞过继转移至受体C57BL/6J小鼠中。在第2天，组R(RBC(IgG488+Ova+poly I:C)+加强)接受第二次(加强)剂量的150M RBC(Ova+poly I:C)负载的囊泡。在第7天，收获脾，并将其用针对Ova特异性四聚体的SIINFEKL(1μg/mL)重新刺激，并对IFN-γ和IL-2进行细胞内细胞因子染色(ICS)。
结果
通过四聚体染色测量抗原特异性T细胞的数量，其中只有组R、加强条件(RBC(IgG488+Ova+poly I:C)+加强)和组S(高剂量佐剂(RBC(IgG488+Ova+高剂量poly I:C)))产生Ova反应性T细胞的统计学显著增加(相比于Endo对照)(图3A)。如通过ICS所测量的IFN-γ阳性细胞百分比进一步支持了用四聚体染色观察到的趋势，其中相同条件产生IFN-γ的百分比的统计学显著增加(相对于对照)(图3B)。虽然经由IL-2ICS对于加强的条件也观察到这种趋势，但高剂量poly I:C条件仅导致IL-2+细胞比例的适度的统计学上不显著的增加(图3C)。综上所述，这些数据表明，使用佐剂poly I:C导致最高的内源性反应，并且在第2天使用第二次加强剂导致更高得多的反应，甚至相比于单次施用包含Ova和10倍更高剂量的poly I:C的囊泡。所有比较均针对Endo+poly I:C阴性对照(组O)进行(5只小鼠/组，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.005)。
实施例4
为了确定正常无核细胞与其无核细胞源性囊泡对应物相比的代谢活性，可以通过使用荧光酶法测定法监测乳酸产生水平而随时间间接测量RBC和RBC源性囊泡的糖酵解水平。可以通过经糖酵解产生乳酸来测量RBC代谢活性。在没有线粒体的情况下，糖酵解是RBC生成ATP的唯一方式，ATP是将外膜小叶上的磷脂酰丝氨酸翻转回细胞内膜小叶所必需的。缺乏ATP意味着RBC无法使细胞表面的磷脂酰丝氨酸恢复到基础水平。
材料与方法
通过Ficoll分离从全血中获得人RBC，将其以1十亿个细胞/mL重新悬浮在具有腺嘌呤的柠檬酸-磷酸-右旋糖(dCPDA-1)缓冲液中，并在室温下通过SQZ(2.2μm缩窄部宽度，在50psi下)递送荧光标记的大鼠IgG(20μg/mL)以生成包含IgG的RBC源性囊泡。然后将细胞在37℃孵育指定的时间点并收集上清液。为了定量RBC和RBC源性囊泡产生的乳酸水平，使用乳酸-Glo测定法(Promega)来测定来自各个时间点的上清液。简而言之，在加入荧光乳酸检测试剂之前，对上清液进行灭活和中和步骤。将荧光相对于空白对照进行归一化，并使用乳酸标准曲线确定上清液中的绝对乳酸水平(0.1-10μM)。
结果
由SQZ产生的人RBC源性囊泡在4小时和21小时处都表现出显著较低的乳酸产生水平(图4)。在4小时处，由SQZ产生的RBC源性囊泡(SQZ)的乳酸产量相对于未经处理的RBC(非SQZ)减少了约5倍，这表明代谢活性和ATP产生降低(左柱，#P<0.005)。即使在延长的恢复时间(21h)之后，由SQZ产生的RBC源性囊泡(SQZ)的乳酸产生量也显著低于非SQZ(2倍；右柱，*P<0.05)。综上所述，这些数据表明，由SQZ加载的RBC源性囊泡具有显著改变的代谢潜力。
实施例5.
该实施例部分证明了SQZ介导的负载对无核细胞源性囊泡的形态和表面磷脂酰丝氨酸水平的影响。
材料与方法
为了定量SQZ介导的递送对无核细胞源性囊泡的形态和表面磷脂酰丝氨酸水平的影响，使红细胞(RBC)源性囊泡负载有荧光标记的抗原，将这些红细胞注射到受体小鼠体内，然后随时间进行连续抽血。然后根据血液中荧光信号的持久性确定无核细胞源性囊泡的半衰期。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得红细胞(RBC)，并且对其未经处理(Untrtd)、在荧光标记的(D-FITC)3kDa右旋糖酐(200μg/mL–非SQZ)存在下孵育或通过SQZ介导的负载进行加工以生成负载有右旋糖酐的RBC源性囊泡(SQZ)。将每种条件产生的细胞或囊泡都用CellTrace
Figure BDA0003275917030001611
(CT)(一种膜标记染料)进行染色。通过
Figure BDA0003275917030001612
分析评估来自每种条件的样品以确定形态变化。
为了定量SQZ介导的递送对形态和表面磷脂酰丝氨酸水平的影响，将上述制备的右旋糖酐孵育的RBC在含有CaCl2缓冲液(0.4mM)的RPMI中在37℃下进一步孵育2h，然后用离子霉素(8μM)处理30min，诱导磷脂酰丝氨酸表面呈递的条件是已知的(产生阳性对照，+ctrl)。然后用膜联蛋白V染色来自Untrt、+ctrl和非SQZ样品的细胞以及SQZ负载的囊泡(SQZ)，并通过流式细胞术平行测量表面磷脂酰丝氨酸的水平。
结果
ImageStream分析的结果表明，当在明场下成像时，未经处理(Untrt)或在没有SQZ(非SQZ)的情况下与右旋糖酐一起孵育的RBC保持通常与RBC相关的双凹形状(图5A)。然而，SQZ负载的RBC源性囊泡在形态学上表现出明显的变化，通常更表现出球形，如通过明场成像所示。此外，只有SQZ负载的囊泡(SQZ)(而不是未经处理的(Untrtd)或孵育的RBC(非SQZ))显示出来自荧光标记的右旋糖酐(D-FITC)的荧光信号，这表明只有使用SQZ介导的负载才能实现递送。所有条件下的样品都对CellTrace
Figure BDA0003275917030001621
呈阳性，这表明存在脂质双层。
还测试了上述RBC或RBC源性囊泡的表面磷脂酰丝氨酸水平(其是RBC源性囊泡中的膜紊乱的标志物)(图5B)。与未处理的(Untrt)和孵育的RBC(非SQZ)相比，SQZ负载的囊泡(SQZ)表现出显著更高水平的磷脂酰丝氨酸染色，其中在SQZ负载的RBC源性囊泡中，>80％的细胞对膜联蛋白V呈阳性，而对于未经SQZ加工的RBC，<5％的细胞对膜联蛋白V呈阳性。在SQZ条件下对较高水平的表面磷脂酰丝氨酸呈阳性的细胞百分比与在阳性对照(+ctrl)中观察到的相似。总体而言，这些数据表明，SQZ介导的递送导致RBC源性囊泡的有效负载、输入的RBC的形态得到显著调节，同时显著增加了表面磷脂酰丝氨酸水平。
实施例6.
该实施例部分证明了SQZ介导的负载对无核细胞源性囊泡的循环半衰期的影响。
材料与方法
为了定量SQZ介导的递送对无核细胞源性囊泡的循环半衰期的影响，使红细胞源性囊泡负载有荧光标记的抗原，将这些红细胞注射到受体小鼠体内，然后随时间进行连续抽血。然后根据血液中荧光信号的持久性确定无核细胞源性囊泡的半衰期。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得红细胞(RBC)，并将其用SQZ负载进行加工以产生具有荧光标记的Ova蛋白(Ova-647-200μg/mL)的RBC源性囊泡，如图6A所示(3只小鼠/组)。在0分钟处，用CFSE对负载有Ova的RBC源性囊泡(200百万个囊泡/动物)进行染色。将等量的RBC(用作非SQZ对照)用CellTrace Violet进行染色。将CFSE染色的负载有OVA的RBC源性囊泡和Celltrace Violet染色的RBC混合并过继转移至受体C57BL/6J小鼠中。在5、30、60和240分钟处，从每只小鼠的尾静脉收集血液，并通过流式细胞术定量循环的荧光标记的RBC源性囊泡以及Violet染色的RBC的数量。
结果
循环的CFSE阳性RBC源性囊泡(SQZ负载有抗原)的水平在第一时间点(5min)处显著下降并且到15min处几乎检测不到(图6B)。然而，未经SQZ加工但用CellTrace
Figure BDA0003275917030001631
标记的RBC在绘制的时间进程中保持相似的水平(图6B)。在绘制的时间进程之外进行重复抽血表明，虽然SQZ加工的RBC源性囊泡和非SQZ的RBC两者的相对水平在约1h后通常是稳定的，但使用长达8周的检索数据，SQZ加工的RBC源性囊泡和非SQZ的RBC的半衰期。寿命相对较短的RBC源性囊泡的半衰期为14.3min，而未经SQZ加工的经标记的RBC的半衰期为7661分钟(约5天)。注射到受体小鼠中的RBC/RBC源性囊泡的混合物的流式图显示在图6C中。该前向与侧向散射图还提供了对显示形态变化的实体的定量。图的右上象限中较大百分比的细胞代表未经SQZ加工的RBC，而较小的SQZ负载的RBC源性囊泡群显示在左侧的簇中。这也说明了一个发现，即SQZ负载的RBC源性囊泡的形态与未经SQZ加工的RBC的形态显著不同。综上所述，这些数据表明，RBC源性囊泡的清除速度明显快于未经SQZ加工的RBC，并且通过流式细胞术观察到这两者在形态上有明显不同。
实施例7
该实施例部分证明了SQZ介导的负载对无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量的影响。
材料与方法
为了定量SQZ介导的递送对无核细胞源性囊泡的血红蛋白(Hb)含量的影响，通过在各种条件下进行SQZ加工来生成RBC源性囊泡，并且使用
Figure BDA0003275917030001641
系统定量剩余血红蛋白量，将其与输入的RBC的剩余血红蛋白量相比。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得RBC，并且将其未经处理(NC-阴性对照)、在用水以1:20稀释的溶液中孵育(95μL水中的5μL血液-裂解对照)或在两种不同的压力(10和12psi)下进行SQZ加工。离心后，使用
Figure BDA0003275917030001642
系统、通过确定上清液中的Hb浓度与全细胞悬液中的Hb浓度、根据以下等式：％溶血＝([游离Hb]/[总Hb])*100来确定溶血量(Hb损失)。
结果
离心后，与基本清澈的上清液(其具有如用未经SQZ加工的RBC观察到的大量红细胞沉淀)相比，肉眼可见产生显著溶血(Hb损失)的SQZ加工的RBC源性囊泡，这很容易从RBC源性囊泡上清液的扩散的红色观察到(图7A)。当使用
Figure BDA0003275917030001643
系统进行定量时，裂解对照显示8％的溶血，而SQZ加载的RBC源性囊泡的两种条件(在10和12psi下)都显示出大约3％的溶血。相比之下，未经SQZ加工的RBC仅记录有0.2％的溶血(图7B)。综上所述，这些数据表明，与未处理的输入的RBC相比，SQZ负载的RBC源性囊泡中的Hb水平降低。
实施例8
该实施例部分证明了SQZ介导的负载对无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量的影响。
材料与方法
为了定量SQZ介导的递送对无核细胞源性囊泡的血红蛋白(Hb)含量的影响，通过在各种条件下进行SQZ加工来生成RBC源性囊泡，并且通过LC/MS定量剩余血红蛋白量，将其与输入的RBC的剩余血红蛋白量相比。具体地，从NOD供体小鼠获得RBC，并将其与PBS中的FAM标记的胰岛素B9-23肽(75μM)(Endo对照)一起孵育、或通过SQZ介导的负载进行加工以生成负载有胰岛素B9-23肽的RBC源性囊泡(SQZ)。在液相色谱/质谱分析(LC/MS)之前，使来自Endo对照或SQZ的样品(5E7-1.5E8个细胞或囊泡/重复样品)经受标准的肽变性、还原、烷基化和胰蛋白酶化(DRAT)程序。衍生化之后，使用反相LC运行样品，并通过计算相应峰的曲线下面积来定量两种已知血红蛋白肽(Hb肽#1–FLASVSTVLTSK；Hb肽#2-VGAHAGEYGAEALER)的水平。
结果
LC/MS分析表明，未经SQZ加工的RBC(Endo对照)的Hb含量几乎比SQZ负载的RBC源性囊泡多十倍(2次技术重复/样品；单独显示)。对于这两种Hb肽均观察到在Endo对照和SQZ之间所观察到的趋势，其中在SQZ样品中Hb含量相对减少>0％(图8A-8B)。综上所述，这些数据表明，与未加工的RBC对应物相比，当RBC经SQZ加工成为RBC源性囊泡时，大量的Hb丢失。
实施例9
该实施例部分证明了在SQZ介导的负载中缩窄部尺寸和压力对无核细胞囊泡的衍生中形成血影的影响。
材料与方法
为了定量在SQZ介导的负载中缩窄部宽度和压力对无核细胞源性囊泡的衍生中形成血影的影响，在各种缩窄部宽度和压力条件下通过进行SQZ加工来生成RBC源性囊泡，并且通过流式细胞术定量形成的血影的数量。具体地，从C57BL/6J供体小鼠获得红细胞(RBC；100M细胞/mL)，并将其与稀释的CPDA-1溶液中的荧光标记的Ova(10μg/mL)(Endo)一起孵育，或使用两种不同的缩窄部直径(2.2μm或2.5μm)和两种不同的驱动压力(30和50psi)的组合进行SQZ负载有Ova。然后通过流式细胞术测定形成的血影的量。非血影和血影囊泡的分布先前已在图6C中示出。
结果
通过改变SQZ加工中的缩窄部宽度和/或压力，可以调节由RBC源性囊泡的SQZ负载导致的血影形成的相对量。如所预期的，未经SQZ加工的RBC(Endo)显示出非常低的血影形成百分比(约5％)。测试的所有SQZ条件均导致相对于Endo的显著更高的血影形成百分比(P<0.005)(图9)。缩窄部宽度为2.5μm时，在30psi驱动压力下进行SQZ加工导致约60％的血影形成，但在50psi驱动压力下进行SQZ加工时血影形成增加到>90％(P<0.05)(图8)。此外，当施加相同的30psi的驱动压力时，与更宽的缩窄部宽度(2.5μm，约60％的血影形成)相比，使用更窄的缩窄部宽度(2.2μm)进行的SQZ加工中的血影形成也导致更高的血影形成百分比(>90％的血影形成)(P<0.05)(图9)。综上所述，这些数据表明，通过改变驱动压力或缩窄部宽度，可以主动调整由SQZ负载的无核细胞源性囊泡形成的血影的百分比。
实施例10
该实施例部分证明了SQZ介导的负载对无核细胞源性囊泡的循环半衰期的影响。
材料与方法
为了确定经SQZ加工的无核细胞的循环动力学，首先用PKH-26标记鼠RBC，然后对其进行SQZ加工以生成RBC源性囊泡。然后将RBC源性囊泡注射到小鼠体内(2只小鼠中的每只注射1十亿个囊泡)，并在施用后24小时内在鼠血液中追踪荧光(PHK-26)标记的、经SQZ加工的RBC源性囊泡。具体地，在施用后0min、15min、30min、1小时、4小时和24小时经由荧光来测量囊泡。
另一组小鼠注射了荧光标记的未进行SQZ加工的RBC(3只小鼠中的每只注射1十亿个细胞)。在施用后24小时内，在鼠血液中追踪荧光(PHK-26)标记的未经加工的RBC。具体地，在施用后0min、15min、30min、1小时、4小时和24小时经由荧光来测量未经加工的RBC。
通过荧光来确定荧光(PKH-26)标记的RBC源性囊泡和小鼠血流中未经加工的RBC对应物的持久性，如通过流式细胞术所测定的。
结果
如图10所示，经SQZ加工的RBC源性囊泡从血液中迅速清除。具体地，大多数RBC源性囊泡在60分钟内从血液中清除，并且其循环半衰期约为10分钟。相比之下，未经加工的RBC在实验期间(72小时)持续存在于血流中。综上所述，这些数据表明，RBC源性囊泡的清除速度明显快于未经SQZ加工的RBC。
实施例11
为了评估SQZ加工的无核细胞源性囊泡引发CD8+T细胞反应的机制，研究了参与无核细胞源性囊泡在体内的摄取的细胞类型和器官。该实施例部分说明了参与静脉内注射后立即摄取SQZ加工的无核细胞源性囊泡的细胞类型和器官。
材料与方法
C57BL/6J小鼠获得自杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)，其中20只雌性被用作进行疫苗接种的受体小鼠，10只雌性被用作供体小鼠。将从供体小鼠中提取的RBC用PKH-26进行荧光标记，随后在抗原(E7 SLP)和佐剂(Poly I:C)存在下进行SQZ加工以产生负载E7的RBC源性囊泡。给第一组受体小鼠注射含有E7和Poly I:C的荧光标记的RBC源性囊泡。给对照组受体小鼠注射PBS(对照)。
注射后一小时，收获经注射的小鼠的肝、肺、脾和骨髓，并检查是否存在标记的SQZ加工的RBC源性囊泡。从收获的肝和脾中提取细胞，并分析巨噬细胞(
Figure BDA0003275917030001671
CD45+，F4/80+，CD11b-/low)、树突细胞(DC；CD45+，F4/80-，CD11chi，MHC-IIhi)和B细胞(CD45+，F4/80-，CD19+，FSClo，SSClo)对RBC源性囊泡的摄取，如经由流式细胞术通过荧光标记所测定的。
结果
如图11A所示，SQZ加工的RBC囊泡主要在肝和脾中被摄取，而在骨髓和肺中较少被摄取。如图11B所示，在肝和脾中，SQZ加工的RBC囊泡主要被巨噬细胞
Figure BDA0003275917030001672
和树突细胞吞没。在注射有PBS的小鼠的脾或肝源性细胞中观察到的背景信号低于检测阈值。
实施例12
该实施例部分证明了包含负载的抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导体内抗原特异性免疫反应。
材料与方法
在第0天，处死10只雌性OT-I小鼠和10只雌性OT-II小鼠。收获脾和淋巴结(腹股沟、腋窝、肱动脉、宫颈和肠系膜)，由其产生单细胞悬液。将抗原特异性CD8+T细胞与OT-I小鼠细胞进行免疫磁性分离。将抗原特异性CD4+T细胞与OT-II小鼠细胞进行免疫磁性分离。将OVA特异性CD4+和CD8+T细胞在注射到CD45.1小鼠体内之前用CFSE染色，其中每只小鼠分别施用2.5M个CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在第1天，从三只安乐死的B6小鼠的鼠血液中分离出RBC，并在OVA(200μM)和polyI:C(1mg/ml)存在下对鼠RBC进行SQZ加工以产生含有抗原和佐剂的RBC源性囊泡。随后，给先前施用了CFSE标记的OT-ICD8+T细胞或OT-II CD4+T细胞的CD45.1小鼠注射PBS(对照)或注射250M个负载的RBC源性囊泡。
在第4天，将施用了CFSE标记的OVA特异性CD4+和CD8+T细胞并且随后注射了(i)PBS或(ii)负载有OVA和Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠处死，并收获它们的脾。将收获的脾经由使其通过过滤器而手动分离，并且经由流式细胞术通过CSFE稀释来测量CD4+和CD8+T细胞增殖。
结果
如图12A和12B所示，与对照相比，接受SQZ负载有OVA和Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠分别表现出强劲的OT-I CD4+T细胞和OT-II CD8+T细胞增殖，如通过大量的CFSE稀释所示的。这些结果表明，包含负载的抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以在体内诱导抗原特异性免疫反应。
实施例13
该实施例部分证明了包含负载的抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导内源性抗原特异性T细胞反应。
材料与方法
在第0天，从三只安乐死的B6小鼠的鼠血液中分离出RBC，并在(i)OVA(200μM)；或(ii)poly I:C(1mg/ml)；或(iii)OVA和poly I:C存在下对鼠RBC进行划分和SQZ加工以产生含有抗原和/或佐剂的相应RBC源性囊泡。随后，给CD45.1小鼠注射PBS(对照)或250M个负载有抗原和/或佐剂的相应RBC源性囊泡。
在第7天，处死施用了PBS或相应的RBC源性囊泡的小鼠，并收获它们的脾细胞。将脾细胞用SIINFEKL重新刺激，并针对CD44进行染色以及针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色以检测任何内源性T细胞活化。
结果
如图13所示，接受仅负载抗原(OVA)或仅负载佐剂(Poly I:C)的RBC源性囊泡的小鼠未表现出CD8+T细胞的活化，而接受负载有OVA和Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠表现出强劲的OVA特异性T细胞增殖，如用SIINFEKL重新刺激后，CD44hi和IFNγ+细胞在总内源性CD8+T细胞群中的百分比显著增加所示。这些结果表明，负载有抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导内源性抗原特异性T细胞反应。
实施例14
该实施例部分证明了包含负载的抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导内源性抗原特异性T细胞反应。
材料和方法
在第0天，使用Ficoll梯度程序从十三只安乐死的B6供体小鼠的鼠血液中分离出RBC，并制备细胞浓度为1十亿/mL的RBC悬液。RBC悬液被分成4组，在(i)仅佐剂(Poly I:C)、(ii)仅抗原(E7 SLP)、或(iii)抗原和佐剂(E7 SLP+Poly I:C)存在下，在50psi下，以2.2μm直径的缩窄部对这些组进行SQZ加工；以生成包含相应有效载荷的RBC源性囊泡。
随后，给CD45.1小鼠眼眶后(RO)注射PBS(对照)或250百万个负载有抗原和/或佐剂的相应RBC源性囊泡。
在第7天，处死小鼠，并收获它们的脾细胞。将脾细胞用E7肽重新刺激，并针对CD44进行染色以及针对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色以检测任何内源性T细胞活化。
结果
如图14所示，接受仅负载抗原(E7)或仅负载佐剂(Poly I:C)的RBC源性囊泡的小鼠未表现出CD8+T细胞的活化，而接受负载有E7和Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠表现出强劲的E7特异性T细胞增殖，如用E7肽重新刺激后，CD44hi和IFNγ+细胞在总CD8+T细胞群中的百分比显著增加所示。这些结果表明，负载有抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导内源性抗原特异性T细胞反应。
实施例15
该实施例部分证明了使用负载抗原的无核细胞源性囊泡的不同的初免和加强方案对体内抗原特异性免疫反应的影响。
使用Ficoll梯度程序从十三只安乐死的B6供体小鼠的鼠血液中分离出RBC，并且在抗原和佐剂(100μM E7 SLP+1mg/mL Poly I:C)存在下对所得的RBC悬液进行SQZ加工以生成含有抗原和佐剂的RBC源性囊泡。
在第0天，以每只小鼠250百万个囊泡，给CD45.1小鼠眼眶后(RO)注射PBS(对照)或负载有抗原和佐剂的RBC源性囊泡(初免)。已接受负载的RBC源性囊泡的初免施用的小鼠亚组进一步接受(i)在第2天，加强剂量的负载的RBC源性囊泡(第2天加强)；或(ii)在第2天和第7天，两次加强剂量的负载的RBC源性囊泡(第7天加强)。
在最后一次免疫(第7天，进行初免和PBS对照；第9天，进行第2天加强；第14天，进行第7天加强)后的第7天，处死相应的小鼠，并收获它们的脾细胞。使接受经受CD44和E7特异性四聚体染色，经由流式细胞术测量，以检测内源性E7特异性T细胞的活化。
结果
如图15所示，接受负载E7和Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠表现出CD8+T细胞的活化，如CD44hi和四聚体+细胞在总CD8+T细胞群中的百分比大幅增加所示。此外，观察到对内源性T细胞活化的诱导越来越强，因为小鼠接受了另外的加强剂量的负载E7和Poly I:C的RBC源性囊泡(图15)。这些结果表明，负载有抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导内源性抗原特异性T细胞反应，并且可以通过使用初免和加强给药方案来增强诱导。
实施例16
该实施例部分证明了包含负载的肿瘤抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可用作针对肿瘤的预防性免疫。
材料与方法
雌性C57BL/6J小鼠获得自杰克逊实验室，并将其用作疫苗接种的受体小鼠以及供体小鼠。在第0天，从供体小鼠中提取RBC，并在100μM E7SLP和1mg/mL Poly I:C存在下对其进行SQZ加工以生成含有肿瘤抗原和佐剂的RBC源性囊泡。然后向受体小鼠施用(i)PBS、或(ii)250百万个含有肿瘤抗原和佐剂的RBC源性囊泡。
免疫后7天(第7天)，给小鼠右后侧腹皮下植入表达HPV E7的TC-1肿瘤细胞。然后每周测量两次TC-1肿瘤生长，并且在41天内，与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。通过公式((长x宽2)/2)测量肿瘤大小。记录60天内的小鼠体重和存活。
结果
如图16A所示，与其中肿瘤生长不减弱的对照小鼠相比，在用负载E7+Poly I:C的囊泡处理的小鼠中肿瘤生长被完全抑制。如图16B所示，PBS处理的小鼠均未(0/10)存活超过第41天(中位存活期＝34天)，而用负载E7+Poly I:C的囊泡进行预防性免疫的所有小鼠(10/10)仍保持无肿瘤至少60天。这些数据表明，在HPV相关癌症的预防模型中，负载有肿瘤抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以有效地阻止肿瘤生长并提高存活率。
实施例17
该实施例部分证明了包含负载的肿瘤抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可用作针对肿瘤的治疗性免疫。
材料与方法
雌性C57BL/6J小鼠获得自杰克逊实验室，并将其用作疫苗接种的受体小鼠以及供体小鼠。
在第0天，给受体小鼠皮下植入表达HPV E7的TC-1肿瘤细胞。在第10天，从供体小鼠中提取RBC，并在100μM E7 SLP和1mg/mL LMW Poly I:C存在下，在50psi下，以2.2μm直径的缩窄部对其进行SQZ加工以生成含有肿瘤抗原和佐剂的RBC源性囊泡。随后，受体小鼠(i)未经处理/施用PBS(对照)；或(ii)施用1十亿、250百万、或100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡的剂量。
在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量TC-1肿瘤的生长，并且在41天内，与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。通过公式((长x宽2)/2)测量肿瘤大小。记录50天内的小鼠体重和存活。
材料与方法
如图17A所示，与肿瘤生长无减弱的对照小鼠相比，在用1十亿或250百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡处理的小鼠中，肿瘤生长被显著抑制，并且在用100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡处理的小鼠中也被明显抑制。如图17B所示，对照小鼠均未存活超过第41天(中位存活期＝32.5天)，而用1十亿或250百万个负载E7+Poly I:C的囊泡进行治疗性免疫的小鼠中有超过一半能存活至少41天，并且治疗功效与施用的囊泡剂量相关(针对施用的100百万个囊泡，中位存活期＝39.5天；针对施用的250百万个囊泡，中位存活期＝46天；未达到针对施用的1十亿个囊泡的46天的中位存活期)。这些数据表明，在HPV相关癌症的治疗模型中，负载有肿瘤抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导肿瘤消退并提高存活率。
实施例18
该实施例部分证明了使用负载抗原的无核细胞源性囊泡的不同的初免和加强方案作为针对肿瘤的治疗性免疫对功效的影响。
材料与方法
雌性C57BL/6J小鼠获得自杰克逊实验室，并将其用作疫苗接种的受体小鼠以及供体小鼠。
在第0天，给受体小鼠皮下植入表达HPV E7的TC-1肿瘤细胞。
从供体小鼠中提取RBC，并在100μM E7 SLP和1mg/mL LMW Poly I:C存在下，在50psi下，以2.2μm直径的缩窄部对其进行SQZ加工以生成含有肿瘤抗原和佐剂的RBC源性囊泡。随后，受体小鼠(i)未经处理/施用PBS(对照)；或(ii)在第10天施用100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡的剂量(初免)；(iii)在第10天和第12天，各施用100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡的剂量(初免/加强)；或(iv)在第10天、第12天和第14天，各施用100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡的剂量(初免/加强/加强)。
在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量TC-1肿瘤的生长，并且在41天内，与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。通过公式((长x宽2)/2)测量肿瘤大小。记录50天内的小鼠体重和存活。
结果
如图18A所示，虽然与对照小鼠相比，在用1个剂量的100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡(初免)处理的小鼠中肿瘤生长被明显抑制；但当用另外加强剂量的负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡(初免/加强、初免/加强/加强)治疗小鼠时，肿瘤消退更为显著。如图18B所示，所有对照小鼠在41天时死亡(中位存活期＝32.5天)，而接受1个治疗剂量的100百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡(初免)的小鼠中的约30％在第41天存活(中位存活期＝39.5天)。另外的加强剂量显著增加了第41天的存活率，其中接受2个剂量的负载的囊泡(初免/加强)的小鼠的存活率超过50％，接受3个剂量的负载的囊泡(初免/加强/加强)的小鼠的存活率为100％(两者的中位存活期＝52天)。这些数据表明，在HPV相关癌症的治疗模型中，负载有肿瘤抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡可以诱导肿瘤消退并提高存活率，并且可以用另外的加强方案提高肿瘤消退和存活率。
实施例19
该实施例部分证明了在用SQZ负载的无核细胞源性囊泡免疫后在TC-1肿瘤的肿瘤微环境中E7特异性CD8+T细胞的数量，以及肿瘤生长模型中E7特异性CD8+T细胞与肿瘤清除率的相关性。
材料与方法
雌性C57BL/6J小鼠获得自杰克逊实验室，并将其用作疫苗接种的受体小鼠以及供体小鼠。
在第0天，给受体小鼠皮下植入表达HPV E7的TC-1肿瘤细胞(50k/小鼠，在100μL的PBS中)。
在第14天，从供体小鼠中提取RBC，并在(i)仅1mg/mL Poly I:C；或(ii)100μM E7SLP和1mg/mL Poly I:C存在下，在50psi下，以2.2μm直径的缩窄部对其进行SQZ加工以生成含有肿瘤抗原和/或佐剂的RBC源性囊泡。随后，受体小鼠(i)施用PBS(对照)；或(ii)施用250百万个负载Poly I:C的RBC源性囊泡；或(iii)施用250百万个负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡。
在第21天和第26天(免疫后第7天和第12天)，切下肿瘤并称重，并从中产生相应的单细胞悬液。通过流式细胞术评估单细胞悬液的总CD8+T细胞、调节性T细胞(CD45+、B220-、CD11b-、CD4+、FoxP3+)和抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
结果
如图19A所示，在免疫后第7天和第12天(即，肿瘤植入后第21天和第26天)，与接受负载Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠和对照小鼠相比，用负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡免疫的小鼠具有显著增加的CD8+T细胞在肿瘤中的百分比。在接受负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡的小鼠中，这些CD8+T细胞中的大多数对E7抗原具有特异性，如通过四聚体染色所确定的(>70％的CD8+群体)(图19B)。为了研究各个囊泡激活的调节性T细胞的相对量，将对E7特异性四聚体染色呈阳性的细胞在肿瘤中的百分比相对于肿瘤中调节性T细胞的量进行归一化(图19C)，并且结果表明，与施用负载Poly I:C的RBC源性囊泡或PBS相比，与免疫后肿瘤微环境中的调节性T细胞相比，用负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡进行免疫可更显著地增加E7特异性CD8+T细胞(TIL)的存在。如图19D所示，还观察到E7特异性CD8+T细胞(TIL)的量与肿瘤重量成反比，这表明肿瘤消退将与E7特异性CD8+T细胞的流入相关。这些数据表明，在TC-1小鼠肿瘤模型中用负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡进行免疫导致浸润肿瘤的E7特异性CD8+T细胞的显著增加。E7特异性CD8+T细胞的增加(图19A-19C)外加肿瘤体积的相关减少(图19D)支持以下结论：负载E7+Poly I:C的RBC源性囊泡通过扩增E7特异性效应CD8+T细胞而减少肿瘤负荷。
实施例20
该实施例部分证明了SQZ介导的加工对人无核细胞源性囊泡中的有效载荷递送、血影形成和表面磷脂酰丝氨酸水平的影响。
材料与方法
人红细胞(RBC)获得自健康供体，并且使所得的RBC悬液(2十亿/mL)未经处理(非SQZ细胞)，或在荧光标记的E7 SLP(抗原)和Poly I:C(佐剂)存在下进行SQZ加工(60psi，2.2μm直径的缩窄部)以产生负载有抗原和佐剂的人RBC源性囊泡(H-SQZ-囊泡)。
为了定量SQZ介导的递送的功效，通过流式细胞术测量非SQZ细胞和H-SQZ-囊泡中荧光标记的E7 SLP的存在。
为了定量血影形成，使用如实施例6和图6C中所述的程序，使非SQZ细胞和H-SQZ-囊泡经受流式细胞术并分析其前向散射和侧向散射。
为了定量SQZ介导的加工对表面磷脂酰丝氨酸水平的影响，将非SQZ细胞和H-SQZ-囊泡用膜联蛋白V染色，并且使用如实施例5中所述的程序通过流式细胞术测量表面磷脂酰丝氨酸水平。
结果
如图20A所示，对人RBC进行SQZ加工产生RBC源性囊泡(H-SQZ-囊泡)，其大部分显示出血影分布。相比之下，极低比例的未经处理的人RBC(非SQZ细胞)显示出血影分布。此外，如图20B所示，在有效载荷存在下，对人RBC进行SQZ加工显示有效递送至高百分比的所得RBC源性囊泡(H-SQZ-囊泡)。如图20C所示，对人RBC进行SQZ加工产生RBC源性囊泡(H-SQZ-囊泡)，其大部分显示表面磷脂酰丝氨酸(膜联蛋白V+)。相比之下，极低比例的未经处理的人RBC(非SQZ细胞)显示表面磷脂酰丝氨酸。
实施例21
评估了SQZ加工的人无核细胞源性囊泡导致抗原呈递和CD8+T细胞反应激活的机制。了解抗原呈递细胞摄取无核细胞源性囊泡的动力学是非常重要的。该实施例部分证明了人单核细胞源性树突细胞(MoDC)在体外内化SQZ加工的体外人无核细胞源性囊泡的效率。
材料与方法
人红细胞(RBC)获得自健康供体，并且将所得的RBC悬液(2十亿/mL)用PKH-26进行荧光标记、未经处理或在E7 SLP存在下对其进行SQZ加工(60psi，2.2μm直径的缩窄部)以生成负载有抗原的人RBC源性囊泡(H-SQZ-囊泡)。为了定量MoDC内化SQZ加工的人无核细胞源性囊泡的功效，将MoDC接种在96孔板中，在37℃或0℃(冰上)与一系列囊泡浓度的H-SQZ-囊泡孵育过夜。随后分离出MoDC，并通过流式细胞术分析荧光的增加。
结果
如图21所示，当与H-SQZ囊泡一起孵育时，MoDC在37℃内化H-SQZ-囊泡的效率明显高于0℃。此外，观察到H-SQZ-囊泡的内化依赖于H-SQZ囊泡的浓度(浓度高达至少100百万个囊泡/孔接种的MoDC)。
实施例22
该实施例部分证明了包含负载的抗原和佐剂的人无核细胞源性囊泡可以在体外诱导抗原特异性免疫反应。
材料和方法
人红细胞(RBC)获得自健康供体，并且在CMV抗原(pp65)存在下对所得的RBC悬液(2十亿/mL)进行SQZ加工以生成负载有CMV抗原pp65的人RBC源性囊泡(H-SQZ-CMV-囊泡)。将pp65特异性CD8+应答T细胞与外源性佐剂(10μg/mL Poly I:C)以及(i)培养基(阴性对照)、(ii)pp65肽(阳性对照)、或(iii)H-SQZ-CMV-囊泡一起共培养；并在37℃孵育24h。24h后，从每种条件收集上清液，并通过IFN-γELISA评估IFN-γ的产生水平。
结果
如图22所示，与针对与培养基一起孵育的应答T细胞(阴性对照)的最少的IFN-γ分泌相比，当与H-SQZ-CMV-囊泡或CMV抗原肽(阳性对照)共培养时，由CMV抗原特异性CD8+应答T细胞进行的IFN-γ产生和分泌显著增加。这些结果表明，包含负载的抗原和佐剂的人无核细胞源性囊泡可以在体外诱导抗原特异性免疫反应。
实施例23
该实施例部分证明了SQZ介导的加工对鼠无核细胞源性囊泡中的有效载荷递送、血影形成和表面磷脂酰丝氨酸水平的影响。
材料与方法
使用Ficoll梯度程序从安乐死的B6供体小鼠的鼠血液中分离出RBC，并制备细胞浓度为1十亿/mL的RBC悬液。所得的RBC悬液(i)与荧光标记的OVA或荧光标记的IgG一起孵育(未加工的RBC；非SQZ)，或(ii)在荧光标记的OVA或荧光标记的IgG存在下对其进行SQZ加工以产生负载有相应的有效载荷的人RBC源性囊泡(SQZ)。
为了定量SQZ介导的递送的功效，通过流式细胞术测量未加工的RBC(非SQZ)和SQZ加工的RBC囊泡(SQZ)中荧光标记的有效载荷的存在。
为了定量血影形成，使用如实施例6和图6C中所述的程序，使未加工的RBC(非SQZ)和SQZ加工的RBC囊泡(SQZ)经受流式细胞术并分析其前向散射和侧向散射。
为了定量SQZ介导的加工对表面磷脂酰丝氨酸水平的影响，将未加工的RBC(非SQZ)和SQZ加工的RBC囊泡(SQZ)用膜联蛋白V染色，并且使用如实施例5中所述的程序通过流式细胞术测量表面磷脂酰丝氨酸水平。
结果
如图23A所示，在有效载荷存在下，对鼠RBC进行SQZ加工显示OVA或IgG有效递送至高百分比(约80％)的所得RBC源性囊泡(SQZ)。如图23B所示，对鼠RBC进行SQZ加工产生RBC源性囊泡，其大部分显示出血影分布。相比之下，极低比例的未加工的RBC(非SQZ)显示出血影分布。此外，如图23C所示，分析了来自未加工的RBC(非SQZ)或RBC源性囊泡(SQZ)的血影群和非血影群的表面磷脂酰丝氨酸水平。尽管未加工的RBC中大约25％的血影群显示表面磷脂酰丝氨酸，但RBC源性囊泡中几乎所有的血影群都显示表面磷脂酰丝氨酸。在另一方面，未加工的RBC中几乎没有一个非血影群显示表面磷脂酰丝氨酸，而RBC源性囊泡中约15％的非血影群显示表面磷脂酰丝氨酸。
实施例24
该实施例部分证明了含有由SQZ递送的抗原的无核细胞源性囊泡诱导对病毒衣壳的体内抗原依赖性耐受性的能力。
材料和方法
为了确定含有由SQZ递送的抗原的无核细胞源性囊泡诱导对病毒衣壳的体内抗原依赖性耐受性的能力，通过IFN-γICS测量来自以下动物的脾细胞的反应，所述动物用病毒和SQZ负载有AAV2最小表位的RBC源性囊泡进行处理。具体地，在第0天，给C57BL/6J受体小鼠注射AAV2 GFP病毒(表达GFP的AAV2病毒；1E12个病毒颗粒/mL，100μL PBS/小鼠；20只小鼠/组)或单独的PBS(5只小鼠/组)，均进行眼眶后(RO)施用。在第7天和第11天，给小鼠注射(100M/小鼠)与AAV2衣壳的免疫原性肽(SNYNKSVNV，200μg/mL)一起孵育的RBC(肽)或SQZ负载有SNYNKSVNV的RBC源性囊泡(SQZ)。在第15天，给小鼠分别RO注射AAV2NanoLuc病毒(表达可溶性萤光素酶的AAV2病毒；1E12个病毒颗粒/mL，100μL PBS/小鼠；20只小鼠/组)或单独的PBS(5只小鼠)。将施用的第二种病毒用不同的转基因标记，以避免初始病毒施用对GFP转基因的任何免疫反应。在第22、29、36、43天，通过脸颊抽血收集100-200μL血液，并通过分光光度法测量血清中的萤光素酶水平。此外，在第43天，处死小鼠，收获它们的脾，分离并用抗原肽重新刺激；并且通过细胞内细胞因子染色(ICS)和流式细胞术测量细胞因子IFN-γ的水平(图24A)。
结果
虽然在用AAV2-NL刺激后未在初试动物中观察到IFN-γ反应，但在用SNYNKSVNV孵育的RBC(肽)处理的小鼠中观察到IFN-γ水平显著增加(P<0.005，与初试动物相比)，而用SQZ负载有SNYNKSVNV的RBC源性囊泡(SQZ)处理的小鼠对AAV2肽表现出与初试动物相似的最小免疫反应(图24B)，这表明SQZ负载的RBC源性囊泡可以降低对负载的抗原具有特异性的细胞因子反应。此外，血清萤光素酶测量表明，在测试的时间进程中，用孵育的RBC(肽)处理的小鼠没有表现出可测量的萤光素酶水平，这表明在这些动物中没有诱导对AAV2的耐受性，并且重复给予AAV2-NL不会导致转基因表达。相比之下，用SQZ负载的RBC囊泡处理的小鼠的血清萤光素酶水平增加了100％-200％(#P<0.005，与肽相比)，这表明对AAV2的耐受性允许在重复给药后成功表达AAV-NL(图24C)。综上所述，这些数据支持以下观察结果：负载有病毒衣壳抗原的无核细胞源性囊泡可以诱导病毒抗原特异性免疫耐受性，从而允许治疗剂AAV载体的重复给药。
实施例25
该实施例部分证明了含有由SQZ递送的抗原的无核细胞源性囊泡诱导对抗体的体内抗原依赖性耐受性的能力。
材料和方法
为了定量含有由SQZ递送的抗原的无核细胞源性囊泡诱导对抗体的体内抗原依赖性耐受性的能力，将大鼠抗体(IgG2b)重复施用于用SQZ负载有IgG2b的RBC源性囊泡处理的小鼠，并且随时间定量循环抗体的水平。具体地，在第-6天和第-2天，给C57BL/6J受体小鼠注射(i)PBS(对照；5只小鼠/组)、(ii)游离大鼠IgG2b(200μg/mL；5只小鼠/组)、或(iii)SQZ负载有大鼠IgG2b的RBC源性囊泡(100M/小鼠；10只小鼠/组)。随后，从第0天到第14天以及从第63天到第70天，根据图25A所示的时间表重复进行大鼠IgG2b的IV注射，并在第20天和第76天通过ELISA评估血清中循环大鼠IgG2b的水平。
结果
如图25B和25C所示，只有用SQZ负载的RBC源性囊泡处理的小鼠表现出对大鼠IgG的降低的免疫反应，如从循环中大鼠IgG的可检测水平的统计学显著增加所观察到的。这种增加的循环大鼠IgG在较早的时间点观察到(20天；#P<0.005)(图25B)，并在甚至70天的较长治疗方案之后仍保持(76天；*P<0.05)(图25C)。综上所述，数据表明，SQZ负载的无核细胞源性囊泡可用于诱导体内抗原依赖性耐受性，以克服长时间内的抗药抗体反应，从而使重复施用具有潜在免疫原性的生物制剂成为可能。
实施例26
该实施例部分证明了含有由SQZ递送的抗原的无核细胞源性囊泡诱导对1型糖尿病(T1D)相关抗原的体内抗原依赖性耐受性的能力。
材料和方法
为了确定含有SQZ负载的抗原的无核细胞源性囊泡诱导对糖尿病相关抗原的体内抗原依赖性耐受性的能力，采用了两种不同的T1D动物模型：胰岛素B9-23(Ins B9-23)模型和BDC2.5转移模型。
对于Ins B9-23模型，对Ins B9-23的耐受程度由用Ins B9-23肽重新刺激后在小鼠脾细胞中的细胞因子产生而确定，所述小鼠用SQZ负载有Ins B9-23肽的RBC源性囊泡进行处理。具体地，在第0天，将NOD小鼠用(i)媒介物(对照)、(ii)负载有对照肽(SQZ HEL；80μM)的RBC源性囊泡(1B细胞/动物，200μL)、或(iii)SQZ负载有荧光标记的Ins B9-23(SQZFAM；75μM)的RBC源性囊泡进行处理。在第7天，用Ins B9-23和完全弗氏佐剂的1:1乳剂(1mg/mL–100μL)激发小鼠。在第14天，收获腹股沟淋巴结，用Ins B9-23进行再激发，并针对IFN-γ和IL-2进行细胞内细胞因子染色(ICS)并通过流式细胞术测量(图26A)。
对于BDC2.5转移模型，通过在用SQZ负载有肽模拟表位1040-p31的RBC源性囊泡处理的动物中T1D发作的延迟来测量耐受程度。具体地，为了诱导T1D的快速发作，首先从雌性BDC2.5供体小鼠(3M细胞/mL)中收获淋巴结，并通过与乙酰化的p31肽(500nM，在D10v2中)一起培养3天来激活这些淋巴结。然后，在第-1天，从培养的淋巴结中收获BDC2.5 T细胞并将其过继转移到NOD/SCID受体小鼠(1E6个细胞/小鼠；5只小鼠/组)中。在第0天，从NOD/SCID供体小鼠收获红细胞，并使其SQZ负载有1040-p31模拟表位肽，并且将负载的RBC源性囊泡(SQZ；1B细胞/小鼠)或媒介物(对照；200μL PBS)注射到受体NOD/SCID小鼠中。每天从小鼠中抽取血液并定量血糖的循环量(图26C)。通过连续2次测量结果为记录的血糖>250mg/dL来定义糖尿病发作。对动物进行为期45天的监测，或直至疾病发作，以先到者为准。
结果
对于Ins B9-23模型，结果显示，与SQZ HEL小鼠(#P<0.005)或初试小鼠(对照)(#P<0.005)相比，在用SQZ负载有Ins B9-23的RBC源性囊泡(SQZ FAM)处理的小鼠的再刺激脾细胞中，炎性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平有统计学显著降低(图26B)。该结果表明，在用SQZ负载有T1D相关抗原的RBC源性囊泡处理的小鼠中，抗原特异性细胞因子反应显著降低。
对于BDC2.5转移模型，相对于对照处理的动物，在用SQZ负载有1040-p31的RBC源性囊泡处理的小鼠中，疾病的发作平均延迟了约35天(图26D、图26E)。这种延迟发作表明，在用SQZ负载有1040-p31的RBC源性囊泡处理的小鼠中，对1040-p31的耐受性增加。
综上所述，这些数据支持以下发现：SQZ介导的自身免疫相关自身抗原向RBC源性囊泡的递送可用于预防免疫反应和自身免疫性疾病的发作。

Claims (228)

1.一种用于将抗原递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述输入的无核细胞进一步包含佐剂。
3.一种用于将佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述输入的无核细胞进一步包含抗原。
5.一种用于将抗原和佐剂递送至无核细胞源性囊泡中的方法，所述方法包括：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
6.一种用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用佐剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
10.一种用于刺激个体对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用佐剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。
13.一种用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，并且其中所述包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
14.一种用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，并且其中所述包含疾病相关抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
15.一种用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向所述个体施用包含所述抗原的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用佐剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时全身施用。
18.根据权利要求13-17所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
19.一种用于治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，并且其中所述包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
20.一种用于预防个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中针对所述抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，并且其中所述包含疾病相关抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
21.一种用于给个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括向所述个体施用包含所述抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡。
22.一种用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，所述方法包括
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡；以及
c)向所述个体施用所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
23.一种用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，所述方法包括
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡；以及
c)向所述个体施用所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
24.一种对个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括，
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡；以及
c)向所述个体施用所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用囊泡外佐剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述囊泡外佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
27.根据权利要求19-24所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
28.一种用于治疗个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应改善所述疾病的状况，所述方法包括
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述疾病相关抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及
c)向所述个体施用所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
29.一种用于预防个体中的疾病的方法，其中针对疾病相关抗原的免疫反应预防所述疾病的发展，所述方法包括
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及
c)向所述个体施用所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
30.一种对个体接种针对抗原的疫苗的方法，所述方法包括，
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及
c)向所述个体施用所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体全身施用囊泡外佐剂。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述囊泡外佐剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
33.根据权利要求13-32中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症、传染病或病毒相关疾病。
34.根据权利要求6-33中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡对所述个体而言是自体的。
35.根据权利要求6-33中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡对所述个体而言是同种异体的。
36.根据权利要求6-35中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡在药物配制品中。
37.根据权利要求6-36中任一项所述的方法，其中全身施用所述无核细胞源性囊泡。
38.根据权利要求6-37中任一项所述的方法，其中静脉内、动脉内、皮下、肌内或腹膜内施用所述无核细胞源性囊泡。
39.根据权利要求6-38中任一项所述的方法，其中将所述无核细胞源性囊泡与治疗剂组合施用于所述个体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述治疗剂在所述无核细胞源性囊泡之前、之后或同时施用。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述治疗剂是免疫检查点抑制剂和/或细胞因子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-α、IFN-γ、IL-2或IL-15中的一种或多种。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的任一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)和BTLA。
44.根据权利要求1、2或4-43中任一项所述的方法，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
45.根据权利要求1、2或4-43中任一项所述的方法，其中所述抗原是CD-1限制性抗原。
46.根据权利要求1、2或4-45中任一项所述的方法，其中所述抗原是疾病相关抗原。
47.根据权利要求1、2或4-46中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
48.根据权利要求1、2或4-47中任一项所述的方法，其中所述抗原源自裂解物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
50.根据权利要求1、2或4-46中任一项所述的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
51.根据权利要求1、2或4-46中任一项所述的方法，其中所述抗原是微生物。
52.根据权利要求1、2或4-50中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽。
53.根据权利要求1、2或4-50中任一项所述的方法，其中所述抗原是脂质抗原。
54.根据权利要求1、2或4-50中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖类抗原。
55.根据权利要求1、2或4-54中任一项所述的方法，其中所述抗原是经修饰的抗原。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中将多种抗原递送至所述无核细胞源性囊泡。
62.根据权利要求2-5、7-12、16-21、25-61中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure FDA0003275917020000081
咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或脂多糖(LPS)。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述佐剂是低分子量的poly I:C。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红细胞。
65.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述红细胞是红血球。
66.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述红细胞是网织红细胞。
67.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是血小板。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是哺乳动物细胞。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。
70.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是人类细胞。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。
75.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述孔包含在表面中。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述表面是过滤器。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述表面是膜。
79.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸随悬液中所述输入的无核细胞的直径而变。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸是悬液中所述输入的无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
81.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
82.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
83.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入的无核细胞通过所述缩窄部。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
86.一种包含抗原的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡；
从而产生所述包含抗原的无核细胞源性囊泡。
87.根据权利要求86所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
88.一种包含佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡；
从而产生所述包含佐剂的无核细胞源性囊泡。
89.根据权利要求88所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞包含抗原。
90.一种包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡，其中所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡通过包括以下步骤的方法制备：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；和
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡；
从而产生所述包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
91.根据权利要求86-90中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。
92.根据权利要求91所述的无核细胞源性囊泡，其中所述红细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
93.根据权利要求86、87或89-92中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
94.根据权利要求86、87或89-92中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是CD-1限制性抗原。
95.根据权利要求86、87或89-94中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是疾病相关抗原。
96.根据权利要求86、87或89-95中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是肿瘤抗原。
97.根据权利要求86、87或89-96中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原源自裂解物。
98.根据权利要求97所述的无核细胞源性囊泡，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
99.根据权利要求86、87或89-95中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
100.根据权利要求86、87或89-95中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是微生物。
101.根据权利要求86、87或89-99中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是多肽。
102.根据权利要求86、87或89-99中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是脂质抗原。
103.根据权利要求86、87或89-99中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是糖类抗原。
104.根据权利要求86、87或89-103中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述抗原是经修饰的抗原。
105.根据权利要求104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
106.根据权利要求105所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
107.根据权利要求104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
108.根据权利要求104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
109.根据权利要求104所述的无核细胞源性囊泡，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
110.根据权利要求86、87或89-109中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中将多种抗原递送至所述无核细胞源性囊泡。
111.根据权利要求87-110中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述佐剂是CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure FDA0003275917020000121
咪喹莫特、瑞喹莫德和/或LPS。
112.根据权利要求111所述的无核细胞源性囊泡，其中所述佐剂是低分子量的poly I:C。
113.根据权利要求86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是红细胞。
114.根据权利要求86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是红血球。
115.根据权利要求86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是网织红细胞。
116.根据权利要求86-112中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是血小板。
117.根据权利要求86-116中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是哺乳动物细胞。
118.根据权利要求86-117中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。
119.根据权利要求86-117中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是人类细胞。
120.根据权利要求86-119中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与施用于哺乳动物后所述输入的无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物后所述无核细胞源性囊泡的半衰期降低。
121.根据权利要求86-115或117-120中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的血红蛋白含量相比，所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量降低。
122.根据权利要求86-120中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的ATP产生相比，所述无核细胞源性囊泡的ATP产生减少。
123.根据权利要求113、114、117-122中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡表现出以下一种或多种特性：
(a)与所述输入的无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低；
(b)与所述输入的无核细胞相比，血红蛋白水平降低；
(c)球形形态；
(d)与所述输入的无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，
(e)与所述输入的无核细胞相比，ATP产生减少。
124.根据权利要求113、114、117-122中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述输入的无核细胞是红血球，并且其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
125.根据权利要求113、114、117-122所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
126.根据权利要求86-125中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。
127.根据权利要求86-126中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。
128.根据权利要求86-127中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。
129.根据权利要求86-128中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。
130.根据权利要求129所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的摄取相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取增强。
131.根据权利要求86-130中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与未修饰的无核细胞源性囊泡相比增强在组织或细胞中的摄取。
132.根据权利要求131所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述输入的无核细胞的摄取相比增强在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。
133.根据权利要求86-132中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
134.根据权利要求86-133中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在制备所述无核细胞源性囊泡期间，所述无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。
135.根据权利要求86-134中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在整个过程中维持所述细胞悬液的渗量。
136.根据权利要求86-135所述的无核细胞源性囊泡，其中在整个过程中所述细胞悬液的渗量维持在200mOsm和400mOsm之间。
137.根据权利要求86-136中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
138.根据权利要求137所述的无核细胞源性囊泡，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
139.根据权利要求138所述的无核细胞源性囊泡，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
140.根据权利要求86-139中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。
141.根据权利要求86-136中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
142.根据权利要求141所述的无核细胞源性囊泡，其中所述孔包含在表面中。
143.根据权利要求142所述的无核细胞源性囊泡，其中所述表面是过滤器。
144.根据权利要求142所述的无核细胞源性囊泡，其中所述表面是膜。
145.根据权利要求86-144中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的尺寸随悬液中所述输入的无核细胞的直径而变。
146.根据权利要求86-144中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的尺寸是悬液中所述输入的无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
147.根据权利要求86-146中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
148.根据权利要求86-147中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
149.根据权利要求86-147中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
150.根据权利要求86-149中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入的无核细胞通过所述缩窄部。
151.根据权利要求86-150中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
152.一种组合物，所述组合物包含多个根据权利要求86-151中任一项所述的无核细胞源性囊泡。
153.根据权利要求152所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
154.一种用于产生包含抗原的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原孵育足够的时间以允许所述抗原进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原的无核细胞源性囊泡。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含佐剂。
156.一种用于产生包含佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述佐剂孵育足够的时间以允许所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述输入的无核细胞包含抗原。
158.一种用于产生包含抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的方法，所述方法包括：
a)使包含输入的无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中输入的无核细胞的直径而变，从而引起所述输入的无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过从而形成无核细胞源性囊泡；
b)将所述无核细胞源性囊泡与所述抗原和所述佐剂孵育足够的时间以允许所述抗原和所述佐剂进入所述无核细胞源性囊泡，从而产生包含所述抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
159.根据权利要求154-158中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述红细胞源性囊泡是红血球源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
161.根据权利要求154、155或157-160中任一项所述的方法，其中所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
162.根据权利要求154、155或157-160中任一项所述的方法，其中所述抗原是CD-1限制性抗原。
163.根据权利要求154、155或157-162中任一项所述的方法，其中所述抗原是疾病相关抗原。
164.根据权利要求154、155或157-163中任一项所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
165.根据权利要求154、155或157-164中任一项所述的方法，其中所述抗原源自裂解物。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述裂解物是肿瘤裂解物。
167.根据权利要求154、155或157-163中任一项所述的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
168.根据权利要求154、155或157-163中任一项所述的方法，其中所述抗原是微生物。
169.根据权利要求154、155或157-167中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽。
170.根据权利要求154、155或157-167中任一项所述的方法，其中所述抗原是脂质抗原。
171.根据权利要求154、155或157-167中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖类抗原。
172.根据权利要求154、155或157-171中任一项所述的方法，其中所述抗原是经修饰的抗原。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与多肽融合的抗原。
174.根据权利要求173所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与靶向肽融合的抗原。
175.根据权利要求174所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与脂质融合的抗原。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与糖类融合的抗原。
177.根据权利要求176所述的方法，其中所述经修饰的抗原包括与纳米颗粒融合的抗原。
178.根据权利要求154、155或157-177中任一项所述的方法，其中将多种抗原递送至所述无核细胞源性囊泡。
179.根据权利要求155-178中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、用聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸
Figure FDA0003275917020000181
咪喹莫特、瑞喹莫德、和/或LPS。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述佐剂是低分子量的poly I:C。
181.根据权利要求154-180中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红细胞。
182.根据权利要求154-181中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红血球。
183.根据权利要求154-181中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是网织红细胞。
184.根据权利要求154-180中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是血小板。
185.根据权利要求154-184中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是哺乳动物细胞。
186.根据权利要求154-185中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是猴、小鼠、狗、猫、马、大鼠、绵羊、山羊、猪或兔细胞。
187.根据权利要求154-185中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是人类细胞。
188.根据权利要求154-187中任一项所述的方法，其中与施用于哺乳动物后所述输入的无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物后所述无核细胞源性囊泡的半衰期降低。
189.根据权利要求181-183或185-188中任一项所述的方法，其中与所述输入的无核细胞的血红蛋白含量相比，所述无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量降低。
190.根据权利要求181-189中任一项所述的方法，其中与所述输入的无核细胞的ATP产生相比，所述无核细胞源性囊泡的ATP产生减少。
191.根据权利要求181-182或185-190中任一项所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡表现出以下一种或多种特性：
(a)与所述输入的无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低；
(b)与所述输入的无核细胞相比，血红蛋白水平降低；
(c)球形形态；
(d)与所述输入的无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，
(e)与所述输入的无核细胞相比，ATP产生减少。
192.根据权利要求181-182或185-191中任一项所述的方法，其中所述输入的无核细胞是红血球，并且其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
193.根据权利要求181-182或185-192所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞血影。
194.根据权利要求154-193中任一项所述的方法，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有多出大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。
195.根据权利要求154-194中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布表现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。
196.根据权利要求154-195中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的至少50％的群体分布表现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。
197.根据权利要求154-196中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在组织或细胞中的摄取增强。
198.根据权利要求197所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞的摄取相比，所述无核细胞源性囊泡表现出在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取增强。
199.根据权利要求154-198中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中与所述输入的无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡被修饰以增强在组织或细胞中的摄取。
200.根据权利要求199所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡被修饰以与所述输入的无核细胞的摄取相比增强在肝和/或脾中的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。
201.根据权利要求154-200中任一项所述的无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡在其表面上包含CD47。
202.根据权利要求154-201中任一项所述的方法，其中在制备所述无核细胞源性囊泡期间，所述无核细胞源性囊泡未(a)热加工、(b)化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。
203.根据权利要求154-202中任一项所述的方法，其中在整个过程中维持所述细胞悬液的渗量。
204.根据权利要求154-203所述的方法，其中在整个过程中所述细胞悬液的渗量维持在约200mOsm和约400mOsm之间。
205.根据权利要求154-204中任一项所述的方法，其中所述缩窄部包含在微流体通道内。
206.根据权利要求205所述的方法，其中所述微流体通道包含多个缩窄部。
207.根据权利要求206所述的方法，其中所述多个缩窄部串联和/或并联排列。
208.根据权利要求154-207中任一项所述的方法，其中所述缩窄部位于多个微柱之间；位于以阵列配置的多个微柱之间；或位于一个或多个可移动板之间。
209.根据权利要求154-208中任一项所述的方法，其中所述缩窄部是孔或包含在孔内。
210.根据权利要求209所述的方法，其中所述孔包含在表面中。
211.根据权利要求210所述的方法，其中所述表面是过滤器。
212.根据权利要求210所述的方法，其中所述表面是膜。
213.根据权利要求154-212中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸随悬液中所述输入的无核细胞的直径而变。
214.根据权利要求154-213中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的尺寸是悬液中所述输入的无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、或约70％。
215.根据权利要求154-214中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。
216.根据权利要求154-215中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm、或约0.25μm。
217.根据权利要求154-215中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的宽度为约2.2μm。
218.根据权利要求154-217中任一项所述的方法，其中在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入的无核细胞通过所述缩窄部。
219.根据权利要求154-218中任一项所述的方法，其中所述细胞悬液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。
220.一种组合物，所述组合物包含通过根据权利要求154-219中任一项所述的方法制备的无核细胞源性囊泡群。
221.一种由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有以下一种或多种特性：
(a)与所述母体无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，
(b)与所述母体无核细胞相比，血红蛋白水平降低，
(c)球形形态，
(d)与所述母体无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或
(e)与所述母体无核细胞相比，ATP产生减少。
222.一种组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有以下一种或多种特性：
(a)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于约20％的所述无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，
(b)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，
(c)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有球形形态，
(d)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是RBC血影，
(e)与所述母体无核细胞群相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或
(f)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
223.一种组合物，所述组合物包含多个由母体无核细胞群制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有以下一种或多种特性：
(a)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于约20％的所述无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，
(b)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，
(c)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有球形形态，
(d)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是RBC血影，
(e)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或
(f)与所述母体无核细胞群的平均水平相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。
224.一种用于制造组合物的方法，所述组合物包含多个由母体无核细胞制备的无核细胞源性囊泡，所述组合物具有以下一种或多种特性：
(a)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有在哺乳动物中的降低的循环半衰期，
(b)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有降低的血红蛋白水平，
(c)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有球形形态，
(d)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡是RBC血影，
(e)所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有更高的磷脂酰丝氨酸水平，或
(f)与所述母体无核细胞相比，所述组合物中大于20％的所述无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生；
所述方法包括使包含所述母体无核细胞的细胞悬液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬液中母体无核细胞的直径而变，从而引起所述母体无核细胞的扰动，所述扰动足够大以使有效载荷通过从而形成无核细胞源性囊泡，从而产生无核细胞源性囊泡。
225.一种用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据权利要求221所述的无核细胞源性囊泡。
226.一种用于在有需要的个体中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据权利要求222所述的组合物。
227.一种用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据权利要求221所述的无核细胞源性囊泡。
228.一种用于在有需要的个体中预防疾病或障碍的方法，所述方法包括施用根据权利要求222所述的组合物。
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