CN116847880A - 活化抗原载体的调配物 - Google Patents

活化抗原载体的调配物 Download PDF

Info

Publication number
CN116847880A
CN116847880A CN202180094095.6A CN202180094095A CN116847880A CN 116847880 A CN116847880 A CN 116847880A CN 202180094095 A CN202180094095 A CN 202180094095A CN 116847880 A CN116847880 A CN 116847880A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aac
formulation
antigen
adjuvant
hpv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180094095.6A
Other languages
English (en)
Inventor
H·伯恩斯坦
D·亚拉尔
K·布拉戈维奇
A·罗摩克里希纳
M·达德加
L·克利尔
J·默里
T·阿布德尔贾瓦德
C·佩奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SQZ Biotechnologies Co
Original Assignee
SQZ Biotechnologies Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SQZ Biotechnologies Co filed Critical SQZ Biotechnologies Co
Publication of CN116847880A publication Critical patent/CN116847880A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6006—Cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请提供了活化抗原载体(AAC)的调配物，其中所述调配物包括：包括至少一种抗原和佐剂的AAC以及冷冻保存培养基。

Description

活化抗原载体的调配物
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年12月29日提交的美国临时申请第63/131,457号的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
以ASCII文本文件形式提交的序列表
以下以ASCII文本文件形式提交的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：750322003440SEQLIST.TXT，记录日期：2021年12月23日，大小：13,016字节)。
技术领域
本公开总体上涉及包括至少一种抗原和佐剂的活化抗原载体(AAC)以及冷冻保存培养基的调配物。还提供了制备包括所述至少一种抗原和所述佐剂的此类AAC的方法、调配可冷冻保存的调配物的方法以及冷冻保存所述调配物的方法。
背景技术
乳头瘤病毒(papillomavirus)是病毒粒子大小(直径)为约55nm的小型非包膜DNA病毒。超过100种人乳头瘤病毒(HPV)基因型被完全表征，并且推测存在较高的数量。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知原因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且是自发清除的，但是具有致癌性HPV类型之一的持续感染可以进展为癌前病变或癌症。其它HPV相关疾病可以包含寻常疣、跖疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头状瘤、疣状囊肿、喉乳头状瘤、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。
许多已知的HPV类型导致良性病变，其中一部分是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，将HPV类型分类为十五种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知这些类型一起表现为低级和高级宫颈变化和癌症、和其它肛门生殖器癌(如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌)以及头颈癌。最近，也描述了高风险类型HPV 16和18与乳腺癌的关联。分类为“低风险类型”的十一种HPV类型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)已知表现为良性低级宫颈变化、生殖器疣和复发性呼吸道乳头状瘤。皮肤HPV 5型、8型和92型与皮肤癌相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统被抑制并且对应地，抗肿瘤应答显著削弱。参见Suresh和Burtness《美国血液学与肿瘤学杂志(Am J Hematol Oncol)》13(6):20-27(2017)。
免疫疗法可以分为两种主要类型的干预，即被动或主动。被动方案包含施用预激活和/或工程化细胞(例如，CAR T细胞)、疾病特异性治疗抗体和/或细胞因子。主动免疫疗法策略旨在刺激体内免疫系统效应子功能。若干种当前主动方案包含使用疾病相关肽、裂解物或同种异体全细胞的疫苗接种策略，输注自体树突细胞(DC)作为肿瘤抗原递送的媒剂，以及输注免疫检查点调节剂。参见Papaioannou,Nikos E.,等人《转化医学年鉴(Annalsof translational medicine 4.14(2016)。过继免疫疗法可以用于调节免疫应答，增强抗肿瘤活性，并实现治疗或预防HPV相关癌症的目标。
由疾病相关抗原刺激的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助性T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力；然而，目前用于诱导内来源的T细胞应答的方法已经面临挑战。本文所述的调配物和小瓶包括在向有需要的个体施用之前，可被制备、储存和运输而不丧失功能性的冷冻保存培养基中的AAC。本文所述的方法被用于以高通量方式有效地产生AAC，所述AAC可以是包括至少一种HPV抗原和佐剂的无核细胞或无核细胞来源的实体，其可用于诱导对HPV抗原的稳健的T细胞应答。本文的公开内容还描述了用于使用包括HPV抗原和佐剂的AAC治疗患有HPV相关癌症的个体的方法、治疗、剂量和方案。
在本文中引用的所有参考文献，包含专利申请和出版物，通过引用整体并入本文。专利出版物WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO 2017041050、WO2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO2020/072833、WO 2020/154696和WO 2020/176789、US20180142198和US20180201889通过引用特此整体明确并入。
发明内容
在一些方面，本发明提供了一种药物调配物，其包括活化抗原载体(AAC)，所述调配物包括：a)AAC，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂；以及b)冷冻保存培养基。在一些实施例中，所述调配物包括约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约9×109个AAC。在一些实施例中，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器(Coulter counter)测量的约0.7×109个AAC/mL。
在本发明的一些实施例中，所述调配物中的所述AAC的群体中至少约70％、80％、90％或95％的AAC是功能性的。在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC维持等于或大于约70％的功能性。在一些实施例中，所述调配物包括约1×108个功能性AAC/mL至约1×109个功能性AAC/mL。在一些实施例中，其中所述AAC的群体中至少约70％、80％、90％或95％的AAC对膜联蛋白染色呈阳性。在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC对膜联蛋白维持等于或大于约70％的阳性染色。在一些实施例中，所述膜联蛋白是膜联蛋白V。
在本发明的一些实施例中，所述调配物中的冷冻保存培养基包括二甲亚砜(DMSO)。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％的DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约2％的DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。
在一些实施例中，所述调配物的pH为约6.0至约8.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7.6。
在一些方面，本发明提供了一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，在冷冻之前，调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。在一些实施例中，所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。在一些实施例中，其中所述调配物是无菌的。在一些实施例中，所述调配物包括少于约2EU/mL的内毒素。在一些实施例中，所述调配物不含支原体。
在本发明的一些实施例中，所述调配物的AAC包括至少一种人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在一些实施例中，所述HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施例中，其中所述抗原包括源自HPV E6的肽和源自HPV E7的肽。在一些实施例中，所述抗原包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，AAC包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。
在本发明的一些实施例中，所述调配物的AAC包括佐剂，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌胞(Poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
在本发明的一些方面，包括包含所述至少一种抗原和佐剂的AAC的所述调配物是通过包括以下的方法制备的：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC。在一些实施例中，所述收缩件的所述直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞。
在一些方面，本发明提供了包括药物调配物的小瓶；所述药物调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些方面，本发明提供了包括药物调配物的小瓶；所述药物调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约9×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，本发明提供了包括药物调配物的小瓶；所述药物调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述AAC位于约9.5mL所述冷冻保存培养基中。在一些实施例中，所述药物调配物包括在约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述调配物是无菌的。
在一些方面，本发明提供了一种产生AAC的药物调配物的方法，所述方法包括将冷冻保存培养基添加到所述AAC中，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂。在一些方面，本发明提供了一种产生AAC的药物调配物的方法，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC；c)洗涤所述AAC；以及d)将所述AAC调配在冷冻保存培养基中。在一些实施例中，所述收缩件的所述直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，所述AAC被洗涤约6次。在一些实施例中，所述AAC是通过离心和重悬或通过离心和过滤进行洗涤的。在一些实施例中，所述离心以约4000rpm进行。在一些实施例中，将约1×109个AAC至约1×1010个AAC调配在约9mL至约10mL所述冷冻保存培养基中。在一些实施例中，在冷冻之前，所述药物调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。在一些实施例中，所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，约7×109个AAC调配在约10mL所述冷冻保存培养基中。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在约-170℃下冷冻AAC的所述调配物。在一些实施例中，AAC的所述调配物是通过包括以下的方法冷冻的：a)将所述调配物放置在室中；b)将所述室的温度降低至约-3℃；c)以约-20℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-140℃；d)以约1.5℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-150℃；e)以约1.0℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-170℃；以及f)将所述室的温度保持处于约-170℃，持续至少约10分钟。
附图说明
图1示出了对从七个不同的健康供体进行的LOVO过程进行的血小板去除和RBC回收的评估。
图2示出了在RBC纯化步骤上十一次运行的RBC、血小板和白细胞的平均总回收率，所述RBC纯化步骤涵盖用LOVO上的递送培养基进行细胞洗涤和重悬并且经由白血球去除过滤器进行纯化。
图3A示出了在红细胞以60psi和75psi操作压力穿过不同芯片配置之后，膜联蛋白V+群体的增加。图3B示出了在红细胞以60psi和75psi操作压力穿过不同芯片配置之后Ova647的递送。
图4示出了在红细胞以不同细胞浓度穿过芯片之后Ova647的递送。
图5示出了在红细胞以不同细胞浓度穿过芯片之后FAM标记的E6和E7肽的递送。
图6示出了红细胞以不同压力穿过芯片之后的FAM标记的E7肽的递送。
图7示出了当AAC被稀释时或未经稀释的AAC在37℃的静置周期期间如通过IFNγ水平所测量的功能分析。
图8示出了使用两个不同协议的LOVO加工的平均回收率。
图9示出了LOVO加工以实现7×108个AAC/mL的目标浓度。
图10示出了使用所开发的方案进行冷冻保存的48瓶SQZ-AAC-HPV的代表性上样。
图11示出了使用双支架配置进行冷冻保存的64瓶SQZ-AAC-HPV的代表性上样。
图12示出了来自五个过程开发批次的解冻后计数。这五个批次的平均AAC计数为1.03×109个AAC/mL。
具体实施方式
在一些方面，本发明提供了一种药物调配物，其包括AAC，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，以及冷冻保存培养基。在一些实施例中，本发明提供了一种活化抗原载体(AAC)的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC/mL至约1×1010个AAC/mL，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的0.7×109个AAC/mL。
在一些方面，本发明提供了包括药物调配物的小瓶；所述药物调配物包括冷冻保存培养基(如但不限于CS2)中的约0.5×109个AAC/mL至约1×1010个AAC/mL，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
在一些方面，本发明提供了包括药物调配物的小瓶；所述药物调配物包括冷冻保存培养基(如但不限于CS2)中的约0.7×109个AAC/mL，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
还提供了包括包含至少一种抗原和佐剂的AAC的调配物和小瓶，以及制备包括至少一种抗原和佐剂的AAC的调配物的方法。在一些实施例中，所述AAC是通过包括以下的方法制备的：a)使包括输入无核细胞的群体的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的输入无核细胞；以及b)将所述经扰动的输入无核细胞的群体与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原进入所述经扰动的输入无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC。在一些实施例中，所述抗原是HPV抗原。还提供了用于诱导对HPV抗原的免疫应答或用于治疗HPV相关癌症的组合物。还提供了包括有效量的AAC的调配物在制备用于刺激对HPV抗原的免疫应答或用于治疗HPV相关癌症的药物中的用途。
在一些实施例中，提供了产生AAC的药物调配物的方法，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC；c)洗涤所述AAC；以及d)将所述AAC调配在冷冻保存培养基中。
通用技术
本文所述或所引用的技术和程序总体上被本领域的技术人员充分理解并通常用于使用常规方法，例如，以下中描述的广泛使用的方法：《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》(Sambrook等人.,第4版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),2012)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人.编辑,2003)；《酶学方法丛书(the series Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《PCR 2：一种实用方法(PCR 2:A Practical Approach)》(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；《抗体实验室手册(Antibodies,ALaboratory Manual)》(Harlow和Lane编辑,1988)；《动物细胞的培养：基础技术和专门应用手册(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications)》(R.I.Freshney,第6版,约翰威利父子出版公司(J.Wiley and Sons),2010)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,学术出版社,1998)；《细胞和组织培养概论(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,普莱纽姆出版社(Plenum Press),1998)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,约翰威利父子出版公司,1993-8)；《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》,(Mullis等人编辑,1994)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(Ausubelet al编辑,约翰威利父子出版公司,2002)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway等人.,2004)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:A Practical Approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社(IRL Press),1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal Antibodies:A Practical Approach)》((P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》((E.Harlow和D.Lane,冷泉港实验室出版社,1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；以及《癌症：肿瘤学原理和实践(Cancer:Principles and Practice of Oncology)》(V.T.DeVita等人编辑,J.B.利平科特出版公司(J.B.Lippincott Company),2011)
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且每当适当时，以单数形式使用的术语也将包含复数形式，并且反之亦然。如果以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则以以下阐述的定义为准。
如本文所使用的，除非另有说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。
如本文所使用的，术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“含有(containing)”和“包含(including)”以及其它类似的形式及其语法上的等效物，旨在意思上是等效的，并且是开放式的，因为这些词语中的任何一个后面的一个或多个项目并不意味着是此类一个或多个项目的详尽列举，或者意味着仅局限于所列出的一个或多个项目。例如，“包括”组分A、B和C的制品可以由组分A、B和C组成(即，仅含有)，或者可以不仅含有组分A、B和C，还含有一种或多种其它组分。因此，意图和理解“包括”及其类似形式，以及其语法等效物，包含“基本上由...组成”或“由...组成”的实施例的公开内容。
在提供值的范围的情况下，应理解在所述范围的上限与下限之间的每个插入值(到下限的十分之一单位，除非上下文清楚地另外指明)以及在所陈述范围内的任何其它所陈述的值或插入值均被涵盖在本公开内，服从所述范围中任何具体排除的限制。在所陈述的范围包含限值中的一个或两个限值的情况下，排除被包含在内的限值中的任一个或两个限值的范围也包含在本公开内。
如本文所使用的，术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”值或参数包含(并且描述)针对所述值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包含对“X”的描述。
如本文所使用的，“无核细胞”是指缺少细胞核的细胞。此类细胞可以包含但不限于血小板、红细胞(RBC)，如红细胞和网织红细胞。网织红细胞是未成熟的(例如，尚未双凹的)红细胞，通常包括人体中红细胞的约1％。网织红细胞也是无核的。在某些实施例中，本文所描述的系统和方法用于处理和/或加工富集的(例如，包括的总细胞群体的百分比大于在自然界中发现的总细胞群体的百分比)、纯化的或分离的(例如，从其自然环境中，以基本上纯的或同质的形式)无核细胞(例如，RBC、网织红细胞和/或血小板)群体。在某些实施例中，本文所描述的系统和方法用于处理和/或加工含有RBC(例如，红细胞或网织红细胞)、血小板以及其它血细胞的全血。这些细胞类型的纯化或富集是使用已知方法完成的，如密度梯度系统(例如，Ficoll-Hypaque)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁性细胞分选或成红细胞和红系前体的体外分化。
如本文所使用的，术语“囊泡”是指包括被脂质双层封闭的液体的结构。在一些实例中，脂质双层来源于天然存在的脂质组合物。在一些实例中，脂质双层可以来源于细胞膜。在一些实例中，囊泡可以源自各种实体，如细胞。在此类实例中，囊泡可以保留来自原始实体的分子(如细胞内蛋白质或膜组分)。例如，源自红细胞的囊泡可以含有红细胞和/或红细胞的膜组分中的任何数量的细胞内蛋白质。在一些实例中，除了期望的有效载荷之外，囊泡可以在细胞内含有任何数量的分子。
如本文所使用的，“有效载荷”是指被递送到(如装载在)无核细胞来源的囊泡(例如，AAC)中的材料。“有效载荷”、“货物”、“递送材料”和“化合物”在本文中可互换使用。在一些实施例中，有效载荷可以指蛋白质、小分子、核酸(例如，RNA和/或DNA)、脂质、碳水化合物、大分子、维生素、聚合物、荧光染料和荧光团、碳纳米管、量子点、纳米颗粒和类固醇。在一些实施例中，有效载荷可以指蛋白质或小分子药物。在一些实施例中，有效载荷可以包括一种或多种化合物。
术语“异源”在其涉及核酸序列(如编码序列和控制序列)时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区是在自然界中未发现与其它分子缔合的另一个核酸分子内或与其附着的核酸区段。例如，核酸构建体的异源区可以包含由在自然界中未发现与编码序列缔合的序列侧接的编码序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞将被视为异源。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源DNA。
术语“异源”在其涉及氨基酸序列(如肽序列和多肽序列)时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，肽序列的“异源”区是在自然界中未发现与其它分子缔合的另一个氨基酸分子内或与其附着的氨基酸区段。例如，肽构建体的异源区可以包含由在自然界中未发现与肽的氨基酸序列缔合的序列侧接的肽的氨基酸序列。异源肽序列的另一实例是其中肽序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因编码的氨基酸的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，用表达通常不存在于细胞中的氨基酸构建体的载体转化的细胞将被视为异源。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源肽。
术语“外源”在用于指与细胞或AAC相关的药剂(如抗原或佐剂等)时，是指细胞外的药剂或从细胞外递送至细胞内的药剂。所述细胞可能已经存在或可能不存在药剂，并且在外源药剂被递送后可能产生或可能不产生药剂。
如本文所使用的，术语“同源”是指源自相同生物体的分子。在一些实例中，所述术语是指通常在给定生物体内发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所使用的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得有益或期望的结果(包含临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包含但不限于以下中的一项或多项：减轻由疾病引起的一种或多种症状；减轻疾病的程度；稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化)；预防或延缓疾病的传播(例如，转移)；预防或延缓疾病的复发；延缓或减慢疾病的进展；改善疾病状态；疾病的缓解(部分或全部)；降低治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量；延缓疾病的进展；提高或改善生活质量；增加体重增加；和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理学结果(例如，肿瘤体积)。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
如本文所使用的，术语“预防性治疗”是指治疗，其中已知或怀疑个体患有某种病症或处于患有所述病症的风险，但没有表现出所述病症的症状或轻微症状。接受预防性治疗的个体可以在症状发作之前接受治疗。在一些实施例中，如果个体患有癌前病变，尤其是与HPV感染相关的癌前病变，则可以对所述个体进行治疗。
如本文所使用的，“组合疗法”意指第一药剂与另一种药剂联合施用。“与…联合”是指除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式，如除了对同一个体施用如本文所描述的免疫缀合物之外，还施用如本文所描述的有核细胞的组合物。因此，“与…联合”是指在向个体递送另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
如本文所使用的，术语“同时施用”意指施用组合疗法中第一疗法和第二疗法的时间间隔不超过约15分钟，如不超过10、5或1分钟中的约任一个。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可以包含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或包含在单独的组合物中(例如，第一疗法包含在一种组合物中，并且第二疗法包含在另一种组合物中)。
如本文所使用的，术语“顺序施用”是指施用组合疗法中的第一疗法和第二疗法的时间间隔超过约15分钟，如超过20、30、40、50、60或更多分钟中的约任一个。可以首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独的组合物中，所述单独的组合物可以包含在相同或不同的包装或试剂盒中。
如本文所使用的，术语“同时施用”意指在组合疗法中的第一疗法的施用和第二疗法的施用相互重叠。
在癌症的情况下，术语“治疗”包含杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞复制、减轻整体肿瘤负担以及改善一种或多种与疾病相关的症状中的任何或全部。
如本文所使用的，术语“调节”可以指更改、改变、变化或以其它方式修改特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指引起更改、改变、变化或以其它方式修饰免疫应答的任何行为。在一些实例中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些实例中，“调节”是指抑制特定靶标的存在或活性。在其它实例中，调节核酸表达可以包含但不限于核酸的转录的变化、mRNA丰度的变化(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的对应变化、mRNA翻译的变化等。
如本文所使用的，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其它方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指引起免疫应答的阻断、减少、消除或任何其它拮抗作用的任何行为。在其它实例中，核酸表达的抑制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制、基因编辑等。在其它实例中，蛋白质表达的抑制可以包含但不限于，编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的减少、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的减少等。在另一个实例中，抑制可以指减缓或停止生长的行为；例如，延缓或防止肿瘤细胞的生长。
如本文所使用的，术语“压制”可以指降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱特定靶标的存在或活动的行为。压制可以指部分压制或完全压制。例如，压制免疫应答可以指引起降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱免疫应答的任何行为。在其它实例中，核酸表达的压制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在其它实例中，蛋白质表达的压制可以包含但不限于，编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的减少、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的减少等。
如本文所使用的，术语“增强”可以指改善、加强、提高或以其它方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指引起改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性实例中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答。在其它实例中，核酸表达的增强可以包含但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的减少、mRNA翻译的增加等。在其它实例中，增强蛋白质的表达可以包含但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。
如本文所使用的，术语“诱导”可以指引发、提示、刺激、建立或以其它方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指引起引发、促使、刺激、建立或以其它方式产生期望的免疫应答的任何行为。在其它实例中，诱导核酸表达可以包含但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。在其它实例中，诱导蛋白质的表达可以包含但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，此术语包含但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可以包括糖和磷酸基(如通常可以存在于RNA或DNA中的)，或经修饰的或经取代的糖或磷酸基。多核苷酸的主链可以包括由肽键(即，肽核酸)连接的重复单元，如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸。可替代地，多核苷酸的主链可以包括合成亚基的聚合物，如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯低聚物或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。另外，通过合成互补链并在适当条件下退火链，或通过使用具有适当引物的DNA聚合酶从头合成互补链，可以从化学合成的单链多核苷酸产物中获得双链多核苷酸。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然的氨基酸残基，并且包含但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白以及其片段两者。所述术语还包含多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包含对天然序列进行如缺失、添加和取代等修饰的蛋白质(通常本质上是保守的)，只要所述蛋白质维持期望的活性。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增而产生的错误。
如本文所使用的，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与抗原单独施用相比，佐剂与抗原联合施用增强对抗原的免疫应答。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡脱氧核苷酸”和“CpG ODN”在本文中是指长度为10至30个核苷酸的DNA分子，含有由磷酸盐分离的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸(在本文中也被称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开的CpG ODN含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。也就是说，CpG二核苷酸中的胞嘧啶没有甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)主链。
如本文所使用的，“药学上可接受的”或“药理上相容的”是指非生物学上或其它方面不期望的材料，例如，所述材料可以并入到施用于患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不期望的生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的组合物中的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地符合毒理学和制备测试的所需标准和/或包含在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)编写的《非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)》中。
如本文所使用的，“微流体系统”是指其中低体积(例如，mL、nL、pL、fL)的流体被加工以实现小体积液体的离散处理的系统。本文所描述的某些实施方案包含多路复用、自动化和高通量筛选。流体(例如，缓冲液、溶液、含有效载荷的溶液或细胞悬浮液)可以被移动、混合、分离或以其它方式加工。在本文所描述的某些实施例中，微流体系统用于对悬浮在缓冲液中的细胞应用机械收缩件，诱导细胞中的扰动(例如，孔)，这允许有效载荷或化合物进入细胞的细胞质。
如本文所使用的，“收缩件”可以指由入口部分、中心点和出口部分限定的微流体通道的一部分，其中中心点由宽度、长度和深度限定。在其它实例中，收缩件可以指孔或者可以是孔的一部分。孔可以包含在表面上(例如，过滤器和/或膜)。
对于本文所描述的结构和功能特性中的任何结构和功能特性，确定这些特性的方法是本领域已知的。
包括抗原的AAC的调配物
在一些实施例中，提供了包括AAC的药物调配物，所述调配物包括：a)AAC，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，以及b)冷冻保存培养基。
在一些实施例中，所述调配物包括约1×107至约1×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约1×109至约1×1011个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC中的任一者。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的约6.65×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约0.7×109个AAC/mL。如通过流式细胞术方法测量的解冻后的预期浓度的1.0×109个AAC/mL大约等同于基于由于较低灵敏度的基于库尔特的计数器方法的负偏差，如通过基于库尔特的细胞计数方法测量的解冻后的7.0×108个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约1×107至约1×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约1×109至约1×1011个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约6.65×109个AAC。
在一些实施例中，所述调配物的体积为约2mL至约50mL。在一些实施例中，所述调配物的体积为约5mL至约20mL。在一些实施例中，所述调配物的体积为1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多mL中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物的体积是约1至约2、约2至约3、约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、或约9至约10、约10至约11、约11至约12、约12至约13、约13至约14、约14至约15、约15至约16、约16至约17、约17至约18、约18至约19或约19至约20mL中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的体积为约9.5mL。
在一些实施例中，所述调配物包括约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约6.65×108个AAC/mL。
在一些实施例中，所述调配物是无菌的。在一些实施例中，所述调配物包括少于约2EU/mL的内毒素。在一些实施例中，所述调配物包括小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mL的内毒素中的任一者。在一些实施例中，所述调配物不含支原体。
冷冻保存培养基中的AAC的调配物
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，AAC的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的AAC的对应组合物相比，所述药剂增强AAC的功能。在一些实施例中，AAC的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的AAC的对应组合物相比，所述药剂增强冷冻-解冻循环后AAC的功能。在一些实施例中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施例中，与在任何冷冻-解冻循环之前不包括所述药剂的AAC的对应组合物相比，冷冻保存剂或低温保存剂都没有预防包括所述药剂的AAC的所述组合物中超过10％或20％的细胞死亡。在一些实施例中，当与在冷冻-解冻循环之前的AAC的对应组合物相比时，包括冷冻保存剂和/或低温保存剂的AAC的组合物的冷冻-解冻循环导致功能损失不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，当与不含冷冻保存剂和低温保存剂的AAC的对应组合物的冷冻-解冻循环相比时，包括冷冻保存剂和/或低温保存剂的AAC组合物的冷冻-解冻循环导致功能损失减少10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，包括至少一种抗原的AAC组合物的功能或功能性通过对于膜联蛋白V染色呈阳性的AAC的百分比来测量。在一些实施例中，AAC组合物的功能或功能性通过对于膜联蛋白V染色呈阳性的AAC的百分比来测量。在一些实施例中，AAC组合物的功能或功能性通过对CD235a染色呈阳性的AAC的百分比来测量。在一些实施例中，AAC组合物的功能或功能性通过阳性CD235a和膜联蛋白V染色的无核细胞来源的囊泡的百分比来测量。在一些实施例中，在至多1、2、3、4、5次冷冻-解冻循环之后，至少约70％、约80％或约90％的AAC是功能性的。在一些实施例中，所述药剂是增强胞吞作用的化合物、稳定剂或辅因子。在一些实施例中，所述药剂是白蛋白。在一些实施例中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是小鼠、牛或人白蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些实施例中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、二甲亚砜(DMSO)、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、葡糖酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、/>DMSO、/>CS2、/>CS5、/>CS10、CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、/>
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将无核细胞的所述组合物与药剂一起温育的步骤，与没有另外的温育步骤而制备的对应的无核细胞相比，所述药剂增强所述无核细胞的功能。
在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL冷冻保存培养基中的约1×109至约1×1011个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL冷冻保存培养基中的0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL冷冻保存培养基中的约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011个AAC、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC中的任一者。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL冷冻保存培养基中的1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约6.65×109个AAC。在一些实施例中，包括AAC的所述调配物包括冷冻保存培养基中的0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC中的约任一者。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约6.65×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的冷冻保存培养基中的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括CS2。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是/>CS2。
在一些实施例中，包括AAC的组合物包括约9mL至约10mL的CS2中的约7×109个AAC。在一些实施例中，包括AAC的组合物包括约9.5mL的/>CS2中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL的/>CS2中的约6.65×109个AAC。
在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC维持等于或大于约50％的功能性至多1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环。在一些实施例中，所述调配物维持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的功能性至多1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环。在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC在处于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，维持等于或大于约70％的功能性。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，维持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的功能性。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-140℃的温度下储存至少6、9、12、15、18、24、30或36个月后，维持等于或大于约70％的功能性。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃或-200℃下储存至少12个月后，维持等于或大于约70％的功能性。
在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC对于膜联蛋白染色维持等于或大于约50％的阳性至多1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环。在一些实施例中，所述调配物对于膜联蛋白染色维持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的阳性至多1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环。在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC在处于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，对于膜联蛋白染色维持等于或大于约70％的阳性。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，对于膜联蛋白染色维持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的阳性。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-140℃的温度下储存至少6、9、12、15、18、24、30或36个月后，对于膜联蛋白染色维持等于或大于约70％的阳性。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃或-200℃下储存至少12个月后，对于膜联蛋白染色维持等于或大于约70％的阳性。
在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC对膜联蛋白V和/或CD235a维持等于或大于约50％的阳性染色至多1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环。在一些实施例中，所述调配物对膜联蛋白V和/或CD235a维持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的阳性染色至多1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环。在一些实施例中，所述调配物中的所述AAC在处于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，对膜联蛋白V和/或CD235a维持等于或大于约70％的阳性染色。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，对膜联蛋白V和/或CD235a维持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的阳性染色。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-140℃的温度下储存至少6、9、12、15、18、24、30或36个月后，对膜联蛋白V和/或CD235a维持等于或大于约70％的阳性染色。在一些实施例中，所述调配物在处于或低于-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃或-200℃下储存至少12个月后，对膜联蛋白V和/或CD235a维持等于或大于约70％的阳性染色。
在一些实施例中，包括AAC的所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个功能性AAC。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×10、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个功能性AAC。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个功能性AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约7×109个功能性AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约1×109至约1×1010个功能性AAC。
在一些实施例中，所述调配物包括约1×106至约1×1011个功能性AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约1×107至约1×1010个功能性AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个功能性AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个功能性AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个功能性AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约7×108个功能性AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约1×108至约1×109个功能性AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，包括AAC的所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个功能性AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011个AAC、约1.0×1011至约0.5×1012个功能性AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个功能性AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约7×109个功能性AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×109至约1×1010个功能性AAC。
在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×106至约1×1011个功能性AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×107至约1×1010个功能性AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个功能性AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个功能性AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个功能性AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约7×108个功能性AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×108至约1×109个功能性AAC/mL。
在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括二甲亚砜(DMSO)。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约25％的DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％的DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、15％、20％和25％的DMSO中的约任一者。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％、约5％至约10％、约10％至约20％的DMSO中的任一种。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约2％的DMSO。
在一些实施例中，所述调配物的pH为约5.0至约9.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约6.0至约8.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7.6。在一些实施例中，所述调配物的pH为约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或10中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的pH为约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9或约9至约10中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7至约7.1、约7.1至约7.2、约7.2至约7.3、约7.3至约7.4、约7.4至约7.5、约7.5至约7.6、约7.6至约7.7、约7.7至约7.8、约7.8至约7.9、或约7.9至约8.0中的任一者。
在一些方面，提供了一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，提供了一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约0.7×109个AAC/mL。
在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约6.65×108个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物中的AAC的浓度通过库尔特计数器测量。
在一些实施例中，在冷冻之前，包括AAC的所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，在冷冻之前，所述调配物包括约6.65×109个AAC。
在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL中。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109以及5×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约6.65×108个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约6.65×108个AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的以下中的约任一者：0.5×106、1.0×106、0.5×107、1.0×107、0.5×108、1.0×108、0.5×109、1.0×109、0.5×1010、1.0×1010、0.5×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的以下中的约任一者：5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×109个AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，包括AAC的所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011个AAC、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约9×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约6.65×109个AAC。
在根据本文所述的调配物中的任何调配物的一些实施例中，AAC在约2mL至约50mL冷冻保存培养基中。在一些实施例中，AAC在约5mL至约20mL冷冻保存培养基中。在一些实施例中，AAC在1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多mL冷冻保存培养基中的约任一者中。在一些实施例中，AAC在约1至约2、约2至约3、约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、或约9至约10、约10至约11、约11至约12、约12至约13、约13至约14、约14至约15、约15至约16、约16至约17、约17至约18、约18至约19或约19至约20mL冷冻保存培养基中的任一者中。在一些实施例中，所述AAC位于约9.5mL所述冷冻保存培养基中。
在一些方面，提供了一种AAC的药物调配物，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。
在一些实施例中，所述调配物是无菌的。在一些实施例中，所述调配物包括少于约2EU/mL的内毒素。在一些实施例中，所述调配物包括小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mL的内毒素中的任一者。在一些实施例中，所述调配物不含支原体。
包括药物调配物的小瓶
在一些实施例中，提供了一种小瓶，其包括本文所述的药物调配物中的任一种。
在一些方面，提供了一种包括药物调配物的小瓶，其中所述药物调配物包括AAC，其中所述调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。在一些实施例中，提供了一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH7.6。
在根据本文所述的小瓶中的任何小瓶的一些实施例中，AAC在约2mL至约50mL冷冻保存培养基中。在一些实施例中，AAC在约5mL至约20mL冷冻保存培养基中。在一些实施例中，AAC在1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多mL冷冻保存培养基中的约任一者中。在一些实施例中，AAC处于约1至约2、约2至约3、约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、或约9至约10、约10至约11、约11至约12、约12至约13、约13至约14、约14至约15、约15至约16、约16至约17、约17至约18、约18至约19或约19至约20mL冷冻保存培养基中的任一者中。
在一些实施例中，所述调配物包括约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约6.65×108个AAC/mL。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约25％的DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％的DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、15％、20％和25％的DMSO中的约任一者。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％、约5％至约10％、约10％至约20％的DMSO中的任一种。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括约2％的DMSO。
在一些实施例中，所述调配物的pH为约5.0至约9.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约6.0至约8.5。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7.6。在一些实施例中，所述调配物的pH为约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或10中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的pH为约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9或约9至约10中的任一者。在一些实施例中，所述调配物的pH为约7至约7.1、约7.1至约7.2、约7.2至约7.3、约7.3至约7.4、约7.4至约7.5、约7.5至约7.6、约7.6至约7.7、约7.7至约7.8、约7.8至约7.9、或约7.9至约8.0中的任一者。
在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约1×109至约1×1011个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的任一者：约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的约7×109个AAC。在一些实施例中，包括AAC的所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约7×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的冷冻保存培养基中的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基包括CS2。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是/>CS2。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL中。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约6.65×108个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的以下中的约任一者：0.5×106、0.7×106、1.0×106、0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的以下中的约任一者：1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108以及1×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约7×108个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约6.65×108个AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×106至约1×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×107至约1×1010个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的以下中的约任一者：0.5×106、1.0×106、0.5×107、1.0×107、0.5×108、1.0×108、0.5×109、1.0×109、0.5×1010、1.0×1010、0.5×1011以及1.0×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的以下中的任一者：约、约0.5×106至约1.0×106、约1.0×106至约0.5×107、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的以下中的约任一者：5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过流式细胞术测量的约1×109个AAC/mL。
在一些实施例中，在解冻之后，包括AAC的所述调配物包括以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括以下中的任一者：约、约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010个AAC、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011个AAC、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC中的约任一者。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约9×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约7×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约6.65×109个AAC。
在一些方面，提供了一种活化AAC的药物调配物，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。
在一些实施例中，所述调配物是无菌的。在一些实施例中，所述调配物包括少于约2EU/mL的内毒素。在一些实施例中，所述调配物包括小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mL的内毒素中的任一者。在一些实施例中，所述调配物不含支原体。
包括抗原和佐剂的AAC的组合物
在一些实施例中，AAC包括细胞内递送的抗原和佐剂。在一些实施例中，AAC包括细胞内递送的HPV抗原和佐剂。在一些实施例中，AAC源自输入无核细胞。在一些实施例中，AAC来源于输入红细胞。在一些实施例中，AAC源自输入网织红细胞。在一些实施例中，AAC源自输入红细胞(RBC)。在一些实施例中，AAC是包括HPV抗原和佐剂的无核细胞来源的囊泡。在一些实施例中，AAC是包括HPV抗原和佐剂的RBC来源的囊泡。
在一些实施例中，包括所述至少一种抗原和所述佐剂的AAC是通过以下制备的：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的输入无核细胞；以及b)将所述经扰动的输入无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的输入无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的AAC。
在一些实施例中，包括所述HPV抗原和所述佐剂的AAC是通过以下制备的：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述HPV抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的输入无核细胞；以及b)将所述经扰动的输入无核细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述经扰动的输入无核细胞的时间，由此生成包括所述HPV抗原和所述佐剂的AAC。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，AAC是无核细胞来源的囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞来源的囊泡是RBC来源的囊泡或血小板来源的囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞来源的囊泡是红细胞来源的囊泡或网织红细胞来源的囊泡。
在一些实施例中，包括所述至少一种抗原和所述佐剂的AAC是通过以下制备的：a)使包括输入红细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入红细胞的直径的函数，由此使得所述输入红细胞的扰动足够大以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的输入红细胞；以及b)将所述经扰动的输入红细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的输入红细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的AAC。
在一些实施例中，包括所述HPV抗原和所述佐剂的AAC是通过以下制备的：a)使包括输入红细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入红细胞的直径的函数，由此使得所述输入红细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的输入红细胞；以及b)将所述经扰动的输入红细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述经扰动的输入红细胞的时间，由此生成包括所述HPV抗原和所述佐剂的AAC。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:1-4和18-25中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述收缩件的宽度为所述输入无核细胞(例如，红细胞)的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一者。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.0μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约3.0μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一者。在一些实施例中，包括所述输入无核细胞的所述细胞悬浮液穿过多个收缩件，其中所述多个收缩件串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述HPV抗原是多种多肽的池，所述多种多肽针对相同和或不同HPV抗原引起应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性HPV表位以及一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其它抗原或与佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(Poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(Poly I:C)。
生成包括包含抗原和佐剂的AAC的药物调配物的方法
在一些实施例中，所述药物调配物内包括的AAC是无核细胞来源的囊泡。在一些实施例中，提供了用于生成包括包含抗原和佐剂的AAC的组合物的方法，其中所述至少一种抗原和佐剂在细胞内递送到AAC。在一些实施例中，提供了用于生成包括包含HPV抗原和佐剂的AAC的组合物的方法，其中所述HPV抗原和佐剂在细胞内递送到AAC。
在根据本文所述的调配物中的任何调配物的一些实施例中，包括至少一种抗原和佐剂的所述AAC是通过包括以下的方法制备的：a)使包括输入无核的群体的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及b)将所述经扰动的输入无核细胞的群体与所述至少一种抗原和佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原进入所述经扰动的输入无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和佐剂的所述AAC。
在一些实施例中，包括所述HPV抗原和佐剂的所述AAC是通过包括以下的方法制备的：a)使包括输入无核的群体的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述HPV抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及b)将所述经扰动的输入无核细胞的群体与所述HPV抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原进入所述经扰动的输入无核细胞的时间，由此生成包括所述HPV抗原和所述佐剂的所述AAC。
在一些实施例中，所述HPV抗原包括源自HPV E6的肽。在一些实施例中，所述HPV抗原包括源自HPV E7的肽。在一些实施例中，所述HPV抗原包括源自HPV E6的肽和源自HPV E7的肽。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞(RBC)或血小板。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，AAC是无核细胞来源的囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞来源的囊泡是RBC来源的囊泡或血小板来源的囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞来源的囊泡是红细胞来源的囊泡或网织红细胞来源的囊泡。在一些实施例中，所述输入无核细胞对于将接受所述组合物的个体是自体的。在一些实施例中，所述无核细胞对于将接受所述组合物的个体是同种异体的。
在一些实施例中，所述收缩件的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一者。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.0μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约3.0μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一者。在一些实施例中，包括所述输入无核细胞的所述细胞悬浮液穿过多个收缩件，其中所述多个收缩件串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述HPV抗原是多种多肽的池，所述多种多肽针对相同和或不同HPV抗原引起应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性HPV表位以及一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原用其它抗原或佐剂递送。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV表位以及一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、与其它抗原或与佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述HPV抗原包含HLA-A2特异性表位。在一些实施例中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施例中，所述至少一种抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施例中，所述至少一种抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(Poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(Poly I:C)。
在一些实施例中，提供了一种产生AAC的药物调配物的方法，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC；c)洗涤所述AAC；以及d)将所述AAC调配在冷冻保存培养基中。在一些实施例中，所述AAC被洗涤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次中的约任一者。在一些实施例中，所述AAC被洗涤约6次。在一些实施例中，所述AAC在PBS中洗涤。在一些实施例中，所述AAC在培养基中洗涤。在一些实施例中，所述培养基与用于输入无核细胞的培养基基本上相同。在一些实施例中，所述AAC在包括一种或多种稳定剂的培养基中洗涤。在一些实施例中，所述AAC在包括一种或多种冷冻保存剂的培养基中洗涤。在一些实施例中，所述AAC是通过离心和重悬进行洗涤的。在一些实施例中，所述AAC是通过离心和过滤进行洗涤的。在一些实施例中，所述AAC是通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个离心和重悬步骤进行洗涤的。在一些实施例中，所述AAC是通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个离心和过滤步骤进行洗涤的。在一些实施例中，所述一个或多个离心步骤以以下中的约任一者进行：100xg、150xg、200xg、250xg、300xg、350xg、400xg、450xg、500xg、550xg、600xg、650xg、700xg、750xg和800xg。在一些实施例中，所述一个或多个离心步骤以以下中的约任一者进行：1000rpm、1500rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm或4500rpm。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述调配物包括约1×107至约1×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的1×109至约1×1011个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的约任一者：0.5×107、0.7×107、1.0×107、0.5×108、0.7×108、1.0×108、0.5×109、0.7×109、1.0×109、0.5×1010、0.7×1010、1.0×1010、0.5×1011、0.7×1011、1.0×1011、0.5×1012、0.7×1012以及1.0×1012个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约0.5×107至约1.0×107、约1.0×107至约0.5×108个AAC、约0.5×108至约1.0×108、约1.0×108至约0.5×109个AAC、约0.5×109至约1.0×109、约1.0×109至约0.5×1010、约0.5×1010至约1.0×1010、约1.0×1010至约0.5×1011、约0.5×1011至约1.0×1011个AAC、约1.0×1011至约0.5×1012个AAC中的任一者。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的以下中的约任一者：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109以及1×1010个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9mL至约10mL中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的约7×109个AAC。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL中的约6.65×109个AAC。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，在解冻之后，所述调配物包括如通过库尔特计数器测量的约0.7×109个AAC/mL。在一些实施例中，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。在一些实施例中，所述冷冻保存培养基是CS2。/>
在一些实施例中，所述方法进一步包括在介于约-80℃至约-250℃之间下冷冻保存(如冷冻)AAC的调配物。在一些实施例中，所述方法进一步包括在-170℃下冷冻保存AAC的调配物(如冷冻)。在一些实施例中，所述方法包括在-80℃、-90℃、-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃、-200℃、-210℃、-220℃、-230℃、-240℃或-250℃中的约任一者下冷冻AAC的调配物。在一些实施例中，所述方法包括在约-80℃至约-90℃、约-90℃至约-100℃、约-100℃至约-110℃、约-110℃至约-120℃、约-120℃至约-130℃、约-130℃至约-140℃、约-140℃至约-150℃、约-150℃至约-160℃、约-160℃至约-170℃、约-170℃至约-180℃、约-180℃至约-190℃、约-190℃至约-200℃、约-200℃至约-210℃、约-210℃至约-220℃、约-220℃至约-230℃、约-230℃至约-240℃或约-230℃至约-240℃中的任一者下冷冻AAC的调配物。
在一些实施例中，所述调配物是通过包括以下的方法冷冻保存(如冷冻)的：a)将所述调配物放置在室中；b)第一步，将所述室的温度降低至介于约0℃至约-20℃之间；c)第二步，以介于约-10℃/分钟至约-30℃/分钟之间的速率将所述室的温度降低至介于约-130℃至约-150℃之间；d)第三步，以介于约-0.5℃/分钟至约-5℃/分钟之间的速率将所述室的温度降低至介于约-140℃至约-160℃之间；e)第四步，以介于约-0.1℃/分钟至约-5℃/分钟之间的速率将所述室的温度降低至到介于约-150℃至约-200℃之间；以及f)将所述室的温度保持在介于约-150℃至约-200℃之间下持续至少约5至约30分钟。在一些实施例中，所述室是冷冻保存室，如但不限于促进温度降低的稳定速率的冷冻保存室，如MR。FROSTYTM(Thermo ScientificTM)。在一些实施例中，不同的冷冻保存室用于上述步骤中的一个或多个。在一些实施例中，所述调配物随后从室移除并移动到永久储存(如但不限于液氮罐，并且如但不限于液相、液-蒸发过渡相或液氮的蒸气相)。
在一些实施例中，降低室的温度的第一步包括将温度降低至约0℃、-1℃、-2℃、-3℃或-4℃中的任一者，或其间的任何温度或范围。在一些实施例中，降低室的温度的第二步包括将室的温度降低至约-130℃、-131℃、-132℃、-133℃、-134℃、-135℃、-136℃、-137℃、-138℃、-139℃、-140℃、-141℃、-142℃、-143℃、-144℃、-145℃、-146℃、-147℃、-148℃、-149℃、-150℃中的任一者，或其间的任何温度或范围。在一些实施例中，降低室的温度的第二步包括将温度以约-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20℃/分钟中的任一者的速率，或其间的任何速率或范围降低。在一些实施例中，降低室的温度的第三步包括将室的温度降低至约-140℃、-141℃、-142℃、-143℃、-144℃、-145℃、-146℃、-147℃、-148℃、-149℃、-150℃、-151℃、-152℃、-153℃、-154℃、-155℃、-156℃、-157℃、-158℃、-159℃、-160℃中的任一者，或其间的任何温度或范围。在一些实施例中，降低室的温度的第三步包括将温度以约-0.5、-1、-1.5、-2、-2.5、-3、-3.5、-4、-4.5、-5℃/分钟中的任一者的速率，或其间的任何速率或范围降低。在一些实施例中，降低室的温度的第四步包括将室的温度降低至约-150℃、-152℃、-154℃、-156℃、-158℃、-160℃、-162℃、-164℃、-166℃、-168℃、-170℃、-172℃、-174℃、-176℃、-178℃、-180℃、-182℃、-184℃、-186℃、-188℃、-190℃中的任一者，或其间的任何温度或范围。在一些实施例中，降低室的温度的第三步包括以约-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9、-1、-1.1、-1.2、-1.3、-1.4、-1.5、-2、-2.5、-3、-3.5、-4、-4.5、-5℃/分钟中的任一者的速率降低。在一些实施例中，所述方法包括将室的温度保持在约-150℃、-152℃、-154℃、-156℃、-158℃、-160℃、-162℃、-164℃、-166℃、-168℃、-170℃、-172℃、-174℃、-176℃、-178℃、-180℃、-182℃、-184℃、-186℃、-188℃、-190℃或其间的任何温度或范围持续约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟中的至少任一者或其间的任何时间间隔或范围。
在一些实施例中，所述调配物是通过包括以下的方法冷冻保存(如冷冻)的：a)将所述调配物放置在室中；b)将所述室的温度降低至约-3℃；c)以约-20℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-140℃；d)以约1.5℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-150℃；e)以约1.0℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-170℃；以及f)将所述室的温度保持处于约-170℃，持续至少约10分钟。
抗原
在根据本文所述的方法、调配物或小瓶的一些实施例中，所述至少一种抗原是外源抗原。在根据本文所述的方法的一些实施例中，所述外源抗原是HPV抗原。乳头瘤病毒是病毒粒子大小(直径)为约55nm的小型非包膜DNA病毒。超过100种HPV基因型被完全表征，并且推测存在较高的数量。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知原因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且是自发清除的，但是具有致癌性HPV类型之一的持续感染可以进展为癌前病变或癌症。其它HPV相关疾病可以包含寻常疣、跖疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头状瘤、疣状囊肿、喉乳头状瘤、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。许多已知的HPV类型导致良性病变，其中一部分是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，将HPV类型分类为十五种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知这些类型一起表现为低级和高级宫颈变化和癌症、和其它肛门生殖器癌(如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌)以及头颈癌。最近，也描述了高风险类型HPV 16和18与乳腺癌的关联。分类为“低风险类型”的十一种HPV类型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)已知表现为良性低级宫颈变化、生殖器疣和复发性呼吸道乳头状瘤。皮肤HPV 5型、8型和92型与皮肤癌相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统被抑制并且对应地，抗肿瘤应答显著削弱。参见Suresh和Burtness《美国血液学与肿瘤学杂志》13(6):20-27(2017)。在一些实施例中，所述外源抗原是多种多肽的池，所述多种多肽针对相同和或不同抗原引起应答。在一些实施例中，多抗原的池中的抗原不会降低针对多抗原的池中的其它抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV表位以及一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、与其它抗原或与佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述HPV抗原包含HLA-A2特异性表位。在一些实施例中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施例中，所述至少一种抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施例中，所述至少一种抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:18-25中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:1具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括与SEQ ID NO:2具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述HPV抗原包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV抗原是包括SEQID NO:18-25中的任一个的至少一个氨基酸序列的多种抗原。在一些实施例中，所述外源抗原是包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的2、3、4、5、6、7或8个氨基酸序列的多种抗原。在一些实施例中，外源抗原是包括与SEQ ID NO:19具有至少90％相似性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列的多种抗原。在一些实施例中，外源抗原是包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列以及SEQ ID NO:23的氨基酸序列的多种抗原。在一些实施例中，所述多种抗原包含在非共价连接的肽的池内。在一些实施例中，所述多种抗原包含在非共价连接的肽的池内，其中每个肽包括不超过一个抗原。在一些实施例中，所述多种抗原包含在非共价连接的肽的池内，其中SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列包含在单独的肽内。
在一些实施例中，所述HPV抗原是多种多肽的池，所述多种多肽针对相同和或不同HPV抗原引起应答。在一些实施例中，多抗原的池中的抗原不会降低针对多抗原的池中的其它抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV抗原以及一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、与其它抗原或与佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV抗原包含HLA-A2特异性表位。在一些实施例中，所述HPV抗原包含HLA-A11特异性表位。在一些实施例中，HPV抗原包含HLA-B7特异性表位。在一些实施例中，所述HPV抗原包含HLA-C8特异性表位。在一些实施例中，所述HPV抗原包括全长HPV蛋白的部分或全部N末端结构域。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述AAC包括包含多种免疫原性表位的多种HPV抗原。在另外的实施例中，在向个体施用包括包含多种免疫原性表位的多种抗原的AAC之后，所述多种免疫原性表位中没有一个降低所述个体对其它免疫原性表位中的任何免疫原性表位的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位以及一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
佐剂
如本文所使用的，术语“佐剂”可以指直接或间接调节和/或产生免疫应答的物质。在本发明的一些实施例中，佐剂被细胞内递送到无核细胞或无核来源的囊泡的群体，如RBC或RBC来源的囊泡的群体(即，在收缩件加工之前、期间和/或之后，但在施用于个体之前，将细胞或囊泡与佐剂一起温育)，以形成包括佐剂的AAC。在一些情况下，与HPV抗原单独施用相比，佐剂与HPV抗原联合施用，以增强对HPV抗原的免疫应答。因此，佐剂可以用于加强对HPV抗原的免疫细胞应答(例如T细胞应答)的引发。示例性佐剂包含但不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、维甲酸诱导基因I(RIG-I)激动剂以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(imiquimod)(R837)、瑞喹莫德(resiquimod)(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在具体实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN或C类CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂包括选自由以下的组：CpG ODN 1018、CpG ODN1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:30))或CpG ODN 2006(也被称为CpG 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTC GTT(SEQ ID NO:31))寡核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。在一些实施例中，所述RIG-I激动剂包括聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)。多种佐剂也可以与HPV抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，包括HPV抗原的AAC进一步包括多于一种佐剂。多种佐剂也可以与HPV抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，包括HPV抗原的AAC进一步包括多于一种佐剂。在一些实施例中，包括HPV抗原的AAC进一步包括以下佐剂的任何组合：CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
用于生成包括抗原和佐剂的AAC的组合物的收缩件
在一些实施例中，本发明提供了包括包含至少一种抗原和佐剂的AAC的调配物。在一些实施例中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，所述无核细胞对于将接受AAC的组合物的个体是自体的。在一些实施例中，所述无核细胞对于将接受AAC的组合物的个体是自体的。在一些实施例中，所述至少一种HPV抗原被细胞内递送到所述无核细胞。在一些实施例中，所述佐剂被细胞内递送到所述无核细胞。将有效载荷引入到无核细胞的方法是本领域已知的。
在一些实施例中，通过使所述细胞穿过收缩件，将所述HPV抗原引入到所述无核细胞中，使得瞬时孔被引入所述细胞的膜中，由此允许所述HPV抗原进入所述细胞。WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO 2017041050、WO 2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO 2020/072833、WO 2020/154696和WO 2020/176789、US20180142198和US20180201889提供了基于收缩件的将化合物递送到细胞中的实例。
在一些实施例中，通过使包括所述无核细胞(例如，RBC)的细胞悬浮液穿过收缩件，将所述HPV抗原和佐剂递送到所述无核细胞中，以产生本发明的AAC，其中所述收缩件使所述细胞变形，由此使得所述细胞扰动，使得HPV抗原和佐剂进入所述细胞。在一些实施例中，所述收缩件包含在微流体通道内。在一些实施例中，多个收缩件可以在所述微流体通道内并联和/或串联放置。
在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩件包含入口部分、中心点和出口部分。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩件的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩件的宽度是所述无核细胞的直径的函数。确定无核细胞的直径的方法是本领域已知的；例如，高含量成像、细胞计数器或流式细胞术。
在基于收缩件的将HPV抗原递送到无核细胞来源的囊泡的一些实施例中，所述收缩件的宽度为约0.5μm至约10μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约1μm至约4μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约1μm至约3μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约1.5μm至约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约1.2μm至约2.8μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约0.5μm至约5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2μm至约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约1.5μm至约2μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约0.5μm至约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约3.2μm至约3.8μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约3.8μm至约4.3μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一者。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.2μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约3μm。
可能影响将所述化合物递送到所述AAC中的参数的实例包含但不限于收缩件的尺寸、收缩件的进入角度、收缩件的表面性质(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，细胞通过所述收缩件的时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中的化合物的浓度、细胞悬浮液中的缓冲液，并且AAC在通过收缩件之后恢复或温育的时间量可以影响递送的化合物到无核来源的囊泡的通道。影响将所述化合物递送到所述AAC中的另外的参数可以包含输入无核细胞在收缩件中的速度、收缩件中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量以及收缩件中的时间。另外，包括串联和/或并联通道的多个芯片可能影响对无核来源的囊泡的递送。多个芯片并联可能有助于增强吞吐量。这些参数可以被设计以控制化合物的递送。在一些实施例中，细胞浓度的范围为约10至至少约1012个细胞/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约10ng/mL至约1g/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约1pM至至少约2M或其间的任何浓度或浓度范围。
在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度介于约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度为小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一者。在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度为大于约10mM。在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度为介于约0.01μM与约0.1μM之间、介于约0.1μM与约1μM之间、介于约1μM与约10μM之间、介于约10μM与约100μM之间、介于约100μM与约1mM之间或介于1mM与约10mM之间中的任一者。在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度为介于约0.1μM与约1mM之间。在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度为介于约0.1μM与约10μM之间。在一些实施例中，与所述无核细胞或AAC一起温育的HPV抗原的浓度为1μM。
在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为介于约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为少于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一者。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为大于约10mM。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为介于约0.01μM与约0.1μM之间、介于约0.1μM与约1μM之间、介于约1μM与约10μM之间、介于约10μM与约100μM之间、介于约100μM与约1mM之间或介于1mM与约10mM之间中的任一者。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为介于约0.1μM与约1mM之间。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为介于约0.1μM与约10μM之间。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原的浓度为1μM。
在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为介于约10000:1至约1:10000之间中的任一者。例如，在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000中的约任一者。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为介于约10000:1与约1000:1之间、介于约1000:1与约100:1之间、介于约100:1与约10:1之间、介于约10:1与约1:1之间、介于约1:1与约1:10之间、介于约1:10与约1:100之间、介于约1:100与约1:1000之间、介于约1:1000与约1:10000之间中的任一者。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约200:1。在一些实施例中，与所述扰动的输入无核细胞一起温育的抗原与佐剂的摩尔比为约20:1。
在一些实施例中，所述AAC包括浓度为介于约1nM与约1mM之间的佐剂。例如，在一些实施例中，所述AAC包括浓度为少于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一者的佐剂。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为大于约10mM的佐剂。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为介于约1nM至约10nM之间、约0.1μM与约1μM之间、介于约1μM与约10μM之间、介于约10μM与约100μM之间、介于约100μM与约1mM之间或介于1mM与约10mM之间中的任一者的佐剂。在一些实施例中，所述AAC包括浓度介于约0.1μM与约1mM之间的佐剂。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为约1μM的佐剂。
在一些实施例中，所述AAC包括浓度为介于约1nM与约1mM之间的至少一种抗原。例如，在一些实施例中，所述AAC包括浓度为少于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一者的至少一种抗原。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为大于10mM中的约任一者的至少一种抗原。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为介于约1nM至约10nM之间、约0.1μM与约1μM之间、介于约1μM与约10μM之间、介于约10μM与约100μM之间、介于约100μM与约1mM之间或介于1mM与约10mM之间中的任一者的至少一种抗原。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为介于约0.1μM与约1mM之间的至少一种抗原。在一些实施例中，所述AAC包括浓度为约1μM的至少一种抗原。
在一些实施例中，所述AAC中的抗原与佐剂的摩尔比为介于约10000:1至约1:10000中的任一者。例如，在一些实施例中，所述AAC中的抗原与佐剂的摩尔比为10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000中的约任一者。在一些实施例中，修饰的PBMC中的抗原与佐剂的摩尔比为介于约10000:1与约1000:1之间、介于约1000:1与约100:1之间、介于约100:1与约10:1之间、介于约10:1与约1:1之间、介于约1:1与约1:10之间、介于约1:10与约1:100之间、介于约1:100与约1:1000之间、介于约1:1000与约1:10000之间的任一者。在一些实施例中，所述AAC中的抗原与佐剂的摩尔比为约200:1。在一些实施例中，所述AAC中的抗原与佐剂的摩尔比为约20:1。
AAC的特性以及抗原呈递细胞的内化
在根据本文所描述的方法、小瓶或调配物中的任一者的实施例中，AAC在包括以下的方法中生成：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使抗原和佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的输入无核细胞；以及b)将所述经扰动的输入无核细胞与所述至少一种抗原和佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和佐剂进入所述经扰动的输入无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和佐剂的AAC。在一些实施例中，包括有效载荷(如HPV抗原和佐剂)的AAC显示出与输入无核细胞相比不同的特性。在一些实施例中，与包括通过其它递送方法(如溶血上样或电穿孔)引入的有效载荷的无核细胞相比，包括有效载荷(如HPV抗原和佐剂)的无核细胞来源的囊泡显示出不同的特性。
在一些实施例中，与施用于哺乳动物之后的输入无核细胞的半衰期相比，施用于哺乳动物之后的AAC的半衰期减少。在一些实施例中，与输入无核细胞的血红蛋白含量相比，所述AAC的血红蛋白含量减少。在一些实施例中，与输入无核细胞的ATP产生相比，所述AAC的ATP产生减少。在一些实施例中，所述AAC表现出球形形态。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞，并且其中与输入红细胞相比，所述AAC具有减小的双凹形状。在一些实施例中，所述AAC是红细胞宿主。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC在其表面上具有大于多约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC的群体分布在表面上表现出更高的平均磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC的群体分布的至少50％在表面上表现出更高的磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC在组织或细胞中表现出优先摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中表现出优先摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC被修饰以增强组织或细胞中的摄取。在一些实施例中，与未经修饰的无核细胞来源的囊泡相比，AAC被修饰以增强吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。在一些实施例中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包括树突细胞或巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施例中，组织或细胞包括肝或脾中的一种或多种。在一些实施例中，无核细胞来源的囊泡在其表面上包括CD47。
在用于生成AAC的上述方法的一些实施例中，所述收缩件包含在微流体通道内。在一些实施例中，所述微流体通道包括多种收缩件。在一些实施例中，多种收缩件串联和/或并联布置。在一些实施例中，所述收缩件在多种微支柱之间；在阵列中配置的多个微支柱之间；或者在一个或多个可移动板之间。在一些实施例中，所述收缩件是孔或包含在孔内。在一些实施例中，所述孔包含在表面中。在一些实施例中，所述表面是过滤器。在一些实施例中，所述表面是膜。在一些实施例中，所述收缩件大小是悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数。在一些实施例中，所述收缩件大小是悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm或约0.25μm。在一些实施例中，所述收缩件的宽度为约2.2μm。在一些实施例中，所述输入无核细胞在范围为约10psi至约90psi的压力下通过收缩件。在一些实施例中，所述细胞悬浮液在通过所述收缩件之前、同时或之后与所述至少一种抗原接触。
在一些实施例中，其中由输入无核细胞制备包括有效载荷(例如，至少一种HPV抗原和佐剂)的AAC，所述AAC具有以下性质中的一项或多项：(a)与输入无核细胞相比，哺乳动物的循环半衰期减少；(b)与输入无核细胞相比，血红蛋白的水平降低；(c)球形形态；(d)与输入无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加；或(e)与输入无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述输入无核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施例中，所述红细胞(red blood cell)是红细胞(erythrocyte)或网织红细胞。在一些实施例中，所述无核细胞对于将接受组合物的个体是自体的。在一些实施例中，所述无核细胞对于将接受组合物的个体是自体的。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，哺乳动物中的AAC的循环半衰期减少。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，哺乳动物中的循环半衰期减少了超过约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是人细胞，并且其中AAC的循环半衰期小于约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天、约25天、约50天、约75天、约100天、约120天。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞，其中与输入无核细胞相比，AAC中的血红蛋白的水平降低。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC中的血红蛋白的水平降低了至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。在一些实施例中，AAC中的血红蛋白的水平是输入无核细胞中的血红蛋白的水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞，并且其中AAC在形态学上是球形的。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞，并且其中与输入无核细胞相比，所述AAC具有减小的双凹形状。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞或红细胞，并且其中AAC是红细胞影泡(RBC影泡)。
在一些实施例中，所述AAC在其表面上包括CD47。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC在其表面上具有大于多约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC在其表面上具有多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或超过约100％的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC具有减少的ATP产生。在一些实施例中，AAC产生的ATP的水平低于输入无核细胞产生的ATP的水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施例中，AAC不产生ATP。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC在组织或细胞中表现出增强的摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC在肝或脾中或通过吞噬细胞或抗原呈递细胞表现出优先摄取。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，AAC被进一步修饰以增强组织或细胞中的摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞的摄取相比，AAC被进一步修饰以增强在肝或脾中或通过吞噬细胞或抗原呈递细胞的摄取。
在一些实施例中，其中AAC表现出在肝或脾中或通过吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，AAC的内化导致吞噬细胞或抗原呈递细胞的成熟标志物的表达增加。在一些实施例中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞是单核细胞来源的树突细胞(MODC)。在一些实施例中，所述成熟标志物是CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种。在一些实施例中，和未与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，和与输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
在一些实施例中，其中包括HPV抗原或HPV抗原和佐剂的AAC表现出在肝或脾中或通过吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，AAC的内化导致无核细胞来源的囊泡内包括的HPV抗原的呈递增加。在一些实施例中，与和包括通过其它递送方法(如但不限于溶血上样)引入的相同HPV抗原的对应无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，HPV抗原的呈递增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
在一些实施例中，其中包括HPV抗原或HPV抗原和佐剂的AAC表现出在肝或脾中或通过吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，AAC的内化导致吞噬细胞和/或抗原呈递细胞诱导抗原特异性免疫应答的能力增加。在一些实施例中，和与输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，由与包括HPV抗原或HPV抗原和佐剂的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞所介导的抗原特异性免疫应答增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，与和包括通过其它递送方法(如但不限于溶血上样)引入的相同HPV抗原的无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，由与包括HPV抗原或HPV抗原和佐剂的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞所介导的抗原特异性免疫应答增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，所述抗原特异性免疫应答是抗原特异性CD4+T细胞应答。在一些实施例中，所述抗原特异性免疫应答是抗原特异性CD8+T细胞应答。
在一些实施例中，所述个体对HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08和/或HLA-C*16呈阳性。
在根据本文所述的方法、组合物或用途中的任一者的一些实施例中，吞噬细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08和/或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，抗原呈递细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*08的单倍型的人细胞。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原包含HLA-A2特异性表位。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原包含HLA-A11特异性表位。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原包含HLA-B7特异性表位。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原包含HLA-C8特异性表位。
在一些实施例中，所述方法包括向个体施用包括HPV抗原和佐剂的AAC，其中AAC通过吞噬细胞和/或抗原呈递细胞内化。在一些实施例中，其中AAC通过吞噬细胞和/或抗原呈递细胞内化，AAC的内化导致吞噬细胞或抗原呈递细胞的成熟标志物的表达增加。在一些实施例中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞是单核细胞来源的树突细胞(MODC)。在一些实施例中，所述成熟标志物是CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种。在一些实施例中，和未与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，和与输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
在一些实施例中，在制备无核细胞来源的囊泡期间，输入无核细胞没有(a)热加工，(b)化学处理，和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施例中，在由输入无核细胞制备AAC的期间，维持渗透压。在一些实施例中，渗透压维持在介于约200mOsm与约600mOsm之间。在一些实施例中，渗透压维持在介于约200mOsm与约400mOsm之间。
系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了一种系统，其包括用于本文所公开的方法的收缩件、无核细胞悬浮液、抗原或佐剂中的一种或多种。所述系统可以包含针对上文所公开的方法描述的任何实施例，包含微流体通道或具有孔的表面，以提供细胞变形收缩件、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在一些实施例中，细胞变形收缩件的大小适于递送到无核细胞。在一些实施例中，优化递送参数，如操作流速、细胞和化合物浓度、收缩件中的细胞的速度和细胞悬浮液的组成(例如，渗透压、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)用于压制免疫应答或诱导耐受性的化合物的最大应答。
还提供了用于治疗患有与HPV相关的癌症的个体的试剂盒或制品。在一些实施例中，所述试剂盒包括包含细胞内抗原和细胞内佐剂的AAC。在一些实施例中，所述试剂盒包括用于生成用于治疗患有与HPV相关的疾病(如癌症)的个体的AAC的收缩件、无核细胞悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种。在一些实施例中，所述试剂盒包括在合适包装中的本文所描述的组合物(例如含有孔、细胞悬浮液和/或化合物的微流体通道或表面)。合适包装材料在本领域中是已知的，并且包含例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。这些制品可以被进一步灭菌和/或密封。
本发明还提供了包括本文所描述的方法的组分的试剂盒并且可以进一步包括用于实施治疗患有与HPV相关的癌症的个体的所述方法的说明书和/或用于将HPV抗原和佐剂引入到无核细胞中的说明书。本文所描述的试剂盒可以进一步包含其它材料，包含其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和用于执行本文所描述的任何方法的说明的包装插页；例如，用于治疗患有与HPV相关的癌症的个体的说明书或用于生成AAC以含有细胞内HPV抗原和细胞内佐剂的说明书。
示例性实施例
实施例1.一种药物调配物，其包括活化抗原载体(AAC)，所述调配物包括：
a)AAC，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，以及
b)冷冻保存培养基。
实施例2.根据实施例1所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC。
实施例3.根据实施例1或2所述的药物调配物，其中所述调配物包括约7×109个AAC。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。
实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个AAC。
实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的药物调配物，其中所述AAC的群体中至少约70％、80％、90％或95％的AAC是功能性的。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的药物调配物，其中所述药物调配物中的所述AAC维持等于或大于约70％的功能性。
实施例12.根据实施例1或2中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约1×108个功能性AAC/mL至约1×109个功能性AAC/mL。
实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的药物调配物，其中所述AAC的群体中至少约70％、80％、90％或95％的AAC对膜联蛋白染色呈阳性。
实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物中的所述AAC对膜联蛋白维持等于或大于约70％的阳性染色。
实施例15.根据实施例13或14所述的药物调配物，其中所述膜联蛋白是膜联蛋白V。
实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基包括二甲亚砜(DMSO)。
实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％的DMSO。
实施例18.根据实施例1至17中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基包括约2％的DMSO。
实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基是CS2。
实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物的pH为约6.0至约8.5。
实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物的pH为约7.6。
实施例22.一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
实施例23.一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
实施例24.根据实施例22或23所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。
实施例25.根据实施例22至25中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。
实施例26.根据实施例22至25中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
实施例27.根据实施例22至26中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例28.根据实施例22至27中任一项所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例29.根据实施例22至28中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
实施例30.一种AAC的药物调配物，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
实施例31.根据实施例22至30中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基是CS2。
实施例32.根据实施例1至31中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物是无菌的。
实施例33.根据实施例1至32中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括少于约2EU/mL的内毒素。
实施例34.根据实施例1至33中任一项所述的调配物，其中所述调配物不含支原体。
实施例35.根据实施例1至34中任一项所述的调配物，其中所述至少一种抗原是人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
实施例36.根据实施例35所述的调配物，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施例37.根据实施例35或36所述的调配物，其中所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。
实施例38.根据实施例35至37中任一项所述的调配物，其中所述抗原包括源自HPVE6的肽和源自HPV E7的肽。
实施例39.根据实施例35至38中任一项所述的调配物，其中所述抗原包括SEQ IDNO:1-4中的任一个的氨基酸序列。
实施例40.根据实施例35至39中任一项所述的调配物，其中所述抗原包括SEQ IDNO:18-25中的任一个的氨基酸序列。
实施例41.根据实施例35至40中任一项所述的调配物，其中所述AAC包括包含SEQID NO:19的氨基酸序列的抗原和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。
实施例42.根据实施例1至41中任一项所述的调配物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、Poly I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。
实施例43.根据实施例42所述的调配物，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
实施例44.根据实施例1至43中任一项所述的调配物，其中包括所述至少一种抗原和佐剂的所述AAC是通过包括以下的方法制备的：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及
b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC。
实施例45.根据实施例44所述的方法，其中所述收缩件的所述直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
实施例46.根据实施例44或45所述的方法，其中所述输入无核细胞是红细胞。
实施例47.一种小瓶，其包括实施例1至46中任一项的药物调配物。
实施例48.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH 8.5。
实施例49.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
实施例50.根据实施例48或49所述的小瓶，其中在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。
实施例51.根据实施例48至50中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。
实施例52.根据实施例48至51中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
实施例53.根据实施例48至52中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例54.根据实施例48至53中任一项所述的小瓶，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例55.根据实施例48至54中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
实施例56.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
实施例57.根据实施例48至56或39中任一项所述的小瓶，其中所述AAC位于约9.5mL所述冷冻保存培养基中。
实施例58.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
实施例59.根据实施例47至58中任一项所述的小瓶，其中所述调配物是无菌的。
实施例60.一种产生AAC的药物调配物的方法，所述方法包括将冷冻保存培养基添加到所述AAC中，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂。
实施例61.一种产生AAC的药物调配物的方法，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，所述方法包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及
b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC；
c)洗涤所述AAC；以及
d)将所述AAC调配在冷冻保存培养基中。
实施例62.根据实施例61所述的方法，其中所述收缩件的所述直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
实施例63.根据实施例61或62所述的方法，其中所述AAC被洗涤约6次。
实施例64.根据实施例61至63中任一项所述的方法，其中所述AAC是通过离心和重悬或通过离心和过滤洗涤的。
实施例65.根据实施例64所述的方法，其中所述离心以约4000rpm进行。
实施例66.根据实施例61至65中任一项的方法，其中将约1×109个AAC至约1×1010个AAC调配在约9mL至约10mL所述冷冻保存培养基中。
实施例67.根据实施例66所述的方法，其中在冷冻之前，所述药物调配物包括约7×109个AAC。
实施例68.根据实施例66或67所述的方法，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。
实施例69.根据实施例66至68中任一项所述的方法，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
实施例70.根据实施例66至69中任一项所述的方法，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例71.根据实施例66至70中任一项所述的方法，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
实施例72.根据实施例66至71中任一项所述的方法，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
实施例73根据实施例66至72中任一项所述的方法，其中约7×109个AAC调配在约10mL所述冷冻保存培养基中。
实施例74.根据实施例66至73中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存培养基是CS2。
实施例75.根据实施例61至74中任一项所述的方法，其中所述输入无核细胞是红细胞。
实施例75.根据实施例60至75中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在约-170℃下冷冻所述AAC的调配物。
实施例76.根据实施例75所述的方法，其中所述AAC的调配物是通过包括以下的方法冷冻的：
a)将所述调配物放置在室中；
b)将所述室的温度降低至约-3℃；
c)以约-20℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-140℃；
d)以约1.5℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-150℃；
e)以约1.0℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-170℃；以及
f)将所述室的温度保持处于约-170℃，持续至少约10分钟。
实例
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内若干个实施例是可能的。将参考以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实例进一步说明了本发明，但是当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
实例1：AAC-HPV的开发
对于AAC-HPV原料药制备过程的开发，使用从健康供体收集的全血执行过程开发研究，并且在冷藏条件(2-8℃)下隔夜运输到制造商。
全血稀释
收到制备房间内的血袋后，对照制备批次记录验证了起始材料信息。将样品从血袋无菌地取出，并且通过血液学分析仪获得全血细胞计数(CBC)测量，其仅供参考，以及使用基于库尔特的细胞计数器获得的RBC计数，其中RBC总数的暂定标准为≥5×1011总RBC。
在样品采集后，用RPMI+5％DMSO(稀释培养基)稀释起始全血，以降低细胞浓度，用于在LOVO细胞洗涤系统上进行加工。稀释培养基含有5％DMSO，与本单元操作下游的递送过程中使用的SLP和佐剂溶解所需的培养基相似。
LOVO细胞洗涤前的全血稀释比
进行全血稀释比的评估。出于此评价的目的，用稀释培养基以不同比率稀释从若干健康供体收集的全血，并在LOVO上处理。本评价使用设备供应商(费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi))推荐的用于血小板清除的LOVO参数。在细胞洗涤后，评估收集的产品的细胞计数，并计算RBC的逐步恢复。表1中示出了来自不同全血稀释比评价的RBC回收结果。所示的测量是使用血液学分析仪从基于库尔特的细胞计数器或全血计数获得的。
表1：全血稀释比评价结果
如表1所示，1:3至1:9的稀释比都显示了在LOVO过程中相似的RBC回收率。对于SQZ-AAC-HPV过程，预期的患者起始材料(全血，包含抗凝血剂)体积为260至270mL，并且实施1L的设定稀释培养基体积以简化制备过程。表2中示出了全血稀释步骤的最终参数。在全血稀释后，将中间产物重力过滤通过无菌一次性40μm血液过滤器以去除任何潜在的细胞聚集体。
表2：全血稀释参数
稀释培养基 稀释体积(ml) 预期全血体积(mL)
RPMI+5％DMSO 1000 大约200a
a患者起始材料将包含大约另外60-70mL的抗凝血剂，总预期体积为260-270mL
RBC纯化和肽+佐剂引入
从稀释的血液袋中无菌地抽取样品，并采集RBC计数。然后在LOVO细胞洗涤系统上处理稀释的血液，其中在含5％DMSO的RPMI 1640培养基(被称为递送培养基)中用50μM E6SLP、250μM E7 SLP和1.5mg/mL poly I:C的除菌过滤混合物洗涤细胞以去除血小板。在血小板去除后，使用LOVO系统用递送培养基将细胞重悬。在用递送培养基培养基重悬之后，将过程中的材料通过白血球去除过滤器进行无菌处理，其中去除了WBC，导致递送培养基中的纯化RBC悬浮液。然后评估纯化细胞悬浮液的RBC计数和捕获WBC和血小板的全血计数(FIO)。所有加工均在环境条件下进行。
RBC纯化-血小板去除和肽+佐剂引入
在全血稀释后，将RBC在环境条件下使用LOVO系统洗涤并用递送培养基重悬。LOVO系统利用一次性LOVO试剂盒，所述LOVO试剂盒由4μm自旋膜组成，从而使得去除血小板，同时使RBC的回收最大化。使用可变的入口和出口流速，LOVO系统允许洗涤和浓缩细胞。在用于用递送培养基洗涤并重悬RBC的LOVO系统上使用的加工参数由设备供应商(费森尤斯卡比公司)提供。在开发活动期间评价了供应商提供的推荐参数。
在从7个不同的健康供体进行的LOVO过程中进行血小板去除和RBC回收率的评估。单元操作证实，平均RBC回收率为89.12±5.75％，并且平均血小板去除为74.56±10.52％，如图1所示。表3中提供了用于血小板去除的LOVO加工参数。
表3：洗涤和SLP和佐剂引入的LOVO加工参数
RBC纯化-白血球去除(WBC去除)
在将RBC洗涤并重悬到递送培养基中之后，将中间产物在环境条件下通过无菌的一次性白血球去除过滤组件进行过滤。过滤组件由白血球去除过滤器(LRF)、40μm血液过滤器和组装成管线的18μm血液过滤器组成。白血球去除-过滤组件允许去除WBC以及任何潜在的细胞聚集体。已经注意到，白血球去除过滤器还以非特异性方式去除血小板。初始试验运行，其中白血球去除过滤步骤尝试在进行其它处理之前对传入的供体全血进行白血球去除，但是观察到过滤时间持续时间长令人望而却步。最终确定在LOVO上发生初始RBC纯化后，进行白血球去除步骤最合适，从而将过滤时间减少至<5分钟。
图2示出了在RBC纯化步骤上n＝11次运行的RBC、血小板和WBC的平均总回收率，所述RBC纯化步骤涵盖用LOVO上的递送培养基进行细胞洗涤和重悬并且经由白血球去除过滤器进行纯化。数据证实了在随后的加工步骤中，在用于肽和佐剂递送的制备中合适的RBC纯化。
肽(E6和E7 SLP)和佐剂(Poly I:C)递送
具有2.2μm收缩件的微流体芯片被用于开发RBC递送过程。选择微流体芯片以与临床前研究期间使用的芯片收缩件宽度对准。需要注意的是，在交付步骤之前，AAC-HPV制备期间，过程中剩余的少量的残余WBC不会堵塞芯片(参见图2)。
用荧光标记的卵清蛋白(卵清蛋白647)作为替代递送材料进行初步研究以鉴定合适的递送参数。一旦建立了初始设计空间，就用荧光标记的E6和E7 SLP(FAM-E6和FAM-E7)进行验证研究。Poly I:C也被用作递送材料，但在这些研究中未测量，因为荧光标记的PolyI:C不可用。
E6 SLP:QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL(SEQ ID NO:19)
E7 SLP:QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL(SEQ ID NO:23)
用卵清蛋白647进行初步递送评价
基于临床前研究规模的递送研究，目标操作温度为2-8℃。使用流式细胞术分析使用卵清蛋白647的RBC递送，以测量每项研究的卵清蛋白647和膜联蛋白V+表型(膜外叶上的磷脂酰丝氨酸的量度)的细胞递送。
压力评价和微流体芯片配置
进行了操作压力和微流体芯片配置研究，以在不同操作压力下评价卵清蛋白647递送和膜联蛋白V阳性，并利用并联布置的不同数量的2.2μm收缩件芯片。研究评价了相同芯片类型(1个芯片、2x芯片并联、4x芯片并联)和两种操作压力(60psi、75psi)的三种离散芯片配置。
图3示出了与在60psi操作压力下执行的研究组相比，在75psi操作压力下执行的研究组中膜联蛋白V+群体的增加。另外，在测试的所有三种芯片配置中，在75psi操作压力下用卵清蛋白647递送的群体显示出最一致的结果(>90％的递送)。作为此评价的结果，选择75psi的操作压力和4x芯片配置以使细胞内递送和递送过程的吞吐量最大化。
细胞浓度评价
由于来自每个供体的可变传入红细胞计数，因此对于肽和佐剂递送过程，预期存在一系列细胞浓度。进行各种细胞浓度的评价。各种浓度下的红细胞用卵清蛋白647作为递送材料在75psi操作压力下通过4x芯片并联检测进行处理，并被分析用于递送。
图4结果示出了，使用先前选择的操作参数的递送在范围为0.5×109至4.0×109个RBC/mL的细胞浓度内保持一致。作为此评价的结果，针对所测试的细胞浓度建立了用SLP和佐剂进行RBC递送的操作范围。SQZ-AAC-HPV制备过程中的细胞浓度预期落入所测试的范围内。
用标记的肽(FAM-E6和FAM-E7 SLP)和Poly I:C含量进行递送评价
在使用卵清蛋白647的初步研究之后，使用FAM标记的E6和E7 SLP和非标记的PolyI:C进行确认研究。使用递送参数(4x芯片配置，75psi，2-8℃)进行研究。
图5示出了FAM-E6 SLP和FAM-E7 SLP分别被递送到>88％和>96％的群体的％。
减少肽(E6和E7 SLP)和佐剂(Poly I:C)递送的操作压力
使用与以70psi递送的FAM标记的E7肽相同的供体全血进行两项研究，以75psi对照进行比较递送。图6中示出了结果。
这些实验的结果证实，70psi的较低操作压力导致与75psi操作压力等同的FAM-E7递送。作为此评价的结果，肽和佐剂的递送的目标操作压力改变为70psi。
表4中示出了所选的最终递送参数。
表4：递送过程参数
目标操作压力 目标操作温度 微流体芯片配置
70psi 2-8℃ 4x2.2μm收缩件芯片并联
在递送过程参数的开发完成后，从SQZ-AAC-HPV药物产品小瓶中测量Poly I:C含量。表5中示出了代表性批次的结果。
表5：代表性全流程运行内的Poly I:C含量
产品静置(37℃温育)
在肽和佐剂递送过程的30分钟环境静置步骤之后，稀释AAC，并且然后通过在37℃置于温育箱内部的摇床上进一步静置持续2小时。为了确定这些参数，进行了静置时间和静置前稀释体积的评价。
执行比较1小时和2小时静置时间的研究，并将休息与经稀释的AAC(用RPMI培养基稀释)和未经稀释的AAC进行比较。这些研究测量了静置期内的逐步回收率和最终药物产品中AAC的群体％。这些评价的结果示出了，与1小时静置相比，当AAC静置2小时时，回收率改善。
用经稀释的相对于未经稀释的AAC的产品静置进行另外的评价。评价了来自每个研究条件的各药物产品的功能性应答。
图7中报告的数据示出，与在所述过程中静置的未经稀释的AAC相比，当经稀释的AAC静置时具有显著更高的分泌的IFN-γ水平。基于此评价，将37℃静置之前递送的AAC的1L稀释实施到制备过程中。
在n＝15个研究中，在产品静置步骤内的平均AAC回收率分析为93.6％。此数据证实，用被评价并实施用于温育的参数的实现了高AAC回收率(表6)。
表6：产品静置参数
稀释培养基 稀释体积 温育时间 温育温度
RPMI 1L 120±10分钟 37±1℃
用于临床制备的AAC-HPV原料药计数
由于连续加工，需要AAC-HPV原料药的最小过程中保持时间。为了实现这一点，在产品静置步骤之前，从过程中AAC获得样品。在2小时静置期间，分析样品，并且用0.9的校正因子测量的计数被用于计算最终AAC-HPV原料药中的总AAC。考虑到开发期间观察到的93.7％(四舍五入到90％)的平均温育逐步回收率，建立了0.9校正因子。
静置后，将递送的AAC通过无菌一次性40μm血液过滤器进行重力过滤。在40μm过滤后，将原料药洗涤并使用LOVO交换到最终调配培养基中。
全血保持时间
全血保持时间定义为全血采集的结束时间(即，患者采血结束)到全血稀释开始(制备开始)。全血保持时间的初始评价在2-8℃下用36和50小时的保持时间进行。研究由以下组成：将一个健康供体血液单元分离，并在对照组的1天保持(大约24小时)后使用一半以产生SQZ-AAC-HPV，并且在36或50小时保持后使用另一半。分析所得SQZ-AAC-HPV药物产品的功能性应答。使用保持时间(36或50小时)由陈旧全血制成的产品在测定和过程变异性内引发类似于对照的功能性应答(24小时)的功能性应答。作为保守方法，实施36小时作为患者起始材料的全血保持时间。随着生成更多数据以支持更长的保持时间，此保持时间可以延长。
实例2：药物产品调配
药物产品SQZ-AAC-HPV通过在CS2中调配AAC-HPV原料药进行制备，以靶向7.0×108个AAC/mL的浓度(如使用基于库尔特的细胞计数器(Moxi GO II)进行分析)，考虑了调配步骤期间的AAC损失，并灌装到小瓶中。小瓶使用室温度≤-170℃的速率受控的冷冻机进行冷冻保存，并且小瓶在产生、储存和运输期间达到并维持≤-140℃的温度。
解冻后的AAC回收率确认此冷冻保存培养基合适用于SQZ-AAC-HPV药物产品。
进行以下评价以开发药物产品调配过程。
用于药物产品调配的LOVO系统参数的验证
在设备供应商(费森尤斯卡比公司)的指导下，开发了初始LOVO方案(方案1)。本方案旨在实现99.97％的过程内的高理论洗脱(即缓冲液培养基交换)。这通过创建如以下公式给出的最大出口包装细胞体积(出口PCV)来实现：
出口PCV＝(入口流速÷出口流速)x入口PCV。
下表7中列出了LOVO方案1参数。
表7：用于最终药物产品调配的LOVO方案1加工参数
在评价用来自8个供体的材料进行n＝13次实验的方案1之后，观察到的平均逐步回收率为42.4％，如图8中所示。调配步骤内观察到的低回收率显著影响了制备过程产率。由于回收率低，评价了第二LOVO方案，目的是增加制备过程产率。
对于方案2，调整LOVO加工参数以靶向所有6个洗涤循环中36％的较低最大出口PCV，以改善回收率，同时保持99.96％的高理论洗脱。LOVO方案2参数可见于下表8。所述方案在用来自8个不同供体的材料进行的n＝10次实验中实施，并且平均AAC回收率增加到了74.5％，如图8中所示。由于改善的回收率，方案2被选择用于SQZ-AAC-HPV的临床制备。
表8：用于最终药物产品调配的LOVO方案2加工参数
将LOVO加工参数最终确定为表8中所示的那些，并且在全尺度过程开发研究期间使用，结果在图9中示出。这些结果证实，在最终调配下7×108个AAC/mL的目标浓度可用这些LOVO参数实现。
小瓶灌装、检查和标签
在生物安全柜内进行小瓶灌装。小瓶以无菌方式供应，完全加塞，随时可以使用。对于灌装，每小瓶灌装9.98g±5％的产品(即9.5mL，这允许8.9mL的可提取体积)。灌装后，将每个小瓶密封，检查重量，并且随后加盖。一旦完成小瓶灌装，就使用配备亮黑白色背景的检查室，目视检查每个灌装小瓶是否有任何可见缺陷(包含大团块或聚集体)。随后，用冷冻标记对每个小瓶进行标记。
对灌装过程进行了过程性能能力(Ppk)评价。技术转移批次中实现的最小灌装Ppk为4.66，从而表明灌装过程稳健并处于控制中。表9中提供了此分析的结果。
表9：灌装Ppk
1Ppk＝以下的最小值：(USL-平均值)/3*σ)或(平均值-LSL)/(3*σ)
2总灌装小瓶为62瓶，1瓶因可见颗粒而被拒收
冷冻保存和储存
将含有标记的SQZ-AAC-HPV小瓶的二级储存箱上料到速率受控的冷冻机内的支架上，并且随后冷冻保存到≤140℃的产品温度。冷冻保存后，将小瓶提供给QC用于释放、表征、稳定性测试，并保留并放置在等温LN2储罐中用于长期储存。将剩余的冷冻保存小瓶保存在标记的二级储存箱中，并放置在等温LN2储罐中用于长期储存。
使用了具有34L室容量和定制冷冻保存方案的速率受控的冷冻机，以冷冻保存SQZ-AAC-HPV药物产品。定制冷冻曲线已被设计以控制在药物产品的成核期间释放的潜在热量。药物产品中的冰核在大约-5℃下开始。为了控制在药物产品成核期间释放的潜在热量，必须在产品温度达到成核点(-5℃)之前开始室的快速冷却。在SQZ-AAC-HPV的冷冻保存期间，在产品温度达到略微高于成核点(-5℃)的-3℃之后，以-20℃/分钟的冷却速率将室温度快速冷却至-140℃。随后，以-1.5℃/分钟的冷却速率将产品冷却至-150℃。一旦产品温度达到-150℃，就以-1℃/分钟的冷却速率将室冷却至-170℃，并且然后在-170℃下保持10分钟。建立了64个小瓶的最大室上样，用于冷冻保存SQZ-AAC-HPV，其中一个小瓶被用于产品温度监测。表10中示出了冷冻保存方案的详细信息。图10和11中示出了由冷冻保存方案产生的室和产品温度曲线。
表10：用于AAC冷冻保存的速率受控的冷冻机方案
步骤 方案参数
1 以-2℃/分钟将室温度降低至0℃
2 保持室在0℃下持续10分钟
3 以-1℃/分钟将产品温度降低至-3℃
4 以-20℃/分钟将室温度降低至-140℃
5 保持室在-140℃下持续10分钟
6 以-1.5℃/分钟将产品温度降低至-150℃
7 以-1℃/分钟将室温度降低至-170℃
8 保持室在-170℃下持续10分钟
9 结束
图10示出了使用所开发的方案进行冷冻保存的48瓶SQZ-AAC-HPV的代表性上样。如上述产品温度迹线所示，在冷冻室内的不同位置处冷冻保存的SQZ-AAC-HPV在相似的时间经历成核，并且在循环完成之前达到最终产品温度≤-140℃。代表性室上样的总冷冻保存循环时间为大约100分钟。
图11示出了使用双支架配置冷冻保存的64瓶SQZ-AAC-HPV的最大上样。如图10和11所示，放置在冷冻室内的不同位置处的两个支架中的SQZ-AAC-HPV在相似的时间经历成核，并且在循环完成之前达到最终产品温度≤-140℃。最大室上样的总冷冻保存循环时间为大约95分钟。
基于两个室上样的温度曲线，所开发的方案显示，在至多最大64个小瓶的所有小瓶上样中可实现一致的曲线。
解冻后AAC恢复
为了评估AAC在冷冻保存后的稳定性和回收率，将药物产品解冻并使用流式细胞术测试AAC计数。应注意，与基于库尔特的计数相反，使用流式细胞术分析解冻后观察到的AAC浓度增加，从而导致与制备过程中数据相比，释放时每小瓶的AAC含量更高。基于库尔特的细胞计数仪Moxi GO II用于在制备期间计数过程中AAC样品。与之相反，流式细胞术方法用于在SQZ-AAC-HPV药物产品的QC释放期间鉴定和计数AAC(CD235a+膜联蛋白V+)。使用不太灵敏的Moxi GO II计数器进行的过程中AAC样品分析相对于使用流式细胞术方法的SQZ-AAC-HPV的对应解冻后测量的测量结果具有负偏差。
在最终药物产品配制步骤期间的目标浓度为7.0×108个AAC/mL，并且使用MoxiGO II的n＝5个过程开发批次的过程中计数平均为7.36×108个AAC/mL(参见图9)。
图12中示出的数据报告了来自n＝5个过程开发批次的解冻后计数。这5个批次内的平均AAC计数为1.03x109个AAC/mL，从而表明CS2赋形剂中通过冷冻-解冻循环的AAC回收率符合1.0x109个AAC/mL的预期解冻后目标浓度。解冻后计数与这些结果一致(表11)。
表11
a总体过程回收率＝100％x(灌装小瓶x解冻后AAC计数x 9.5mL)/全血起始RBC计数。
b通过血液学分析仪测量。
c通过流式细胞术方法测量
基于从全血到药物产品的平均过程回收率(61.8％)，估计全血中的暂时最小RBC，即5.0x1011个总细胞将产生32瓶SQZ-AAC-HPV(全血中的5.0x1011个RBC×61.8％平均过程回收率/9.5×109个目标AAC/药物产品小瓶)。
序列
/>
/>
序列表
<110> SQZ生物技术公司
<120> 活化抗原载体的调配物
<130> 75032-20034.40
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> US 63/131,457
<151> 2020-12-29
<160> 50
<170> Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 1
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 2
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 3
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 4
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 5
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 6
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 7
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 8
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 9
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 10
Gly Gln Ala Glu Pro Asp
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 11
Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 12
Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 13
Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 14
Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 15
Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 16
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 17
Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 18
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
Asp Phe Ala Phe
35
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu
1 5 10 15
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 21
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala
1 5 10 15
Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val
20 25 30
Ser Asp Lys
35
<210> 22
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 24
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29
<210> 38
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 39
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
20 25 30
Ile Val Thr
35
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
1 5 10 15
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
20 25
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
20 25
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
1 5 10 15
His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30

Claims (77)

1.一种药物调配物，其包括活化抗原载体(AAC)，所述调配物包括：
a)AAC，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，以及
b)冷冻保存培养基。
2.根据权利要求1所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC。
3.根据权利要求1或2所述的药物调配物，其中所述调配物包括约7×109个AAC。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个AAC。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物调配物，其中所述AAC的群体中至少约70％、80％、90％或95％的AAC是功能性的。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物中的所述AAC维持等于或大于约70％的功能性。
12.根据权利要求1或2中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约1×108个功能性AAC/mL至约1×109个功能性AAC/mL。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物调配物，其中所述AAC的群体中至少约70％、80％、90％或95％的AAC对膜联蛋白染色呈阳性。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物中的所述AAC对膜联蛋白维持等于或大于约70％的阳性染色。
15.根据权利要求13或14所述的药物调配物，其中所述膜联蛋白是膜联蛋白V。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基包括二甲亚砜(DMSO)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基包括约0.5％至约5％的DMSO。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基包括约2％的DMSO。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基是CS2。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物的pH为约6.0至约8.5。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物的pH为约7.6。
22.一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 6.0至约pH8.5。
23.一种AAC的药物调配物，所述调配物包括冷冻保存培养基中的约0.5×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
24.根据权利要求22或23所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的药物调配物，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
30.一种AAC的药物调配物，所述调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
31.根据权利要求22至30中任一项所述的药物调配物，其中所述冷冻保存培养基是CS2。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物是无菌的。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的药物调配物，其中所述调配物包括少于约2EU/mL的内毒素。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的调配物，其中所述调配物不含支原体。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的调配物，其中所述至少一种抗原是人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
36.根据权利要求35所述的调配物，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
37.根据权利要求35或36所述的调配物，其中所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的调配物，其中所述抗原包括源自HPV E6的肽和源自HPV E7的肽。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的调配物，其中所述抗原包括SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的调配物，其中所述抗原包括SEQ ID NO:18-25中的任一个的氨基酸序列。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的调配物，其中所述AAC包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的调配物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、poly I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。
43.根据权利要求42所述的调配物，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的调配物，其中包括所述至少一种抗原和佐剂的所述AAC是通过包括以下的方法制备的：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及
b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述收缩件的所述直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述输入无核细胞是红细胞。
47.一种小瓶，其包括权利要求1至46中任一项的药物调配物。
48.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH6.0至约pH 8.5。
49.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括冷冻保存培养基中的约1×109个AAC至约1×1010个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，其中所述调配物的pH为约pH7.6。
50.根据权利要求48或49所述的小瓶，其中在冷冻之前，所述调配物包括约7×109个AAC。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
54.根据权利要求48至53中任一项所述的小瓶，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
55.根据权利要求48至54中任一项所述的小瓶，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
56.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
57.根据权利要求48至56或39中任一项所述的小瓶，其中所述AAC位于约9.5mL所述冷冻保存培养基中。
58.一种小瓶，其包括药物调配物，所述药物调配物包括约9.5mL冷冻保存培养基中的约7×109个AAC，其中AAC包括至少一种抗原和佐剂，并且其中所述调配物的pH为约pH 7.6。
59.根据权利要求47至58中任一项所述的小瓶，其中所述调配物是无菌的。
60.一种产生AAC的药物调配物的方法，所述方法包括将冷冻保存培养基添加到所述AAC中，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂。
61.一种产生AAC的药物调配物的方法，其中所述AAC包括至少一种抗原和佐剂，所述方法包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液穿过细胞变形收缩件，其中所述收缩件的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此对所述输入无核细胞引起大到足以使所述至少一种抗原和所述佐剂穿过的扰动，以形成经扰动的无核细胞；以及
b)将所述经扰动的无核细胞与所述至少一种抗原和所述佐剂一起温育足以允许所述至少一种抗原和所述佐剂进入所述经扰动的无核细胞的时间，由此生成包括所述至少一种抗原和所述佐剂的所述AAC；
c)洗涤所述AAC；以及
d)将所述AAC调配在冷冻保存培养基中。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述收缩件的所述直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述AAC被洗涤约6次。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述AAC是通过离心和重悬或通过离心和过滤洗涤的。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述离心以约4000rpm进行。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的方法，其中约1×109个AAC至约1×1010个AAC调配在约9mL至约10mL所述冷冻保存培养基中。
67.根据权利要求66所述的方法，其中在冷冻之前，所述药物调配物包括约7×109个AAC。
68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约9×109个细胞。
69.根据权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述调配物包括约0.5×109个AAC/mL至约1×109个AAC/mL。
70.根据权利要求66至69中任一项所述的方法，其中所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
71.根据权利要求66至70中任一项所述的方法，其中在冷冻之前，所述调配物包括约0.7×109个AAC/mL。
72.根据权利要求66至71中任一项所述的方法，其中所述调配物包括先前冷冻的AAC，其中在解冻之后，所述调配物包括约1×109个AAC/mL。
73.根据权利要求66至72中任一项所述的方法，其中约7×109个AAC调配在约10mL所述冷冻保存培养基中。
74.根据权利要求66至73中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存培养基是CS2。
75.根据权利要求61至74中任一项所述的方法，其中所述输入无核细胞是红细胞。
76.根据权利要求60至75中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在约-170℃下冷冻所述AAC的调配物。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述AAC的调配物是通过包括以下的方法冷冻的：
a)将所述调配物放置在室中；
b)将所述室的温度降低至约-3℃；
c)以约-20℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-140℃；
d)以约-1.5℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-150℃；
e)以约-1.0℃/分钟的速率将所述室的温度降低至约-170℃；以及
f)将所述室的温度保持处于约-170℃，持续至少约10分钟。
CN202180094095.6A 2020-12-29 2021-12-28 活化抗原载体的调配物 Pending CN116847880A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063131457P 2020-12-29 2020-12-29
US63/131,457 2020-12-29
PCT/US2021/073142 WO2022147442A1 (en) 2020-12-29 2021-12-28 Formulations of activating antigen carriers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116847880A true CN116847880A (zh) 2023-10-03

Family

ID=80123528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180094095.6A Pending CN116847880A (zh) 2020-12-29 2021-12-28 活化抗原载体的调配物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220233676A1 (zh)
EP (1) EP4271407A1 (zh)
JP (1) JP2024503277A (zh)
CN (1) CN116847880A (zh)
CA (1) CA3203709A1 (zh)
WO (1) WO2022147442A1 (zh)

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005072523A2 (en) * 2004-02-02 2005-08-11 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Biological material and methods and solutions for preservation thereof
RS59898B1 (sr) 2011-10-17 2020-03-31 Massachusetts Inst Technology Intraćelijsko davanje
JP6502940B2 (ja) 2013-08-16 2019-04-17 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 細胞への物質の選択的送達
AU2015241422B2 (en) * 2014-04-01 2020-12-03 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
SG10201903912XA (en) 2014-10-31 2019-05-30 Massachusetts Inst Technology Delivery of biomolecules to immune cells
AU2016289530B2 (en) 2015-07-09 2021-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of materials to anucleate cells
EP3344747B1 (en) 2015-09-04 2022-11-09 SQZ Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules mediated by a surface with pores
AU2017259988B2 (en) 2016-05-03 2023-04-27 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance
CA3023092A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance
SG11202008863XA (en) 2018-03-12 2020-10-29 Sqz Biotechnologies Co Methods for treating hpv-associated diseases
CR20200460A (es) 2018-03-12 2020-11-23 Sqz Biotechnologies Co Suministro intracelular de biomeléculas para modificar respuestas inmunes
CA3115245A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to enhance antigen presenting cell function
CN113614237A (zh) 2019-01-25 2021-11-05 Sqz生物技术公司 无核细胞源性疫苗
BR112021016903A2 (pt) 2019-02-28 2021-11-03 Sqz Biotechnologies Co Administração de biomoléculas a pbmcs para modificação de uma resposta imune
JP2023535982A (ja) * 2020-07-29 2023-08-22 スクイーズ バイオテクノロジーズ カンパニー 無核細胞を使用して変異型Ｒａｓに対する免疫応答を刺激する方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220233676A1 (en) 2022-07-28
EP4271407A1 (en) 2023-11-08
JP2024503277A (ja) 2024-01-25
CA3203709A1 (en) 2022-07-07
WO2022147442A1 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7420856B2 (ja) Ｔ細胞を製造する組成物及び方法
US20220105166A1 (en) Anucleate cell-derived vaccines
AU2001282123B2 (en) Method for producing ready to use, antigen loaded or unloaded, cryoconserved mature dendritic cells
JP6134763B2 (ja) ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞
JP2022065022A (ja) 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法
US20040214333A1 (en) Loading of cells with antigens by electroporation
TW202108761A (zh) T細胞製備組合物及方法
JP2018531022A6 (ja) 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法
EP4271184A1 (en) Formulations for cryopreservation of pbmcs
CN116847880A (zh) 活化抗原载体的调配物
CN116322752A (zh) 使用无核细胞刺激对突变体ras的免疫应答的方法
WO2012101109A1 (en) Native dendritic cells
RU2793344C2 (ru) Композиции и способы для производства т-клеток
CN118215489A (zh) 抗原呈递细胞/靶细胞杂交瘤衍生疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination