KR102430856B1 - 관용을 유도하는 생체분자의 세포내 전달 - Google Patents

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부 왕
스캇 러프헤드
하워드 번스타인
알몬 알. 샤레이
피놀라 무레
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에스큐지 바이오테크놀로지스 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 무핵 세포를 함유하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 방법이며, 여기서 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및/또는 관용원성 인자가 세포에 진입하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 개체에게 전달되고, 항원은 관용원성 환경에 전달되고 이러한 환경에서 프로세싱되어, 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제한다.

Description

관용을 유도하는 생체분자의 세포내 전달
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2016년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/331,368을 우선권 주장하며, 상기 출원은 이에 의해 그 전문이 참조로 포함된다.
발명의 분야
일반적으로 본 개시내용은 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시킴으로써 화합물을 세포 내로 전달하는 것에 의해 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하는 방법에 관한 것이다.
비장의 비-염증성 및 아폽토시스 환경에서의 항원의 존재는 아네르기 및 관용을 유도하는 것으로 제시된 바 있다. 이러한 관용원성 환경에 관심 항원을 지속적으로 제사하는 것을 확실하게 하는 하나의 방식은 적혈 세포 (RBC)와의 물리적 상호작용을 통해서이다.
그러나, 항원성 물질과 회합되도록 적혈 세포를 조작하는 것은 이들이 불규칙한 형태이고 (양면오목), 무핵이며, 전사적으로 불활성이라는 점에서 도전과제이다. 그 결과, 표준 형질감염 기술이 작동되지 않고, 따라서, 적혈 세포의 관용원성 잠재력의 초기 증거는 물질을 적혈구의 표면에 접합시키는 것에 초점을 두었다 (Lorentz et al. Sci. Adv. 2015, 1:e1500112; Grimm et al. Sci Rep. 2015 Oct 29, 5:15907; Kontos et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Jan 2, 110(1):E60-8). 표면 접합을 이용한 초기 작업은 1형 당뇨병의 마우스 모델 및 모델 항원에서 전도유망한 결과를 제시한 바 있지만, 몇몇 유의한 단점이 있다. 이러한 단점은 a) 부착에 대한 화학적으로 변형된 항원의 요구, b) 제한된 로딩 표면적, c) 면역원성을 포함한다.
따라서, 항원을 적혈 세포의 세포질 내로 로딩할 수 있고 자가면역 질환 및 이식 거부의 기저를 이루는 병원성 면역 반응의 치료를 위한 강력한 면역억제 반응을 구동시킬 수 있는 세포내 전달 기술에 대한 요구가 충족되지 않았다. 미세유체 협착을 사용하여 화합물을 세포에 전달하는 방법이 기술된 참고문헌은 WO2013059343, WO2015023982, WO2016070136, WO2016077761, 및 PCT/US2016/13113을 포함한다.
특허 출원 및 공보를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 하나 이상의 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 관용원성 인자의 작용은 관용원성 환경 및 면역 반응 억제에 기여하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 하나 이상의 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 관용원성 환경에서의 상기 항원의 프로세싱은 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 제1 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 제2 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 제1 무핵 세포 제2 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 관용원성 인자를 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 관용원성 인자와 접촉되는 것인방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 항원을 관용원성 환경 내로 도입하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 관용원성 인자의 작용은 관용을 유도하는 관용원성 환경에 기여하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 제1 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 제2 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 제1 무핵 세포 제2 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 측면은 항원을 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 항원과 접촉되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경에서의 상기 항원의 프로세싱 및 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경에서의 상기 항원의 프로세싱 및 제시는 항원에 대한 면역 반응을 유도한다. 이전 실시양태와 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 관용원성 환경은 비장, 간, 또는 림프절 내에 위치한다.
일부 실시양태에서, 협착부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 협착부는 세공이거나 또는 세공 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 세공은 표면 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 약 0.5 μm 내지 약 4 μm이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 4 μm, 약 3 μm, 약 2 μm, 약 1 μm 또는 약 0.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부 크기는 무핵 세포 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 협착부 크기는 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60% 또는 약 70%이다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 수행된다.
달리 상술되지 않는 한, 무핵 세포 직경에 관한 언급은 협착부를 통과하기 전, 예를 들어, 세포가 협착부에 접근할 때의 유체 내의 세포의 직경을 의미한다.
이전 실시양태와 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 혼합 세포 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 전혈이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 정제된 세포 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 정제된 무핵 세포 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 인간 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 적혈 세포이다. 일부 실시양태에서, 적혈 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, 적혈 세포는 망상적혈구이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 혈소판이다.
이전 실시양태와 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 항원은 세포 용해물 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 항원은 외래 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 자기-항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 동종이식편 이식 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물이다. 일부 실시양태에서, 항원은 지질 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물 항원 (예를 들어, 당)이다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 치료제와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 탄수화물 (예를 들어, 당)과 융합된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 이식된 조직과 연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스와 연관된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 현탁액은 협착부 통과 전에, 협착부 통과와 동시에, 또는 협착부 통과 후에 항원과 접촉된다.
이전 실시양태와 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα, 또는 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 탄수화물 (예를 들어, 당)에 접합된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 현탁액은 협착부 통과 전에, 협착부 통과와 동시에, 또는 협착부 통과 후에 관용원성 인자와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포의 반감기가 감소된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포의 반감기가 증가된다.
면역 반응이 억제되는 실시양태에서, 면역 반응은 적어도 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 또는 약 200% 초과만큼 억제된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 T 세포 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 활성화 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 생존 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 증식 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 기능성 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 표현형에서의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 T 세포의 비-공동자극 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 Treg 반응 강화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 B 세포 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포 반응 감소는 항체 생산 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 시토카인 생산 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 자가면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 알레르기 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 이식된 조직에 대한 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 바이러스에 대한 병원성 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소를 포함한다.
관용이 유도되는 실시양태에서, 관용은 T 세포 반응 감소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 활성화 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 생존 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 증식 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 기능성 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 표현형에서의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 T 세포의 비-공동자극 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 Treg 반응 강화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 B 세포 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포 반응 감소는 항체 생산 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 시토카인 생산 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 자가면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 알레르기 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 이식된 조직에 대한 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 바이러스에 대한 병원성 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용은 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소를 포함한다.
변형된 무핵 세포가 개체에게 투여되는 일부 실시양태에서, 방법은 상기 기술된 바와 같은 변형 무핵 세포의 적어도 1회 (예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과)의 추가 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 2회의 투여 사이의 기간은 적어도 1일, 1주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년이다.
본 발명의 특정 측면은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에서 사용하기 위한, 협착부, 세포 현탁액 및 항원을 포함하는 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에서 사용하기 위한, 협착부, 세포 현탁액 및 관용원성 인자를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
도 1a&b는 세포내이입 대조군에 비교된 바와 같은, IgG 항체 (도 1a) 및 덱스트란 입자 (도 1b)의 인간 RBC로의 협착 매개 전달 (SQZ) 후의 형광을 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯을 제시한다.
도 2a는 IgG 항체 및 덱스트란 입자의 인간 RBC로의 협착 매개 전달 후의 전달 효율을 제시한다. 도 2b는 IgG 항체 및 덱스트란 입자의 인간 RBC로의 협착 매개 전달 후의 추정 세포 생육성을 제시한다.
도 3a는 IgG 항체의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 형광을 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯을 제시한다. 도 3b는 IgG 항체의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 추정 세포 생육성을 제시한다. 도 3c는 IgG 항체의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 전달 효율을 제시한다.
도 4a-i는 세포내이입 (도 4a), 음성 대조군 (도 4b), 및 물질 없음 대조군 (도 4c)에 비교된 바와 같은, 2 psi (도 4d), 4 psi (도 4e), 6 psi (도 4f), 10 psi (도 4g), 20 psi (도 4h) 하에서 또는 수동 주사기 압력 (도 4i)을 사용하여, 덱스트란 입자를 마우스 RBC로 전달하는 것을 실연하는 예시적인 FACS 플롯을 제시한다.
도 5a는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 추정 세포 생육성을 제시한다. 도 5b는 IgG 항체 또는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 전달 효율을 제시한다. 도 5c는 IgG 항체 또는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 기하 평균 형광을 제시한다.
도 6a는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 형광을 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯을 제시한다. 도 6b는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 추정 세포 생육성을 제시한다. 도 6c는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 전달 효율을 제시한다. 도 6d는 덱스트란 입자의 마우스 RBC로의 협착 매개 전달 후의 기하 평균 형광을 제시한다.
도 7은 처리 스케줄의 개략도를 제시한다.
도 8은 4개의 처리군으로부터의 마우스 내의 OT-I-특이적 T 세포의 수를 제시한다.
도 9는 높은 수준의 IFN-γ를 발현한 비장 T 세포의 퍼센트 (좌측) 및 IFN-γ 생산 수준 (우측)을 제시한다.
도 10은 모든 CD8+ T 세포 중 OT-I T 세포의 비율 (상부 패널) 및 OT-I T 세포 중 IFN-γ 반응성 T 세포의 비율 (하부 패널)에 대한 대표적인 유동 사이토그램을 제시한다.
도 11a 및 11b는 대표적인 처리 스케줄의 개략도를 제시한다.
도 12a 및 12b는 대표적인 처리 스케줄의 개략도를 제시한다.
본 발명은 무핵 세포를 함유하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시켜, 항원 및/또는 관용원성 인자를 무핵 세포에 전달하는 것을 가능하게 하는 것에 의해 개체에서 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 협착부는 미세유체 채널 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 협착부는 세공이거나 또는 세공 내에 함유된다.
본 개시내용의 특정 측면은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 함유하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 것인 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 복수의 항원에 대한 관용 및/또는 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
본 개시내용의 특정 측면은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 함유하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 세포와 접촉된 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 것인 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 항원은 관용원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경에서 이러한 환경의 관용원성 성질을 추가로 증가시키는 작용을 한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 비-관용원성 환경에서 관용원성 환경을 생성시키는 작용을 한다. 일부 실시양태에서, 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 복수의 항원에 대한 관용 및/또는 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
본 개시내용의 특정 측면은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 함유하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 복수의 항원에 대한 관용 및/또는 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
I. 일반 기술
본원에서 기술 또는 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적인 방법론, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)]; 시리즈 [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)]; [Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)]; [Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)]; [Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)]에 기술된 널리 활용되는 방법론을 이용하여 통상적으로 사용된다.
II. 정의
본 명세서를 해석하기 위한 목적으로, 하기의 정의가 적용될 것이고, 적합한 경우, 단수형으로 사용된 용어는 복수형을 또한 포함할 것이며, 반대도 마찬가지이다. 하기에 기재된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문서와 상충되는 경우, 기재된 정의가 우선하여야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 형태는 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 기술된 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는 것", 측면 및 실시양태로 "이루어지는 것", 및 측면 및 실시양태로 "본질적으로 이루어지는 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 이러한 기술 분야의 숙련자가 용이하게 아는 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 이러한 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함 (및 기술)한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "세공"은 물질 내의 구멍, 인열부, 공동, 간극부, 파쇄부, 틈, 또는 천공을 포함하는 개구부를 지칭한다. 일부 예에서, (지시된 경우에) 이러한 용어는 본 개시내용의 표면 내의 세공을 지칭한다. 다른 예에서, (지시된 경우에) 세공은 세포 막 내의 세공을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "막"은 세공을 함유하는 선택적 장벽 또는 시트를 지칭한다. 이러한 용어는 경계 또는 라이닝으로서 작용하는 휘어질 수 있는 시트형 구조를 포함한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 세공을 포함하는 표면 또는 필터를 지칭한다. 이러한 용어는 용어 "세포 막"과 별개이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "필터"는 세공을 선택적으로 통과하는 것을 허용하는 다공성 물품을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 세공을 함유하는 표면 또는 막을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비균질성"은 구조 또는 조성 면에서 혼합되었거나 균일하지 않은 것을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 크기, 형상, 또는 소정의 표면 내에서의 분포가 다양한 세공을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "균질성"은 전체적으로 구조 또는 조성 면에서 일관적이거나 균일한 것을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 크기, 형상, 또는 소정의 표면 내에서의 분포가 일관적인 세공을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이종성"은 상이한 생물로부터 유래된 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 소정의 생물에서 정상적으로 발견 또는 발현되지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "저해하다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 차단하거나, 저하시키거나, 제거하거나, 또는 다른 방식으로 길항하는 작용을 지칭할 수 있다. 저해는 부분적 저해 또는 완전 저해를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 저해하는 것은 면역 반응의 차단, 저하, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용에 이르는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현의 저해는 핵산 전사의 저하, mRNA 과다의 저하 (예를 들어, mRNA 전사를 침묵화함), mRNA 분해, mRNA 번역의 저해, 유전자 편집 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질 발현의 저해는 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 저하, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 저하, 단백질 번역의 저해, 단백질 안정성의 저하 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제하다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 감소시키거나, 저하시키거나, 금지하거나, 제한하거나, 축소시키거나, 또는 다른 방식으로 저감시키는 것을 지칭할 수 있다. 억제는 부분적 억제 또는 완전 억제를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 억제하는 것은 면역 반응을 감소시키거나, 저하시키거나, 금지하거나, 제한하거나, 축소시키거나 또는 다른 방식으로 저감시키는 것에 이르는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현의 억제는 핵산 전사의 저하, mRNA 과다의 저하 (예를 들어, mRNA 전사를 침묵화함), mRNA 분해, mRNA 번역의 저해 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질 발현의 억제는 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 저하, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 저하, 단백질 번역의 저해, 단백질 안정성의 저하 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "강화하다"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 개선하거나, 증진시키거나, 고조시키거나, 또는 다른 방식으로 증가시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 강화하는 것은 면역 반응을 개선하거나, 증진시키거나, 고조시키거나, 또는 다른 방식으로 증가시키는 것에 이르는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현을 강화하는 것은 핵산 전사의 증가, mRNA 과다의 증가 (예를 들어, mRNA 전사를 증가시킴), mRNA 분해의 감소, mRNA 번역의 증가 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질 발현을 강화하는 것은 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 증가, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 증가, 단백질 번역의 증가, 단백질 안정성의 증가 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유도하다"는 결과를 개시시키거나, 촉진하거나, 자극하거나, 확립하거나, 또는 다른 방식으로 생산하는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 유도하는 것은 원하는 면역 반응을 개시시키거나, 촉진하거나, 자극하거나, 확립하거나, 또는 다른 방식으로 생산하는 것에 이르는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현을 유도하는 것은 핵산 전사의 개시, mRNA 번역의 개시 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 단백질 발현을 유도하는 것은 단백질을 코딩하는 핵산의 전사의 증가, 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성의 증가, 단백질 번역의 증가, 단백질 안정성의 증가 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 동일한 생물로부터 유래된 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 소정의 생물에서 정상적으로 발견 또는 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하여, 임의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 천연이거나, 화학적 또는 생화학적으로 변형되었거나, 비-천연이거나 또는 유도체화된 기타 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트 기 (전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견되는 바와 같을 수 있음), 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복 단위, 예컨대 N-(2-아미노에틸)-글리신을 포함할 수 있다 (즉, 펩티드 핵산). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 합성 서브유닛 예컨대 포스포르아미데이트의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트 (P-NH2) 또는 혼합형 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 추가적으로, 상보적 가닥을 합성하고 적합한 조건 하에 가닥들을 어닐링시킴으로써, 또는 DNA 폴리머라제와 적합한 프라이머를 사용하여 신생으로 상보적 가닥을 합성함으로써, 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 이중-가닥 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용되고, 최소 길이에 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 전장 단백질 및 그의 단편 둘 다가 이러한 정의에 포함된다. 이러한 용어는 폴리펩티드의 발현-후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 또한 포함한다. 더욱이, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 성질 면에서 보존적임)을 포함하는 단백질을 지칭하고, 단 이러한 단백질은 원하는 활성을 유지한다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 의도적일 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭에 기인하는 오류를 통해서와 같이 우발적일 수 있다.
본원에 기술된 임의의 구조적 및 기능적 특성에 대해, 이러한 특성을 결정하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다.
III. 면역 억제 및 관용
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 억제하고/하거나 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및/또는 관용원성 화합물이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다.
면역학적 관용은 관용이 유도되어 있는 항원의 챌린지에 대한 면역학적 무반응이다. 대상체가 관용-유도 항원의 후속 챌린지에 대해 무반응성일 때 관용이 실연된다. 관용은 자가반응 세포의 아폽토시스, 아네르기 유도, 또는 림프구 표현형의 편향을 포함하는 여러 상이한 메카니즘에 의해 매개될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용은 특정 항원에 대한 면역 반응의 불활성화를 야기하는 T 세포 비-반응성을 포함할 수 있다. 관용은 세포 표면 분자 또는 세포독성 인자와의 접촉-의존적 상호작용에 의해 또는 면역억제성 시토카인의 분비를 통해 조절 T 세포 (Treg)에 의해 매개될 수도 있다. 관용원성 메카니즘에서의 결함은 자가면역 질환, 이식 거부, 항-약물 반응, 및 바이러스 감염에 대한 병원성 반응에 기여할 수 있다. 면역억제는 면역 반응 활성의 감소이다. 예를 들어, 면역억제는, 비제한적으로, 항원 챌린지에 대한 반응성 감소, 면역 세포 활성화 및 증식 감소, 시토카인 분비 조정, 면역 세포 생존 감소, 또는 면역 세포 이펙터 기능 감소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역억제는 소정의 항원에 대해 특이적이다. 예를 들어, 자기-항원에 대한 면역 반응이 억제된다.
일부 실시양태에서, 관용원성 환경에서 항원이 프로세싱되어 제시된다. 관용원성 환경은 관용원성 면역 반응의 생성을 지지하는 신체 내의 장소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경은 1차 림프 조직, 예컨대 흉선에 위치한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경은 2차 림프 조직에 위치한다. 예시적인 2차 림프 조직은 비장, 림프절, 및 점막-연관 림프 조직 (MALT)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경은 비장에 위치한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경은 비-림프 조직 예컨대 간에 위치한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경은 관용원성 인자의 전달에 의해 염증 부위에서 유도된다. 예를 들어, 염증성 환경이 관용원성 인자에 의해 관용원성 환경으로 전환된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 무핵 세포로 전달하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 세포는 포유동물 세포이다. 무핵 세포는 핵이 결여된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지 또는 토끼 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 비-포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 닭, 개구리, 곤충, 어류, 또는 선충류 세포이다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 적혈 세포이다. 적혈 세포 (RBC)는 가요성이고 타원형인 양면오목 원반으로, 세포질에 산소-캐리어 생체분자 헤모글로빈이 풍부하다. RBC는 신체 전반에 걸쳐 산소 전달 및 이산화탄소 제거를 위한 1차 수단으로서의 역할을 한다. RBC는 120일까지 순환될 수 있고, 그 후에는 비장에서의 소거를 통해 신체에서 제거된다. 망상적혈구는 무핵의 미성숙한 (아직 양면오목이 아닌) 적혈 세포이고, 전형적으로 인체 내의 적혈 세포의 약 1%를 이룬다. 성숙형 적혈 세포는 적혈구로도 지칭된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 혈소판이다. 혈소판 (트롬보사이트로도 칭해짐)은 그의 기능이 혈액 응고를 수반하는 혈액 성분이다. 혈소판은 직경이 2-3 μm인, 양면볼록 원반 모양 (렌즈-형상)의 구조이다.
일부 실시양태에서, 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하거나 또는 항원에 대한 관용원성 반응을 유도한다. 비장의 관용원성 환경에서 정기적으로 소거되는 아폽토시스 세포, 예컨대 RBC로부터 유래된 항원은 반응성 T 세포의 제거 (예를 들어, 살해) 또는 아네르기를 통해 항원에 대한 관용을 구동시키고/시키거나 면역 반응을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 항원-특이적이다. RBC는 수명이 제한되고, 자기-복구가 불가능하여, 아폽토시스와 유사한 프로세스인 에립토시스에 의한 RBC 사망에 이르고, 이어서 혈류로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포의 아폽토시스 시에 관용원성 환경에서 항원이 방출될 수 있고, 이어서 여기에서 항원-제시 세포에 의해 포식되고, 프로세싱되어, 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원을 함유하는 무핵 세포는 항원-제시 세포, 예컨대 대식세포에 의해 포식되고, 이어서 항원이 항원-제시 세포에 의해 프로세싱되어 제시된다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포의 반감기가 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포의 반감기는 증가된다. 예를 들어, 무핵 세포가 비장에서의 소거 전에 혈류를 순환하는 시간이 증가되도록 무핵이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포의 반감기는 감소된다. 예를 들어, 무핵 세포가 비장에서의 소거 전에 혈류를 순환하는 시간이 감소되도록 무핵 세포가 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포 표면 상의 지질 비 변경이 무핵 세포의 반감기를 감소시킨다. 예를 들어, 무핵 세포의 반감기를 저하시키도록, 예컨대 표면 포스파티딜세린을 증가시키기 위해 관련 분야에 공지된 임의의 방법을 사용함으로써, 무핵 세포의 표면 상의 포스파티딜세린의 존재가 증가될 수 있다 (문헌 [Hamidi et al., J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60] 참조). 외부 세포 막 상의 포스파티딜세린 노출은 아폽토시스의 특징이고, 포식을 촉진하는 방식으로 포식세포 상의 수용체에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 개체에게 전달되기 전에 지질과 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포는 중합체와 회합되어 무핵 세포의 반감기를 감소시킨다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 복수의 항원에 대한 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 복수의 항원에 대한 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법이며, 제1 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 제2 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 제1 무핵 세포 제2 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포 및 제2 무핵 세포는 동시에 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포 및 제2 무핵 세포는 순차적으로 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포가 개체에게 도입된 후에 제2 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포가 개체에게 도입되고 나서 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 중 임의의 것을 초과하는 시간 후에 제2 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 무핵 세포가 개체에게 도입된 후에 제1 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 무핵 세포가 개체에게 도입되고 나서 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 중 임의의 것을 초과하는 시간 후에 제1 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 복수의 항원에 대한 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 관용은 항원-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도한다. 일부 실시양태에서, 관용은 복수의 항원에 대한 관용을 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 관용은 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 관용은 복수의 항원에 대한 관용을 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 제1 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 제2 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및 제1 무핵 세포 제2 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원에 대한 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포 및 제2 무핵 세포는 동시에 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포 및 제2 무핵 세포는 순차적으로 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포가 개체에게 도입된 후에 제2 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 제1 무핵 세포가 개체에게 도입되고 나서 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 중 임의의 것을 초과하는 시간 후에 제2 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 무핵 세포가 개체에게 도입된 후에 제1 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 제2 무핵 세포가 개체에게 도입되고 나서 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 또는 24시간 중 임의의 것을 초과하는 시간 후에 제1 무핵 세포가 도입된다. 일부 실시양태에서, 관용은 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 관용은 복수의 항원에 대한 관용을 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 관용은 항원-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 항원-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였으며, 이에 의해 항원에 대한 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 관용은 복수의 항원에 대한 관용을 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였으며, 이에 의해 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 복수의 항원에 대한 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원 및 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 항원 및 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 관용은 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 관용은 복수의 항원에 대한 관용을 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원 및 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 항원 및 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 관용원성 환경을 생성시키거나 또는 촉진하고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 항원-특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역 억제는 복수의 항원에 대한 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 항원을 관용원성 환경 내로 도입하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입한 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 제시된다. 일부 실시양태에서, 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱된다.
특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 관용원성 환경을 생성시키는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입한 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하고/하거나 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 관용 및/또는 면역 억제는 복수의 항원에 대한 관용 및/또는 면역 반응의 억제를 포함하여 비-특이적이다.
일부 실시양태에서, 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100% 중 임의의 것만큼 면역 반응이 억제된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 T 세포 반응 감소를 포함한다. 예를 들어, T 세포 반응 감소는, 비제한적으로, T 세포 활성화 또는 증식 감소, T 세포 생존 감소, 또는 세포 기능성 감소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 활성화 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 생존 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 증식 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 반응 감소는 T 세포 기능성 감소를 포함한다. 예를 들어, T 세포 기능성 감소는, 비제한적으로, 시토카인 분비 조정, 염증 부위로의 T 세포 이동 감소, 및 T 세포 세포독성 활성 감소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 염증성 시토카인 생산 및/또는 분비 감소, 및/또는 항염증성 시토카인 생산 및/또는 분비 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 인터류킨-1 (IL-1), IL-12, 및 IL-18, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 (IFN-감마), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로부터 선택된 하나 이상의 염증성 시토카인의 생산 및/또는 분비 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-알파 및 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)로부터 선택된 하나 이상의 항염증성 시토카인의 생산 및/또는 분비 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 T 세포 표현형에서의 변화를 포함한다. 예를 들어, T 세포 상태가 염증유발성 표현형에서 조절 또는 항염증 표현형으로 변화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 T 세포의 비-공동자극 활성화를 포함하고, 이는 후속적으로 세포 사망에 이를 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 Treg 반응 강화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 B 세포 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포 반응 감소는 항체 생산 감소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 자가면역 반응 감소를 포함한다. 예를 들어, 자가면역 반응 감소는, 비제한적으로, 제I형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 건선, 다발경화증, 면역 성분이 있을 수 있는 신경변성 질환 예컨대 알츠하이머병, ALS, 헌팅톤병 및 파킨슨병, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌병, 크론병, 또는 궤양성 결장염과 연관된 항원에 대한 면역 반응 감소 또는 관용 유도를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 알레르기 반응 감소를 포함한다. 예를 들어, 알레르기 반응 감소는 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염 (건초열), 또는 식품 알레르기와 연관된 항원에 대한 면역 반응 감소 또는 관용 유도를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 이식된 조직과 연관된 항원이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 이식된 조직에 대한 면역 반응 감소 또는 관용 유도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스와 연관된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 바이러스에 대한 병원성 면역 반응 감소 또는 관용 유도를 포함한다. 예를 들어, 병원성 면역 반응은 특정 바이러스 감염에 의해 생성되는 시토카인 폭풍을 포함할 수 있다. 시토카인 폭풍은 시토카인과 백혈 세포 사이의 양성 피드백 루프로 이루어지는 잠재적으로 치명적인 면역 반응이다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 응고 인자이다. 예시적인 응고 인자는, 비제한적으로, 인자 VIII 및 인자 IX를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항체이다. 예시적인 치료용 항체는, 비제한적으로, 항-TNFα, 항-VEGF, 항-CD3, 항-CD20, 항-IL-2R, 항-Her2, 항-RSVF, 항-CEA, 항-IL-1베타, 항-CD15, 항-미오신, 항-PSMA, 항-40 kDa 당단백질, 항-CD33, 항-CD52, 항-IgE, 항-CD11a, 항-EGFR, 항-C5, 항-알파-4 인테그린, 항-IL-12/IL-23, 항-IL-6R, 및 항-RANKL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 성장 인자이다. 예시적인 치료용 성장 인자는, 비제한적으로, 에리트로포이에틴 (EPO) 및 거핵세포 분화 및 성장 인자 (MDGF)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 호르몬이다. 예시적인 치료용 호르몬은, 비제한적으로, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 및 난포 자극 호르몬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 재조합 시토카인이다. 예시적인 치료용 재조합 시토카인은, 비제한적으로, IFNβ, IFNα, 및 GM-CSF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제는 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서,치료용 비히클은 유전자 요법에 사용되는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료용 비히클은 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 치료용 비히클은 나노입자이다.
IV. 세포-변형 협착부를 제공하는 미세유체 채널
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하는 방법이며, 여기서 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 또는 화합물이 세포에 진입하고, 여기서 협착부는 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다중 협착부가 미세유체 채널 내에 병렬 및/또는 직렬로 놓일 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 세포-변형 협착부를 함유하는 예시적인 미세유체 채널이 WO2013059343에 기술되어 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 세공이 있는 예시적인 표면이 2015년 9월 4일에 출원된 미국 가출원 62/214,820에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 루멘을 포함하고, 완충제 내에 현탁된 세포가 통과할 수 있도록 구성되며, 여기서 미세유체 채널은 협착부를 포함한다. 미세유체 채널은 실리콘, 금속 (예를 들어, 스테인레스 스틸), 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, PET, PETG), 세라믹, 유리, 결정질 기판, 무정형 기판, 또는 중합체 (예를 들어, 폴리-메틸 메타크릴레이트 (PMMA), PDMS, 시클릭 올레핀 공중합체 (COC) 등)을 포함하는 다수의 물질 중 임의의 것으로 만들어질 수 있다. 미세유체 채널의 제작은 건식 에칭, 습식 에칭, 포토리소그래피, 사출 성형, 레이저 삭마, 또는 SU-8 마스크를 포함하는 관련 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 협착부는 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 협착부의 길이, 깊이, 및 폭은 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 협착부의 직경은 세포 또는 세포 클러스터의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 협착부의 직경은 세포 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부 크기는 세포 직경의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부 크기는 세포 (예를 들어, 무핵 세포 예컨대 RBC)의 최소 단면 거리의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 4 μm, 약 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm (이러한 값들 사이의 임의의 범위를 포함함) 폭의 협착부 폭을 포함한다. 채널, 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분의 단면 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 단면은 형상 면에서 원형, 타원형, 긴 틈새, 사각형, 육각형, 또는 삼각형일 수 있다. 입구 부분은 협착부 각도를 정의하고, 협착부 각도는 채널 막힘을 저하시키도록 최적화되고, 화합물의 세포 내로의 전달 강화를 위해 최적화된다. 출구 부분의 각도 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 비-층류를 초래할 수 있는 난류의 가능성을 저하시키도록 출구 부분의 각도가 구성된다. 일부 실시양태에서, 입구 부분 및/또는 출구 부분의 벽은 직선형이다. 다른 실시양태에서, 입구 부분 및/또는 출구 부분의 벽은 곡선형이다.
V. 세포 변형 협착부를 제공하는 세공이 있는 표면
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하는 방법이며, 여기서 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 또는 화합물이 세포에 진입하고, 여기서 협착부는 세공이거나 또는 세공 내에 함유되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세공은 표면 내에 함유된다. 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 세공이 있는 예시적인 표면이 2015년 9월 4일에 출원된 미국 가출원 62/214,820에 기술되어 있다.
본원에 개시된 바와 같은 표면은 다수의 물질 중 임의의 것으로 제조될 수 있고, 다수의 형태 중 임의의 것을 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 필터는 접선 유동 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 스폰지 또는 스폰지-유사 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 표면은 매트릭스이다.
일부 실시양태에서, 표면은 굴곡 경로 표면이다. 일부 실시양태에서, 굴곡 경로 표면은 셀룰로스 아세테이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 비제한적으로 합성 또는 천연 중합체, 폴리카르보네이트, 실리콘, 유리, 금속, 합금, 셀룰로스 니트레이트, 은, 셀룰로스 아세테이트, 나일론, 폴리에스테르, 폴리에테르술폰, 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리프로필렌, PVDF, 폴리테트라플루오르에틸렌, 혼합형 셀룰로스 에스테르, 자기, 및 세라믹으로부터 선택된 물질을 포함한다.
본원에 개시된 표면은 관련 분야에 공지된 임의의 형상, 예를 들어 3차원 형상일 수 있다. 표면의 2차원 형상은, 비제한적으로, 원형, 타원형, 구형, 사각형, 성상형, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형 또는 팔각형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 형상 면에서 구형이다. 일부 실시양태에서, 표면의 3차원 형상은 원통형, 원뿔형, 또는 입방형이다.
표면은 단면 폭 및 두께가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면의 단면 폭은 약 1 mm 내지 약 1 m, 또는 이들 사이의 임의의 단면 폭 또는 단면 폭 범위이다. 일부 실시양태에서, 표면은 규정된 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서,표면 두께는 균일하다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 가변적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표면의 일부분이 표면의 다른 부분보다 더 두껍거나 또는 더 얇다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 약 1% 내지 약 90% 또는 이들 사이의 임의의 백분율 또는 백분율 범위만큼 다양하다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 0.01 μm 내지 약 5 mm 두께 또는 이들 사이의 임의의 두께 또는 두께 범위이다.
일부 실시양태에서, 협착부는 세공이거나 또는 세공 내에 함유된다. 세공의 단면 폭은 처리될 세포의 유형에 관련된다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 처리될 세포 또는 세포 클러스터의 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 세공 통과 시 세포가 교란되도록 하는 것이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 세포 직경 미만이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 세포 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 세포 직경의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 최적의 세공 크기 또는 세공 단면 폭은 용도 및/또는 세포 유형을 기초로 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 약 0.1 μm 내지 약 4 μm이다. 일부 실시양태에서, 세공 크기는 약 4 μm, 약 3 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 약 0.25 μm, 또는 약 0.1 μm이다. 일부 실시양태에서, 세공 단면 폭은 약 4 μm, 약 3 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 약 0.25 μm, 또는 약 0.1 μm 중 임의의 이하이다. 세공 통로의 입구 및 출구는 각도가 다양할 수 있다. 세공 각도는 세포가 통과하는 동안 세공 막힘을 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면을 통과하는 유속은 약 0.001 mL/㎠/s 내지 약 100 L/㎠/s 또는 이들 사이의 임의의 속도 또는 속도 범위이다. 예를 들어, 입구 또는 출구 부분의 각도는 약 0 내지 약 90도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입구 또는 출구 부분은 90도를 초과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공은 입구 및 출구 각도가 동일하다. 일부 실시양태에서, 세공은 입구 및 출구 각도가 상이하다. 일부 실시양태에서, 세공 가장자리는 매끄럽고, 예를 들어, 둥글거나 곡선형이다. 매끄러운 세공 가장자리는 혹, 융기부 또는 균일하지 않은 부분이 없으면서 표면이 연속적이고, 평평하며 균일하다. 일부 실시양태에서, 세공 가장자리는 날카롭다. 날카로운 세공 가장자리는 뾰족하거나 예각인 얇은 가장자리가 있다. 일부 실시양태에서, 세공 통로는 직선형이다. 직선형 세공 통로는 곡선, 만곡부, 각도, 또는 기타 불규칙 부분을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세공 통로는 곡선형이다. 곡선형 세공 통로는 구부러지거나 또는 직선으로부터 벗어난다. 일부 실시양태에서, 세공 통로는 다수의 곡선, 예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 곡선이 있다.
세공은 2차원 또는 3차원 형상을 포함하여 관련 분야에 공지된 임의의 형상일 수 있다. 세공 형상 (예를 들어, 단면 형상)은, 비제한적으로, 원형, 타원형, 구형, 사각형, 성상형, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형 및 팔각형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공의 단면은 형상 면에서 구형이다. 일부 실시양태에서, 세공의 3차원 형상은 원통형 또는 원뿔형이다. 일부 실시양태에서, 세공은 세로 홈이 있는 입구 및 출구 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세공 형상은 소정의 표면 내의 세공들 사이에서 균질하다 (즉, 일관적이거나 규칙적이다). 일부 실시양태에서, 세공 형상은 소정의 표면 내의 세공들 사이에서 균질하지 않다 (즉, 혼합형이거나 다양하다).
본원에 기술된 표면은 총 세공 수가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공은 총 표면적의 약 10% 내지 약 80%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 1.0x105개 내지 약 1.0x1030개 또는 이들 사이의 임의의 수 또는 수 범위의 총 세공을 함유한다. 일부 실시양태에서, 표면은 ㎟ 표면적당 약 10개 내지 약 1.0x1015개의 세공을 포함한다.
세공은 소정의 표면 내에서 수많은 방식으로 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공은 소정의 표면 내에서 병렬로 분포된다. 하나의 이러한 예에서, 세공은 동일한 방향으로 나란히 분포되고, 소정의 표면 내에서 동일한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 세공 분포는 정연하거나 또는 균질하다. 하나의 이러한 예에서, 세공은 규칙적이고 조직적인 패턴으로 분포되거나, 또는 소정의 표면 내에서 동일한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 세공 분포는 무작위이거나 또는 비균질성이다. 하나의 이러한 예에서, 세공은 불규칙하고 무질서한 패턴으로 분포되거나, 또는 소정의 표면 내에서 상이한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 다중 표면이 일렬로 분포된다. 다중 표면은 표면 크기, 형상 및/또는 조도 면에서 균질성 또는 비균질성일 수 있다. 다중 표면은 세공 크기, 형상 및/또는 수가 균질성 또는 비균질성인 세공들을 추가로 함유할 수 있으며, 이에 의해 광범위한 화합물을 상이한 세포 유형들 내로 동시에 전달하는 것을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 개별적인 세공은 폭 치수가 균일하다 (즉, 세공 통로의 길이를 따라 폭이 일정하다). 일부 실시양태에서, 개별적인 세공은 폭이 가변적이다 (즉, 세공 통로의 길이를 따라 폭이 증가하거나 또는 감소된다). 일부 실시양태에서, 소정의 표면 내의 세공은 개별적인 세공 깊이가 동일하다. 일부 실시양태에서, 소정의 표면 내의 세공은 개별적인 세공 깊이가 상이하다. 일부 실시양태에서, 세공은 서로 인접한다. 일부 실시양태에서, 세공은 서로 일정 거리만큼 떨어진다. 일부 실시양태에서, 세공은 약 0.001 μm 내지 약 30 mm의 거리 또는 이들 사이의 임의의 거리 또는 거리 범위만큼 서로 떨어진다.
일부 실시양태에서, 표면은 물질로 코팅된다. 물질은 테플론, 접착성 코팅물, 계면활성제, 단백질, 부착 분자, 항체, 항응고제, 세포 기능을 조정하는 인자, 핵산, 지질, 탄수화물, 또는 막횡단 단백질을 비제한적으로 포함하는, 관련 분야에 공지된 임의의 물질로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 물질은 표면에 공유결합으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 물질은 표면에 비-공유결합으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 표면 분자는 세포가 세공을 통과할 때 방출된다.
일부 실시양태에서, 표면은 변형된 화학적 성질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면은 친수성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 소수성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 하전된다. 일부 실시양태에서, 표면은 양으로 및/또는 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 표면은 일부 영역에서는 양으로 하전되고, 다른 영역에서는 음으로 하전될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 전반적인 양전하 또는 전반적인 음전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 표면은 매끄럽거나, 전해연마되거나, 거칠거나, 또는 플라즈마 처리된 것 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 쯔비터이온 또는 이극성 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 플라즈마 처리된 것이다.
일부 실시양태에서, 표면은 더 큰 모듈 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 주사기, 예컨대 플라스틱 또는 유리 주사기 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 플라스틱 필터 홀더 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 피펫 팁 내에 함유된다.
VI. 세포 교란
일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하는 방법이며, 여기서 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 또는 화합물이 세포에 진입하고, 여기서 세포에서의 교란은 세포 외부로부터의 물질이 세포 내로 이동하도록 허용하는 세포 내의 틈새 (예를 들어, 구멍, 인열부, 공동, 간극부, 세공, 파쇄부, 틈, 천공)인 방법을 제공한다. 변형은, 예를 들어, 기계적 변형력 및/또는 전단력에 의해 유도된 압력에 의해 야기될 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란은 세포 막 내에서의 교란이다. 일부 실시양태에서, 교란은 일시적이다. 일부 실시양태에서, 세포 교란은 약 1.0x10-9초 내지 약 2시간, 또는 이들 사이의 임의의 시간 또는 시간 범위 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 세포 교란은 약 1.0x10-9초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 1시간 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 세포 교란은 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-2초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-3초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-4초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-5초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-6초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-7초, 또는 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-8초 중 임의의 것 사이 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 세포 교란은 약 1.0x10-8초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-7초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-6초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-5초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-4초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-3초 내지 약 1.0x10-1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 1.0x10-1초 중 임의의 시간 동안 지속된다. 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 세포 교란 (예를 들어, 세공 또는 구멍)은 보체 또는 박테리아 용혈소에 의해 생성된 것과 같은 다량체성 세공 구조를 형성하기 위한 단백질 서브유닛의 조립의 결과로서 형성되지 않는다.
세포가 협착부를 통과함에 따라, 협착부는 일시적으로 세포 막에 대한 손상을 부여하고, 이는 교란을 통한 물질의 수동 확산을 야기한다. 일부 실시양태에서, 다른 기간 (예를 들어, 나노초 내지 수 시간 범위)도 가능하지만, 세포는 100 μs 정도의 짧은 기간 동안만 변형되어, 세포 신호전달 메카니즘을 통해 아폽토시스 경로를 활성화시킬 가능성을 최소화한다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1.0x10-9초 내지 약 2시간, 또는 이들 사이의 임의의 시간 또는 시간 범위 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1.0x10-9초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 1시간 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-2초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-3초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-4초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-5초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-6초, 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-7초, 또는 약 1.0x10-9초 내지 약 1.0x10-8초 중 임의의 것 사이 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1.0x10-8초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-7초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-6초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-5초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-4초 내지 약 1.0x10-1초, 약 1.0x10-3초 내지 약 1.0x10-1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 1.0x10-1초 중 임의의 시간 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, 세포를 변형시키는 것은 비제한적으로 약 1 μs 내지 적어도 약 750 μs 범위의 시간, 예를 들어, 적어도 약 1 μs, 10 μs, 50 μs, 100 μs, 500 μs, 또는 750 μs 동안 세포를 변형시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과하는 것 및/또는 세포 교란과 동시에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과한 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과하고 나서 수 분 정도 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-2초 내지 적어도 약 30분 후에 발생한다. 예를 들어, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 30분 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-2초 내지 약 10분, 약 1.0x10-2초 내지 약 5분, 약 1.0x10-2초 내지 약 1분, 약 1.0x10-2초 내지 약 50초, 약 1.0x10-2초 내지 약 10초, 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 0.1초 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포 내로의 화합물 통행은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-1초 내지 약 10분, 약 1초 내지 약 10분, 약 10초 내지 약 10분, 약 50초 내지 약 10분, 약 1분 내지 약 10분, 또는 약 5분 내지 약 10분 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포가 협착부를 통과한 후의 세포에서의 교란은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 5분 정도 후 이내에 수정된다.
일부 실시양태에서, 협착부를 통과한 후의 세포 생육성은 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 협착부를 통과한 후의 세포 생육성은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 일부 실시양태에서, 세포 생육성은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-2초 내지 적어도 약 10일 후에 측정된다. 예를 들어, 세포 생육성은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 약 1분 내지 약 30분, 또는 약 30분 내지 약 2시간 후에 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 생육성은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.0x10-2초 내지 약 2시간, 약 1.0x10-2초 내지 약 1시간, 약 1.0x10-2초 내지 약 30분, 약 1.0x10-2초 내지 약 1분, 약 1.0x10-2초 내지 약 30초, 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 0.1초 후에 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 생육성은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 1.5시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 30분 내지 약 2시간, 약 15분 내지 약 2시간, 약 1분 내지 약 2시간, 약 30초 내지 약 2시간, 또는 약 1초 내지 약 2시간 후에 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 생육성은 세포가 협착부를 통과하고 나서 약 2시간 내지 약 5시간, 약 5시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 또는 약 24시간 내지 약 10일 후에 측정된다.
VII. 전달 파라미터
다수의 파라미터가 본원에 기술된 방법에 의해 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위해 화합물을 세포에 전달하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 협착부 통과 전에, 협착부 통과와 동시에, 또는 협착부 통과 후에 화합물과 접촉된다. 세포가 협착부를 통과한 후에 화합물이 세포 현탁액에 첨가될 수 있지만, 세포는 전달할 화합물을 포함하는 용액에 현탁되어 협착부를 통과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달될 화합물은 협착부 상에 코팅된다.
세포 내로의 화합물 전달에 영향을 미칠 수 있는 파라미터의 예는 협착부의 치수, 협착부의 입구 각도, 협착부의 표면 성질 (예를 들어, 조도, 화학적 변형, 친수성, 소수성 등), 작업 유속 (예를 들어, 세포의 협착부 이행 시간), 세포 농도, 세포 현탁액 내의 화합물의 농도를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 협착부를 통과한 후에 세포가 회수 또는 인큐베이션되는 시간의 양이 전달되는 화합물이 세포 내로 통행하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 세포 내로의 화합물 전달에 영향을 미치는 추가적인 파라미터는 협착부 내에서의 세포의 속도, 협착부 내에서의 전단 속도, 세포 현탁액의 점도, 유속에 수직인 속도 성분, 및 협착부에서의 시간을 포함할 수 있다. 이러한 파라미터들은 화합물 전달을 제어하도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 농도는 약 10개 내지 적어도 약 1012개의 세포/ml 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위의 범위이다. 일부 실시양태에서, 전달 화합물 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 1g/mL 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 화합물 농도는 약 1 pM 내지 적어도 약 2 M 또는 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위의 범위일 수 있다. 세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)이 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 화합물의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성 용액은 등삼투압성 또는 등장성이다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 온도는 화합물 전달 및 세포 생육성에 영향을 미치도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 수행된다. 예를 들어, 방법은 실온 (예를 들어, 약 20℃), 생리학적 온도 (예를 들어, 약 37℃), 생리학적 온도보다 높은 온도 (예를 들어, 약 37℃ 초과 내지 45℃ 또는 그 초과), 또는 낮은 온도 (예를 들어, 약 -5℃ 내지 약 4℃), 또는 이러한 예시적인 온도들 사이의 온도에서 수행될 수 있다.
다양한 방법이 세포를 협착부를 통과해 구동시키는데 이용할 수 있다. 예를 들어, 입구 측의 펌프 (예를 들어, 가스 실린더, 또는 압축기)에 의해 압력을 적용할 수 있고/있거나, 출구 측의 진공 펌프에 의해 진공을 적용할 수 있고/있거나, 튜브를 통해 모세관 작용을 적용할 수 있고/있거나, 시스템에 중력이 공급될 수 있다. 변위 기반 유동 시스템을 또한 사용할 수 있다 (예를 들어, 주사기 펌프, 연동 펌프, 수동 주사기 또는 피펫, 피스톤 등). 일부 실시양태에서, 세포는 양압 또는 음압에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 세포는 일정한 압력 또는 가변성 압력에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 압력은 주사기를 사용하여 적용된다. 일부 실시양태에서, 압력은 펌프를 사용하여 적용된다. 일부 실시양태에서, 펌프는 연동 펌프 또는 펌프 또는 다이어프램 펌프이다. 일부 실시양태에서, 압력은 진공을 사용하여 적용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 g-힘에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 세포는 원심력에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 세포는 모세관 압력에 의해 협착부를 통과한다.
일부 실시양태에서, 유체 흐름이 세포가 협착부를 통과하게 지시한다. 일부 실시양태에서, 유체 흐름은 세포가 협착부를 통과하기 전에 난류이다. 난류는 소정의 지점에서의 속도가 규모 및 방향 면에서 불안정하게 변하는 유체 흐름이다. 일부 실시양태에서, 협착부를 통하는 유체 흐름은 층류이다. 층류는 모든 지점에서의 흐름의 방향이 일정하게 유지되는 고체 경계 근처의 유체에서의 중단되지 않은 흐름을 수반한다. 일부 실시양태에서, 유체 흐름은 세포가 협착부를 통과한 후에 난류이다. 세포가 협착부를 통과하는 속도는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 균일한 세포 속도로 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 세포는 변동되는 세포 속도로 협착부를 통과한다.
다른 실시양태에서, 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 협착부가 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 또는 화합물이 세포에 진입하는 것에 의해 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하는데 조합 처리가 사용되고, 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 협착부의 하류에서 전기장에 노출시키는 것이 이어진다. 일부 실시양태에서, 세포는 협착부를 통과한 후에 적어도 1개의 전극에 의해 생성된 전기장을 통과한다. 일부 실시양태에서, 전기장은 화합물을 세포 내부의 제2 장소에 전달하는 것을 보조한다. 예를 들어, 세포-변형 협착부 및 전기장의 조합이 항체를 코딩하는 플라스미드를 세포 내로 전달하여, 항체의 신생 생산을 초래한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 전극이 세포-변형 협착부에 인접하여 전기장을 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 전기장은 약 0.1 kV/m 내지 약 100 MV/m, 또는 이들 사이의 임의의 숫자 또는 숫자 범위이다. 일부 실시양태에서, 집적 회로가 전극을 구동시키는 전기 신호를 제공하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1 ns 내지 약 1 s의 펄스 폭 및 약 100 ns 내지 약 10 s 또는 이들 사이의 임의의 시간 또는 시간 범위의 기간으로 전기장에 노출된다.
VIII. 무핵 세포로의 전달을 위한 세포 현탁액
세포 현탁액은 혼합된 또는 정제된 세포 집단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 혼합 세포 집단, 예컨대 전혈이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 정제된 세포 집단, 예컨대 정제된 무핵 세포 집단이다.
세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)이 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 화합물의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 전혈을 포함한다. 대안적으로, 세포 현탁액은 생리식염수 용액 또는 혈액 이외의 생리학적 매질 내의 세포 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 수성 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 용액은 세포 배양 배지, PBS, 염, 당, 성장 인자, 동물 유래 생성물, 벌크화 물질, 계면활성제, 윤활제, 비타민, 아미노산, 단백질, 세포 주기 저해제, 및/또는 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 DMEM, 옵티-MEM(Opti-MEM)™, IMDM, 또는 RPMI이다. 추가적으로, 용액 완충제가 하나 이상의 윤활제 (플루로닉 또는 기타 계면활성제)를 포함할 수 있고, 이는, 예를 들어, 표면 막힘을 저하시키거나 제거하고 세포 생육성을 개선하도록 디자인될 수 있다. 예시적인 계면활성제는, 비제한적으로, 폴록사머, 폴리소르베이트, 당 또는 당 알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 동물 유래 혈청, 및 알부민 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 용액은 등삼투압성 또는 등장성이다. 일부 실시양태에서, 수성 용액은 혈장을 포함한다.
특정 세포 유형이 있는 일부 구성에서, 세포는 세포 내부로의 화합물 전달을 보조하는 하나 이상의 용액에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성 용액은 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제는 라트룬쿨린 A, 시토칼라신, 및/또는 콜키신이다. 예를 들어, 액틴 세포골격을 탈중합시키기 위해 전달 전에 1시간 동안 탈중합 용액 예컨대 라트룬쿨린 A (0.1 μg/ml)에서 세포를 인큐베이션할 수 있다. 추가적인 예로서, 미세관 네트워크를 탈중합시키기 위해 전달 전에 2시간 동안 10 μM 콜키친 (시그마(Sigma))에서 세포를 인큐베이션할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법에서의 사용 전에 세포 집단이 강화된다. 예를 들어, 세포가 체액, 예를 들어, 말초혈로부터 수득되고, 임의적으로, B 세포가 농축되도록 강화 또는 정제된다. 자기 세포 분리, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 또는 밀도 구배 원심분리를 비제한적으로 포함하는, 관련 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 세포가 강화될 수 있다.
세포 현탁액의 점도 또한 본원에 개시된 방법에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 점도의 범위는 약 8.9x10-4 Pa.s 내지 약 4.0x10-3 Pa.s 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값 범위이다. 일부 실시양태에서, 점도 범위는 약 8.9x10-4 Pa.s 내지 약 4.0 x10-3 Pa.s, 약 8.9x10-4 Pa.s 내지 약 3.0 x10-3 Pa.s, 약 8.9x10-4 Pa.s 내지 약 2.0 x10-3 Pa.s, 또는 약 8.9x10-3 Pa.s 내지 약 1.0 x10-3 Pa.s 중 임의의 것 사이이다. 일부 실시양태에서, 점도 범위는 약 0.89 cP 내지 약 4.0 cP, 약 0.89 cP 내지 약 3.0 cP, 약 0.89 cP 내지 약 2.0 cP, 또는 약 0.89 cP 내지 약 1.0 cP 중 임의의 것 사이이다. 일부 실시양태에서, 전단 변형의 조건 하에 세포 현탁액의 점도가 감소되는 전단 박화 효과가 관찰된다. 점도계, 예컨대 유리 모세관 점도계, 또는 검류계를 비제한적으로 포함하는, 관련 분야에 공지된 임의의 방법으로 점도를 측정할 수 있다. 점도계는 하나의 유동 조건 하에서의 점도를 측정하는 한편, 검류계는 유동 조건에 따라 변하는 점도를 측정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 전단 박화 용액 예컨대 혈액에 대해 점도가 측정된다. 일부 실시양태에서, 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 점도가 측정된다. 예를 들어, 실온 (예를 들어, 약 20℃), 생리학적 온도 (예를 들어, 약 37℃), 생리학적 온도보다 높은 온도 (예를 들어, 약 37℃ 초과 내지 45℃ 또는 그 초과), 낮은 온도 (예를 들어, 약 -5℃ 내지 약 4℃), 또는 이러한 예시적인 온도들 사이의 온도에서 점도가 측정된다.
IX. 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 항원 및 관용원성 인자
일부 실시양태에서, 본 발명은 항원이 본원에 기술된 방법 중 임의의 것에 의해 세포에 전달되는, 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 항원의 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 단일 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 항원 혼합물이다. 항원은 특이적인 면역 반응, 예컨대 세포 또는 항체-매개 면역 반응을 자극하는 물질이다. 항원은 면역 세포가 발현하는 수용체, 예컨대 T 세포 수용체 (TCR)에 결합하고, 이는 특정 항원에 대해 특이적이다. 이어서 항원-수용체 결합이 세포내 신호전달 경로를 촉발하고, 이는 하류 면역 이펙터 경로, 예컨대 세포 활성화, 시토카인 생산, 세포 이동, 세포독성 인자 분비, 세포 아폽토시스, 및 항체 생산에 이른다.
일부 실시양태에서, 항원은 단백질 또는 폴리펩티드 항원이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 질환-연관 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 외래 출처, 예컨대 박테리아, 진균, 바이러스, 또는 알레르기원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 내부 출처, 예컨대 자기-단백질로부터 유래된다 (즉, 자기-항원). 일부 실시양태에서, 항원은 세포 용해물 내에 있다. 자기-항원은 생물 자신의 세포 상 또는 내에 존재하는 항원이다. 자기-항원은 정상적으로는 면역 반응을 자극하지 않지만, 자가면역 질환, 예컨대 I형 당뇨병 또는 류머티스성 관절염의 정황에서는 그럴 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 치료제이다. 일부 실시양태에서, 항원은 치료용 폴리펩티드, 또는 치료용 폴리펩티드의 단편이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 탄수화물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 응고 인자이다. 예시적인 응고 인자는, 비제한적으로, 인자 VIII 및 인자 IX를 포함한다. 예를 들어, 항원은 혈우병의 치료에서 사용되는 인자 VIII 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항체이다. 예시적인 치료용 항체는, 비제한적으로, 항-TNFα, 항-VEGF, 항-CD3, 항-CD20, 항-IL-2R, 항-Her2, 항-RSVF, 항-CEA, 항-IL-1베타, 항-CD15, 항-미오신, 항-PSMA, 항-40 kDa 당단백질, 항-CD33, 항-CD52, 항-IgE, 항-CD11a, 항-EGFR, 항-C5, 항-알파-4 인테그린, 항-IL-12/IL-23, 항-IL-6R, 및 항-RANKL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 성장 인자이다. 예시적인 치료용 성장 인자는, 비제한적으로, 에리트로포이에틴 (EPO) 및 거핵세포 분화 및 성장 인자 (MDGF)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 호르몬이다. 예시적인 치료용 호르몬은, 비제한적으로, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 및 난포 자극 호르몬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 재조합 시토카인이다. 예시적인 치료용 재조합 시토카인은, 비제한적으로, IFNβ, IFNα, 및 GM-CSF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 동종이식편 이식 항원이다. 동종이식편 이식은 동일한 종의 유전적으로 동일하지 않은 공여자로부터 수용자에게 세포, 조직 또는 장기를 전달하는 것이다. 일부 실시양태에서, 항원은 변형된 항원이다. 예를 들어, 항원은 치료제 또는 표적화 펩티드와 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 폴리펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항원은 지질과 융합된다. 일부 실시양태에서, 항원은 탄수화물과 융합된다. 일부 실시양태에서, 항원은 비-단백질 항원, 예컨대 지질, 당지질, 또는 다당류이다. 일부 실시양태에서, 항원은 전체 미생물, 예컨대 무손상 박테리아이다.
일부 실시양태에서, 항원은 바이러스와 연관된다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원이다. 예시적인 바이러스 항원은 SARS-CoV 항원 및 인플루엔자 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 미지의 병원체로 감염된 조직으로부터의 세포 용해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 치료용 비히클이다. 일부 실시양태에서, 치료용 비히클은 유전자 요법에 사용되는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료용 비히클은 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 치료용 비히클은 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 항원은 미생물, 예를 들어 박테리아와 연관된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 억제 및/또는 관용 유도는 미생물, 예를 들어, 박테리아에 대한 병원성 면역 반응 감소 또는 관용 유도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 개체의 마이크로바이옴의 일부이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 개체의 마이크로바이옴에 이로울 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 항원을 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 항원과 접촉되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 관용원성 환경에서의 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도한다. 일부 실시양태에서, 항원은 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 무핵 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 관용원성 인자가 본원에 기술된 방법 중 임의의 것에 의해 세포에 전달되는, 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 관용원성 인자의 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항원에 대한 면역 반응의 억제를 강화하고/하거나 항원에 대한 관용의 유도를 강화한다. 예를 들어, 관용원성 인자는 항원-제시 세포에 의한 항원의 관용원성 제시를 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항원과 동시에 도입된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자 및 항원은 순차적으로 도입된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα, 또는 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 탄수화물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은, 비제한적으로, mRNA, DNA, miRNA, 또는 siRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 관용원성 인자는 염증성 유전자의 발현을 녹-다운시키는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 NFκB에 결합하여 NFκB 활성화 및 하류 신호전달을 방지하는 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 소형 분자이다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역조정제 (예컨대 면역자극제 (예를 들어, 공동자극 분자), 면역억제제, 또는 염증성 또는 항염증성 분자)의 발현 및/또는 활성을 조정한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역자극제 (예를 들어, 공동자극 분자)의 발현 및/또는 활성을 저해하고/하거나, 면역억제성 분자의 발현 및/또는 활성을 강화하고/하거나, 염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 저해하고/하거나, 항염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 강화한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자의 활성을 저해한다. 공동자극 분자와 그의 리간드 사이의 상호작용은 최적의 T 세포 증식 및 분화를 자극하기 위해 TCR 신호전달을 지속 및 통합시키는데 중요하다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자의 발현을 저하시킨다. 항원-제시 세포 상에서 발현되는 예시적인 공동자극 분자는, 비제한적으로, CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79, 또는 ICOS 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동자극 분자는 CD80 또는 CD86이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자를 발현시키거나 또는 그의 발현을 조정하는 핵산의 발현을 저해한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자를 발현시키거나 또는 그의 발현을 조정하는 핵산을 결실시킨다. 일부 실시양태에서, 공동자극 분자를 발현시키거나 또는 그의 발현을 조정하는 핵산의 결실은 유전자 편집을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자를 저해한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자를 저해하는 siRNA이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자의 발현을 억제하는 전사 조절인자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자의 발현을 억제하는 단백질 저해제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자의 억제제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자를 분해시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동자극 분자를 파괴용으로 표지시킨다. 예를 들어, 관용원성 인자는 공동자극 분자의 유비퀴틴화를 강화함으로써, 이를 파괴용으로 표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 발현 및/또는 활성을 강화한다. 일부 실시양태에서, 면역억제성 분자는 공동-저해 분자, 전사 조절인자, 또는 면역억제성 분자이다. 공동-저해 분자는 림프구 활성화를 음성적으로 조절한다. 예시적인 공동-저해 분자는, 비제한적으로, PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, 면역글로불린-유사 전사체 (ILT) 수용체 (ILT2, ILT3, ILT4), FasL, CTLA4, CD39, CD73, 및 B7-H4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-저해 분자는 PD-L1 또는 PD-L2이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 발현을 강화하는 전사 조절인자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 발현을 증가시키는 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 인핸서를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 공동-저해 분자의 저해제를 저해한다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 예시적인 면역억제성 분자는, 비제한적으로, 아르기나제-1 (ARG1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 유도성 산화질소 신타제 (iNOS), 산화질소 (NO), 산화질소 신타제 2 (NOS2), 흉선 기질 림포포이에틴 (TSLP), 혈관 장 펩티드 (VIP), 간세포 성장 인자 (HGF), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ), IFNα, IL-4, IL-10, IL-13, 및 IL-35를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역억제성 분자는 NO 또는 IDO이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 발현을 강화하는 전사 조절인자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 발현을 강화하는 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 인핸서를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 면역억제성 분자의 음성 조절인자를 저해한다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 저해한다. 일부 실시양태에서, 염증성 분자는 염증성 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자를 저해한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 염증성 전사 인자는 NF-κB, 인터페론 조절 인자 (IRF), 또는 JAK-STAT 신호전달 경로와 연관된 분자이다. NF-κB 경로는 시토카인, 케모카인 및 부착 분자를 포함하는 염증유발성 유전자의 발현을 매개하는 원형 염증유발성 신호전달 경로이다. 인터페론 조절 인자 (IRF)는 염증유발성 유전자의 발현을 조절할 수 있는 전사 인자들의 패밀리를 구성한다. JAK-STAT 신호전달 경로는 세포외 시토카인 신호로부터의 정보를 핵으로 전달하여, 면역 세포 증식 및 분화에서 수반되는 유전자의 DNA 전사 및 발현을 초래한다. JAK-STAT 시스템은 세포 표면 수용체, 야누스 키나제 (JAK), 및 신호 전달인자 및 전사 활성화제 (STAT) 단백질로 이루어진다. 예시적인 JAK-STAT 분자는, 비제한적으로, JAK1, JAK2, JAK 3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 (STAT5A 및 STAT5B), 및 STAT6을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 시토카인 신호전달의 억제제 (SOCS) 단백질의 발현을 강화한다. SOCS 단백질은 JAK-STAT 경로를 통한 신호전달을 저해할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자를 코딩하는 핵산의 발현을 저해한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자를 코딩하는 핵산을 결실시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자의 발현을 억제하는 전사 조절인자의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자의 발현을 억제하는 단백질 저해제의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 염증성 전사 인자의 억제제를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 분자의 발현 및/또는 활성을 강화한다. 일부 실시양태에서, 항염증성 분자는 항염증성 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 전사 인자를 강화한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 전사 인자의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 전사 인자를 코딩하는 핵산의 발현을 강화한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 전사 인자의 발현을 억제하는 전사 조절인자의 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 전사 인자의 발현을 억제하는 단백질 저해제의 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항염증성 전사 인자의 인핸서를 코딩하는 핵산을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 관용원성 인자를 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 관용원성 인자와 접촉되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 무핵 세포에 전달된다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 핵산이다. 예시적인 핵산은, 비제한적으로, 재조합 핵산, DNA, 재조합 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, siRNA, mRNA, saRNA, miRNA, lncRNA, tRNA, guide RNA, 및 shRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 세포 내의 핵산과 상동성이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 세포 내의 핵산에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 치료용 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 치료용 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 siRNA, mRNA, miRNA, lncRNA, tRNA, 또는 shRNA를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 관용원성 인자는 염증성 유전자의 발현을 녹-다운시키는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 NFκB에 결합하여 NFκB 활성화 및 하류 신호전달을 방지하는 DNA 서열이다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 치료용 단백질, 항체, 융합 단백질, 항원, 합성 단백질, 리포터 마커, 또는 선별성 마커이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 유전자-편집 단백질 또는 뉴클레아제 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가 뉴클레아제, CRE 레콤비나제, 트랜스포사제, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CAS9 효소), DNA-가이드 엔도뉴클레아제, 또는 인테그라제 효소이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은, 비제한적으로, 키메라 단백질 약물 예컨대 항체 약물 접합체 또는 재조합 융합 단백질 예컨대 GST 또는 스트렙타비딘 태그가 부착된 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 전사 인자이다. 예시적인 전사 인자는, 비제한적으로, Oct5, Sox2, c-Myc, Klf-4, T-bet, GATA3, FoxP3, 및 RORγt를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα, 또는 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 펩티드 핵산 (PNA)이다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 단백질-핵산 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 단백질-핵산 복합체이다. 일부 실시양태에서, 단백질-핵산 복합체, 예컨대 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문식 반복물(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (CRISPR)-Cas9가 게놈 편집 용도에서 사용된다. 이러한 복합체는 비-특이적 DNA 절단 뉴클레아제와 조합된 서열-특이적 DNA-결합 도메인을 함유한다. 이러한 복합체는 특이적 유전자의 서열을 부가하거나, 파괴하거나 또는 변화시키는 것을 포함하여, 표적화된 게놈 편집을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 장애형 CRISPR가 표적 유전자의 전사를 차단 또는 유도하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA 또는 공여자 DNA를 함유한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 공여자 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 복합체는 공동자극 분자 (예를 들어, CD80 및/또는 CD86)의 발현을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 실시양태에서, CAR은 세포외 인식 도메인 (예를 들어, 항원-결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합체이다. 항원과 맞물리면, CAR의 세포내 신호전달 부분이 면역 세포에서 면역억제 또는 관용원성-관련 반응을 개시시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR은 키메라 T 세포 항원 수용체이다. 일부 실시양태에서, CAR 항원-결합 도메인은 단일쇄 항체 가변 단편 (scFv)이다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항원에 결합 시 면역억제성 시토카인의 생산을 촉발하는 세포질 신호전달 도메인을 함유하는 변형된 TCR을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 항원에 결합 시 면역억제성 시토카인의 생산을 촉발하는 세포질 신호전달 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 소형 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관용원성 인자는 소형 분자이다. 일부 실시양태에서, 소형 분자는 공동자극 분자의 활성을 저해하고/하거나, 공동-저해 분자의 활성을 강화하고/하거나, 염증성 분자의 활성을 저해한다. 예시적인 소형 분자는, 비제한적으로, 약제, 대사산물, 또는 방사성핵종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제는 치료용 약물 및/또는 세포독성제이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 나노입자를 포함한다. 나노입자의 예는 금 나노입자, 양자점, 탄소 나노튜브, 나노쉘, 덴드리머, 및 리포솜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 치료용 분자를 함유하거나 또는 이에 (공유결합으로 또는 비공유결합으로) 연결된다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 핵산, 예컨대 mRNA 또는 cDNA를 함유한다.
일부 실시양태에서, 전달될 화합물은 정제된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 적어도 약 60 중량% (건조 중량)가 관심 화합물이다. 일부 실시양태에서, 정제된 화합물은 적어도 약 75%, 90%, 또는 99%가 관심 화합물이다. 일부 실시양태에서, 정제된 화합물은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% (w/w)가 관심 화합물이다. 순도는 칼럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, HPLC 분석, NMR, 질량 분광법, 또는 SDS-PAGE를 비제한적으로 포함하는 임의의 공지된 방법으로 결정된다. 정제된 DNA 또는 RNA는 외인성 핵산, 탄수화물 및 지질이 없는 DNA 또는 RNA로서 정의된다.
일부 실시양태에서, 화합물은 중간체 화합물이다. 중간체 화합물은 선행 중간체로부터 형성되어 최종 반응 생성물을 추가로 제공하도록 반응하는 분자 실체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중간체 화합물은 단백질 전구체, 또는 전단백질이고, 이는 성숙한 기능성 형태의 단백질이 생산되도록 효소에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 중간체 화합물은 불활성 효소 전구체, 또는 효소원이며, 이는 활성 효소를 생산하도록 변형 또는 절단을 필요로 한다.
X. 용도
일부 측면에서, 본 발명은 화합물이 세포에 진입하도록 협착부에 통과시킴으로써 변형된 무핵 세포를 환자에게 도입하는 것에 의해 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 이러한 변형된 무핵 세포를 환자에게 도입하는 단계를 다중 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 초과 중 임의의 것)으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 환자로부터 단리하고, 개시된 방법에 따라 변형시키고, 다시 환자 내로 도입한다. 예를 들어, 무핵 세포 집단을 환자로부터 단리하고, 협착부에 통과시켜 화합물 전달을 달성한 후, 환자 내로 재주입하여 치료적 면역 반응을 증대시킨다. 일부 실시양태에서, 세포를 개체로부터 단리하고, 개시된 방법에 따라 변형시키고, 개체 내로 다시 도입한다. 예를 들어, 무핵 세포 집단을 개체로부터 단리하고, 협착부에 통과시켜 화합물 전달을 달성한 후, 환자 내로 재주입하여 개체에서 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도한다.
일부 실시양태에서, 무핵 세포를 범용 혈액 공여자 (예를 들어 O- 혈액 공여자)로부터 단리한 후, 추후의 협착-매개 전달 및 개체 내로의 도입을 위해 보관하고/하거나 동결시킨다. 일부 실시양태에서, 항원을 개체로부터 단리하고, 범용 공여자로부터 단리된 무핵 세포에 전달하고, 개체 내로 도입한다. 일부 실시양태에서, 무핵 세포를 혈액 공여자로부터 단리한 후, 추후의 협착 매개 전달 및 혈액 공여자와 혈액형이 맞는 개체 내로의 도입을 위해 보관하고/하거나 동결시킨다. 일부 실시양태에서, 항원을 개체로부터 단리하고, 혈액 공여자로부터 단리된 무핵 세포에 전달하고, 개체 내로 도입한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 화합물이 세포에 진입하도록 협착부에 통과시킴으로써 변형된 세포를 개체에게 도입하는 것에 의해 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 자가 세포이다. 예를 들어, 무핵 세포를 개체 (예를 들어, 환자)로부터 단리하고, 개시된 방법에 따라 변형시키고, 개체 내로 다시 도입한다. 일부 실시양태에서, 세포를 개체로부터 단리하고, 개시된 방법에 따라 변형시키고, 동일한 개체 내로 다시 도입한다. 일부 실시양태에서, 세포는 동종이형 세포이다. 예를 들어, 세포를 상이한 개체로부터 단리하고, 개시된 방법에 따라 변형시키고, 제1 개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입한다. 일부 실시양태에서, 다중 개체로부터의 세포의 풀을 개시된 방법에 따라 변형시키고, 제 1개체 (예를 들어, 환자) 내로 도입한다. 일부 실시양태에서, 세포를 개체로부터 단리하고, 개시된 방법에 따라 변형시키고, 상이한 개체 내로 도입한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단을 개체 (환자) 또는 상이한 개체로부터 단리하고, 협착부에 통과시켜 화합물 전달을 달성한 후, 환자 내로 재주입하여 치료 반응을 증대시킨다.
일부 실시양태에서, 치료는 본원에 기술된 바와 같은 변형된 무핵 세포를 개체에게 투여하는 단계를 다중 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6회, 또는 그 초과 중 임의의 것)으로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화합물이 세포에 진입하도록 협착부에 통과시킴으로서 변형된 세포를 개체에게 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과의 횟수로 투여함으로써 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 임의의 2회의 연속적인 세포 투여 사이의 기간은 적어도 약 1일 (예컨대 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 그 초과의 기간 (이러한 값들 사이의 임의의 범위를 포함함) 중 임의의 것)이다.
상기 기술된 방법 중 임의의 것이 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 수행된다. 생체내 용도를 위해, 장치가 혈관 내강에 이식될 수 있고, 예를 들어, 인-라인 스텐트가 동맥 또는 정맥 내에 이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자 세포의 생체외 치료 및 환자 내로의 즉각적인 세포 재도입을 위한 병상 시스템의 일부로서 사용된다. 이러한 방법은 개체에서 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 전형적인 병원 실험실에서 최소한도로 훈련된 기술자에 의해 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자 조작 치료 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액이 직접적으로 환자로부터 우회되고, 협착부를 통과하여, 혈액 세포로의 화합물 전달을 초래하며, 치료 후 환자 내로 직접적으로 다시 수혈되는 인-라인 혈액 치료 시스템을 사용하여 방법이 실행된다.
XI. 시스템 및 키트
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 협착부, 세포 현탁액 및 화합물을 포함하는 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 세포-변형 협착부를 제공하는 세공이 있는 표면 또는 미세유체 채널, 세포 현탁액, 세포 교란, 전달 파라미터, 화합물, 및/또는 용도 등을 포함하여, 상기 개시된 방법에 대해 기술된 임의의 실시양태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-변형 협착부는 무핵 세포로의 전달을 위한 크기이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 화합물의 최대 반응을 위해 전달 파라미터, 예컨대 작업 유속, 세포 및 화합물 농도, 협착부에서의 세포의 속도, 및 세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)이 최적화된다.
면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하도록 화합물을 전달하는데 사용하기 위한 키트 또는 제작품이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 적절한 포장재 내의 본원에 기술된 조성물 (예를 들어 미세유체 채널 또는 세공을 함유하는 표면, 세포 현탁액, 및/또는 화합물)을 포함한다. 적절한 포장재 물질은 관련 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 바이알 (예컨대 밀봉 바이알), 용기, 앰풀, 병, 단지, 가요성 포장재 (예를 들어, 밀봉 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이러한 제작품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기술된 방법의 성분들을 포함하는 키트를 또한 제공하고, 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위해 상기 방법을 수행하기 위한 설명서(들)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 임의의 본원에 기술된 방법을 수행하기 위한 설명서, 예를 들어, 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한 설명서가 있는 포장 삽입물을 포함하여, 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
XII. 예시적인 실시양태
실시양태 1. 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며,
a. 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및
b. 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인
방법.
실시양태 2. 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며,
a. 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및
b. 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 관용원성 인자는 면역 반응을 억제하는 관용원성 환경에 기여하는 것인
방법.
실시양태 3. 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며,
a. 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및
b. 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인
방법.
실시양태 4. 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며,
a. 제1 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계,
b. 제2 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및
c. 제1 무핵 세포 및 제2 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인
방법.
실시양태 5. 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법.
실시양태 6. 개체에서 면역 반응을 억제하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원 및 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 항원 및 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법.
실시양태 7. 관용원성 인자를 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 관용원성 인자와 접촉되는 것인 방법.
실시양태 8. 항원을 관용원성 환경 내로 도입하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되는 것인 방법.
실시양태 9. 항원 및 관용원성 인자를 관용원성 환경 내로 도입하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원 및 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 항원 및 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되는 것인 방법.
실시양태 10. 개체에서 항원-특이적 관용을 유도하는 방법이며,
a. 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및
b. 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인
방법.
실시양태 11. 개체에서 관용을 유도하는 방법이며,
a. 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및
b. 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 관용원성 인자는 관용을 유도하는 관용원성 환경에 기여하는 것인
방법.
실시양태 12. 개체에서 관용을 유도하는 방법이며,
a. 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계; 및
b. 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인
방법.
실시양태 13. 개체에서 항원-특이적 관용을 유도하는 방법이며,
a. 제1 무핵 세포를 포함하는 제1 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하는 것인 단계,
b. 제2 무핵 세포를 포함하는 제2 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하는 것인 단계, 및
c. 제1 무핵 세포 및 제2 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 단계
를 포함하며,
여기서 상기 항원 및 상기 관용원성 인자는 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인
방법.
실시양태 14. 개체에서 항원-특이적 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원을 포함하고, 여기서 항원은 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법.
실시양태 15. 개체에서 항원-특이적 관용을 유도하는 방법이며, 무핵 세포를 개체 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 무핵 세포는 항원 및 관용원성 인자를 포함하고, 여기서 항원 및 관용원성 인자는 무핵 세포를 협착부에 통과시키는 것에 의해 무핵 세포에 도입되었고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하였고, 여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 프로세싱되고, 여기서 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법.
실시양태 16. 항원을 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원이 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 항원과 접촉되는 것인 방법.
실시양태 17. 항원 및 관용원성 인자를 무핵 세포 내로 전달하는 방법이며, 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 협착부는 무핵 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 항원 및 관용원성 인자가 세포에 진입하고, 여기서 상기 세포 현탁액은 항원 및 관용원성 인자와 접촉되는 것인 방법.
실시양태 18. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 관용원성 환경에서의 상기 항원의 프로세싱 및 제시가 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 관용원성 환경에서의 상기 항원의 프로세싱 및 제시가 항원에 대한 관용을 유도하는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 1, 4, 5, 8, 10, 및 13-19 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항원이 세포 내로 도입되는 것인 방법.
실시양태 21. 실시양태 2-4, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 15, 및 17 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 관용원성 인자가 세포 내로 도입되는 것인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1-6, 8-15, 18, 및 19 중 어느 하나에 있어서, 관용원성 환경이 비장, 간 또는 림프절 내에 위치하는 것인 방법.
실시양태 23. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 협착부가 미세유체 채널 내에 함유되는 것인 방법.
실시양태 24. 실시양태 1-23 중 어느 하나에 있어서, 채널이 약 0.25 μm 내지 약 4 μm의 협착부 폭을 포함하는 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 1-24 중 어느 하나에 있어서, 채널이 약 4 μm, 3.5 μm, 약 3 μm, 약 2.5 μm, 약 2 μm, 약 1.5 μm, 약 1 μm, 약 0.5 μm, 또는 약 0.25 μm의 협착부 폭을 포함하는 것인 방법.
실시양태 26. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 협착부가 세공이거나 또는 세공 내에 함유되는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 세공이 표면 내에 함유되는 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 표면이 필터인 방법.
실시양태 29. 실시양태 27에 있어서, 표면이 막인 방법.
실시양태 30. 실시양태 26-29 중 어느 하나에 있어서, 세공 크기가 약 0.5 μm 내지 약 4 μm인 방법.
실시양태 31. 실시양태 26-30 중 어느 하나에 있어서, 세공 크기가 4 μm, 약 3 μm, 약 2 μm, 약 1 μm, 또는 약 0.5 μm인 방법.
실시양태 32. 실시양태 1-31 중 어느 하나에 있어서, 협착부 크기가 무핵 세포 직경의 함수인 방법.
실시양태 33. 실시양태 1-32 중 어느 하나에 있어서, 협착부 크기가 세포 직경의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%인 방법.
실시양태 34. 실시양태 1-33 중 어느 하나에 있어서, 방법이 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 수행되는 것인 방법.
실시양태 35. 실시양태 1-4, 7, 10-13, 및 16-34 중 어느 하나에 있어서, 세포 현탁액이 혼합 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, 세포 현탁액이 전혈인 방법.
실시양태 37. 실시양태 1-4, 7, 10-13, 및 16-34 중 어느 하나에 있어서, 세포 현탁액이 정제된 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 세포 현탁액이 정제된 무핵 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
실시양태 39. 실시양태 1-4, 7, 10-13, 및 16-38 중 어느 하나에 있어서, 세포 현탁액이 포유동물 세포를 포함하는 것인 방법.
실시양태 40. 실시양태 1-4, 7, 10-13, 및 16-39 중 어느 하나에 있어서, 세포 현탁액이 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포를 포함하는 것인 방법.
실시양태 41. 실시양태 1-4, 7, 10-13, 및 16-39 중 어느 하나에 있어서, 세포 현탁액이 인간 세포를 포함하는 것인 방법.
실시양태 42. 실시양태 1-41 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 적혈 세포인 방법.
실시양태 43. 실시양태 42에 있어서, 적혈 세포가 적혈구인 방법.
실시양태 44. 실시양태 42에 있어서, 적혈 세포가 망상적혈구인 방법.
실시양태 45. 실시양태 1-41 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 혈소판인 방법.
실시양태 46. 실시양태 1-45 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
실시양태 47. 실시양태 1-46 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 말, 래트, 양, 염소, 돼지, 또는 토끼 세포인 방법.
실시양태 48. 실시양태 1-46 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 인간 세포인 방법.
실시양태 49. 실시양태 1-5, 8-14, 및 22-48 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 개체로부터의 것인 방법.
실시양태 50. 실시양태 1-5, 8-14, 및 22-48 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포가 상이한 개체로부터의 것인 방법.
실시양태 51. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 세포 용해물 내에 위치하는 것인 방법.
실시양태 52. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 외래 항원인 방법.
실시양태 53. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 자기-항원인 방법.
실시양태 54. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 동종이식편 이식 항원인 방법.
실시양태 55. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 단백질 또는 폴리펩티드인 방법.
실시양태 56. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 용해물인 방법.
실시양태 57. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 미생물인 방법.
실시양태 58. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 지질 항원인 방법.
실시양태 59. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 탄수화물 항원인 방법.
실시양태 60. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-59 중 어느 하나에 있어서, 항원이 변형된 항원인 방법.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, 변형된 항원이 폴리펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
실시양태 62. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 변형된 항원이 치료제와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
실시양태 63. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 변형된 항원이 표적화 펩티드와 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
실시양태 64. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 변형된 항원이 지질과 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
실시양태 65. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 변형된 항원이 탄수화물과 융합된 항원을 포함하는 것인 방법.
실시양태 66. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 이식된 조직과 연관된 항원인 방법.
실시양태 67. 실시양태 1, 4, 5, 8-10, 및 13-50 중 어느 하나에 있어서, 항원이 바이러스와 연관된 것인 방법.
실시양태 68. 실시양태 1, 4, 10, 13, 및 16-67 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 현탁액이 협착부 통과 전에, 협착부 통과와 동시에, 또는 협착부 통과 후에 항원과 접촉되는 것인 방법.
실시양태 69. 실시양태 2-4, 7, 11-13, 및 22-68 중 어느 하나에 있어서, 관용원성 인자가 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 폴리펩티드가 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα, 또는 TGFβ인 방법.
실시양태 71. 실시양태 69에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 폴리펩티드인 방법.
실시양태 72. 실시양태 69에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 폴리펩티드의 단편인 방법.
실시양태 73. 실시양태 69에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 펩티드인 방법.
실시양태 74. 실시양태 69에 있어서, 폴리펩티드가 탄수화물에 접합되는 것인 방법.
실시양태 75. 실시양태 2-4, 7, 11-13, 및 22-74 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 현탁액이 협착부 통과 전에, 협착부 통과와 동시에, 또는 협착부 통과 후에 관용원성 인자와 접촉되는 것인 방법.
실시양태 76. 실시양태 1-75 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포의 반감기가 감소되는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 1-75 중 어느 하나에 있어서, 무핵 세포의 반감기가 증가되는 것인 방법.
실시양태 78. 실시양태 1-6, 18, 및 22-77 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응이 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 억제되는 것인 방법.
실시양태 79. 실시양태 1-6, 18, 및 22-78 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 하나 이상의 염증성 시토카인의 생산 및/또는 분비 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 80. 실시양태 79에 있어서, 하나 이상의 염증성 시토카인이 인터류킨-1 (IL-1), IL-12, 및 IL-18, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 (IFN-감마), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 81. 실시양태 1-6, 18, 및 22-78 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 하나 이상의 항염증성 시토카인의 생산 및/또는 분비 증가를 포함하는 것인 방법.
실시양태 82. 실시양태 81에 있어서, 하나 이상의 항염증성 시토카인이 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α 및 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 83. 실시양태 1-6, 18, 및 22-78 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 T 세포 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 84. 실시양태 83에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 활성화 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 85. 실시양태 83 또는 84에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 생존 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 86. 실시양태 83-85 중 어느 하나에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 증식 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 87. 실시양태 83-86 중 어느 하나에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 기능성 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 88. 실시양태 83-87 중 어느 하나에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 표현형에서의 변화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 89. 실시양태 1-6, 18, 및 22-88 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 T 세포의 비-공동자극 활성화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 90. 실시양태 1-6, 18, 및 22-89 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 Treg 반응 강화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 91. 실시양태 1-6, 18, 및 22-90 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 B 세포 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 92. 실시양태 91에 있어서, B 세포 반응 감소가 항체 생산 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 93. 실시양태 1-6, 18, 및 22-92 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 시토카인 생산 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 94. 실시양태 1-6, 18, 및 22-93 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 자가면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 95. 실시양태 1-6, 18, 및 22-94 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 알레르기 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 96. 실시양태 1-6, 18, 및 22-95 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 이식된 조직에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 97. 실시양태 1-6, 18, 및 22-95 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 바이러스에 대한 병원성 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 98. 실시양태 1-6, 18, 및 22-95 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 99. 실시양태 1-6, 18, 및 22-95 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응 억제가 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 100. 실시양태 10-15 및 19-77 중 어느 하나에 있어서, 관용이 하나 이상의 염증성 시토카인의 생산 및/또는 분비 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 101. 실시양태 100에 있어서, 하나 이상의 염증성 시토카인이 인터류킨-1 (IL-1), IL-12, 및 IL-18, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 (IFN-감마), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 102. 실시양태 10-15 및 19-77 중 어느 하나에 있어서, 관용이 하나 이상의 항염증성 시토카인의 생산 및/또는 분비 증가를 포함하는 것인 방법.
실시양태 103. 실시양태 102에 있어서, 하나 이상의 항염증성 시토카인이 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α 및 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 104. 실시양태 10-15 및 19-77 중 어느 하나에 있어서, 관용이 T 세포 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 105. 실시양태 104에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 활성화 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 106. 실시양태 104 또는 105에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 생존 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 107. 실시양태 104-106 중 어느 하나에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 증식 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 108. 실시양태 104-107 중 어느 하나에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 기능성 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 109. 실시양태 104-108 중 어느 하나에 있어서, T 세포 반응 감소가 T 세포 표현형에서의 변화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 110. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-109 중 어느 하나에 있어서, 관용이 T 세포의 비-공동자극 활성화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 111. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-110 중 어느 하나에 있어서, 관용이 Treg 반응 강화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 112. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-111 중 어느 하나에 있어서, 관용이 B 세포 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 113. 실시양태 112에 있어서, B 세포 반응 감소가 항체 생산 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 114. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-113 중 어느 하나에 있어서, 관용이 시토카인 생산 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 115. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-114 중 어느 하나에 있어서, 관용이 자가면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 116. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-115 중 어느 하나에 있어서, 관용이 알레르기 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 117. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-116 중 어느 하나에 있어서, 관용이 이식된 조직에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 118. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-116 중 어느 하나에 있어서, 관용이 바이러스에 대한 병원성 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 119. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-116 중 어느 하나에 있어서, 관용이 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 120. 실시양태 10-15, 19-77, 및 104-116 중 어느 하나에 있어서, 관용이 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 방법.
실시양태 121. 실시양태 1-120 중 어느 하나에 있어서, 방법이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 반복되는 것인 방법.
실시양태 122. 실시양태 121에 있어서, 방법의 임의의 2회의 반복 사이의 기간이 적어도 1일, 1주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년인 방법.
실시양태 123. 실시양태 1, 4, 10, 13 및 16-120 중 어느 하나의 방법에서 사용하기 위한, 협착부, 세포 현탁액 및 항원을 포함하는 시스템.
실시양태 124. 실시양태 2-4, 7, 11-13 및 22-120 중 어느 하나의 방법에서 사용하기 위한, 협착부, 세포 현탁액 및 관용원성 인자를 포함하는 시스템.
실시예
하기 실시예는 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하려는 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 목표를 수행하고 언급된 목적 및 장점, 뿐만 아니라 본원에 고유한 목표, 목적 및 장점을 수득하기 위해 본 개시내용이 잘 개조된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 청구항의 범주에 의해 정의되는 바와 같은 개시내용의 취지 내에 포함되는 본원에서의 변화 및 기타 용도가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다.
실시예 1: 덱스트란 및 IgG 항체의 인간 RBC로의 협착-매개 전달
개론
분자의 무핵 세포 내로의 필터-매개 전달을 평가하기 위해, 형광 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합된 인간 RBC를 규정된 크기의 세공을 함유하는 주사기 필터에 통과시키고, FACS 분석을 통해 세포내 입자 전달을 평가하였다.
물질 및 방법
시판 필터 및 홀더 조합 (COTS 필터)이 있는 2 μm 직경 세공 크기의 폴리카르보네이트 막 필터를 스털리테크(STERLITECH)™에서 수득하였다. 인간 RBC를 전혈 또는 류코프로덕션 칼라(leukoreduction collar)로부터 피콜(Ficoll) 구배 분리 방법을 사용하여 분리하고, 옵티멤(Optimem) 내에 원하는 농도 (50-500 M/mL)로 를 재현탁시켰다. 폴리카르보네이트 막 필터를 핀셋을 사용하여 옵티멤에 현탁시켜 막 필터를 습윤화시켰다. 플라스틱 필터 홀더의 뚜껑을 벗기고, 필터를 반짝이는 측면을 위로 향하게 하여 내부 표면 상에 놓고, 필터 홀더의 뚜껑을 다시 닫았다. 덱스트란 입자 및 IgG 항체를 0.1 mg/mL로 현탁시켰다. 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합된 1 mL의 세포를 실온에서 필터 홀더 내로 첨가하였다. 주사기에 대한 수동 핑거 푸시를 사용하여 세포를 필터에 밀어보냈다. 필터 관류물을 15 ml 팔콘(Falcon) 튜브 또는 FACS 튜브 내로 수집하였다. FACS 분석 전에, 모든 샘플을 원심분리하고, 4℃에서 4분 동안 400 rcf로 3회 세정하여, 세포외 덱스트란을 제거하였다. FACS 분석을 준비하기 위해, 하기 단계들을 행하였다. FACS 완충제를 제조하고 (PBS + 최종 농도: 1% FBS + 2 mM EDTA), 튜브당 400 μL의 FACS 완충제를 첨가하고, 세포를 재현탁시켰다. 모든 세포 이벤트를 가시화하도록 유동 세포측정법 전방 산란, 측면 산란 및 형광 채널 전압을 조정하고, ≥10,000개의 이벤트/샘플을 기록하였다. 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합되었지만 필터를 통과하지 않은 세포가 세포내이입을 통한 전달에 대한 대조군으로서 사용되었다. 이러한 세포는 염료와 접촉되었지만, 필터를 통과하지 않았다. 세포내이입 대조군에 대해 모든 다른 단계는 동일하였다.
결과
10 kDa 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647 덱스트란 입자 또는 알렉사 플루오르® 647에 접합된 150 kDa IgG 항체와 혼합된 RBC를 2 μm 크기의 필터 세공에 통과시켰다. 세포내이입 대조군에 대비된, 협착 매개 전달 (SQZ) 후의 형광 덱스트란 및 IgG의 전달 증가를 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯이 도 1a&b에 제시된다. 필터 전달 후 덱스트란 입자 또는 IgG 항체에 대해 양성인 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 전달 효율이 도 2a에 제시된다. 세포내이입 대조군에서의 둘 다의 분자에 대한 <10% 전달 효율에 비교하여, 필터 전달 후의 IgG 항체의 전달 효율은 88.6%였고, 덱스트란 입자의 전달 효율은 95.6%였다.
필터 전달 후에 세포 생육성을 측정하였다. 필터 전달 후 FSC 및 SSC 게이트 내에 존재하는 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 추정 세포 생육성이 도 2b에 제시된다. 필터 전달 후의 IgG 항체가 전달된 세포의 추정 생육성은 68.8%였고, 덱스트란 입자가 전달된 세포의 추정 생육성은 63.3%였다.
덱스트란 입자 및 IgG 항체의 인간 RBC 내로의 협착 매개 전달이 달성되었다.
실시예 2: 덱스트란 및 IgG 항체의 마우스 RBC로의 협착-매개 전달
개론
분자의 무핵 세포 내로의 필터-매개 전달을 평가하기 위해, 형광 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합된 마우스 RBC를 규정된 크기의 세공을 함유하는 주사기 필터에 통과시키고, FACS 분석을 통해 세포내 입자 전달을 평가하였다.
물질 및 방법
시판 필터 및 홀더 조합 (COTS 필터)이 있는 1 μm 및 2 μm 직경 세공 크기의 폴리카르보네이트 막 필터를 스털리테크™에서 수득하였다. 백색 혈액을 회전으로 침강시키고, 세포를 옵티멤 내에 원하는 농도 (100-500 M/ml)로 재현탁시켰다. 폴리카르보네이트 막 필터를 핀셋을 사용하여 옵티멤에 현탁시켜 막 필터를 습윤화시켰다. 플라스틱 필터 홀더의 뚜껑을 벗기고, 필터를 반짝이는 측면을 위로 향하게 하여 내부 표면 상에 놓고, 필터 홀더의 뚜껑을 다시 닫았다. 덱스트란 입자 및 IgG 항체를 0.1 mg/mL로 현탁시켰다. 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합된 1 mL의 세포를 실온에서 필터 홀더 내로 첨가하였다. 주사기에 대한 수동 핑거 푸시를 사용하여 세포를 필터에 밀어보냈다. 대안적으로, 압력 제어 시스템을 사용하여 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합된 200 μL의 세포를 필터에 밀어보냈다. 필터 관류물을 15 ml 팔콘 튜브 또는 FACS 튜브 내로 수집하였다. FACS 분석 전에, 모든 샘플을 원심분리하고, 24℃에서 10분 동안 1000 rcf로 3회 세정하여, 세포외 덱스트란을 제거하였다. FACS 분석을 준비하기 위해, 하기 단계들을 행하였다. FACS 완충제를 제조하고 (PBS + 최종 농도: 1% FBS + 2 mM EDTA), 튜브당 400 μL의 FACS 완충제를 첨가하고, 세포를 재현탁시켰다. 모든 세포 이벤트를 가시화하도록 유동 세포측정법 전방 산란, 측면 산란 및 형광 채널 전압을 조정하고, ≥10,000개의 이벤트/샘플을 기록하였다. 덱스트란 입자 또는 IgG 항체와 혼합되었지만 필터를 통과하지 않은 세포가 세포내이입을 통한 전달에 대한 대조군으로서 사용되었다. 이러한 세포는 염료와 접촉되었지만, 필터를 통과하지 않았다. 세포내이입 대조군에 대해 모든 다른 단계는 동일하였다. NC (접촉 없음) 샘플은 염료와 접촉되지 않았으나, 실험 샘플과 동일한 단계들에 적용되었지만, 필터를 통과하지 않았다.
결과
IgG 항체 (150 kDa)와 혼합된 마우스 RBC를 수동 주사기 압력을 사용하여 1 μm 및 2 μm 크기 필터 세공에 통과시켰다. 세포내이입 (Endo), 음성 (NC), 및 물질 없음 대조군에 대비된, 협착 매개 전달 (SQZ) 후의 형광을 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯이 도 3a에 제시된다. '물질 없음' 대조군은 IgG 항체와 접촉되지 않았지만, 실험 샘플과 동일한 단계들에 적용되었고, 필터를 통과하였다.
필터 전달 후에 세포 생육성을 측정하였다. 수동 주사기 압력을 사용한 IgG 항체의 필터 전달 후 FSC 및 SSC 게이트 내에 존재하는 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 추정 세포 생육성이 도 3b에 제시되고, 필터-매개 전달은, 도 3c에 제시된 바와 같이, 대조군에 대비하여 추정 생육성을 ~70%만큼 감소시켰지만, 4-12배 더 높은 IgG 항체의 전달 효율을 초래하였다.
70 kDa 알렉사 플루오르® 488 덱스트란 입자 및 알렉사 플루오르® 647에 접합된 IgG 항체 (150 kDa)와 혼합된 RBC를 압력 제어 시스템을 사용하여 2 psi, 4 psi, 6 psi, 10 psi, 20 psi 하에 또는 수동 주사기 압력을 사용하여 2 μm 크기 필터 세공에 통과시켰다. 세포내이입 (Endo - 도 4a), 음성 (NC - 도 4b), 및 물질 없음 대조군 (도 4c)에 대비된, 협착 매개 전달 (SQZ - 도 4d-i) 후의 형광을 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯이 도 4a-i에 제시된다. 이러한 데이터는 Endo, NC 및 물질 없음 대조군에 비교 시 필터-매개 전달이 덱스트란 및 IgG 전달에서의 55%까지의 증가를 초래하였음을 제시하였다. 필터 전달 후에 세포 생육성을 또한 측정하였다. 덱스트란 입자의 필터 전달 후 FSC 및 SSC 게이트 내에 존재하는 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 추정 세포 생육성이 도 5a에 제시된다. 필터 전달 후 덱스트란 입자 또는 IgG 항체에 대해 양성인 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 전달 효율이 도 5b에 제시된다. 덱스트란 입자 또는 IgG 항체의 필터 전달 후의 기하 평균 형광이 도 5c에 제시된다.
70 kDa 알렉사 플루오르® 488 덱스트란 입자와 혼합된 RBC를 압력 제어 시스템을 사용하여 10 psi, 12 psi, 14 psi, 16 psi, 또는 18 psi 하에 2 μm 크기 필터 세공에 통과시켰다. 세포내이입 (Endo), 및 음성 (NC) 대조군에 대비된, 협착 매개 전달 (SQZ) 후의 형광을 도시하는 예시적인 유동 세포측정법 히스토그램 플롯이 도 6a에 제시된다. 필터 전달 후에 세포 생육성을 측정하였다. 덱스트란 입자의 필터 전달 후 FSC 및 SSC 게이트 내에 존재하는 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 추정 세포 생육성이 도 6b에 제시된다. 필터 전달 후 덱스트란 입자에 대해 양성인 세포의 백분율에 의해 지시되는 바와 같은 전달 효율이 도 6c에 제시된다. 덱스트란 입자의 필터 전달 후의 기하 평균 형광이 도 6d에 제시된다.
덱스트란 입자 및 IgG 항체의 마우스 RBC 내로의 협착 매개 전달이 달성되었다.
실시예 3: 관용을 유도하기 위한, 항원의 RBC로의 협착-매개 전달
모델 항원 및 트랜스제닉 T 세포를 사용하여 관용 유도를 실연하기 위해 일련의 실험에 착수한다.
RBC를 OVA 항원과 혼합하고, 미세유체 채널 내의 협착부, 또는 세공을 함유하는 표면에 통과시킨다. 전달을 달성하도록 압력, 온도, 및 완충제 조성을 최적화한다. 그 후, OVA가 로딩된 RBC를 입양으로 전달된 CFSE-표지 OT-I 세포가 있는 CD45.1 마우스 내로 도입한다. 대안적으로, OT-I T 세포를 세포 외에서 활성화시킨 후 CD45.1 마우스 내로 전달한다. 9일 후, 관용원성 제시 및 후속 T 세포 결실을 허용하기 위해, 마우스에 가용성 OVA 및 LPS를 챌린지한다. 챌린지 4일 후, 비장 및 배출 림프절을 OT-I 증식에 대해 분석한다.
실시예 4: 관용을 유도하기 위한, 항원의 RBC로의 협착-매개 전달
SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 RBC가 생체내 항원-의존적 관용을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 항원-특이적 T 세포의 수 및 염증성 시토카인 IFN-γ의 수준을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
물질 및 방법
제0일에 암컷 OT-I 공여자 마우스 (CD45.2)로부터의 마우스당 1 M의 OVA-특이적 OT-I T 세포를 C57BL/6J 수용자 마우스 (CD45.1)에게 입양에 의해 전달하였다. 제1일 (프라이밍) 및 제6일 (부스팅)에, C57BL/6J 마우스로부터의 RBC를 수확하고, RBC를 완전 OVA 단백질과 함께 인큐베이션하거나, 또는 OVA를 필터-매개 SQZ 조건에 의해 전달한 후, 20-125 M RBC/마우스를 수용자 마우스 내로 주사하였다. 대조군 동물은 주사를 맞지 않았거나 (나이브), 또는 PBS (챌린지 대조군) 또는 유리 OVA (10 μg/동물 - 관용 대조군)를 주사하였다. 나이브 (항원 또는 LPS 없음)에 비교하여, 챌린지 동물에서의 10 μg OVA 단백질 + 50 ng LPS/마우스의 피내 주사로, 제15일에 항원을 챌린지하였다. 항원 챌린지에 대한 OT-I T 세포 반응을 제19일에 OT-I T 세포의 수에 대한 유동 세포측정법 및 IFN-γ 세포내 염색에 의해 측정하였다. 처리 스케줄의 개략도가 도 7에 제시되고, 처리군이 표 1에 요약된다.
표 1
Figure 112018120904975-pct00001
결과
OVA 단백질과 함께 인큐베이션된 RBC (RBC-Endo) 또는 SZQ에 의한 세포내 OVA 단백질 전달 (RBC-SQZ)로 처리된 군에 대해 항원 (OVA) 및 아주반트 (LPS)가 챌린지된 마우스에서 OT-I-특이적 T 세포 수를 측정하였다 (도 8). 이러한 조건들을 항원, 아주반트 또는 RBC를 만나지 않은 동물 (나이브), 또는 유리 OVA 단백질 (관용 대조군) 또는 PBS (챌린지 대조군)로 처리된 후 항원+아주반트가 챌린지된 마우스에 비교하였다. 챌린지 대조군에 비교 시 OVA 단백질이 SQZ된 RBC로 프라이밍/부스팅된 마우스에서 배출 림프절 및 비장 둘 다에서의 OT-I T 세포 수가 유의하게 저해되었다 (****P<0.0001). 이러한 마우스는 나이브 마우스 또는 관용 대조군과 유사한 OT-I T 세포 수를 나타낸 반면, OVA 단백질과 함께 인큐베이션된 RBC로의 처리는 챌린지 대조군와 상이하지 않았다.
T 세포 기능에 대한 SQZ RBC-매개 관용의 기능적 효과를 평가하기 위해, SIINFEKL 펩티드 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1) (활성 OVA 에피토프)로 재자극된 OT-I T 세포의 높은 수준의 IFN-γ를 발현한 비장 T 세포의 % (도 9, 좌측) 및 세포당 IFN-γ 생산 수준 (도 9, 우측; 모든 CD44hi 세포를 기초로 함)을 모든 군에 대해 세포내 시토카인 염색에 의해 평가하였다. OVA가 SQZ된 RBC로 처리된 마우스로부터의 OT-I T 세포는 챌린지 대조군에 비교 시 IFN-γ 고발현 세포에서의 수수하지만 유의한 감소 (**P<0.005) 및 IFN-γ 생산의 큰 감소 (****P<0.0001)를 제시하였고, 관용 대조군보다 감소가 더 컸다 (유리 Ova; **P<0.005). 그러나, OVA 단백질과 함께 인큐베이션된 RBC는 챌린지 대조군에 비교 시 IFN-γ 생산에서의 감소를 나타내지 않았다.
모든 CD8+ T 세포 중 OT-I T 세포의 비율 및 OT-I T 세포 중 IFN-γ 반응성 T 세포의 비율에 대한 대표적인 유동 사이토그램 (도 10, 표 2에 요약됨)은 RBC-SQZ 샘플이 챌린지 대조군 및 RBC-Endo 조건에 비교 시 OT-I가 더 적었고 IFNg 반응이 더 낮았다는 것을 제시한다.
표 2
Figure 112018120904975-pct00002
실시예 5: CD4+/CD8+ 매개 관용
SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 적혈 세포 (RBC)가 생체 내애서 CD4- 및/또는 CD8-매개 T 세포 항원-의존적 관용을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 항원-특이적 T 세포의 수 및 염증성 시토카인 IFN-γ의 수준을 유동 세포측정법에 의해 측정한다.
물질 및 방법
제0일에 암컷 공여자 마우스로부터의 마우스당 1 M의 OVA-특이적 CD8+ OT-I 및 2-4 M의 CD4+ OT-II T 세포 (둘 다 CD45.2+)를 C57BL/6J 수용자 마우스 (CD45.1+)에게 입양에 의해 전달한다. 제1일 (프라이밍) 및 제6일 (부스팅)에, C57BL/6J 마우스로부터의 RBC를 수확하고, RBC를 완전 OVA 단백질과 함께 인큐베이션하거나, 또는 OVA를 SQZ 조건에 의해 전달한 후, 20-125 M RBC/마우스를 수용자 마우스 내로 주사한다. 대조군 동물은 PBS (챌린지 대조군) 또는 유리 OVA (10 μg/동물 - 관용 대조군)를 주사한다. 챌린지 동물에서의 10 μg OVA 단백질 + 50 ng LPS/마우스의 피내 주사로, 제15일에 항원을 챌린지한다. 각각의 마우스의 배출 림프절 및 비장을 제19일에 분석하고, 항원 챌린지에 대한 OT-I 및 OT-II T 세포 반응을 OT-I 및 OT-II T 세포의 수에 대한 유동 세포측정법 및 IFN-γ 세포내 염색 및 ELI스폿 검정법에 의해 측정한다. 대표적인 처리 스케줄의 개략도가 도 7에 제시되고, 처리군이 표 3에 요약된다.
표 3
Figure 112018120904975-pct00003
실시예 6A: 뮤린 I형 당뇨병 모델에서의 예방
개론
SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 RBC가 뮤린 I형 당뇨병의 예방 생체내 모델에서 항원-의존적 관용을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 관용 유도 후에 경시적으로 매주 혈액 글루코스 수준을 측정할 것이다.
물질 및 방법
NOD/ShiltJ 마우스를 10주령에 RBC로 처리한다. 제0일 (프라이밍) 및 제5일 (부스팅)에, NOD/ShiltJ 마우스로부터의 RBC를 수확하고, RBC를 인슐린 B-쇄 펩티드 9-23 (InsB9-23: CKKGSSHLVEALYLVCGERG, 서열식별번호: 2)과 함께 인큐베이션하거나, 또는 InsB9-23을 SQZ 조건에 의해 전달한 후, 20-125 M RBC/마우스를 수용자 마우스 내로 주사한다. 대조군 동물은 PBS (챌린지 대조군)을 주사한다. 처리 후 제7일 (11주령)에 시작하여, 매주 혈액 글루코스 측정을 수행한다. 바이엘 컨투어 당뇨병 측정기/글루코스 테스트 스트립(Bayer Contour Diabetes Meter/Glucose Test Strip)에 의해 측정 시 혈액 글루코스 수준이 260 mg/dL를 초과할 때 마우스가 당뇨병으로 간주된다. 대표적인 처리 스케줄의 개략도가 도 11a에 제시되고, 처리군이 표 4에 요약된다.
표 4
Figure 112018120904975-pct00004
실시예 6B: 뮤린 I형 당뇨병에서의 치료법
개론
SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 RBC가 뮤린 I형 당뇨병의 치료 생체내 모델에서 항원-의존적 관용을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 마우스에서의 관용 유도 후에 경시적으로 매주 혈액 글루코스 수준을 측정할 것이다.
물질 및 방법
수용자에서 T1D의 신속한 발병을 유도하기 위해, CD4 T 세포를 BDC2.5 NOD 마우스로부터 수확하고, 4일 동안 p31 미메토프 펩티드 (YVRPLWVRME, 서열식별번호: 3)로 생체 외에서 활성화시키고, 정상혈당성 NOD 수용자 내로 입양에 의해 전달한다 (5 M 세포/마우스). 입양 전달 8시간 후 관용 유도를 시작하고, 총 3회의 용량에 대해 3일 마다 반복한다. 수용자를 PBS (챌린지 대조군) 또는 p31과 함께 인큐베이션되거나 (RBC-Endo) 또는 SQZ에 의해 p31이 전달된 (RBC-SQZ) 20-125 M RBC로 처리한다. 바이엘 컨투어 당뇨병 측정기/글루코스 테스트 스트립에 의해 혈액 글루코스를 매일 측정한다. 혈액 글루코스 수준이 260 mg/dL를 초과할 때 마우스가 당뇨병으로 간주된다. 대표적인 처리 스케줄의 개략도가 도 11b에 제시되고, 처리군이 표 5에 요약된다.
표 5
Figure 112018120904975-pct00005
실시예 7A: 뮤린 MS형 자가면역 장애에서의 예방
개론
SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 RBC가 뮤린 MS형 자가면역 장애의 생체내 예방 모델에서 항원-의존적 관용을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 경시적으로 매일 임상 기동성 점수를 평가할 것이다.
물질 및 방법
암컷 C57BL/6 마우스 (10-12주령)를 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)의 유도 전에 RBC로 처리한다. 제-7일 (프라이밍) 및 제-2일 (부스팅)에, C57BL/6 마우스로부터의 RBC를 수확하고, RBC를 협착 없이 미엘린 핍지교세포 당단백질 펩티드 35-55 (MOG35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS, 서열식별번호: 4)와 함께 인큐베이션하거나, 또는 OVA323-339 펩티드 (음성 대조군: ISQAVHAAHAEINEAGRGS, 서열식별번호: 5) 또는 MOG35-55 펩티드를 SQZ 조건에 의해 RBC에 전달한 후, 20-125 M RBC/마우스를 수용자 마우스 내로 주사한다. 제0일에, CFA 내의 MOG35-55 및 PBS 내의 백일해 독소 (후크(Hooke) 키트)의 투여에 의해 EAE를 유도한다. 제7일에 시작하여 매일 마우스를 채점하고, 임상 점수는 하기와 같이 정의된다: 1, 꼬리 늘어짐; 2, 부분적인 뒷다리 마비; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 마비 및 부분적인 앞다리 마비; 및 5, 빈사. 대표적인 처리 스케줄의 개략도가 도 12a에 제시되고, 처리군이 표 6에 요약된다.
표 6
Figure 112018120904975-pct00006
실시예 7B: 뮤린 MS형 자가면역 장애에서의 치료법
개론
SQZ에 의해 전달된 항원을 함유하는 RBC가 확립된 뮤린 MS형 자가면역 장애의 생체내 모델에서 항원-의존적 관용을 유도하는 능력을 결정하기 위해, 경시적으로 매일 임상 기동성 점수를 평가할 것이다.
물질 및 방법
암컷 C57BL/6 마우스 (10-12주령)에서, 제0일에 CFA 내의 MOG35-55 및 PBS 내의 백일해 독소 (후크 키트)의 투여에 의해 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)을 유도한다. 그 후, 하기의 기동성 기준을 기초로 마우스의 점수가 ≥1이면 발생하는 EAE의 발병일에 마우스를 RBC로 처리한다. 제~11/12일 (프라이밍) 및 제~17/18일 (부스팅)에, C57BL/6 마우스로부터의 RBC를 수확하고, RBC를 협착 없이 미엘린 핍지교세포 당단백질 펩티드 35-55 (MOG35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS, 서열식별번호: 4)와 함께 인큐베이션하거나, 또는 OVA323-339 펩티드 (음성 대조군: ISQAVHAAHAEINEAGRGS, 서열식별번호: 5) 또는 MOG35-55 펩티드를 SQZ 조건에 의해 RBC에 전달한 후, 20-125 M RBC/마우스를 수용자 마우스 내로 주사한다. 제19일에 시작하여 매일 마우스를 채점하고, 임상 점수는 하기와 같이 정의된다: 1, 꼬리 늘어짐; 2, 부분적인 뒷다리 마비; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 마비 및 부분적인 앞다리 마비; 및 5, 빈사. 대표적인 처리 스케줄의 개략도가 도 12b에 제시되고, 처리군이 표 7에 요약된다.
표 7
Figure 112018120904975-pct00007
서열 목록
Figure 112018120904975-pct00008
SEQUENCE LISTING <110> SQZ BIOTECHNOLOGIES COMPANY GILBERT, Jonathan B. WANG, Bu LOUGHHEAD, Scott BERNSTEIN, Howard SHAREI, Armon R. MOORE, Finola <120> INTRACELLULAR DELIVERY OF BIOMOLECULES TO INDUCE TOLERANCE <130> 750322001140 <140> PCT/US2017/030932 <141> 2017-05-03 <150> 62/331,368 <151> 2016-05-03 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Pro Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Pro Cys Lys Lys Gly Ser Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly 20 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Pro Tyr Val Arg Pro Leu Trp Val Arg Met Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Pro Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His 1 5 10 15 Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Ser 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Pro Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5 10 15 Gly Arg Gly Ser 20

Claims (124)

  1. 개체에서 면역 반응을 억제하거나 또는 관용을 유도하기 위한, 항원 또는 항원 및 관용원성 인자를 포함하는 무핵 세포이며,
    여기서 상기 항원 또는 항원 및 관용원성 인자를 포함하는 무핵 세포가 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시킴으로써 생성되고, 여기서 상기 협착부는 세포를 변형시킴으로써 세포의 교란을 야기하여 세포와 접촉된 항원 또는 항원 및 관용원성 인자가 무핵 세포에 진입하도록 하며,
    여기서 상기 항원은 관용원성 환경에서 무핵 세포의 아폽토시스 시에 방출되고, 이어서 항원-제시 세포에 의해 포식되고, 프로세싱되어 제시되며, 상기 관용원성 환경에서의 상기 항원의 제시는 항원에 대한 면역 반응을 억제하거나 또는 항원-특이적 관용을 유도하고, 상기 관용원성 인자는 면역 반응을 억제하거나 항원-특이적 관용에 기여하는 관용원성 환경에 기여하며,
    여기서 관용원성 인자는
    (a) IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα 또는 TGFβ를 포함하고/하거나;
    (b) CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79, ICOS 리간드, NF-카파 B, IRF 또는 JAK-STAT 신호전달 분자 중 하나 이상의 억제제를 포함하고/하거나;
    (c) PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, ILT2, ILT3, ILT4, FasL, CTLA4, CD39, CD73, B7-H4, 아르기나제-1(ARG1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 유도성 산화질소 신타제(iNOS), 산화질소(NO), 산화질소 신타제 2(NOS2), 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP), 혈관 장 펩티드(VIP), 간세포 성장 인자(HGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ), IFNα, IL-4, IL-10, IL-13 및 IL-35 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성을 강화하는 것인, 무핵 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 항원 및 적어도 하나의 추가적인 항원을 포함하고/거나;
    (b) 관용원성 인자 및 적어도 하나의 추가적인 관용원성 인자를 포함하는 것인, 무핵 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 협착부 크기가 무핵 세포 직경의 함수인 무핵 세포.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 협착부 크기가 세포 직경의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70%인 무핵 세포.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 현탁액이 혼합 세포 집단을 포함하는 것인 무핵 세포.
  6. 제5항에 있어서, 세포 현탁액이 전혈인 무핵 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 현탁액이 정제된 세포 집단을 포함하는 것인 무핵 세포.
  8. 제7항에 있어서, 세포 현탁액이 정제된 무핵 세포 집단을 포함하는 것인 무핵 세포.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 세포 현탁액이 인간 세포를 포함하고/거나;
    (b) 무핵 세포가 적혈 세포 또는 혈소판이고/거나;
    (c) 무핵 세포가 인간 세포인, 무핵 세포.
  10. 제9항에 있어서, 무핵 세포가 적혈 세포이고, 적혈 세포가 적혈구 또는 망상적혈구인, 무핵 세포.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 무핵 세포가 개체 또는 상이한 개체로부터의 것인, 무핵 세포.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이
    (i) 세포 용해물 내에 위치하거나;
    (ii) 외래 항원이거나;
    (iii) 자기-항원이거나;
    (iv) 동종이식편 이식 항원이거나;
    (v) 식품 알레르기원이거나;
    (vi) 이식된 조직과 연관된 항원이거나;
    (vii) 바이러스와 연관된 항원이거나; 또는
    (viii) 치료제인 것
    중 하나 이상인, 무핵 세포.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이 바이러스와 연관된 것이고, 여기서 바이러스가 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스 중 하나 이상인, 무핵 세포.
  14. 제13항에 있어서, 바이러스가 아데노-연관 바이러스인 무핵 세포.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이 치료제이고, 여기서 치료제가
    (a) 응고 인자;
    (b) 항체;
    (c) 성장 인자;
    (d) 호르몬; 또는
    (e) 재조합 시토카인
    중 하나 이상인, 무핵 세포.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이
    (i) 단백질 또는 폴리펩티드;
    (ii) 지질 항원; 또는
    (iii) 탄수화물 항원인, 무핵 세포.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이 용해물인 무핵 세포.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원이 변형된 항원인 무핵 세포.
  19. 제18항에 있어서, 변형된 항원이
    (a) 폴리펩티드와 융합된 항원;
    (b) 치료제와 융합된 항원;
    (c) 표적화 펩티드와 융합된 항원;
    (d) 지질과 융합된 항원; 및/또는
    (e) 탄수화물과 융합된 항원
    을 포함하는 것인 무핵 세포.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관용원성 인자가 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 폴리펩티드의 단편을 포함하는 것인 무핵 세포.
  21. 제20항에 있어서, 폴리펩티드가 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα, 또는 TGFβ인 무핵 세포.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이
    (a) 하나 이상의 염증성 시토카인의 생산 감소 및/또는 분비 감소; 및/또는
    (b) 하나 이상의 항염증성 시토카인의 생산 증가 및/또는 분비 증가
    를 포함하는 것인 무핵 세포.
  23. 제22항에 있어서,
    (a) 면역 반응 억제 또는 관용이 하나 이상의 염증성 시토카인의 생산 감소 및/또는 분비 감소를 포함하고, 여기서 하나 이상의 염증성 시토카인이 인터류킨-1 (IL-1), IL-12, 및 IL-18, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 (IFN-감마), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
    (b) 면역 반응 억제 또는 관용이 하나 이상의 항염증성 시토카인의 생산 증가 및/또는 분비 증가를 포함하고, 여기서 하나 이상의 항염증성 시토카인이 IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α 및 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 무핵 세포.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이 T 세포 반응 감소를 포함하는 것인 무핵 세포.
  25. 제24항에 있어서, T 세포 반응 감소가
    (a) T 세포 활성화 감소;
    (b) T 세포 생존 감소;
    (c) T 세포 증식 감소;
    (d) T 세포 기능성 감소; 및/또는
    (e) T 세포 표현형에서의 변화
    를 포함하는 것인 무핵 세포.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이
    (a) T 세포의 비-공동자극 활성화;
    (b) Treg 반응 강화;
    (c) B 세포 반응 감소; 및/또는
    (d) 시토카인 생산 감소
    를 포함하는 것인 무핵 세포.
  27. 제26항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이 B 세포 반응 감소를 포함하고, 여기서 B 세포 반응 감소가 항체 생산 감소를 포함하는 것인 무핵 세포.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이 자가면역 반응 감소를 포함하는 것인 무핵 세포.
  29. 제28항에 있어서, 자가면역 반응 감소가 제I형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 건선, 다발경화증, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌병, 크론병, 궤양성 결장염, 또는 면역 성분이 있을 수 있는 신경변성 질환과 연관된 항원에 대한 면역 반응 감소를 포함하는 것인 무핵 세포.
  30. 제29항에 있어서, 신경변성 질환이 알츠하이머병, 근위축성 축삭경화증 (ALS), 헌팅톤병 또는 파킨슨병인 무핵 세포.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이 알레르기 반응 감소를 포함하는 것인 무핵 세포.
  32. 제31항에 있어서, 알레르기 반응 감소가 식품 알레르기원에 대한 것인 무핵 세포.
  33. 제1항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이
    (a) 이식된 조직에 대한 면역 반응 감소;
    (b) 바이러스에 대한 병원성 면역 반응 감소;
    (c) 치료제에 대한 면역 반응 감소; 및/또는
    (d) 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소
    를 포함하는 것인 무핵 세포.
  34. 제33항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이
    (a) 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함하고, 여기서 치료제가 (i) 응고 인자 또는 (ii) 호르몬이고/거나;
    (b) 치료용 비히클에 대한 면역 반응 감소를 포함하고, 여기서 치료용 비히클이 바이러스인, 무핵 세포.
  35. 제34항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이 치료제에 대한 면역 반응 감소를 포함하고, 여기서
    (i) 치료제가 응고 인자이고, 여기서 응고 인자가 인자 VIII 또는 인자 IX이거나; 또는
    (ii) 치료제가 호르몬이고, 여기서 호르몬이 인슐린, 인간 성장 호르몬, 또는 난포 자극 호르몬인, 무핵 세포.
  36. 제33항 또는 제34항에 있어서, 면역 반응 억제 또는 관용이 바이러스에 대한 면역 반응 감소를 포함하고, 여기서 바이러스가 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스 중 하나 이상인, 무핵 세포.
  37. 제36항에 있어서, 바이러스가 아데노-연관 바이러스인 무핵 세포.
  38. 제1항 또는 제2항에서 정의된 방법에서 사용하기 위한,
    (a) 협착부;
    (b) 세포 현탁액;
    (c) 항원; 및/또는
    (d) 관용원성 인자
    를 포함하는 시스템.
  39. 항원 또는 항원 및 관용원성 인자를 포함하는 변형된 무핵 세포를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물이
    a) 입력 무핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시킴으로써 항원 또는 항원 및 관용원성 인자가 통과하기에 충분히 큰 입력 무핵 세포의 교란을 야기하여 교란된 입력 무핵 세포를 형성하는 단계이며, 여기서 협착부의 직경은 상기 현탁액 내의 입력 무핵 세포 직경의 함수인 단계; 및
    b) 교란된 입력 무핵 세포를 항원 또는 항원 및 관용원성 인자와 함께, 항원 또는 항원 및 관용원성 인자가 교란된 입력 무핵 세포에 진입할 수 있게 하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하여, 항원 또는 항원 및 관용원성 인자를 포함하는 변형된 무핵 세포를 생성하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이고,
    여기서 관용원성 인자는
    (a) IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα 또는 TGFβ를 포함하고/하거나;
    (b) CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79, ICOS 리간드, NF-카파 B, IRF 또는 JAK-STAT 신호전달 분자 중 하나 이상의 억제제를 포함하고/하거나;
    (c) PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, ILT2, ILT3, ILT4, FasL, CTLA4, CD39, CD73, B7-H4, 아르기나제-1(ARG1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 유도성 산화질소 신타제(iNOS), 산화질소(NO), 산화질소 신타제 2(NOS2), 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP), 혈관 장 펩티드(VIP), 간세포 성장 인자(HGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ), IFNα, IL-4, IL-10, IL-13 및 IL-35 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성을 강화하는 것인, 조성물.
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