KR101613675B1 - 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 면역관용 수지상 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법에 대한 것으로, 구체적으로 성숙되지 않은 수지상 세포에 로지글리타존을 접촉시키는 단계를 포함하는 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법에 대한 것이다. 이러한 방법에 의해 제조된 면역관용 수지상 세포는 우수한 조절 T 세포 유도능을 보였다. 따라서, 이러한 방법을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포는 우수한 조절 T 세포 유도능을 보이므로 세포 치료제로 활용가능성이 높다. 특히, 상기 세포치료제를 CIA 류마티스 관절염 동물모델에 주입시에, 보다 우수한 항류마티스 활성을 나타내었으므로, 향후 세포 치료제로 활용 가능성이 높다.

Description

면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 면역관용 수지상 세포{Method for preparing a immune tolerant dendritic cell and the immune tolerant dendritic cell prepared by the method}

본 발명은 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법 및 이를 통하여 수득된 면역관용 수지상 세포를 활용하는 것에 관한 것이다.

현재까지 개발된 생물학적 치료제는 표적대상에 따라 사이토카인 기능을 억제하는 사이토카인 차단제, T 림프구의 활성을 차단하는 약제, 그리고 발병기전에 관여하는 특정 세포군을 제거하는 약제로서 3가지로 구분된다. 최근 TNF-알파의 관절염 관련 분자 면역학적인 병리기전에 근거하여 류마티스 관절염 치료에 상당한 효과를 보이는 억제용 생물학적 제제가 개발되어 시판되고 있으며 항류마티스제인 DMARDs(Disease modifying antirheumatic drugs)에 반응하지 않는 중증의 류마티스 관절염 환자에서도 탁월한 효과를 보이는 것으로 보고되었다.

이들 생물학적 제제는 가격 면에서 환자 1인당 치료비가 1000 만원이 넘어 가격대비 효과가 미진한 사례가 상당수에 이르는 것으로 보고되고 있으며 1998년 FDA 허가 이래 레미케이드 R(Remicade R)을 투약한 509,000여 명 중 580명이 사망했으며, 특히 이들 환자 중 일부는 백혈구, 적혈구, 과립구, 혈소판 등의 감소로 출혈과 감염을 일으킨 사례가 보고되었다. 또한, 일부 환자들은 면역체계가 파괴되어 혈관이 붓는 등 중추신경계 장애 소견을 보여 혈액과 중추신경계에 심각한 부작용을 나타낼 수 있음이 최근 FDA 보고서에서 발표되었다. 기존의 류마티스 관절염 치료제에 대한 많은 한계점을 극복할 수 있는 새로운 차세대 치료제 개발이 시급히 요구되고 있다.

한편, 전 세계적으로 면역관용 수지상 세포를 이용한 류마티스 관절염 치료제 개발을 위해 진행 중인 임상연구는 2-3건 정도로 미미하나, 그 효과가 명확히 규명되지 않았다. 따라서, 부작용이 적고 효과가 우수한 면역관용 수지상 세포의 개발이 절실한 시점이다. 이러한 문제점을 해소하기 위해 연구하던 중, 염증억제 인자인 로지글리타존(Rosiglitazone)을 수지상 세포 제조과정에 첨가하였을 때, 보다 우수한 조절 T 세포 유도능을 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 성숙되지 않은 수지상 세포에 로지글리타존을 접촉시키는 단계를 포함하는 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 면역관용 수지상 세포를 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 상기 면역관용 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 자가 면역 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법은 성숙되지 않은 수지상 세포에 로지글리타존을 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “수지상 세포”는 항원을 세포내부로 흡수하고 이를 처리하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 펩타이드를 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 수지상 세포는 "dendritic cell" 또는 "DC"라고도 한다. 본 발명에서의 수지상 세포는 Steinman et al., Annual Rev. Immunol. 9:271-296, 1991 및 Banchereau and Steinman Nature 392:245-252, 1998.에 개시된 수지상 세포의 전형적인 표현형과 특성을 갖는 세포를 의미한다. 수지상 세포는 면역성(immunogenic) 및 면역관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells; "imDC"), 준성숙 수지상 세포(semimature dendritic cells; "smDC") 및 성숙 수지상 세포(mature dendritic cells; "mDC")로 분류한다.

본 명세서에서 용어 "미성숙 수지상 세포"는 성숙 수지상 세포와 마찬가지로 CD14와 같은 세포 표면 마커를 발현하지 않는다. 또한, 공동 자극 분자 CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 어느 하나가 성숙 수지상 세포에 비해 낮은 수준으로 발현한다. 미성숙 수지상 세포의 소스는 미성숙 수지상 세포 또는 증식 가능한 이들의 원조(progenitor)를 포함하는 조직 소스이며, 구체적으로 비장, 어패런트(afferent) 림프, 골수, 혈액 및 G-CSF 또는 FLT-3 리간드와 같은 사이토카인을 투여하여 유도된 혈액 세포를 포함한다. 미성숙 수지상 세포는 PCT 출원 WO 97/29182호에 개시된 바와 같이 혈액의 다능성 단핵세포 전구세포로부터도 유도될 수 있다. 이들 다능성 세포들은 CD14, CD32, CD68 및 CD115 단핵세포 마커를 발현하고, CD83, p55, CD40 및 CD86는 거의 발현하지 않는다. 다능성 세포를 사이토카인 GM-CSF와 IL-4 또는 IL-13의 존재 하에 배양하여 미성숙 수지상 세포를 유도한다. 미성숙 수지상 세포를 인 비트로 또는 인 비보에서 미성숙한 상태로 유지하기 위해서 변형시킬 수 있는데, 예를 들어 IL-10을 발현하는 벡터를 사용할 수 있다. 당 업자는 미성숙 수지상 세포를 분리하고 이들을 미성숙의 상태에서 유지하기 위해 공지된 방법에 변형을 가할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용되는 미성숙 수지상 세포는 동물의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명에서 이용되는 미성숙 수지상 세포는 동종동계(syngenic) 또는 동종이계(allogenic)의 수지상 세포를 사용 할 수 있다.

또한, 상기 미성숙 수지상 세포를 얻기 위한 과정에서 이용되는 배지로는, 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Waymouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항산화제(예컨대, β-머캅토에탄올)가 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

일 구체예로 상기 미성숙 수지상 세포는 골수유래 단핵구에서 적혈구를 제거한 후 분화시키는 방법으로 수득할 수 있다. 상기 골수유래 단핵구는 포유류의 뼈에서 수득할 수 있으며, 특히, 치료를 위한 개체의 골수에서 수득할 수 있다. 또한, 상기 골수유래 단핵구는 줄기세포를 분화시켜 수득할 수 있다. 상기 분화는 RPMI, FBS, GM-CSF 및 머캅토에탄올을 포함한 배지에서 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어“성숙 수지상 세포”는 미성숙 수지상 세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상 세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 II, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 발현이 높으며, 프로염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상 세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상 세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "준성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상 세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상 세포로서, 부분적으로 또는 불완전하게 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상 세포를 의미한다. 준성숙 수지상 세포는 일반적으로 자가-항원(self-antigen)에 대응하여 면역관용 반응을 유도하는 능력을 갖는다. 상기 준성숙 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포를 TNF-알파 존재하에서 배양하면서 수득될 수 있다. 상기 TNF-알파의 농도는 바람직하게는 0.1-100 ng/ml이고, 더욱 바람직하게는 1-50 ng/ml이며, 더욱 더 바람직하게는 5 - 20 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10 ng/ml이다.

또한, 상기 준성숙 수지상 세포를 얻기 위해서는 항원을 접촉시킬 수 있다. 상기 항원은 자가 항원일 수 있다. 상기 자가-항원은 자가 면역 반응의 타겟 항원, 알러젠(allergen), 이식체 항원(transplantation antigen) 등이 될 수 있다.

상기 타겟 항원으로는 루푸스 자가항원(lupus autoantigen), 스미스(Smith), Ro, La, U1-RNP, 피브릴린(피부경화증, scleroderma), GAD65 (당뇨병 관련), 인슐린, 미엘린 단백질, 히스톤, PLP, 콜라겐, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 시트룰리네이티드(citrullinated) 단백질 및 펩티드, 타이로글로불린, 다양한 tRNA 씬세타아제, 아세틸 콜린 수용체(AchR), MOG, 프로테나아제-3, 미엘로퍼옥시다아제 등이 있다.

상기 알러젠은 Fel d1 (아미노산 서열이 WO 91/06571에 공개되어 있는 애완용 고양이 Felis domesticus 의 고양이 피부 및 침샘의 알러젠), Der p I, Der p II, Der fI or Der fII (아미노산 서열이 WO 94/24281에 공개되어 있는 집 먼지 진드기로부터의 주요 단백질 알러젠), 잔디, 풀, 나무 및 잡초, 꽃가루로부터 유래되는 알러젠; 균류 및 곰팡이로부터 유래되는 알러젠; 물고기, 갑각류, 게, 롭스터, 땅콩, 콩, 밀, 글루텐, 달걀 및 우유와 같은 식품으로부터 유래되는 알러젠; 벌, 말벌, 호박벌과 같은 찌르는 곤충, 집파리, 초파리, 선박파리, 곡물 바구미, 누에, 꿀벌, 날벌레 유충, 벌 유충, 테니브리오 몰리터 유충, 딱정벌레와 같은 곤충 및 거미 및 집 먼지 진드기를 포함하는 진드기 등으로부터 유래되는 알러젠; 소, 개, 고양이, 돼지, 염소, 말, 토끼, 랫트, 기니아 피그, 마우스 및 게르빌루스쥐와 같은 포유류의 비듬, 오줌, 타액, 혈액 또는 다른 체액에서 발견되는 알러젠; 일반적으로 공기중의 입자; 라텍스(latex); 및 단백질 세척제 첨가제 등을 포함한다.

상기 이식체 항원은 공여자 세포 또는 조직으로부터 유래될 수 있고 외인성 항원의 부존재 하에서 자가-항원으로 로딩된 MHC를 갖는 공여자 항원-제시 세포로부터 유래될 수 있다.

상기 자가 항원은 바람직하게는 류마티스 관절염 특이 자가 항원일 수 있으며, 타입 II 콜라겐일 수 있다. 또한, 상기 TNF-알파와 항원을 동시에 접촉시킴으로서 미성숙 수지상 세포에서 준성숙 수지상 세포를 얻을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "로지글리타존"은 "rosiglitazone"라고도 하며, "(RS)-5-[4-(2-[methyl(pyridin-2-yl)amino]ethoxy)benzyl]thiazolidine-2,4-dione" 라고도 한다. 상기 로지글리타존은 제2형 당뇨병 치료제의 유효 성분으로 사용되고 있다. 또한, 염증억제인자로 작용하여 류마티스 관절염 치료에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "접촉"은 충분한 시간 및 조건 하에서 성숙되지 않은 수지상 세포에 로지글리타존이 영향을 줄 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게 배지 내에 로지글리타존 존재하에 성숙되지 않은 수지상 세포를 배양하는 것을 의미한다. 상기 로지글리타존은 성숙되지 않은 수지상 세포에 1시간 내지 24시간 가량 접촉시킬 수 있으며, 0.1 μM ~ 100 μM, 1 μM ~ 50 μM, 2 μM ~ 20 μM, 5 μM ~ 10 μM 의 농도로 접촉시킬 수 있다.

상기 로지글리타존은 TNF-알파와 동시에 미성숙 수지상 세포에 접촉시킬 수 있으며, TNF-알파를 미성숙 수지상 세포에 접촉시킨 후에 접촉시키는 것일 수 있다. 또한, 로지글리타존은 항원과 동시에 미성숙 수지상 세포에 접촉시킬 수 있으며, 항원을 미성숙 수지상 세포에 접촉시킨 후에 접촉시키는 것일 수 있다.

상기 성숙되지 않은 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포 또는 준성숙 수지상 세포일 수 있으며, 미성숙 수지상 세포 및 준성숙 수지상 세포는 상기에서 기술한 바와 같다.

상기 방법으로 제조된 면역관용 수지상 세포는 표면 항원형 분석 결과 준성숙 수지상 세포의 일종으로 분류될 수 있으나, 종래의 방법으로 분화시킨 준성숙 수지상 세포와는 다른 특징을 가지고 있음을 확인하였다. 특히, 조절 T 세포 유도능이 종래의 방법에 의해 분화된 준성숙 수지상 세포에 비하여 우수함을 확인하였다(도 8 내지 도 10). 따라서, 상기 제조 방법에 의해 제조된 면역관용 수지상 세포는 조절 T 세포의 유도를 통하여 다양한 면역 관련 질환을 치료하는데 적용될 수 있다.

또 다른 측면은 성숙되지 않은 수지상 세포에 로지글리타존을 접촉시키는 방법에 의해서 제조된 면역관용 수지상 세포를 제공한다. 상술한 바와 같이 성숙되지 않은 수지상 세포는 미분화 수지상 세포 또는 준성숙 수지상 세포일 수 있다. 또한, 상기 면역관용 수지상 세포는 준성숙 수지상 세포로서 공동 자극 분자 CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274 중 어느 하나를 성숙 수지상 세포에 비해 낮은 수준으로 발현하는 세포를 의미하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 면역관용 수지상 세포는 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T세포(regulatory T cell; Treg Cell)의 파퓰레이션을 증가시키는 작용을 한다. 특히, 로지글리타존을 처리하지 않은 종래의 방법에 의해 생성된 면역관용 수지상 세포에 비하여 그러한 효능이 우수함을 확인하였다(도 6 및 도 7).

또 다른 측면은 성숙되지 않은 수지상 세포에 로지글리타존을 접촉시키는 방법에 의해서 제조된 면역관용 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 면역관용 수지상 수지상 세포를 포함하는 약학적 조성물에 의해 치료가 가능한 질환은 자가 면역 질환일 수 있다. 상기 자가 면역 질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들어, 제 1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병 등이 있다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물이 적용되는 질병 또는 질환은 류마티스 관절염 일 수 있다.

본 명세서에서“약학적 유효량”은 약학적 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 상기 준성숙 수지상 세포의 수(number)는 특정의 세포수로 한정되지 않는다, 그러나, 바람직하게는 2× 10⁶ 세포수 미만, 보다 바람직하게는 1× 10⁶ 세포수 미만, 보다 더 바람직하게는 5× 10⁵ 세포수 미만, 보다 더욱 더 바람직하게는 5× 10⁵ 내지 2× 10⁵ 세포수 일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또 다른 측면은 상기 면역관용 수지상 세포를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 류마티스 관절염에 적용하는 것이므로 국부적으로 관절 내 혹은 피하 주입이 가장 바람직하다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 상기 기술된 바와 같다. 또한, 개체는 포유류 일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수있다.

또 다른 측면은 로지글리타존을 포함하는 면역관용 수지상 세포 분화용 배지를 제공한다. 상기 배지는 TNF-알파를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지는 자가 항원을 더 포함할 수 있다. 상기 자가 항원은 바람직하게는 류마티스 관절염 특이 자가 항원일 수 있으며, 타입 II 콜라겐일 수 있다.

본 발명의 일 측면은 염증억제 인자인 로지글리타존을 수지상 세포 제조과정에 첨가하였을 때 우수한 조절 T 세포 유도능을 보이는 면역관용 수지상 세포를 제조하는 것이다. 이러한 방법을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포는 우수한 조절 T 세포 유도능을 보이므로 세포 치료제로 활용가능성이 높다. 특히, 상기 세포치료제를 CIA 류마티스 관절염 동물모델에 주입시에, 보다 우수한 항류마티스 활성을 나타내었으므로, 향후 세포 치료제로 활용 가능성이 높다고 판단된다.

도 1은 성숙하지 않은 수지상 세포를 분화 후에 세포 표면에 있는 항원형을 유세포분석기를 통해 분석한 것이다. 이때, imDC는 미성숙 수지상 세포를 의미하며, conventional tDC는 로지글리타존을 처리하지 않는 종래의 방법으로 분화시킨 준성숙한 면역관용 수지상 세포를 의미하며, Rosi tDC는 로지글리타존을 처리하여 분화시킨 준성숙한 면역관용 수지상 세포를 의미하며, mDC는 성숙 수지상 세포를 의미한다.
도 2는 미분화, 준성숙, 성숙한 수지상 세포를 유세포분석기를 통해 분석했을 시 항원형의 강도를 측정한 것을 나타낸다.
도 3은 로지글리타존을 처리하지 않고 분화시킨 면역관용 수지상 세포와 로지글리타존을 처리하여 분화시킨 면역관용 수지상 세포의 항원형을 비교한 것이다.
도 4는 로지글리타존을 처리하지 않고 분화시킨 면역관용 수지상 세포와 로지글리타존을 처리하여 분화시킨 면역관용 수지상 세포를 유세포분석기를 통해 분석했을 시 항원형의 강도를 측정한 것을 나타낸다.
도 5는 미분화 수지상 세포, 준성숙 면역관용 수지상 세포 및 성숙한 수지상 세포가 분비하는 사이토카인 중 IL-10 및 IL-12p70의 분비량을 측정한 것이다.
도 6은 미분화 수지상 세포, 준성숙 면역관용 수지상 세포 및 성숙한 수지상 세포가 조절 T 세포를 유도하는 정도를 유세포분석기를 통하여 분석한 것을 나타낸 것이다. X축은 CD4의 발현 정도를, Y축은 FoxP3의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 미분화 수지상 세포, 준성숙 면역관용 수지상 세포 및 성숙한 수지상 세포가 조절 T 세포를 유도하는 정도를 유세포분석기를 통하여 분석한 것을 나타낸 것으로, FoxP3와 CD4 및 CD25의 발현 비율을 나타낸 것이다.
도 8은 미분화 수지상 세포, 준성숙 면역관용 수지상 세포 및 성숙한 수지상 세포가 콜라겐 유도 관절염 모델 동물에서 치료 효과를 확인한 것으로, 치료 효과를 확인하기 위하여 동물의 발바닥 두께를 측정한 값을 나타낸 것이다.
도 9는 미분화 수지상 세포, 준성숙 면역관용 수지상 세포 및 성숙한 수지상 세포가 콜라겐 유도 관절염 모델 동물에서 치료 효과를 확인한 것으로, 치료 효과를 확인하기 위하여 동물의 류마티스 점수를 측정한 값을 나타낸 것이다.
도 10은 미분화 수지상 세포, 준성숙 면역관용 수지상 세포 및 성숙한 수지상 세포가 콜라겐 유도 관절염 모델 동물에서 치료 효과를 사진으로 확인한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 미성숙, 준성숙 , 성숙 수지상 세포 제조

마우스의 목뼈 경골(tiba)과 대퇴골(femur)을 분리한 후 골수 유래 단핵구 (Bone-marrow derived cell, BMDC)를 분리하였다. 분리한 단핵구를 세척한 후, 적혈구(Red blood cell, RBC)를 ACK 라이싱 버퍼(Gibco®)로 제거 후, 세척하였다. 세척한 세포를 세포 스트레이너(cell strainer)(Biologix 사)를 통과하여 찌꺼기를 제거하였다. 세포 계수 후, RPMI1640(Gibco®), 10% FBS(Gibco®), 20 ng/mL rmGM-CSF(Gibco®), 50 nM 2-mercaptoethanol(life technologies^TM)이 포함된 배지로 2x10⁵ cell/mL로 세포를 희석한 후, 100mm 세포 배양 용기에 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 10 mL까지 배양을 시작하였다. 총 8일간 배양하였으며, 3일, 6일째 배지의 절반을 신선한 배지로 교체하여 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다.

8일간 분화시킨 미성숙 수지상 세포는 준성숙, 성숙 수지상 세포로 분화시키기 위해 부유세포를 모두 수거하였다. 그 후, RPMI1640, 10% FBS, 20 ng/mL rmGM-CSF, 50nM 2-mercaptoethanol이 포함된 배지에 현탁하였다. 그 후, 미성숙 수지상 세포에서 준성숙 수지상 세포로 분화시키기 위해 10ng/mL rmTNF-a를 4시간 동안 접촉시켰다. 또한, 미성숙 수지상 세포에서 성숙 수지상 세포로 분화시키기 위해 1 ug/mL LPS(lipopolysaccharide)(Sigma aldrich)를 24 시간 동안 접촉시켜, 성숙화를 유도하였다. 성숙화 유도 기간 동안 25 ug/mL 타입 II 콜라겐(Type II collagen)(Sigma aldrich)을 처리하여 항원정보를 제시하여 주었다. 성숙화 후, 부유된 세포를 모두 수거하여 수지상 세포의 물리, 생물학적 기능을 평가하였다.

또한, 면역관용 수지상 세포를 제작하기 위하여 로지글리타존을 처리하였다. 로지글리타존은 상기 준성숙 유도 기간 동안 10 uM 로 처리하였다. 이와 같이 로지글리타존을 처리하여 얻은 면역관용 수지상 세포의 물리, 생물학적 기능을 평가하였다. 로지글리타존을 처리하여 얻은 수지상 세포는 준성숙 수지상 세포와 동일한 표현형을 가짐을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 수지상 세포 (미성숙, 준성숙, 성숙)의 표면 항원형 분석

8일간 배양한 수지상 세포를 수거하여 표면 항원형을 분석하기 위해 FACS 염색 버포(staining buffer)를 사용하여 각 항원당 4x10⁴ ~ 2x10⁵ 세포를 각 튜브에 분주하였다. 분주한 세포는 수지상 세포 표면항원형은 PE(poly ethylene)가 결합된 CD11c, CD40, CD80, MHC II 및 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 결합된 CD14, CD54, CD86, MHC I으로 20분간 4℃, 암실에서 반응시켰다. 반응 후 PBS로 1500 rpm, 5 분간 원심분리 후, 상등액을 제거하고 세포를 단일세포로 잘 풀어서 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하여 표면항원을 검출하였다. 데이터는 FlowJo (Treestar, USA)를 이용하여 분석하였다(도 1, 도 2, 도 3 및 도 4).

실시예 3. 수지상 세포 (미성숙, 준성숙 , 성숙)의 사이토카인 분비능 확인

제조된 수지상 세포의 배양액을 수거하여 0.22 um 포어 사이즈로 필터링 한 후 각각의 사이토카인을 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다. 이중 IL-10 (eBioscience), IL-12p70 (BD)의 분비량을 측정하였고, 측정 결과는 도 5에서 보이는 바와 같다(도 5).

실시예 4. 수지상 세포와 T 세포 공동배양을 통한 조절 T 세포( Treg cell) 활성 강화 효과 확인

수지상 세포를 수거하는 날 naive DBA1/J 마우스의 비장을 적출하여 세포 스트레이너를 이용하여 조직을 곱게 갈아서 단일세포로 만든 후, RPMI 1640 배지에 넣고 1500 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. ACK 라이싱 버퍼를 이용하여 RBC 세포을 모두 용해(lysis)시켰다. 그 후, 다시 RPMI1640 배지를 이용하여 원심분리를 하였다. 분리된 세포는 CD4 분리 키트 (FluriSelect 사)를 이용하여 음성 선택(negative selection)을 실시하였다. 분리된 CD4+ T 세포을 계수한 다음 2x10⁶으로 현탁한 후, 6 웰 플레이트에 분주하였다. 이 후 각각의 수지상 세포를 2x10⁵로 현탁한 후, CD4+ T 세포가 분주된 플레이트에 넣어주었다. 배양은 37℃, 5% CO₂ 조건에서 72 시간 동안 배양하였다. 그 후, 떠 있는 모든 세포를 수거하여 단일항체 CD4-FITC, CD25-APC (BD)로 표면 염색을 실시한 후, FoxP3 염색 키트(eBioscience)를 이용하여 FoxP3-PE 단일클론항체로 염색하였다. 염색된 세포는 유세포분석기를 이용하여 FoxP3+CD4+CD25+ 세포를 검출하였다(도 6 및 도 7).

실시예 5. 콜라겐 유발 관절염( Collagen Induced Arthritis , CIA ) 동물 모델 유도 및 in vivo 동물 실험

관절염 모델을 유도하기 위하여, 타입 II 콜라겐 (Sigma 사)을 0.05 N 아세트산을 이용하여 4 mg/mL로 용액을 제조하였다. 1^st 면역 반응 유발시 Complete Freud's Adjuvant (Sigma 사)와 상기 콜라겐 용액을 1:1로 혼합한 혼합액을 제조하였다. 또한, 2^nd 면역 반응 유발시에는 Incomplete Freud's Adjuvant (Sigma 사)와 상기 콜라겐 용액을 1:1로 혼합한 혼합액을 제조하였다.

제조한 혼합액을 6 주령된 암컷 DBA1/J 마우스에 200 ug/100 uL씩 꼬리 피하주사를 실시하였다. 1^st 면역 반응 유발 후, 21일째 2^nd 면역 반응 유발을 실시하였다. 동물 실험의 그룹은 CIA 유도 후, PBS만 주사한 그룹과 종래의 방법으로 수득된 면역관용 수지상 세포(tDC)를 주사한 그룹, 로지글리타존을 처리한 면역관용 수지상 세포를 주사한 그룹 및 항원정보를 제공받지 못한 로지글리타존을 처리한 그룹과 항원정보를 잘못 제공받은 미오신(Myosin)을 처리한 그룹으로 총 5개의 그룹으로 나누었으며 그룹당 마우스는 총 6 마리씩 동물실험을 진행하였다.

실시예 6. Rosiglitasone - mediated tDC 의 CIA 억제 효과

유도된 CIA 마우스에 Rosiglitasone을 처리한 tDC의 효과를 입증하기 위하여 tDC를 1^st 면역 반응 유발 후 21일과 29일째 tDC를 피하주사하였다. 피하주사 후, 마우스의 CIA 유도 억제능을 확인하기 위하여 발 바닥의 두께 및 임상 점수(Clinical score)를 이용하여 측정하였다.

마우스는 22일 째부터 50일까지 2~3일 간격으로 모니터링 하였다. 임상 점수는 마우스 발바닥 당 3점을 만점으로 측정하였으며, 한 마리의 총점은 12점을 만점으로 측정하였다. 측정 기준은 하기와 같은 기준으로 설정하였다 : 0점 : 정상 관절, 1점 : 약한 염증 및 적열상태, 2점 : 심각한 홍반 및 전체 발에 부종, 3점 : 관절의 변형 및 굳음 또는 기능상실 상태.

발바닥의 두께는 캘리퍼(caliper)를 사용하여 측정하였으며, 모든 동물실험은 3명의 관찰자가 각각 따로 기록하였다. 데이터는 3명의 관찰자의 평균으로 나타내었다. 그 결과는 도 8 내지 도 10에 나타낸 바와 같다(도 8, 도 9 및 도 10). 결과에서 보는 바와 같이 항원과 로지글리타존을 동시에 접촉시켜 수득한 면역관용 수지상 세포를 투여한 실험군이, 다른 대조군 및 실험군에 비하여 발바닥의 두께가 가장 얇았으며(도 8), 류마티스 점수 또한 가장 낮음을 확인할 수 있었다(도 9).

본 발명에 의해 제조된 면역관용 수지상 세포는 우수한 조절 T 세포 유도능을 갖는다. 따라서, 이러한 방법을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포는 우수한 조절 T 세포 유도능을 보이므로 세포 치료제로 활용가능성이 높다. 특히, 상기 세포치료제를 류마티스 관절염제로서 산업적인 활용 가능성이 높다고 판단된다.

Claims (16)

1. 미성숙 수지상 세포에 종양괴사인자-알파 및 로지글리타존을 접촉시켜 면역관용 수지상 세포를 수득하는 단계를 포함하는 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법으로서,
   상기 미성숙 수지상 세포는 개체로부터 분리된 것이거나 또는 개체로부터 분리된 단핵구 세포로부터 분화된 것인 방법.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 로지글리타존은 종양괴사인자-알파와 동시에 미성숙 수지상 세포에 접촉시키거나 또는 종양괴사인자-알파를 미성숙 수지상 세포에 접촉시킨 후에 접촉시키는 것인 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포와 항원을 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 항원은 루푸스 자가항원(lupus autoantigen), 스미스(Smith), Ro, La, U1-RNP, 피브릴린, GAD65, 인슐린, 미엘린 단백질, 히스톤, PLP, 콜라겐, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 시트룰리네이티드(citrullinated) 단백질, 타이로글로불린, tRNA 씬세타아제, 아세틸 콜린 수용체(AchR), MOG, 프로테나아제-3, 및 미엘로퍼옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것인 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 로지글리타존은 0.1 μM 내지 100 μM인 것인 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 개체로부터 분리된 골수 유래 단핵구에서 적혈구를 제거한 후 분화시킨 것인 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 분화는 RPMI, FBS, GM-CSF 및 머캅토에탄올을 포함한 배지에서 수행되는 것인 방법.
9. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 면역관용 수지상 세포.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 면역관용 수지상 세포는 공동 자극 분자 CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 어느 하나가 성숙 수지상 세포에 비해 낮은 수준으로 발현되는 것인 면역관용 수지상 세포.
11. 청구항 9의 면역관용 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염인 것인 약학적 조성물.
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