KR100887560B1 - 준성숙 수지상 세포를 포함하는 류마티스 관절염 치료용약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)의 약제학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 준성숙 수지상세포는 현저하게 개선되고 안전한 류마티스 관절염의 면역 치료 활성을 갖는다.

류마티스성 관절염(Rheumatoid arthritis, RA), 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cells, smDCs), 조절 T세포(Regulatory T cells, Tregs)

Description

준성숙 수지상 세포를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Treating Rheumatoid Arthritis Comprising Semi-mature Dendritic Cell}

도 1은 TNF-α에 의해 자극된 수지상세포(Dendritic Cell, DC)가 준성숙(semi-mature) 표현형을 나타내는 것을 보여준다.

도 2는 준성숙 수지상세포(Semi-mature dendritic cell, smDC)의 면역억제 특성을 보여주는 실험결과이다.

도 3은 준성숙 수지상세포가 콜라겐 유도성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)의 발달의 억제를 촉진하는 것을 보여주는 실험결과이다.

도 4는 마우스 뒤쪽 다리의 조직학적인 분석결과이다.

도 5는 준성숙 수지상세포가 조절 T세포(regulatory T cell, Treg)의 생성 및 Th2 반응의 증대를 통해 콜라겐 유도성 관절염(CIA)을 억제하는 것을 보여주는 실험결과이다.

도 6은 준성숙 수지상세포의 수의 점진적 감소에 따라 조절 T 세포 파퓰레이션(population)이 증가하고 공동자극분자(co-stimulatory molecule)의 발현이 감소되는 것을 보여주는 실험결과이다.

도 7은 미성숙(immature), 준성숙(semi-mature) 및 성숙(mature) 수지상세포의 ESEM(Environmental Scanning Electron Microscope) 사진이다.

본 발명은 준성숙 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 자가 면역 질환, 특히 류마티스 관절염의 치료용 조성물에 관한 것이다.

수지상세포는 전문적인 항원 제시 세포(antigen presenting cell)로서, 병원체를 최초로 인식하며 주위 환경을 샘플링하고 신호(signal)의 농도에 의존하여 분화한다. 즉, 수지상세포는 조직이나 기관에서 식세포(macrophage)로서 작용하고 2차 림프기관에서는 항원 제시 세포로 기능하는데, 조직에서 병원체와 숙주세포로부터의 항원을 수집하여 림프절에서 원시 T세포(naive T cell)에 다양한 항원 샘플을 제시한다.

현재까지 알려진 바에 의하면, 수지상세포는 주위에 존재하는 환경적 신호에 종류에 따라 성숙도가 상이한 상태로 분화되어, 미성숙(immature), 준성숙(semi-mature) 및 성숙(mature) 수지상세포로 존재한다.

미성숙 수지상세포는 초기 성숙단계에서 발견되는 것으로서 세포간액(interstitial fluid)으로부터 부스러기 물질(debris)들을 수집하고 제거하는 1차적인 기능을 수행한다. 소화된 물질들은 세포에 의해 처리되는데, 세포내부에서 대사되어 사용되거나 주위환경으로 다시 되돌려 지거나 포장되어 다른 면역세포에게 제시된다. 이때 이러한 물질들을 항원이라고 하는데, 이들은 자가(self) 항원 또는 외래(foreign) 항원일 수 있다. 항원성 물질을 제시하는 과정은 MHC 분자와 복합체를 형성하는 과정을 포함하는데, MHC 복합체와 결합한 항원 형태만이 T세포 수용자에 인식될 수 있기 때문이다. 또한, T세포를 활성화시키기 위해서는 염증성 사이토카인의 발현이 필요하다. 따라서, 미성숙 수지상세포와 접촉한 T세포는 비활성화 된다. 미성숙 수지상세포의 분화는 다양한 신호를 수용하면서 개시되며, 이러한 분화는 수용되는 신호의 조합에 따라 완전한 분화 또는 부분적 분화에 이르게 된다.

미성숙 수지상세포는 발현되는 염증성 사이토카인의 수준이 낮기 때문에 T세포와 접촉하여도 T세포를 활성화 시킬 수 없다. T세포에 항원을 제시하면서 동시에 T세포를 활성화시키기 위해서는 다수의 단백질과 사이토카인이 발현되어야 한다. 원시 T세포(naive T cell)를 활성화시켜 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 갖는 수지상세포를 성숙 수지상세포라고 한다. 미성숙 수지상세포가 성숙 수지상세포로 분화되기 위해서는 다수의 특정 신호에 노출되어야 하는데, 외인성(exogeneous) 및 내인성(endogeneous)의 신호에 노출되어 toll-like 수용체가 활성화되는 것이 요구된다. 이러한 신호의 다양한 조합에 노출되면, 수지상세포는 T세포 반응을 자극하는데 필요한 다수의 분자를 상향조절(up-regulate)한다. 예를 들어, 다수의 공동 자극분자(co-stimulatory molecule)들과 IL-12와 같은 친-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 상향조절하고 조직으로부터 림프절로 이동한다. 이러한 이동기간동안에 미성숙 수지상세포는 형태적으로 변화하는데, 이때 성숙 수지상세포에 특징적으로 나타나는 손가락 같은 돌기들이 나타난다(도 7 참조).

항원을 수집하는 과정 중에서 미성숙 수지상세포는 다른 환경조건에 놓일 수 있는데, 이러한 조건이 수지상세포의 최종 분화단계에 영향을 미쳐 미성숙 수지상세포가 준성숙 수지상세포로 분화될 수 있다. 준성숙 수지상 세포를 생성하는 신호는 조직-내재성 신호에 의해 생성될 수 있다. 아폽토시스(apoptosis) 과정 중에서 다수의 단백질이 상향 조절되어 사멸하는 세포로부터 분비된다. 아폽토시스를 진행하는 세포에서 방출되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α)가 준성숙 수지상세포로의 분화에 기여하는 것으로 생각된다(Manfred B. Lutz and Gerold Schuler. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity ? Trends in Immunology, 23(9):991-1045, 2002).

TNF-α를 포함하여 아폽토시스 관련 사이토카인에 노출되면 미성숙 수지상세포도 역시 림프절로 이동하게 되고, 일정의 성숙과정을 거쳐 분화하게 된다(도 7 참조). 공동자극분자는 약하지만 상당한 정도의 양으로 상향 조절되고 림프절로 이동한 수지상 세포는 매칭되는 T세포에 항원을 제시할 수 있다. 그러나, 준성숙 수지상세포는 T세포를 활성화시키기에 필요한 정도의 양의 친염증성 사이토카인을 생성하지는 않는다. 대신에 준성숙 수지상 세포는 적은 양의 IL-10(항-염증성 사이토카인)을 생성하여 매칭되는 T세포의 면역반응 유도능을 억제하도록 작용한다.

자가면역(autoimmunity)은 자기의 항원 및 조직에 대한 비정상적인 면역반응으로 인한 염증반응으로 야기된다. 자가 면역질환에 있어서, 자기 항원을 공격하는 T세포가 관여하는 질환으로는 다발성 경화증(multiple sclerosis), 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM 또는 제 1 형 당뇨병) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)이 있다(KJ Johnson et al., Immunopathology in Pathology, pp104-153(1999)).

류마티스 관절염은 관절의 염증을 특징으로 하는 만성 전신성 자가 면역질환으로서, 관절의 염증은 계속적으로 관절 연골과 골 조직으로 침윤되어 이들 조직의 부식을 가져온다. 류마티스 관절염의 유발 가능한 원인 항원으로는 관절의 주요 구성성분인 제 2 형 콜라겐이 잘 알려져 있으며, 이를 특이 조직적합항원을 가지는 마우스에 주사할 경우 류마티스 관절염이 유발된다 (LK Myers 등, Life Sci., 19:1861-1878(1997)). 류마티스 관절염의 경우 발병 시 관절 내 대식세포나 섬유아세포에서 사이토카인의 생산이 증가되며 T 세포에 의한 림포카인도 Th1 세포에 의한 IFN-γ와 IL-2 생산이 항진되어 있는 것으로 보고 되었다. 이러한 Th1 세포에서 생산된 사이토카인은 관절염 증세를 악화시키는 반면 IL-4 및 IL-10 등과 같은 Th2 세포에 의해 생산된 사이토카인은 관절염을 예방하는 것으로 알려져 왔다. 또한 바이러스 벡터에 Th2 형 사이토카인인 IL-4 또는 IL-10을 발현시켜 관절염을 유도한 마우스의 관절 내에 주사할 경우 주사한 다리 이외에 다른 다리에서도 치료 효과를 나타냈다는 보고도 있었다 (SH Kim 등, J. Immunol., 166:3499-3505(2001)). 류마티스성 관절염의 치료제 또는 경감제로서 현재까지 개발된 것은 메토트렉세이드(methotrexate), 아자티오프린(azathioprine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 코티코스테로이드(corticosteroid) 등이 있다(Johnson CJ 등, Ann. Pharmacother., 35(4):464-471(2001), Seymour HE 등, Br. J. Clin. Pharmacol., 51(3):201-208(2001)). 그러나, 현재까지 개발된 류마티스성 관절염 치료제의 대부분은 큰 부작용이 있으며, 관절 손상의 발전을 크게 억제하지는 못하고 있는 실정이다.

한편, M. B. Lutz 등은 C57BL/6 마우스에서 TNF-α로 처리된 수지상 세포가 Th1 세포 매개된 자가 면역성 질환인 뇌척수염(encephalomyelitis)을 억제할 수 있다는 실험적 결과를 제시하고 있지만, 류마티스성 관절염의 치료 가능성에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다 (Menges, M., S. Rossner, C. Voigtlander, H. Schindler, N. A. Kukutsch, C. Bogdan, K. Erb, G. Schuler, and M. B. Lutz: Repetitive injections of dendritic cells matured with tumor necrosis factor- α induce antigen-specific protection of mice from autoimmunity. J. Exp . Med, 2002, 195: 15?21).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발 명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 항원 특이적 준성숙(semi-mature) 수지상세포가 면역관용적 반응을 유도한다는 사실에 기초하여, 마우스 골수로부터 미성숙 수지상세포로 분화한 후 적합한 사이토카인과 항원으로 처리하여 불완전하게 성숙시킨 준성숙 수지상세포가 인 비트로 및 류마티스 관절염 동물모델에서 면역관용적 반응과 류마티스 관절염의 치료 능력을 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 류마티스 관절염 치료용 준성숙 수지상세포를 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 준성숙 수지상세포를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 류마티스 관절염 치료용 준성숙 수지상세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cell)의 약제학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 항원 특이적 준성숙(semi-mature) 수지상세포가 면역관용 반응을 유도한다는 사실에 기초하여, 마우스 골수로부터 미성숙 수지상세포를 분화한 후 적합한 사이토카인과 항원으로 처리하여 불완전하게 성숙시킨 준성숙 수지상세포가 인 비트로 및 류마티스 관절염 동물모델에서 면역관용적 반응과 류마티스 관절염의 치료 능력을 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 용어 “수지상 세포(dendritic cell)”는 항원을 세포내부로 흡수하고 이를 처리하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 펩타이드를 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 본 발명에서의 수지상 세포는 Steinman et al., Annual Rev. Immunol. 9:271-296, 1991 및 Banchereau and Steinman Nature 392:245-252, 1998.에 개시된 수지 상 세포의 전형적인 표현형과 특성을 갖는 세포를 의미한다. 수지상 세포는 면역성(immunogenic) 및 면역관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells; "imDC"), 준성숙 수지상세포(semi-mature dendritic cells; "smDC") 및 성숙 수지상세포(mature dendritic cells; "mDC")로 분류한다.

본 명세서에서 용어 "미성숙 수지상세포“ 는 성숙 수지상세포와 마찬가지로 CD14와 같은 세포 표면 마커를 발현하지 않으며, CCR7 및 세포질 단백질 DC-LAMP을 낮은 수준으로 발현하고, 공동 자극 분자 CD40, CD80 및 CD86을 낮은 수준으로 발현하며, CD1a 및 CCR1, CCR2, CCR5 및 CXCR1을 통상적 수준으로 발현하는 수지상 세포를 말한다.

본 명세서에서 용어“성숙 수지상세포”는 미성숙 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 II, CD40, CD80, CD83 및 CD86의 증가된 발현을 나타내며, 친염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4을 높은 수준으로 발현한다.

본 명세서에서 용어 "준성숙 수지상세포"는 미성숙 수지상세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상 세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상 세포로서, 부분적으로(partially) 또는 불완전하게(incompletely) 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상세포를 의미한다. 준성숙 수지상세포는 일반적으로 자가-항원(self-antigen)에 대응하여 면역관용 반응을 유도하는 능력을 갖는다.

수지상세포의 표면 마커의 발현 프로파일링은 당 업계에 공지된 유세포 분석을 통하여 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 준성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포를 분화 유도시켜서 얻을 수 있다.

미성숙 수지상세포의 분리 및 배양 방법은 미국특허 제5,994,126호 및 PCT 출원 WO 97/29182호에 개시되어 있고, 관련 문헌의 전체 내용은 참조로서 본 명세서에 삽입된다.

미성숙 수지상세포의 소스는 미성숙 수지상세포 또는 증식 가능한 이들의 원조(progenitor)를 포함하는 조직 소스이며, 구체적으로 비장, 어패런트(afferent) 림프, 골수, 혈액 및 G-CSF 또는 FLT-3 리간드와 같은 사이토카인을 투여하여 유도된 혈액 세포를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 다른 타입의 세포에 대한 수지상세포 전구세포의 비율을 증가시키기 위해서, 조직 소스를 배양 전에 예를 들어 G-CSF, FLT-3, GM-CSF, M-CSF, TGF-β 및 트롬보포이에틴과 같은 자극 물질로 처리할 수 있다. 상기와 같이 처리하면 수지상세포의 원조세포들과 경쟁하여 수지상세포의 증식을 방해하는 세포들을 제거할 수 있다. 상기 전처리에 의해 조직 소스가 인 비트로 배양에 더욱 적합하게 될 수 있다. 전처리 방법은 특정 조직 소스에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 비장 또는 골수를 본 명세서에 참조로서 삽입되는 미국특허 제5,851,756호 및 제5,994,126호에 개시된 방법과 같은 적합한 방법에 의해 단일 세포를 얻기 위해 처리한다. 혈액에서 독성이 있는 적혈구를 포함하는 다른 타입의 세포들로부터 세포 분리 방법을 이용하여 백혈구를 분리한다. 상기 적혈구를 제거하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 상기 조직 소스는 혈액 또는 골수이다.

미성숙 수지상세포는 PCT 출원 WO 97/29182호에 개시된 바와 같이 혈액의 다능성 단핵세포 전구세포로부터도 유도될 수 있다. 이들 다능성 세포들은 CD14, CD32, CD68 및 CD115 단핵세포 마커를 발현하고, CD83, p55, CD40 및 CD86는 거의 발현하지 않는다. 다능성 세포를 사이토카인 GM-CSF와 IL-4 또는 IL-13의 존재 하에 배양하여 미성숙 수지상 세포를 유도한다. 미성숙 수지상세포를 인 비트로 또는 인 비보에서 미성숙한 상태로 유지하기 위해서 변형시킬 수 있는데, 예를 들어 IL-10을 발현하는 벡터를 사용할 수 있다. 당 업자는 미성숙 수지상세포를 분리하고 이들을 미성숙의 상태에서 유지하기 위해 공지된 방법에 변형을 가할 수 있다.

상기한 바와 같이, 적합한 조직 소스로부터 세포를 얻은 다음, 이 세포를 적합한 지지체(substrate)에서 배지(바람직하게는, GM-CSF로 보충된 배지)를 이용하여 일차 배양(primary culture)한다. 전능성 세포 또는 다능성 세포로부터 미성숙 수지상세포로의 분화를 촉진하는 물질, 특히 GM-CSF는 미국특허 제5,851,756호 및 제5,994,126호에 개시되어 있으며, 이들 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 기판은 바람직하게는 세포가 부착할 수 있는 기판을 포함하며, 바람직하게는 조직 배양에 사용되는 플라스틱이다.

미성숙 수지상세포의 수율을 증가시키기 위해, GM-CSF 이외에, 비-수지상세포 타입의 세포 증식을 막거나 억제하는 인자들을 배양배지에 첨가할 수 있다. 상기 인자들은, 예를 들어 대식세포를 억제하는 IL-4 및/또는 IL-13을 포함한다. 상기 인자들은 수지상세포 전구세포들의 증식을 촉진하는 반면 비-수지상세포 타입의 세포의 성장을 억제함으로써 배지에서 미성숙 수지상세포의 수를 증가시킨다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 단핵세포를 플라스틱 조직 배양 플레이트에 플레이팅하여 부착시킴으로써 혈액의 단핵세포 전구세포로부터 미성숙 수지상세포를 생성시킬 수 있다. 미성숙 수지상세포의 파퓰레이션을 증가시키기 위해서 플라스틱 부착 세포들을 GM-CSF 존재하에 낮은 밀도(2x10⁵ 세포 /ml)로 플레이팅하고 배양 기간을 10일로 증가시킨다. 배양 기간을 7일로 하였을 때 단핵세포 전구세포로부터 수지상 세포의 분화 수율은 70%이지만 상기 방법은 단핵세포 전구세포로부터 미성숙 수지상세포나 성숙 수지상세포의 분화 수율을 90-95%로 높일 수 있다.

상기 미성숙 수지상세포를 얻기 위한 과정에서 이용되는 배지로는, 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp . Med . 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio. Med . 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항산화제(예컨대, β-머캅토에탄올)가 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명에서 이용되는 미성숙 수지상세포는 동물의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명에서 이용되는 미성숙 수지상세포는 동종동계(syngenic) 또는 동종이계(allogenic)의 수지상세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 준성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포를 적합한 사이토카인의 존재 하에 배양하여 얻는다. 바람직하게는 상기 적합한 사이토카인은 TNF-α이다.

일반적으로 어떠한 소스로부터 얻어진 미성숙 수지상세포라 하여도, 단핵세 포-유래 사이토카인(monocyte-derived cytokines), 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), 및 CpG 반복서열을 포함하는 DNA, TNF-α, IL-6, IFN-α, IL-1β와 같은 사이토카인, 괴저성 세포(necrotic cell), readherence, 전체 세균(whole bacteria), 막성분(membrane components), RNA 또는 polyI:C (polyinosinic-polycytidylic acid)와 같은 활성화 인자의 존재 하에서 배양하면 미성숙 수지상세포가 활성화 된다 (Clark, R. B. (2002). J Leukoc Biol, 71, 388-400; Hacker, G., Redecke, V. & Hacker, H. (2002). Immunology 105, 245-251; Kaisho, T. & Akira, S. (2002). Biochim Biophys Acta 1589, 1-13; Koski, G. K., Lyakh, L. A., Cohen, P. A. & Rice, N. R. (2001). Crit Rev Immunol 21, 179-189). 또한, 이러한 수지상세포의 활성화는 NF-κB 억제자가 존재하면 억제된다 (O'Sullivan, B. J., and Thomas, R. (2002). CD40 Ligation conditions dendritic cell antigen-presenting function through sustained activation of NF-kappaB, J Immunol 168, 5491-5498.).

본 발명의 조성물에 포함되는 준성숙 수지상세포는 자가 면역 질환을 일으키는 자가-항원(self-antigen) 특이적 면역 관용 반응을 유도하는데 유용하다. 상기 자가-항원은 자가 면역 반응의 타겟 항원, 알러젠(allergen), 이식체 항원(transplantation antigen) 등이 될 수 있다.

상기 자가 면역 반응의 타겟 항원으로는 루푸스 자가항원(lupus autoantigen), 스미스(Smith), Ro, La, U1-RNP, 피브릴린(피부경화증, scleroderma), GAD65 (당뇨병 관련), 인슐린, 미엘린 단백질, 히스톤, PLP, 콜라 겐, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 시트룰리네이티드(citrullinated) 단백질 및 펩티드, 타이로글로불린, 다양한 tRNA 씬세타아제, 아세틸 콜린 수용체(AchR), MOG, 프로테나아제-3, 미엘로퍼옥시다아제 등이 있다.

상기 알러젠은 Fel d1 (아미노산 서열이 WO 91/06571에 공개되어 있는 애완용 고양이 Felis domesticus 의 고양이 피부 및 침샘의 알러젠), Der p I, Der p II, Der fI or Der fII (아미노산 서열이 WO 94/24281에 공개되어 있는 집 먼지 진드기로부터의 주요 단백질 알러젠), 잔디, 풀, 나무 및 잡초, 꽃가루로부터 유래되는 알러젠; 균류 및 곰팡이로부터 유래되는 알러젠; 물고기, 갑각류, 게, 롭스터, 땅콩, 콩, 밀, 글루텐, 달걀 및 우유와 같은 식품으로부터 유래되는 알러젠; 벌, 말벌, 호박벌과 같은 찌르는 곤충, 집파리, 초파리, 선박파리, 곡물 바구미, 누에, 꿀벌, 날벌레 유충, 벌 유충, 테니브리오 몰리터 유충, 딱정벌레와 같은 곤충 및 거미 및 집 먼지 진드기를 포함하는 진드기 등으로부터 유래되는 알러젠; 소, 개, 고양이, 돼지, 염소, 말, 토끼, 랫트, 기니아 피그, 마우스 및 게르빌루스쥐와 같은 포유류의 비듬, 오줌, 타액, 혈액 또는 다른 체액에서 발견되는 알러젠; 일반적으로 공기중의 입자; 라텍스(latex); 및 단백질 세척제 첨가제 등을 포함한다.

상기 이식체 항원은 공여자 세포 또는 조직으로부터 유래될 수 있고 외인성 항원의 부존재 하에서 자가-항원으로 로딩된 MHC를 갖는 공여자 항원-제시 세포로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 자가항원 특이적 준성숙 수지상세포는 특정의 자가항원 또는 자가 항원을 발현하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 미성숙 수지상세포를 항원 또는 프로세싱(processing)된 항원이 수지상세포에 의해 세포 표면으로부터 제시(presenting)되기에 충분한 시간 및 조건 하에서 서로 “접촉”시킴으로써 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 “접촉”은 “공동 배양(co-culture)”이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 준성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포를 TNF-α 및 자가 항원의 존재 하에서 공동 배양함으로써 얻어진다. 상기 TNF-α의 농도는 바람직하게는 10-1000 U/ml이고, 더욱 바람직하게는 50-800 U/ml이며, 더욱 더 바람직하게는 200-700 U/ml이며, 가장 바람직하게는 500 U/ml이다. 상기 공동배양시간은 바람직하게는 1-10 시간이며, 더욱 바람직하게는 2-8 시간이며, 더욱 더 바람직하게는 3-7 시간이며, 가장 바람직하게는 4 시간이다.

상기 자가항원은 바람직하게는 류마티스 관절염 특이 자가항원이며, 더욱 바람직하게는 콜라겐이다.

상기 준성숙 수지상세포의 공동배양에 의한 제조 시에 이용하는 배지는 상기 미성숙 수지상세포의 분리 및 배양 시에 사용하는 배지와 동일하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 준성숙 수지상세포는 성숙 수지상세포에 비해 공동자극분자 CD80, CD86 및 CD40 중 하나 이상의 발현수준이 낮은 것을 특징으로 한다.

상기 준성숙 수지상세포들은 전형적인 형태(morphology)와 성숙 수지상세포들과 비교한 공동자극분자 CD80, CD86 및 CD40의 저발현(low expression)에 의해 확인된다. 상기한 마커 또는 마커에 대한 항체를 이용하여 당 업계에 공지된 방법 에 따라 준성숙 수지상세포를 확인할 수 있다. 또한, 항체를 이용하여 당 업계에서 공지된 유세포 분석법 또는 다른 세포 분류(sorting) 방법에 따라 혼합된 세포 배양으로부터 준성숙 수지상세포를 분리 또는 정제할 수 있다.

본 발명의 준성숙 수지상세포를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 치료가 가능한 자가 면역 질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함하며, 예를 들어, 제 1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병 등이 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물이 적용되는 질병 또는 질환은 류마티스 관절염이다.

본 발명의 준성숙 수지상세포는 면역반응 억제능력이 매우 우수하다. 본 발명의 준성숙 수지상세포에 의한 면역 관용은 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 세포에 의해 유도된 면역억제에 의한 결과이다. Treg 세포는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포, B세포, NK세포 및 수지상세포를 포함하는 다양한 타입의 면역세포의 활성, 증식, 분화 및 이펙터 기능(effector function)을 억제한다고 보고 되어 있다(Sakaguchi, S. 2005. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+ CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat . Immunol. 6:345-352). Treg 세포에 의해 매개되는 면역억제의 정확한 작용기전은 밝혀져 있지 않지만, TGF-β 및 IL-10과 같은 면역억제 사이토카인의 생성을 유도하거나, 또는 억제 수용체 CTLA-4에 의해 매개되는 세포-세포간 접촉에 의존하는 억제 작용기전에 의한 것으로 알려져 있다(Ghiringhelli, F., C. Menard, M. Terme, C. Flament, J. Taieb, N. Chaput, P.E. Puig, S. Novault, B. Escudier, E. Vivier, et al. 2005. CD4+ CD25+ regulatory T cells inhibit natural killer cell functions in a transforming growth factor-beta-dependent manner. J. Exp . Med . 202:1075-1085; Meirelles Lda, S., and N. B. Nardi. 2003. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol 123:702-711). 본 발명의 준성숙 수지상세포는 면역억제 작용을 하는 CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포의 파퓰레이션을 현저하게 증가시키고, 면역억제 사이토카인 TGF-β의 분비를 크게 증가시킨다. 또한, IFN-γ(Th1 사이토카인)의 분비를 억제하는 반면, IL-4 및 IL-10 (Th2 사이토카인)의 분비를 증가시켜 Th1/Th2 비율을 감소시킨다. 결국, 본 발명의 준성숙 수지상세포는 인 비보에서 면역억제 반응을 유도하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 상기 준성숙 수지상세포는 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 조절 T세포(regulatory T cell; Treg Cell)의 파퓰레이션을 증가시키는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에서 상기 준성숙 수지상세포는 Th1 사이토카인 IFN-γ의 분비를 감소시키고, Th2 사이토카인 IL-4 또는 IL-10의 분비를 증가시키는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 상기 준성숙 수지상세포는 면역억제 사이토카인 TGF-β의 분비를 증가시키는 작용을 한다.

본 명세서에서“약제학적 유효량”은 약제학적 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 상기 준성숙 수지상세포의 수(number)는 특정의 세포수로 한정되지 않는다, 그러나, 바람직하게는 2× 10⁶ 세포수 미만, 보다 바람직하게는 1× 10⁶ 세포수 미만, 보다 더 바람직하게는 5× 10⁵ 세포수 미만, 보다 더욱 더 바람직하게는 5× 10⁵ 내지 2× 10⁵ 세포수이고, 가장 바람직하게는 2× 10⁵ 세포수이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추 가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 류마티스 관절염에 적용하는 것이므로 국부적으로 관절 내 혹은 피하 주입이 가장 바람직하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 항원 특이적 면역관용(immunotolerance) 능력이 뛰어난 준성숙 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물 을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 약제학적 조성물에 의하면 자가 면역 반응을 억제함으로써 특히 류마티스성 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

마우스 및 시약

6 내지 7 주령의 병원체로 오염되지 않은 암컷 DBA/1 마우스를 오리엔트 바이오(대한민국 경기도)로부터 구입한 후 크레아젠 연구소(대한민국 경기도)의 동물사육시설에서 유지하였다. 한개의 우리(cage)에 5 또는 6 마리의 마우스를 표준 온도 및 광(light) 조건하에서 연구실기준 표준 음식물과 물을 제공하면서 유지하였다. 재조합 마우스 TNF-α(rm TNF-α)를 R&D 시스템즈사(Abington, OX, UK)로부터 구입하고, 재조합 마우스 GM-CSF(rm GM-CSF)는 크레아젠사(대한민국, 경기도)로부터 구입하였다. 완전 프로인트 어쥬번트(CFA, complete Freund's adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬번트(IFA, incomplete Freund's adjuvant), 콜라겐(타입 II 콜 라겐, 닭), 및 LPS(리포폴리사카라이드)를 시그마-알드리치사(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

배지는 10 ％ FBS(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA), 50μM의 2-머캅토에탄올(Life technologies, Gaithersburg, MD, USA), 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 50 U/㎖의 페니실린, 및 25 ㎍/㎖의 암포테리신 B (GIBCO Laboratories; Grand Island, NY, USA)가 첨가된 RPMI 1640(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA)을 사용하였다.

면역형광염색을 위해서, PE-콘쥬게이트된 항-마우스 CD11c 및 CD25 항체와 FITC-콘쥬게이트된 항-마우스 MHC 클래스 II, CD80, CD86, CD40, CD54, CD14, 및 CD3 항체를 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다. FITC-콘쥬게이트된 항-마우스 Foxp3 항체를 eBioscience (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다.

수지상 세포("DC")의 제조

Lutz et al.(Lutz, M.B.,N,Kukutsch, A.L. Oqilvie, S. Rossner, F.Koch, N.Romani, and G. Schuler: An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol . Methods, 1999, 223:77-92.)에 의해 기술된 방법에 따라 DBA/1 마우스의 골수 전구세포(progenitor)로부터 수지상세포를 생성시켰다. 간략하게 설명하면, 골수 단일 세포 현탁액을 제조하고 세정한 세포들을 2x10⁵ 세포/ml 농도로 조직 배양 플레이트에 플레이팅하여 10 ml 배지 및 20 ng/㎖ GM-CSF의 존재하에서 배양하였다. 3일째에 신선한 배지 및 20 ng/ml GM-CSF를 10 ml 첨가하여 배양하였다. 세포들에게 6일째와 8일째에 50％의 신선한 배지 및 20 ng/ml GM-CSF를 제공하였다. 10일 배양한 후에, 과립구의 오염을 줄이기 위해 신선한 배지 및 10 ng/ml GM-CSF와 500 U/㎖의 TNF-α 및 50 ㎍/㎖의 콜라겐 존재하에 4 시간 배양하여 준성숙 수지상세포(smDC)을 얻었고, 1 ㎍/㎖ LPS 및 50 ㎍/㎖ 콜라겐을 첨가하여 24 시간 배양하여 성숙 수지상세포(mDC)를 각각 생성하였다.

혼합 림프구 반응( Mixed lymphocyte reaction , MLR )

비장림프구(Splenocyte)를 DBA/1 마우스의 비장으로부터 분리하고 RPMI 1640 배지에서 세포들을 해체시켰다. 또한, 비장림프구로부터 CD4⁺ T세포들을 CD4 마이크로비즈 마우스 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)을 사용하여 분리하였다. 간략하게 설명하면, MACS 자기 분리기(MACS magnetic separator) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)내의 자기-활성화세포 분류기(magnetic-activated cell sorter) MS 컬럼을 통해 세포현탁액을 통과시켜 CD4⁺ T세포를 분리하였다. 컬럼에 부착된 CD4⁺ T세포를 이 반응 분석법에 사용하였다.

비장림프구 또는 CD4⁺ T세포를 콜라겐(50 μg/㎖)과 함께 48 시간 동안 인큐 베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포들을 원심분리에 의해 수집하고 반응자(responder)로서 첨가하였다 (1 x 10⁶/웰, 2 x 10⁶/웰, 1 x 10⁷/웰 및 2 x 10⁷/웰).

콜라겐-펄스된(collagen-pulsed) 준성숙 수지상세포(2 x 10⁵/웰 및 2 x 10⁶/웰) 또는 성숙 수지상세포(2 x 10⁵/웰 및 2 x 10⁶/웰)을 자극자(stimulaotr)로서 6-웰 플레이트에 접종하였다.

혼합림프구 반응을 1 자극자에 대해 5 또는 10 반응자의 비율로 평가하였다 (2 x 10⁵ 자극자 : 1 x 10⁶ 또는 2 x 10⁶ 반응자, 2 x 10⁶ 자극자 : 1 x 10⁷ 또는 2 x 10⁷ 반응자). 혼합된 세포들을 10％ FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지 2 ㎖에서 37°C에서 72 시간 동안 공동-배양하였다.

마지막으로, 세포들을 수집하여 조절 T세포의 파퓰레이션을 측정했으며, 배양 상등액을 수집하여 사이토카인에 대한 ELISA 측정에 사용했다.

한편, CD4⁺ T세포에 대한 수지상세포수의 변화에 따른 조절 T세포 파퓰레이션 및 수지상세포 성숙도(CD80 및 CD86 마커를 사용함)의 변화를 조사하기 위해, 2 x 10⁵-2 x 10⁶ 의 준성숙 수지상세포(smDC)를 1 x 10⁷ CD4⁺ T세포와 72시간 동안 공동배양시켰다.

FACS 분석

FACS 버퍼(0.2％ BSA, PBS안에 0.02％ 소디엄 아지드) 내에서 염색당 1× 10⁵ 세포의 비율로 준성숙 수지상세포의 세포 표면 염색을 하고, 이에 대해 직접면역형광법(direct immunofluorescence)을 사용하여 표현형 분석을 행했다. 항체 인큐베이션은 4 ℃에서 20 분간 행했다. 데이터는 CellQuest 소프트웨어와 FACS Calibur (BD Bioscience, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 히스토그램 또는 도트 플롯으로 나타냈다. 세포들은 전방 및 측면-분산 패턴에 따라 게이트시켰다. 각각의 마커에 대해 게이트에서 10⁴ 세포들을 카운팅하였다. 또한, FITC-콘쥬게이트된 Foxp3 및 PE-콘쥬게트된 CD25 마커를 사용하여 조절 T세포 파퓰레이션을 조사하였다.

Th1 / Th2 반응 평가

Th1 사이토카인 IFN-γ 및 Th2 사이토카인 IL-4/IL-10의 수준의 정량분석을 위해, 2× 10⁵ 의 수지상 세포 및 CD4⁺ T 세포를 이용한 72시간 혼합림프구반응(MLR) 배양의 상등액에 대해 ELISA 분석하였다. 또한, 상기 샘플에 대해 TGF-β 수준을 정량 분석하였다. 상업적으로 구입가능한 ELISA 키트(R&D system, Abington, OX, UK)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다.

DBA /1 마우스에서 콜라겐을 이용한 관절염 유도

마우스에서 관절염을 문헌(Tetsuya Tomita, Yoshimi Kakiuchi and Philip S Tsao: THR0921, a novel peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist, reduces the severity of collagen-induced arthritis. Arthritis Red Ther, 2006, 8:R7.)에 기술된 방법에 따라 유도하였다. 간략히 설명하면, 6주령의 암컷 DBA/1 마우스에, 닭의 타입 Ⅱ 콜라겐 200 ㎍을 0.05 M 아세트산 100 ㎕에 용해시킨 후 같은 부피(100 ㎕)의 CFA와 혼합한 후 꼬리의 끝부분에서 면역화시켰다. 콜라겐(2 ㎎/㎖)을 4 ℃에서 밤샘 교반하여 용해시켰다. 21일째 되는 날 마우스에 IFA에 용해시킨 타입Ⅱ 콜라겐을 피하 주입하여 추가 접종했다. 추가 접종은 확실한 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)을 유도하는데 필요하며, 정상적으로 약 34 일째에 콜라겐-유도 관절염 동물 모델이 확립된다.

인 비보 실험 프로토콜

마우스를 4개의 그룹으로 나누었다 : 2× 10⁵ 의 준성숙 수지상세포로 백신화 된 CIA 마우스로 구성되는 그룹, 2× 10⁶ 의 준성숙 수지상세포로 백신화된 CIA 마우스로 구성되는 그룹, 백신화되지 않은 CIA 마우스로 구성된 그룹, 및 순수 마우스로 구성된 대조군 그룹.

21일째 개시 시에, 동물들에게 준성숙 수지상세포들을 복부 부위에 피하주사하여 백신화시켰다. 조직학적 연구 및 면역 상태의 평가를 위해, 41일째에 마우스를 경추 탈골시켜 희생시켰다. 면역 상태의 평가를 위해, 마우스의 비장으로부터 분리한 CD4⁺ T세포를 50 ㎍/㎖ 콜라겐의 존재 하에 48 시간동안 배양한 후, 조절 T세포 파퓰레이션 및 IFN-γ/IL-4 분비를 FACS 분석 및 ELISA를 이용하여 각각 조사하였다.

관절염 발달 평가 및 조직학적 연구

콜라겐 유도 관절염의 질병 활성도는 각각의 발에 대해 3-점 스케일(three-point scale)을 이용하여 2 명의 관찰자에 의해 27 일 에서 61 일 사이에 1주일에 2회씩 시각 평가하였다. 관절염의 위중도는 0-3 스케일(0은 정상 관절; 1은 약한 염증 및 적열상태; 2는 심각한 홍반 및 전체 발에 영향을 미치는 부기; 및 3은 관절 굳음증, 관절 강직증, 및 기능상실을 가진 변형된 형태의 발 및 관절)에 기초해 평균 관절염 인덱스로 표현했다.

객관적인 질병 활성도에 대한 전체 스코어는 모든 4개의 다리에 기초하여 각각의 마우스에 대해 최대 12 스코어를 갖도록 하였다 (Banda NK, Kraus D, Vondracek A, Huynh LH, Bendele A, Holers VM, Arend WP: Mechanisms of effects of complement inhibition in murine collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum, 2002, 46:30653075.). 또한, 캘리퍼스(caliper)를 사용하여 1주일에 2회 발바닥 살(footpad) 두께를 측정했다.

조직학적 연구를 위해서, 41일째 모든 그룹의 마우스로부터 뒤쪽 다리를 떼어내어 10％ 포스페이트-버퍼된 포르말린에서 2일간 고정시켰다. 이어서, 고정된 샘플을 10 ％ 포름산에서 18일간 석회질을 제거하고, 탈수시킨 후에, 파라핀 블록에 끼워넣었다. 문헌(Tomita T, Takeuchi E, Tomita N, Morishita R, Kaneko M, Yamamoto K, Nakase T, Seki H, Kato K, Kaneda Y, Ochi AP: Suppressed severity of collagen-induced arthritis by in vivo transfection of nuclear factor kappaB decoy oligodeoxynucleotides as a gene therapy. Arthritis Rheum, 1999, 42:2532-2542.)에 기술된 방법에 따라, 세로축을 따라서 섹션(5 ㎛)으로 절단하고, 고정한 후에, 헤마토자일린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다.

통계학적 분석

결과들은 평균 표준편차로 나타내었다. 모든 통계 분석에 대해 Mann-Whitney U 테스트를 사용했다. 0.05 보다 작은 p-값을 통계학적으로 유의한 값으로 간주하였다.

실험결과

TNF -α- 성숙된 준성숙 수지상세포가 조절 T세포 파퓰레이션 및 Th2 사이토카인 분비를 현저한 수준으로 유도하였다.

수지상 세포는 전문적 항원제시세포로써(antigen presenting cells, APCs) 면역개시 및 면역관용에 관여한다.

본 발명자들은 준성숙 수지상세포가 공동-자극분자 CD80, CD86 및 CD40을 성 숙 수지상세포에 비해 낮은 정도로 발현하는 특성을 확인하였고(도 1 참조), CD4⁺ T세포와의 혼합림프구 반응에서 조절 T세포 파퓰레이션, Th2 사이토카인 IL-4/IL-10 분비 및 면역억제제 TGF-β를 현저하게 유도한다는 것을 확인하였다(도 2 참조).

원시 T세포(naive T cell)의 프라이밍(priming)과 분화에 대한 수지상세포의 성숙상태의 영향을 분석하기 위해, 준성숙 수지상세포 및 성숙 수지상세포를 혼합림프구 반응에서의 자극자로 사용하여 수행했다. 수지상세포들을 콜라겐으로 펄스(pulse)하고 이어서 TNF-α로 4 시간, 또는 LPS로 24 시간 처리하였다. 혼합림프구 반응의 자극자로서 2× 10⁵ 준성숙 수지상세포를 사용한 경우, 2× 10⁵ 성숙 수지상세포를 사용한 경우와 비교하여, Th2 사이토카인 IL-4의 생성이 증가하였고 Th1 사이토카인 IFN-γ가 감소하였다(도 2의 패널 B 및 C 참조).

준성숙 수지상세포의 관용적 역할의 가능성을 평가하기 위해, 조절 T세포의 파퓰레이션과 면역억제성 사이토카인의 생성을 조사하였다. 혼합림프구 반응에서 2× 10⁵ 준성숙 수지상세포를 사용한 경우, 조절 T세포가 증가하는 결과를 가져왔고(도 2의 패널 A 참조), 면역억제성 사이토카인인 IL-10 및 TGF-β가 현저하게 생성되는 결과를 가져왔다(도 2의 패널 D 및 E 참조). 이들 결과들은 준성숙 수지상세포가 인 비트로에서 콜라겐에 반응하여 IL-10 및 TGF-β를 생성하는 조절 T세포를 유도하는 능력을 갖는다는 것을 입증하는 결과들이다.

한편, 2× 10⁶ 준성숙 수지상세포를 혼합 림프구 반응에서 자극자로서 사용 한 경우에는 조절 T세포 파퓰레이션의 증가 효과를 나타내지 않았다.

준성숙 수지상세포 백신화에 의해 콜라겐 유도 관절염( CIA )의 발달이 현저한 수준으로 억제되었다.

관절염 연구에서 콜라겐 유도성 관절염(CIA) 모델은 자가면역성 관절염의 치료적 중재를 평가하는 잘 확립된 방법이다. 심각한 관절염 유도 프로토콜이 보고되어 있는 데, 이들은 모두 활액막에 대해 T세포 의존적인 염증성 침윤을 유도하여 연골파괴 및 뼈 분해에 이르게 한다.

백신화 되지 않은 그룹과 비교했을 때, 준성숙 수지상세포로 백신화된 콜라겐 유도 관절염 그룹에서는 전혀 관절염이 발생되지 않았다. 콜라겐 유도 관절염 동물 모델을 100 ％ 확립한 상태에서 준성숙 수지상세포의 CIA 항류마틱 효능 유무를 반복하여 측정 분석 한 결과, 준성숙 수지상세포로 백신화된 콜라겐 유도 관절염 마우스가 백신화 되지 않은 콜라겐 유도 관절염 마우스와 비교하였을 때 관절염의 발병을 현저한 수준으로 억제한다는 것을 입증하였다.

또한, 본 발명자들은 3 내지 5 일 간격으로 관절 부풀어오름 및 홍반을 거시적으로 검사함으로써 관절염 인덱스 및 발바닥 두께를 측정하여 준성숙 수지상세포의 치료학적 최적 농도를 최초로 결정하였다.

마우스에 2×10⁵ 의 준성숙 수지상세포 또는 2×10⁶의 준성숙 수지상세포를 주입하였다. 모든 2×10⁵의 준성숙 수지상세포 주입 동물들에서는 관절염의 발병이 관찰되지 않았다. 이러한 결과들과 일치하게, 관절염 인덱스는 2×10⁵의 준성숙 수지상세포수에서 0 포인트이었다(도 3의 패널 B 참조). 2×10⁵ 세포수의 준성숙 수지상세포로 동물을 주입시킨 경우에는, 관절염의 진행이 백신화하지 않은 대조군 마우스와 비교하여 극적으로 억제되는 것을 관찰하였다(도 3의 패널 A 및 C 참조).

발바닥 두께는 2×10⁵ 세포수의 준성숙 수지상세포로 주입한 마우스에서 백신화 되지 않은 콜라겐 유도성 관절염 대조군 마우스와 비교하여 현저한 수준으로 극적으로 억제되었다 (도 3의 패널 A 참조). 그러나, 2×10⁶ 세포수의 준성숙 수지상세포로 주입한 마우스에서는 백신화되지 않은 콜라겐 유도성 관절염 대조군 마우스와 비교하여 관절염의 진행이 더욱 촉진되었다.

이들 결과들은 인 비트로 혼합림프구반응 데이터(도 2의 패널 A 참조)와 일치하는 결과로서, 준성숙 수지상세포를 적합한 수로 투여해야 마우스에서의 콜라겐 유도성 관절염을 억제할 수 있다는 것을 의미하는 것이다.

본 발명에서 관절염 질병 활성도는 관절염 스코어의 평균값을 사용함으로써 관절염의 징후를 명확하게 억제하는 것을 입증하였지만, 백신화되거나 또는 백신화되지 않은 콜라겐 유도성 관절염 마우스에서의 조직학적 차이점을 추가로 검사하였다.

준성숙 수지상세포(2×10⁵ 또는 2×10⁶ 의 세포수)로 백신화되거나 백신화되 지 않은 콜라겐 유도성 관절염 동물을 관절염 발병후 41일 후에 희생시키고 관절을 연속적 섹션으로 절단한 후 이를 검사하였다.

본 발명자들은 2×10⁶ 준성숙 수지상세포-처리된 마우스(도 4의 패널 D 참조) 및 콜라겐 유도 관절염 대조군 마우스(도 4의 패널 B 참조)가 염증성 세포 침윤, 판누스 형성 및 뼈 침식 등이 현저하게 나타나는 것을 관찰하였다. 이와는 대조적으로, 2×10⁵ 준성숙 수지상세포로 처리된 마우스들은 류마티스성 관절염의 어떠한 증상도 나타내지 않았다(도 4의 패널 C 참조). 이러한 결과들은 상기 형태학적 데이터들과 일치하는 것들이다.

준성숙 수지상세포는 인 비보 및 인 비트로 에서 조절 T세포 파퓰레이션을 강력하게 유도한다.

다음으로, 본 발명자들은 2×10⁵의 준성숙 수지상세포로 백신화시킨 마우스로부터 조절 T세포가 유도될 수 있는지를 결정하였다.

도 5의 패널 A에서 나타나는 바와 같이, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 조절 T세포들이 2× 10⁵ 준성숙 수지상세포들로 백신화된 마우스의 비장으로부터 현저하게 유도된다는 것을 확인하였다. 또한, 2×10⁵의 준성숙 수지상세포로 백신화시킨 마우스에서 Th1 사이토카인 IFN-γ가 현저한 수준으로 감소했고, Th2 사이토카인 IL-4 분비가 현저 한 수준으로 증가했다(도 5의 패널 B 참조). 이들 결과들은 이전의 데이터들을 더욱 뒷받침하는 것들이다(도 3 및 4의 결과 참조).

또한, CD4⁺ T세포에 반응하여 준성숙 수지상세포의 수에 의존하는 상반되는 기능의 원인을 밝히기 위해서, 준성숙 수지상세포의 수를 2×10⁵ 내지 2×10⁶ 세포수로 변화시키면서 혼합림프구 반응을 수행했다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, 준성숙 수지상세포의 수가 점차적으로 감소하면서 Foxp3⁺ 조절 T세포 파퓰레이션이 증가하였고(도 6의 패널 A 참조), 공동자극분자 CD80 및 CD86가 낮게 발현되었다(도 6의 패널 B 참조).

이러한 결과들은 류마티스 관절염 치료에 효과적인 준성숙 수지상세포의 수는 2×10⁶ 세포수 미만이고, 바람직하게는 1×10⁶ 세포수 미만, 보다 바람직하게는 5×10⁵ 세포수 미만, 보다 더 바람직하게는 5×10⁵ 내지 2×10⁵ 세포수이고, 가장 바람직하게는 2×10⁵ 세포수라는 것을 보여준다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 면역관용(immunotolerance) 능력이 뛰어난 준성숙 수지상세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 자가 면역 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 의하면 자가 면 역 반응을 억제함으로써 자가 면역 질환, 특히 류마티스 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

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Claims (8)

1. 류마티스 관절염 치료용 준성숙 수지상세포로서, ⅰ) 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 TNF (tumor necrosis factor)-α 및 류마티스 관절염 유도 자가항원의 존재 하에 배양하여 얻은 것이고, ⅱ) 공동자극분자(co-stimulating factor) CD80, CD86 및 CD40 중 하나 이상의 발현수준이 성숙 수지상세포(mature dendritic cell)에 비해 낮은 것을 특징으로 하는 준성숙 수지상 세포.
2. 삭제
3. (a) 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell)를 TNF (tumor necrosis factor)-α 및 류마티스 관절염 유도 자가항원의 존재 하에 배양하여 얻은 준성숙 수지상세포의 약제학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물.
4. 삭제
5. 제 3 항에 있어서, 상기 준성숙 수지상세포는 성숙 수지상세포에 비해 공동 자극분자 CD80, CD86 및 CD40 중 하나의 이상의 발현수준이 낮은 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 3 항에 있어서, 상기 준성숙 수지상세포는 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 조절 T세포(regulatory T cell)의 파퓰레이션(population)을 증가시키는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 3 항에 있어서, 상기 준성숙 수지상세포는 Th1 사이토카인 IFN-γ의 분비를 감소시키고, Th2 사이토카인 IL-4 또는 IL-10의 분비를 증가시키는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 3 항에 있어서, 상기 준성숙 수지상세포는 면역억제 사이토카인 TGF-β의 분비를 증가시키는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.

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