CN106701676B - 新型nkt样细胞亚群及其治疗免疫性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的NKT样细胞亚群及其在治疗由免疫过激反应引起的免疫性疾病中的用途。本发明的新型NKT样细胞亚群具有抗原特异性与非抗原特异性的免疫负向调节作用，可以通过体外培养扩增后过继回输给受试者用于治疗由免疫过激反应引起的免疫性疾病。

Description

新型NKT样细胞亚群及其治疗免疫性疾病的用途

技术领域

本发明属于免疫学和临床医学领域，涉及一种新型的NKT样免疫细胞亚群及其用于治疗免疫性疾病的用途，其中所述NKT样细胞亚群包含CD8⁺NKT样细胞。

背景技术

1987年，三个独立的研究小组分别报道了一群表达中等强度的αβTCR而不表达CD4和CD8的T细胞群体^[1-3]；1990年Sykes报道了一种表达NK1.1同时也表达αβTCR的细胞亚群^[4]。1995年，“NKT”细胞作为专有名词第一次出现，并特指一群表达NK1.1(小鼠CD161c)标志的T细胞亚群^[5]。在小鼠的研究中，根据NKT细胞的CD1d限制性和TCR的多样性，Godfrey将NKT细胞分为三种类型^[6]：I型NKT细胞、II型NKT细胞和NKT样细胞。I型NKT细胞是能够识别CD1d递呈的α-Galcer脂类抗原的一群NKT细胞，II型NKT细胞则能识别CD1d递呈的除α-Galcer外的脂类抗原，NKT样细胞包括除I型NKT细胞、II型NKT细胞外的其他NKT细胞亚群。其中，I型NKT细胞免疫学特征和功能的研究最为广泛，又被称为经典NKT细胞；目前文献资料中提到的NKT细胞大多是指此NKT细胞类型。由于CD1d四聚体技术的成熟，以及CD1d缺陷转基因小鼠的出现，目前对NKT细胞的研究大多集中于经典NKT细胞(I型NKT细胞)。然而，I型NKT细胞仅为NKT细胞群体的一个亚群；NKT细胞中50％以上细胞均为NKT样细胞^[6]。NKT细胞的发现与其免疫调节相关细胞因子的主要贡献者的地位密切相关，于是NKT细胞的免疫调节功能成为免疫学家研究其功能的重点。

(1)I型NKT细胞(iNKT细胞)

Jα18缺陷小鼠模型和CD1d四聚体技术帮助研究者准确的分离和研究I型NKT细胞(iNKT细胞)，极大推动了I型NKT细胞的研究进 展。对I型NKT细胞的研究表明，该NKT细胞亚群在接受CD1d递呈的脂类抗原α-GalCer刺激后，分泌大量IL-4、IFN-γ和TNF等细胞因子。在小鼠体内，iNKT细胞以CD4⁺和DN NKT细胞为主；人体内iNKT细胞除了CD4⁺和DN两个亚群外，还包含CD8⁺NKT细胞群体。回顾NKT细胞的研究历史，我们不难看出，正是iNKT的发现才导致一群NK1.1⁺T细胞逐渐为人们所认知。因此，狭义的NKT细胞的概念即iNKT细胞。在此过程中，iNKT细胞也成为目前NKT细胞中研究最为广泛和充分的类型。研究人员发现，iNKT细胞参与了机体包括抗感染、抗肿瘤和自身免疫病在内的多个病理生理过程^[7]。

(2)II型NKT细胞

随着对iNKT细胞研究的深入，CD1d缺陷小鼠和Jα18缺陷小鼠在揭示iNKT细胞功能方面有时会展示不同、甚至截然相反的现象，提示一群依赖于CD1d分子、但不表达恒定TCR链Vα14-Jα18的II型NKT细胞的存在，且其功能与iNKT细胞不同。

应用上述两种小鼠模型发现，MCMV感染会导致CD1d缺陷小鼠产生高死亡率，但在Jα18缺陷小鼠中并未观察到这一现象^[8，9]。CD1d缺陷小鼠更易感染EMCV，但Jα18缺陷小鼠和正常小鼠对EMCV的抵抗能力相似。这表明II型NKT细胞具有促进抗病毒免疫的作用^[10]。然而，II型NKT细胞也被报道广泛参与了包括抗肿瘤免疫、I型糖尿病、ConA诱导肝炎模型、EAE等病理过程，并被认为发挥了免疫负向调节效应^[6]。相信随着更为精确的分离方法的发明，II型NKT细胞的功能会得到进一步阐述。

(3)NKT样细胞

NKT样细胞是一群不依赖于CD1d分子、表达多样TCR的NK1.1⁺T细胞。尽管iNKT细胞一直以来是NKT细胞研究的主线，研究人员仍然借助荷瘤小鼠、OT-I特异性TCR转基因小鼠和β₂微球蛋白缺陷小鼠模型，对其中NKT样细胞进行了研究，并发现其具有快速高效杀伤多种肿瘤细胞的能力^[11，12]。但由于该类型NKT细胞因子分泌较I型NKT细胞和II型NKT细胞少，该类型NKT细胞的免疫调节功能尚未进行研究。

通过野生型和CD1d缺陷小鼠对比分析表型，非CD1d限制性NKT 细胞约占总NKT细胞50％左右^[6]，目前对于该群NKT细胞研究较少，其生物学功能尚无定论。非CD1d限制性NKT细胞(属于NKT样细胞)，作为NKT细胞群体的重要组成部分，既表达NK细胞的重要功能标志(CD161c和CD49b)，又表达能识别多种抗原的可变TCR。

然而，NKT样细胞中那个细胞亚群发挥何种免疫调节作用、其机制以及其在免疫相关性疾病中的作用尚不明确。

发明内容

通过大量的基础和应用研究，本申请的发明人出人意料地发现了一个具有特殊表型的NKT样细胞亚群，该亚群细胞具有高效的免疫负向调节能力。

在第一个方面，本发明提供了一种分离的NKT样细胞亚群(下文中有时简称为“本发明的NKT样细胞”)，所述NKT样细胞亚群可以包含表面表达CD8分子的NKT样细胞(下文中有时简称为“本发明的CD8⁺NKT样细胞”或“CD8⁺NKT样细胞”)。

在一个实施方案中，本发明的NKT样细胞可以包含一定比例的不表达CD8分子的免疫细胞(在本文中有时也称为“CD8-免疫细胞”)。CD8⁺NKT样细胞在本发明的NKT样细胞中的比例可以为50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，最优选80％以上。

在一个实施方案中，本发明的NKT样细胞可以包含100％的CD8⁺NKT样细胞，即，全部是CD8⁺NKT样细胞。

根据本发明，本发明的NKT样细胞可以分离自哺乳动物。

在第二个方面，本发明提供了活化和扩增本发明的NKT样细胞的方法(在本文中有时简称为“本发明的扩增方法”)，该方法可以包括以下步骤：

1)采集受试者的外周血并分离去除红细胞；

2)从步骤1)中获得的已去除红细胞的外周血中分离单个核细胞，采用本领域中已知的细胞分选技术(例如，借助本领域中公知的细胞分选技术)利用本发明的CD8⁺NKT样细胞的表面标志物(例如，TCRαβ、CD3、CD56/CD161c、CD8、Vα24 TCR或Vα14 TCR等)分选出本发明的NKT样细胞；

3)将步骤2)中得到的本发明的NKT样细胞在体外培养，并向培养物中添加能够刺激T细胞增殖和活化的细胞因子，培养足以使其数量扩增至少10～1000倍的时间；以及

4)收获步骤3)中得到的本发明的NKT样细胞。

应该理解的是，在本发明的扩增方法中，步骤2)和步骤3)可以互换，即可以先分选再扩增，也可以先扩增后分选。由于本发明的NKT样细胞在外周血中的含量很小，因此在另一个优选的实施方案中，可以先扩增后分选(即，先进行步骤3)接着进行步骤2))，然后再将分选出目标细胞。

在第三个方面，本发明涉及本发明的NKT样细胞亚群在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的用途，其中所述NKT样细胞亚群包含表达CD8分子的NKT样细胞。

出于临床使用方便性和减少患者采血时交叉感染或医源性感染的考虑，可以将上述扩增后的本发明的NKT样细胞制备成治疗用组合物，从而便于保存以备随时使用。

因此，在第四个方面，本发明提供了一种治疗用组合物，其包含本发明的NKT样细胞作为主要活性成分。

在一个优选实施方案中，本发明的治疗用组合物还可以包含药学上可接受或生理学可接受的载体、稀释剂、缓冲液、赋形剂和/或添加剂。

在第五个方面，本发明涉及一种治疗受试者的免疫性疾病的方法，该方法可以包括以下步骤：

1)采集所述受试者的外周血；

2)从所述受试者的外周血中分离单个核细胞，富集(例如，采用本领域中已知的细胞分选技术)本发明的NKT样细胞并在体外扩增；以及

3)收获步骤2)中获得的经扩增的NKT样细胞亚群，并过继回输给所述受试者；并且

其中所述NKT样细胞亚群包含表达CD8分子的NKT样细胞。

应该理解的是，在步骤2)中，即可以先富集再扩增，也可以先扩增后富集。由于本发明的NKT样细胞在外周血中的含量很小，因此在 一个优选的实施方案中，可以先扩增后富集，然后再将富集的细胞回输。

根据本发明，所述免疫性疾病可以是由免疫过激反应引起的。优选地，所述免疫过激反应可以是由抗原递呈细胞活化引发的。

在一个实施方案中，所述抗原递呈细胞可以包括但不限于树突状细胞(DC)、巨噬细胞、内皮细胞、B细胞等。

在一个实施方案中，所述免疫过激反应可以是变态反应性疾病，所述变态反应性疾病可以包括但不限于：I型变态反应性疾病、II型变态反应性疾病、III型变态反应性疾病和IV型变态反应性疾病等。其中I型变态反应性疾病可以包括但不限于过敏性休克、荨麻疹、血管神经性水肿、过敏性鼻炎、支气管哮喘等；II型变态反应性疾病可以包括但不限于溶血性贫血、血小板减少性紫癜等；III型变态反应性疾病可以包括但不限于血管炎、血清病等；IV型变态反应性疾病可以包括但不限于湿疹、发疹性药疹、剥脱性皮炎等。

在另一个实施方案中，所述免疫性疾病可以是涉及免疫过激反应的自身免疫病，所述涉及免疫过激反应的自身免疫病可以包括但不限于风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘等。在一个优选实施方案中，所述涉及免疫过激反应的自身免疫病可以是糖尿病，优选I型糖尿病。

在又一个实施方案中，所述免疫性疾病可以是涉及免疫过激反应的炎症，所述涉及免疫过激反应的炎症可以包括但不限于肝炎、胃炎、肺炎、脑炎、脑膜炎等。

上面的概述描述了本发明的某些方面、优势和新特征。但要理解，所有这些优势不一定全部由本发明的任何特定实施方案来实现。因此，本领域技术人员会认识到，本发明可以通过本文所教导的一个或多个优点的组合的方式来实施或进行，而不一定实现如本文所教导或提示的其他优点或全部优点。

附图说明

以下参照附图说明本发明的优选实施方案并详细描述本发明的上述和其他特征、方面和优势。要理解的是，此意在举例说明而非限制本发明。在附图中：

图1图示了本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞的表型，在图中黑线代表分子表达水平，灰线代表相应的同型对照。

图2图示了本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异，填充区域代表同型对照，空心区域代表相应分子的表达水平。

图3是本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD8 T细胞的透射电镜照片和激光共聚焦显微镜照片，其中图3A是透射电镜照片，图3B是激光共聚焦显微镜照片。在图3B的照片中，红色是溶酶体染料LysoTracker染色的结果，绿色是FITC标记的抗小鼠CD90抗体的染色结果，蓝色是Hoechst33342染料染色结果。

图4比较了本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞、CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的细胞因子分泌能力，其中图4A显示抗原刺激后24h时检测的结果，图4B显示抗原刺激后48h时检测的结果。

图5示意性地显示了本发明的CD8⁺NKT样细胞的体外扩增方法的一个实例的流程图。

图6是显示本发明的CD8⁺NKT样细胞的体外扩增能力的图，其显示了用细胞因子处理后不同时间点CD8⁺NKT样细胞的扩增倍数。其中图6A图示了来自小鼠的CD8⁺NKT样细胞的结果，图6B图示了来自于人的CD8⁺NKT细胞的结果。

图7图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性抑制CD4 T细胞反应的实验结果。

图8图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性抑制CD8 T细胞反应的实验结果。

图9图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制CD4 T细胞反应的实验结果。

图10图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制CD8 T细胞反应的实验结果。

图11图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制GFP/OVA抗原的免疫应答的实验结果。

图12图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在胰岛表达OVA抗原的转基因小鼠体内抑制DC递呈OVA抗原而引发的糖尿病。图12A图示了受体小鼠血糖值的变化，图12B图示了受体小鼠体重的变化。

图13图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性杀伤树突状细胞的实验结果。

图14图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD 8 T细胞上各种Granzyme、Perforin和Lamp-1表达的热图，图中右上方为色阶，从黄到红表示表达强度从低到高。

具体实施方式

定义：除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域中的一般技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中所述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明，但是现在描述优选的方法和材料。本文中引用应用的全部出版公开物和专利申请通过引用整体结合于本文中。本文中没有任何内容可以被解释为承认本发明无权通过在先发明而使早于本公开内容的日期获得授权。

必须注意，用于本文中和所附权利要求中时，单数形式“一个”、“某个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地规定。

定义

“NKT细胞”：NKT细胞的定义有广义和狭义两种。广义的NKT细胞是指既表达NK细胞表面标志(小鼠为CD161c，人为CD56)又表达T细胞表面标志的细胞群体。随着脂类抗原结合CD1d四聚体技术的发展，研究人员在小鼠的研究中发现一群能够结合负载脂类抗原α-GalCer的CD1d四聚体的细胞亚群，该群体大多既表达NK细胞表面标志，又表达T细胞表面标志，且分泌大量细胞因子，发挥免疫调节作用；这群细胞根据Godfrey定义，为I型NKT细胞，即狭义NKT细胞。目前这群细胞研究最为广泛，也最为深入，因此这群细胞被称为经典NKT细胞。现有文献资料中提及的NKT细胞主要是指狭义NKT 细胞。在本发明中，如果未明确指明，当提及NKT细胞时均是指广义NKT细胞。

“iNKT细胞”：即狭义NKT细胞，由于该群体表达恒定TCR链(对于小鼠为Vα14Jα18，对于人为Vα24Jα18)，又被称为invariant NKT细胞(在本文中有时简称为iNKT细胞)^[7]。

“NKT样细胞”：NKT样细胞是指既表达NK细胞表面标志(在小鼠中为CD161c，在人中为CD56)，又表达T细胞表面标志(例如，TCR和/或CD3)，发育不依赖于CD1d分子的细胞亚群。这群细胞的特点是单个细胞的表面可以各自表达不同类型的TCR，但这群细胞不包括表面表达Vα24 TCR(人)或Vα14 TCR(小鼠)的细胞^[7]。该细胞群体的定义是与经典或狭义NKT细胞相对的(就Vα24 TCR或Vα14 TCR而言)。

“Vα24 TCR”在本发明中是指表达Vα24基因的TCR序列。经典免疫学理论认为，TCR序列重排导致T细胞的TCR序列具有多样性，但是某些特殊表达TCR的细胞亚群却偏好表达某一类型的TCR序列。如经典NKT细胞偏好表达Vα24 TCR。“Vα14 TCR”的定义与“Vα24 TCR”类似。

“CD1d限制性”在本发明中是指免疫细胞的发育对于CD1d分子的依赖性。在NKT细胞群体中，经典NKT细胞被认为是CD1d限制性，NKT样细胞被认为是非CD1d限制性。

“CD8⁺”在本发明中是指细胞表面上表达CD8标志。

“CTL细胞”在本发明中是Cytotoxic T Lymphocyte的缩写，是指表达CD8标志的T细胞(也称为“CD8⁺T细胞”)经过抗原特异性刺激后转变成的一群具有强大杀伤病毒感染的靶细胞能力的效应性T细胞。要注意的是，经典CTL细胞的概念并不包含表达NK细胞标志(CD56)的NKT细胞和NKT样细胞。

“免疫性疾病”是指由于免疫稳态失衡引发的疾病，其发病机制与免疫调节紊乱有关。

“免疫过激反应”是指由于免疫系统过度活化，导致对携带自身抗原的自身组织细胞进行攻击和破坏而引发的疾病。

“抗原递呈细胞”是指能够识别、吞噬、加工、处理并将抗原片段递呈给T淋巴细胞的一类细胞。抗原递呈细胞包括但不限于：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和内皮细胞等。抗原递呈细胞是免疫应答的中心环节，是连接获得性免疫和固有免疫的桥梁。

本发明的NKT样细胞

本发明公开了一种NKT样细胞亚群，其包含表面表达CD8分子的NKT样细胞。

在一个实施方案中，本发明的NKT样细胞可以包含一定比例的不表达CD8分子的免疫细胞。CD8⁺NKT样细胞在本发明的NKT样细胞中的比例可以为50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，最优选80％以上。

优选地，本发明的NKT样细胞可以包含100％的CD8⁺NKT样细胞，即，全部是CD8⁺NKT样细胞。

根据本发明，本发明的CD8⁺NKT样细胞的表面上可以表达CD3和CD56(或CD161c)，但不表达Vα24 TCR(Vα14 TCR)，即其表型可以表示为CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24 TCR^-或CD3⁺CD161c⁺CD8⁺Vα14 TCR^-。

在一个具体的实施方案中，本发明的CD8⁺NKT样细胞的表面上还可以表达TCRαβ，即表型为TCRαβ⁺CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24 TCR^-或TCRαβ⁺CD3⁺CD161c⁺CD8⁺Vα14 TCR^-。

图1图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞的表型。在图1中，可以看出小鼠CD8⁺NKT样细胞表达T细胞谱系标志CD3和TCRβ，也表达NK细胞谱系标志NK1.1(CD161c)，但不表达iNKT的谱系标志CD1d。另外，从图1中还可以看出，CD8⁺NKT样细胞表达T细胞活化标志CD44、CD62L和CD122，以及NK细胞受体NKG2A/C/E、KLRG1、NKG2D、Ly49G₂和CD27。这些结果表明这群细胞兼具NK细胞和T细胞的功能特征。

图2图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异。从图2中可以看出：(1)与NK细胞相比，小鼠CD8⁺NKT样细胞表达NK细胞标志NK1.1(CD161c)、NKG2A/C/E、CD27、KLRG1和Ly6G，但比NK细胞多表达TCRβ和CD3；(2)与 CTL细胞相比，小鼠CD8⁺NKT样细胞表达T细胞谱系标志TCRβ和CD3，但不表达NK细胞受体；(3)与iNKT细胞相比，CD8⁺NKT样细胞不能结合负载脂类抗原的CD1d四聚体。上述结果表明本发明的CD8⁺NKT样细胞是独立于现有技术中已发现的任何一群具有确定表型的具有抗肿瘤效应的免疫细胞亚群的新的免疫细胞亚群。

图3是本发明的CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD8⁺T细胞的透射电镜照片和激光共聚焦显微镜照片。图3A的透射电镜照片显示，小鼠CD8⁺NKT样细胞中含有大量的颗粒样物质，而NK和CD8⁺T细胞中类似的颗粒样物质较少。从图3B的激光共聚焦显微照片中发现本发明的CD8⁺NKT样细胞体积较大，其直径为约15μm以上，而NK细胞和CD8+T细胞的直径小于10μm，大约在7μm左右。同时，CD8⁺NKT样细胞中的颗粒样物质为溶酶体染料染色阳性，提示这些颗粒样物质可能含有发挥细胞毒效应的颗粒酶，而NK细胞和CD8+T细胞中这些溶酶体染料染色阳性的颗粒则很少。另外，通过对细胞核和细胞膜的染色还发现，CD8⁺NKT样细胞的核质比与其他两种细胞相比较小。以上的这些形态学差异提示，本发明的CD8⁺NKT样细胞是完全不同于NK细胞和CD8+T细胞的一个新的独特的免疫细胞亚群。而且，从形态学上也可以预期CD8⁺NKT样细胞的功能与其他两者也存在很大的差异。细胞内溶酶体染料染色阳性的颗粒提示本发明的CD8⁺NKT样细胞可能具有颗粒酶介导的细胞毒效应。

图4比较了本发明的CD8⁺NKT样细胞、CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的细胞因子分泌能力。从图4中可以看出在特异性抗原刺激后24h和48h，小鼠CD8⁺NKT样细胞分泌的IFN-γ水平显著高于CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞；其分泌的IL-2水平低于CD8⁺T细胞，但与CD4⁺T细胞相当。从细胞因子表达谱来说，相对于CD4⁺T细胞，在CD8⁺T细胞中IFN-γ和IL-2两者均为高水平表达，而在本发明的CD8⁺NKT样细胞中仅IFN-γ高表达，由此可见本发明的CD8⁺NKT样细胞具有独特的细胞因子表达谱。

另外，出于刺激T细胞的活化效率和强度以及增加细胞总数量(因为本发明的NKT样细胞亚群在血液中的比例较小)从而延长回输后血中半衰期的考虑，本发明的NKT样细胞可以包含一定比例的CD8^-免 疫细胞。在此情况下，本发明的NKT样细胞可以包含50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上，优选60％以上，更优选70％以上，最优选80％以上的CD8⁺NKT样细胞。

扩增本发明的NKT样细胞的方法

本发明进一步提供了扩增本发明的NKT样细胞的方法。

在本发明中，哺乳动物可以是选自牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物等的动物，包括但不限于牛、马、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物(诸如猿、猴、狒狒、猩猩)和人，优选是牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠、猴和人，更优选是人。

本发明的哺乳动物也可以是宠物动物，包括但不限于宠物狗、宠物猫、啮齿动物宠物(例如，龙猫、仓鼠、小白鼠、沙鼠、金花鼠、八齿鼠、松鼠、鼯鼠和大花鼠等)、宠物兔、貂、刺猬、羊驼、豚鼠、牛、猴、绵羊、猪、马、鹿、大象、犀牛等，优选宠物狗、宠物猫、猴、绵羊等。

如无特殊说明，上述对哺乳动物的描述和定义适用于本文中提到哺乳动物的所有章节、任何实施方案和实施例以及权利要求书。

在本发明的扩增方法中，采集外周血和分离单个核细胞的方法不受特别的限制，可以采用本领域中公知的方法，例如，可以采用体外循环的方法或设备(例如，可以使用人单个核细胞分离机，循环3000～6000mL外周血)。

在本发明的扩增方法中，从抗凝血中去除红细胞的方法也不受特别的限制，可以采用本领域中公知的方法。例如，可以采用密度梯度离心的方法。

在本发明的扩增方法中所采用的细胞分选技术是本领域中所熟知的，可以采用本领域中常用的方法或设备来完成，在本发明中不受任何限制。只要是可以利用表面标志物来分选细胞的技术、方法和设备均可以在本发明中使用。例如，可以采用磁性分选技术或流式细胞术。 细胞分选技术例如磁性分选技术或流式细胞术的具体实施方法可以在许多科学文献中找到，或按照设备或仪器生产厂商的说明书或推荐实验流程实施，本领域技术人员完全有能力获得这些具体实施方法或实验流程。

对于表面标志物，可以根据受试者的物种种类(例如人、小鼠、狗等)以及需要分选和富集的目标细胞占最终分离细胞的比例范围(例如，50％、60％、70％、80％或90％以上)来选择一种或多种标志物的组合。例如，对于人，可以选择CD3、CD56、CD8和Vα24 TCR的组合，为了更高的富集率，还可以增加TCRαβ，即CD3、CD56、CD8、Vα24 TCR和TCRαβ的组合(即，分选出TCRαβ⁺CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24 TCR^-NKT样细胞)。对于小鼠，可以选择CD3、CD161c、CD8和Vα14 TCR的组合，为了更高的富集率，还可以增加TCRαβ，即CD3、CD161c、CD8、Vα14 TCR和TCRαβ的组合(即，分选出TCRαβ⁺CD3⁺CD161c⁺CD8⁺Vα14 TCR^-NKT样细胞)。

在本发明的扩增方法中，本发明的NKT样细胞的培养条件不受特别的限制。对于培养基，可以采用常规用于T细胞培养的培养基，例如RPMI-1640培养基。对于培养条件，可以采用本领域中T细胞培养的常用条件，例如，温度37℃、CO₂浓度5％，每3～5天更换一次培养基。对于本发明的NKT样细胞的扩增和活化，可以通过添加一些细胞因子来实现，例如，能够刺激T细胞增殖和活化的细胞因子，包括但不限于GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、4-1BBL等。

对于培养时间，本领域技术人员可以根据扩增后的细胞的用途具体确定。可以通过定期取样进行细胞计数来估算细胞扩增数量或倍数，从而控制培养时间。如果用于人体临床应用，对于免疫细胞过继回输，回输的细胞量可以在1×10⁹～1×10¹²个细胞，优选1～10×10¹⁰个细胞。如果用于小鼠，则回输的细胞量可以在1～100×10⁶个细胞。一般而言，培养的时间应足以使初步分离或分选的细胞的数量扩增10～1000倍的时间，一般培养7～30天，优选10～27天，更优选14～21天。

本发明的扩增NKT样细胞的方法的一个具体实施方案可以包括以 下步骤：

1)将受试者的外周血采集到抗凝试管中，通过密度梯度离心的方法去除红细胞；

2)从已去除红细胞的外周血中分离单个核细胞，利用表面标志物CD3、CD56(对于受试者是人的情况)或CD161c(对于受试者是小鼠的情况)、CD8、Vα24 TCR以及任选的TCRαβ，借助于流式细胞术分选出CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24 TCR^-或(以及任选地TCRαβ⁺CD3⁺CD56⁺CD8⁺Vα24 TCR^-)NKT样细胞；

3)将步骤2)中得到的本发明的NKT样细胞在完全培养基中，置于37℃、5％CO₂环境下体外培养，并向培养物中添加选自GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、4-1BBL等的一种细胞因子或多种细胞因子的组合，培养足以使其数量扩增10～1000倍的时间(培养时间为大约7～30天，优选10～27天，更优选14～21天，期间定期取样通过细胞计数估算)；以及

4)收获步骤3)中得到的本发明的NKT样细胞。

作为一个非限制性实例，图5中示意性地显示了扩增本发明的NKT样细胞的方法的一个具体实施例的流程图。在图5中所示的具体实例中，采用Ficoll离心并收集外周血中的单个核细胞，通过流式细胞仪分选CD8⁺NKT样细胞亚群，然后通过添加细胞因子组合将分选后的细胞进行扩增，即先分选后扩增的方案。

图6图示了本发明的CD8⁺NKT样细胞的体外扩增能力。从图6A中可以看出体外培养小鼠CD8⁺NKT样细胞21天时，CD8⁺NKT样细胞扩增超过1000倍。由于培养30天时，细胞数量已经足以保证回输的细胞数量，因此对于小鼠，扩增的时间可以选择培养7～30天，优选10-21天。

另外，从图6B中可以看出，人CD8⁺NKT样细胞在14天时扩增达到782倍，之后生长趋缓，在21天时达到1120倍。考虑到体外细胞的潜在成瘤性以及与临床治疗计划的配合，细胞培养时间不宜过长，因此在临床应用中，细胞培养时间可以选择7～30天，优选10～27天，更优选14～21天。

本发明的治疗用组合物

如上所述，可以将本发明的NKT样细胞制备成治疗用组合物，从而便于长期保存以备随时使用，这样可以不仅减少受试者的采血次数从而减少受试者的痛苦和费用，还可以减少医疗操作从而减少交叉性感染或医源性感染的机会。

本发明的治疗用组合物，其包含本发明的NKT样细胞作为主要活性成分。在本发明中，主要活性成分是指能够发挥目标效应的成分。在本发明中，当本发明的治疗用组合物用于治疗免疫性疾病时，则目标效应是调节免疫的效应(例如，免疫负向调节效应)，因而主要活性成分是指所述治疗用组合物中能够发挥免疫调节效应(例如，免疫负向调节效应)的成分。

当本发明的治疗用组合物为包含治疗用细胞的细胞制剂的形式时，则主要活性成分是指主要细胞成分，即发挥目标效应的细胞成分。当本发明的治疗用组合物为包含细胞与具有某种治疗用途的生物分子(例如，蛋白质或多肽、肽、核酸、抗体、氨基酸等)和/或化学药物(例如，化学合成药物)组合的混合物形式时，则主要活性成分为发挥目标效应的细胞成分以及生物分子和/或化学药物的组合。优选地，所述生物分子和/或化学药物的治疗用途与所述治疗用细胞的治疗用途相同，例如，均用于治疗如上文所提及的各种免疫性疾病。所述生物分子和/或化学药物的治疗用途与所述治疗用细胞的治疗用途也可以不同。例如，当本发明的治疗用组合物中包含的治疗用细胞用于治疗如上文所提及的各种免疫性疾病时，所述生物分子和/或化学药物可以是具有治疗细胞治疗的不良反应或副作用以及并发症或合并症(例如，发热、寒战、焦虑；腹水、恶心、呕吐、腹胀、腹泻、梗阻、心力衰竭、心律失常、干咳、咳嗽、呼吸困难、少尿、多尿、蛋白尿、血尿、疼痛、皮肤过敏、皮肤红斑、皮肤瘙痒等等)的活性的分子或药物。

当本发明的治疗用组合物为细胞制剂的形式时，则按细胞数量计，本发明的NKT样细胞占本发明的治疗用组合物中的细胞总数或主要细胞成分总数的50％、60％、70％、80％、90％或95％以上，甚至100％，优选60％以上，更优选80％以上，最优选90％以上。

当本发明的治疗用组合物为包含治疗用细胞和治疗用生物分子和/或化学药物的混合物形式时，则按重量计本发明的NKT样细胞占本发明的治疗用组合物中的主要活性成分(即，细胞以及生物分子和/或化学药物的总量)的50％、60％、70％、80％、90％或95％以上，甚至100％，优选60％以上，更优选80％以上，最优选90％以上。

在一个优选实施方案中，本发明的治疗用组合物还可以包含药学上可接受或生理学可接受的药用辅料、载体、稳定剂、稀释剂、赋形剂、缓冲液、等渗剂和/或添加剂等。

在进一步优选的实施方案中，本发明的治疗用组合物还可以包含常规用于T细胞低温保存的抗冻液(例如，ZENOAQ公司CELLBANKER系列细胞冻存液)，从而可以进行深低温(-80℃以下，例如，在液氮中)保存。

本发明的NKT样细胞的医学用途

本发明的发明人通过大量的研究出人意料地发现本发明的NKT样细胞具有抗原特异性与非抗原特异性的免疫负向调节作用，可以用于治疗由免疫过激反应引起的免疫性疾病，特别是由抗原递呈细胞活化引发的免疫过激反应，更特别地，是由树突状细胞活化引发的免疫过激反应。

图7图示了CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性抑制CD4 T细胞反应的实验结果。在图7图示的实验中，对照组采用GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞递呈OVA_323-339给OT-II转基因小鼠的CD4 T细胞，能够导致CD4 T细胞发生活化和扩增，表现为细胞数量增多。在同样的培养体系中添加NKT-GFP(GFP抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞)则能够有效抑制OT-II转基因小鼠的CD4 T细胞的增殖(p＜0.05)。然而，在同样的培养体系中添加NKT-OVA(OVA抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞)则不能有效抑制OT-II转基因小鼠的CD4 T细胞的增殖。

图8图示了CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性抑制CD8 T细胞反应的实验结果。在图8图示的实验中，对照组采用GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞递呈OVA_257-264 给OT-II转基因小鼠的CD8 T细胞，能够导致CD8 T细胞发生活化和扩增，表现为细胞数量增多。在同样的培养体系中添加NKT-GFP(GFP抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞)则能够有效抑制OT-I转基因小鼠的CD8 T细胞的增殖(p＜0.05)。然而，在同样的培养体系中添加NKT-OVA(OVA抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞)则不能有效抑制OT-I转基因小鼠的CD8 T细胞的增殖。

图9图示了CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制CD4 T细胞反应的实验结果。在图9图示的实验中，在对照组(最左侧的直方图)中向B6小鼠过继回输用CFSE标记的分离自OT-II转基因小鼠的CD4 T细胞，然后将负载OVA_323-339的GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞经腹腔注射至B6小鼠，72h后检测外周血，发现供体CD4 T细胞发生活化和扩增，在流式细胞仪上表现为CFSE分裂峰增多。当向B6小鼠过继回输NKT-GFP和用CFSE标记的分离自OT-II转基因小鼠的CD4 T细胞，然后将负载OVA_323-339的GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞经腹腔注射至B6小鼠时，72h后检测外周血，发现供体CD4 T细胞未发生明显扩增，在流式细胞仪上观察不到CFSE分裂峰(见最右侧的直方图)。当向B6小鼠过继回输NKT-OVA和用CFSE标记的分离自OT-II转基因小鼠的CD4 T细胞，然后将负载OVA_323-339的GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞经腹腔注射至B6小鼠时，72h后检测外周血，发现供体CD4 T细胞发生明显扩增，在流式细胞仪上出现CFSE分裂峰(见中间的直方图)。

图10图示了CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制CD8 T细胞反应的实验结果。在图10图示的实验中，在对照组(最左侧的直方图)中向B6小鼠过继回输用CFSE标记的分离自OT-I转基因小鼠的CD8T细胞，然后将负载OVA_257-264的GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞经腹腔注射至B6小鼠，72h后检测外周血，发现供体CD8 T细胞发生活化和扩增，在流式细胞仪上表现为CFSE分裂峰增多。当向B6小鼠过继回输NKT-GFP和用CFSE标记的分离自OT-I转基因小鼠的CD8 T细胞，然后将负载OVA_257-264的GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞 经腹腔注射至B6小鼠时，72h后检测外周血，发现供体CD8 T细胞未发生明显扩增，在流式细胞仪上观察不到CFSE分裂峰(见最右侧的直方图)。当向B6小鼠过继回输NKT-OVA和用CFSE标记的分离自OT-I转基因小鼠的CD8 T细胞，然后将负载OVA_257-264的GFP-DC(从GFP转基因小鼠体内分离的树突状细胞)作为抗原递呈细胞经腹腔注射至B6小鼠时，72h后检测外周血，发现供体CD8 T细胞发生明显扩增，在流式细胞仪上出现CFSE分裂峰(见中间的直方图)。

图11图示了CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制GFP/OVA抗原的免疫应答的实验结果。在图11的实验中，将GFP-DC和OVA-DC(表达OVA抗原的树突状细胞)的混合物经腹腔注射至B6小鼠，2周后处死小鼠，分离CD49B^-细胞，然后在体外添加或不添加GFP-DC或OVA-DC，72小时后收集培养上清，在上清中检测到较高的TNF-α和IFN-γ分泌水平(对照组)。当将NKT-GFP与GFP-DC和OVA-DC的混合物一起经腹腔注射至B6小鼠时，添加GFP-DC刺激，则与对照组相比TNF-α和IFN-γ分泌水平显著降低(P＜0.05)；添加OVA-DC刺激，则与对照组相比TNF-α和IFN-γ分泌水平相似。当将NKT-OVA与GFP-DC和OVA-DC的混合物一起经腹腔注射至B6小鼠时，添加GFP-DC刺激，则与对照组相比TNF-α和IFN-γ分泌水平相似；添加OVA-DC刺激，则与对照组相比TNF-α和IFN-γ分泌水平显著降低(P＜0.05)。

图12图示了CD8⁺NKT样细胞抗原特异性抑制GFP-DC递呈抗原引发的糖尿病的实验结果。在图12的实验中，借助胰岛素器官特异性表达OVA抗原的转基因小鼠模型，预先注射两种抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞NKT_GFP和NKT_SV，然后注射入OVA特异性CD8 T细胞和负载OVA抗原的GFP-DC。此后动态检测受体小鼠血糖值和体重变化。实验结果表明，NKT_GFP的注射能够有效抑制GFP-DC递呈OVA抗原给OVA抗原特异性CD8 T细胞；而NKT_SV的注射无法阻止GFP-DC递呈OVA抗原给OVA抗原特异性CD8 T细胞，导致表达OVA的胰岛被GFP-DC递呈OVA抗原活化的CD8 T细胞所攻击，产生糖尿病(类似于I型糖尿病)。

图13图示了CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性杀伤树突状细胞 的实验结果。在图13的实验中，将NKT-GFP或NKT-OVA与GFP-DC分别共培养12小时，添加7-AAD，通过流式细胞仪检测GFP阳性的细胞中7-AAD阳性细胞比例，该比例即为CD8⁺NKT样细胞对树突状细胞的杀伤率。实验结果表明，GFP-DC能够特异性的被NKT_GFP细胞杀伤，而NKT_OVA对GFP-DC的杀伤效率较低。该结果提示，NKT细胞可能通过其表明TCR分子识别GFP-DC表面MHC-I类分子递呈的GFP抗原，从而实现NKT_GFP对GFP-DC的抗原特异性杀伤。

图14图示了CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD 8 T细胞上各种Granzyme、Perforin和Lamp-1表达的热图，图中右上方为色阶，从红到黄表示表达强度从低到高。图14的结果表明，CD8⁺NKT样细胞表达比NK细胞和CD8 T细胞更丰富的杀伤分子，如Granzyme B、Perforin和Lamp-1。该结果提示，CD8⁺NKT样细胞对靶细胞的杀伤效应通过颗粒释放途径实现。

如上所述，CD8⁺NKT样细胞兼具NK细胞(表达自然杀伤受体)和CD8 T细胞(表达TCRβ)的表型特征。与NK细胞和CD8 T细胞相比，该细胞体积较大，但核质比小，含有大量可被溶酶体染料染色的颗粒；高分泌IFN-gamma而其它细胞因子分泌较少。上述结果表明，CD8⁺NKT样细胞是一群不同于NK细胞和CD8 T细胞的独特的免疫细胞亚群。进一步研究发现，该细胞亚群能够通过抗原特异性识别并杀伤树突状细胞，负向调节免疫应答，表现为抑制树突状细胞对T细胞(包括CD4 T细胞和CD8 T细胞)的抗原递呈能力。而CD8⁺NKT样细胞对树突状细胞的杀伤依赖于其大量颗粒释放相关分子的表达，如Granzyme B，Perforin和Lamp-1。上述结果表明，CD8⁺NKT样细胞具有抗原特异性免疫负向调节作用，提示其在免疫过激反应引起的免疫性疾病治疗中的应用。在糖尿病小鼠模型中，CD8⁺NKT样细胞的干预能够有效抑制糖尿病进展，证明其具有治疗免疫过激反应引起的疾病的效果。

因此，本发明的NKT样细胞可以用于治疗由免疫过激反应引起的免疫性疾病，优选地，由抗原递呈细胞活化引发的免疫过激反应，更优选地，所述抗原递呈细胞是树突状细胞。

在一个实施方案中，所述免疫过激反应是变态反应性疾病。

在另一个实施方案中，所述免疫性疾病是涉及免疫过激反应的自身免疫病，优选风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘，更优选糖尿病，最优选I型糖尿病。

在又一个实施方案中，所述免疫性疾病是涉及免疫过激反应的炎症。

利用本发明的NKT样细胞治疗免疫性疾病的方法

本发明还提供了一种治疗需要治疗的受试者中的免疫性疾病的方法(在本文中有时称为“本发明的治疗方法”)。该方法的一个具体实施方案可以包括以下步骤：

1)采集受试者的外周血；

2)从所述受试者的外周血中分离单个核细胞，然后富集本发明的NKT样细胞并在体外培养使其数量达到1×10⁹～1×10¹²个细胞；以及

3)收获步骤2)中获得的经扩增的本发明的NKT样细胞并过继回输给所述受试者。

如上所述，在本发明的治疗方法中，在步骤2)中采用的是先富集(例如采用细胞分选的方法)后扩增的方式，但是也可以先扩增后富集的方式，在本发明中不受特别的限制。由于本发明的NKT样细胞在外周血中的含量很小，因此在一个优选的实施方案中，也可以将单核细胞先扩增到一定量后再富集，然后再将富集的本发明的NKT样细胞过继回输，或任选地根据需要的细胞数量进一步扩增到所需数量后再回输。

在本发明的治疗方法中，对于人体临床应用，过继回输的细胞量可以在1×10⁹～1×10¹²个细胞，优选1～10×10¹⁰个细胞范围内。如果用于小鼠，则回输的细胞量可以在1～100×10⁶个细胞范围内。如果回输的细胞量过大(例如，超过1×10⁸个细胞)，则可能产生免疫过度，诱发自身免疫性疾病。而如果回输的细胞量过小(例如，小于1×10⁶个细胞)，则达不到预期治疗效果。

在一个优选的实施方案中，在步骤2)中收获细胞后，为减少所述受试者的采血次数并减少医源性感染机会，如上所述，可以将所述细胞制成本发明的治疗用组合物并保存备用。在此情况下，步骤3)中可 以将本发明的治疗用组合物回输给所述受试者。

在本发明中，术语“治疗”是指向受试者施用本发明的NKT样细胞或本发明的治疗用组合物以获得缓解、减轻或甚至消除一种或多种与本发明所述的免疫性疾病相关的症状或并发症的有益效果。

根据本发明，所述免疫性疾病是由免疫过激反应引起的。优选地，所述免疫过激反应是由抗原递呈细胞活化引发的。

在一个实施方案中，所述免疫过激反应可以是变态反应性疾病，所述变态反应性疾病可以包括但不限于：I型变态反应性疾病、II型变态反应性疾病、III型变态反应性疾病和IV型变态反应性疾病等。其中I型变态反应性疾病可以包括但不限于过敏性休克、荨麻疹、血管神经性水肿、过敏性鼻炎、支气管哮喘等；II型变态反应性疾病可以包括但不限于溶血性贫血、血小板减少性紫癜等；III型变态反应性疾病可以包括但不限于血管炎、血清病等；IV型变态反应性疾病可以包括但不限于湿疹、发疹性药疹、剥脱性皮炎等。

在另一个实施方案中，所述免疫性疾病可以是涉及免疫过激反应的自身免疫病，所述涉及免疫过激反应的自身免疫病可以包括但不限于风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘等。

在又一个实施方案中，所述免疫性疾病可以是涉及免疫过激反应的炎症，所述涉及免疫过激反应的炎症可以包括但不限于肝炎、胃炎、肺炎、脑炎、脑膜炎等。

在一个优选的实施方案中，过继回输本发明的NKT样细胞的频次可以为每月2次，每次回输细胞量可以为1～10×10¹⁰。

在优选的实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，优选地选自牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠、猴和人，更优选是人。所述受试者还可以是宠物动物。

本发明的优选实施方案包括：

1.NKT样细胞亚群在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的用途，其中所述NKT样细胞亚群包含表达CD8分子的NKT样细胞。

2.根据实施方案1所述的用途，其特征在于所述表面表达CD8分子 的NKT样细胞在所述NKT样细胞亚群中的比例为50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，最优选80％以上。

3.根据实施方案2所述的用途，其特征在于所述NKT样细胞亚群包含100％的表面表达CD8分子的NKT样细胞。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的用途，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD56，但不表达Vα24 TCR。

5.根据实施方案1-3中任一项所述的用途，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD161c，但不表达Vα14 TCR。

6.根据实施方案4或5所述的用途，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上还表达TCRαβ。

7.根据实施方案1-6中任一项所述的用途，其特征在于所述NKT样细胞亚群分离自哺乳动物。

8.根据实施方案7所述的用途，其特征在于所述哺乳动物选自牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物，优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物和人，更优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠、猴和人。

9.根据实施方案7所述的用途，其特征在于所述哺乳动物是宠物动物，优选宠物狗、宠物猫、啮齿动物宠物、宠物兔。

10.根据实施方案1-9中任一项所述的用途，其中所述免疫性疾病是由免疫过激反应引起的。

11.根据实施方案10所述的用途，其中所述免疫过激反应是由抗原递呈细胞活化引发的，所述抗原递呈细胞优选是树突状细胞。

12.根据实施方案11所述的用途，其中所述免疫过激反应是变态反应性疾病，所述变态反应性疾病选自：I型变态反应性疾病、II型变态反应性疾病、III型变态反应性疾病和IV型变态反应性疾病。

13.根据实施方案12所述的用途，其特征在于I型变态反应性疾病选自过敏性休克、荨麻疹、血管神经性水肿、过敏性鼻炎和支气管哮喘。

14.根据实施方案12所述的用途，其特征在于II型变态反应性疾病选自溶血性贫血和血小板减少性紫癜。

15.根据实施方案12所述的用途，其特征在于III型变态反应性疾病选自血管炎和血清病。

16.根据实施方案12所述的用途，其特征在于IV型变态反应性疾病选自湿疹、发疹性药疹和剥脱性皮炎。

17.根据实施方案10所述的用途，其中所述免疫性疾病是涉及免疫过激反应的自身免疫病，所述涉及免疫过激反应的自身免疫病选自风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、多发性硬化、糖尿病和哮喘，优选风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和糖尿病，更优选糖尿病，最优选I型糖尿病。

18.根据实施方案10所述的用途，其中所述免疫性疾病是涉及免疫过激反应的炎症，所述涉及免疫过激反应的炎症选自：肝炎、胃炎、肺炎、脑炎和脑膜炎。

19.一种治疗受试者中的免疫性疾病的方法，该方法包括以下步骤：

1)采集所述受试者的外周血；

2)从所述受试者的外周血中分离单个核细胞，富集NKT样细胞亚群并在体外扩增；以及

3)收获步骤2)中获得的经扩增的NKT样细胞亚群，并过继回输给所述受试者；并且

其中所述NKT样细胞亚群包含表达CD8分子的NKT样细胞。

20.根据实施方案19所述的方法，其中所述免疫性疾病是由免疫过激反应引起的。

21.根据实施方案20所述的方法，其中所述免疫过激反应是由抗原递呈细胞活化引发的，所述抗原递呈细胞优选是树突状细胞。

22.根据实施方案21所述的方法，其中所述免疫过激反应是变态反应性疾病，所述变态反应性疾病选自：I型变态反应性疾病、II型变态反应性疾病、III型变态反应性疾病和IV型变态反应性疾病。

23.根据实施方案22所述的方法，其特征在于I型变态反应性疾病选自过敏性休克、荨麻疹、血管神经性水肿、过敏性鼻炎和支气管哮喘。

24.根据实施方案22所述的方法，其特征在于II型变态反应性疾病选 自溶血性贫血和血小板减少性紫癜。

25.根据实施方案22所述的方法，其特征在于III型变态反应性疾病选自血管炎和血清病。

26.根据实施方案22所述的方法，其特征在于IV型变态反应性疾病选自湿疹、发疹性药疹和剥脱性皮炎。

27.根据实施方案19所述的方法，其中所述免疫性疾病是涉及免疫过激反应的自身免疫病，所述涉及免疫过激反应的自身免疫病选自风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、多发性硬化、糖尿病和哮喘，优选风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和糖尿病，更优选糖尿病，最优选I型糖尿病。

28.根据实施方案19所述的方法，其中所述免疫性疾病是涉及免疫过激反应的炎症，所述涉及免疫过激反应的炎症选自：肝炎、胃炎、肺炎、脑炎和脑膜炎。

29.根据实施方案19所述的方法，其特征在于所述受试者是哺乳动物。

30.根据实施方案29中所述的方法，其特征在于所述哺乳动物选自牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物，优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物和人，更优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠、猴和人。

31.根据实施方案19所述的方法，其特征在于所述哺乳动物是宠物动物，优选宠物狗、宠物猫、啮齿动物宠物和宠物兔。

32.根据实施方案19所述的方法，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞在所述NKT样细胞亚群中的比例为50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，最优选80％以上。

33.根据实施方案32所述的方法，其特征在于所述NKT样细胞亚群包含100％的表面表达CD8分子的NKT样细胞。

34.根据实施方案19-33中任一项所述的方法，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD56，但不表达Vα24 TCR。

35.根据实施方案19-33中任一项所述的方法，其特征在于所述表面表 达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD161c，但不表达Vα14 TCR。

36.根据实施方案34或35所述的方法，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上还表达TCRαβ。

以下实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明，但而不是要限制本发明的范围。当阅读说明书并参考公知常识时，其它实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到。

实施例

实施例1：小鼠CD8⁺NKT样细胞表型检测。

(1)分离小鼠脾脏细胞，用密度为1.083的Ficoll液进行密度梯度离心，分离其中的单个核细胞。

(2)按照stemcell公司panNK阳性分选试剂盒的要求，分选小鼠脾脏细胞中的panNK阳性细胞。具体操作步骤如下：

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

②按照50μL/mL细胞悬液的用量添加CD49b-PE(CD49b是panNK的标志)，室温避光孵育15分钟；

③按照100μL/mL细胞悬液的用量添加cocktail液，室温避光孵育15分钟；

④按照50μL/mL细胞悬液的用量添加magnetic beads，室温避光孵育10分钟；

⑤向细胞悬液中添加PBS至2.5mL，转移入5mL BD Falcon流式细胞仪上样管中，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑥拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑦2.5mL PBS重悬细胞，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑧拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑨从磁铁中取出BD Falcon流式细胞仪上样管，500μL PBS重悬阳性细胞。

(3)200μL PBS重悬阳性细胞，标记10μL APC标记的α-GalCer-loaded CD1dtetramer(Proimmune公司)，4℃孵育30分钟。

(4)1mL PBS洗涤一遍，500μL PBS重悬细胞，50μL/管分装样本后标记(以下荧光抗体非特殊说明，均购自BioLegend公司)：

管①标记TCRβ-FITC，CD8-PerCP，CD3-APC-Cy7，NK1.1-PE-Cy7

管②标记TCRβ-FITC，CD8-APC-Cy7，NKG2D-PE-Cy7，CD44-PerCP

管③标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，KLRG1-PE-Cy7，Ly49G2-FITC(eBioscience公司)

管④标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，CD27-PE-Cy7，NKG2A/C/E-FITC

管⑤标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PE-Cy7，CD62L-FITC，CD122-PerCP

管⑥-⑩标记上述抗体相应的同型对照抗体(来自BioLegend公司)，不再赘述。

(5)各样本管4℃孵育30分钟。

(6)各样本管加1mL PBS，1500rpm离心10分钟，弃上清。

(7)重复步骤(6)，300μL PBS重悬细胞。

(8)BD FACSAria II流式细胞仪上样，对CD8⁺DX5⁺TCRβ⁺CD1d Tetramer^-细胞(小鼠CD8⁺NKT样细胞)进行表型检测。

结果表明，小鼠CD8⁺NKT样细胞既表达T细胞谱系标志CD3和TCRβ，也表达NK细胞谱系标志NK1.1(CD161c)，但不表达iNKT的谱系标志CD1d。另外，从图1中还可以看出，本发明的CD8⁺NKT样细胞表达 T细胞活化标志CD44、CD62L和CD122，以及NK细胞受体NKG2A/C/E、KLRG1、NKG2D、Ly49G₂和CD27。

实施例2：小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异

(1)分离小鼠脾脏细胞，用密度为1.083的Ficoll液进行密度梯度离心，分离其中的单个核细胞。

(2)按照stemcell公司panNK阳性分选试剂盒的要求，分选小鼠脾脏细胞中的panNK阳性细胞。具体操作步骤如下：

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

②按照50μL/mL细胞悬液的用量添加CD49b-PE(CD49b是panNK的标志)，室温避光孵育15分钟；

③按照100μL/mL细胞悬液的用量添加cocktail液，室温避光孵育15分钟；

④按照50μL/mL细胞悬液的用量添加磁珠，室温避光孵育10分钟；

⑤向细胞悬液中添加PBS至2.5mL，转移入5mL BD Falcon流式细胞仪上样管中，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑥拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑦2.5mL PBS重悬细胞，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑧拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑨从磁铁中取出BD Falcon流式细胞仪上样管，500μL PBS重悬阳性细胞。

(3)200μL PBS重悬阳性细胞，标记10μL APC标记的α-GalCer-loaded CD1dtetramer(Proimmune公司)，4℃孵育30分钟。

(4)1mL PBS洗涤一遍，500μL PBS重悬细胞，50μL/管分装样本后标记(均购自BioLegend公司)：

管①标记TCRβ-FITC，CD8-PerCP，CD3-APC-Cy7，NK1.1-PE-Cy7

管②标记TCRβ-FITC，CD8-APC-Cy7，NKG2D-PE-Cy7

管③标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，KLRG1-PE-Cy7，Ly6G-FITC

管④标记TCRβ-APC-Cy7，CD8-PerCP，CD27-PE-Cy7， NKG2A/C/E-FITC

管⑤-⑧标记上述抗体相应的同型对照抗体(来自BioLegend公司)，不再赘述。

(5)各样本管4℃孵育30分钟。

(6)各样本管加1mL PBS，1500rpm离心10分钟，弃上清。

(7)重复步骤(6)，300μL PBS重悬细胞。

(8)BD FACSAria II流式细胞仪上样，设门关注CD8⁺DX5⁺TCRβ⁺CD1d Tetramer^-细胞(小鼠CD8⁺NKT样细胞)、CD8^-DX5⁺TCRβ⁺CD1d Tetramer⁺细胞(小鼠iNKT细胞)、CD8⁺DX5^-TCRβ⁺CD1d Tetramer^-细胞(小鼠CD8⁺T细胞)、DX5⁺TCRβ^-细胞(小鼠NK细胞)，并分析其表型。

结果显示，本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞与NK细胞、iNKT细胞和CTL细胞的表型差异。从图2中可以看出：(1)与NK细胞相比，CD8⁺NKT样细胞表达NK细胞标志NK1.1(CD161c)、NKG2A/C/E、CD27、KLRG1和Ly6G，但比NK细胞多表达TCRβ和CD3；(2)与CTL细胞相比，CD8⁺NKT样细胞表达T细胞谱系标志TCRβ和CD3，但不表达NK细胞受体；(3)与iNKT细胞相比，CD8⁺NKT样细胞不能结合负载脂类抗原的CD1d四聚体。

实施例3：本发明的小鼠CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD8 T细胞的透射电镜照片和激光共聚焦显微镜照片。

(1)分离小鼠脾脏细胞，用密度为1.083的Ficoll液进行密度梯度离心，分离其中的单个核细胞。

(2)按照stemcell公司panNK阳性分选试剂盒的要求，分选小鼠脾脏细胞中的panNK阳性细胞。具体操作步骤如下：

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

②按照50μL/mL细胞悬液的用量添加CD49b-PE(CD49b是panNK的标志)，室温避光孵育15分钟；

③按照100μL/mL细胞悬液的用量添加cocktail液，室温避光孵育15 分钟；

④按照50μL/mL细胞悬液的用量添加magnetic beads，并加入20μL/mL TCRβ-FITC和CD8-APC-Cy7，室温避光孵育10分钟；

⑤向细胞悬液中添加PBS至2.5mL，转移入5mL BD Falcon流式细胞仪上样管中，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑥拿起磁铁，将阴性细胞倾倒入新的离心管中；

⑦2.5mL PBS重悬细胞，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑧拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑨从磁铁中取出BD Falcon流式细胞仪上样管。

(3)200μL PBS重悬阳性细胞，标记10μL APC标记的α-GalCer-loaded CD1dtetramer(Proimmune公司)，4℃孵育30分钟。

(4)1mL PBS洗涤一遍，500μL PBS重悬细胞，BD FACSAria II流式细胞仪上样，设门分选CD8⁺DX5⁺TCRβ⁺细胞(小鼠CD8⁺NKT样细胞)和DX5⁺TCRβ^-细胞(小鼠NK细胞)；阴性细胞上样分选CD8⁺DX5^-TCRβ⁺细胞(小鼠CD8⁺T细胞)。

(4)CD8⁺NKT样细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞分别以2×10⁶/mL密度铺板于96孔板，添加含有IL-2 50ng/mL，IL-4 10ng/mL，IL-5 10ng/mL，IL-6 100ng/mL，IL-7 80ng/mL，IL-91ng/mL，IL-12 100ng/mL，IL-15 20ng/mL，GM-CSF 10ng/mL、4-1BBL 20ng/mL的1640完全培养基，体外培养5天后收集细胞送样透射电镜和激光共聚焦显微镜。

(5)激光共聚焦显微镜观察CD8⁺NKT样细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞的形态包括以下步骤：

①调节3种细胞在PBS缓冲液中的密度均为1×10⁶/ml。

②按照1∶100的体积比加入CD90.2-FITC抗体，并加入终浓度为1μmol/L的LysoTracker染料。4℃孵育30分钟。

③PBS缓冲液充分洗涤2遍，加入终浓度为10μg/ml的Hoechst 33342 染料。室温孵育10分钟后即可观察。

图3A的透射电镜照片显示，CD8⁺NKT样细胞中含有大量的颗粒样物质，而NK和CD8+T细胞中类似的颗粒样物质较少。从图3B的激光共聚焦显微照片中发现本发明的CD8⁺NKT样细胞体积较大，其直径为约15μm以上，而NK细胞和CD8⁺T细胞的直径小于10μm，大约在7μm左右。同时，CD8⁺NKT样细胞中的颗粒样物质为溶酶体染料染色阳性，提示这些颗粒样物质可能含有发挥细胞毒效应的颗粒酶，而NK细胞和CD8⁺T细胞中这些溶酶体染料染色阳性的颗粒则很少。另外，通过对细胞核和细胞膜的染色还发现，CD8⁺NKT样细胞的核质比与其他两种细胞相比较小。

实施例4：小鼠CD8⁺NKT样细胞、CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的细胞因子分泌能力比较。

1.OT-I小鼠CD8⁺NKT样细胞和CD8⁺T细胞的分离

(1)分离OT-I小鼠脾脏细胞，用密度为1.083的Ficoll液进行密度梯度离心，分离其中的单个核细胞。

(2)按照stemcell公司panNK阳性分选试剂盒的要求，分选OT-I小鼠脾脏细胞中的panNK阳性细胞。具体操作步骤如下：

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

②按照50μL/mL细胞悬液的用量添加CD49b-PE(CD49b是panNK的标志)，室温避光孵育15分钟；

③按照100μL/mL细胞悬液的用量添加cocktail液，室温避光孵育15分钟；

④按照50μL/mL细胞悬液的用量添加magnetic beads，并加入20μL/mL TCRβ-FITC和CD8-APC-Cy7，室温避光孵育10分钟；

⑤向细胞悬液中添加PBS至2.5mL，转移入5mL BD Falcon流式细胞仪上样管中，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑥拿起磁铁，将阴性细胞倾倒入新的离心管中；

⑦2.5mL PBS重悬细胞，放入stemcell阳性分选磁铁内静置5分钟；

⑧拿起磁铁，倾倒掉阴性细胞；

⑨从磁铁中取出BD Falcon流式细胞仪上样管，500μL PBS重悬阳性细胞。

(3)200μL PBS重悬阳性细胞，标记10μL APC标记的α-GalCer-loaded CD1dtetramer(Proimmune公司)，4℃孵育30分钟。

(4)1mL PBS洗涤一遍，500μL PBS重悬阳性细胞，BD FACSAria II流式细胞仪上样，设门分选CD8⁺DX5⁺TCRβ⁺细胞(小鼠CD8⁺NKT样细胞)；阴性细胞上样分选CD8⁺DX5^-TCRβ⁺细胞(小鼠CD8⁺T细胞)。

2.OT-II小鼠CD4⁺T细胞的分离：

(1)分离OT-II小鼠脾脏细胞，用密度为1.083的Ficoll液进行密度梯度离心，分离其中的单个核细胞。

(2)按照Miltenyi公司CD4阳性分选试剂盒的要求，分选OT-II小鼠脾脏细胞中的CD4⁺T细胞。具体操作步骤如下：

①将脾脏单个核细胞用PBS缓冲液重悬于10⁸/mL；

②按照100μL/mL细胞悬液的用量添加抗小鼠CD4磁珠抗体，4℃避光孵育15分钟；

③2mL PBS重悬标记后的细胞，加入到Miltenyi磁性分离柱上；

④液体滴尽后再加入2mLPBS；再重复一遍；

⑤将分选柱与磁铁解离，冲洗出阳性细胞，纯度在90％以上。

3.淋巴细胞群体的抗原特异性活化和胞内细胞因子检测：

(1)用含10％胎牛血清的1640培养基重悬，按照8×10⁴/孔的密度接种于96孔圆底培养板，每孔加入1×10⁴/孔负载抗原的树突状细胞(对于OT-I小鼠来源的CD8⁺NKT样细胞和CD8⁺T细胞，添加OVA_257-264肽段终浓度为1μg/mL；对于OT-II小鼠来源的CD4⁺T细胞，添加OVA_323-339肽段终浓度为1μg/mL)刺激。每孔培养基总体积为100μL。(3)培养24小时、48小时，分别收取培养上清，应用eBioscience公司Th细胞因子检测试剂盒(BMS822FF mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13plex)检测细胞因子浓度。具体操作完全按照说明书进行，不再赘述。

从图4中可以看出在特异性抗原刺激后24h和48h，CD8⁺NKT样细胞分泌的IFN-γ水平显著高于CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞；其分泌 的IL-2水平低于CD8⁺T细胞，但与CD4⁺T细胞相当。从细胞因子表达谱来说，相对于CD4⁺T细胞，在CD8⁺T细胞中IFN-γ和IL-2两者均为高水平表达，而在本发明的CD8⁺NKT样细胞中仅IFN-γ高表达。

实施例5：本发明的人CD8⁺NKT样细胞的体外扩增方法的一个实例的流程图。

(1)取人静脉血于含有肝素抗凝剂的真空管中，用密度1.077的Ficoll淋巴细胞分离液(Sigma公司)，通过密度梯度离心的方法分离血液中的单个核细胞(PBMC)。

(2)PBS缓冲液重悬PBMC，密度为2×10⁶/mL，按照1∶100的比例加入PerCP标记的的人CD3抗体，PE标记的抗人CD56抗体，APC标记的抗人CD8抗体，PE-Cy7标记的抗人CD4抗体，FITC标记的抗人iNKT Vα24TCR抗体，4℃孵育30分钟。

(3)20mLPBS重悬，1500rpm离心10分钟。

(4)重复步骤(3)

(5)按照图5第二步的设门策略分选CD3⁺CD56⁺Vα24TCR^-CD8⁺CD4^-细胞亚群。

(6)以2×10⁶/mL密度培养。培养体系为含有IL-2 50ng/mL(购自Peprotech公司，下同)，IL-4 10ng/mL，IL-5 10ng/mL，IL-6 100ng/mL，IL-7 80ng/mL，IL-9 1ng/mL，IL-12100ng/mL，IL-15 20ng/mL，GM-CSF 10ng/mL、4-1BBL 20ng/mL的无血清培养基Takara GT-T551(宝日医公司)。

(7)培养21天即可收集使用。

实施例6：CD8⁺NKT样细胞的体外扩增能力展示。

1.小鼠CD8⁺NKT样细胞的体外扩增能力展示。

(1)按照实施例4描述的OT-I小鼠CD8⁺NKT样细胞的分离方法分选OT-I小鼠CD8⁺NKT样细胞。

(2)在含有IL-2 50ng/mL(购自Peprotech公司，下同)，IL-4 10ng/mL，IL-5 10ng/mL，IL-6 100ng/mL，IL-7 80ng/mL，IL-9 1ng/mL，IL-12 100ng/mL，IL-15 20ng/mL，GM-CSF10ng/mL、4-1BBL 20ng/mL和10％胎牛血清(Gibco公司)的1640培养基(Gibco公司)中，以2×10⁶/mL密度培养；培养体系中同时添加1×10⁴/孔负载1μg/mL OVA_257-264抗原(ChinesePeptide Company合成)的树突状细胞。

(3)培养后每7天收集细胞，用血球计数板计数细胞数量，绘制细胞生长曲线。

2.人CD8⁺NKT样细胞的体外扩增能力展示。

(1)按照实施例5描述的人CD8⁺NKT样细胞的分离方法分离CD8⁺NKT样细胞。

(2)以2×10⁶/mL密度培养。培养体系为含有IL-2 50ng/mL(购自Peprotech公司，下同)，IL-4 10ng/mL，IL-5 10ng/mL，IL-6 100ng/mL，IL-7 80ng/mL，IL-9 1ng/mL，IL-12100ng/mL，IL-15 20ng/mL，GM-CSF 10ng/mL、4-1BBL 20ng/mL的无血清培养基Takara GT-T551(宝日医公司)。

(3)培养后每7天收集部分细胞，用血球计数板计数细胞数量，绘制细胞

实施例7：CD8⁺NKT细胞抗原特异性抑制CD4 T细胞反应体外实验。

1.负载GFP抗原或OVA抗原的树突状细胞的诱导和培养：

(1)取6～8周龄的EGFP转基因小鼠或OVA转基因小鼠，颈部脱臼处死，酒精棉擦拭消毒后放入超净工作台中。

(2)取小鼠双侧股骨，放入PBS缓冲液中。

(3)用1mL注射器吸取PBS后，冲洗股骨两端的骨髓造血细胞，直至股骨颜色变白。

(4)冲洗液移入离心管中，300g离心10分钟，弃掉上清。

(5)细胞重悬后，加入红细胞裂解液(Tris-NH₄Cl)，室温静置3分钟。

(6)200g离心10分钟，弃掉上清。

(7)在含10％胎牛血清的1640培养基中添加10ng/ml rmGM-CSF和1ng/ml IL-4，配制DC培养基。

(8)用DC培养基重悬细胞，以4×10⁶/ml的密度接种于6孔培养板。

(9)细胞培养板放置于37℃二氧化碳培养箱中培养3天。

(10)轻轻晃动培养板，使板内悬浮细胞和贴壁细胞分开。丢弃悬浮细胞。

(11)贴壁细胞继续培养4天，其间根据细胞生长状态进行换液和传代。

(12)培养至第7天时，向培养体系中添加1ng/ml LPS。

(13)24小时后，收集培养体系内的悬浮细胞，应用StemCell磁性分选体系分选其中的CD11c阳性细胞，即为成熟的树突状细胞。

2.GFP抗原特异性CD8⁺NKT样细胞的制备：

(1)2×10⁶负载GFP抗原的树突状细胞免疫C57BL/6小鼠，2周一次，共免疫4次。

(2)取免疫后的C57BL/6小鼠，分离脾脏细胞，在含有IL-2 50ng/mL(购自Peprotech公司，下同)，IL-4 10ng/mL，IL-5 10ng/mL，IL-6 100ng/mL，IL-7 80ng/mL，IL-91ng/mL，IL-12 100ng/mL，IL-15 20ng/mL，GM-CSF 10ng/mL、4-1BBL 20ng/mL和10％胎牛血清(Gibco公司)的1640培养基(Gibco公司)中，以2×10⁶/mL密度培养；培养体系中同时添加1×10⁴/孔负载GFP抗原的树突状细胞。

(3)培养28天后，按照实施例6的分选策略，分选其中的CD8⁺NKT样细胞，记为NKT_GFP。

3.OVA抗原特异性CD8⁺NKT样细胞的制备：

(1)2×10⁶负载OVA抗原的树突状细胞免疫C57BL/6小鼠，2周一次，共免疫4次。

(2)取免疫后的C57BL/6小鼠，分离脾脏细胞，在含有IL-2 50ng/mL(购自Peprotech公司，下同)，IL-4 10ng/mL，IL-5 10ng/mL，IL-6 100ng/mL，IL-7 80ng/mL，IL-91ng/mL，IL-12 100ng/mL，IL-15 20ng/mL，GM-CSF 10ng/mL、4-1BBL 20ng/mL和10％胎牛血清(Gibco公司)的1640培养基(Gibco公司)中，以2×10⁶/mL密度培养；培养体系中同时添加1×10⁴/孔负载OVA抗原的树突状细胞。

(3)培养28天后，按照实施例6的分选策略，分选其中的CD8⁺NKT样细胞，记为NKT_OVA。

4.CD8⁺NKT样细胞、CD4 T细胞、树突状细胞共培养检测

(1)取OT-II转基因小鼠(Jackson Laboratory)脾脏细胞，按照Miltenyi公司抗小鼠CD4磁珠抗体的使用方法进行磁性分选(步骤参照实施例4)，获得OVA_323-339抗原特异性的CD4 T细胞，流式细胞仪检测其纯度大于90％。

(2)按照表1所示的实验设计，预先将DC接种于24孔板，每孔1×10⁵。

(3)按照CD8⁺NKT样细胞∶CD4 T细胞∶DC数量比1∶20∶1的比例，参照表1，将不同抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞和CD4 T细胞接种于24孔板，每孔细胞数量分别为1×10⁵和2×10⁶。

(4)按照表1所示，添加终浓度为200ng/ml的OVA_323-339多肽。

(5)按照图7B所示将各种细胞或试剂添加至24孔板，72小时后标记APC标记的抗小鼠CD4抗体，比较各组CD4 T细胞数量(图7)。

表1 CD8⁺NKT样细胞抗原特异性抑制CD4 T细胞反应体外实验设计表

图7结果显示，NKT_GFP细胞在体外能够显著抑制GFP-DC对CD4 T细胞的抗原递呈(P＜0.05)，而对OVA-DC对CD4 T细胞的抗原递呈抑制效应不显著。图7结果提示NKT细胞对CD4T细胞应答具有抑制效应，且该效应具有抗原依赖性。

实施例8：CD8⁺NKT细胞抗原特异性抑制CD8 T细胞反应体外实验。

(1)按照实施例7描述的方法制备负载GFP或OVA抗原的树突状细胞、NKT_GFP和NKT_OVA。

(2)取OT-I转基因小鼠(Jackson Laboratory)脾脏细胞，按照Miltenyi公司抗小鼠CD8磁珠抗体的使用方法进行磁性分选(步骤参照实施例4)，获得OVA_257-264抗原特异性的CD8 T细胞，流式细胞仪检测其纯度大于90％。

(2)按照表2所示的实验设计，预先将DC接种于24孔板，每孔1×10⁵。

(3)按照CD8⁺NKT样细胞∶CD8 T细胞∶DC数量比1∶10∶1的比例，参照表2，将不同抗原特异性的CD8⁺NKT样细胞和CD8 T细胞接种于24孔板，每孔细胞数量分别为1×10⁵和1×10⁶。

(4)按照表2所示，添加终浓度为100ng/ml的OVA_257-264多肽。

(5)培养72小时后，显微镜取像(图8A)。

(6)按照图8B所示将各种细胞或试剂添加至24孔板，72小时后标记APC标记的抗小鼠CD8抗体，比较各组CD8 T细胞数量(图8B)。

表2 CD8⁺NKT样细胞抗原特异性抑制CD8 T细胞反应体外实验设计表

图8结果显示，NKT_GFP细胞在体外能够显著抑制GFP-DC对CD8 T细胞的抗原递呈(P＜0.05)，而对OVA-DC对CD8 T细胞的抗原递呈抑制效应不显著。图8结果提示NKT细胞在体外对CD8 T细胞应答具有抑制效应，且该效应具有抗原依赖性。

实施例9：CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制CD4 T细胞反应

(1)按照实施例7描述的方法制备负载GFP或OVA抗原的树突状细胞、NKT_GFP和NKT_OVA。

(2)取OT-II转基因小鼠(Jackson Laboratory)脾脏细胞，按照Miltenyi公司抗小鼠CD4磁珠抗体的使用方法进行磁性分选(步骤参照实施例4)，获得OVA_323-339抗原特异性的CD4 T细胞，流式细胞仪检测其纯度大于90％。

(3)用PBS缓冲液重悬分选的小鼠淋巴细胞至1×10⁶/ml密度。

(4)加入终浓度1μmol/L的CFSE荧光染料，4℃孵育10分钟。

(5)加入含10％胎牛血清的PBS缓冲液，室温封闭3分钟后，300g离心10分钟。该步骤再重复2遍。

(6)弃掉洗涤上清，获得细胞即CFSE标记的淋巴细胞。

(7)取18只Thy1.1转基因小鼠，均分三组，每组6只，作为受体小鼠。

(8)按照表3设计方案，同时腹腔注射指定数量的CD4 T细胞和(或)CD8⁺NKT样细胞。

(9)6小时后，腹腔注射负载OVA_323-339多肽的GFP-DC，每只小鼠注射1×10⁵。

(10)72小时后，取Thy1.1受体小鼠脾脏细胞，标记抗小鼠CD90.2荧光抗体和抗小鼠CD4荧光抗体，对CD90.2⁺CD4⁺细胞显示CFSE分裂峰，并对不同组供体CD4 T细胞CFSE分裂峰进行比较。

表3 CD8⁺NKT样细胞抗原特异性抑制CD4 T细胞反应体内实验设计表

图9结果显示，NKT_GFP细胞在体内能够显著抑制GFP-DC对CD4 T细胞的抗原递呈(P＜0.05)，而对OVA-DC对CD4 T细胞的抗原递呈抑制效应不显著。图9结果提示NKT细胞在体内对CD4 T细胞应答具有抑制效应，且该效应具有抗原依赖性。

实施例10：CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制CD8 T细胞反应

(1)按照实施例7描述的方法制备负载GFP或OVA抗原的树突状细胞、NKT_GFP和NKT_OVA。

(2)取OT-I转基因小鼠(Jackson Laboratory)脾脏细胞，按照Miltenyi公司抗小鼠CD8磁珠抗体的使用方法进行磁性分选(步骤参照实施例4)，获得OVA_257-264抗原特异性的CD8 T细胞，流式细胞仪检测其纯度大于90％。

(3)用PBS缓冲液重悬分选的小鼠淋巴细胞至1×10⁶/ml密度。

(4)加入终浓度1μmol/L的CFSE荧光染料，4℃孵育10分钟。

(5)加入含10％胎牛血清的PBS缓冲液，室温封闭3分钟后，300g离心10分钟。该步骤再重复2遍。

(6)弃掉洗涤上清，获得细胞即CFSE标记的淋巴细胞。

(7)取18只Thy1.1转基因小鼠，均分三组，每组6只，作为受体小鼠。

(8)按照表4设计方案，同时腹腔注射指定数量的CD8 T细胞和(或)NKT样细胞。

(9)6小时后，腹腔注射负载OVA_257-264多肽的GFP-DC，每只小鼠注射1×10⁵。

(10)72小时后，取Thy1.1受体小鼠脾脏细胞，标记抗小鼠CD90.2荧光抗体和抗小鼠CD8荧光抗体，对CD90.2⁺CD8⁺细胞显示CFSE分裂峰，并对不同组供体CD8 T细胞CFSE分裂峰进行比较。

表4 CD8⁺NKT样细胞抗原特异性抑制CD8 T细胞反应体内实验设计表

图10结果显示，NKT_GFP细胞在体内能够显著抑制GFP-DC对CD8 T细胞的抗原递呈(P＜0.05)，而对OVA-DC对CD4 T细胞的抗原递呈抑制效应不显著。图10结果提示NKT细胞在体内对CD8 T细胞应答具有抑制效应，且该效应具有抗原依赖性。

实施例11：CD8⁺NKT样细胞在体内抗原特异性抑制GFP/OVA抗原激发的免疫应答

(1)按照实施例7描述的方法制备负载GFP或OVA抗原的树突状细胞、NKT_GFP和NKT_OVA。

(2)第1天：按照表5实验设计，取18只C57BL/6小鼠，均分三组，分别腹腔注射2×10⁶NKT_GFP、2×10⁶NKT_OVA和等体积PBS。

(3)6小时后，所有小鼠免疫GFP-DC和OVA-DC的混合细胞，各1×10⁵。

(4)第14天：取各组每只小鼠脾脏淋巴细胞，应用StemCell磁性分选体系，分选CD49b阴性细胞(具体步骤参照实施例1)。

(5)取各组每只小鼠DX5阴性细胞5×10⁶，接种于24孔培养板。并按照表3.5实验设计，分别向培养体系中添加GFP-DC或OVA-DC每孔1×10⁴。

(6)共培养72小时后，收取培养上清200μl/孔，应用eBioscience多种细胞因子检测试剂盒(BMS822FF mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13plex)进行细胞因子分泌谱检测，以反映整体免疫系统状态。

表5 CD8⁺NKT样细胞抗原特异性抑制体内对GFP/OVA抗原免疫应答实验设计

图11所示的结果表明，NKT_GFP细胞的干预能够有效抑制机体对GFP抗原产生的免疫应答，但并不影响机体对OVA抗原产生的免疫应答。反之亦然。该结果表明，NKT_GFP细胞能够抗原特异性抑制T细胞免疫应答。

实施例12：CD8⁺NKT样细胞抑制糖尿病进展

(1)按照实施例7描述的方法制备NKT_GFP细胞、负载GFP抗原的树突状细胞，并按照相同原理制备NKT_SV细胞。

(2)取OT-I转基因小鼠(Jackson Laboratory)脾脏细胞，按照Miltenyi公司抗小鼠CD8磁珠抗体的使用方法进行磁性分选(步骤参照实施例4)，获得OVA_257-264抗原特异性的CD8 T细胞，流式细胞仪检测其纯度 大于90％。

(3)2×10⁶NKT_GFP和NKT_SV细胞预先腹腔注射入RIP-OVA转基因小鼠(购自Jackson实验室)。

(4)受体小鼠腹腔注射8×10⁶OVA_257-264抗原特异性的CD8 T细胞和2×10⁵负载OVA_257-264抗原的GFP-DC。

(5)每两天检测受体小鼠血糖值(强生One-Touch Ultra血糖仪)和体重，反映小鼠糖尿病进展。

图12所示的结果表明，NKT_GFP细胞的干预能够有效抑制GFP-DC递呈抗原引发的糖尿病，NKT_SV细胞无法抑制GFP-DC递呈抗原引发的糖尿病。这表明CD8⁺NKT样细胞能够抗原特异性抑制T细胞免疫应答。

实施例13：CD8⁺NKT样细胞在体外抗原特异性杀伤树突状细胞

(1)按照实施例7描述的方法制备负载GFP抗原的树突状细胞和NKT_GFP细胞。

(2)收集靶细胞GFP-DC，以5×10³/孔的密度接种于96孔平底板；收集靶细胞OVA-DC，标记CMFDA后，以5×10³/孔的密度接种于96孔平底板。

(3)收集效应细胞NKT_GFP细胞，以效靶比(E∶T)1∶1、5∶1和10∶1的比例加入预先接种GFP-DC的培养孔内，每个效靶比6个复孔。

(4)12小时，收集剩余各组细胞，标记7-AAD，4℃孵育10分钟后，流式细胞仪检测7-AAD阴性细胞数量。实验组CD8⁺NKT细胞杀伤率计算公式是：

图13所示的结果表明，NKT_GFP细胞能够高效杀伤GFP-DC，但对OVA-DC杀伤效率较低。该数据反映了CD8⁺NKT样细胞对树突状细胞抗原特异性的直接杀伤效应。

实施例14：小鼠CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD8 T细胞上各种Granzyme、Perforin和Lamp-1表达水平比较。

(1)按照实施例3描述的方法分离并活化OT-I特异性TCR转基因小鼠CD8⁺NKT样细胞、NK细胞和CD8 T细胞。

(2)收集各细胞1×10⁷，离心后弃去上清，加入1ml Trizol重悬，吹打均匀。

(3)样本送至基因公司，利用Affymetrix基因表达芯片进行表达谱分析。

(4)应用R语言提取各种细胞颗粒释放途径相关基因的表达谱，作出热图以便于比较。

图14所示的结果表明，CD8⁺NKT样细胞颗粒释放相关分子的表达高于NK细胞和CD8T细胞，以此提示CD8⁺NKT样细胞比NK细胞和CD8 T细胞更加高效的杀伤效应。

除非明确地不包括或者其它限制，将本文所引用的每篇文献(包括任何交叉引用的或相关的专利或专利申请)在此以引用方式全文并入本文。对任何文献的引用不是认可：其作为本文所公开的或要求保护的任何发明的现有技术，或者其单独或与任何其它参考文献组合，或者参考、提出、建议或者公开任何此类的发明。此外，当本文中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中同一术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本文中赋予该术语的含义或定义。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可以做出多种其他改变和变型。因此，在随附的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。

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Claims (7)

1.NKT样细胞亚群在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的用途，其中所述NKT样细胞亚群是表达CD8分子的NKT样细胞，所述免疫性疾病是I型糖尿病，所述I型糖尿病由树突状细胞活化引发的免疫过激反应引起，其中所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD56，但不表达Vα24 TCR或所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上表达CD3和CD161c，但不表达Vα14 TCR。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述表面表达CD8分子的NKT样细胞的细胞表面上还表达TCRαβ。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述NKT样细胞亚群分离自哺乳动物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述哺乳动物选自牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述哺乳动物选自牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物和人。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述哺乳动物是宠物动物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述宠物动物选自宠物狗、宠物猫、啮齿动物宠物、宠物兔。

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