KR101950008B1 - 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법 - Google Patents

당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101950008B1
KR101950008B1 KR1020180054515A KR20180054515A KR101950008B1 KR 101950008 B1 KR101950008 B1 KR 101950008B1 KR 1020180054515 A KR1020180054515 A KR 1020180054515A KR 20180054515 A KR20180054515 A KR 20180054515A KR 101950008 B1 KR101950008 B1 KR 101950008B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
insulin
cell
composition
present
Prior art date
Application number
KR1020180054515A
Other languages
English (en)
Inventor
황인후
Original Assignee
황인후
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 황인후 filed Critical 황인후
Priority to KR1020180054515A priority Critical patent/KR101950008B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101950008B1 publication Critical patent/KR101950008B1/ko
Priority to PCT/KR2019/005437 priority patent/WO2019216623A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GM-CSF를 포함하는 배지에 인슐린분비 췌장 β 세포 타원체 배양물을 첨가하고, 미성숙 수지상 세포를 배양하여 면역관용 세포로 분화 유도하는 것을 특징으로 하는 면역관용 세포의 제조 방법, 상기 방법에 따라 제조한 세포 백신 및 이의 제조 방법, 및 상기 세포를 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역관용 세포의 접종시 당뇨병 및 비만에 대한 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있다. 이와 더불어 골수유래 인슐린 분비 세포와 병합 사용시, IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 추가적으로 증가시켜, 당뇨병 및 비만의 예방 또는 치료용으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법{Method of preparing tolerogenic cells and insulin producing cells based diabetes and obesity vaccine}
본 발명은 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GM-CSF를 포함하는 배지에 인슐린분비 췌장 β 세포 타원체 배양물을 첨가하고, 미성숙 수지상 세포를 배양하여 면역관용 세포로 분화 유도하는 것을 특징으로 하는 면역관용 세포의 제조 방법, 상기 방법에 따라 제조한 세포 백신 및 이의 제조 방법, 및 상기 세포를 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
수지상 세포(Dendritic Cell, DC)는 포유류 면역계의 항원 제시 세포이며 막성 혹은 가시와 같은 나뭇가지 모양의 돌기를 가지고 있다. 수지상 세포의 주요 기능은 항원 물질을 처리하여 면역계의 T 세포에 세포 표면에 제시하는 것이다. 따라서 수지상세포는 비감작 T 림프구를 활성화시키는 주요한 항원표지세포로, 타고난 면역 체계와 적응 면역 체계 사이의 메신저 역할을 한다. 말초 조직에 위치하며, 밀집된 네트워크를 형성하고, Toll-like receptors(TLR)와 같은 병원체 인식 수용체의 발현 및 병원체에 반응하는 특성을 통해 면역 체계의 감시 역할을 한다. 말초 조직에서 수지상 세포는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 및 보조 자극 분자 (CD80, CD86)의 낮은 수준과 높은 식균작용(endocytic) 속도로 특징지어지는 미성숙한 표현형을 가지고 있다.
예방 백신은 질병을 예방하는 가장 효과적인 방법 중 하나로, 예방 백신은 감염의 확산을 막기 위해 고안되었으며, 이들의 활동은 특정 항체 및 기억 B 세포(memory B cell)의 유도와 관련이 있다. 반면에 치료 백신은 주어진 질병의 원인을 제거하기 위해 고안되었다. 치료 백신의 활동은 주로 암 또는 감염된 세포를 거부하는 세포 독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)를 생성하도록 감작된 항원 특이 CD8+ T 세포에 대해 의존적이다.
당뇨병은 인슐린의 체내에서의 양적 부족 혹은 작용 부족에 기인하여 혈당이 정상인에 비해 상승해, 그 결과로 신장, 망막, 신경 등에서의 미소혈관 장해나, 동맥 경화 등의 대혈관 장해에 의해 현저하게 건강한 생활이 손상되는 대사성 질환이다. 지금까지 인슐린, 인슐린 분비 촉진제, 인슐린 저항성 개선제, α-글루코시다제 저해제 등의 혈당 강하제가 임상 치료법으로서 넓게 적용되고 있다. 그러나 이들의 혈당 강하제는 유용성이 인정되고 있지만, 각각이 많은 문제점을 안고 있다. 예를 들어, 인슐린은 부적절한 용법, 또는 용량으로 투여했을 경우, 저혈당을 초래하는 위험성이 있다. 또, 췌장의 인슐린 분비 용량이 현저하게 저하한 당뇨병 환자에서는 인슐린 분비 촉진제 및 인슐린 저항성 개선제의 유효성이 감소하거나, 인슐린 저항성이 현저한 당뇨병 환자에서는 인슐린이나 인슐린 분비 촉진제의 유효성이 감소한다.
이에 당뇨병 치료 또는 예방과 관련하여 비-비만성 당뇨병(NOD) 마우스 모델을 이용하여 당뇨병을 예방할 수 있는 다양한 치료법이 연구되고 있다(Immunity. 2005 Aug;23(2):115-26). 그러나, 다양한 치료법 중 몇 가지 치료법만이 당뇨병 발달을 억제하거나, 고혈당을 역전시킬 수 있다고 알려져 있을 뿐, 비만 관련 인슐린 저항성 당뇨병을 억제하고 고혈당을 역전시키는 치료법은 거의 알려져 있지 않다.
한편, 당뇨병 예방 또는 치료용 제제의 임상연구에 있어서, 현재 연구 개발된 제1형 당뇨병의 세포 백신은 기대에 크게 미치지 못한 성과를 보이고 있으며, 제2형 당뇨병 및 비만 관련 세포 백신은 개발된 사례가 아직 없다.
이에 본 발명자들은 수지상 세포를 이용한 백신 조성물 개발을 위하여 연구한 결과, 3D 타원체 배양을 통해 인슐린 분비능력을 증가시킨 인슐린분비 췌장 β 세포 배양물 또는 이로부터 추출한 엑소좀을 미성숙 수지상 세포에 처리하여 성숙한 면역관용 수지상 세포로 유도하는 효과가 있음을 확인하였고, 이 세포가 제1형, 제2형 당뇨병 및 비만 등의 대사성 질환에 대한 백신 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
췌장 β 세포 엑소좀을 첨가한, GM-CSF를 포함하는 배지에서 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙한 면역관용 수지상 세포로 분화하는 것을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법:
상기 미성숙 수지상 세포는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 배지에서 세포 배양을 통해 수득하며,
상기 췌장 β 세포 엑소좀은,
a) TSPAN2(tetraspanin-2) 유전자가 제거된 췌장 β 세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양하는 단계;
b) 상기 배양물에서 엑소좀을 분리하거나 상기 엑소좀이 포함된 배양배지를 분리하여 수득하는 단계;를 포함하는 방법에 의해서 제조된 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 제조한 면역관용 수지상 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 면역관용 수지상 세포를 포함하는 제1형, 제2형 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 면역관용 수지상 세포에 하기 특성을 가지는 인슐린 분비 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다:
a) 인슐린 분비 세포(insulin producing cells, IPCs)일 것;
b) 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거(knock-out)됨.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
췌장 β 세포 엑소좀을 첨가한, GM-CSF를 포함하는 배지에서 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙한 면역관용 수지상 세포로 분화하는 것을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법:
상기 미성숙 수지상 세포는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 배지에서 줄기세포 배양을 통해 수득하며,
상기 췌장 β 세포 엑소좀은,
a) TSPAN2(tetraspanin-2) 유전자가 제거된 췌장 β 세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양하는 단계;
b) 상기 배양물에서 엑소좀을 분리하거나 상기 엑소좀이 포함된 배양배지를 분리하여 수득하는 단계;를 포함하는 방법에 의해서 제조된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 면역관용 수지상 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기의 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포 백신을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 본 발명의 면역관용 수지상 세포를 포함하는 제1형, 제2형 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 본 발명의 면역관용 수지상 세포에 하기 특성을 가지는 중간엽 줄기세포로부터 분화된 인슐린 분비 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다:
a) 인슐린 분비 세포(insulin producing cells, IPCs)일 것;
b) 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거(knock-out)됨.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 췌장 β 세포 엑소좀을 첨가한, GM-CSF를 포함하는 배지에서 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙한 면역관용 수지상 세포로 분화하는 것을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법:
상기 미성숙 수지상 세포는 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 배지에서 줄기세포 배양을 통해 수득하며,
상기 췌장 β 세포 엑소좀은,
a) TSPAN2(tetraspanin-2) 유전자가 제거된 췌장 β 세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양하는 단계;
b) 상기 배양물에서 엑소좀을 분리하거나 상기 엑소좀이 포함된 배양배지를 분리하여 수득하는 단계;를 포함하는 방법에 의해서 제조된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 면역관용 수지상 세포의 제조 방법은 TSPAN2 유전자가 제거된 췌장 β세포를 3차원 회전 타원체 배양하여 인슐린 분비의 증가를 확인하고, 이러한 췌장 β 세포의 배양물 또는 이로부터 유래한 엑소좀을 미성숙 수지상 세포에 처리하여, 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도한 후, 다시 면역관용 수지상 세포로 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포를 의미하며, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)를 포함한다. 줄기세포는 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 특성으로 인해, 손상된 조직을 재생하는 등의 치료에 응용하기 위한 연구가 진행되고 있다. 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 또는 태반에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 골수 유래 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 면역관용이란 면역학적 관용이라고도 하며, 특정 항원에 대하여 면역 반응을 나타내지 않는 상태를 의미한다. 본 발명에서 면역관용 수지상 세포는 자가 항원에 대한 관용을 유도하고 T 세포의 증식을 억제하는 수지상 세포를 의미하며, 본 발명의 목적상, 본 발명의 면역관용 수지상 세포는 당뇨병을 일으키는 항원에 대하여 면역관용을 유도하는 수지상 세포를 의미한다. 본 발명의 면역관용 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포를 분화 유도시켜서 얻을 수 있다.
본 발명의 미성숙 수지상 세포(Dendritic Cell, DC)는 전구 세포를 함유하는 적합한 조직 공급원으로부터 DC 전구 세포를 분리하거나 또는 미성숙 DC를 제조하는 방법에 의해 취득할 수 있다. 미성숙 DC를 제조하는 방법이란, 전구세포를 시험관내에서 분화시켜 미성숙 DC를 생산하는 방법을 말하며, 상기 전구세포는 적합한 조직공급원으로부터 유래한 혈액 단핵구 세포(mononuclear cell) 또는 조혈모세포일 수 있으며, 상기 적합한 조직 공급원이란 골수, 말초 혈액 및 제대혈 등일 수 있으며, 보다 바람직하게는 골수 세포로부터 유래된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 세포의 수를 급격히 증가시켜 수지상 세포의 분화를 유도하는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 성숙 수지상 세포를 제조하기 위하여, 미성숙 수지상 세포 및 췌장 β 세포 배양물로부터 얻은 엑소좀을 30μL로 혼합하여 배양하는 것으로 성숙 수지상 세포를 얻은 후 면역관용이 유도된 수지상 세포를 제조하였다.
보다 구체적으로는 (1) 마우스의 경골과 대퇴골에서 골수 유래 줄기세포를 분리하여, IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙 수지상 세포를 수득하였으며, (2) 하기 a) 내지 c) 단계의 방법으로 췌장 β 세포 배양물을 제조하였다.
a) 췌장 β세포주인 RNAKT-15 세포주에서 TSPAN2(tetraspanin-2) 유전자를 제거하는 단계;
b) 상기 TSPAN2 유전자가 제거된 췌장 β 세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양을 형성하는 단계;
c) 상기 TSPAN2 유전자가 제거된 췌장 β 세포 및 배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양물을 수득하는 단계;
그 다음, (3) 상기 2)단계의 췌장 β 세포 배양물에 1) 단계의 미성숙 수지상 세포를 혼합하여, 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시켰다.
본 발명의 ‘TSPAN-2(tetraspanin-2) 유전자’는 transmembrane 4 superfamily 또는 tetraspanin family에 속하는 단백질인 테트라스파닌-2 단백질을 암호화하는 유전자이다. 테트라스파닌-2 단백질은 특징적인 4개의 소수성 도메인을 갖는 막단백질이며, NET3, TSN2, TSPAN2, TSPAN-2 등으로도 알려져 있으며, 3개의 주요한 동형(isoform)이 알려져 있다. 이는 세포 발달, 활성화, 성장 및 운동성에 중요한 역할을 담당하며, NET3, TSN2, TSPAN2, TSPAN-2 등으로도 알려져 있고, 3개의 주요한 동형(isoform)이 알려져 있다. 또한 테트라스파닌-2가 인간의 췌장 β세포에서 JNK/β-catenin 신호체계를 조절하고 세포사멸을 촉진하는 역할을 한다는 것이 알려져 있다.
본 발명의 상기 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거된 췌장 β 세포는 IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 추가적으로 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 증가시키는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장 β 세포는 인슐린 분비 능력이 증가함을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 췌장 β 세포를 3D 타원체시 ‘E-카데린(E-cadherin)’의 발현이 증가한다. E-카데린은 초기 배아의 상피화, 세포 재배치, 조직형태형성, 세포극성의 확립 및 조직구조의 유지에 필수적인 기능을 하는 단백질로, 본 발명에서는 엑소좀 분리 상태를 위한 주요한 마커로 활용할 수 있다. 회전 타원체에서 E-cadherin은 접촉 의존적으로 인슐린 단백질 분비를 증가시킨다.
본 발명에서 상기 b) 단계의 배양물은 면역원성 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 ‘엑소좀(exosome)’은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포를 제공한다. 또한 본 발명에 따른 성숙 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포 백신을 제공한다.
본 발명의 성숙 수지상 세포 백신의 제조 방법은, 상기의 방법에 따라 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시킨 다음((1)~(3) 단계), (4) 분화되지 않은 미성숙 수지상 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기의 방법으로 제조한 면역관용 수지상 세포 백신은 바람직하게, 당뇨병 또는 비만의 예방용 백신일 수 있으며, 또는 당뇨병 또는 비만의 치료용 백신일 수 있다. 본 발명에서 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병일 수 있다.
본 발명에서 상기 ‘백신’은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 백신 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 항원 물질을 생체 내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조 성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 백신 조성물을 보호할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 멸균수 또는 식염수(바람직하게는 완충된 식염수)와 같은 현탁 액체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기에 충분한 양의 임의의 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 적합한 애쥬번트는 문헌 Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875에 기술되어 있으며, 예컨대, 알루미늄염(알루미늄 포스페이트(Aluminium phosphate) 또는 알루미늄 히드록시드(Aluminium hydroxide), 스쿠알렌(Squalene) 혼합물(SAF-1), 무라밀(muramyl) 펩티드, 사포닌(Saponin) 유도체, 마이코박테리아(mycobacterium) 세포벽 제조물, 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A, 미콜산(mycolic acid) 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit), 폴리포스파젠(polyphosphazene) 및 유도체, 및 면역자극 복합체(immun-stimulating complexes, ISCOMs)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 모든 백신 조성물과 마찬가지로, 면역원의 면역학적 유효량은 경험적으로 결정되어야 하며, 이 경우 고려될 수 있는 인자는 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 회수를 들 수 있다. 또한 환자의 비만 및 혈당에 의한 합병증의 진행과 불안정한 상태, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 중의 항원물질인 타원체 배양한 췌장 β 세포 배양물은 본 발명의 조성물 내에서 다양한 농도로 존재할 수 있으나, 통상적으로, 상기 항원물질이 생체 내에서 적절한 수준의 항체 형성을 유도하기에 필요한 농도로 포함한다.
본 발명에서 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 수지상 세포 백신의 투여경로는 이들이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써, 췌장암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 백신 조성물의 투여는 근내, 복막내, 피내 또는 피하, 소장의 장간막, 췌장의 β 세포, 간내, 신장의 피막하 경로를 통한 주사, 경구/식사, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 수지상세포에 근거한 백신의 효능을 높이기 위하여 수지상세포를 주입시에 IL-12와 같은 T 세포의 활성화를 도와주는 사이토카인을 병용 투여하거나, 이러한 사이토카인 유전자를 트랜스펙션 시킨 수지상세포를 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 의해 제조되는 백신의 유효성분인 수지상세포를 포함하는 세포는, 인간 체내에 치료용 백신으로서 접종하기 때문에, 안전성을 높이기 위해 세포 증식성을 없애 두는 것도 가능하다. 예를 들면, 선택적으로 세포 백신으로서 보다 안전하게 이용하기 위해, 가열처리, 방사선처리, 또는 마이토마이신 C(mitomycin C, MMC) 처리 등으로 처리하고, 백신으로서의 기능을 남긴 채, 증식성을 없앨 수 있다. 예를 들면, 수지상세포에 25~50㎍/㎖의 마이토마이신 C를 첨가하여, 37℃, 30분 내지 60분간 보온처리할 수 있다. 열에 의한 세포처리방법은, 예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서 20분간 가열처리를 행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 성숙 수지상 세포를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 신장 피막내, 경피, 피하, 복막내, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 세포 치료제로 제형화할 수 있다.
상기 ‘세포 치료제’란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.
세포 치료제의 경우에는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 세포 치료제는 비경구로 투여하며, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있고, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 투여 시간 및 투여 경로와 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있으나, 바람직하게는 1회당 1X105~10X109 세포이다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기의 조성물에 하기 특성을 가지는 인슐린 분비 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다:
a) 인슐린 분비 세포(insulin producing cells, IPCs)일 것;
b) 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거(knock-out)됨.
본 발명의 상기 인슐린 분비 세포는 중간엽 줄기세포로부터 분화가 유도된 것일 수 있으며, 이와 같은 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거된 인슐린 분비 세포를 추가적으로 투여 또는 이식하는 경우 IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 추가적으로 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 추가적으로 증가시키는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 3D 타원체 배양이 췌장 유래 세포의 인슐린 분비능력에 미치는 영향을 확인한 결과, 대조군(2D 평면 배양)의 경우에 비해서 3D 타원체 배양한 경우가 인슐린 분비량이 2배 이상으로 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
본 발명의 일실시예에서 본 발명의 수지상 세포 백신이 제1형 당뇨병 모델이 되는 당뇨병성 비-비만(NOD)마우스에서의 당뇨 발병에 미치는 영향을 확인한 결과, 대조군(No injection)의 경우 16주령을 시작으로 하여 전체 군 중 당뇨병 발병비율이 점차 증가하는 반면, 수지상 세포 백신 (DC-Vac)을 투여한 군에서는 당뇨병이 발병하지 않았고(도 4), 인슐린 투여를 중단한 후에도 DC-Vac만을 투여하는 경우 정상 혈당이 유지됨을 알 수 있었다(도 5).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 비-비만(NOD) 마우스에 본 발명에 따른 수지상 세포 백신 (DC-Vac) 및 이의 병용 (DC-Vac + TK-IPCs)을 투여한 후, 마우스의 지방 조직을 관찰한 결과, 백신을 투여한 경우에 지방 세포의 크기가 더 작은 것을 확인하였다(도 6). 또한, 마우스의 체지방량 및 혈청 내 아디포넥틴의 함량을 측정한 결과, 백신을 투여한 경우에, 체지방량이 적고, 아디포넥틴 함량이 높으며, 혈당 농도 및 인슐린 농도 모두 대조군에 비해 DC-Vac 투여군에서 감소하고, DC-Vac + TK-IPCs 투여군에서 더욱더 혈중 함량이 더 낮아지는 것으로 나타났다(도 7).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 고지방식이로 비만을 유도한 마우스와 정상식이 마우스에 본 발명에 따른 수지상 세포 백신을 투여한 후, 인슐린 감수성 및 내당능을 측정한 결과, 백신을 투여한 경우에 대조군에 비해서 효과를 보였으며, TK-IPCs를 병용하여 투여한 경우에는 더욱 더 효과가 좋아 정상 마우스와 유사하게 조절되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
본 발명의 또 다른 일실시예에서, 고지방식이로 비만을 유도한 마우스와 정상식이 마우스에 본 발명에 따른 수지상 세포 백신 또는 이의 병용 제제를 투여한 후, 공복 상태의 마우스의 체중, 혈당, 혈장 인슐린 농도를 측정한 결과, 대조군에 비해 수지상 세포 백신 투여군에서 감소하고, TK-IPCs를 병용하여 투여한 경우 더욱 더 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(도 9)
본 발명의 또 다른 일실시예에서, IRS-1의 Ser307에서의 또는 티로신에서의 인산화를 관찰한 결과, Ser307에서의 IRS-1의 인산화는 수지상 세포 백신을 처리한 경우에 감소하고, TK-IPCs와 병용하여 처리한 경우는 더욱 더 감소하였으며, DC-Vac과 TK-IPCs의 처리가 티로신 인산화를 증가시킴을 알 수 있었다(도 10).
따라서, 본 발명은 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료에 적합한 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 본 발명의 면역관용 수지상 세포의 접종시 당뇨병 및 비만에 대한 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있다. 이와 더불어 골수유래 인슐린 분비 세포와 병합 사용시, IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 추가적으로 증가시켜, 당뇨병 및 비만의 예방 또는 치료용으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 췌장 β 세포를 3D 타원체 배양시 인슐린 분비 능력이 증가되는 것을 나타낸 것이다.
도 2a는 수지상세포가 성숙후 면역관용 수지상 세포로 유도되어 면역관용 수지상 세포(tDC)는 낮은 수준의 MHC II 발현을 보이는 것을 나타낸 것이다.
도 2b는 웨스턴 브롯팅에 의해서 tDC가 3-dioxygenase (IDO) 면역 억제 분자를 발현함을 나타낸 것이다.
도 2c는 tDC가 낮은 IL-10, IL-12 및 TNF-α 분비를 보이는 데에 비해서 성숙 수지상 세포(mDC)는 높은 분비를 보이는 것을 나타낸 것이다.
도 3은 고농도 포도당(10mM) 농도로 자극할 때 IPCs 및 TK+IPCs는 인슐린의 생산이 증가함을 나타낸다. MSC를 대조군으로 사용하였다.
도 4는 신규로 당뇨가 발병하는 마우스 모델에서 수지상 세포 백신(DC-Vac)을 처리한 경우 마우스의 당뇨의 발생이 예방되는 것을 나타낸 것이다.
도 5는 수지상 세포 백신(DC-Vac)만 처리한 경우(도 5a), 수지상 세포 백신 및 엑센딘-4(DC-Vac + exendin)을 처리한 경우(도 5b), 수지상 세포 백신 및 골수 유래 인슐린 분비세포(DC-Vac + TK-IPCs)를 처리한 경우(도 5c)의 혈당 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 수지상 세포 백신(DC-Vac)만 처리한 경우(중간 패널), 수지상 세포 백신 및 골수유래 인슐린 분비세포(DC-Vac + TK-IPCs)를 처리한 경우(하부 패널), 아무것도 처리하지 않은 경우(상부 패널)의 간의 지방 축적의 변화를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 수지상 세포 백신(DC-Vac), 수지상 세포 백신 및 골수유래 인슐린 분비세포(DC-Vac + TK-IPCs)를 처리한 경우, 마우스의 체지방량(도 7a), 마우스의 혈중 아디포넥틴(adiponectin) 농도(도 7b), 혈당 농도 (도 7c) 및 혈장의 인슐린 농도(도 7d)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 제2형 당뇨병의 비만 마우스 모델(ob/ob mouse)에서 수지상 세포 백신(DC-Vac), 수지상 세포 백신 및 골수유래 인슐린 분비세포(DC-Vac + TK-IPCs)를 처리한 경우, 비만 마우스의 혈중 포도당 농도(도 8a) 및 인슐린 감수성 검사 결과(도 8b)를 나타낸 것이다.
도 9는 비만 마우스에 수지상 세포 백신(DC-Vac), 수지상 세포 백신 및 골수유래 인슐린 분비세포(DC-Vac + TK-IPCs)를 처리하고 6주 및 10주 후에 체중(도 9a), 혈중 포도당 농도(도 9b) 및 혈중 인슐린 농도(도 9c)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 비만 마우스에 수지상 세포 백신(DC-Vac), 수지상 세포 백신 및 골수유래 인슐린 분비세포(DC-Vac + TK-IPCs)를 처리한 마우스에서 추출한 간세포에서 Ser307에서 IRS-1(insulin receptor substrate-1)의 인산화(인슐린 저항성의 증가) (도 10a) 및 IRS-1의 티로신 인산화(인슐린 저항성의 감소)(도 10b)를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
TSPAN2-넉아웃 (TSPAN2-KO) RNAKT-15 세포주 생성
인간 췌장 β 세포주인 RNAKT-15(가천 의과 대학 당뇨병 연구소) 세포에서 유전자 가위(Crispr/Cas9)를 이용하여 TSPAN2 유전자를 영구제거하여 TSPAN2-KO RNAKT-15 세포주를 생성하였다.
Crispr/Cas9 sequence: GGGGACTGGGGATCCCGCCGCCGGGCCGCAGC
세포 배양 및 인간 췌장 β 세포 배양물 제조
상기에서 제조한 TSPAN2-KO RNAKT-15 세포주를 10% 우태아혈청(Thermo, Rockville, MD, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10 mM 니코틴 아미드, 10μM 트로글리타존 및 16.7μM 황산아연이 첨가된 저포도당(5 mM) DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2조건으로 배양하였다. 그 다음 세포를 15 mL 튜브에 수확하고 13,000 rpm으로 3 분간 원심 분리하였고, 상등액을 제거하여, 새로운 배양 배지에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 1×104 cells/ml의 농도로 초 저부착 표면 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Ultra-Low Attachment Surface 96-well)에 넣고 배양하였다. 그 다음 1,800 rpm에서 3분간 원심 분리하여 3차원(3D) 회전 타원체(spheroid)를 형성하고, β-세포 타원체 배양을 통해 인슐린 분비능력을 증가시켜 췌장세포 배양물을 제조하였다.
유세포 분석
CD44, CD90, CD31, CD45 분자에 대한 FITC-표지된 단클론 항체, MHC-II에 대한 PE- 접합 단클론 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대한 정제된 단클론 항체를 사용하였다. 샘플을 FACSCalibur (BD Biosciences)상에서 분석하였다.
인슐린 분비 분석
2D 평면과 3D 타원체로 배양된 RNAKT-15 세포에서 완충액 배양배지를 교체하여 인슐린분비를 측정하였다. 37℃에서 1시간 평형 후 세포를 1시간 동안 10mM 포도당 농도를 함유한 완충액과 함께 배양했다. 1시간 후, 상등액을 모으고 휴먼 인슐린 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 인슐린 함량을 측정하였다.
엑소좀 추출
상기와 같이 제조한 3D 회전 타원체 배양시킨 RNAKT-15 세포 배양물로부터 엑소좀을 추출하였다. 먼저 세포 및 배양액을 튜브에 모은 후, 300xg의 속도로 10분간 원심분리하였다. 이를 통해 수득한 상등액을 50ml 원심분리 튜브에 옮기고 2000xg의 속도로 4℃에서 20 분간 원심분리하였다.
분리된 상등액을 수득하여 초원심분리 로터에 적합한 폴리 알로머 튜브 또는 폴리 카보네이트 병으로 옮긴 후, 10,000xg의 속도로 4℃에서 30 분간 원심분리하고, 펠렛을 수득하였다 (이때, 스윙-버킷 로터의 경우, 펠렛은 튜브의 바닥에 있다. 고정 각도 로터의 경우 펠렛은 튜브의 바닥 근처에서 위를 향한 튜브 측면에 있다.).
그런 후, 100,000xg의 속도로, 4℃에서 최소 70 분간 원심 분리한 후, 상등액을 완전히 제거하였다.
그런 후 1 mL 인산염완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)의 각 튜브에 펠렛을 재부유시켰다. 모든 튜브로부터 재부유된 펠렛을 모은 후 이에 PBS를 넣어 튜브를 완전히 채우고 100,000xg, 4℃에서 70분간 원심 분리하였다. 그 후 모든 상등액을 제거하였다. 상등액을 제거하여 수득한 펠렛(엑소좀)을 재부유하거나, 농축하여 사용하였다.
재부유하는 경우, 50 내지 100μl의 PBS 또는 TBS를 첨가하여 재부유시켰다.
엑소좀을 농축하는 경우, TLA-100.3 로터와 상응하는 두꺼운 벽의 폴리카보네이트 튜브를 사용하여 탁상형 초원심 분리기에서 상기에서 수득한 상등액을 100,000 xg의 속도로, 4℃에서 1시간 동안 원심 분리하였다. 눈에 보이는 펠렛 위의 PBS 대부분을 제거하고 20 내지 50μl의 신선한 PBS에 엑소좀을 재부유시켰다.
수지상 세포의 배양
암컷 NOD 마우스(5주령, ㈜샘타코바이오코리아)의 경골과 대퇴골에서 수득한 골수 유래 세포를 수득하였다. 그 다음 골수 유래 세포에서 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells(DC)를 분리하여, RPMI1640 배지에 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신, rmIL-4 및 rmGM-CSF 를 첨가하여 배양하였다. 그 다음 배양 6-9일째에 엑소좀(30ul)을 넣고 24시간 동안 배양하였다. 또한, LPS(lipopolysaccharide)(투여량), 항원 마이오신 (Myosin, From Porcine heart; Sigma)을 투여하여 배양하였다. 그 후, 성숙 수지상 세포를 수득하였으며, 면역관용 수지상 세포는 10일째에 metformin 과 vitamin D를 처리하여 수득하였다.
골수 중간엽줄기세포 인슐린 분비 세포 유도
골수로부터 중간엽줄기세포(bone marrow derived mesenchyma stem cells; BD-MSC)를 분리하기 위해 암컷 비당뇨병성 C57BL/6 mouse의 bone marrow에서 얻어낸 골수세포를 alpha-MEM(15% fbs) media에서 8~12일간 배양을 한다. 3일마다 media 교체를 하고 이후 5% FBS high DMEM 15일 배양을 진행하여 MSC를 분리하였다. 다음 단계에서 BD-MSC를 5% FBS, 20μmol/L 니코틴 아미드를 함유한 Low DMEM 배지에서 7일간 배양하고 마지막 3단계에서 10 μmol/L의 Exclusive-4를 첨가한 Low DMEM 배지에서 7일간 더 배양하여 인슐린 분비 β 세포(insulin producing cells; IPCs)를 유도하였다. 세포에서 유전자 가위(Crispr/Cas9)를 이용하여 TSPAN2 유전자를 영구제거하여 TSPAN2-KO IPCs(TK-IPCs) 세포주를 생성하였다. 3x106개의 TK-IPCs를 췌장에 이식하였다.
마우스 모델에 수지상 세포 백신 투여방법
13주령 암컷 비당뇨병성 C57Bl/6J 마우스와 당뇨병 마우스를 이용하여 실험을 실시하였다. 당뇨병성 마우스는 주당 1회 뇨당을 측정하였고, 3회 연속 양성 수치인 경우를 당뇨병으로 정의하였으며, 혈당 수치가 >250mg/dl 인 것을 확인하였다. 당뇨병성 마우스를 두 그룹으로 나누어 한 그룹에 13mg의 인슐린이 포함되어 있으며, 지속적으로 0.1단위/임플란트 (LinShin Canada, Inc.) 이하로 방출되는 인슐린 펠릿을 피하에 이식한 후, 40일 동안 혈당 수치는 <250mg/dl로 유지시켰다. 그 다음 인슐린 펠릿을 제거하였다. 그 다음, 비당뇨병성 마우스와 당뇨병성 마우스 각각에 상기 실험방법에서 제조한 TSPAN2 넉아웃 β 세포 타원체의 용액으로부터 추출된 엑소좀 펄스화된 수지상 세포(DC-Vac)를 1.5×106/ml의 농도로, 0일 및 14 일에 피하주사 하였다. 그 다음, 0일, 1일, 2일, 7일, 8일 및 9일째에 50ng의 엑센딘-4 (Bachem)를 복강내(i.p.)로 주입하였다. 당뇨병의 후속 발달은 혈당 수치를 주당 2 ~3회 측정하여 관찰하였다. 이는 최소 2개월 내지 4개월 동안 추적하여 모니터링하였다. 비만 및 제2형 당뇨병 모델도 상기와 같이 실험하였으며, 수지상 세포 백신(DC-Vac)을 1.5×106개/ml의 농도로 0일 및 14일에 피하 주사하였다.
비만 마우스 모델의 신진 대사 측정
상이한 유전형(C57BL/6)을 가진 수컷 마우스(5주령, ㈜샘타코바이오코리아)를 배리어-프리 시설에 넣고 12주 동안 추적관찰하였다. 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이 군(high fat diet, HFD)으로 군당 6마리씩 나누어 사육하였다. 자유롭게 정상(ND)군의 사료는 엔비고사(Envigo, Alconbury Huntingdon, UK)의 2018S 사료를, 고지방식이(HFD)군의 사료는 60%의 지방을 함유하는 Research Diets사(New Brunswick, NJ, USA)의 D12492 사료를 사용하였다. ELISA법을 이용 혈청 아디포넥틴의 측정을 위해 폴리클로날 토끼 항마우스 ACRP30/아디포넥틴 항체는 invitrogen으로부터 구매하였다.
웨스턴블랏
상기에서 제조한 RNAKT-15 세포 배양물을 용해한 후, 이를 로딩 완충액과 혼합하고 SDS-PAGE로 분리하였다. 이어서 단백질을 니트로 셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 막 상에 비특이적 결합 부위는 실온에서 90분 동안 5% 비지방 분유(skim milk)를 사용하여 차단하였다. 막을 섭씨 4℃에서 1차 항체인 anti-insulin-receptor-b(Santa Cruz 구매), anti-phosphotyrosine(Santa Cruz 구매), anti-IRS-1(Upstate Biotechnology 구매 및 anti-IRS-1-pSer307(Upstate Biotechnology 구매)와 함께 항온 배양한 후, 실온에서 1시간 동안 2차 항체를 처리하였다. 막밴드에 있는 단백질 밴드는 Santa Cruz Biotechnology Inc. 의 ECL Plus Blotting Detection System을 사용하여 시각화하였다.
< 실시예 1>
제1형 당뇨병에 수지상 세포 백신이 미치는 영향
<1-1> 3D 타원체 배양이 RNAKT -15 세포의 인슐린 분비능력에 미치는 영향
TSPAN2이 넉아웃 (TSPAN2-KO)된 RNAKT-15 세포주에 대해서 상기에 기재된 방법에 따라서 3차원 타원체 배양을 통해서 인슐린 분비능력이 증가 되도록 하였다. 그 후 대조군으로써 3차원 배양을 제외한 다른 조건은 동일하게 한 세포주를 대상으로 하여 각각 인슐린 분비량을 측정하여 비교하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 대조군(2D 평면 배양)의 경우에 비해서 3D 타원체 배양한 경우가 인슐린 분비량이 2배 이상으로 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
<1-2> 면역관용 수지상 세포의 특성 분석
본 발명의 방법에 따라서 제조한 면역관용 수지상 세포의 발현 및 분자적 수준에서의 조절 특성을 분석하고자 MHC II, IDO 또는 주요 싸이토카인의 발현/분비를 각각 유세포 분석이나 웨스턴 블롯 등으로 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 보듯이, 수지상세포가 성숙후 면역관용 수지상 세포(tDC)로 유도되어, 낮은 수준의 MHC II 발현을 나타내고 (도 2a), tDC가 3-dioxygenase (IDO) 면역 억제 분자를 발현함으로써 수지상세포가 성숙한 이후 면역관용 수지상 세포로 유도되어 면역 억제 효과가 있음을 나타내었다 (도 2b). 또한, 면역관용 수지상 세포(tDC)는 IL-10, IL-12 및 TNF-α가 낮은 수준으로 분비되는데 비해서 성숙 수지상 세포(mDC)는 IL-10, IL-12 및 TNF-α가 높은 수준으로 분비되는 것을 확인하여 IL-10, IL-12 및 TNF-α 등의 조절을 통해 면역관용 수지상세포(tDC)가 숙주 방어 및 면역 항상성에서 매우 중요한 면역 조절 역할을 함을 알 수 있었다(도 2c).
<1-3> 고농도 포도당 자극에 대한 인슐린 생성능의 비교
본 발명에서 골수 유래 중간엽줄기세포를 대조군으로 하여 인슐린 분비세포(IPCs), 테트라스파닌-2 유전자를 넉아웃 (knock-out)시킨 IPCs(TK-IPCS)에 각각 고농도의 포도당을 처리하는 경우에 인슐린 분비 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이, 고농도 포도당(10mM) 농도로 작극할 때 IPCs 및 TK+IPCs는 인슐린의 생산이 증가되는 것에 비해서 음성대조군인 중간엽 줄기세포(MSC)의 경우 인슐린 분비가 거의 측정되지 않았다. 이와 같은 결과는 MSC에서 IPCs로 분화되어 인슐린 분비가 증가되었음을 나타내고, 특히 TK+IPCs는 고농도의 혈당 상태에서도 높은 인슐린 분비능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2>
제1형 당뇨병에 수지상 세포 백신이 미치는 영향
<2-1> 마우스의 제1형 당뇨병 발병율에 미치는 영향
제1형 당뇨병 모델이 되는 당뇨병성 비-비만(NOD)마우스를 대상으로 하여 본 발명의 방법에 따라서 제조한 수지상 세포 백신(DC-Vac)를 투여한 암컷 마우스와 투여하지 않은 암컷 마우스의 당뇨병의 발병비율(percentage diabetic)을 매주 측정하였다.
당뇨병의 발병은 혈당을 250mg/dl 이상을 기준으로 하여 평가하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군(No injection)의 경우 16주령을 시작으로 하여 전체 군 중 당뇨병 발병비율이 점차 증가하는 반면, 수지상 세포 백신 (DC-Vac) 1.5 × 106 세포를 13주령의 암컷 비당뇨병성 마우스에 0일, 14일에 투여한 군의 경우는 당뇨병이 발병하지 않았다.
이와 같은 결과는 소량의 DC-Vac을 당뇨병이 생기기 전에 투여시 당뇨병의 발생을 억제할 수 있음을 보여준다.
<2-2> 혈당량에 미치는 영향
이와 같은 결과를 확인하기 위하여 상기와 같이 수지상 세포 백신(DC-Vac)을 투여 또는 미투여한 마우스에 대해서 혈당량에 미치는 영향을 확인하였다.
13주령 당뇨병 암컷 NOD 마우스(각 군에 대해서 4마리씩)에게 0일 및 14일, 1일 및 14일에 1.5x106 수지상 세포 백신(DC-Vac) 만을 투여한 경우(도 5A), DC-Vac + 엑센딘-4(exendin-4)을 투여한 경우(도 5B), DC-Vac + TSPAN2 knockout IPS(TK-IPCs)을 투여한 경우(도 5C)로 나누어 실험하였다. TK-IPCs의 경우 3x106 세포의 TK-IPCs를 췌장에 이식하였다. 마우스의 피하에 인슐린 펌프(micro-osmotic pump, 0.2 U/day)를 삽입한 후, 21일 째에 인슐린 펌프를 제거하였다. 그 후 매일 정맥혈로부터 혈당 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 보듯이 인슐린 투여를 중단한 후에도 DC-Vac만을 투여하는 경우 3/4이 정상 혈당이 유지되었고, DC-Vac + 엑센딘의 경우 모두 정상 혈당이 유지되었고, DC-Vac + TK-IPCs의 경우 모두 혈당이 정상 마우스에 근접하게 유지되었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 수지상 세포 백신에 대해서 다른 당뇨 치료제와 병용하는 경우에 더욱더 우수한 효과를 발휘할 수 있음을 나타낸다.
<실시예 3>
비만에 수지상 세포 백신이 미치는 영향
<3-1> 지방 조직에 미치는 영향
고지방식이로 비만이 유도된 13주령 수컷 마우스에 1.5x106/mL 수지상 세포 백신 (DC-Vac)만을 투여한 경우, DC-Vac + TK-IPCs를 투여하였다. 대조군의 경우 아무런 주입도 하지 않았다. 8주 후에 마우스를 희생시켜 지방 조직을 적출하였으며, 적출된 조직을 현미경을 이용하여 비만으로 인한 간조직의 지질 침착 정도를 확인하였다 (H&E 염색 (X400 배율))
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군 (No injection)에 비해 수지상 세포 백신을 투여한 군의 경우 세포의 지방 함유도가 더 작음을 알 수 있었으며, DC-Vac + TK-IPCs을 투여한 경우 더욱더 지방 함유도가 작게되어 정상에 가까운 것을 확인할 수 있었다.
<3-2> 체지방 및 아디포넥틴 함량에 미치는 영향
13주령 수컷 마우스(n=8)에 DC-Vac만을 투여한 경우, DC-Vac + TK-IPCs를 투여한 경우에서 투여 4주 후에 마우스의 체지방량, 혈중 에디포넥틴, 혈당, 혈장 인슐린 농도를 측정하였다.
각각의 마우스의 체지방을 결정하기 위해 Bruker minispec Body Composition Analyzer을 수행하였다. 그 결과 도 7a에 나타난 바와 같이, 체지방은 투여하지 않은 대조군(No injection)에 비해 DC-Vac 투여군에서 감소하고, DC-Vac + TK-IPCs 투여군에서 더욱더 감소하는 것으로 나타났다.
또한, 마우스에서 혈액을 채취한 다음 원심분리방법으로 혈청을 분리하여 ELISA 법으로 혈청 내의 아디포넥틴(adiponectin)의 함량을 측정하였다. 아디포넥틴은 에너지 대사, 염증 및 세포 증식과 같은 다양한 과정에서 보호 활성을 나타낸다, 따라서, 아디포넥틴은 비만 및 비만 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 중요한 역할을 한다. 그 결과, 도 7b에서 보듯이 대조군에 비해 DC-Vac 투여군에서 증가하고, DC-Vac + TK-IPCs 투여군에서 더욱더 혈중 아디포넥틴 함량이 더 높아지는 것으로 나타났다.
또한, 혈당 농도 (도 7c)과 혈장의 인슐린 농도(도 7d)는 각각 혈당 및 인슐린 농도를 측정하는 키트를 사용하여 측정하였으며, 혈당 농도 및 인슐린 농도 모두 대조군에 비해 DC-Vac 투여군에서 감소하고, DC-Vac + TK-IPCs 투여군에서 더욱더 혈중 함량이 더 낮아지는 것으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 수지상 세포 백신 DC-Vac 및 이의 병용 투여 (DC-Vac + TK-IPCs)이 우수한 비만 개선 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
제2형 당뇨병에 세포 백신이 미치는 영향
<4-1> 인슐린 감수성 및 내당능에 미치는 영향
5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육하였다. 사육 0일에 에 1.5 × 106 DC-Vac 백신를 투여하고 IPCs는 1일에 이식하고, 식이-유발성 비만마우스의 인슐린 감수성(도 8a) 및 내당능(도 8b)을 측정하였다.
이를 위하여 고지방식이군(HFD) (60 kcal% fat) 및 정상식이군으로서 표준 chow 식이군(18 kcal% fat)에서 경구 포도당 내성 검사 및 인슐린 내성 검사를 수행하였다. 포도당(체중의 2g kg-1)은 경구 투여하였다. 인슐린 (체중의 0.5U kg- 1)은 복강내(IP) 주사로 투여하였다. 글루코스 수준은 테일 블리드법에 의해 검사 전 30, 검사 후 30, 60, 90 및 120 분에서 모니터링하였다.
그 결과 도 8a에서 보듯이 인슐린 투여 후 혈당량을 측정한 결과 비만 마우스 대조군(Obese-no injection)에 비하여 수지상 세포 백신 투여군(Ob/Ob Dc-Vac)의 경우 혈당이 혈액에서 빨리 제거되는 것으로 나타났으며, DC-Vac 및 TK-IPCs를 병용하여 투여한 군에서는 정상 마우스 수준(Lean-no injection)으로 혈당이 변화됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8b에서 보듯이, 포도당 투여 후 시간에 따른 혈당량의 변화를 측정한 결과 비만 마우스 대조군의 경우 90분까지는 혈당량이 감소하지 않으며, 90분 이후에 감소하는 반면, 수지상 세포 백신 투여군(Ob/Ob Dc-Vac)의 경우의 증가된 혈당량이 30분 이후부터는 서서히 감소하는 것으로 나타났으며, DC-Vac 및 TK-IPCs를 병용하여 투여한 군에서는 정상 마우스 수준(Lean-no injection)과 유사하게 혈당이 조절되는 것을 확인할 수 있었다.
<4-2> 체중, 혈당 및 혈장 인슐린 농도에 미치는 영향
본 발명의 수지상 세포 백신 및 이에 TK-IPCs를 병용하여 투여하는 경우 체중, 혈당 및 혈장 인슐린 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 고지방식이를 통해 비만이 유도된 마우스에 대해서 각각의 투여방법에 따라서 투여하였다. 투여 6주 후와 10주 후에 6시간 동안 음식을 금식하였다. 그 다음 마우스의 체중을 측정하였고, 혈당과 혈장 인슐린 농도를 각각 측정하였다.
그 결과, 도 9에서 보듯이, 체중 (도 9a), 혈당(도 9b), 혈장 인슐린 (도 9c) 대조군에 비해 DC-Vac 투여군에서 감소하고, DC-Vac + TK-IPCs 투여군에서 더욱 더 낮아지는 것으로 나타났다.
<실시예 5>
인슐린 신호에 수지상 세포 백신이 미치는 영향
<5-1> IRS-1 인산화에 미치는 영향
본 발명의 수지상 세포 백신이 생체내의 인슐린 신호 전달에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 비만 마우스에 수지상 세포 백신(DC-Vac)을 투여한 다음, 마우스를 희생시켜 간 조직을 적출하였다. 그 다음 당업계의 통상적인 방법으로 간 조직에서 간세포를 추출하였다. 그 다음, 10ng/ml TNF-α를 1시간 동안 처리한 후, 세포를 수득하여 단백질을 추출하였다. 그 다음 상기 실험방법에 따른 웨스턴 블랏 방법으로 인슐린 저항성을 알아보기 위해 Ser307에서의 IRS-1(insulin receptor substrate-1)의 인산화를 분석하였다.
그 결과 도 10a에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 TNF-α를 처리한 경우에 Ser307에서의 IRS-1의 인산화(IRS-1pSer307)가 증가하는 것으로 나타났으나, Ser307에서의 IRS-1의 인산화는 TNF-α와 수지상 세포 백신(TNF-α+DC-Vac)를 처리한 경우에 감소하고, TNF-α+DC-Vac+TK-IPCs 처리한 경우는 더욱 더 감소하는 것으로 나타났다. 이는 DC-Vac과 TK-IPCs의 처리가 인슐린 저항성을 감소시키는 것을 보여준다.
<5-2> IRS-1 인산화에 미치는 영향
또한 상기 실험방법에 따라 제2형 당뇨 비만 마우스에 DC-Vac, DC-Vac+TK-IPCs을 처리한 다음에 25mIU/kg 인슐린(Eli Lilly)을 인슐린 펌프로 투여하였다. 4주후, 마우스를 희생시켜 간 조직을 적출하였다. 그 다음 당업계의 통상적인 방법으로 간 조직에서 단백질을 추출하였다. 그 다음 상기 실험방법에 따른 웨스턴 블랏 방법으로 인슐린 저항성의 감소를 의미하는 IRS-1의 티로신 인산화(IRS-1pTyr )를 통해 인슐린 신호를 분석하였다.
그 결과 도 10b에 나타난 바와 같이, 인슐린을 투여한 경우가 투여하지 않은 경우에 비해 IRS-1의 티로신 인산화(IRS-1pTyr)가 증가하였으며, 대조군에 비해 DC-Vac과 TK-IPCs의 처리가 인슐린 신호를 증가 시켜, 인슐린 저항성을 감소시키는 것을 보여준다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료에 적합한 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 본 발명의 면역관용 수지상 세포의 접종시 당뇨병 및 비만에 대한 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있다. 이와 더불어 골수유래 인슐린 분비 세포와 병합 사용시, IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 추가적으로 증가시켜, 제1형, 제2형 당뇨병 및 비만의 예방 또는 치료용으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (16)

  1. ⅰ) 췌장 β 세포 엑소좀을 첨가한, GM-CSF, IL-4, LPS(lipopolysaccharide) 및 항원 마이오신(myosin)을 포함하는 배지에서 미성숙 수지상 세포를 배양하는 단계; 및
    ⅱ) 메트포민(metformin) 및 비타민 D3(vitamin D3)를 처리하여 성숙한 면역관용 수지상 세포로 분화하는 단계를 포함하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법:
    상기 미성숙 수지상 세포는 IL-4, GM-CSF, LPS(lipopolysaccharide) 및 항원 마이오신(myosin)을 포함하는 배지에서 줄기세포 배양을 통해 수득하며,
    상기 췌장 β 세포 엑소좀은,
    a) TSPAN2(tetraspanin-2) 유전자가 제거된 췌장 β 세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양하는 단계;
    b) 상기 배양물에서 엑소좀을 분리하거나 상기 엑소좀이 포함된 배양배지를 분리하여 수득하는 단계;를 포함하는 방법에 의해서 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow derived stem cells)인 것을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 췌장 β 세포를 3차원 회전 타원체 배양하여 인슐린 분비 능력이 증가된 것을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 췌장 β 세포는 중간엽 줄기세포로부터 인슐린분비 세포 (insulin producing cells, IPCs)로 분화가 유도된 것임을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역 관용 수지상 세포는 IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 증가시키는 것임을 특징으로 하는 면역관용 수지상 세포의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장 β 세포는 인슐린 분비능력이 향상되는 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 b)단계의 배양물은 면역원성 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 면역관용 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 하기 특성을 가지는 인슐린 분비 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    a) 인슐린 분비 세포(insulin producing cells, IPCs)일 것; 및
    b) 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거(knock-out)됨.
  12. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 하기 특성을 가지는 인슐린 분비 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    a) 인슐린 분비 세포(insulin producing cells, IPCs)일 것; 및
    b) 테트라스파닌-2 (tetraspanin-2) 유전자가 제거(knock-out)됨.
  13. 제11항에 있어서, 상기 인슐린 분비 세포는 중간엽 줄기세포로부터 분화가 유도된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 인슐린 분비 세포는 중간엽 줄기세포로부터 분화가 유도된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 IRS-1의 세린 인산화를 감소시키고 IRS-1의 티로신 인산화를 증가시킴으로써 인슐린 감수성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020180054515A 2018-05-11 2018-05-11 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법 KR101950008B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180054515A KR101950008B1 (ko) 2018-05-11 2018-05-11 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법
PCT/KR2019/005437 WO2019216623A1 (ko) 2018-05-11 2019-05-07 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180054515A KR101950008B1 (ko) 2018-05-11 2018-05-11 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101950008B1 true KR101950008B1 (ko) 2019-02-19

Family

ID=65528638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180054515A KR101950008B1 (ko) 2018-05-11 2018-05-11 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101950008B1 (ko)
WO (1) WO2019216623A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019216623A1 (ko) * 2018-05-11 2019-11-14 Hwang In Hu 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112773889A (zh) * 2020-12-15 2021-05-11 重庆医科大学附属永川医院 一种基于vdbp/vsig4的免疫负向调节多价疫苗及其制备方法
CN113925960B (zh) * 2021-08-31 2022-10-28 苏州尔生生物医药有限公司 一种预防或治疗i型糖尿病的疫苗系统及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101524079B1 (ko) * 2014-12-03 2015-06-04 서울대학교산학협력단 엑소솜을 이용한 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100490308B1 (ko) * 2002-02-25 2005-05-17 크레아젠 주식회사 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법
KR101613675B1 (ko) * 2013-11-15 2016-04-20 차의과학대학교 산학협력단 면역관용 수지상 세포를 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 면역관용 수지상 세포
KR101870963B1 (ko) * 2016-09-28 2018-06-25 한국기초과학지원연구원 테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법
KR20170121096A (ko) * 2017-10-18 2017-11-01 충북대학교 산학협력단 미노사이클린을 이용하여 제조된 면역관용 수지상 세포 및 이의 제조방법
KR101950008B1 (ko) * 2018-05-11 2019-02-19 황인후 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101524079B1 (ko) * 2014-12-03 2015-06-04 서울대학교산학협력단 엑소솜을 이용한 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FASEB J. 2016, 30(9):3107-3116. XP NUMBER: SOURCE: () *
FASEB J. 2016, 30(9):3107-3116.*
Mediators of Inflammation 2016, Article ID: 2636701.* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019216623A1 (ko) * 2018-05-11 2019-11-14 Hwang In Hu 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019216623A1 (ko) 2019-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Märten et al. Therapeutic vaccination against metastatic renal cell carcinoma by autologous dendritic cells: preclinical results and outcome of a first clinical phase I/II trial
Mitchell et al. Dendritic cell/macrophage precursors capture exogenous antigen for MHC class I presentation by dendritic cells
US20190276803A1 (en) Method of culturing immune cells, kit for thereof, immune cell cultured medium obtained by same method, cosmetic composition and pharmaceutical composition comprising thereof
KR101950008B1 (ko) 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법
JP5986196B2 (ja) 高静水圧によって死滅させた腫瘍細胞および樹状細胞を用いた活性細胞癌免疫療法のための手段および方法
JP2021512874A (ja) 単離ミトコンドリアを含む関節リウマチの予防または治療のための医薬組成物
JP6235085B2 (ja) 高静水圧によって死滅させた腫瘍細胞および樹状細胞を用いた活性細胞癌免疫療法のための手段および方法
JP6629195B2 (ja) ウイルス免疫療法用の医薬組成物およびその使用
CA2649290C (en) Allogeneic cell therapy for treatment of opportunistic infection
Ou et al. Enhancement of dendritic cell-tumor fusion vaccine potency by indoleamine-pyrrole 2, 3-dioxygenase inhibitor, 1-MT
KR101568323B1 (ko) 겔솔린을 유효성분으로 포함하는 수지상세포 분화 유도용 조성물 및 이의 분화 유도방법
WO2007043630A1 (ja) 上気道粘膜下に投与されるｎｋｔ細胞刺激剤
KR100542817B1 (ko) 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적조성물 및 이를 이용한 치료방법
KR20100109099A (ko) 암 특이 면역반응 유도능을 갖는 수지상 세포의 제조 방법,이 수지상 세포를 포함하는 암의 예방, 치료, 또는 전이 억제용 약제학적 조성물 및 키트
US8105601B2 (en) Compositions and methods for modulating an immune response
JP2020506186A (ja) 自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物およびその製造方法
KR101869518B1 (ko) 췌장암 줄기세포의 emt-met 가소성을 이용한 암 치료용 수지상 세포 백신의 제조 방법
KR101523140B1 (ko) 길경 유래의 다당류를 유효성분으로 포함하는 수지상세포 성숙화 유도용 조성물
BG107482A (bg) Лекарствено средство за имунотерапия на злокачествени тумори
KR20130106786A (ko) 골수유래억제세포 및 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102383866B1 (ko) 자가 면역 질병 및 당뇨병의 치료를 위한 바이러스 벡터 및 그의 제조방법 및 응용
KR20170141914A (ko) 베르바민을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
US9833473B2 (en) Tolerogenic dendritic cells for treating myocardial infarction and manufacturing method thereof
Xie et al. Inhibitory effects of a dendritic cell vaccine loaded with radiation-induced apoptotic tumor cells on tumor cell antigens in mouse bladder cancer
KR101628453B1 (ko) 심근경색 치료용 면역관용 수지상 세포 및 그 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant