KR100542817B1 - 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적조성물 및 이를 이용한 치료방법 - Google Patents
수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적조성물 및 이를 이용한 치료방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (a) 치료학적으로 효과적인 양의 성숙된 수지상세포 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 자가면역 질환에 대한 면역치료용 약제학적 조성물, 및 이를 이용하여 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한것이다.
수지상 세포, 제 1 형 당뇨병, IFN-γ, 류마티스성 관절염
Description
본 발명은 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수지상 세포를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것이다.
자가면역(autoimmunity)은 자기의 항원 및 조직에 대한 비정상적인 면역반응으로 인한 염증 반응으로 야기된다. 자가면역 질환에 있어서, 자기 항원을 공격하는 T 세포가 관여하는 질환으로는 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM 또는 제 1 형 당뇨병) 및 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) 등이 있다 (KJ Johnson et al., Immunopathology in Pathology, pp104-153(1999)).
인슐린 의존형 당뇨병은 인슐린을 생산하는 췌도 (pancreatic islet) 베타세 포가 자가면역을 일으키는 T 세포에 의해 파괴되면서 나타나는 자가면역질환으로, 글루타메이트 디카복실라아제 (GAD65)와 같은 베타세포의 특정 항원 (Lohmann 등, Lancet 343:1607(1994); Yoon 등, Science, 284:1183-1187(1999))이나 인슐린에 대한 항체 (Williams 등, J. Autoimmun. Nov. 13(3):357-363(1999); Yu 등, P.N.A.S. USA, 97(4):1701-1706(2000)) 유무로 당뇨병의 발생 가능성을 규명하고 있지만, 아직까지 그 정확한 원인이나 면역학적 기전, 그리고 유전적인 요인도 제대로 밝혀지지 않고 있는 실정이고, 따라서 효과적인 치료방법이 개발되지 않았다.
사람의 제 1 형 당뇨병과 유사한 동물모델인 NOD (non-obese diabetic) 마우스 (Makino 등, Exp. Anim., 29:1-13(1980))와 BB (BioBreeding) 래트 (Like 등, Science, 216:644-646(1982))가 개발되었지만, 이렇다 할 병인학적 기전과 치료법에 대해서는 아직 성공을 거두지 못하고 있다.
한편, Green 등은 강력한 항원제시세포인 수지상 세포 (dendritic cell)가 제 1 형 당뇨병의 발병과 깊은 관련이 있을 것이라는 발표를 하였고 (Green 등, Immunity, 9:933-943(1998)), 보다 구체적으로는 TNF-α형질전환 NOD의 경우 췌도에서 국소적으로 TNF-α가 발현되면 췌도염이 시작되는데, 이 때 염증 초기에 주위의 수지상 세포들이 몰려들어 췌도-특이항원에 대한 T 세포의 활성을 강력하게 유도하고 췌도염을 가속화시켜 최종적으로 당뇨병을 유발시킨다는 기전을 제시하였다.
그러나 정상의 NOD 마우스에서 당뇨 발증 기전을 상기 Green 등의 이론으로 설명하기에는 한계가 있었다. 한편, 수지상 세포가 아폽토시스된 세포에서 매우 효과적으로 항원을 취하여 크로스-프라이밍 방법으로 세포독성 T 세포를 활성화한다는 결과 (Albert 등, Nature, 392:86-89(1998))가 발표되었다. 또한 Rovere 등은 (J. Immunol., 161:4467-4471(1998); J. Leuk. Biol., 66:345-349(1999)) 정상 마우스와 NOD 마우스를 비교하여 당뇨병의 발증에 수지상 세포가 관여 한다는 것을 제시했다. 이들에 의하면, 정상 마우스의 경우 췌도의 베타세포 재생과정에서 아폽토시스된 세포를 대식세포가 주로 제거하고 일부를 미성숙 상태의 수지상 세포가 도와주며 이 경우 수지상 세포가 췌도 항원-특이 T 세포를 만날 경우 클론제거 (clonal deletion) 방법이나 비활성상태 (anergy)를 유도하여 췌도 항원에 대한 자기관용 (tolerance)을 유도한다. 하지만, NOD 마우스의 경우 재생과정에서 아폽토시스 되는 베타세포가 많아, 일부 미성숙 수지상 세포가 몰려들어 이에 관여하게 되고 이들 일부가 아폽토시스된 세포를 제거하는 과정에서 성숙되어 췌도 항원-특이 T 세포를 활성화시킴으로써 강력한 자가면역성 T 세포가 만들어져 췌도가 파괴되고 당뇨로 진행된다고 발표하였다.
한편, B 세포 발생이 억제된 형질전환 마우스 실험을 통해 초기 췌도염 발생과정에 항원제시세포(APC)로 B 세포도 중요하게 작용하는 것으로 보고되었다 (Akashi 등 Int. Immunol., 9:1159-1164(1997); Noorchashm 등, Daibetes, 46:941- 946(1997); Serreze 등, J. Exp. Med., 184:2049-2053(1996)). 하지만, 초기 당뇨병에서 B 세포 보다는 수지상 세포가 주요하게 관여한다는 많은 보고가 있다. Green 등의 실험에 의하면 TNF-α-NOD 마우스 모델에서는 B 세포를 제거하여도 역시 당뇨가 유발되었으며 (Green과 Flavell, Curr. Opinion. Immunol., 11:663-669(1999)), 활성화된 수지상 세포가 B 세포에 비해 당뇨병 발증에 있어서 10배 이상 효과적이라는 보고 (Delon 등, J. Exp. Med., 188:1473-1484(1998)); 당뇨 초기에 NOD 마우스나 BB 랫드의 췌도에 다량의 수지상 세포의 침투가 관찰된다는 많은 보고들 (Voorbij 등, Diabetes, 38:1623-1629(1989); Jansen 등, Diabetes, 43:667-675( 1994); Dahlen 등, J. Immunol., 160:3585-3593(1998); Papaccio 등, J. Cell Biochem., 74:447-457(1999); Rosmalen 등, Lab Invest., 80:23-30(2000); Rosmalen 등, Lab Invest., 80:769-77(2000))은 B 세포보다는 수지상 세포가 당뇨 유발 초기에 중요하게 작용하고 있음을 시사해 준다. 그 외에도 자가면역 뇌질환의 동물모델인 EAE (Experimental autoimmune encephalitis)의 경우 자가항원을 발현하도록 조작하거나 자가항원으로 표지시킨 수지상 세포를 정상 마우스에 옮겨줄 경우 동일 질병이 유도된다는 연구결과 (Ludwig 등, J. Exp. Med., 188:1493-1501(1998); Dittel 등, J. Immunol., 163:32-39(1999))도 수지상 세포가 이러한 자가면역질환에 핵심적으로 작용할 가능성을 뒷받침해준다.
그러나 무엇보다도 당뇨병과 관련된 수지상 세포의 연구 결과 중 최근 큰 관심을 모은 것은 정상 NOD 마우스의 비장에서 부착성 (adhesive)이 약한 수지상 세 포를 분리하여 감마-인터페론(IFN-γ)을 처리한 후 1-4주령된 NOD 마우스의 복강에 주입할 경우 70% 정도 되던 NOD의 당뇨 발병율이 현저히 감소하여 26.3%까지 떨어졌다는 것이다 (Shinomiya 등, Clin. exp. Immunol., 117:38-43(1999)). 또한 이들은 ICR 마우스에서 동일한 방법으로 분리한 수지상 세포를 NOD 마우스에 투여하여도 비슷한 결과를 얻었다고 발표하였다. 또한 NOD 마우스에 생후 4주와 6주에 수지상 세포를 누 중 투여할 경우 30주 동안 6마리 중 한 마리도 당뇨 증상을 보이지 않았다. 그러나 이러한 수지상 세포의 투여에 의한 예방효과는 6 주령 이상된 NOD 마우스에서는 나타나지 않았으며 오직 1-4 주령된 어린 NOD 마우스에서만 나타난다고 발표하였다. 이러한 연구결과는 1992년 Clare-Salzler 등 (J. Clin. Invest., 90:741-748(1992))이 발표한 수지상 세포의 당뇨 예방 가능성을 한 단계 발전시킨 것으로, Clare-Salzler 등은 췌장의 임파절에서 분리한 수지상 세포를 NOD 마우스에 투여할 경우 다른 세포보다 매우 효과적인 당뇨예방 효과를 보였다고 발표하였다.
또한, 최근 NOD 마우스의 비장에서 수지상 세포를 분리하여 인간 감마글로불린 (human γ-globulin: HGG)을 감작시키고 NOD 마우스에 투여할 경우 12마리 중 11마리에서 25주 동안 당뇨 증상이 나타나지 않았으며 당뇨가 예방된 NOD 마우스에서 아일릿 (islet)을 분리하여 배양하고 상층액을 분석한 결과 IL-4와 IL-10이 증가하였고, IFN-γ나 TNF-α와 같은 사이토카인의 발현은 감소함을 보였다 (Papaccio 등, Endocrinology, 141:1500-1505(2000)). 그러나 HGG로 감작되지 않 은 DC 투여군에서는 이러한 예방 효과를 보이지 않았다.상술한 여러 연구 결과들은 NOD 마우스의 경우 수지상 세포를 인위적으로 활성화시킬 경우 체내의 비정상적인 면역반응을 정상적으로 조절할 수 있음을 보여주는 예가 되며, 사람의 제 1 형 당뇨 환자나 NOD 마우스의 수지상 세포가 비정상일 가능성이 있음을 시사해 준다.
실제 제 1 형 당뇨 환자의 경우나 (Jansen 등, Lancet, 345:491-492(1995); Takahashi 등, J. Immunol., 161:2629-2635(1999)) NOD 마우스에서 (Serreze 등, J. Immunol., 150:2534-2543(1993)) 항원제시세포에 문제가 있을 가능성이 몇 차례 보고된 바 있으며, 특히 최근 BB 랫드에서 항원제시세포 중 수지상 세포의 미성숙이 T 세포의 활성을 효과적으로 조절하지 못하여 당뇨가 일어날 가능성이 보고되었다 (Delemarre 등, J. Immunol., 162:1795-1801(1999)). 또한 이러한 사실과 관련하여 Lee 등 (J. Korean Med. Sci., 15:217-223(1999))은 NOD 마우스의 척수 (bone marrow: BM) 유래 수지상 세포 (BM-DC)를 조사한 결과 NOD 마우스의 BM-DC가 골수성 수지상 세포로 잘 분화되지 않으며 표면의 Ⅱ형 MHC, 보조활성분자 (co-stimulatory molecule)인 B7-1 및 B7-2, 그리고 CD40의 발현이나 IL-12의 분비가 C57BL/6 마우스에 비해 낮다고 보고하였다. Lee 등 (1999)의 결과는 Takahashi 등 (J. Immunol., 161:2629-2635(1999))의 결과를 뒷받침하는 것으로 제 1 형 당뇨 환자에게서 분리하여 분화시킨 단핵구 유래 수지상 세포 (Mo-DC)가 T 세포 활성을 효과적으로 유도하지 못하며, 그 이유 중 하나가 제 1 형 당뇨 환자의 경우 Mo-DC의 표면에 B7 분자의 발현이 낮다는 점을 들고 있다.
상술한 바와 같이 수지상 세포가 자가면역질환 중 하나인 제 1 형 당뇨 발병과 밀접한 관계가 있으며 수지상 세포를 이용한 제 1 형 당뇨의 예방 가능성은 몇 차례 보고된 적이 있지만, 현재까지 수지상 세포를 이용한 당뇨병의 치료 가능성은 보고된 적이 없다.
한편, 류마티스성 관절염의 치료제 또는 경감제로서 현재까지 개발된 것은 메토트렉세이드 (methotrexate), 아자티오프린 (azathioprine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide) 및 코티코스테로이드 (corticosteroid) 등이 있다 (Johnson CJ 등, Ann. Pharmacother., 35(4):464-471(2001), Seymour HE 등, Br. J. Clin. Pharmacol., 51(3):201-208(2001)). 그러나, 현재까지 개발된 류마티스성 관절염 치료제의 대부분은 큰 부작용이 있으며, 관절 손상의 발전을 크게 억제하지는 못하고 있는 실정이다.
미합중국 특허 제 6,007,821 호에는 gp96, hsp90 및 hsp70을 포함하여 자가면역 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 미합중국 특허 제 6,098,631 호에는 스핑고마이엘린 (sphingomyelin) 신호전달 경로에 대한 억제제를 이용하여 자가면역 질환을 치료하기 위한 방법이 개시되어 있다. 또한, 미합중국 특허 제 6,184,253 호에는 치료학적으로 효과적인 양의 토레미펜 (toremifene) 또는 이것의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하여 자가면역 질환을 치료하는 방 법이 개시되어 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시하였다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 마우스 비장으로 부터 특정 수지상 세포 아군을 분리하고, 적절한 사이토카인으로 처리하여 성숙시킨 후 투여하면 자가면역 반응을 경감시키거나 제거할 수 있다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 자가면역 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명에 따른 추가적인 목적 및 이점은 상세한 설명 및, 청구항 및 도면을 통해 더욱 구체적으로 명시될 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 치료학적으로 효과적인 양의 성 숙된 수지상 세포 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 자가면역 질환의 면역학적 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 "성숙된 수지상 세포"는 표면 보조 활성 분자 (예로 마우스에서 B7 molecules, CD80 또는 CD86)를 표현하지 않는 미성숙 수지상 세포를 분리하여 적합한 사이토카인 등으로 in vitro 또는 ex vivo 에서 성숙 분화시킨 것을 말한다. 수지상 세포는 이하에서 필요에 따라 "DC"로 기재한다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는 (a) 아직 자가면역 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나, 이러한 경향이 있는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람에서 질병 또는 장애가 발생되는 것의 예방; (b) 자가면역 질환의 억제, 즉 발전의 억제; 및 (c)자가면역 질환의 경감을 의미한다.
본 발명의 수지상 세포에 의해 치료가 가능한 자가 면역 질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함하며, 예를 들어, 제 1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 다발성근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병 등이 있 다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물이 적용되는 질병 또는 질환에는 제 1 형 당뇨병 및 류마티스 관절염이다.
상술한 바와 같이, 수지상 세포의 당뇨 예방 효과는 공지되어 있으나, 성숙된 수지상 세포에 의한 제 1 형 당뇨병 치료 용도는 종래에는 전혀 알려져 있지 않은 것이다. 따라서, 성숙된 수지상 세포를 이용하여 효과적인 제 1 형 당뇨병에 대한 치료가 가능하다는 것은 신규하며 획기적인 것이다. 한편, 수지상 세포의 제 1 형 당뇨병을 치료할 수 있다는 사실은 수지상 세포가 다른 자가면역 질환에 적용될 수 있는 가능성을 보여준다.
예를 들어, 류마티스 관절염은 관절의 염증을 특징으로 하는 만성 전신성 자가면역 질환으로서, 관절의 염증은 계속적으로 관절 연골과 골 조직으로 침윤되어 이들 조직의 부식을 가져온다. 류마티스 관절염의 유발 가능한 원인 항원으로는 관절의 주요 구성성분인 제 2 형 콜라겐이 잘 알려져 있으며, 이를 특이 조직적합항원을 가지는 마우스에 주사할 경우 류마티스 관절염이 유발된다 (LK Myers 등, Life Sci., 19:1861-1878(1997)). 류마티스 관절염의 경우 발병시 관절내 대식세포나 섬유아세포에서 사이토카인의 생산이 증가되며 T 세포에 의한 림포카인도 Th1 세포에 의한 IFN-γ와 IL-2 생산이 항진되어 있는 것으로 보고되었다. 이러한 Th1 세포에서 생산된 사이토카인은 관절염 증세를 악화시키는 반면 IL-4 및 IL-10 등과 같은 Th2 세포에 의해 생산된 사이토카인은 관절염을 예방하는 것으로 알려져 왔다. 또한 바이러스 벡터에 Th2 형 사이토카인인 IL-4 또는 IL-10을 발현시켜 관절염을 유도한 마우스의 관절내에 주사할 경우 주사한 다리 이외에 다른 다리에서도 치료 효과를 나타냈다는 보고도 있었다 (SH Kim 등, J. Immunol., 166:3499-3505(2001)). 위와 같은 사실은 류마티스 관절염의 발병시 원인이 되는 조직 항원만이 제 1 형 당뇨병과 상이할 뿐 자가 면역의 형성 기전이나 치료 기전은 2가지 자가면역질환에서 공통적일 것이란 점을 강력히 시사한다.
따라서, 본 발명에서 제 1 형 당뇨병 치료에 사용되는 수지상 세포는 류마티스 관절염의 치료에도 적용된다.
본 발명에서 이용되는 성숙된 DC는 바람직하게는 생체내에 있는 성숙된 DC를 직접 분리하여 이용할 수도 있고, 미성숙된 DC를 분리한 다음 적합한 사이토카인으로 처리하여 성숙시킬 수도 있다. 또한, 본 발명에서 이용되는 수지상 세포는 인간의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로 부터 분리될 수 있다.
상기 성숙화 과정에서 이용할 수 있는 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-4 등이 있으며, 가장 바람직하게는 IFN-γ이다. IFN-γ를 이용하여 성숙화하는 경우에는, IFN-γ1 unit 당 102-106 세포, 바람직하게는 104-10
5 세포를 이용하여 성숙화시킨다.
성숙된 DC에 의한 자가 면역 질환의 치료 효과는 성숙된 DC가 Th1 형의 자가 면역 반응성 T 세포를 Th2 형으로 전환시키거나 또는 새로운 Th2 형 T 세포를 생성시켜 자가 면역 반응성 T 세포의 활성을 억제함으로써 나타난다.
본 발명에서 이용되는 DC는 syngenic DC 또는 allogenic DC 모두 가능하지만, 자가 면역 질환의 치료에 특히 유효한 DC는 allogenic 수지상 세포이다. 본 명세서에서 용어 "allogenic DC"는 수용자와 다른 주조직적합성 (major histocompatibility; MHC)을 가진 공여자로부터 분리한 수지상 세포이다. 예로, 공여자가 NOD 마우스(H-2bIA-g7)인 경우, BALB/c 마우스(H-2d; C3H, H-2k)에서 분리한 수지상 세포를 의미한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 DC는 lymphoid DC 또는 myeloid DC 모두 이용할 수 있으나, 특히 바람직하게는 lympoid DC의 치료 효과가 우수하다. 본 명세서에서 용어 "lymphoid DC"는 T 및 B 세포와 같은 유래를 갖는 림포이드성 수지상 세포로서, 마우스의 예로 표면항원 표현형이 CD11b-/CD8α+ DC인 것을 의미하며 "myeloid DC"는 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage) 등의 세포와 같은 유래의 골수성 수지상 세포로서 마우스의 예로, 표면항원 표현형이 CD11b+/CD8α-인 것을 의미한다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 수지상 세포는 표면 단백질 발현 양상을 기준으로 하여, 사람의 CD11c-/CD4+ 수지상 세포 아군이다. CD11c-/CD4+ 수지상 세포가 IFN-γ에 의해 성숙화되면, CD11c-/CD4+/CD86+의 표면 단백질 발현 양상을 나타낸다. 상기 수지상 세포 아군에 대응하는 마우스에서의 아군은 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, CD11b-/CD8α+ 수지상 세포 아군이다.
한편, 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (a) IFN-γ로 전처리된 성숙된 allogenic CD11c-/CD4+ 수지상 세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가면역 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소비톨, 소비톨만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네 랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 수지상 세포 및 담체로서 생리 식염수의 현탁액으로 이루어질 수 있어, 용이하게 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 예컨대 제 1 형 당뇨병인 경우에는 복강투여가 가장 바람직하고, 이는 투여된 수지상 세포가 희석되지 않고 효과적으로 췌장으로 이동할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물이 관절염 환자에 적용되는 경우에는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만, 가장 바람직하게는 국부적으로 관절내 주입으로 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 당뇨 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예컨대, 제 1 형 당뇨병의 경우에는 바람직한 투여량은 1 x 106 -1 x 107의 성숙된 수지상 세포를 복강내 투입하는 것이며, 류마티스성 관절염의 경우에는 바람직한 투여량은 1 x 105 -1 x 106을 관절내 투여하는 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a)성숙된 수지상 세포를 준비하는 단계; 및 (b)상기 성숙된 수지상 세포의 치료학적 유효량과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 자가면역 질환의 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 상술한 바와 같이 성숙한 수지상 세포를 이용하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 치료방법에 대한 내용 중 상술한 본 발명의 약제학적 조성물과 공통적인 것은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 수지상 세포에 의해 치료가 가능한 자가 면역 질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함하며, 예를 들어, 제 1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 다발성근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물이 적용되는 질병 또는 질환에는 제 1 형 당뇨병 및 류마티스 관절염이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치료방법에 이용되는 성숙된 수지상 세포는 동물에서 직접 분리한 성숙한 수지상 세포이거나, 미성숙된 수지상 세포에 적절한 사이토카인을 처리하여 성숙화 시킨 것이다. 본 발명에서 이용되는 상기 성숙된 수지상 세포는 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 사람의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로 부터 분리한 것이다.
본 발명의 치료 방법에 있어서, syngenic DC 또는 allogenic DC를 모두 이용할 수 있으나, 바람직하게는 allogenic DC를 이용하는 것이다. 또한, 본 발명의 치료방법에 이용되는 수지상 세포는 lympoid DC가 바람직하며, 표면 단백질 양상이 CD11c-/CD4+인 수지상 세포 아군을 이용하는 것이 보다 바람직하다. 상기 CD11c-/CD4+ 수지상 세포가 IFN-γ에 의해 성숙화 되면, CD11c-/CD4+/CD86
+의 표면 단백질 발현 양상을 나타낸다.
본 발명의 치료방법에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계는 1회 투여로서 실시될 수도 있지만, 바람직하게는 1회 투여 이후에 부스팅 과정을 실시하는 것이 바람직하다. 부스팅 과정이 포함되는 투여에 있어서는 trans-allo-DC로 실시하는 것이 바람직하다. 용어 "trans-allo-DC"는 최초 투여한 수지상 세포의 공여자와 주조직적합항원성이 상이한 공여자로부터 분리한 수지상 세포를 의미한다.
한편, 투여 단계에서의 투여 경로는 경구 또는 비경구일 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 또한, 상기 투여 단계는 적용되는 질환의 종류에 따라, 예컨대 제 1 형 당뇨병인 경우에는 복강투여가 가장 바람직하고, 류마티스성 관절염에 적용되는 경우에는 국부적으로 관절내 주입이 가장 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 자가면역 질환 중 제 1 형 당뇨병의 발전은 개념적으로 6 단계로 나눌 수 있다 (Eisenbarth, New Engl. J. Med.
314:1360-1368(1986)). (a)단계 Ⅰ은 당뇨병의 발전에 필수적인 유전적 감수성 (genetic susceptibility)을 나타내지만 질병의 발전에는 충분한 조건이 갖추어지지 않은 단계이다. (b)단계 Ⅱ는 베타 세포에 대한 자가 면역의 활성화가 촉발되는 단계이고, (c)단계 Ⅲ은 베타 세포가 감소되고 인슐린에 대한 자가항체와 같은 면역학적 이상 및 췌도의 세포질성 항원이 확인되는 단계이다. (d)단계 Ⅳ는 베타 세포의 점진적인 감소로 인슐린 분비가 감소되지만, 아직은 정상적인 혈당량을 나타내는 단계이고, (e)단계 Ⅴ는 명백한 당뇨 증상 (고혈당증)이 확인되고 베타 세포의 약 90%가 파괴되며 환자는 생존을 위해 외래의 인슐린을 요구하는 단계이다. (f)단계 Ⅵ은 잔여의 모든 베타 세포가 파괴되고, C 펩타이드가 혈액에서 더 이상 발견되지 않는 단계이다. 상술한 당뇨 증상의 단계에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물 및 치료방법은 상술한 모든 단계에 작용하여 치료적 효과를 나타낸다. 바람직하게는 단계 Ⅱ 내지 단계 Ⅴ 중 어느 한 단계에 있는 환자에게 적용되며, 단계 V에서도 우수한 치료 효과를 나타낸다.
도 1a - 1f는 본 발명에서의 특정 수지상 세포 아군을 분리하는 방법을 나타내는 개략도;
도 2a - 2d는 실시예에서 분리된 수지상 세포의 표면 단백질의 발현 양상을 나타내는 FACS 결과;
도 3은 본 발명의 분리 방법에 따른 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포의 수득율을 나타내는 그래프;
도 4는 본 발명의 분리 방법에 따른 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 IFN-γ의 처리 하에 배양하였을 때의 생존율을 나타내는 그래프;
도 5a는 NOD 마우스에서 연령에 따른 혈당량의 변화를 나타내는 그래프;
도 5b는 NOD 마우스에서 연령에 따른 당뇨병의 발전 양상을 나타내는 그래프;
도 6a는 본 발명에 따른 수지상 세포를 1회 주입한 후 초기 반응을 분석한 표로서, 수치는 초기 반응을 보이는 마우스이 백분율이고, 괄호 안의 수치는 시험에 사용된 전체 마우스 수이다;
도 6b는 각 수지상 세포 아군의 주입에 따른 NOD 마우스에서 초기 반응 및 정상혈당증이 유지되는 기간을 나타내는 표;
도 6c는 각 수지상 세포 아군의 주입 및 부스팅 주입에 따른 NOD 마우스에서의 정상혈당증이 유지되는 기간을 나타내는 표;
도 7은 본 발명에 따른 수지상 세포의 당뇨병에 대한 치료적 효과를 보여주는 췌도의 헤마톡실린 및 에오신 염색 사진;
도 8은 본 발명에 따른 수지상 세포의 당뇨병에 대한 치료적 효과를 보여주는 인슐린의 면역조직화학적 염색 사진;
도 9는 수지상 세포 및 자가면역 T 림프구의 in vivo 이동을 나타내는 사진;
도 10a는 초기 당뇨병 증상을 보이는 NOD 마우스에서 분리한 췌장 림프절 세포에 췌도 항원을 처리한 후, IL-4 및 IFN-γ의 변화를 나타내는 그래프;
도 10b는 본 발명에 따라 당뇨병이 치료된 NOD 마우스에서 분리한 췌장 림프절 세포에서 면역반응의 전환을 나타내는 IL-4 및 IFN-γ의 변화 그래프;
도 11은 IFN-γ를 처리한 후에 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포의 형태적 변화를 나타내는 사진;
도 12는 사람의 말초혈에서 분리된 CD11c- 및 CD11c+ 수지상 세포의 형태적 변화를 나타내는 사진.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 마우스 비장에서 CD11b - /CD8α + /CD86 - 수지상 세포의 분리
실시예 1-a. CD11b
-
/CD8α
+
/CD86
-
수지상 세포의 분리 (Method 1)
우선, ICR 또는 BalB/c 마우스 (분양처: 대한바이오링크, 한국)에서 비장을 분리하고 페트리 디쉬 상에서 PBS 용액으로 세척한 다음, 콜라겐나아제 용액 (100 unit/㎖ of PBS: Sigma Type Ⅳ)를 상기 세척한 비장 조직에 주사기로 주입하였다. 5분간의 반응 후 주사기 바늘로 조직을 잘게 찢어 비장 세포들을 콜라겐나아제 용액상으로 분리해 내었다. 이어, 남은 조직과 비장 세포를 50㎖ 튜브로 옮긴 후 실온에서 25분 동안 콜라겐나아제 용액으로 처리하여 비장세포들이 조직으로부터 콜라겐나아제 용액상으로 분리되어 나오도록 하였다.
그런 다음, EDTA를 10 mM이 되게 넣어 준 후 5분간 실온에서 잘 섞어주었다. 용액상의 비장 세포들을 원심분리하여 수집한 후, 2% FCS, 10 mM HEPES 그리고 10 mM EDTA가 첨가된 냉장 PBS에 부유한 후 Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용한 원심분리를 실행하여 낮은 밀도의 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 위에서 사용한 PBS에 두 번 세척하고 재부유한 후 17.5% 메트리자마이드(Sigma 제품 No.M-3383) 용액의 상층에 조심스럽게 올려놓고 다시 원심분리하여 낮은 밀도의 세포를 얻었다. 이렇게 얻어진 세포를 MACS 용액 (containing PBS, 0.5% BSA and 2 mM EDTA)으로 세척한 후 세포의 수를 세어 107 세포 당 10 ㎕의 CD90, CD19 및 NK에 대한 항체에 자석입자가 부착된 용액 (Microbeads: Miltenyi Biotech 제품 No.130-049-101, 130-081-601 및 130-052-501)을 첨가하고, 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시킨 다음, 세포 반응액을 LS 또는 MS 컬럼 (Miltenyi Biotech,제품 No.130-042-401 및 130-042-201)에 통과시켰다. 컬럼을 통과하여 나온 세포 중에서 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포를 분리하기 위해서 상기와 동일한 비율로 CD8α에 대한 항체의 자석 입자 용액(Microbeads : Miltenyi Biotech 제품 No.130-049-401)을 첨가, 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시키고 MS 컬럼을 통과시켰다. MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용액으로 분리하여 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 수득하였다. 도 1a는 본 실시예의 분리 방법을 개략적으로 나타낸다.
실시예 1-b. CD11b
-
/CD8α
+
/CD86
-
수지상 세포의 분리 (Method 2)
우선, ICR 마우스 또는 BalB/c 마우스 (분양처: 대한바이오링크)에서 비장을 분리하고 페트리 디쉬 상에서 PBS 용액으로 세척한 다음, 콜라겐나아제 (100 U/㎖: Sigma Type Ⅳ)를 상기 세척한 비장 조직에 주사기로 주입하고 주사기 바늘로 조직을 잘게 찢어 비장 세포들을 콜라겐나아제 용액상으로 분리해 내었다. 이어, 남은 조직과 비장 세포를 50㎖ 튜브로 옮긴 후 실온에서 25분 동안 콜라겐나아제 용액으로 처리하여 비장세포들이 조직으로부터 콜라겐나아제 용액상으로 분리되어 나오도록 하였다.
그런 다음, EDTA를 10 mM이 되게 넣어 준 후 5분간 실온에서 잘 섞어주었다. 용액상의 비장 세포들을 원심분리하여 수집하고, 10 ㎖의 적혈구 용해용액 (0.14 M NH4Cl, 0.02 M Tris-Cl, pH 7.2)에 10분 동안 실온에서 방치하여 적혈구만을 선택적으로 용해시켰다. 적혈구가 제거된 비장세포를 5% FBS 배지를 포함한 RPMI 1640 (GibcoBRL)에 재부유한 다음, 세포수가 Φ100 세포배양 용기 당 1 x 108 세포가 넘 지 않도록 배지 부피를 맞추고, 37℃ 배양기에서 90분간 배양하였다. 이어, 세포배양 배지를 9-10회 피펫팅하여 플레이트 바닥에 느슨하게 붙어있는 세포를 제거하였다. 37℃에서 미리 예열된 RPMI 1640 배지를 디쉬 당 10 ㎖씩 넣고 상기와 동일한 방법으로 느슨하게 붙은 세포를 제거하였다. 다시 미리 가열된 RPMI 1640-5% FBS 배지를 디쉬 당 10 ㎖씩 넣고 60분간 배양하였다. 배양 후 상기와 같은 방법으로 세척을 2회 반복하였다. 마지막 세척을 끝내고 RPMI 1640-5% FBS 배지를 10 ㎖씩 넣고 18시간 내지 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지에 떠있는 부유 세포들만을 수집하였다. 플레이트에 느슨하게 붙어있을 수지상 세포를 회수하기 위해 5 ㎖ RPMI 1640-5% FBS로 세척하였다.
이렇게 수집한 세포의 수를 세고, 107 세포 당 10 ㎕의 CD90, CD19 및 NK에 대한 항체에 자석입자가 부착된 용액 (Microbeads: Miltenyi Biotech 제품 #130-049-101, 130-081-601 및 130-052-501)을 첨가하여 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시킨 다음, 세포 반응액을 LS 또는 MS 컬럼 (Miltenyi Biotech,제품 #130-042-401 및 130-042-201)에 통과시켰다. 컬럼을 통과하여 나온 세포 중 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포를 분리하기 위해서 상기와 동일한 비율로 CD8α에 대한 항체의 자석 입자 용액(Microbeads : Miltenyi Biotech 제품 #130-049-401)을 첨가하고 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시키고 MS 컬럼을 통과시켰다. MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 0.5% BSA가 첨부된 냉장 PBS 용액)으로 분리하여 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포를 수득하였다. 도 1b는 본 실시예의 분리 방법을 개략적으로 나타낸다.
실시예 2: 마우스 비장에서 CD11b - /CD8α + /CD86 + 수지상 세포의 분리
실시예 2-a: CD11b - /CD8α + /CD86 + 수지상 세포의 분리 (Method 3)
우선, BalB/c 또는 ICR 마우스 (분양처: 대한바이오링크)에서 비장을 분리하고 페트리 디쉬 상에서 PBS 용액으로 세척한 다음, 콜라겐나아제 (100 U/㎖: Sigma Type Ⅳ)를 상기 세척한 비장 조직에 주사기로 주입하고 주사기 바늘로 조직을 잘게 찢어 비장 세포들을 콜라겐나아제 용액상으로 분리해 내었다. 이어, 남은 조직과 비장 세포를 50㎖ 튜브로 옮긴 후 실온에서 25분 동안 처리하여 비장세포들이 조직으로부터 콜라겐나아제 용액상으로 분리되어 나오도록 하였다.
그런 다음, EDTA를 10 mM이 되게 넣어 준 후 5분간 실온에서 잘 섞어주었다. 용액상의 비장 세포들을 원심분리하여 수집한 후, 2% FCS, 10 mM HEPES 그리고 10 mM EDTA가 첨가된 냉장 PBS에 부유한 후 Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용한 원심분리를 실행하여 낮은 밀도의 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 위에서 사용한 PBS에 두 번 세척하고 재부유한 후 14.5% 메트리자마이드 (Sigma 제품 # M-3383) 용액의 상층에 조심스럽게 올려 놓고 다시 원심분리하여 낮은 밀도의 세포를 얻었다. 습득한 비장세포를 RPMI 1640-10%FBS 배지 (GibcoBRL)에 재부유한 다음, 세포수가 Φ100 세포배양 용기 당 1 x 108 세포가 넘지 않도록 배지 부피를 맞추고, 37℃ 배양기에서 90분간 배양하였다. 이어, 세포배양 배지 를 9-10회 피펫팅하여 플레이트 바닥에 느슨하게 붙어있는 세포를 제거하였다.
37℃에서 미리 가열된 RPMI 1640 배지를 디쉬 당 10 ㎖씩 넣고 상기와 동일한 방법으로 느슨하게 붙은 세포를 제거하였다. 다시 미리 가열된 RPMI 1640-10% FBS 배지를 디쉬 당 10 ㎖씩 넣고 60분간 배양하였다. 배양 후 상기와 같은 방법으로 세척을 2회 반복하였다. 마지막 세척을 끝내고 RPMI 1640-10% FBS 배지를 10 ㎖씩 넣고 18시간 내지 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지에 떠있는 부유 세포들만을 수집하였다. 플레이트에 느슨하게 붙어있을 수지상 세포를 회수하기 위해 5 ㎖ RPMI 1640-10% FBS로 세척하였다. 이렇게 수집한 세포의 수를 세고, 107 세포 당 10 ㎕의 CD90, CD19 및 NK에 대한 항체에 자석입자가 부착된 용액(Microbeads: Miltenyi Biotech 제품 #130-049-101, 130-081-601 및 130-052-501)을 첨가하여 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시킨 다음, 세포반응액을 LS 또는 MS 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 통과하여 나온 세포 중에서 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포를 분리하기 위해서 상기와 동일한 비율로 CD8α에 대한 항체의 자석 입자 용액(Microbeads : Miltenyi Biotech 제품 #130-049-401)을 첨가하고 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시키고 MS 컬럼을 통과시켰다. MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 0.5% BSA가 첨부된 냉장 PBS 용액)으로 분리하여 CD11b-/CD8α+
수지상 세포를 수득하였다. 도 1c는 본 실시예의 분리방법을 개략적으로 나타낸다.
실시예 2-b. CD11b - /CD8α + /CD86 +
수지상 세포의 분리 (Method 4)
우선, BalB/c 마우스 또는 ICR 마우스 (분양처: 대한바이오링크)에서 비장을 분리하고 페트리 디쉬 상에서 PBS 용액으로 세척한 다음, 콜라겐나아제 (1 ㎎/㎖: Sigma Type Ⅳ)를 상기 세척한 비장 조직에 주사기로 주입하고 주사기 바늘로 조직을 잘게 찢어 비장 세포들을 콜라겐나아제 용액상으로 분리해 내었다. 이어, 남은 조직과 비장 세포를 50㎖ 튜브로 옮긴 후 실온에서 25분 동안 처리하여 비장세포들이 조직으로부터 콜라겐나아제 용액상으로 분리되어 나오도록 하였다.
그런 다음, EDTA를 10 mM이 되게 넣어 준 후 5분간 실온에서 잘 섞어주었다. 용액상의 비장 세포들을 원심분리하여 수집한 후, 2% FCS, 10 mM HEPES 그리고 10 mM EDTA가 첨가된 냉장 PBS에 두 번 세척하였다. 세척 후, 한 마리당 1 ㎖의 고밀도 BSA 용액 (38% BSA)에 재부유하고 5-6 ml을 15 ㎖ 튜브로 옮겼다. 그런 후 1-1.5 ㎖의 냉장 RPMI 1640을 조심스럽게 그 위에 올려놓고 원심분리하여 낮은 밀도의 세포를 취했다. 두 번의 세척을 실행하였으며 이때 세포의 수를 세었다.
상기에서 얻어진 비장세포를 RPMI 1640-10% FCS 배지(GibcoBRL)에 재부유한 다음, 세포수가 Φ100 세포배양 용기 당 1 x 108 세포가 넘지 않도록 배지 부피를 맞추고, 37℃ 배양기에서 2시간 배양하였다. 이어, 세포배양 배지를 9-10회 피펫팅하여 플레이트 바닥에 느슨하게 붙어있는 세포를 세척하여 제거하였다. 다시 한번 5 ㎖ RPMI 1640의 배지로 세척을 실행하고 37℃에서 미리 가열된 RPMI 1640-10%FCS 배지를 디쉬 당 10 ㎖을 넣고 18시간 배양하였다. 배양 후, 배지에 떠있 는 부유 세포들만을 수집하였다. 플레이트에 느슨하게 붙어있을 수지상 세포를 회수하기 위해 5 ㎖ RPMI1640-10% FCS로 세척하였다.
이렇게 수집한 세포의 수를 세고, 107 세포 당 10 ㎕의 CD90, CD19와 NK에 대한 항체에 자석입자가 부착된 용액 (Microbeads: Miltenyi Biotech 제품 #130-049-101, 130-081-601 및 130-052-501)을 첨가하여 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시킨 다음, 세포반응액을 LS 또는 MS 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 통과하여 나온 세포 중에서 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포를 분리하기 위해서 상기와 동일한 비율로 CD8α에 대한 항체의 자석 입자 용액(Microbeads : Miltenyi Biotech 제품 #130-049-401)을 첨가하고 6-12℃에서 15분간 세포와 반응시키고 MS 컬럼을 통과시켰다. MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 2% FBS가 첨부된 냉장 PBS 용액)으로 분리하여 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포를 수득하였다.
도 1d는 본 실시예의 분리방법을 개략적으로 나타낸다.
실시예 3: 본 발명에서의 분리 방법에 따른 림포이드성 수지상 세포의 표면 단 백질 발현 및 수득율 조사
상기 실시예 1 및 2에서 분리된 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포 각각을 PE (phycoerythrin), FITC (fluorescein isothiocyanate) 등의 형광물질로 표지된 단일클론 항체 (Pharmingen)를 사용하여 다음과 같이 염색한 후 분석하였다: 우선, 상기 실시예에서 분리된 세포를 각각 2 x 104 세포씩 유세포 분석용 용기 (Falcon 2052: Becton Dickinson)에 분주하고, 유세포 분석 용액 (BSA가 최종농도 0.2%로 첨가된 냉장 PBS 용액) 3 ㎖을 첨가하여 원심분리하였다. 원심분리 후, 200 ㎕의 유세포 분석 용액으로 세포를 잘 부유하고 4 ㎕의 형광물질이 표지된 단일클론 항체들을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 유세포 분석 용액 3 ㎖을 넣고 세포를 다시 원심분리하여 여분의 항체들을 제거하였다. 원심분리 후 200 ㎕의 유세포 분석 용액에 세포를 잘 혼합하고 유세포 형광 분석기 (FACScalibur flow cytometer; Becton Dickinson)와 유세포 분석 프로그램 (CellQuest software)을 사용하여 세포의 형광 표지 정도를 분석하였다 (참조: 도 2).
도 2에서 확인할 수 있듯이, 분리 된 수지상 세포는 T 세포, B 세포 및 단핵세포의 대표적인 표지 단백질인 CD3, CD19, CD14 등으로는 거의 염색되지 않았다. 이러한 결과는 상기 실시예 1 및 2에서 분리된 세포가 임파구 또는 단핵구가 아닌 수지상 세포임을 보여주는 것이다. 또한, 실시예 1에서 분리된 수지상 세포는 활성화된 항원 제시세포들의 표면에서 과량 발현되는 B7 분자 (CD86)도 거의 발현되지 않은 것으로 보아 아직 미성숙 단계의 수지상 세포 아군임을 보여준다. 반면, 기존에 많이 이용되고 있는 방법인 실시예 2의 방법으로 분리할 경우, B7 분자 (CD86)가 발현되는 것으로 나타났다. 더욱이, 실시예 1에서 Method 1과 Method 2를 비교할 경우 17.5%의 메트리자마이드를 사용하는 Method 1의 경우가 부착 방법 을 사용하는 Method 1에 비하여 월등히 많은 세포를 수득할 수 있는 것 (약 7배)으로 나타났다 (참조: 도 3 ).
실시예 4: 분리된 CD11b - /CD8α + /CD86 -
수지상 세포에 IFN-γ처리 및 처리시간 에 따른 생존율 확인
상기한 실시예 1의 Method 1에 의해 분리된 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 10% FBS (Gibco/BRL 제품 # 26140-079)와 100 U/㎖의 IFN-γ(PharMingen 19301T)이 함유된 RPMI 1640 (GibcoBRL 31800-022) 배지에 2 x 106 세포/㎖ 정도 되게 부유시켜 15시간 동안 배양하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이 15시간 배양시 생존율은 50-60%를 나타내었다.
실시예 5: NOD 마우스의 연령에 따른 당뇨 자연 발증율 관찰 및 치료 혈당 수준의 결정
7-8 주령 자성 NOD/Ltj 마우스를 미국의 잭슨사로부터 구입하여 실험동물 사육용 챔버에서 온도 23±2℃, 상대 습도 55±10%를 유지하여 사육하였다. 사육기간중 12시간 인공 조명 하에서 마우스용 케이지 (polycarbonate, 명진기계)에 5마리 이하로 넣어 사육하였으며, 음수와 사료(삼양사료, 서울)는 자유로이 공급하였다.
실험 기간 중 체중 및 혈당량은 1주일 간격으로 일정한 시간 (10:00)에 측정 하여 당뇨 발증 여부를 관찰하였다. 혈당은 헤파린을 처리한 모세관 (Chase, Rockwood, 미합중국, Cat#2501)을 이용하여 안와정맥총 (retinal vein)에서 채혈하여 혈당측정기 (Glucotrend, Boehringer Mannheim, Berlin, 독일국)를 사용하여 측정하였으며, 체중은 실험동물용 저울 (Mettler, 미합중국)을 사용하여 측정하였다.
도 5a는 24주까지 총 116마리의 NOD 마우스중 67마리가 당뇨가 발증하여 57.75 %가 발증하였으며, 이중 혈당이 200 mg/dl 이상을 보인 마우스는 80% 이상이 심한 당뇨로 진전되는 것으로 나타났다. 도 5b는 도 5a에 나타난 결과를 요약한 것이다. 도 5b에서 type A는 주로 10 - 12 주령에 당뇨병이 발생하며, 당뇨병 진행이 매우 빠른 형 (1주 이내 혈당이 400 mg/dl 이상에 도달)이며, type B는 주로 16 - 18 주령에 주로 당뇨병이 발생하며, 당뇨병 진행 정도가 비교적 느린 형 (혈당이 400 mg/dl 이상으로 도달하는데 2주 걸림)이며, type C는 20 주령이상에서 주로 발생하여 당뇨병 진행정도가 매우 느린 형 (혈당이 400 mg/dl까지 도달하는데 4주 이상 걸림)이다. Type A, B, C를 통털어 diabetes-prone (DP)라고 하며, 24 주령 이상임에도 혈당이 150 mg/dl로서 혈당이 상승하지 않는 마우스를 diabetes-resistance (DR) 마우스라고 한다.
하기의 모든 실시예에서는 도 5b의 type B (16 - 22 주령)형 마우스를 주로 사용하였으며, 혈당이 200 mg/dl 내외 수준이 관찰될 경우 실시예 1-a에서 준비한 수지상 세포를 하기의 실시예 6과 같이 복강 주사하였다.
실시예 6: 당뇨가 발증된 NOD 마우스에 대한 수지상 세포 단회 처리시의 치료 효과
실시예 6-1. 수지상 세포 아군에 따른 치료 효과
상기의 실시예 1-a의 방법에 따라 분리된 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포 또는 다른 아군의 수지상 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, PBS 400 ㎕ 당 1 x 106 세포가 되도록 세포수를 조정하여 NOD 마우스의 복강 내에 주사하였다. 이어, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 4주 동안 체중 및 혈당의 변화를 측정하였다. 수지상 세포에 의한 치료 효과는 초기 반응의 평가와 반응의 지속 시간으로 평가하였다. 초기 반응은 수지상 세포의 처리에 의하여 혈당이 200 mg/dl 이하로 저하된 시점을 의미하며, 지속 시간은 수지상 세포의 처리에 의하여 혈당이 200 mg/dl 이하로 저하된 시점으로부터 혈당이 200 mg/dl 이상으로 상승될 때까지의 시간을 의미한다 (참조; 도 6a 및 도 6b).
도 6a와 도 6b는 NOD 마우스에서 각 수지상 세포 아군을 단회 처리시 초기 반응과 반응 지속 시간을 나타내는 표이다. 도 6a 및 도 6b의 표에서 syngenic DC는 동일한 개체 (NOD mouse)에서 분리한 DC를 이용한 경우이고, allogenic DC는 다른 개체 (BalB/c 마우스)에서 분리한 DC를 이용한 경우이다.
도 6의 표에서 볼 수 있듯이 초기 당뇨발증 상태 (Early DM) 에서는 IFN-γ를 처리한 모든 아군의 수지상 세포가 초기 반응을 나타내는 것으로 나타났다. 초기 반응의 지속 시간은 최저 1일에서 130일 이상 동안 지속되는 것으로 나타났다.
명백한 당뇨가 형성된 시기 및 그 이후 (Overt DM & Late DM)에 수지상 세포 를 처리할 경우에는 림포이드성 allogenic DC에 IFN-γ를 처리한 경우에만 초기 반응을 나타내었다. 특히, IFN-γ를 처리한 골수성 수지상 세포 (myeloid DC)는 초기 당뇨의 마우스에 대해서만 효과를 보였고, 그 이후의 당뇨 단계에서는 전혀 반응를 나타내지 않아 림포이드성 수지상 세포와 치료 기전이 다른 것으로 예상된다. 또한, IFN-γ를 처리한 syngenic DC의 경우에도 초기 당뇨 시기에 효과가 있는 것으로 나타났다.
상기한 실험 결과는 수지상 세포를 분리하여 적합한 처리로 성숙/분화 시킬 경우 NOD 마우스의 췌장 베타 세포를 파괴하는 자가 반응성 T 세포를 당뇨 단계에 따라 일시적 또는 장기적으로 조절하거나 효과적으로 제거할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6-2. CD11b
-
/CD8α
+
/CD86
-
수지상 세포를 반복 투여 (boosting) 했을 때의 당뇨 치료 효과의 지속성에 관한 관찰
실시예 6-1에서와 같이 수지상 세포의 단회 처리에 의한 효과는 마우스의 경우에 따라 최고 130일 정도까지 혈당 강하 효과를 나타내기도 하였으나, 대부분의 경우에 있어서 그 효과가 일시적이었다. 따라서, 단회 처리에 의한 초기 반응 평가에서 가장 우수한 효과를 나타낸 것으로 평가되는 allogeneic lymphoid CD11b-/CD8α+/CD86- DC를 IFN-γ 처리로 활성화시킨 후 반복투여 (boosting) 하여 장기간 혹은 영구적 효과를 유도하기 위한 시도를 다음과 같이 실시하였다:
17-23 주령의 당뇨 발증 NOD 5마리에 ICR 또는 Balb/c로부터 분리된 allogeneic lymphoid CD11b-/CD8α+/CD86- DC에 IFN-γ를 처리한 후 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 투여한 다음, 혈당의 상승 시점 혹은 상승 이전에 boosting 하였다. 도 6c이 표에서 볼 수 있듯이, 동일한 allogeneic DC로만 boosting할 경우에는 매우 일시적인 효과만이 나타났다. 그러나, allogeneic DC를 변화시켜갈 경우 (trans-allo-DC treatment: Balb/c to ICR, Balb/c to C3H or ICR to Balb/c)에는 2번의 부스팅만으로도 충분히 장기간의 혈당 강하 효과를 얻을 수 있었다. 도 6c의 표에서 ICR 마우스로부터 분리한 DC만으로도 충분한 효과를 얻을 수 있었던 점은 ICR 마우스가 outbred이기 때문에 충분히 trans-allo-DC treatment 효과를 나타낸 것으로 생각된다.
실시예 6-3. IFN-γ의 단독 투여에 의한 당뇨 치료 효과의 확인
상기 실시예 6-1에서 볼 수 있듯이, IFN-γ는 수지상 세포에 의한 당뇨 치료 효과에 필수적인 것으로 확인 되었다. 따라서, 본 발명자들은 IFN-γ단독으로 당뇨 치료 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하였다. 상기 실시예 5의 NOD 마우스에 직접 IFN-γ를 마리 당 600 U로 투여하여 치료 가능성을 조사한 결과, 6 마리 중 한 마리에서만 일시적으로 치료 가능성을 보이다가 사망하였으며 나머지에서는 전혀 치료효과를 보이지 않았다. 이는 수지상 세포에 IFN-γ를 처리하여 나타나는 당뇨 치료 효과는 IFN-γ를 투여하여 얻을 수 있는 면역반응이 아니며, 상기 실시예 6-1에서 확인한 수지상 세포의 당뇨 치료 효과는 전신성이라기 보다는 국부적인 면역반응으로 나타나는 결과임을 나타낸다.
실시예 7: 수지상 세포에 의한 당뇨 치료의 조직병리학적 확인
실시예 7-1. 췌도의 H&E 염색에 의한 확인
상기 실시예 5의 당뇨 초기 NOD 마우스에 allogeneic IFN-γ가 처리된 림포이드성 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 마우스 당 1 x 106 세포로 복강 내에 주사하였고, 4 주 후에 마우스를 척추 탈골하여 안락사시키고 췌장을 적출하였다. 이어, 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 동안 고정시키고, 알코올 탈수 및 파라핀 포매 과정을 거친 다음 조직 박절기 (Zeiss Super Cut 2050, Berlin, Germany)로 4 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 그런 다음, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고 (Shinomia 등, Clin. Exp. Immunol., 117:38-43(1999)) 광학현미경 (Nicon)으로 췌도염 (insulitis) 정도를 관찰하였다 (참조: 도 7).
첨부 도 7에서 NOD-DM은 수지상 세포를 처리하지 않은 마우스에서의 췌도염의 정도를 나타내는 것으로서 당뇨 발증 후 초기 1 주일만에 췌도염이 초기의 췌도염 (A, insulitis score 1)에서부터 췌도염이 급격히 진전된 췌도 (B, insulitis score 3)와 베타세포 전부가 파괴되고 T 세포가 췌도 전체를 채우고 있는 모습 (C, insulitis score 4)이 모두 관찰되었다. 반면 수지상 세포로 치료된 군의 췌도 경우에는, 췌도염이 관찰되기는 하였으나, 약간의 T 세포 침윤 흔적이 보일 뿐 더 이상 췌도염의 흔적을 볼 수 없어 그 정도가 미약한 형태 (A, insulitis score 1)와 췌도 가장자리에만 T 세포가 심하게 침윤 (infiltrated)된 형태 (B, insulitis score 2)로 관찰되었고, 고혈당 상태의 대조군에 비해 췌도의 중심부가 정상적인 형태로 남아있는 모습 (C, insulitis score 0)이 상당 부분 관찰되었다. 때때로 T 세포가 침윤되어 들어왔던 흔적이 보이기도 하나 대부분 그러한 흔적은 사라지고 정상적인 췌도의 모습을 나타내었다.
실시예 7-2. 췌도의 인슐린 염색에 의한 확인
췌도의 인슐린 분비를 면역화학적으로 관찰하기 위해 적출한 췌장을 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 다음, 알코올 탈수 및 파라핀 포매 과정을 거쳤다. 이어, 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 인슐린 분비세포 (췌도 베타 세포) 대하여 다음과 같이 아비딘-바이오틴 복합체 방법으로 췌도에 대한 면역조직화학적 염색을 실시하였다: 조직 내의 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위하여 메탄올에 과산화수소수를 1% 농도로 첨가한 용액으로 절편된 췌장 조직을 30분간 반응시키고, 인슐린에 대한 항체 (guinea pig anti-porcine insulin; Dako Co., Copenhagen, 덴마크국)를 1:400으로 희석하여 조직에 처리한 다음 4℃의 습윤 챔버에서 24시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로 바이오틴이 결합된 항-기니아피그 항체 (biotinylated anti-guinea pig IgG; Vector, 미합중국)를 사용하였으며, 3차 반응은 효소가 결합된 아비딘 용액 (avidin-horseradish peroxidase; Vector, 미합중국)을 사용하였다. 각각의 염색 과정은 10% 정상 산양 혈청 (Sigma, S-2007)이 함유된 0.1 M의 PBS에서 진행하였다. 항원항체 반응 후 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB, Sigma, D8001)을 증류수에 0.3 ㎎/㎖되게 용해시켜 첨가하고 발색 직전에 과산화수소수 0.003%를 처리하여 발색시킨 다음 광학현미경하에서 발색 과정을 관찰하면서 적절한 시기에 반응을 정지시켰으며, 면역조직화학적 염색 후에는 마이어스 헤마톡실린 용액으로 감별 염색한 뒤 탈수과정을 거쳐 현미경으로 관찰하고 사진촬영하였다 (참조: 도 8).
첨부 도 8에서 NOD-DM으로 나타낸 연속 3장의 사진은 초기 당뇨가 형성된 NOD 마우스로서 수지상 세포를 투여하지 않은 췌도의 인슐린 면역염색 결과이며, NOD-DC로 표시된 연속 2장의 사진은 초기 당뇨가 형성된 NOD 마우스에 IFN-γ가 처리된 allogeneic lymphoid CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 투여하고 혈당이 20일간 조절된 마우스 췌도의 인슐린 면역염색 결과이다.
도 8에서 볼 수 있듯이, 대조군 NOD 마우스 (수지상 세포가 투여되지 않음)의 경우에는 초기 당뇨 발증 후 1-2주 내에 소도는 췌도염으로 거의 모두 파괴되어 인슐린 분비가 매우 미약하거나 (참조: 도 8의 NOD-DM- A, B) 거의 관찰되지 않는 (참조: 도 8의 NOD-DM- C) 당뇨 말기상태에 이른다. 그러나 수지상 세포로 치료된 NOD 마우스의 경우에는, 소도의 일부가 파괴되지 않고 남아 있는 모습들이 많이 발견되며 이들 남은 소도들은 정상적으로 인슐린을 분비함을 관찰하였다(참조: NOD-DC- A, B). 한편 이들 치료군에서는 인슐린에 양성 반응을 보이는 작은 췌도가 췌장 도관 및 외분비부에서 다수 관찰되어 수지상 세포 치료 후 췌도 신생이 계 속 진행되고 있음이 관찰되었다 (참조: 도 8의 NOD-DC-A).
실시예 8: CMTMR 및 CMFDA 염색으로 염색된 수지상 세포 및 자가면역성 T 세포의
in vivo
에서 이동 위치 조사
CMTMR (Molecular Probe 제품#c-2926) 및 CMFDA (Molecular Probe 제품#c-2925) 을 10 mM로 용해한 후 사용직전 혈청 및 다른 보조물이 전혀 들어있지 않은 RPMI 1640 배지로 최종 농도가 2 μM되게 희석하여 세포의 이동 위치를 알아 보는데 사용하였다. 세포의 이동위치를 알아보기 위하여 명백히 당뇨가 발증한 NOD 마우스를 도살하여 비장으로부터 T 세포를 나일론 울을 사용하여 분리하여 사용하였고, 수지상 세포는 실시예 1의 Method 1과 같이 분리한 림포이드성 또는 골수성 수지상 세포를 사용하였다. 염색시 106 세포당 100 ㎕의 CMTMR 및 CMFDA 용액을 사용하여 37℃에서 15분간 반응시키고 세포를 2회 세척하였다. 이어, 세포를 다시 새로운 RPMI 배지에 부유시킨 후 37℃에서 30분간 방치하여 세포내로 침투한 CMTMR 및 CMFDA가 세포막을 다시 투과하여 나갈 수 없는 물질로 전환시켰다. 그런 다음, CMFDA로 염색된 자가면역성 T 세포 3 x 106개를 PBS 200 ㎕에 부유하여 NOD 마우스에 꼬리 정맥에 주사하였고, CMTMR로 염색된 림포이드성 수지상 세포 또는 골수성 수지상 세포 1 x 106개의 세포를 PBS 400 ㎕에 각각 부유하여 NOD 마우스 복강내에 주사한 후 48시간에 마우스를 도살하여 췌장을 적출하고 조직동결배지 (Tissue freezing media: Jung, Nussloch, 독일국, Cat# 0201 08926)로 냉동하여 냉동절편기 (Cryostat, Leica CM1510-3, Lusslooh, 독일국)로 5 ㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 직접 다초점 현미경 (Bio-Rad MRC 1024ES, Hercules, 미합중국)으로 관찰하였다 (참조: 도 9).
첨부 도 9에서, LDC+T는 림포이드성 DC 및 자가 면역성 T 세포를 투여한 NOD 마우스에 대한 사진이고, MDC+T는 myeloid DC 및 자가 면역성 T 세포를 투여한 NOD 마우스에 대한 사진이다. 도 9에서, DLN은 이격의 임파절, PI는 췌도의 주변부, Spl는 비장, PLN은 췌장 임파절 그리고 Thy는 흉선 조직에 각각 해당하는 동결 박편의 단위 면적당 형광의 정도를 나타내는 사진이다. 도 9에서 볼 수 있듯이, NOD 마우스에 복강 투여된 IFN-γ로 15시간 동안 배양한 CD11b-/CD8α+/CD86-
수지상 세포 및 CD11b+/CD8α_/CD86- 수지상 세포는 췌장 임파절에 가장 많이 위치하고 다음으로 비장, 흉선, 췌도 그리고 복강에서 멀리 떨어진 곳에 단위 면적당 이동한 세포수가 가장 많음을 확인하였다. 자가면역성 T 세포 역시 수지상 세포의 이동 위치에 공존하는 것으로 관찰되어 복강 주사한 수지상 세포는 주로 자가 면역질환이 발생한 장소와 흉선에서 주로 작용하고 있음을 강하게 시사해준다.
실시예 9: 췌장 임파절에서 췌도항원-특이 세포의 배양 및 배양액에서 사이토카인 발현 측정
상기 실시예 6-1에서 ICR 마우스의 IFN-γ로 처리된 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포의 단회 투여에 의해 당뇨가 치료된 NOD 마우스의 치료 후 췌도 베타세포에 대한 자가 면역반응의 변화를 관찰하기 위해 다음과 같이 실험을 실시하였다:
실시예 9-1. 췌도항원-특이 임파절 세포의 증식 및 췌도 분리
ICR 마우스의 IFN-γ로 처리된 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포 1 x 106개를 투여한 초기 당뇨의 NOD 마우스와 수지상 세포를 투여하지 않은 초기 당뇨가 발증된 NOD 마우스에서 각각 췌장을 적출하여 임파절을 분리하고 임파절 세포를 얻은 다음, 5%의 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배지에 부유한 후 플레이트에 웰당 5 x 105 세포가 들어가도록 분주하였다.
한편, 별도로 NOD 마우스의 췌도를 적출하고 베타세포를 분리하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음, 상기 임파절 세포가 든 각 웰에 2.5 x 104 또는 5 x 104 세포 분량의 파쇄물 (CEQ; cells of equivalent)을 췌도 항원 (islet antigen)으로서 첨가하고 96시간 동안 배양하면서 상청액에 분비된 IFN-γ (Th1 면역반응의 지표로서의 사이토카인) 및 IL-4 (Th2 면역반응의 지표로서의 사이토카인)의 생성량을 샌드위치-ELISA 방법으로 하기 실시예 9-2와 같이 측정하였다.
상기 췌도는 다음과 같이 분리하였다: 우선, NOD 마우스에 체중 100 g 당 1 ㎖의 20% 우레탄 (Urethane)을 복강 투여하여 마취시킨 다음, 복강을 절개하고 췌장에 콜라겐나아제 P 를 주입한 후 일정시간이 경과한 다음에 췌장을 적출하였다. 이어, 췌장을 37℃에서 상태에 따라 10 여분 방치한 후 분해된 췌장에서 흘러나온 세포들을 수집하였다. 상기 세포들을 PBS로 2차례 원심분리로 세척한 다 음 비중 1.086의 파이콜 (Ficoll)로 균일하게 부유시키고 용액 상층에 비중 1.076의 파이콜 4 ㎖ 및 비중 1.053의 파이콜 2 ㎖을 차례로 조심스럽게 채웠다. 이어, 4℃ 800 g에서 10분간 원심분리하여 비중 1.076 및 비중 1.053 사이에 모인 췌도 (islet)를 조심스럽게 수거하고 PBS로 2회 세척한 다음 37℃ CO2 배양기에서 하루동안 배양하고 다음날 현미경하에서 췌도를 수획하였다.
실시예 9-2. ELISA에 의한 사이토카인의 정량
IL-4 및 IFN-γ의 생성은 Endogen (Woburn, MA. 미합중국)에서 제공하는 시약과 재료 (Matched Antibody Pairs)를 이용하여 샌드위치-ELISA 방법으로 다음과 같이 측정하였다: 우선, 96 웰 둥근 저부 플레이트를 100 ㎕ (2 ㎍/㎖)의 코팅 항체 (Endogen, 미합중국)로 10-14시간 실온에서 코팅한 다음, 웰을 세척하였다. 이어, 200 ㎕의 분석완충액 (PBS - 4% BSA, pH 7.2-7.4)을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 세 번 세척한 후 일정 비율로 희석한 시료와 표준 용액을 50 ㎕씩 이중으로 1시간 동안 반응시키고 50 ㎕ (250 ㎍/㎖)의 바이오틴-표지 2차 항체를 첨가하여 1-2시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 웰을 세척한 다음, 1:12,000의 비율로 희석한 HRP-결합 스트렙타비딘 (Endogen, 미합중국) 100 ㎕를 첨가하고 어두운 곳에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 세척용 완충액으로 세척한 다음, TMB 기질 (Sigma, T-3405)을 이용하여 30분간 반응시키고 2 M의 황산을 첨가해 반응을 종료하였다. 그런 다음, 570 nm에서 흡광도를 측정하 여 표준 용액을 기준으로 계산하여 발현된 양을 결정하였다 (참조: 도 10a 및 10b).
첨부 도 10a는 수지상 세포를 처리하지 않은 상기 실시예 5의 초기 당뇨 발증을 나타내는 마우스로부터 분리된 임파절 세포에서 생성된 사이토카인이고, 도 10b는 수지상 세포에 의해 당뇨가 치료된 마우스로부터 분리된 임파절 세포에서 생성된 사이토카인이다. 도 10a에서 확인할 수 있듯이, 수지상 세포를 처리하지 않은 대조군의 경우에는 췌도 항원 존재 하에서 임파절 세포의 배양 시 IFN-γ 발현만 관찰되고 IL-4는 거의 발현되지 않았다. 한편, 도 10b에서 확인할 수 있듯이, 수지상 세포의 투여에 의해 당뇨가 치료된 NOD 마우스의 경우 추출한 췌장 임파절 세포 배양에서 췌도 항원의 농도에 비례하여 IFN-γ 뿐만 아니라 IL-4의 발현도 크게 증가함을 나타내었다.
상기 실험 결과는 수지상 세포의 처리에 의해 당뇨 초기 Th1 형의 자가면역반응성 T 세포 중 상당수가 Th2 형으로 전환되었거나 또는 새로이 췌도 항원 특이적인 Th2 형이 발생하여 자가 면역반응성 T 세포의 활성을 억제함으로써 췌도염의 진전을 막아 당뇨 증상이 치료되었을 가능성을 보여준다.
실시예 10: 전자현미경을 이용한 CD11b
-
/CD8α
+
수지상 세포의 형태 관찰
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 ICR 마우스로부터 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 분리하여 PBS로 세척한 다음, 2% 파라포름알데히드와 2.5% 글루타르알 데히드 혼합액 (4℃, pH 7.2)으로 2시간 동안 전고정 (pre-fixation) 하고 0.1 M PBS로 3회 세척하였다. 이어, 동일 완충용액과 1:1로 혼합한 1% OsO4 (4℃, pH 7.2)로 1시간 후고정 (post-fixation) 하였다. 고정이 끝난 실험재료를 동일 완충용액을 사용하여 충분히 세척하고, 에탄올로 농도를 증가시키면서 (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 무수Ⅰ, 무수Ⅱ) 탈수하였다. 탈수가 끝난 시료는 프로필렌 옥시드로 치환하여 투명화 (clearing)시킨 후, 에폰-아랄다이트 (Epon-Araldite) 혼합액 (Poly/Bed 812 Embedding Media, Polysciences Inc.)으로 포매하여 60℃에서 28시간 동안 열중합시켰다.
포매된 조직은 울트라마이크로톰 (LKB-Ⅴ)을 이용하여 먼저 준초박절편 (semithin section)으로 제작한 다음, 1% 보락스에 용해된 1% 톨루이딘 블루로 핫 플레이트 (60℃) 상에서 염색하고, 광학현미경으로 관찰하였다. 이어, 초박절편 (thin section)을 제작하여 니켈 그리드에 부착시킨 다음, 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트로 이중 염색하여 JEM 100 CX-II형 (JEOL Co., 일본국) 투과전자현미경으로 80 kV에서 관찰 및 촬영하였다 (참조: 도 11).
첨부 도 11에서, A 패널은 IFN-γ가 처리되지 않은 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포에 대한 것이고, B 패널은 IFN-γ를 처리한 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포에 대한 것이다. 도 11에서 확인할 수 있듯이, IFN-γ를 처리하지 않은 세포의 경우에는 처음 분리되었을 때와 동일하게 소포체가 잘 발달되어 있으며 핵막과 염색체의 구조가 분명하게 관찰되었으나, IFN-γ를 처리한 세포의 경우에는 소포체의 구조가 사라지고 형질구 (plasmasytoid)의 형태도 현저히 바뀌며 핵막의 구분이 희미해지고 염색체도 풀리어 사라지는 모습을 나타내며 더욱이 세포막은 수지상의 돌기가 많이 나타나는 형태학적 소견을 보였다. 상기한 형태적 변화는 일반적으로 성숙된 수지상 세포에 나타나는 현상으로서, IFN-γ의 처리로 미성숙 단계의 임파성 수지상 세포가 기원은 다르지만 활성화된 골수성 수지상 세포처럼 성숙된 수지상 세포의 형태로 분화됨을 보여주는 것이다.
실시예 11: 정상인의 혈액에서 CD11c
-
/CD4
+
/CD86
-
수지상 세포의 분리
마우스의 CD11b-/CD8α+
수지상 세포 아군은 사람에서는 나타나지 않는 표현형이다. 이에, 본 발명자들은 CD11b-/CD8α+
수지상 세포에 대응되는 사람의 수지상 세포를 다음과 같은 근거에 기초하여 CD11c- 수지상 세포로 판단하였다: 도 12에서 A 패널은 사람의 말초혈액으로부터 분리한 CD11c- 수지상 세포 그리고 B 패널은 CD11c+ 수지상 세포의 형태학적 특징을 나타내는 것이다. 도 12는 CD11c- 수지상 세포의 전자현미경적 형태를 종래의 문헌 (J. Immunol. 163:3250-3259(1999))에서 발췌한 것으로서, 소포체 (endoplasmic reticulum; ER)의 발달, 분명한 핵막 및 염색체의 형태 등의 전자현미경적 소견이 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포와 매우 유사하다 (참조: 도 12의 A). 또한, CD11c- 수지상 세포가 임파성 수지상 세포로서 면역 조절 및 면역 관용에 관여할 가능성을 보인 연구 결과 (O'Doherty 등, Immunology 82:487-93(1994))도 본 발명자들의 결론을 뒷받침하는 것이다. 결국, 상술한 사실에 기초하여 본 발명자들은 사람의 혈액에서 CD11c- 수지상 세포를 다음과 같이 분리하였다 (참고; 도 1 e-f):
실시예 11-1: PMBC로부터의 분리
MACS사의 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제시하는 방법을 변형하여 다음과 같이 사람의 혈액에서 CD11c- 수지상 세포를 분리하였다: 우선, 정상인의 혈액을 류카페레시스 (leukapheresis)하여 얻은 백혈구 농축액을 PBS 용액으로 3배 희석한 다음, 30 ㎖ 당 10 ㎖의 파이콜-하이파크 (Hypaque)를 용기 바닥에 첨가하고 2000 g로 30분 동안 상온에서 원심분리하여 중간층에 모이는 세포층을 수획하였다. 이어, 수획한 세포들을 PBS 용액으로 3 번 연속적으로 세척하였고, 이 과정에서 원심분리 속도는 1600 g, 1200 g 및 900 g로 순차적으로 낮추어가며 5분간씩 진행하였다. 이렇게 분리된 PBMC (peripheral blood mononuclear cells)의 세포수를 측정한 뒤 각 2.5 x 108 - 3 x 108개의 PBMC로부터 다음과 같은 방법으로 CD11c- 수지상 세포를 분리하였다 (도 1e).
우선, 상기 분리된 2.5 x 108 - 3 x 108개의 PBMC를 20 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 0.5% BSA가 첨부된 냉장 PBS용액)으로 세척하였다. 이어, 전체 부피가 1.2 ㎖가 되도록 MACS 용액으로 조정하고 세포들을 균일하게 잘 혼합한 다음, 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제공하는 FcR 블록킹 용액 0.4 ㎖과 햅텐-Ab 칵테일을 0.4 ㎖ 넣어 냉장 상태에서 20분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 40 ㎖의 MACS 용액으로 두 번 세척하고 원심분리를 실시하였으며, 원심분리 시마다 세포 상등액을 음압을 사용하여 최대한으로 제거하였다. 그리고 나서, 전체 부피가 3.6 ㎖이 되도록 세포들에 MACS 용액을 첨가하고 세포를 균일하게 잘 혼합한 다음, MACS 항-햅텐 자석 구슬 용액 0.4 ㎖과 잘 혼합하여 냉장 상태에서 20분 동안 반응시켰다. 별도로, 냉장 상태의 CS 컬럼 (Miltenyi Biotec 제품#130-041-305)을 자성 분리대 (VarioMACS: Miltenyi Biotec 제품# 130-090-282)에 고정하고 60 ㎖의 MACS 용액으로 컬럼을 세척하였다.
상기 반응이 끝난 2 ㎖의 세포 용액을 상기 CS 컬럼에 통과시키고 30 ㎖의 MACS 용액으로 세척한 다음, 컬럼에 부착되지 않고 빠져나온 세포들을 수거하였다. 이어, 세포수를 측정하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 그런 다음, 107개 세포당 70 ㎕되게 MACS 용액으로 잘 혼합하고 15 ㎍의 CD11c 항체 (1㎍/㎕: BD제품# 30480D) 및 70 ㎕의 CD14 항체를 넣고 냉장 상태에서 20분 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 3 ㎖의 MACS 용액으로 두 번 세척하고 원심분리를 실시하였으며, 원심분리 단계마다 세포 상등액을 최대한 제거하였다. 이어, 전체 부피가 70 ㎕이 되도록 세포들을 MACS 용액으로 균일하게 혼합한 후 마우스 IgG 특이적 항체가 부착된 자석 구슬용액 (Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads: Miltenyi Biotec 제품# 130-048-401) 30 ㎕와 혼합하여 15분 동안 4-6℃에서 반응시켰다. 그런 다음, 3 ㎖의 MACS 용액을 넣고 원심분리하여 세포에 붙지 않은 남은 자석 구슬을 가급적 완전히 제거하였다.
이어, 세포들을 0.5 ㎖의 MACS 용액에 잘 혼합한 후 MS 컬럼에 통과시켜 자성 표지된 세포들을 제거하였다. 컬럼을 0.5 ㎖의 MACS 용액으로 3번 세척한 후 자성 표지되지 않은 세포들을 원심분리하여 수거하였다. 전체 부피가 0.2 ㎖이 되도록 MACS 용액으로 조정하고 원심분리된 세포들을 잘 혼합한 다음, 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제공하는 CD4 자석 구슬 용액 0.2 ㎖과 혼합하여 냉장 상태에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 8 ㎖의 MACS 용액을 넣고 원심분리하여 세포에 붙지 아니한 남은 자석 구슬을 가급적 완전히 제거한 다음, 세포들을 0.5 ㎖의 MACS 용액에 잘 혼합한 후 MS 컬럼에 통과시켜 자성 표지되지 않은 세포들을 제거하였다. 그런 다음, 컬럼을 0.5 ㎖의 MACS 용액으로 3번 세척하고, 컬럼에 부착된 세포들을 선택적으로 수거하기 위하여 컬럼을 자성 분리대 (VarioMACS:Miltenyi Biotec 제품# 130-090-282)로부터 분리하였다. 그리고 나서, 상기 컬럼을 15 ㎖ 원심분리 용기 위에 올려놓고 1 ㎖의 MACS 용액을 첨가한 다음, 주사기 밀대로 살짝 압력을 가하여 컬럼내에 남아있는 세포들을 원심분리 용기에 수거하였다. 이렇게 자성으로 선택된 세포들을 다시 MS 컬럼 (Miltenyi Biotec 제품# 130-042-201)에 통과시켜 자성 표지되지 않은 다른 세포들을 다시 한번 제거하였다. 이어, 0.5 ㎖의 MACS 용액으로 세 번 세척한 뒤 상술한 바와 동일한 방법으로 MS 컬럼에 선택되어 남아 있는 세포들을 1 ㎖의 MACS 용 액으로 분리하였다. 최종적으로, 원심분리로 세포를 수집하고, 유세포 형광측정 방법에 의해 CD11c-/CD4+/CD86- 수지상 세포의 분리 순도를 확인하였다.
실시예 11-2: 비장 세포로부터의 분리
사람의 비장세포에서 CD11c- 수지상 세포를 분리하는 방법은 MACS사의 혈액 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec 제품# 468-01)에서 제시하는 방법을 변형하여 다음과 같이 CD11c- 수지상 세포를 분리하였다:
우선, 콜라겐나아제 처리 방법으로 사람의 비장 세포들을 유리하여 낸 다음, PBMC 분리시 사용하는 표준화된 Ficoll 원심분리조건에서 원심분리하고, 경계층에 있는 비장세포를 수확하여 PBS 용액으로 세척한다. 분리된 비장세포 중 3 x 108 개만 취하여 20 ㎖의 MACS 용액 (2 mM EDTA, 0.5% BSA가 첨부된 냉장 PBS용액)으로 세척하였다. 이어, 전체 부피가 1.2 ㎖가 되도록 MACS 용액으로 조정하고 세포들을 균일하게 잘 혼합한 다음, 위에서 기술한 혈액 수지상 세포 분리 방법과 동일한 방법으로 CD11c-/CD4+/CD86- 수지상 세포를 분리하였다 (도 1f). 한편, CD11c+ 세포를 제거하는 단계를 생략한 경우에도 약 86 % 순도로 CD11c-/CD4+/CD86- 수지상 세포를 분리할 수 있었다.
실시예 12: 제 1 형 당뇨병 환자에 대한 수지상 세포의 치료 효과
상기 실시예 11에서 분리된 CD11c-/CD4+/CD86- 수지상 세포를 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 IFN-γ로 처리한다. 이어, CD11c-/CD4+ 수지상 세포의 배양물을 원심 분리기로 침전시킨 다음, 상등액을 버리고 생리식염수를 첨가한다. 그런 다음, 제 1 형 당뇨병 환자의 복강 내에 주사한다. 그리고 나서, 혈당량의 변화를 측정하여 당뇨 증상의 치료 효과를 확인한다.
실시예 13: 콜라겐으로 유발한 류마티스 관절염 모델 마우스에서 수지상 세포의 치료 효과
실시예 13-1. DBA/1 마우스에서 콜라겐으로 류마티스 관절염의 유발
5-6 주령의 웅성 DBA/1 마우스 (Jackson Laboratory, 미합중국)를 이용한다. 소 제 Ⅱ 형 콜라겐 (Sigma, 미합중국)을 0.05 M 아세트산 용액에 최종 농도 2 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 다음, 교반기를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 흔들어 용해한다. 용해한 콜라겐을 동일 용량의 완전 프룬드 아쥬번트 (complete Freund's adjuvant: CFA)에 혼합하고, 마우스 당 100 ㎍을 꼬리 시작 부위에 피내주사한다.
3주 후 100 ㎍의 콜라겐을 동일 용량의 불완전 프룬드 아쥬번트 (incomplete Freund's adjuvant: IFA)에 용해하여 동일 부위에 주사한다. 최초 투여 후 4주에 40 ㎍의 LPS를 복강내로 투여하여 관절염 발증을 동기화시킨다 (참조: SH Kim 등, J. Immunol., 166:3499-3505(2001)).
실시예 13-2. 수지상 세포 아군의 관절염 치료 효과 확인
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 정상의 DBA/1 마우스의 비장으로부터 CD11b-/CD8α+/CD86- 수지상 세포를 분리하고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 IFN-γ로 처리한 다음, 상기 실시예 12-1의 마우스의 다리의 관절내에 국소 투여하여 관절염 치료 효과를 확인한다.
관절염의 중등도 평가는 아래와 같은 방법으로 점수화하여 평가함으로써 수지상 세포의 치료 효과를 검증한다 (SH Kim 등, J. Immunol., 166:3499-3505( 2001)): 중등도 0: 부종이나 종창이 없는 경우; 중등도 1: 족근골이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적; 중등도 2: 발목 관절에서 족근골에 걸친 경한 부종과 발적; 중등도 3: 발목 관절에서 중족골에 걸친 중등도의 부종과 발적; 및, 중등도 4: 발목에서 발가락 전체에 걸친 심한 부종과 발적, 특히 발목 및 발가락의 기형과 강직이 발생한 경우.
평균 관절염 지수 (Mean arthritis index) = 전체 마우스의 4 다리의 중등도의 합/전체 마우스의 수
관절염이 생긴 다리의 평균 다리수 (%) = 중등도 2 이상의 관절염을 가진 다리의 수/전체 다리의 수 x 100
부종도 = 전체 마우스의 4 다리의 두께의 합/전체 마우스의 수
실시예 13-3. 치료 효과의 조직학적 검사
상기 실시예 13-2에서 CD11b-/CD8α+ 수지상 세포가 투여된 마우스의 발 관절을 신선하게 분리하여 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 다음, 15% EDTA와 30% 글리세린이 포함된 용액으로 탈칼슘 (decalcification) 시키고, 일반적인 알코올 탈수 및 파라핀 포매 과정을 거친 후 5 ㎛ 두께로 박절하여 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 으로 염색하여 골부식도와 단핵구 침윤정도를 관찰하여 치료 정도를 평가한다 (참조: SH Kim 등, J. Immunol., 166:3499-3505, (2001)).
실시예 14: 류마티스 관절염 환자에 대한 수지상 세포의 치료 효과
상기 실시예 10에서 분리된 CD11c-/CD4+/CD86- 수지상 세포를 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 IFN-γ로 처리한다. 이어, CD11c-/CD4+ 수지상 세포의 배양물을 원심분리기로 침전시킨 다음, 상등액을 버리고 생리식염수를 첨가한다. 그런 다음, 류마티스 관절염 환자의 관절내에 주사한다. 그리고 나서, 관절염의 치료 효과를 확인한다.
이상으로 본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아니라는 것은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (19)
- CD11c-/CD8a+ 또는 CD11b-/CD8a+ 표현형을 가지는 임파성(lymphoid) 수지상 세포를 IFN-γ로 처리하여 얻어지는 수지상 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제 1 형 당뇨병의 면역치료용 약제학적 조성물.
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- 제 1 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 자가면역 Th1 림프구를 Th2 림프구로 전환하거나 또는, 새로운 Th2 림프구를 발생시킴으로써 자가면역반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 사람의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로 부터 분리된 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 동종이형(allogeneic) 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- CD11c-/CD8a+ 또는 CD11b-/CD8a+ 표현형을 가지는 임파성(lymphoid) 수지상 세포를 IFN-γ로 처리하여 얻어지는 수지상 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스성 관절염의 면역치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 얻어지는 수지상 세포는 CD11c-/CD8a+/CD86+ 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 미성숙 임파성 수지상 세포에 INF-γ를 처리함으로써 성숙된 수지상 세포를 준비하는 단계, 상기 미성숙 임파성 수지상 세포는 마우스 CD11b-/CD8a+에 대응되는 해당 포유동물의 수지상 세포인 것을 특징으로 함; 및치료학적으로 유효한 양의 상기 성숙된 수지상 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 제 1 형 당뇨병의 면역치료 방법.
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- 미성숙 임파성 수지상 세포에 INF-γ를 처리함으로써 성숙된 수지상 세포를 준비하는 단계, 상기 미성숙 임파성 수지상 세포는 마우스 CD11b-/CD8a+에 대응되는 해당 포유동물의 수지상 세포인 것을 특징으로 함; 및치료학적으로 유효한 양의 상기 성숙된 수지상 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 류마티스성 관절염의 면역치료 방법.
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- 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 성숙된 수지상 세포는 자가면역 Th1 림프구를 Th2 림프구로 전환하거나 또는, 새로운 Th2 림프구를 발생시킴으로써 자가면역반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역치료 방법.
- 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 인간을 제외한 포유동물의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로 부터 분리된 것임을 특징으로 하는 면역치료 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 수지상 세포는 동종이형(allogeneic) 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 면역치료 방법.
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- 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 방법은 추가적으로 교차-동종이형(trans-allogeneic) 수지상 세포로 부스팅(boosting)시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역치료 방법.
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