JP2547162B2 - 哺乳動物における異系移植片拒否反応を抑制するための方法と組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は哺乳動物における免疫応答を抑制するための
方法と組成物に関する。更に詳しくは、それにより限定
されないが、本発明は外来組織の導入に対して哺乳動物
の免疫応答を抑制及びコントロールするための調剤処方
と方法とに向けられる。その発明は又、移植器官と組織
の遷延生存のための方法を含む。

発明の背景 器官と組織の外科的な移植の成功は、移植受容体の免
疫応答の変調に臨床家の能力が大きく依存する。殊に免
疫学的な応答は、もしその組織が生存し機能しているな
らばコントロールすることが必要な外来組織の移植に対
して向けられる。通常、皮膚、腎臓、肝臓、膵臓と心臓
は、同種異系の移植が実行されたところの主要な器官又
は組織である。それは、“非−自己”組織と移植された
器官に存在しそれ以後に増す免疫応答のような移植器官
の認識する移植受容体の通常の免疫作用システムである
と長い間認識されていた。その阻止されない、免疫応答
は、最終的な結果として、生物学的な作用の消失又は移
植された器官の死滅になるであろう細胞と蛋白質の純化
を産むであろう。

組織と器官の移植受容体は、移植された器官又は組織
に対する移植受容体の免疫応答を抑制するための努力に
おいて１又はそれ以上の細胞毒性の薬剤によって一般に
治療される。例えば、シクロスポリン（シクロスポリン
Ａ）、11アミノ酸残基よりなるサイクリック・ポリペプ
チドと、トリポクラディウム・インフラツム（Tolypocl
adium inflatum Gams）種のカビによる生産物は、同種
異系移植片の腎臓、肝臓、膵臓と心臓（すなわち、当該
ドナーと受容体は同種の哺乳動物である）の移植受容体
に投与されるために選択される一般の薬である。しかし
ながら、シクロスポリンの投与は、高血圧と同様に腎臓
と肝臓毒性を引き起こすことのできる薬のように欠陥を
無くすることができない。さらにシクロスポリンの使用
は悪性（例えばリンパ腫）を生じ、そして薬によって長
期間治療を受けている患者に誘因されるその免疫抑制の
“グローバルな”自然発現のため日和見的感染を生じ得
ることになり、即ち、病因性微生物に通常の防御的免疫
応答する宿主はこれらの薬によって引き起こされた感染
の危険性を増しそれによってダウンレギュレーションと
なる。

予備試験結果としてFK−506（シクロスポリンのよう
な作用と類似様式を有する）が示されており、その免疫
抑制の性質はシクロスポリンと同じく有効であり、シク
ロスポリンより毒性の副作用がわずかでしかない。しか
しながら、FK−506の研究報告は初期の段階でしかな
く、一般に広く利用可能ではない。それ故に、この薬剤
の使用は制限される。

他の薬及び／又は、同種異系片又は同種移植片の拒否
反応を抑制するための通常の投与（シクロスポリンと結
合して又は単独のいずれか一方）は又、非−特異性の免
疫抑制性の薬又は治療である。ステロイド、プレドニゾ
ンとメチルプレドニザロンと同等物と、アザチオプリン
（６−メルカプトプリンの類似物）は、移植受容体にお
ける同種移植片の生存を延長するために使用される非−
特異性の免疫抑制薬剤中にある。

Ｔ細胞上にあるCD3抗原に対して支持されたOKT3モノ
クローナル抗体は、非−特異性の免疫抑制治療薬として
使用されている。しかし、OKT3モノクローナル抗体は、
ネズミの生体と患者に、同様のモノクローナル抗体がこ
れら外来の蛋白質に対する免疫応答の増加を与える。そ
れ故、同様の材料の使用は制限される。

上記の薬剤と抗体の別の不利益は、同種異系移植片の
拒否反応を抑制するためにそれらに無期限に投与しなけ
ればならないことと、発育しない外来組織耐性にある。

全リンパ系照射（Total lymphoid irradiation;TLI）
は、同種異系片の生存を延長するように臨床的及び実験
的に用いられている非−特異性免疫抑制の治療法の更に
別な形態である。TLIのための曝露照射と治療スケジュ
ールはホジキン病の治療のために発展し、そして免疫抑
制があることが続いて見出された。けれども、TLIは上
述した“グローバルな”免疫抑制の生産を誘因し、他の
グローバルな免疫抑制の治療法と同様の制限を有してお
り、それは同種異系片の組織に特異的な耐性を誘因する
ことで表される使用において一般的な免疫抑制の唯一の
形態である。しかしながら、TLIは施行が煩わしく、ま
た発展の早期の段階においてであり、故にその使用は制
限される。

抗原の経口とエアゾール投与は又、哺乳動物における
免疫応答をこれら抗原により抑圧するための効果的な手
段として認められている。経口ルートを経て抗原を投与
することの有利性は、技法の単純性、それは：その方法
に由来する多くの同様の技法の便利性がその調査又はそ
の調査又は治療の容易性で元の位置に進展できること、
その安全性について、摂取ルートの非−毒性効果；また
は抗原を供給可能な特異性を含んでいる。

幾つかの自己免疫疾患のモデルについての最近の研究
は、自己抗体に対して向けられ、そして又、特異的な自
己免疫疾患の誘導から治療動物を守るその免疫応答の少
なくとも一部を抑制することのできる抗原を経口投与す
ることを説明している。例えば、各種動物モデルは、自
己免疫の病気であるタイプ１糖尿病の研究のために利用
可能である。これらには、BBラット（Nakbookda,A.F.,e
t al.,Diabetologic 14:199−207,1978）と、NOD（非−
肥満糖尿病;non−obese diabetic）マウスでそれは自然
進展糖尿病（Prochazka et al.,Science 237:286,198
7）である、が含まれる。島細胞、特に、CD4−とCD8−
陽性Ｔ−リンパ球は、島状ベータ細胞に損傷を与える原
因となる作因的薬剤として包含されており、同様のこと
が新生動物に感化された成体からリンパ球を移植するこ
とによって示されている（J.Exp.Med.166:823,1987）。

実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）は、ヒトの疾患
の多発性硬化症（MS）のための動物モデルとして広く使
用される、ミエリン塩基性蛋白質（MBP）に対して向け
られた自己免疫疾患に介在したＴ細胞に誘導される。EA
Eは完全フロイントアジュバントと同様に、MBPと強いア
ジュバントの静脈内投与によって小さい動物中で誘引さ
せることができる。この治療は、MSの特徴と一緒に単相
性の自己免疫疾患を急激に誘因する。

ウェィナーらの、1990年10月10日提出、表題「インシ
ュリンの経口投与によるタイプ１糖尿病の治療と予防の
方法」の米国特許出願には、タイプ１糖尿病に罹患し又
はその特徴を有する自己免疫疾患の危険のある哺乳動物
を治療するために使用されるインシュリンを含めた経口
とエアゾールの組成物と調剤上の処方が開示されてい
る。

ウェィナーらの、1990年２月21日提出の米国特許出願
第460852号（PCT出願No.PCT/US88/02139,1988年６月24
日提出の国内段階）は、米国特許出願第065734号（1987
年６月24日提出）の一部継続出願であり、自己抗原の経
口投与による自己免疫疾患の治療が一般に開示されてい
る。

ウェィナーらの、米国特許出願第454486号（1989年12
月20日提出）は、Ｔ細胞を介した自己免疫疾患を治療す
るための効果的な方法として、自己抗原、その自己抗原
の疾患−抑圧断片とそれらの類似物のエアゾール投与が
開示されている。

ウェィナーらの、米国特許出願第487732号（1990年３
月２日提出）は、Ｔ細胞を介した自己免疫疾患のための
効果的な治療として、自己抗原、その自己抗原の疾患−
抑圧断片とそれらの類似物の経口投与と一緒に用いるた
めのシネルギスト（エンハンサー）が開示されている。

ウェィナーらの、米国特許出願第551632号（1990年７
月10日提出）は米国特許出願第379778号（1989年７月14
日提出）の一部継続出願であり、精製されたＳ抗原、イ
ンターフォトレセプター・レチノイド結合蛋白質（Inte
rphotoreceptor Retinoid Binding Protein;IRBP）抗原
又はそれらの疾患抑圧断片の経口投与によって哺乳動物
におけるブドウ膜網膜炎を予防する又は治療する方法が
開示されている。

ナグラー−アンダーソンらの文献（Nagler−Anderso
n,et al.,（Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）83:7443−744
6,1986）には、マウスのモデルにおけるコラーゲン−誘
因性の関節炎を抑制するコラーゲンの経口投与が記載さ
れている。

しかしながら、上述した参考資料には、哺乳類の移植
片拒否反応のメカニズムを抑制するための抗原の使用が
開示されておらず、何故ならば、異系移植片拒否反応を
予防できる移植抗原の経口投与の原理について示されて
無いからである。

本発明は、外来組織移植への耐性を誘因する経口とエ
アゾールのルートを経たアロ抗原の移植受容哺乳類への
臨床的投与を提案する。その発明は、骨髄を含めた器官
移植の分野において最初の有益なものであろう。たとえ
以前の研究が腎臓移植の生存を延長することが可能なよ
うに、受容体にアロ抗原を静脈内に注射すること（Tran
splantation 39:56,1985;J.Immunol.121:1480,1978;J.E
xp.Med.149:1042,1979）が示されていても、それにより
調製された経口又はエアゾール形態のそれら抗原を紹介
している開示又は示唆は無い。

そしてその結果として、本発明の目的は、外来（又は
“非−自己”）組織と器官の哺乳動物への移植（grafti
ng又はtransplantation）における有害な免疫応答を抑
制するための薬剤と方法を提供することである。

本発明の別の目的は、外科的に移植された組織の免疫
拒否反応を抑制するために哺乳動物に投与して良い調剤
上の処方と調合薬を提供することである。

その発明の更に別な目的は、移植された移植又は器官
に存在する哺乳類の免疫応答を抑制するための経口又は
エアゾールのルートを経て哺乳動物に投与して良い合成
組成物と調剤上の処方とを提供することである。

本発明のこれらと他の目的は、以下に照らして当業者
であれば明白になるであろう。

発明の要約 非限定的な実施例として異系の脾臓組織と、培養され
たリンパ球と、特異的な主要組織適合抗原系（MHC）の
抗原が含まれる、特異的な抗原の薬剤を備えた組成物
は、外科的に移植された“非−自己”の器官又は組織へ
の哺乳類の免疫応答を抑制するために経口又はエアゾー
ルのルートを経て哺乳動物に投与することができるとい
う今迄に予想し得ないことが発見された。なぜならその
効果は、組織ドナーと受容体との間に差があり、これら
抗原の単独での投与は有効であることが予測される脾臓
細胞の表面上に存在するMHC分子に従属するからであ
る。

異系の脾細胞を経口投与することは、抗原特異性手法
における外科的に移植された“非−自己”組織に対して
移植手術のすぐ後に通常起こる宿主哺乳動物の免疫応答
を抑制することができる。そこではまた、異種の脾細胞
組織調製物の経口摂取は、哺乳動物における遅延型過敏
症と混合されたリンパ球反応を押し下げることが見出さ
れた。異種の脾細胞の経口投与のための組成物と調剤上
の処方は、天然の同種異系の組織から調製されるであろ
う。ヒトに投与するための同様の組成物は、抗原の派生
的な合成物、すなわちMHC抗原のペプチド断片を備えて
いる。

本発明の方法を実行する上で、抗原の合成物又は天然
の同種異系の脾臓又はリンパ球の組織又は派生的な細胞
を含む調剤上の処方は、器官又は組織の移植手術よりい
くらか以前に調製され、そして目的哺乳類に経口的に投
与される。

加えて、エアゾール・デリバリー・システムは、上記
のような脾細胞から派生又はMHC抗原の必須の投薬とと
もに、調剤上適当な媒体（キャリヤ）又は希釈剤とから
調製することができる。そのエアゾール処方は、エアゾ
ールのルートを経て、移植手術の以前のいずれかの時に
また投与することができる。これらと他の改良は以下の
記載、図面と付属のクレームにおいて開示されるであろ
う。

図面の簡単な説明 図１は、混合リンパ球反応（MLR）による同種異系の
脾細胞の給餌の効果を示すグラフである。

図２は、混合リンパ球反応による同種異系の脾細胞溶
解産物の給餌の効果を示すグラフである。

図３はアロ抗原に経口耐性の動態を示すグラフであ
る。

図４は遅延型過敏症（delayed type hypersensitivit
y;DTH）反応による同系又は異系の脾細胞の給餌の効果
を描写するグラフである。

図５はリンパ球組成物による異系脾細胞の給餌の効果
を示す連続的な蛍光免疫測定（ヒストグラム）である。

図６は、コントロールのラット、同系の脾細胞を給餌
したLEWラット、第３派（WF）脾細胞を給餌したLEWラッ
ト又は異系脾細胞を給餌したLEWラットにおける心臓異
系移植片の生存を示すグラフである。

図７は、皮膚移植受容体のMLRによる脾細胞の給餌の
影響を、コントロール（非−給餌）皮膚移植受容体と比
較して示すグラフである。

発明の詳細な説明 特許出願の全ての内容、この明細書中に関連した特許
と参考文献は、それら全体の中の関係により、これによ
って合併される。

本発明は、例えば、移植手術の後のように、外来組織
の移植に対して向けられる免疫応答を抑制するための既
存の方法の代替のために必要なものを準備する。加え
て、本発明の方法は、その種の治療が必要な哺乳動物に
おいて、器官と組織の同種異系移植片（即ち、同種の個
体からの移植片）の生存を延長させるためになされる。

このように、本発明は異系移植片組織の拒否反応を防
ぐことができ、かくて移植された組織と器官の生存を延
長することの手段を供給する。

今迄予想し得ず発見された同種異系の脾細胞又は合成
MHC抗原（又は免疫抑圧断片又はそれらの類似物）の経
口投与は、移植後の哺乳動物の受容体における移植片の
拒否反応のための典型システムである、イン ピトロで
の混合リンパ球反応を抑制することに有効である。

その発明のための作用又は動作のメカニズムの幾つか
の個々の理論への結び付きを望むことなく、本発明に従
うMHC抗原の同種異系脾細胞又は派生物の経口投与は、
移植片拒否反応の免疫学的なメカニズムに影響を及ぼす
ものと確信される。即ち、ヘルパーＴ細胞の活性化は特
異的サプレッサーＴ細胞の誘因によって減少される。

以下の用語を論じた以下の記載において、その意味は
それらについての以下の記載に帰するものとする。

“経口投与”とは、経口投与と経腸投与（胃への直接
のデリバリー）の両方の意味とする。

“哺乳動物”とは、免疫システムを有しており、それ
故に同種異系移植片の拒否反応に影響され易い何らか生
体を意味するものとする。

“エアゾール”とは、ネブライザーと同じく気圧保持
システムを用いて創作されるであろう個体又は液体の微
粒子に最終的に分割するものに関する。その個体と液体
のソース材料には、MHC抗原及び／又は疾患抑制断片と
この中に定義されたようなそれらの類似物を含む。

投与の“エアゾールルート”は経鼻又は経口の腔を経
ての宿主体へのエアゾール処方のデリバリーを意味す
る。

“主要組織適合抗原系”（MHC）とは、哺乳類細胞表
面の蛋白質の連続した複合体として定義される。そのMH
Cは、組織適合性（又は移植）抗原が存在することと、
通常の（外来の）抗原に対する免疫応答が維持されてい
ることの両方の免疫性の大きな局面において主要な役割
を行う。それらにはMHC蛋白質分子の２つの型、クラス
ＩとクラスIIがある。クラスI MHC蛋白質は実質的に全
ての組織に存在し、そしてクラスII MHC蛋白質は活性化
Ｔ細胞、マクロファージと他の免疫システム細胞の表面
上に存在する。ヒトのMHC遺伝子（HLA遺伝子の座）はヒ
ト第６染色体に位置し、マウスMHC遺伝子はマウス第17
染色体上のＨ−２遺伝子の座中に位置し、それに類似し
たラットMHC遺伝子はRTIとして関連される。

“クラスI MHC抗原”は、全ての有核細胞の表面上に
存在する糖蛋白質の膜と、Ｔ細胞の細胞毒性CD8＋によ
って認識される抗原においての鍵となる役割を行うもの
と定義される。

“クラスII MHC分子”は、MHCの一部を形成する糖蛋
白質の膜であり、そして免疫応答の開始において最も重
要なものである。クラスII MHC分子は、Ｂ−細胞、マク
ロファージ、脳の星状細胞、表皮ランゲルハンス細胞、
樹状突起細胞、胸腺上皮とヘルパーＴ細胞を含む免疫シ
ステムの細胞上に主に見出される。クラスII MHC分子
は、細胞移植片拒否反応の間に免疫応答を維持してい
る、抗体生産の刺激を受けている、移植片−対−宿主の
拒否反応と自己（又は自己由来の）抗原、他の徴候の
中、に含まれる。

“MHC抗原”は、クラスＩ及び／又はクラスII抗原の
ような中に定義される。本発明のMHC抗原はクラスＩと
クラスIIの両方を、単独で又は複合したいずれか一方を
含む。

“同種異系移植片組織の抽出物”は、以下の記載のよ
うに同種異系移植のドナーと摘出物から得られた脾細
胞、脾臓組織又は培養されたリンパ球の抽出物として定
義される。

“免疫抑制断片”は幾つかのペプチド又はアミノ酸配
列の一部を含むポリペプチド又は、同種異系移植片の器
官又は組織に対する宿主免疫応答の抑制誘因の能力を所
有している適当なMHC抗原の類似物の一部を意味する。
同様な断片は、MHC分子の全体のアロ抗原的な特性を所
有する必要は無い。

免疫抑制断片の“類似物”は、同様の生物学的活性、
即ち移植された器官又は組織に対する哺乳類宿主の応答
を抑制するための能力、を所有するものについてMHC抗
原の抑制断片の構造上関係する化合物に関する。その用
語は、１又はそれ以上のアミノ酸残基によって潜在的な
移植片受容体の適切なMHC抗原のアミノ酸配列と異なる
アミノ酸配列を有するペプチドを含む。

本発明に使用される疾患抑圧断片と類似物は既知の固
相合成手法（Merrifield,R.B.Fed.Proc.Am.Soc.Ex.Bio
l.24:412,1962と、J.Am.Chem.Soc.85:2149,1963;Mitche
l,A.R.et al.,J.Am.Chem.Soc.98:7357,1976;Tam,J.et a
l.,J.Am.Chem.Soc.105:6442,1983）を用いて合成でき
る。類似物は、相当するアミノ酸配列の検証と上述した
ペプチド合成手法を用いることによって構築することが
できる。

類似物は、Immunogenetics 29:231−234,1989に開示
されたようなMHC抗原の既知のアミノ酸配列を用いて提
供することができる。

疾患抑圧類似物と断片は、当該技術分野で良く知られ
た組み替えDNA技法を用いて、やはり得ることができ
る。

MHC抗原の疾患抑圧断片とそれらの類似物は、後述す
る実施例１−４のそれらと同じく適切なイン ビボシス
テムを用いた通常的な実験を使って検証することができ
る。

Ｔ−リンパ球は、当該技術分野で良く知られた方法を
用いて潜在的な同種異系ドナーと、Transplantation 4
1;549,1986及びTransplantation 48:639,1989に開示さ
れたような培養と、器官又は組織の異系移植片を受ける
又は受けている（以下の開示のように）哺乳動物に投与
とから得ることができる。

脾臓組織の抽出物（又は溶解産物）又は培養されたリ
ンパ球は、以下の実施例１中に開示されたそれらと同様
に当該技術分野で良く知られた技法を用いて調製するこ
とができる。

本発明に従えば、通常の組織の典型、当該技術分野で
良く知られるとともに全ての移植ドナーと受容体に通常
的に導入され、ドナーの組織又は器官のMHC表現型を決
定するための潜在的な移植ドナーに実行される。合成MH
C抗原、疾患抑圧断片又はそれらの類似物は上述した技
法を用いて合成することができる。それら抗原及び／又
は断片は、移植を受け、又は“非−自己”組織の移植を
既に受けている患者である哺乳動物、殊にヒトに対して
投与して良い。本発明の方法と組成物は、“非−自己”
器官又は組織の移植を予め受け、そして異系移植片拒否
反応の徴候の開始が現われ始めた（例えば、発熱、移植
された器官の軟化又はそれらの機能の損失）哺乳動物の
治療に使用して良い。その発明の方法と組成物は、その
器官又は組織を保持することと、移植された組織又は器
官に対して支持された受容体の部分的な免疫応答の鎮静
と消失に有効である。本発明の方法と組成物を有効とす
るためには総合的な拒否反応を起こす以前に投与される
必要がある。本発明に従うと、MHC抗原又は移植拒否反
応抑圧断面又はそれらの類似物は、経口又は経腸のルー
トを経て“非−自己”の器官又は組織の移植を、受容す
る、或いは既に受容されている哺乳動物に、１日当り、
体重kg当り約0.1mgから体重kg当り約10mgの間の量を摂
取させる。その発明の調剤上の組成物は、経口又は経腸
のルートを経て１回投薬又は複数回投薬状態として投与
して良い。投薬するべき正確な量は、重篤度、患者の症
状の段階、及び患者の臨床的な情況に基づいて変えられ
るであろう。

脾臓細胞、培養されたリンパ球又はそれらの抽出物を
投与する時には、１日当り、体重kg当り約10⁶から体重k
g当り約10⁹細胞の間の相当量が単一又は分割投与により
投与して良い。

そのような治療のタイミングは、もし可能であれば、
本発明の調剤上の処方又は投与形態は移植が実行される
約７日前から約14日前の間に投与されるべきである。そ
の治療は好ましくは、宿主（受容体）の生体内に導入さ
れている器官又は組織が移植される少なくとも約６ヶ月
後まで継続し、さらに必要か又は要求されたなら不定期
で継続させる。

加えて、もし移植受容体に（本発明の組成物を既に受
けているか又はそうでないうちの一方）、拒否反応の明
白な徴候が開始されていたならば、本発明の調剤処方
は、増加した量及び／又は頻繁に投与されるであろう。

本発明は又、移植された器官又は組織の生存を延長す
るため又は拒否反応を抑制するために哺乳動物に投与す
るための経口投薬形態と調剤上の処方とに向けられる。
本発明の治療に従う移植片の生存における延長の幾つか
の統計学的に意味のあることは本発明の範囲に入るとい
うことは理解されるであろう。

本発明の経口調剤処方は又、調剤上受諾し得る媒体、
希釈剤、充填剤、可溶化又は乳化用の薬剤と、当該技術
分野で良く知られたタイプの塩類を含む不活性成分を包
含する。例えば、錠剤とカプレットは、当該技術分野で
良く知られたスターチやベントナイトと同様の固体媒体
を使用して通常の製造方法に従って調剤されるであろ
う。固体媒体の実施例には、ベントナイト、シリカ、デ
キストロースと他の通常使用される媒体が含まれる。本
発明の処方において使用されるであろう固体媒体と希釈
剤の更なる非−限定的な実施例では、塩類と、pH7−８
のリン酸緩衝溶液のような幾つかの生理学的な緩衝塩溶
液と、水とが含まれる。

本発明において使用されるカプセルは、ゼラチン又は
セルロース派生物と同様の調剤上受諾し得る材料から製
造して良い。該発明の活性な生物学的材料は、経口デリ
バリー・システムで解放を維持する形態及び／又は米国
特許第4704292号（1987年11月３日発行）、米国特許第4
309404号（1982年１月５日発行）と、米国特許第430940
6号（1982年１月５日発行）に開示されたそれらと同様
の経腸用被覆された経口投薬形態で投与して良い。

活性化成分の単位濃度又は、投薬の単位の複数性の投
与により到達することのできる必要とされる有効な量に
由来する移植片の拒否反応を抑制するための有効な量を
厚生するそれ自身必要でない各々の投薬形態の個別の投
薬中に含まれる成分は識別されるであろう。

本発明の投薬形態の投与の好適なルートは、経口又は
経腸である。好適な経口又は経腸の調剤処方又は投薬形
態は、例えば約70mgから約500mgの間のMHC抗原、疾患抑
圧断片又はそれらの類似物又は異系の細胞又はそれらの
抽出物を用いる時には10⁷−10¹⁰細胞の相当量を備えて
いて良い。

本発明の調剤処方に代替するべき本発明の実施態様で
は哺乳動物にエアゾール形態で投与される。エアゾール
形態での投薬を用いる時に移植片拒否反応の抑制を達成
するのに要求されるであろう異系の組織抽出物又MHC抗
原、疾患抑圧断片又はそれらの類似物のより少量である
ことが予想される。これは、ミエリン塩基性蛋白質（MB
P）による実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）の治療、
そしてまたウェイナーらの同時継続米国特許出願第4544
86号（1989年12月20日提出）中に開示されているように
コラーゲンによる関節炎のアジュバントの治療における
ケースに見出されている。エアゾール投薬形態において
投与して良いそのような材料のMHC抗原、疾患抑圧断片
又は類似物の量は、１日当り哺乳動物の体重kg当り約0.
01mgから10mgの間とされるであろう。本発明のエアゾー
ル投薬形態は、１回投薬形態又は複数回投薬形態におけ
るエアゾールのルートを経て患者に投与して良い。投与
するべき正確な量は、その段階と、患者の症状の重さ、
患者の免疫システムの活性と、患者の生理学的なコンデ
ィションに基づいて変えられるであろう。脾臓細胞、培
養されたリンパ球又はそれらの抽出物を投与する時に
は、エアゾール形態により１回又は分割で１日当り体重
kg当り約10⁵から10⁹細胞に相当する量の間で投与して良
い。

本発明のエアゾールの調剤処方は、付属的成分とし
て、調剤上受諾し得る媒体、希釈剤、可溶化又は乳化の
薬剤、そして当該技術分野で良く知られた典型の塩類を
包含して良い。媒体及び／又は希釈剤の特有の非−制限
的実施例では、本発明のエアゾール調剤処方で有効なも
のは、水、通常の塩類と、pH7.0−8.0のリン酸緩衝塩溶
液のような生理学的受諾性の緩衝塩溶液を含む。

有効な可溶化と乳化の薬剤の実施例は、生理学的の平
衡塩溶液、リン酸緩衝塩類と等張塩溶液である。該発明
のエアゾール投薬形態を調製するのに使用して良い塩類
には、ナトリウムとカリウムの調剤上受諾し得る塩類が
含まれる。

本発明のこの代替の実施態様による異系の脾臓細胞、
培養されたリンパ球、それらの抽出物又はMHC抗原又は
疾患抑圧断片又はそれらの類似物の投与のルートは、エ
アゾール又は吸入される形態である。本発明のエアゾー
ル組成物は、乾燥粉末又は水溶液として投与することが
できる。好適なエアゾール調剤処方は、例えば、本発明
の組成物、疾患抑圧断片又はそれらの類似物を約7mgか
ら約700mgの間で含む、生理学上受容可能な緩衝塩溶液
を含んで良い。

不溶性又は液体中に懸濁した状態での脾臓細胞、MHC
抗原疾患抑圧断片又はそれらの類似物から抽出された組
織の固体粒子を細かく細分化した形態の乾燥粉末はま
た、本発明の実施において有効である。本発明の組成物
は、塵状の粉末と、１から５ミクロンの間、好ましくは
２から３ミクロンの間の平均粒径を持つ細分化された微
粒子を備えた形態として良い。細分化された微粒子は、
当該分野で当業者に周知の粉砕機と通常の手法で使用さ
れるスクリーンろ過により調製して良い。その微粒子
は、乾燥した霧状粉末の形態とすることのできる細分化
された材料を予め決定された量吸引することによって投
与して良い。

本発明の調剤処方は、米国特許第4624251号（1986年1
1月25日発行）、同第3703173号（1972年11月21日発
行）、同第3561444号（1971年２月９日発行）と同第463
5627号1971年１月13日発行）に開示されたそれらの実施
例のようなネブライザーによってエアゾールのルートを
経て投与して良い。そのエアゾール材料は治療される対
象により吸入される。

エアゾール・デリバリーの他のシステムでは、例え
ば、気圧調整された投薬吸入測定（metered dose inhal
er;MDI）とニューマンの文献（Newman,S.P.in Arosols
and the Lung,Clarke,S.W.and Davia.D.eds.pp.197−22
4,Butter−worths,London,England,1984）に開示された
ように乾燥粉末吸入器が含まれ、本発明の方法と結合さ
せて用いることができる。

その中に開示された典型のエアゾール・デリバリー・
システムは、Fisons社（Bedford,MA）、Schering社（Ke
nilworth,NJ）とAmerican Pharmoseal社（Valencia,C
A）を含む多くの市販品から利用し得る。

本発明によれば、実験は、移植受容体の免疫応答に関
して殊に注意するべき影響を与えられている、調査され
るLewisラットに対する異系脾細胞の経口投与の影響と
して実行される。この結果として、イン ビトロの混合
リンパ球反応（MLR）、遅延型過敏症（DTH）反応と、イ
ン ビボでの亢進心臓移植拒否反応技法が利用される。
各々のケースにおいて、ドナー動物からの脾臓細胞の経
口投与（“非−自己組織移植の受容体について）は、そ
れらＴ細胞を介する免疫反応を抑制する結果となる。例
えばＴ細胞は本発明の方法と調剤処方の実質的な効力の
立証のためとこれら試験の結果、異系移植拒否反応の主
要な媒介体として包含されている。

本発明は、以下に示された特に実用的な実施例におい
て具体化され、本発明の範囲をそれにより制限すること
無く、本発明を具体化することを意図するものである。

実施例 1:哺乳動物と試験材料の調製 1.材料哺乳動物 試験個体は、Lewis（LEW）、Wistar Furth（WF）とBr
own Norway（BN）の種類（Harlan Sprague Dawley社,In
dianapolis,INより得た）のオスのラットよりなる。以
下に記載した実験におけるラットは、おおよそ８−10週
令で、注意深い監視下で飼育した。

2.経口投与のための脾細胞の調製 新鮮な脾臓組織は、経口投与の直前に同系（同種、同
系）又は異系（同種、異系）の動物より得た。単細胞化
した脾細胞の懸濁物は、新鮮な脾臓を標準ステンレス鋼
のメッシュ（２インチに２インチ）に通してすりつぶす
ことにより調製した。赤血球は当該分野で良く知られた
トリス アンモニウム クロライド緩衝液で特別に崩壊
させ、ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）で２回洗浄し、
そして以下に記載した通り様々な濃度に再懸濁した後、
使用した。

3.脾細胞溶解物の調製 上述した方法により調製した脾細胞は以下の方法にお
いて反復して凍結−融解により溶解させた： （ａ）細胞を30分の間に−70℃で急速凍結し； （ｂ）急速凍結脾細胞を37℃で融解し； （ｃ）この凍結−融解のサイクルを１回以上繰り返
す。

その結果の材料は経口投与のために使用される。

実施例 2:調製された脾細胞懸濁液の経口投与 実施例１において調製した細胞懸濁液の1ml投薬は、
ボール−チップ給餌ニードルを有するシリンジ（Thomas
Scientific,Swedesboro,NJ）で各試験ラットに経口で
投与した。

以下の実験室免疫学的と病理学的方法では、試験ラッ
トのリンパ器官を処理した。

実施例 3:混合リンパ球反応 生存リンパ節は応答体（LEW）と刺激体（WF又はBN）
ラットから取り出した。その切除された節は、次いで上
記のようなステンレス鋼のメッシュを通して押し出し、
そしてリン酸緩衝塩溶液中に懸濁させた。

分離したリンパ節細胞は、ついで２回洗浄し、そして
10％ウシ胎児血清（FCS）、１％ペニシリンとストレプ
トマイシン（Microbiological Associates,Walkersvill
e,MA）、２×10^-5M・２−メルカプトエタノールと、5mM
・HEPESを含んだRPMI 1640媒体中に再懸濁し、６×10⁶
細胞/mlの濃度とした。応答細胞は１穴当り50μｌの96
−穴の平底培養プレート（Costar Cambridge,MA）で、
同量の放射線照射（Shepherd irradiator,モデル143−4
5とセシウム137ソースを用いて3000Radのガンマ線照
射）された刺激体細胞を加え、又は加えることなく培養
した。

処理した細胞は次いで５％CO₂のもとで37℃で培養
し、４日後にそれらは³H−チミジン（１マイクロCi/ウ
ェル、NEN Dupont,Boston,MAより得た）とともに６時間
のパルス標識を行った。増殖細胞はペックマン社製、液
体シンチレーションカウンターによって測定した³H−チ
ミジンの合体量によりモニターした。

抑制分析 得られたリンパ節細胞は放射線照射（ガマン線1000Ra
d）と、ウェル当りのトータルの細胞数を５から20％で
変えた濃度で試験MLRを加えた。コントロールのウェル
は、唯一受容体細胞を有するバックグラウンドのウェル
の間にモジュレータの無い状態でセットアップしたもの
である。これらの培養は37℃で５％CO₂において96時間
インキュベートした。増殖は培養の最終６時間で１マイ
クロCi/ウェルの³H−チミジンによりプレートにパルス
標識することによって分析した。そのプレートは次いで
上述した通り収穫した。

遅延型過敏症 DTH反応 各々のグループのラットは10ミリオンのガンマ照射
（3000Rad）された異系脾細胞をフットパッド中に皮下
に入れ免疫化した。10日後、それらに耳たぶ中に同じ投
薬を再度注射した。その反応は耳の厚みの変化により決
定され、この後と48時間後に試みた。

細胞の型 抽出されたリンパ球の表現型は間接免疫蛍光法と蛍光
活性化細胞分類（FACS）によって試験した。そのリンパ
細胞は、細胞表面マーカーCD4又はCD8に対する第１のモ
ノクローナル抗体、又はマウス免疫グロブリン（Organo
n−Taknica,Westchester,PA）とともに１時間インキュ
ベートし、そして0.02％アジ化ナトリウムを含んだPBS
で２回洗浄した。それらは次いで、FITC−複合のヤギ−
抗−マウスIgG（1:40）（Organon Teknica）と一緒に暗
所で30分、そして15％の自己の通常ラット血清の存在
中、更なるインキュベートを行った。その細胞は完全に
洗浄され、そして試験以前に１％ホルムアルデヒドで固
定した。

加えて、以下の実施例中に記載された典型の外科的な
移植方法を実行した。

実施例 4:心臓異系移植 LEWラットを外科的移植処置の材料とした。促進拒否
反応のモデルは、心臓異系移植の７日前にBN種の全厚皮
膚移植して予備感作し、脾細胞調製物の経口摂取のある
ものと無いもののLEW種ラットを用いた。

７日後、（LEW×BN）F1種の血管化の試験の心臓異系
移植を各々の予備処理されたラットについて実行した。
その心臓移植は下部腎臓の腹部大動脈に吻合した。拒否
反応は受容体の横腹の日毎の触診による決定と、同じく
心拍の完全な休止により定義した。

上述した方法により以下の結果を得た。

I.異系脾細胞調製物の経口投与による混合リンパ球反応
（MLR）の抑制 WFラットからの脾細胞は新しく調製され、そして１−
２週の期間を越えてLEWラットに２、５又は10回、経口
的に投与した。

個々の投薬量は経口投与当り50ミリオンの細胞とし
た。

最終の経口投与の次の７日、リンパ節はWF又はBN刺激
体を用いたMLR調査のためコントロールのグループと脾
細胞を経口で与えたそれらの両方から取得した。図１に
示すように、異系脾細胞を摂取したLEWラットは、WF種
からのリンパ球に対する応答が有意に減少したことを示
している。この現象は原案の３つの給餌全て（即ち、2,
5又は10回）について得られた。しかしながら唯一10回
給餌を受けたグループでは、BN種、第３パーティーコン
トロールに対する抑制を示した。

これらの結果は、異系脾細胞調製物の制限された摂取
がMLRの抑制の特異的な抗原を誘導したことを示す。

II.異系対同系脾細胞調製物の経口投与によるMLRの抑制
の比較 投薬応答の研究は同系対異系細胞の給餌の高価での決
定による結果として処理した。LEWラットは、LEW又はWF
種のいずれか一方からの脾細胞を1,5,25又は50ミリオン
で２回給餌させた。その結果を以下の表Ｉ中に示す。

同系細胞の最も低い投薬量（１ミリオン）での給餌
は、抑制の誘導が無かった。他の全ての投薬、同系と異
系細胞の両方とも、変動の程度に何らかの抑制を示し
た。

III.MLRでの異系脾細胞調製物の摂取された溶解産物の
効果 経口的に耐性を誘導するために生体脾細胞が必要かど
うかを決定するために次にMLRでの単独の摂取された溶
解産物の効果を調査をした。ラットは、生体脾細胞又
は、それに相当する凍結と解凍とを繰り返す方法（上述
した）により調製された溶解産物とのいずれか一方の２
つの分離した経口投薬とし、そしてこれらの処理物の効
果を比較した。図２は細胞溶解産物が単独でもMLRの抑
制に十分であることが示されており、サブ細胞の断片に
は細胞媒介の免疫性を抑制するものが含まれていること
を示唆している。

IV.アロ抗原の経口投与によるMLR抑制の動態 アロ抗原への耐性を経口的に誘導する動態を、分離し
たLEWラットグループに脾細胞を２つの経口投薬形態で
与え、14日、７日、３日及び１日後にMLRを実行するこ
とにより調査した。図３に示すように、経口投薬を１日
又は３日与えた後にMLRを実行したグループでは抑制の
誘導が無かった。最終の経口摂取とMLRの間の間隔が７
日と14日のグループでは、MLRにおける増殖の劇的な縮
少が示され、アロ抗原による経口での非感応の誘導のた
めには４日よりも長く必要であることを示唆している。

V.アロ抗原に対するDTH応答の抑制 イン ビトロでのMLRに加えて、LEWラットによるイン
ビボでの遅延型過敏症（DTH）について異系非細胞摂
取の効果を調査した。LEWラットは同系又は異系（WF）
動物の一方からの脾細胞50ミリオンの10回給餌を経口的
に投与した。最終の経口摂取の後、DTHのための試験
を、それらのフットパッド中の皮下が免疫されている動
物を用いて開始した。その同じ動物は10日後に耳たぶ中
に再度注射した。DTHは実施以前と実施後48時間後の耳
の厚さの変化によって測定した。その結果を図４中に示
した。

WFに応答するDTH中のおおよそ50％の減少が同種の細
胞を給餌したラットについて得られたが、同系LEW脾細
胞を給餌したそれらはなかった。BNに対するDTH応答は
予備処理によって影響されず、DTH抑制は抗原特異性が
あることを示唆している。

VI.MLRにおける増殖減少の仲介に包含される抑制活性 飼育動物中のMLR増殖の阻害のメカニズム研究に従
い、抑制細胞分析は、CD8＋の抑制細胞が観察された結
果に介していることを包含しているかを決定することで
実行した。コントロール又は予備給餌動物のいずれか一
方からのリンパ球は、ガンマ線の1000Rad照射される以
前に、第１のMLRに加えられ、モジュレーターのような
役を果す。

ルイス ラット（3/グループ）は、WF脾細胞の量を変
えて（表中に示されているように）経口的に10回投薬し
て予備処理した。１週間後、それらの首のリンパ節を取
り出し、そしてその細胞をモジュレーターとし、その後
ガンマ線を1000Rad照射した。第１のLEW抗−WFとLEW抗
−BNのMLRと、Con−Ａ刺激培養は上述したように構成し
た。モジュレーター細胞は第１の培養の1/5の比率に加
えた。その結果を以下の表II中に記述する。

表II中の結果は、予備給餌動物からのモジュレーター
の20％添加で示すが、コントロール動物からではなく、
第１のLEW−抗−WFのMLRが抑制された。これは、サプレ
ッサー細胞が給餌の後とMLRの抑制に介在しているこれ
らが誘導されたことを示唆する。

VII.脾細胞摂取動物からのリンパ節細胞の表現型 コントロール又は給餌動物のいずれか一方からの首の
リンパ細胞は、放射線照射されたWF刺激体と５日間培養
し、次いで間接的な蛍光免疫標識によりCD4＋又はCD8＋
細胞のために分類した。その結果は図５中に示したよう
に、異系脾細胞を用いた予備給餌ラットではCD8＋（サ
プレッサーＴ細胞）細胞中に増加を生じ、そしてコント
ロールと比較した時にCD4＋（ヘルパーＴ細胞）細胞が
減少することを示した。

VIII.促進性心臓異系移植拒否反応を予防する脾細胞の
経口投与 異系移植拒否反応の予防を実証するために、上述した
ような促進性拒否反応の移植モデルを用いた。LEWラッ
トは、心臓異系移植試験のBNの血管化とともに実施の７
日以前にBNの皮膚移植によって予備感応させ、試験移植
片の生存率における異系ドナー脾細胞の給餌の効果を調
査することとした。

非感応化コントロールは、第６から第８日を通してそ
れらの間に異系移植心臓が拒否反応を生じ、全ての感応
化コントロール動物は36時間以内にそれらの異系移植心
臓が超急性拒否反応となった。脾細胞50ミリオンの５−
10球餌で飼育した試験動物、７日前に皮膚移植したも
の、又は皮膚移植の日と同等のものでは試験心臓異系移
植の生存率が、7.65±0.5日に増加することが認められ
た。

これらの結果より異系脾細胞の給餌によって感応化
と、急性形態の中へ促進性拒否反応が変換することの予
防を示す。

この徴候の特異性は以下に記載したように検討され
る。

心臓受容体のLEWラットは、非給餌（ｎ＝10）、LEW
（同系）リンパ球給餌（ｎ＝８）、BN脾細胞給餌（しか
しWF心臓異系移植を受容した、ｎ＝６）又はBN脾細胞給
餌（そしてBN心臓異系移植を受容した、ｎ＝８）とし
た。全ての給餌動物は50x10⁶の脾細胞を５−10給餌受容
した。その結果を図６中に示した。

図６から理解できるように、異系脾細胞を単独給餌し
たラットは心臓異系移植の生存日数が３日を越えたこと
を示した。第３種（BN）リンパ球を給餌し、WF移植片を
受容しているLEWラットは心臓異系移植の生存日数の増
加は実証されず、この拒否反応の特異性が実証された。

移植片生存延長のメカニズムの研究のための予備の試
みにおいて、コントロールと感応化して飼育したLEWラ
ットとからの生存リンパ節細胞のMLRは心臓移植の後48
時間で調査した。その結果を図７に示した。

コントロールと比較されるように、給餌動物中の抑制
がある（図７）。これらデータはナイーブな動物モデル
中に見出される以前のMLRと一致する。

フロントページの続き (72)発明者 カーペンター， チャールズ ビィ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02193 ウェスト グレン ロード 242 (72)発明者 セイエ， モハメッド アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02215 ブルックリン メッドフィール ド ストリート 18 (72)発明者 ザング， ゼンギ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02148 マルデン エイヴォン ストリ ート 130 (56)参考文献 特開 昭59−116224（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−99419（ＪＰ，Ａ) Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖ ｏｌ．39，Ｎｏ．１（1985），ＰＰ．56 −62

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】移植ドナーからのMHC抗原を持つ脾臓細
   胞、前記MHC抗原を含む脾臓細胞の溶解産物、前記ドナ
   ーからのMHC抗原を持つ培養したリンパ球、前記MHC抗原
   を含む培養したリンパ球の溶解産物、前記ドナーからの
   MHC抗原、及び前記MHC抗原のフラグメントから選択され
   る薬剤を含み、経口または経腸投与用薬の形態であるこ
   とを特徴とする移植片拒否反応抑制薬。
2. 【請求項２】前記抑制薬が、錠剤、カプセル、カプレッ
   トから選択される固体薬形態であることを特徴とする請
   求項１記載の抑制薬。
3. 【請求項３】前記抑制薬が、水性懸濁液または溶液形態
   であることを特徴とする請求項１記載の抑制薬。
4. 【請求項４】さらに、製薬上許容されるキャリアまたは
   希釈剤を含むことを特徴とする請求項１記載の抑制薬。
5. 【請求項５】移植ドナーからのMHC抗原を持つ脾臓細
   胞、前記MHC抗原を含む脾臓細胞の溶解産物、前記ドナ
   ーからのMHC抗原を持つ培養したリンパ球、前記MHC抗原
   を含む培養したリンパ球の溶解産物、前記ドナーからの
   MHC抗原、及び前記MHC抗原のフラグメントから選択され
   る薬剤を含み、経口または経腸投与用薬の形態であり、
   移植された器官または組織に対する哺乳類の免疫反応を
   抑制することを特徴とする免疫反応抑制薬。
6. 【請求項６】前記MHC抗原が、クラスIIMHC抗原、または
   前記ドナーにシンジェネイックなクラスIIMCH抗原から
   なることを特徴とする請求項５記載の抑制薬。
7. 【請求項７】前記薬が、錠剤、カプセル、カプレットか
   ら選択される固体薬形態であることを特徴とする請求項
   ６記載の抑制薬。
8. 【請求項８】前記薬が、水性懸濁液または溶液形態であ
   ることを特徴とする請求項６記載の抑制薬。
9. 【請求項９】さらに、製薬上許容させるキャリアまたは
   希釈剤を含むことを特徴とする請求項６記載の抑制薬。