JPH09508277A

JPH09508277A - ヒト異種移植における超急性拒絶の管理のための物質及び方法

Info

Publication number: JPH09508277A
Application number: JP7519965A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ピアーズ，マーチン; ジェイ．クロフォード，ロバート; ジェイ．ロビンズ，アラン; ディー．ラスジェン，ピーター; ジェイ．エフ．ダパイス，アンソニー
Original assignee: ブレサゲンリミテッド; セントヴィンセンツホスピタル（メルボルン）リミテッド
Priority date: 1994-01-27
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 1997-08-26
Also published as: WO1995020661A1

Abstract

(57)【要約】ヒトの予め形成された異種抗体は、ヒト異種移植における超急性拒絶反応に重要な役割を果たしている。かかる抗体を除去又は中和する物質及び方法が開示されている。かかる抗体により認識されるドナー臓器内のエピトープを少なくするか又は取り除く物質及び方法も開示されている。かかるエピトープは、酵素α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼによる活性の結果として形成される。α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするブタの遺伝子が開示されており、哺乳動物細胞及び胚内のα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性化（“ノックアウト”）する物質及び方法が同じく開示されている。標的細胞内のα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性化するのに有用な核酸構築物が含まれている。また、培養下にある胚性幹細胞及び始原生殖細胞を維持するのに有用である新規な白血病阻害因子（Ｔ−ＬＩＦ）も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト異種移植における超急性拒絶の管理のための物質及び方法発明の分野本発明は、広義には異種移植の分野に係わる。特に本発明は、ヒトにおける超急性拒絶反応を軽減し除去するための方法及び物質に関する。より特定的には、本発明は、超急性拒絶を軽減し除去するためのヒト血清の処理方法に関する。本発明はまた、α1,3 ガラクトシルトランスフェラーゼを欠いているかその活性が低減された非ヒト臓器を製造する方法及び物質に関する。発明の背景移植のためのヒト臓器の差し迫った不足が世界中に存在することが認められている。法律の改正やこの問題に対する公衆の意識を高める教育プログラムにもかかわらず上記のような状態にある。例えばアメリカ合衆国においては、年間約18 ,000の腎臓が不足している。同様にオーストラリアにおいては1992年に移植を待っている腎臓病患者の41% のみしか移植を受けられなかった。日本では、死亡ドナーからの臓器の使用に対する宗教的な禁忌のために供給と需要の間のアンバランスはさらに大きい。移植の利益は、移植患者の社会復帰率を透析患者のものと比較すると理解できる。オーストラリア及びニュージーランドにおいては、移植患者の大部分(60%) はフルタイムで仕事に就きあるいは就学することができ、さらに10% がパートタイムの仕事につくことができ、7%が仕事をするのに適さないだけである。これに対し、透析患者は23% がフルタイムで仕事に就きあるいは就学することができ、 15% がパートタイムの仕事に就いており、20% が仕事をするのに適さない。残りの患者は「引退」している(Australia and New Zealand Dialysis and Transpla nt Registry（ANZDATA）のレポート第15号、Queen Elizabeth Hospital，Woodvi lle，S.A.，APS Disney，ed．(1992))。オーストラリア及びニュージーランドにおける透析の直接的な経費は患者あたり年間約$A 45,000 である。それに加えて失業及び疾病による間接的なコストは透析患者においてより高く、社会的コストも相当なものである。移植は最初の年に患者あたり約$A 30,000、その後患者あたり年間$A 14,000 の出費を生じさせる。これらの統計によれば、a)移植が最終段階の腎不全の最適な治療であること、b)ドナー腎臓は供給不足であること、c)移植率を高めることを目的とした現在の戦略は成功には程遠いことが明らかである。さらに、心臓、肝臓、肺及び膵臓等のその他の移植可能な臓器の不足も深刻である。異種移植片（種間の移植物）の使用は、移植用のヒト臓器の供給不足を克服する一つの方法である。生存不能な非抗原性の異種移植片は血管再構成（ウシ動脈）や心臓手術（ブタ心臓弁）に通常に使用されている。しかし、過去におけるこれらの随時の使用にもかかわらず、免疫障害のために生存能のある異種移植片の一般的な使用が阻まれてきた。1964年から1991年の間に全部で27のヒト以外の霊長類からヒトへの臓器異種移植が報告されており、報告された最長の患者の生存期間は９カ月であった。現在の免疫抑制治療法が異種移植に起こりやすい重篤な拒絶の問題に対処できるであろうとの予測のもとに、ヒヒからヒトへの肝臓の移植が最近２回行われている。これまでのところ、これらの患者の一人の経過が報告されており、この場合は拒絶が直接の死因ではなかった(Starzl et al.，Babo on-to-Human Liver Transplantation．Lancet 341:65-71 (1993))。この臨床実験は、a)非ヒト臓器が機能でき、ヒト生命を維持できること、b)拒絶エピソードは慣用の抗拒絶療法により克服できること、及びc)拒絶のメカニズムは原理的に同種移植拒絶のものと同じであることを示している。霊長類が異種移植用の臓器の十分な供給源とはなりそうにない。殆どが絶滅に瀕している種であり、野性では繁殖が遅く、捕獲下においては殆ど繁殖しない。ヒヒはこれらの一般的状況の例外であるが、別の不利な点のためにこの種の有用性が制限されている。ヒヒは単胎妊娠し、妊娠期間が長く、飼育するのが難しく費用がかかり、ヒトにとって病原体となる生物、特にウィルスに感染しキャリアとなり得る。心臓及び腎臓では臓器の大きさが考慮され得るが、より小さい霊長類はヒト成人へのドナーとしては不十分である。またサルを使用することは公衆からかなりの反対が起きると考えられる。これらの困難により、非霊長類の種をヒト患者への臓器ドナーとして使用することに改めて関心が寄せられている。ブタはヒトへの異種移植について広く認められた選択肢である。ブタの赤血球直径(6.5μm)及びそれに関連してその毛細血管寸法はヒトに似ており、ヒトの循環系に異種移植片を結合するのが容易である。ブタは飼育下において十分に繁殖し、妊娠期間が短く、多数の同腹児を産む。さらに、ブタは低病原体施設で繁殖させ飼育することができ、任意の大きさに飼育することができ、公衆の反応も霊長類についてのレベルでは起こらないであろう。ブタの臓器をヒト患者に使用することに対する免疫学的障害には、a)移植後数分から数時間の間に発現する即座の重篤な（「超急性」）拒絶症状、及びb)数日から数週間の間に発現する提案されている急性の拒絶がある。一旦超急性拒絶症状が克服されたら、通常の急性の拒絶がそれに続くと予想される。この拒絶の形態は、同種移植片（同一種の個体間の移植物）について見られるものに似ていると考えられ、通常の免疫抑制療法がしやすいはずである。ヒト血清中の前もって形成されている「天然抗体」（異種抗体）及び補体調節因子の両方が超急性拒絶のプロセスに関与していると考えられる。超急性拒絶は、異種抗体がドナー臓器の内皮上のエピトープに結合したときに開始され、古典的補体経路を活性化するものと考えられる。発明の要旨本発明の精製及び単離された核酸分子は図４に示したブタ核酸配列（配列番号７）を含み、これはα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するブタポリペプチドをコードしている。当業者により日常的に生成できるこの配列の変異体は、図４の配列に対応するが、遺伝子コードの縮重の範囲で変化しているものを含む。即ち、本発明は図４に記載された配列の変異体を包含し、これは当業者により容易に決定できるものであり、図４に記載された配列によりコードされたものと同じアミノ酸配列をコードするものである。本発明はさらに、ブタα-1,3 ガラクトシルトランスフェラーゼをコードし、標準的な高ストリンジェンシー条件下で図４に示した配列に相補的な配列と、あるいは遺伝子コードの縮重の範囲の図４に記載された配列の変異体に相補的な配列とハイブリダイズする、精製及び単離された核酸分子を包含する。上記の核酸配列に相補的な鎖は標準的な方法により容易に決定でき、これらも本発明の範囲内にあるものである。上の段落に記載したパラメーターの範囲で、天然遺伝子産物の機能的特徴を保存する、ブタα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼのコード配列の変異体も本発明に含まれる。そのような変異体は、例えば、5'非翻訳領域あるいは開示された配列の種々のコード領域における僅かなヌクレオチド変化を含むものである。コード領域における変化に由来する僅かなアミノ酸変化で、下記に記載する機能的なα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒部位、膜アンカードメイン及びステム領域をそのまま残しているものは本発明の範囲内にあるものである。そのような核酸及びアミノ酸配列における日常的な変化は、本明細書中に示した配列及び構造についての情報に基づき当業者が確定できるものである。本明細書で使用する「高ストリンジェンシー条件」とは、核酸ハイブリダイゼーションについて広く認識されているプロトコルに説明されている高ストリンジェンシーの標準的な条件を示すものとして当業者に一般的に理解されているハイブリダイゼーション条件である。例えば、Sambrook et al，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1 989)，pp．1.101-1.104; 9.47-9.58及び11.45-11.57 を参照。一般的にはこのような条件は、ハイブリダイゼーション膜を65℃で0.1% SDSを含む0.05x 〜0.5x S SC中で少なくとも一回洗浄すること、あるいはこれと同等なストリンジェンシーの洗浄条件を示すものである。本発明は、上記の精製及び単離された核酸分子の任意のもので形質転換された宿主細胞、並びにそのような形質転換核酸分子によりコードされ前記宿主細胞から発現されたブタα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼも包含する。適当な宿主細胞を形質転換する方法、及びそのような宿主細胞からポリペプチドを発現する方法は当分野で知られており、例えばSambrook et al.，(1984)，pp．12.2-12 .44; 16.3-17.44 に記載されている。本発明はさらに、所望のDNA 配列をブタα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入部位に挿入することにより前記遺伝子を不活性化するのに有用な DNA 構築物を包含する。本明細書で使用する「α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子」の用語は、α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするかもしくは潜在的にコードするエクソン、そのようなエクソンに隣接するイントロン、そのようなエクソン及びイントロンに結合された調節要素を含むものである。前記DNA 構築物は、所望のDNA 配列とそれに隣接する第１及び第２の相同配列を含む。これらの第１及び第２の相同配列は、挿入部位に隣接する第１及び第２のゲノム配列にそれぞれ十分に相同であり、DNA 構築物がブタα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む標的細胞に導入されたときに、ブタα-1,3 ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子とDNA 構築物との相同組換えを可能とするものである。好ましくは、挿入部位はブタα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエクソン４、エクソン７、エクソン８またはエクソン９内にある。所望のDNA 配列は好ましくは選択マーカーであり、これは限定するものではないが、neo^R遺伝子、ヒドロマイシン耐性(hyg^R)遺伝子、及びチミジンキナーゼ遺伝子等である。所望のDNA 配列は両端においてFRT DNA 要素に接していてもよく、３つのリーディングフレームのそれぞれの停止コドンが所望のDNA 配列の３’側に挿入される。FRT 要素の存在により、選択マーカーを標的細胞から欠失させることができ、停止コドンによりα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が選択マーカーの欠失の後に不活性化されたままであることが確保される。本発明はさらに、所望のDNA 配列をマウスα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入部位に挿入することにより前記遺伝子を不活性化するのに有用なDNA 構築物を包含する。前記DNA 構築物は、所望のDNA 配列とそれに隣接する第１及び第２の相同配列を含む。これらの第１及び第２の相同配列は、挿入部位に隣接する第１及び第２のゲノム配列にそれぞれ十分に相同であり、DNA 構築物がマウスα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む細胞に導入されたときに、マウスα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子とDNA 構築物との相同組換えを可能とするものである。好ましくは、挿入部位はマウスα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエクソン４、エクソン７、エクソン８またはエクソン９内にある。所望のDNA 配列は好ましくは選択マーカーであり、これは限定するものではないが、neo^R遺伝子、hyg^R遺伝子、及びチミジンキナーゼ遺伝子等である。所望のDNA 配列は両端においてFRT DNA 要素に接していてもよく、３つのリーディングフレームのそれぞれの停止コドンが所望のDNA 配列の 3'側に挿入される。FRT 要素の存在により、選択マーカーを標的細胞から欠失させることができ、停止コドンによりα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が選択マーカーの欠失の後に不活性化されたままであることが確保される。本発明はさらに、少なくとも１の不活性化（非機能性）α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子を含む哺乳動物全能性細胞を生成する方法を包含するものであり、該分化全能性細胞はα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼの対立遺伝子が通常存在し機能している哺乳動物種から誘導されるものである。「機能性」対立遺伝子は、転写及び翻訳され、天然α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼと同じ、あるいは実質的に同様の活性を有するポリペプチドを生成することができるものである。前記方法は、前記の哺乳動物種の分化全能性細胞として特徴付けられる複数の細胞を用意し、所望のDNA 配列を相同組換えによりα-1,3 ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入部位に挿入することにより前記遺伝子を不活性化するのに有効な核酸構築物を分化全能性細胞に導入し、その後少なくとも１の不活性化α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子を含む分化全能性細胞を同定することを含む。前記分化全能性細胞は、限定するものではないが、胚性幹(ES)細胞、始原生殖細胞(PGC)及び卵子を含む。これらの細胞はα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼについての対立遺伝子が存在し機能している種々の哺乳動物種、限定するものではないがマウス及びブタの種から得られる。本発明はさらに、機能性α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く哺乳動物を生成する方法を提供するものであり、該方法においては哺乳動物は機能性α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する種に属するものである。前記方法は、少なくとも１の不活性化α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子を有する哺乳動物分化全能性細胞を用意し、ここで分化全能性細胞は前記の機能性α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する哺乳動物種から誘導されたものであり、前記の分化全能性細胞を該細胞の有糸分裂子孫が発生中の胚の全部あるいは一部を構成するように操作し、分娩予定日まで胚を発達させ、胚から得られた新生子個体を回収し、新生子を飼育繁殖させて不活性化 α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子についてホモ接合の哺乳動物、即ち両方のα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子が不活性化されている哺乳動物を得ることを含む。前記分化全能性細胞は、限定するものではないが、ES細胞、PGC 及び卵子を含む。これらの細胞はα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の対立遺伝子が存在し機能している種々の哺乳動物種、限定するものではないがマウス及びブタの種から得られる。ES細胞及びPGC は、種々の方法によりその有糸分裂子孫が発生中の胚に見られるように操作される。このような操作には、限定するものではないが、胚盤胞あるいは桑実胚への注入、透明帯分断桑実胚との同時培養、除核接合子との融合等が含まれる。胚盤胞あるいは桑実胚段階の胚に注入された細胞は胚盤胞胚の内部細胞塊に取り込まれるようになり、得られる胚の種々の分化細胞型を生じ、これには場合によっては生殖細胞が含まれる。そのような操作から得られた胚は、正常な胚細胞並びに導入されたES細胞あるいはPGC の有糸分裂子孫からなるキメラである。あるいはキメラ胚は、少なくとも１つのES細胞あるいはPGC を透明帯が十分に分断されている桑実胚胚と同時に培養し、ES細胞/PGC 及び桑実胚の少なくとも１の細胞が直接接触するようにして得ることができる。透明帯分断胚は透明帯を全く含まない胚であってもよい。最後に、ES細胞/PGCを除核接合子と融合させることによりES細胞またはPGC のゲノムを胚に導入することができる。このような手順により非キメラ胚、即ち全ての核が融合ES細胞/PGC の有糸分裂子孫の核である胚を生成することができる。得られた胚をレシピエント雌、即ち代理母に移植し、分娩予定日まで発達させる。 ES細胞あるいはPGC ではなく、卵子にα-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性化するのに有効な核酸構築物を直接注入する場合には、レシピエント雌に移植することにより胚を形成するように卵子を操作できる。本発明は、人工的な操作により作出された、機能性α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く哺乳動物も包含する。前記哺乳動物は、α-1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が通常は存在し機能している種に属するものである。哺乳動物は、限定するものではないが、マウスあるいはブタであってよい。本発明はさらに、（1）図26に記載された核酸配列（配列番号25）、（2）遺伝子コードの縮重の範囲内で（1）の配列に対応する配列、及び（3）マウスT-LIF をコード化、標準的な高ストリンジェンシー条件下で（1）または（2）の配列に相補的な配列にハイブリダイズする配列からなる群から選択される核酸配列を含む、精製及び単離された核酸分子を包含する。上記の核酸配列に相補的な鎖は標準的な方法により容易に決定でき、それらも本発明の範囲に包含される。本発明は、上の段落に記載した精製及び単離された核酸分子のいずれかにより形質転換された宿主細胞、並びにそのような形質転換核酸分子によりコードされ、前記宿主細胞から発現されたT-LIF ポリペプチドも包含する。本発明はさらに、（1）図27に記載された核酸配列（配列番号31）、（2）遺伝子コードの縮重の範囲内で（1）の配列に対応する配列、及び（3）ヒトT-LIF をコードし、標準的な高ストリンジェンシー条件下で（1）または（2）の配列に相補的な配列にハイブリダイズする配列からなる群から選択される核酸配列を含む、精製及び単離された核酸分子を包含する。上記の核酸配列に相補的な鎖は標準的な方法により容易に決定でき、それらも本発明の範囲に包含される。本発明は、上の段落に記載した精製及び単離された核酸分子のいずれかにより形質転換された宿主細胞、並びにそのような形質転換核酸分子によりコードされ、前記宿主細胞から発現されたT-LIF ポリペプチドも包含する。本発明はさらに、ヒト血清による非霊長類哺乳動物細胞の超急性拒絶を除去し、あるいは軽減する方法を包含し、該方法は、ヒト血清を非霊長類細胞にさらす前に、生理学的に許容される量のガラクトース、あるいは末端炭水化物が１位で結合したαガラクトースである糖をヒト血清に加えることを含む。添加されるガラクトースあるいは糖の量は、超急性拒絶反応を軽減しあるいは除去するのに十分なものである。前記糖は、限定するものではないが、メリビオース、ガラクトースα1-3 ガラクトースまたはスタキオース等である。あるいは、ヒト血清を処理して、免疫グロブリン、IgM 抗体、抗-GAL IgM及びIgG 抗体、あるいは抗-GAL IgM抗体を実質的に枯渇させることもできる。本発明はさらに、抗-GAL抗体、あるいは抗-GAL IgM抗体を実質的に含まない、アフィニティ処理したヒト血清も包含する。図面の簡単な説明図１は、抗GAL 抗体のみ、あるいは選択した糖と前もってインキュベートした抗GAL 抗体によるブタ大動脈内皮細胞の免疫蛍光染色の後の蛍光強度を示すグラフである。図２は、ヒト血清、及び精製された抗GAL 抗体によるブタ大動脈内皮細胞の溶解を⁵¹CR放出アッセイを用いて測定した実験の結果を示す。図３は、選択された糖を含むか、あるいは含まないヒト血清の存在下の灌流ラット心収縮のフィジオグラフトレーシング(physiograph tracings)を示す。図４は、ブタα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA配列と対応するマウスの及びウシの配列との比較である。PGTCD = ブタの配列、BOVGSTA = ウシの配列、MUSGLYTNG = マウスの配列。図５は、ブタα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と対応するマウス及びウシのアミノ酸配列との比較である。PGT = ブタの配列、BGT = ウシの配列、MGT = マウスの配列。図６は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼゲノム領域の部分にわたる４つのオーバーラップしているファージクローンにおけるSal1制限部位を示す。図７は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのサブクローンｐαG T-S5.5 の詳細な制限地図である。図８は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのサブクローンｐαG T-S4.0 の詳細な制限地図である。図９は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのサブクローンｐαG T-S11の詳細な制限地図である。図10は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのサブクローンｐαG T-S13の詳細な制限地図である。図11は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのサブクローンｐαG T-S5.5 の別の詳細な制限地図である。図12は、マウスα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼのサブクローンｐαG T-S4.0 の別の詳細な制限地図である。図13は、エクソン９のSal1部位に隣接する、ｐαGT-S5.5 及びｐαGT-S4.0 からの4.0 及び5.5kb Sal1フラグメントを有するノックアウト構築物の図である。図14は、本文中に示すプローブを使用する、割り込まれていないα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子及び標的とされた（不活性化）α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にそれぞれ特徴的な8.3kb 及び6.4kb BgIII フラグメントを示す。図15は、ベクターｐαGT-S5.5 を開始ベクターとして使用したノックアウト構築物の生成の概略図である。図16は、マウス中でα-1,3-GalT遺伝子に割り込むためのDNA 構築物の構築に使用したネオマイシン耐性カセットのヌクレオチド配列を記載する。図17は、配列決定してその同一性、コピー数及び種々の挿入物の方向を確認した最終的なノックアウト構築物の一例の図である。図18は、図16のノックアウト構築物により形質転換された種々のマウスES細胞株からのゲノムDNA のサザンブロットであり、プローブすることにより図14に記載した特徴的なフラグメントが明らかになった。図19は、指定したプライマーを使用して野性型及び割り込まれたα-1,3-GalT 遺伝子から誘導された「長い」PCR 産物を示す。図20は、野性型及びノックアウトマウスから得られた長いPCR 産物のサザンブロットである。図21は、割り込まれた（標的とされた）galT遺伝子座を同定するために使用したPCR 産物を示す。図22は、割り込まれた（不活性化された）GalT対立遺伝子を有するマウスから生成されたPCR 産物を示す。図23は、正常及びノックアウトマウス中のα-1,3-GalT mRNAから生成されたcD NAのPCR 分析から予測されたPCR 産物を示す。フェロキラターゼプライマー及び PCR フラグメントが、cDNA合成が起こったことを示す対照を表す。図24は、野性型マウス(+/+)、割り込まれたα-1,3-GalT 対立遺伝子についてヘテロ接合のマウス(+/-)及び割り込まれたα-1,3-GalT 対立遺伝子についてホモ接合のマウス(-/-)の、腎臓(K)、心臓(H)及び肝臓(L)から単離されたRNA より得たcDNAから生成されたPCR フラグメントを示す。図25は、ヒト血清による溶解からの、GalTノックアウトマウスから得られた脾臓細胞の相対的な保護を示すグラフである。図26は、マウスT-LIF についてのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。図27は、ヒトT-LIF についてのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。図28は、トランスフェクトCOS 細胞から発現されたLIF ポリペプチドのウェスタンブロットである。図29は、図27のCOS 細胞のトランスフェクションに使用した発現プラスミドを示す図である。図30は、LIF 特異的プローブを使用した、マウスES細胞からのPCR 増幅cDNAのサザンブロットである。詳細な説明本明細書に示す証拠により、予め形成されたヒト抗ブタ異種抗体の実質的な部分が、ブタ内皮細胞の表面の特異的末端ガラクトース結合を認識することが確立される。本発明者らが行った実験により示されるように、適当なエピトープを含む固定化された抗体での吸着により、予め形成された異種抗体の力価を低減できる。これにより、超急性拒絶反応に関連する細胞応答を低減し、あるいは排除することができる。逆に、ヒト血清に適当な炭水化物抗原を添加することによりそのような抗体を中和できることを証明する。これらの方法の有用性を示すにあたっては、関連する炭水化物部分を同定し、培養細胞株における、そして重要なこととして臓器全体におけるその効能を示す必要があった。超急性拒絶反応を低減し排除する１つの方法はそれ自体、関連する抗体集団を除去あるいは中和することによるレシピエントの治療として認識される。異種移植に対する代替方法は、ドナー臓器における関連エピトープを除去することである。これは例えば、エピトープの形成に応答する代謝機構をコードする遺伝子の発現を低下させあるいは除去することにより達成される。α-1,3-ガラクトース結合により規定されるエピトープ(GALエピトープと称する)は、酵素UDP -ガラクトース:β-D-ガラクトシル-1,4-N-アセチル-D-グルコサミニドα-1,3-ガラクトシル-トラスフェラーゼ（「α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ」または「α-1,3-GalT」）により生成される。この酵素は、ガラクトースを、N-アセチルラクトサミン型炭水化物鎖及びラクトサミノグリカンの末端ガラクトース残基に転移させる。α-1,3-GalT により触媒される反応は以下のように記載することができる。 UDP-Gal + GaLβ-1,4-GlcNAc-R → Galα-1,3-Galβ-1,4-GlcNAc-R + UDP α-1,3-GalT 酵素は殆どの哺乳動物に見られるが、旧世界サル及びヒトには存在しない。異種移植の目的のためには、ヒト及び旧世界サルがGAL エピトープに対する天然の異種抗体を有していることに意味がある。GAL エピトープを欠くブタ臓器を使用することにより、ヒトレシピエントにおけるそのような臓器の超急性拒絶を排除することができる。そのような方法の有用性は、GAL エピトープが実際に細胞及び臓器全体における超急性拒絶現象の中枢であることを本発明者が示したことにより支持される。そのような臓器を得る１つの方法は、α-1,3-Gal T 酵素をコードする遺伝子が相同組換えにより「ノックアウト」されたブタを生成することである。超急性拒絶におけるGAL エピトープの役割本発明者らは、ヒト血清からGAL エピトープに対する抗体（抗GAL 抗体）をアフィニティ精製した。これは、固相に結合された適当なエピトープ（例えばガラクトシルガラクトースまたはメリビオース）を含むアフィニティカラムにより行った。１つのセットの実験で全抗GAL IgG 及びIgM を得た。別の方法においては、アルブミン及びIgG を除く全てのタンパク質に対して特異性を有するアフィニティカラムに血清を通すことにより抗-GAL IgGを得た。次いでこのカラムからの洗浄通過物をガラクトシルガラクトースアフィニティカラムに通し、精製された抗-GAL IgGを溶出物として回収した。得られた抗-GAL IgGは、IgG に特異的に結合し、他の抗体イソタイプには結合しないプロテインG カラムを通すことによりさらに精製することができる。逆に、上記のカラムからの洗浄通過物を全抗-GAL (IgG + IgM)枯渇血清あるいは抗-GAL IgG枯渇血清のソースとして別の実験に使用することができる。好ましくは、抗-GAL抗体調製物はタンパク含量、分子量及び純度、及び抗体クラス及びイソタイプについて特徴づけされているものである。超急性拒絶応答におけるGAL エピトープの役割を証明するためには、最初にIg G 及びIgM 抗-GAL抗体がブタ細胞及び組織と反応することを示す必要がある。本発明者らは免疫蛍光染色を用いてヒト抗-GAL抗体のブタ細胞及び組織に対する結合を調べた。この方法においては、選択されたヒト抗体調製物をそのままの(int act)ブタ細胞と反応させ、次いでフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識された非ヒト抗ヒトIgG またはIgM を含むシグナル抗体と反応させる。蛍光活性化セルソーター(FACS)あるいはその他の適当な検出手段により染色された細胞を検出し定量することができる。例えば酵素標識シグナル抗体試薬の使用を介して、細胞表面上に結合された抗体の存在を検出するためのその他の方法も当業者に知られている。全抗-GAL(IgG及びIgM)、並びに精製抗-GAL IgGは、ブタ上皮細胞株(PK₁)からの細胞、並びにブタ大動脈内皮細胞株(PAE)からの細胞を染色した。抗-GAL(全Ig M + IgG)抗体枯渇血清及び抗-GAL IgG枯渇血清はいずれも検出可能な染色を示さなかった。反応の特異性をさらに調べるためには、問題とするエピトープを含むことが疑われる１種以上の分子に予め暴露することにより、ブタ細胞との抗体の反応性が減じられるかあるいは除去されるかどうかを調べることが望ましい。この点、本発明者らは、抗体の結合はガラクトースにより阻害され、またα１配置の末端ガラクトース残基を有する二糖により阻害されることを確立した。β１→ ４配置にある末端ガラクトースを有する糖によっては染色は阻害されなかった。これらの結果は、抗体結合の特異性及び適当な糖のそのような結合を阻害する能力を示している。抗-GAL抗体の培養ブタ細胞との反応性は、ブタ臓器の組織切片を使用して確認した。やはり、蛍光シグナル抗体系を使用して、全抗-GAL IgM + IgG及び精製抗 -GAL IgGにより染色が見られたが、抗-GAL抗体枯渇血清では見られなかった。染色は腎臓、心臓及び肝臓の内皮、心臓内膜、及び胆管上皮について特に強かった。組織結合はメリビオースにより阻害されたが、GAL エピトープを示さない他の二糖類では阻害されなかった。これらのデータは、GALエピトープがブタの腎臓、心臓及び肝臓の動脈、静脈及び毛細血管の内皮細胞上に高レベルで発現されることを明らかに示している。異種移植片の場合、これらの管の内皮細胞はヒト血清中の抗-GAL抗体と直接接触する。上記の結果は、これらの抗体の結合（随伴する補体活性化とともに）が超急性拒絶反応の鍵となる成分であるという証拠と合致している。ヒト血清中に天然に存在する異種抗体のブタ抗原に対する特異性をさらに調べるために、ヒト血清のブタ赤血球細胞凝集能を調べた。この研究により、ヒト血清中にそのような抗体が高レベルで存在することが明らかになった。さらに、メリビオース、スタキオース、ガラクトース、フコース等のα1-6 配置の末端残基を有する糖が、μM〜mMの範囲で凝集を阻害することが見出された。その他の配置を有する糖は、非常に高い用量で僅かに阻害したに過ぎず、観察された効果はオスモル濃度やその他の非特異的メカニズムの単純な変化によるもののようである。上記の研究は、超急性拒絶の基礎となっている補体媒介性の破壊においては天然に存在するヒト抗-GAL異種抗体の重要な役割を確立している。しかし、溶解過程におけるGAL エピトープ及び抗-GAL抗体の特異性を確認するためには、ブタ細胞の補体媒介性破壊を直接調べることが好ましい。この目的のため、本発明者らはヒト血清のブタ細胞溶解能を調べた。細胞の補体媒介性破壊を調べるためには、細胞溶解について定量的データを与える１以上のアッセイを使用する必要がある。好ましくは、そのようなアッセイは、補体媒介性細胞溶解の際に培地中に放出される細胞絶離成分(cell-sequeste red component)を測定するものである。そのような実験では、天然の補体タンパク質並びに非働化補体の両方を使用して誘導された溶解における補体の関与を制御する必要がある。本発明者らは、⁵¹Cr- 放出アッセイ及びラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)-放出アッセイを使用し、ヒト血清によるブタ上皮及び内皮細胞の補体媒介性溶解を調べた。 ⁵¹Cr- 放出アッセイにおいては、ブタの細胞を⁵¹Crで前もって標識し、次いで非働化ヒト血清及びウサギ補体(PAE)または非働化していない正常ヒト血清(PK₁) 中のヒト補体の存在下でインキュベートした。⁵¹Crの培地への放出は、シンチレーション液の添加後、ガンマカウンターで測定した。LDH-放出アッセイにおいては、製造者(Promega，USA)の指示書に従って細胞をLDH で標識した。培地へのLD H の放出は、吸収を492 nmで測定するELISA 法を使用して測定した。両方のアッセイでは、種々の糖の補体誘導溶解阻害能も試験した。両方型のアッセイを使用して、２種の関連のないブタ細胞株、PAE 及びPK₁で同様の結果を得た。結果は、天然に存在する異種抗体(NXAb)がブタ細胞の補体誘導溶解の開始に関与していることを明らかに示している。本発明者らは、IgM 及び非IgG 抗体がこの系の溶解に関与していることも示した。さらに、補体調製物の非働化は溶解を阻害し、ブタ細胞の溶解が補体依存性の現象であることの別の証拠が得られた。本発明者らは、メリビオースがブタの細胞を溶解から保護するが、ラクトースはしないことも示した。重要なこととして、これらの研究において有効であると判った糖の濃度は、生理的な血糖の範囲、即ち約10 mM をカバーしていた。これらの結果は、正常ヒト血清中の抗-GAL NXAb がブタ細胞の溶解に主として関与していることを示している。抗-GAL NXAb のブタ異種移植片の血管の内部を覆う内皮細胞に対する結合はそれ自体、随伴する補体カスケードの活性化とともに、ブタ異種移植片の超急性拒絶の鍵となる成分であるようである。これは他の異なる種、例えば齧歯類、ヒツジ、ウシ、ヤギ等からの臓器についても当てはまり、これらはいずれもそのゲノム中に活性なα-1,3-GalT 遺伝子を有している。これらの結論は、本発明者らが行った臓器全体の研究によっても支持される。この研究のために、単離され灌流されたラットの心臓を使用して、超急性拒絶において抗-GAL異種抗体が関与していることをさらに示した。Doring and Dehnert ，The Isolated Perfused Heart According to Langendorf，Bionesstechnik-Ve rlag March GmbH，D7806，西ドイツに記載されたようにしてラット心臓をランゲンドルフ灌流装置につないだ。つながれた心臓を生理的バッファー系を灌流することにより安定化させ、メリビオースまたはラクトース(10 mM)を含む同じバッファーで灌流した。次いで13% の最終濃度までヒト血漿を加え、心拍数、収縮の強度、拍出量についての影響を測定した。これらの結果は、全臓器系において、以下の内容を示した。１）非修飾ヒト血漿による灌流は機能の急速な喪失を招く。２）抗-GAL抗体の結合と競合するメリビオースの存在下でヒト血漿でラットの心臓を灌流すると、心臓の生存及び拍出が延長される。しかし、抗-GAL抗体の結合と競合しないラクトースは心臓の生存を延長しない。３）抗-GAL抗体枯渇血漿によりラット心臓を灌流すると、心臓の生存及び拍出が延長される。４）精製された抗-GAL抗体を抗-GAL抗体枯渇血漿に添加して戻すと、心臓は機能を急速に喪失する。培養細胞、組織及び臓器全体を使用した本発明者らの実験により、抗-GAL抗体が超急性拒絶反応の不可欠な要素であるという重要な確認が得られる。さらに、開示した結果により、ヒトによる異種哺乳動物臓器の超急性拒絶を除去あるいは軽減するのに使用できる種々の方法が示されるものである。例えば、特異的な二糖、ガラクトースα1-3 ガラクトースを静脈内投与すると、あらゆるクラスの天然に存在する抗-GAL抗体がブロックされ、それらが異種移植片の内皮細胞上の特異的エピトープに結合するのを阻止し、従ってそれらが超急性拒絶を開始しあるいはそれに関与することを防止する。本発明者らの結果は、この効果を得るのに必要なガラクトースα1-3 ガラクトースの濃度は生理学的に許容される範囲にあることを示している。実験により、その他の種々の炭水化物により前記特異的な二糖を置き換えることができることも示されている。それらには、単糖のガラクトース、１位置を介して次の糖に結合する末端αガラクトースを有するその他の種々の二糖類、三糖類、あるいは四糖類が含まれる。これらのその他の糖としては、限定するものではないが、メリビオース及びスタキオースが挙げられる。同様に、異種移植に先立ち、全IgM(即ち、全ての特異性のIgM)の全部、あるいは実質的な部分を体外免疫吸収により患者の血清から除去することができる。あるいは、全てのクラスの抗-GAL抗体を体外免疫吸収により除去することができる。最も好ましくは、前もって作製された患者の天然抗-GAL IgM抗体を除去することができる。このように、超急性拒絶の主要な免疫学的因子の多くあるいは殆どが除去され、異種移植後の反応が軽減され、あるいは除去される。 GAL エピトープの抑制のための標的としてのα-1,3-GalT 遺伝子本発明者らは、ブタα-1,3-GalT 遺伝子の全コード領域をクローニングすることに成功した。これは、ヒトの異種移植の目的でブタで遺伝子工学的に操作された前記遺伝子を十分に活用するために望ましいことである。ブタの遺伝子の全コード領域を得ようとするこれまでの試みでは、本発明者らの知る限り、5'コード領域を生成するのに成功していない。例えば、Dabkowski et al.，Transplant． Proc．25:2921(1993)を参照。本発明者らは、PCR をベースとする方法を使用して完全な配列を生成した。この遺伝子の5'及び3'領域を得るために必要なプライマー及び実験条件の設計において、本発明者らは成功を阻む重大な理論的及び実際的な障害を克服した。プライマーは、この目的に利用できる発表された配列の全てである、マウス、ウシ及びヒトα-1,3-GalT 遺伝子の発表された配列の慎重な分析に基づいて選択した。本発明者らの分析により、報告されているウシcDNAの配列において、エクソン3(5'-非翻訳領域にある)が失われていることが判明した。これは文献には報告されていない。従って、有用なプライマー配列を得るのに適当な領域を見つけるためにマウス及びウシの配列を再整列させなければならなかった。しかし、適当に再整列させても、5'非翻訳領域内の約20塩基対(bp)の１つの島のみがPCRオリゴヌクレオチドの設計のために必要な相同性(20bp 中19)を示したにすぎなかった。最適に整列させてもマウス及びウシ遺伝子の5'非翻訳領域が実質的に関連していないという事実は、当業者であれば異常とは考えないであろう。5'非翻訳領域が種間でよく保存されていないことが多いからである。このままでは自然の成り行きとして、徹底的というほどではない分析を行い、この領域からの相同性に基づいたPCR オリゴヌクレオチドの設計は成功しそうにないと結論することになろう。下流の3'非翻訳領域でも、やはり相同性は明確ではない。マウス及びウシの配列の適当な整列を得るためには、種々の挿入や欠失が行わなければならなかった。さらに、PCR オリゴヌクレオチドの設計のための適当な相同性の領域を得るためには、停止コドンの約200bp 下流の領域を選択する必要があった。また、適当に機能する5'及び3'プライマーを得るためには、アニーリング温度を9 ℃低下させる必要があることを本発明者らは見出した。PCR をベースとする方法を成功裏に使用することを阻むこれらの技術的及び理論的ハードルは本発明者らによって克服され、完全なコード配列を決定することが可能とした。ヌクレオチド配列の分析により、5'非翻訳領域のマウスエクソン３の対応物はブタ遺伝子においては見られないことが示されている。ブタの配列はこの点でウシの配列と同様である。アミノ酸配列の分析により、ブタα-1,3-GalT の構造はその他のグリコシルトランスフェラーゼの構造に類似しており、特にウシ及びマウスα-1,3-GalT に極めて近いことが示された。これらの酵素のそれぞれにおいては、約６残基の短い細胞質アミノ末端ドメインが疎水性膜アンカードメイン（残基７〜22にわたる）に先行している。柔軟な結合鎖として働くステム領域と、 α-1,3-GAL結合の合成を触媒する触媒ドメインはゴルジ体の内腔に位置し、アミノ酸23からアミノ酸371 のカルボキシル末端に伸びている。ステムドメインと触媒ドメインとの正確な境界ははっきりしていない。示唆されたステム領域の特徴に基づくと、これは最も保存されていない領域であり、グリシン及びプロリン残基に富んでいるようである(Paulson and Colley，J．Biol．Chem．264: 17615(1 989); Joziasse et al.，J．Biol．Chem．267: 5534(1992))。ステム/触媒の境界はアミノ酸60付近に存在し得る。相同組換えにより遺伝子を不活性化するための構築物を生成するためには、好ましくは別のDNA フラグメントの挿入により適当なコードエキソン内で遺伝子に割り込みをかける。完全長のブタ核酸配列の分析において、本発明者らはエクソン４、７、８及び９を相同組換えによる遺伝子の分断に好ましい位置として同定した。しかし、これらのエクソンの好ましい部位としての同定は本発明を限定するものと解釈してはならないものであり、エクソン５及び６における割り込みは特にα-1,3-GalT 遺伝子の発現の完全ではない阻害が望ましい細胞型あるいはそのような場合には有用なものである。さらに、コード配列に関連する制御要素も不活性化のための有用な標的を与え得る。好ましい態様においては、マウスα-1,3-GalT 遺伝子のエクソン９内のコドン 211-222 に位置するSal1部位をマウスコード配列の分断部位として選択する。ブタの配列の分断については、Sal1部位は保存されていないが、対応するブタのヌクレオチドによりコードされているアミノ酸は保存されていることが、指摘される。ブタ遺伝子の不活性化の好ましい態様においては、ノックアウト配列の好適な構築のためにSal1部位を遺伝子操作してブタの配列の対応位置に形成する。Sa l1はゲノムDNA をまれにしか切断しない。複数の制限部位はDNA の大きいフラグメントを操作することにおいて問題となり得るので、別のSal1部位がノックアウト構築物のその他の位置に存在する可能性が低いことからエクソン内にSal1部位が存在することは非常に有用である。相同組換えにより標的とされたエクソン部位に割り込むためには、一般的には選択可能なマーカーをコードする遺伝子が使用される。好ましくは、選択可能なマーカーは、所望の挿入部位に隣接する配列と相同な配列が隣接するものである (Thomas and Capecchi，Cell 51: 503-12(1987); Capecchi，Trends in Genetic s 5: 70-76(1989))。隣接する配列は所望の挿入部位に直接隣接している必要はない。抗生物質G418（ネオマイシン誘導体）に対する耐性を与える遺伝子がよく使用されるが、その他の抗生物質耐性マーカー（例えばヒグロマイシン）も使用できる。その他の選択系としては、単純ヘルペスからのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のような負の選択マーカーがある。ノックアウトベクターに含ませるのに適当な選択可能なマーカーはいずれも本発明の範囲内に含まれるものである。しかし、ある環境においては、移植臓器の細胞中に取り込まれた発現性の抗生物質耐性遺伝子を有することが望ましくない場合もある。従って、好ましい態様においては、１以上の遺伝子要素が、構築物がα-1,3-GalT 遺伝子による相同組換えを受けたものならば、抗生物質耐性遺伝子を切り出すことを可能にするノックアウト構築物に含まれる。酵母からのFLP/FRT リコンビナーゼ系はそのような遺伝子要素の１つのセットである(O'Gorman et al.，Science 251，1351-1355(1991))。FLP リコンビナーゼは約45kDの分子量のタンパク質である。これは酵母Saccharomyces cerevisiae の2 ミクロンプラスミドのFLP 遺伝子によりコードされている。このタンパク質はFLP リコンビナーゼ標的部位、またはFRT に結合することにより作用し、FR T のコア領域は約34bpのDNA 配列である。FLP は、隣接するFRT 部位の相対的な方向に依存して、切除、挿入、逆転等のいくつかの種類の組換え反応を媒介する。DNA の領域がFRT の直列反復に隣接している場合は、FLP は介在DNA を切り出し、単一のFRT を残すように働く。FLP は広範な系で機能することが示されており、それらには培養哺乳動物細胞株CV-1及びF9(O'Gorman et al.，Science 251 ：1351(1991))、及びマウスES細胞(Jung et al.，Science 259: 984(1993))が含まれる。 FRT の直列反復が隣接する抗生物質耐性遺伝子のゲノムコピーを有する標的細胞は、FLP リコンビナーゼにより、1)部分的に精製されたFLP タンパク質をエレクトロポレーションにより細胞内に導入するか、2)FLP 遺伝子を含む発現プラスミドをトランスフェクトすることで得られる。このように、抗生物質耐性遺伝子はFLP リコンビナーゼの作用により削除され、不活性化α-1,3-GalT 遺伝子を含み、外来の抗生物質耐性遺伝子を含まない細胞が生成される。標的細胞中での相同組換えが比較的まれであることから、殆どのそのような細胞は標的遺伝子の不活性化対立遺伝子の１つのみを含む。即ち、適当なノックアウト構築物による一回の形質転換により得られる細胞の大部分はヘテロ接合体である。本明細書で使用する「形質転換された」の用語は、当業者に知られる任意の手段による外来DNA の標的細胞への導入として定義される。そのような導入の方法には、限定するものではないが、トランスフェクション、マイクロインジェクション、感染（例えば、レトロウィルスをベースとするベクターによる）、エレクトロポレーション、マイクロバリスティックス等が含まれる。「形質転換された」の用語は、特に明記しない限り、本明細書では、不死化、密度依存性増殖、悪性形質転換あるいは培養中での同様の獲得された状態を伴う細胞の挙動及び増殖パターンの変化を示すものではない。本発明の方法においてはヘテロ接合細胞を使用することができるが、種々の操作方法を使用して培地中にホモ接合細胞を生成することができる。例えば、不活性化対立遺伝子についてヘテロ接合の細胞に対して第２の相同組換えを行うことによりホモ接合細胞を生成することができる。最初の形質転換において使用されるノックアウト構築物がneo^R遺伝子を有する場合、neo^R遺伝子を別の抗生物質（例えばヒグロマイシン）に対する耐性を与える遺伝子に置き換えた第２の構築物を２回目の形質転換に使用することができる。G418及びヒグロマイシンの両方に耐性を有する細胞をサザンブロットによりスクリーニングして、存在する「ダブルノックアウト」（即ちホモ接合体）を検出することができる。両方の抗生物質耐性遺伝子は、その後FLP リコンビナーゼを使用して単一の手順で除去することができる。G418による選択を維持することにより、この方法で第２の構築物が単に先にノックアウトされた対立遺伝子を置換せず、細胞をヘテロ接合のままにすることができる。あるいは、FLP リコンビナーゼと当初のneo^R遺伝子含有構築物を使用して行われる第２のノックアウト手順とを使用して、neo^R遺伝子を当初のヘテロ接合体細胞から欠失させることができる。ダブルノックアウトされたものはサザン分析により検出できる。新たに導入されたneo^R遺伝子はその後FLP リコンビナーゼにより欠失させることができる。この代替方法はノックアウト構築物を非不活性化対立遺伝子に特異的に指向させない。しかし、標的細胞の適当な数をスクリーニングすることにより、不活性化遺伝子座についてホモ接合の細胞を同定することができる。ノックアウト構築物の導入のための細胞ベヒクル全ての細胞において不活性化された特定の遺伝子を有する動物を形成するためには、ノックアウト構築物を所望の種の生殖細胞（精子あるいは卵子、即ち「生殖系」）中に導入しなければならない。マイクロインジェクションにより、遺伝子あるいはその他のDNA 配列を受精卵子の前核に導入することができる。前核融合の後、接合体は発生する胚中の全ての細胞の有糸分裂の前駆細胞であるので、胚はその全ての体細胞及び生殖細胞中に導入された遺伝子を有し得る。ノックアウト構築物の標的とされた挿入は比較的まれな事象であるので、そのような方法を採用する場合にはたくさんの動物を形成しスクリーニングすることが望ましい。このため、大きな細胞集団と、培養細胞系に特徴的な選択基準を使用して作業することが有利である。しかし、培養細胞の当初の集団からノックアウト動物を製造するためには、所望のノックアウト構築物を含む培養細胞が動物全体を形成できることが必要である。これは、一般に細胞をある種の発生胚の環境に置くことにより達成することができる。少なくとも数種の分化細胞型を生じることができる細胞を以後「多能性」細胞と称する。生殖細胞を含む、胚の全ての細胞型を生じることができる多能性細胞を以後「全能性」細胞と称する。全能性マウス細胞株（胚幹細胞、あるいは「ES 」細胞）を非常に若い胚（胚盤胞）から誘導された細胞の培養物から単離した。このような細胞は、胚へ導入すると、生殖細胞を含む全ての細胞型に分化でき、機能的なα-1,3-GalT 遺伝子を欠く動物を生成するのに使用できる。即ち、培養 ES細胞はノックアウト構築物で形質転換でき、α-1,3-GalT 遺伝子が、例えば適当なエクソン内に前記構築物を挿入することにより不活性化されている選択された細胞であることができる。実際に、ES細胞株はマウス及びブタについて誘導されている。例えば、Robertson，Embryo-Derived Stem Cell Lines，Teratocarci nomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach(E.J．Robertson，ed. )，IRL Press，Oxford(1987); PCT国際公開WO/90/03432; PCT国際公開94/26884 参照。一般的には、これらの細胞株は分化阻害因子(DIF)を含む培地で増殖させ、自発的な分化及び有糸分裂能の損失を阻止しなければならない。白血病阻害因子(LIF)はDIF として特に有用である。ES細胞分化の阻止に有用なその他のDIF としては、限定するものではないが、オンコスタチンM（Gearing and Bruce,The New Biologist 4: 61-65(1992); A．Smith からの私信）、可溶性IL-6レセプター(sIL-6R)を有するインターロイキン6(IL-6)(Taga et al.，Cell 58: 573-81(1 989); A．Smithよりの私信)、及び繊毛状神経向性因子(CNTF)(Conover et al.， Development 19: 559-65(1993))が挙げられる。その他の公知のサイトカインもそれ単独で、あるいはその他のDIF との組み合わせにより適当なDIF として機能し得る。未分化状態のES細胞の維持における有用な進歩として、本発明者らはLIF の新規な変異体を同定した。細胞外のものであるLIF のこれまでに同定されている形態と異なり、この新規な形態のLIF(以下T-LIF)は細胞内に局在している。RACE法 (Frohman et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 8998-9002(1988))を使用して転写物をマウスES細胞からクローン化し、配列分析にかけた。得られた核酸配列及び推定アミノ酸配列の分析によりT-LIF は文献にこれまで報告されたLIF 配列の切断形態であることが示されている。適当な宿主細胞中でのT-LIF 核酸の発現により17kDの非グリコシル化タンパク質が得られる。このタンパク質は培養物中でマウスES細胞の分化を阻害するのに有用である。このタンパク質はブタ細胞と同様の活性を有すると予測され、これはマウスD-LIF がマウス及びブタES細胞の両方の分化の阻害に有効であることによる。本発明者らは、T-LIF のヒト形態の配列も決定した。ノックアウト動物を生成するために、少なくとも１の不活性化α-1,3-GalT 対立遺伝子を有するES細胞を同定し、発生中の胚に導入する。これはマウス胚盤胞段階胚の胚盤胞膣への注入、桑実胚段階の胚への注入、ES細胞の桑実胚段階の胚との共培養、あるいはES細胞の除核接合体との融合により達成できる。得られる胚を性的に成熟するまで育てて交配し、動物を得るが、これらの動物の細胞（生殖細胞を含む）は全て不活性化α-1,3-GalT 対立遺伝子を有する。最初のES細胞が不活性化α-1,3-GalT 対立遺伝子についてヘテロ接合であった場合には、これらの動物のいくらかを互いに交配させて不活性化対立遺伝子についてホモ接合の動物を生成しなければならない。 DNA の卵子への直接のマイクロインジェクションは多数の培養細胞をトランスフェクトすることにより得られるような多数の組換えを起こさないが、それでも卵子の直接の注入は培養細胞を動物に変えるのに必要な特別な操作（上記参照）を必要としないので、この方法は有用な方法である。これは、受精卵子はもちろん典型的に「全能性」であり、即ち、代理母中に移植する以外は別の実質的な操作をすることなく成体に成長できるからである。卵子にノックアウト構築物を直接注入する場合に相同組換えの確率を高めるためには、少なくとも約8kb の相同 DNA をターゲティング構築物中に導入するのが有用である。さらに、同質遺伝子型DNA からのノックアウト構築物を調製することも有用である。例えば、ブタの卵子を注入するためには、その精子が注入に使用される卵子を受精させるのに使用される雄ブタから単離されたDNA から構築物を調製することが有用である。マイクロインジェクションにより導入された卵子から得られた胚はいくつかの方法で相同組換えの事象についてスクリーニングすることができる。例えばGalT 遺伝子が検出可能な（例えば蛍光により）遺伝子産物を生成するコード領域により割り込みされている場合は、注入された卵子を胚盤胞段階まで培養し、インジケーターポリペプチドの存在について分析する。例えば、蛍光を発する細胞を有する胚を次いで代理母に移植し、分娩予定日まで発育させる。あるいは、注入された卵子を発育させて、得られる子ブタを相同組換えの証拠についてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)あるいは逆転写PCR(RT/PCR)により分析する。ノックアウト動物の特徴づけ不活性化GalT遺伝子を一つ（ヘテロ接合）あるいは二つ（ホモ接合）有する動物を特徴づけして遺伝子の発現及び表現型効果における予測される変化を確認する。例えばGalT mRNA はホモ接合ノックアウト動物には存在しないはずである。これは例えば、適当なGalT特異的プライマーを使用する逆転写PCR(RT-PCR)により確認できる。さらに、種々の試験によりホモ接合ノックアウト動物中のGAL エピトープの発現を評価することができる。例えば抗-GAL抗体及びIB₄ レクチン（末端α-D-ガラクトシル残基に対して排除アフィニティを有する）を、種々のアッセイあるいは免疫組織学的フォーマット中で使用して、一連の組織中のGAL エピトープの存在について試験することができる。GAL エピトープ状態を示す別のものとしては、⁵¹クロム放出アッセイを使用して、ヒト血清による細胞の溶解を試験することができる。実施例１ヒト抗-GAL抗体のアフィニティ精製以下の一連の手順を使用して、通常の熱不活性化AB血清(CS1，Parkville，Vic tria，Austlaria より）から抗-GAL抗体を精製した。Ａ．全抗-GAL(IgG + IgM)抗体の調製 4 ℃において以下の手順を行う。１．予備平衡化された(20 mlのアプリケーションバッファー: 20 mM K₂HPO₄， 30 mM NaCl，pH 8)Econo Pac 10DG（Bio-Rad，Richmond，USA）カラムを通すことにより、15〜30 mlの血清を（3 mlバッチで）脱塩する。あるいは、大規模製造のためには、アプリケーションバッファーに対する透析により徹底的に脱塩する。２．アプリケーションバッファーの4 mlアリコートによりカラムを洗浄する。カラム溶出物を収集しプールする。３．プールした脱塩血清を、予備平衡化した(20 mlのアプリケーションバッファー)Synsorb 115(ガラクトシル- ガラクトース; Chembiomed，Alberta，Canada )あるいはD(+)メリビオース- アガロース(Sigma)アフィニティカラム(必要な収量により5 ml〜50 ml)にアプライする。４．通過物（部分的に抗-GALが枯渇されている）を回収しカラムに再度アプライする。この過程を３回繰り返し、抗-GAL抗体を完全に除去する。Synsorb カラムの３番目の通過からの通過洗浄物を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)，pH7 + 0.05% アジドで容量を血清のもとの容量に調整する。これを抗-GAL抗体枯渇血清のソースとして使用する。５．溶出物中にタンパク質がなくなるまで(O.D．280nm=0)カラムをPBS，pH 8 で洗浄する。６．3.5 M KSCN，pH 7.5で抗-GAL抗体を溶出する。4 mlずつのフラクションを集め、O.D．280を測定し、ピークフラクションをプールする(通常1-6)。７．CF25限外濾過コーン(Amicon，Danvers，USA)を使用して抗-GAL抗体を濃縮する。抗-GAL抗体を含むプールしたフラクションの7 mlをスピンコーンに加え、遠心分離する(2,000 RPM，10分，4 ℃)。コーンを再び満たし、容量が3 〜5 ml に減るまで再遠心分離する。８．KSCNを希釈するため、容量をPBS で7 mlに調整し、遠心分離する(2,000 R PM，10分，4 ℃)。この工程をさらに10回繰り返す。９．プラスチックピペットを使用してコーンから抗-GAL抗体を含む試料を取り出し、コーンをPBS pH 7 + 0.05%アジドによりリンスする。Ｂ．IgG 抗-GAL抗体の調製 4 ℃において以下の手順を行う。１．予備平衡化された(20 mlのアプリケーションバッファー)Econo Pac 10DG （Bio-Rad，Richmond，USA）カラムを通すことにより、15〜30 ml の血清を（3 mlバッチで）脱塩する。あるいは、大規模製造のためには、アプリケーションバッファーに対する透析により徹底的に脱塩する。２．アプリケーションバッファーの4 mlアリコートによりカラムを洗浄する。カラム溶出物を収集しプールする。３．脱塩血清を、予備平衡化した(30 mlのアプリケーションバッファー)Affi- Blue カラム(Bio-Rad，Richmond，USA)にアプライする(Affi-Blueはアルブミン及びIgG を除いて全てのタンパク質を結合する)。４．20 ml のアプリケーションバッファーでカラムを洗浄し、IgG に富んだフラクションを溶出する。５．IgG に富んだフラクションを、予備平衡化した(20 mlのアプリケーションバッファー、pH 8.0)Synsorb 115(ガラクトシル- ガラクトース; Chembiomed，A lberta，Canada)アフィニティカラム（5 ml）にアプライする。６．通過物を回収しカラムに再アプライする。この過程を３回繰り返し、抗-G AL抗体を確実に除去する。Synsorb カラムの３番目の通過からの通過洗浄物を回収し、PBS，pH 7 + 0.05% アジドで容量を血清のもとの容量に調整する。これを対照抗-GAL抗体枯渇IgG のソースとして使用する。ある場合においては、IgG を効率的に結合するがその他の抗体イソタイプを結合しないプロテインG カラムを用いて抗-GAL IgGをさらに精製した。IgG はその後グリシン pH 2.4 を使用してプロテインG カラムから溶出した。全ての抗-GAL抗体調製物を以下について分析した。ａ．タンパク質含量を、精製ヒトIgG を標準として使用して、Bradford比色法で測定した(Bradford，M.M 1976，Anal．Biochem．72:248-254)。ｂ．Laemli，Nature（London）227: 680（1970）により記載された方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分子量及び純度を測定した。ゲル中、タンパク質は標準的なキット試薬（Amersham，UK）を使用して銀染色により検出した。ｃ．Rose et al．(eds.)，Manual of Clinical Laboratory Immunology，Amer ican Society for Microbiology，Washington，D.C．に記載されたような標準的方法を使用した放射状免疫拡散法により抗体クラス及びイソタイプを決定した。 IgG 抗-GAL調製物は全てのサブクラスを含有し、IgG2が優勢であることが判明した。実施例２ IgG 及びIgM 抗-GAL抗体及び枯渇血清のブタ細胞及び組織との反応性Ｉ．細胞 IgG 及びIgM 抗-GAL抗体の反応性は、ブタ大動脈内皮細胞（本発明者らが下記のように調製した）、あるいはAmerican Type Culture Collection（ATCC）、受託番号CRL1392 から得たブタ上皮細胞株LLC PK₁（PK₁）のいずれかを使用して調べた。Ａ．ブタ大動脈内皮細胞(PAE)の単離及び培養ブタの血液型を判定し（ヒトの血液型判定試薬を使用）、「Ｏ型」のブタ、即ちＡ及びＢヒト赤血球細胞抗原に対する抗体に反応性を有しないブタを同定した。「Ｏ型」のブタから大動脈を切り出し、氷で冷却して屠殺場から研究室に輸送した。Gimbrone et al.，J．Cell Biol．60: 673-84(1974)に記載されたようにしてPAE をコラゲナーゼ処理して単離した。10% のウシ胚血清(FCS)を含み、150 μg/mlの内皮細胞補充物(Sigma)及び50μg/mlのヘパリン(Sigma)を補充したRPM I培地中でPAE を培養した。その典型的な丸石型形態と、免疫蛍光法を使用して同定したその第VIII因子抗体に対する免疫反応性とから、細胞を内皮細胞と同定した。以下に記載する全てのアッセイにおいて、PAE は８から12代目の継代で使用した。Ｂ．組織培養: PK-1及びPAE 細胞株の維持全ての組織培養は、適当な組織培養滅菌法を使用して薄片状フローフード(a l aminar flow hood)中で行った。全ての組織培養試薬は、特に記載しない限り、C SL，Melbourne，Australia から購入した。培地は以下のものから構成した。 PK-1培養培地 DMEM（Cytosystems，Castle Hill，Austlaria） 500 ml FCS（CSL，Melbourne，Austlaria） 37.5 ml グルタミン（200 mM）（Cytosystems） 5 ml Hepes（1M）（CSL） 7.5 ml ペニシリン（CSL） 0.5 ml（10⁵U/ml最終）ストレプトマイシン（CSL） 0.5 ml（10⁵μg/ml最終） PAE 培地 RPMI（CSL） 90 ml FCS（CSL） 10 ml 内皮細胞補充物(3 mg/ml)(Sigma) 1.5 ml ヘパリン（10 mg/ml）（CSL） 0.5 ml 内皮細胞補充物はSigma Chem．Co．(St．Louis，Missouri，USA)から凍結乾燥粉末として購入したものであり、滅菌HBBS中に再懸濁し、3 mlのアリコートを4 ℃で保存した。ヘパリン（Sigma，Missouri，USA）- PBS 中に溶解（10 mg/ml） - 濾過滅菌（0.22μm）ハンクスバッファー - Cytosystems から購入以下の全体的手順を、細胞株を増殖させるのに使用した。１）古い培地を流し出す。２）細胞を滅菌PBS で２回リンスする。３）3 mlのTED（0.05 M トリプシン、0.53 M EDTA、Gibco，NY，USA）を加える。４）37℃のCO₂インキュベーターで10分インキュベートする。５）10% FCS を含む7 mlのRPMIを添加する。６）細胞を再懸濁し、滅菌された10mlチューブに移す。７）5 分間、1200 rpmで遠心分離し、上清を捨てる。８）10% 新生仔ウシ血清(NBS)を含むRPMIに細胞を再懸濁し、遠心分離を繰り返す。９）細胞を1 mlのDMEM(PK-1 用)またはRPMI(PAE用）中に（上記したように添加物とともに）再懸濁する。 10）10 ml の培地を加え、適当量の細胞懸濁物、各75 cm²の組織培養フラスコに所望の希釈物となるように加え、湿度を与えられたCO₂インキュベーターにもどす。Ｃ．抗体染色及びFACS分析１）PK-1またはPAE を含む75 cm²の培養フラスコに2 mlのTED を加え、10分間室温でインキュベートする。２）10% FCS(5 ml)を加えたRPMIを加えてトリプシンを中和する。３）遠心分離(700 g、5 分、4 ℃）により細胞をペレット化する。４）ハンクスバッファー中での再懸濁及び遠心分離により細胞を洗浄する(x2)。５）遠心分離(700 g、5 分、4 ℃)により細胞をペレット化する。６）精製された抗-GAL抗体、GAL-枯渇血清またはGAL-枯渇IgG を含むハンクスバッファー中に細胞ペレットを再懸濁し、4 ℃で60分間インキュベートする。全ての抗体は、未希釈またはハンクスバッファー中に1:2 もしくは1:4 で希釈して使用した。７）1 mlのハンクスバッファーを加え、細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を吸引して除去する。８）ハンクスバッファー中に1:80に希釈したFITC標識ヒツジ抗ヒトIgG Fab2またはIgM Fab2（Silenus，Hawthorn，Australia）中にペレットを再懸濁する。９）4 ℃で30分間インキュベートする。 10）ハンクスバッファーで３回洗浄し、0.5 mlのハンクスバッファー中の最終洗浄物からのペレットを再懸濁する。 11）FACScan II（Becton Dickinson）を使用して、製造者の指示書に従い染色試料を分析する。ブタ細胞に対する抗-GAL抗体の結合の特異性を、種々の構造の糖の抗体結合を阻害する能力を測定することにより調べた。これらの競争分析では、抗-GAL抗体は細胞に加える前に糖(0.1 M)と37℃で30分間プレインキュベートした。Ｄ．結果免疫蛍光法を使用して、全抗-GAL(IgG及びIgM)及び精製抗-GAL IgGはPK-1及び PAE 細胞の両者を染色することが判明した。一方、全抗-GAL抗体枯渇血清及び抗 -GAL IgG枯渇血清はいずれもバックグラウンドを超える検出可能な染色を示さなかった。抗-GAL IgM及び／またはIgG による染色は、精製されたガラクトース、及びメリビオース（6-O-α-D- ガラクトピラノシル-D- グルコース）及びスタキオース（α-D-Gal-[1→6]-α-D-Glc-[1→2]-β-D-Fru）のようなα1-配置にある末端ガラクトース残基を有する二糖により阻害された。末端ガラクトース残基を有するが、β1→4 配置であるラクトース(4-O-β-D- ガラクトピラノシル- α-D -グルコース)のような糖によっては染色は阻害されなかった。１つのそのような実験の結果を図１に示す。PAE は、抗-GAL抗体のみ(GAL:PSB)、またはメリビオース(GAL:メリビオース)、ガラクトース(GAL: ガラクトース)、あるいはラクトース(GAL: ラクトース)のいずれかとプレインキュベートされた抗-GAL抗体により染色された。抗-GAL抗体の染色はメリビオース及びガラクトースを含む試料中で約10倍低いものであったが、ラクトースによっては有意に影響を受けなかった。 II．組織Ａ．方法ブタ腎臓はホルマリン中で固定して脱水した後にパラプラスト(Paraplast)中に包埋した。ブタ心臓及び肝臓はパラホルムアルデヒド−リシン−過ヨウ素酸塩固定剤中で固定し、O.C.T 包埋化合物(10.24% w/w ポリビニルアルコール、4.26 s，Inc.，Elkhart，Indiana，USA)中で急速冷凍した。ブタ心臓及び肝臓の4 μm 厚の切片及び腎臓の2 μm 厚の切片を、精製された抗-GAL抗体（未希釈、1:2 及び1:4)と60分間インキュベートし、次いでフルオレセインイソチオシアネート (FITC)- 結合ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンF(ab')フラグメント(Silenus Laborat ories，Hawthorn，Australia)(1:100)と30分間インキュベートするか、あるいはペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトIgG(Dakopatts，Glostrup，Denmark)(1:50) と60分間インキュベートした。対照切片については、第２抗体のみ、または第１抗体としての抗-GAL枯渇IgG もしくは正常ブタ血清により、自己蛍光について分析した。染色は検出されなかった。ブタ腎皮質の切片をメリビオース、ラクトース、シュクロース及びグルコースを0.1Mで含む種々の糖とプレインキュベートすることにより、抗-GAL抗体の特異性を試験した。Ｂ．結果免疫蛍光法を使用してブタ細胞について行った分析のように、全抗-GAL IgG + IgM、精製抗-GAL IgGは調べたブタ組織の全てを染色したが、抗-GAL IgM及び／またはIgG 枯渇血清は染色しなかった。臓器により異なる個々の染色パラメーターを以下に示す。抗ＧＡＬ抗体を用いたブタ組織の免疫染色：ブタ腎皮質の切片を用いて、0.1 M メリビオース、ラクトース、スクロースおよびグルコースを用いた阻害により、抗ＧＡＬ抗体の結合特異性を試験した。抗ＧＡＬ抗体の近位細管刷子縁との反応性は、抗体をメリビオースとプレインキュベートすることによりほぼバックグラウンドまで減少したが、他の糖類によっては阻害されなかった。実施例３ヒト血清によるブタＲＢＣの血球凝集反応：糖阻害試験ヒト血清によるブタ赤血球（ＲＢＣ）の血球凝集反応を調べるために用いた方法は、Galili，J．Exp．Med．160:1579-81(1984)およびSeverson，Immunol．96: 785-789(1966)に記載の方法から適合させた。Ｉ．方法Ａ．媒地／溶液の調製１．ヒト血清アルブミン(HSA)(CSL，Melbourne，Australia)(5 mg/ml)をP BSに溶解し、濾過滅菌し、４℃で保存した。２．糖の調製下記に示す量を100 mlのPBSに溶解することにより、1Mの糖保存液を調製した。アジ化ナトリウムを添加し(0.02%)、溶液を４℃で保存した。 α-ラクトース（4-O-β-D-ガラクトピラノシル-α-D-グルコース）36.0 g D(+)ガラクトース 18.0 g スタキオース（α-D-gal-[1->6]-α-D-Glc-[1->2]-β-D-Fru） 66.6 g メリビオース（6-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-グルコース） 34.2 g スクロース（α-D-グルコピラノシル β-D-フルクトフラノシド） 34.2 g D-(+)-グルコース 18.0 g α-D-(+)-フコース（6-デオキシ-D-ガラクトピラノース） 16.4 g 糖類はすべてSigmaより購入した(St．Louis，Missouri，USA)。糖溶液はPBSで必要とされる適切な濃度まで希釈した。Ｂ．ブタＲＢＣの調製１．ヘパリン処理したブタ血液(Animao Resources，Clayton，Australia) を800 RPMで10分間遠心にかけ、RBCをペレットにする。２．RBCペレットをPBS(10 ml)に再懸濁し、再度遠心にかけることにより洗浄する(3回繰り返す)。最後の洗浄の後、RBCペレットを10 ml PBSに再懸濁する。３．50μlのRBC溶液（上記工程２由来のもの）を、0.5 g/100 mlのHSAを含有する PBS 10 mlに加えることにより、RBCの0.5%溶液を調製する。Ｃ．96ウエル・マイクロタイタープレートの調製(Titretek，USA) １．各ウエルに25μlのPBSを加える。２．プールしてあったヒトAB血清(CSL，Melbourne，Australia)25μlをプレートの列１のウエルに加え、以下のように連続希釈を行なう。すなわち、25μ lを縦列１のウエルから除去して縦列２のウエルに加え、次に連続的に25μlを各ウエルから除去し次の縦列の各ウエルに加えることにより希釈を繰り返し、最後に縦列11のウエルより25μlを捨て、縦列12のウエルには血清を全く加えない。３．次に、25μlの糖溶液を各横列のウエルに下の列ほど濃度を減少させながら添加する。最後の横列には糖溶液を全く添加しない。４．４℃で一晩、次に37℃で30分間インキュベートする。５．50μlの0.5%ブタRBCを各ウエルに添加する: ボルテックスで混合し、室温で２時間インキュベートする。血球凝集を肉眼判定する。ＩＩ．結果ヒト血清は、1/32から1/64の力価でブタRBCの血球凝集反応を引き起こした。この力価は、ヒト血清中に天然に存在する異種抗体(NXAb)が高レベルで存在するのと一致する。NXAb応答の特異性を調べるため、糖阻害試験を実施した。α1-6 配置において末端ガラクトース残基を有するメリビオース、スタキオース、ガラクトースおよびフコース等の糖は、μMからmMの範囲で血球凝集を阻害することが見いだされた。他の構造を有する糖（ラクトースおよびスクロース等）は、非常な高濃度で使用した時のみ阻害を示した。このような高濃度では、例えば容量オスモル濃度の変化等により、観察される効果は大抵非特異的である。以下に結果をまとめて示す：ヒト血清によるブタRBC血球凝集反応：糖阻害実施例４ヒト血清誘導ブタ細胞溶解の糖による阻害ブタ細胞の溶解を引き起こすヒト血清の能力を、ブタ上皮(PK₁)および大動脈内皮(PAE)細胞の両方を用いて調べた。これらの細胞の単離および培養は実施例２に記述されている。Cerottini およびBrunner，Nature New Biol．237:272，1 972 に記載の⁵¹クロム放出アッセイ、または製造者(Promega，USA)の指示に従ったCytotox LDH 放出アッセイにより、細胞溶解を測定した。Ｉ．方法Ａ． ⁵¹ＣＲ放出アッセイ１．細胞の調製：ａ）コンフレントな、フラスコ１個分の細胞をトリプシン処理する。10 m lフラスコ１個あたり、平均で約3x10⁶個のPAE細胞および3x10⁷個のPK₁細胞が得られる。⁵¹ＣＲ放出アッセイでは、各ウエルにつき約 1x10⁵個の細胞が必要とされる。ｂ）10 mlのRPMI(FCSを含まない)中で細胞を４回洗浄する; 1200 rpmで５分間遠心する。ｃ）細胞を100μlのRPMI(10%の非働化FCS含有；下記参照)に再懸濁する。２．⁵¹ＣＲを用いた細胞の標識：ａ）10 mlの試験管中で以下のものを合わせる：195μlのRPMI/10%FCS（非働化）に懸濁した細胞；5μlの⁵¹ＣＲ(120μCi)。ｂ）37℃で２時間インキュベートする。ｃ）2 mlのRPMI/10% FCS（非働化）を加える。ｄ）FCS（非働化）の層を通して細胞を遠心し、過剰な標識を除去する。ｅ）パスツールピペットを用いて、標識化細胞を4 mlのFCSのクッションの上にそっと重層させる。ｆ）700 gで５分間4 ℃で遠心する。ｇ）細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去する。ｈ）ペレットをRPMI/10% FCS（非働化）中に約3x10⁷個/mlの細胞密度で再懸濁する。３．アッセイ条件：ａ）PAE に対しては補体供給源としてウサギ補体を用いた。なぜなら、⁵¹ ＣＲ放出アッセイはヒト補体（これはより「活性」の低い供給源である）を用いた場合に溶解を検出できるほど十分な感度がなかったからである。対照的に、有意により感度が高いＬＤＨアッセイにおいては、補体の供給源として正常ヒト血清（ＮＨＳ）を用いた。ｂ）96ウエルＶ底プレートの各テストウエルに以下のものを加える： - 100μlの標識化細胞 - 10〜50μlのNHS(非働化)(最終濃度5〜25%) - 補体： PAE: 50μlの吸収されたウサギ補体(最終濃度25%) PK₁: 10〜40μlのNHS(最終濃度5〜25%) - 50μlの抗体（全抗ＧＡＬ(IgG + IgM、抗ＧＡＬ IgG、抗ＧＡＬ抗体枯渇血清、または抗ＧＡＬ抗体枯渇IgG) ｃ）必要であればRPMI/10% FCS（非働化）を用いて、容量を200μlに調整する。ｄ）プレートを37℃で３時間インキュベートする。ｅ）プレートを1000 rpmで5 分間遠心し、細胞をペレットにする。ｆ）各ウエルから100μlの上清を除去し、γカウンターチューブに移す。ｇ）3 mlのシンチレーション液を加え、γカウンター(Packard Instrumen t Company，Illinois，USA)を用いて⁵¹ＣＲの放出を測定する。（最大放出を測定するため、RPMI/10%FCS（非働化）を用いて調製した100 μl の8% Triton X-100を100 μlの標識化細胞に加える。）（注：各反応は１サンプルについて４個のウェルを用いて実施する。）４．溶解パーセントの計算：５．補体誘導細胞毒性の糖阻害： 96ウエルのテストプレートで、以下のものを混合する： - 50μlの標識化細胞 - 50μlの補体（PAE細胞用: ブタ脾細胞に吸収させた補体；PK₁細胞用: NHS） - x μlの糖（糖の最終濃度：10^-1から10^-3M） - y μlのNHS（非働化）- （最終濃度5 〜20％） - 容量を200μlにするRPMI。プレートのレイアウト：Ｂ．ＬＤＨ放出アッセイ１．全般的手順：ａ）⁵¹ＣＲ放出アッセイの場合と同様に細胞を調製し、製造者の指示(C ytotox非放射性LDH放出アッセイ，Promega，USA)に従ってこれをLDHで標識する。ｂ）96ウエルプレートの各ウエルに以下のものを加える（各反応は１サンプルについて４個のウェルを用いて実施する）： - 25μlの標識化細胞 - 5 〜20μlのNHS - x μlの糖（糖の最終濃度：10^-1から10^-3M） - 全容量を100μlとするRPMI/10%FCS（非働化）。ｃ）プレートを37℃で3時間インキュベートする。ｄ）プレートを1500 rpmで5分間遠心する。ｅ）（細胞を除去しないよう注意しながら）各ウエルから50μlの上清を除去し、50μlの基質混合物（製造者の指示に従って調製されたもの）を含有するELISAプレートに移す。ｆ）トレーにカバーをし、遮光して室温で30分間インキュベートする。ｇ）マルチチャンネルピペットを用いて各ウエルに50μlの停止液を加える。ｈ）492 nmにおける吸光度を読む。２．対照：ａ）自然放出（抗体または補体なし） - 25μlの標識化細胞 - 75μlのRPMI/10%FCS（非働化）ｂ）最大放出 - 25μlの標識化細胞 - 50μlの16% Trison X-100 - 25μlのRPMI/10%FCS（非働化）３．溶解パーセントの計算：４．実験設計：プレート１縦列：1. 自然放出横列: 1-4: 細胞 + 糖なし 2. 最大放出 5-8: 細胞なし + 糖なし 3. 5% 血清 4. 10% 血清 5. 25% 血清 6. RF10単独プレート２メリビオースプレート３ガラクトースプレート４ラクトースプレート５スクロースプレート６〜９プレート２〜５に同じ、ただし細胞は添加しない。糖濃度縦列：1-2 1 x 10^-1M 横列: 1-2 0% 血清 3-4 5 x 10^-2M 3-4 5% 血清 5-6 1 x 10^-2M 5-6 10%血清 7-8 5 x 10^-3M 7-8 25%血清 9-10 2 x 10^-3M 11-12 1 x 10^-3M ５．ブタ脾臓に吸収させたウサギ補体の調製：ａ）ブタ脾臓（地元の屠殺場より入手）を小さい断片に切断し、細かい金属製のふるいを通過させることにより単細胞懸濁物を調製する。ｂ）700 g で7 分間4 ℃で遠心して、細胞をペレットにする。ｃ）細胞ペレットをRPMI/10%FCS中に再懸濁し、遠心を繰り返す。ｄ）RPMI/10%FCS/10%ジメチルスルホキシド(DMSO)中に再懸濁する。ｅ）細胞を数え、凍結アリコートを保存する（3 x 10⁹細胞／アリコート）。 - 各吸収にアリコート１個を使用する。ｆ）吸収のためには、アリコートを融解し、600 gで5分間4℃で遠心し、DMSOを含有する上清を除去する。ｇ）RPMI/10%FCS(10 ml)で２回洗浄する。ｈ）細胞ペレットをウサギ補体中に再懸濁する；４℃で２時間混合（回転ホイール）する。ｉ）600 gで5分間4℃で遠心し、ウサギ補体を含有する上清を除去する；４℃で保存する。ＩＩ．結果両方の溶解アッセイを用いた両方の細胞型(PAE及びPK₁)について匹敵する結果が得られた。典型的溶解実験の結果を図２に示す。この実験では、⁵¹ＣＲ放出アッセイを用いて、ヒト血清および精製抗ＧＡＬ抗体によるPAE細胞の溶解が測定された。⁵¹ＣＲ放出アッセイを用いたPK₁細胞についても、LDH放出アッセイを用いた両細胞株についても、匹敵する結果が得られた。これらのアッセイの結果は以下のように要約することができる：１．ヒト血清中の異種抗体(NXAb)は補体の存在下でブタ細胞を溶解することができる。溶解は血清濃度が増加するにつれ増加する。２．ブタ脾細胞（これはNXAbを除去する）を用いたNHSの前もっての吸収: 溶解なし。３．非働化補体の使用：溶解なし。４．抗ＧＡＬ抗体を枯渇させたNHSの使用：溶解なし。５．精製全抗ＧＡＬ抗体(IgG + IgM)の使用：溶解。６．精製抗ＧＡＬ IgGの使用：溶解なし。７．精製全抗ＧＡＬ抗体(IgG + IgM)およびジチオトレイトール(DTT)の使用：溶解なし。（DTTはIgGに影響を及ぼすことなくIgM抗体の多量体構造を破壊する還元剤である。）これらの結果は全体として、抗ＧＡＬ抗体が観察される溶解に関与していることを示している。精製抗ＧＡＬ IgGおよびDTT処理全(IgG + IgM)抗ＧＡＬ抗体は溶解を生じさせなかった。これは、IgG抗体ではなくIgM抗体がこの系の原因となる作用物質であることを示している。この観察を立証しようとする、真性グロブリン分画またはα-IgMアフィニティークロマトグラフィーにより粗形態に調製された精製IgMを用いた予備的な試みは、成功しなかった。本発明者らは、これはブタ細胞の溶解を引き起こす抗ＧＡＬ IgMの能力の真の反映ではなく、調製の間のIgMの不活性化を反映するものと考える。補体の非働化は溶解を妨げた。これは、ブタ細胞の溶解は補体依存性の現象であることを示している。二糖であるメリビオース(Gal α1 →6 Gal)およびラクトース(Gal β1 →4 Gl u)添加がヒト血清によるPAE細胞溶解に及ぼす効果を、Cytotox非放射性LDH放出アッセイを用いて評価した。異種抗体および補体の供給源としての50%ヒト血清の存在下で、種々の濃度の各糖(1 mMから100 mM)と共に、PAE細胞をインキュベートした。これらの条件下で、Gal α1 →6 Gal 配置を有するメリビオースはブタ細胞を溶解から保護したが、β1 →4 配置において末端Gal 部分を有するラクトースは保護しなかった。実施例５ヒト血清によって誘導されるラット心臓損傷の糖による抑制超急性拒絶における抗ＧＡＬ異種抗体の関与をさらに示すため、ランゲンドルフ摘出灌流ex vivo心臓モデルを使用した。Ｉ．方法Ａ．ヒト血漿の調製および保存１．新鮮なヒト血液を3000 rpmで10分間4℃で遠心し、赤血球(RBC)を除去する。２．血漿を除去する。３．血漿を10,000 rpmで10分間4℃で遠心し、残っている細胞を除去する；血漿をデカンテーションする。４．血漿各50 mlに対し、2.5 mlの0.1 M EDTA pH 7.30を加える。５．50 mlアリコートを-70 ℃で保存する。６．熱不活性化血漿を得るためには、56℃で60分間加熱し、次に2,500 rpm で10分間遠心する。Ｂ．補体活性の評価 ex vivoモデルに使用する前に、熱不活性化血漿および対照血漿の両方を補体活性について試験した。Weirら(編)，Handbook of Experimental Immunology an d Immunochemistry，第4版，Blackwell Scientific Publications(1986)中にHar risonおよびLachmanが記述するように、感作ヒツジRBCを用いて溶血により古典的補体活性を測定した。第二補体経路活性は、Serraisら，J．Immunol．Meth．1 40:93-100（1991）が記述するように、ウサギ溶血アッセイを用いて測定した。アッセイは、EGTAおよびMgCl₂を含有する緩衝液中で実施した。EGTAはCa⁺⁺をキレート化し、したがって古典経路を阻害する。Mg⁺⁺は、第二経路のC3転換酵素であるCdbBbの活性化および組み立てに必要とされる。Ｃ．心臓灌流のための血漿の調製異なる血液パックより調製した血漿を37℃で融解し、プールし、濾過(100μm スチールメッシュ、8.0μmおよび4.5μm Millipore フィルターを連続的に用いて）する。血漿１ mlに対しCaCl₂を0.58 mg添加し、灌流の準備が整うまで血漿を氷上に置いておく。Ｄ．Ex Vivo 摘出灌流齧歯類心臓モデル１．ラットをネンブタール［体重ｇあたり1 μlのナトリウムペントバルビトン(60 mg/ml)］で麻酔し、またマウスをエーテルで麻酔する。２．外科的に心臓を暴露し、ヘパリン(ブタ粘液性、10,000 U/ml)を大腿静脈に注射する（ラット：0.3 mlを注射）。３．心臓を摘出し、ヘパリン含有（緩衝液50 ml中0.2 ml）クレブス−ヘンゼライト緩衝液に入れる。クレブス−ヘンゼライト緩衝液: - 119 mM NaCl - 25 mM NaHCO₃ - 4.6 mM KCl - 1.2 mM MgSO₄・7H₂O - 1.3 mM CaCl₂・2H₂O - 1.2 mM KH₂PO₄ - 11 mM グルコース - 0.25%（v/v）BSA - pH 7.4に調整し、4℃で保存する。４．大動脈をランゲルドルフ灌流装置のカニューレに接続し、きっちりと結ぶ。灌流装置は、DoringおよびDehnerrt，The Isolated Perfused Heart Accord ing to Langendorf，Bionesstechnik-Verlang March GmbH，D7806，West German yに記述されているランゲンドルフ心臓モデルの実験要件にしたがって、本発明者らによって組み立てられたものである。５．クレブス−ヘンゼライト緩衝液（毎日新しいものを調製）を用いて灌流する。この緩衝液は、カーボゲン(carbogen)(95% O₂，5% CO₂)を用いて100 mmHg の圧力で37℃で継続的にガス処理をほどこされる。６．変換器(Physiograph MK-111-S，Narco Bio-Systems)に接続したフックを心尖に取り付ける。７．クレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いて心臓を20分間灌流し、心臓を安定化させる（レザバー容量：270 ml）。８．（前もって37℃に温めておいた）血漿を以下のように加える： - 20 分目、10 mlの血漿を添加（＝5% 血漿） - 25 分目、10 mlの血漿を添加（＝9% 血漿） - 30 分目、10 mlの血漿を添加（＝13% 血漿）９．心臓をさらに30分間モニターし、心臓流量および収縮速度を記録する。Ｅ．糖灌流１．上記のように心臓をクレブス−ヘンゼライト緩衝液中で30分間安定させる。２．2.5 mlの1.08 M 糖原液をレザバーに加える；全容量＝270 ml; 最終糖濃度= 10 mM。３．心臓を10分間、再度安定化させ、次に上記のスケジュールにしたがって血漿（対照または熱不活性化）を加える。４．心拍および流量を記録する。Ｆ．抗ＧＡＬ抗体枯渇血漿の大規模調製（すべての操作は４℃で実施する。）１．200 mlの新たに調製したヒト血漿を用いて開始する；100 mlを枯渇に付す;100 mlを同一の患者から同じ日に引き出した、非処理対照として使用する;４ ℃で保存する。２．100μmおよび8 μmの金属シーブ、および最後に0.45μmのMilliporeフィルターを通して血漿を連続的に濾過する；PBS(pH 8.0)を用いて1000 ml に希釈する。３．Amiconの渦巻きカートリッジを用いて200 mlに濃縮する（塩を除去する）。４．メリビオース・セファロースカラム(40 ml)を、PBS，pH 8.0（10カラム容量）で平衡化する。５．血漿をメリビオース・セファロースカラムに通す；通過した血漿を回収し、-70℃で保存する（＝部分枯渇血漿）。６．溶出液のO.D.(280 nm)が約ゼロになるまで、カラムをPBS，pH 8.0（10 カラム容量）で洗浄する。７．部分枯渇血漿と洗浄由来の溶出液を合わせる；200 mlに濃縮する(Amico n渦巻き濃縮器)。８．4Mグアニジニウム HCl pH 6.4（2カラム容量）を用いて抗ＧＡＬ抗体画分を溶出する。９．PBS(10カラム容量)を用いてカラムを再生する。 10．全工程をさらに２回繰り返す。すなわち、血漿を再度メリビオースカラムに通し、洗浄し、抗ＧＡＬ画分を溶出し、そしてカラムを再生する。 11．抗ＧＡＬ抗体枯渇画分を得るためには： - メリビオース・セファロースカラムからの溶出液を最終洗浄由来の溶出液と合わせる。 - クレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いて容量を５リットルに調整し、 EDTAを10 mM まで加える; pHを7.0に調整する。 - 元の容量に濃縮する(Amicon渦巻き濃縮器); 35 mlのアリコートに分け、-70℃で保存する。 12．抗ＧＡＬ抗体画分を得るためには： - 溶出した抗ＧＡＬ抗体画分を合わせ、クレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いて５リットルに希釈し、EDTAを10 mM まで加える。 - 10 mlに濃縮する(Amicon渦巻き濃縮器); 1 mlのアリコートに分け、- 70℃で保存する。 13．抗ＧＡＬ抗体枯渇画分および精製抗ＧＡＬ抗体画分を以下の点について試験する：ａ）抗ＧＡＬ反応性：ブタ細胞(PK₁)を染色する一次試薬として用いる。上記実施例２に記述するように、染色を検出する。染色されたサンプルをFACS can II(Becton Dickinson)を用いて、製造者の指示にしたがって分析する。ｂ）タンパク質含量：精製ヒトIgGを標準品として用いて、Bradford，A nal．Biochem．72:248-54(1976)の比色法によって測定する。ｃ）電解質濃度：灌流を実施する日に、抗ＧＡＬ抗体枯渇血漿も電解質自動分析機(Olympus)を用いて試験して、カルシウム、マグネシウム、およびカリウムレベルを測定する; 各レベルを必要であれば正常値に調整する。ＩＩ．結果ラット心臓をランゲルドルフ装置に接続し、次にクレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いて10分間、さらにメリビオースまたはラクトース(10 mM)を含有する上記緩衝液を用いてさらに10分間灌流することにより安定させた。次に、ヒト血漿を最終濃度13%まで上記のように段階的に加え、添加した糖の心臓機能に及ぼす効果を評価した。測定したパラメーターは心拍数、収縮の振幅（強度）および心拍出量であった（図３参照）。ヒト血清単独の存在下では（下の線参照）、心臓は本質的に数分以内に鼓動を停止した。ラクトースを加えた場合にも同じ結果が得られた。しかし、メリビオース（上の線参照）または抗ＧＡＬ抗体枯渇血漿の存在下では、心臓は強い鼓動を維持できた。精製抗ＧＡＬ抗体を抗ＧＡＬ抗体枯渇血漿に加えた場合、心臓は再び数分以内に鼓動を停止した。実施例６ブタα-1,3-GalT遺伝子の特徴付けブタα-1,3-GalTをコードするｃＤＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション( PCR)技法により創出した。ChomczynskiおよびSacchi，Anal．Biochem 162，156- 159(1987);Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版)，Col d Spring Harbor Laboratory Press（1989）に記述されているように、ブタ肝臓切片を7M グアニジニウムチオシアネート中でホモジナイズすることによりブタ肝臓の全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡへの転写に先立って、16μg の上記ＲＮＡを1 μg のオリゴdTプライマーと共に、5 分間65℃で熱変性させた。ｃＤＮＡへの転写は、100μlの反応液中でトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)の逆転写酵素を用いて、37℃で90分間実施する。ｃＤＮＡ合成溶液の3μlを、次のPCR増幅に用いた。ｃＤＮＡ創出のために用いた一般的手順は、前出のSambrookら(1989)により提供されている。 PCR用のプライマーは、Applied Biosystems DNAシンセサイザーを用いてホスホルアミダイト法により合成した。PCRプライマーの配列は、マウスおよびウシ α-1,3-GalT遺伝子について公表された配列内の対応する保存された領域に基づいていた。Joziazzeら，J．Biol．Chem 264:14290-97(1989);Joziazzeら，J.Bio l．Chem 267:5534-5541(1992)参照。すべてのプライマーは、クローニングしやすいように5'末端にEcoR1リンカーを付けて合成した。この試験に使用したプライマーの以下のリストにおいて、ウシおよびマウスの間で異なるヌクレオチド位置には一本の下線が施してある; ウシおよびヒトの間で異なるヌクレオチド位置には二重下線が施してある：エキソン２プライマー（フォワード）：（配列番号：１）名称： GTE2F -- 28量体 - ウシとマウスの間に相違１つ - ヒトエキソン２については、利用できる配列がないエキソン４プライマー（フォワード）：（配列番号：２）名称： GTE4F -- 28量体 - ウシ、マウスおよびヒトの間に相違なしエキソン９プライマー（リバース）：（配列番号：３）名称： GTE9R -- 28量体 - ウシとマウスの間に相違３つ - ウシとヒトの間に相違１つ３’−ＵＴＲプライマー（リバース）：（配列番号：４）名称： GT3UR -- 28量体 - ウシとマウスの間に相違なし - ウシとヒトの間に相違なしエキソン９プライマー（フォワード）：（配列番号：５）名称： GTE9F -- 28量体 - ウシとマウスの間に相違なし - ウシとヒトの間に相違３つ（配列番号：６） * Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ： ** Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ（プライマーはＶおよびＮについて全てのヌクレオチド変異型を含む。）名称： APATR -- 28量体ブタα-1,3-GalT ｃＤＮＡ断片を作成するのに使用したPCR条件は以下の通りであった：１）GTE2F + GTE9R およびGTE4F + GTE9R について：94℃に加熱する(60秒間)；次に以下の３工程を35サイクル繰り返す：(1)94℃、40秒間、(2)57℃、50秒間、および(3)72℃、80秒間。２）GTE9F + GT3UR について: 94℃に加熱する(120秒間);次に以下を35サイクル繰り返す：(1)94℃、40秒間、(2)48℃、45秒間、および(3)72℃、60秒間。 PCR断片をEcoR1で切断したpBluescript II KS+(Stratagene，カタログ番号212 206)中にサブクローン化し、チェーンターミネーション法を用いてＤＮＡ配列を決定した。ＤＮＡ配列は、DNASIS-Mac v2.01 (Hitachi)を用いて組み立て、分析した。ブタα-1,3-GalT のヌクレオチド配列（配列番号：７）およびこの酵素の推定されるアミノ酸配列（配列番号：10）を図４および５に示す。一個の大きいオープンリーディングフレームがヌクレオチド91の開始メチオニンからヌクレオチド 1204に位置する終止コドンまで伸びている。上記の推定上の開始メチオニンを取り囲む配列は、真核細胞の共通開始配列に合致している。Kozak，Cell 44，283- 92(1986)参照。図４において、ブタｃＤＮＡ配列を対応するマウス（配列番号：９）およびウシ（配列番号：８）配列を比較している。マウス遺伝子内のイントロンの位置も示してある。Joziazzeら，J．Biol．Chem 267:5534（1992）参照。この配列一覧は、マウス遺伝子の5'非翻訳領域に位置するエキソン３が、ブタｃＤＮＡにもウシｃＤＮＡにも見い出されないことを示している。コード配列間の全般的配列同一性は以下の通りである：ａ）マウスと比較したブタ：75.02%（エキソン３は考慮せず）ｂ）ウシと比較したブタ：85.15% ブタ（配列番号：10）、マウス（配列番号：12）およびウシ（配列番号：11）のα-1,3-GalT 酵素のアミノ酸配列を図５に示す。イントロンの位置もまた、マウス遺伝子内のそれらの位置に基づいて示してある(Joziazze ら，1992)。この配列一覧は全般的アミノ酸相同性が以下の通りであることを示している：ａ）マウスと比較したブタ：71.98% ｂ）ウシと比較したブタ：82.87% ｃ）マウスと比較したウシ：73.72% 実施例７ α-1,3-GalT遺伝子を中断する可能性のある部位の同定本発明者らによる、α-1,3-GalT遺伝子を中断する部位の選択は、この遺伝子の幾つかの特徴およびその発現に影響された。特に、α-1,3-GalT の幾つかのｍＲＮＡがマウスにおいて検出されている。Joziazzeら，J．Biol．Chem 267:5534 （1992）参照。これらのｍＲＮＡはエキソン５および／または６が削除される可能性のある選択的スプライシングの産物である。したがって、これらのエキソンはマウスにおける適切な中断部位ではない。なぜなら、機能性α-1,3-GalT 酵素をコードする転写物は恐らくエキソン５または６がスプライシングされて落ちた場合にも形成されうるからである。さらに、本発明者らはブタから２つの異なるクラスのα-1,3-GalT ｃＤＮＡクローンを単離した。一方はエキソン５を含み、他方はエキソン５が欠失している。エキソン６を含む、または含まないｍＲＮＡも、ブタにおける選択的スプライシングにより形成されうる。したがって、最初の実験のために、本発明者らは中断部位としてこれらのエキソンを選択しなかった。中断性ＤＮＡ断片をエキソン４（これは細胞質NH₂-末端ドメインおよび膜アンカーリング(anchoring)ドメインをコードしている：図５参照）に挿入することは、活性α-1,3-GalT をコードする転写物の生産を乱すであろう。したがって、このエキソンはα-1,3-GalT遺伝子を中断するのに適切な部位である。同様に、触媒ドメインのNH₂-末端領域をコードするエキソン７および８も適切な中断部位である。これらのエキソン内に中断性ＤＮＡ断片を挿入することは、活性な触媒ドメインの合成を妨げるであろう。マウス遺伝子を中断するのに好ましい部位は、マウスα-1,3-GalT遺伝子のエキソン９内に見いだされる、コドン221 + 222 のSal1部位に位置する（図５参照）。この部位はCOOH-末端から150アミノ酸離れた所にあり、触媒ドメイン内にある。本発明者らの相同組換えのための構築物内にあるマウス遺伝子は、このSal1 部位で中断される。このSal1部位におけるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸は、ブタおよびウシ配列において保存されている(Sal1部位それ自体は保存されていないが)。ブタ遺伝子におけるこの位置でのSal1部位の構築（すなわち、in vitro突然変異誘発による）は、この遺伝子を不活性化する有用な構築物を提供する。実施例８ α-1,3-GalT遺伝子を中断するＤＮＡ断片の選択本発明者らは、α-1,3-GalT遺伝子を中断するため、ネオマイシン耐性遺伝子( neo^R)およびハイグロマイシン耐性遺伝子(hyg^R)の両方を用いた。一組の「ノックアウト」構築物においては、neo^Rおよびhyg^R遺伝子はマウスホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターに連結され(Adraら，Gene 60:65-74(1987))、そして両方ともEcoRVおよびClaIの制限部位を含むポリリンカー配列に両端を接する。別の構築物においては、neo^R遺伝子の発現は変更されたポリオーマウイルスプロモーター(PMC1; ThomasおよびCappechi，Cell 51: 503-12(1987))によって引き出される。この構築物を用いて、本発明者らは移植体器官のゲノム内に抗生物質耐性遺伝子を含む問題に取り組んだ。すなわち、ある状況下では、移植される器官内に抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を有することは望ましくない場合がある。酵母のFLP/FRTリコンビナーゼ系が、α-1,3-GalT遺伝子を中断する配列からneo^R遺伝子を除去するために使用された。本発明の構築物において、neo^R遺伝子は5'および3'末端の両方でFRT ＤＮＡ要素に接している。さらに、３つのリーディングフレームのそれぞれに対する終止コドンが、neo^R遺伝子の3^'末端側に挿入されている。そして、これらの終止コドンは、FLPによってneo^R遺伝子が削除された後、１つのFRT配列と共にα-1,3-Gal T遺伝子内に残る。FRTの直接反復に両端を接したneo遺伝子のゲノムコピーを担持する組換え細胞は、FLPリコンビナーゼを用いて２つの方法により供給されうるであろう：１）部分精製FLPタンパク質の細胞への導入： FLPタンパク質(0.1〜10μg)を、標準的エレクトロポレーション条件を用いて、約10⁷個の細胞に導入（「トランスフェクト」）する。細胞をゼラチン処理した組織培養皿で適切な培地中に個別コロニーをもたらすに十分な希釈度でプレートする。次に、更なる分析のために、これらのコロニーの約200を取る。２）FLP遺伝子を有するプラスミドを用いたトランスフェクション： FLP発現を引き出すことのできるプロモーター（例えばヒトインターフェロン誘導性6-16プロモーター）の制御下にあるFLP遺伝子を含有するプラスミドを標準的方法にしたがって構築する。Porterら，EMBO J．7:85(1988)参照。約10μg のFLP発現プラスミドを、標準的エレクトロポレーション条件を用いて、約10⁷個の細胞にトランスフェクトする。ヒト6-16プロモーターを有するプラスミドを用いる場合は、FLPの発現を誘導するため、約500単位/mlの割合でインターフェロンを加える。次に、上記(1)に記述するように細胞を処理する。 FRT含有構築物を用いた、ES細胞中のα-1,3-GalT遺伝子をノックアウトする手順は、以下の通りである：ａ）完全な構築物を、エレクトロポレーションによりES細胞中に導入する。ｂ）neo^R細胞を選択し、中断されたα-1,3-GalT遺伝子を有するES細胞を同定する。ｃ）上記のようにFLPリコンビナーゼを用いてneo^R遺伝子を削除する；削除がなされたかどうかについて、細胞を以下のように試験する：第１に、選択された各細胞系のサンプルを化学物質G418で処理することにより neo^R遺伝子の不在について試験する。neo^R遺伝子がゲノム中にまだ存在しているのでなければ、細胞はmlあたり約200μgのG418の存在下で死滅する。次に、G418 感受性細胞をさらに試験して、neo^Rの削除が起こったことを確認する。これは、 Sambrookら(1989)に記述されているサザン分析又はPCR分析により行なう。サザン分析のためには、細胞からゲノムＤＮＡを単離し、適切な制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動にかけ、そして消化されたＤＮＡを膜に移す。このＤＮＡを標識化プローブとハイブリダイズさせ、標識を検出（例えば、Ｘ線フィルムまたは発色を利用して）すると、バンドのパターンがその細胞系でneo^Rの削除が起こったかどうかを示す。PCR分析のためには、細胞からゲノムＤＮＡを単離し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR反応に付す。ｄ）neo^R削除の確認に次いで、操作されたＥＳ細胞またはＰＧＣ細胞を用いてキメラ動物を創出する。実施例９マウスにおけるα-1,3-GalT遺伝子を中断するＤＮＡ構築物の調製遺伝子ターゲッティング(targeting)（相同組換え）は、ターゲッティングに用いるクローン化ｃＤＮＡ断片が遺伝子ノックアウトに用いる細胞系から単離される（すなわち、ＤＮＡが「同質遺伝子」である）場合、より効果的である。したがって、ＤＮＡをE14 ES細胞系(Hooperら，Nature 326: 292-95(1987))より単離し、これを使用してマウスゲノムライブラリーを構築した。制限酵素Sau 3Aを用いてＤＮＡを部分的に切断し、大きさが12 kb〜20 kbの断片をグリセロール勾配分画により単離した。サイズ分画したＤＮＡをλEMBL3のBam H1部位に連結し(Sambrookら、1989、前出)、in vitroでパッケージしてラムダファージ粒子を形成した。ラムダライブラリーを大腸菌株PMC103宿主細胞に感染させることにより(Dohertyら，Gene 124: 29-35(1993))、プレートあたりファージ4 x 10⁴個の密度でプレートした。長さが約900 bpで、エキソン7〜9に対応するα-1,3-GalT 遺伝子の一部分を含有するウシｃＤＮＡクローンを使用して、合計5.6 x 10⁵個の独立した組換えファージを釣り上げた。α-1,3-GalT遺伝子を含有する４つの重複するクローンを単離し、精製した。これらのクローン内にあるSalI制限部位をマップし（図６参照）、そして２個のクローン（λ３およびλ５）由来の4.0k b，5.5kb，11kbおよび12kbのSalI断片をpBlueScript KS+（Stratagene）またはp UBS(pBlueScript KS+ ポリリンカーを担持するpUC19)にサブクローン化し、制限部位のさらなる詳細なマッピングを容易にした。これらの４個のサブクローン(pαGT-S4.0、pαGT-S5.5、pαGT-S11およびpαG T-S13と称する)を、制限酵素BamHI，EcoRI，HindIII，XbaI，XhoI，KpnI，SacI ，SacII，EcoRV，PstI，SmaI，NotI およびBgIII による制限部位についてマップした。pａGT-S4.0およびpａGT-S5.5は、PvuI，PvuII，NdeI およびSphI制限部位についてもチェックした。これらのデータから上記４個のサブクローンの詳細な制限地図を作成した（図7〜12参照）。これらの地図に基づいて、ノックアウト戦略を考えた。基本的には、この戦略はエキソン９内に存在するSalI部位に耐性遺伝子(neo^Rまたはhyg^R）を挿入するというものである。ノックアウト構築物は、pａGT-S4.0およびpαGT-S5.5由来の、エキソン9 SalI部位に接する4.0 および5.5kb SalI断片を担持する。（図１３参照）次に、ゲノム領域を表すが、ノックアウト構築物に含まれるＤＮＡの外（すなわち、pαGT-S4.0およびpαGT-S5.5にカバーされる9.5kbの外）に存在するＤＮＡ断片を用いることにより、相同組換え現象についてのスクリーニングが実施できる。pａGT-S11由来の0.7kb EcoR1/XmnI断片を用いて、BgIII消化ES細胞ＤＮＡのサザンブロットを相同組換え現象についてスクリーニングする。中断されていないα-1,3-GalT遺伝子がこのEcoR1/XmnI断片によって釣り上げられた場合は、これらのサザンブロット上に8.3kbのバンドが現れるはずである（図14参照）。相同組換え現象後のneo^R遺伝子の挿入は、ノックアウト構築物内にエキソン9 SalI位に接するBg1II部位が存在するため、6.4kbのバンドを生ずるであろう。したがって、6.4kbバンドの存在は相同組換えの診断に役立つ。この戦略を実施するため、本発明者らは一連のノックアウト構築物を作成した。このような構築物の１つの創出を、図15に詳細に示す。エキソン9 SalI部位の 3'に直接接する5.5kb 断片を担持するベクターpαGT-S5.5を出発ベクターとして選択した。pαGT-S5.5をEcoRVおよびClaIで消化し、平滑末端とClaI適合性末端を有するベクターを創出した。PMC1プロモーターによって駆動される、FRT部位に接しているneo^R遺伝子を担持する1.3kb断片を、プラスミドpNeo2FRT（本発明者らにより前もって構築された）より切り取った。これはプラスミドをBamHIで消化し、制限部位を埋め、次にClaIで消化して平滑末端とClaI適合性末端を有する断片を創出することにより行なった。この1.3kb断片のヌクレオチド配列を図1 6（配列番号：13）に示す。次に、この断片をClaI/EcoRV消化pαGT-S5.5に連結し、連結反応混合物で形質転換を行い、そしてコロニーを組換え体についてスクリーニングした。pαGT-S5.5のEcoRV/ClaIに挿入されたNeo^R断片を含有する１つのコロニーを、診断用制限酵素ClaI，EcoRV，XbaIおよびEcoRIを用いた消化後の制限パターンに基づいて回収した。この構築物をPNeoαGT6.8と名付けた。 pNeoαGT6.8をSmaIで消化して、平滑末端を有するベクターを創出した。pαGT -S4.0より4.0kb Sal1断片を切り出し、末端を平滑にした。次に、この断片をSma I消化pαGT-S5.5に連結し、連結反応混合物で形質転換を行い、そしてコロニーを組換え体についてスクリーニングした。pNeoαGT6.8のSmaI部位に挿入された4 .0kb Sal1断片を含有し、そしてエキソン９の5'末端部分が近くのSalI 5.5kb断片内のエキソン９の3'末端部分の近くに位置する、４個のコロニーが回収された。挿入配列の同一性および方向を、診断用制限酵素XbaI，EcoRI，HindIII，BamH I，EcoRVおよびその他を用いた消化後の制限パターンによって確認した。この構築物をpNeoαGT10.8と名付けた。 pNeoαGT10.8をClaIで消化し、ClaI適合性末端を有するベクターを創出した。２個の相補的オリゴマーを合成し、これらはアニールされて、３個のリーディングフレームのすべて及びBgIII部位に翻訳終止コドンを含有するリンカーをもたらした。このリンカーはClaI適合性末端を有する。このリンカーをClaI消化pNeo αGT10.8に連結し、連結反応混合物で形質転換を行い、そしてコロニーを組換え体についてスクリーニングした。pNeoαGT10.8内のClaI部位に挿入された上記リンカーを含有する多数のコロニーが、診断用制限酵素Bg1II，ClaおよびBg1II/No tIを用いた消化後の制限パターンに基づいて回収された。この構築物の配列決定を行なって、挿入配列の同一性、コピー数、および方向を確認した。この構築物をpNeoαGT10.8Bと称する（図17参照）。実施例１０ＥＳ細胞 - 一般的材料および方法作業条件全ての細胞系（胚幹、始源胚芽、および胎児繊維芽細胞系）の単離および培養手順は、汚染性微生物の増殖を防ぐため、無菌条件を必要とする：１．研究室のベンチの上および装置のすべては、使用前に70%エタノールで拭く。２．すべての外科的器具は使用前にオートクレーブ滅菌する。３．培地調製およびガラス器具の洗浄に用いる水は高品質のものである(例えば、Milli-Q 超純粋装置(Millipore)に通して調製したMilli-Q water)。４．ガラス器具は、使用前にMilli-Q waterで広範に洗浄してから乾熱滅菌またはオートクレーブ滅菌する。５．すべての組織培養作業は層流条件下で実施する（Hepa濾過水平層流ワークステーション）。６．すべての培地は使用前に濾過滅菌する（22μm 使い捨てフィルター）。７．細菌汚染の危険を最小限にするため、抗生物質を使用する（細菌に対してペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン；真菌に対してナイスタチン）。培地／溶液の調製ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) 10.0 g DMEM 粉末 - Gibco （ピルビン酸を含有する、または含有しない、低グルコースまたは高グルコース組成物が使用できる；L-グルタミンを含む） 1.0 リットル Milli-Q水 3.7 ｇ NaHCO₃ 溶解するまでゆっくり攪拌する。 pHを約7.2に調整する。濾過滅菌する（濾過滅菌後、pHは7.4 まで上昇する）。４℃に保つ。 STO 細胞培地 83.0 ml DMEM 15.0 ml 15%ウシ胎児血清(FBS);使用前にバッチ試験したもの 1.0 ml ペニシリン／ストレプトマイシン 1:100 1.0 ml グルタミン 1:100(必要であれば)(下記の注参照) 濾過滅菌し、４℃に保つ。注：完全な培地(DMEM 培地)(STOまたはES)にグルタミンを補う。 * この工程は培地が１週間〜10日齢より古い時にのみ必要とされる。この時期を過ぎるとグルタミンが壊れるからである。 LIFを含有する、または含有しないES細胞培地 100.0 mlまで DMEM 15.0 ml 15% FBS; 使用前にバッチ試験したもの; 下記参照） 1.0 ml（0.01M 原液より） β-メルカプトエタノール（最終濃度0.1 mM） 1.0 ml ペニシリン／ストレプトマイシン 1:100 0 〜1.0 ml グルタミン 1:100（必要であれば） 1.0 ml ナイスタチン 1:100 0 〜2.5 ml 組換えマウスLIF(4x10⁴U/mlより；1000 U/ml 原液); LIFアッセイを用いて活性を試験したもの（下記参照） 0.4 ml ゲンタマイシン 1.0 ml ヌクレオチド 1.0 ml 非必須アミノ酸ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液(1:100) - Commonwealth Serum Laboratories，Australia; カタログNo.05081901 ペニシリンG - 5000 U/ml 硫酸ストレプトマイシン - 5000 μg/ml マイトマイシン-C溶液 2.0 mg マイトマイシン-C（Sigma Chemical Co．(”Sigma”); カタログNo .M0503） 200.0ml STO細胞培地濾過滅菌し、10 mlのアリコート20個に分け、-20℃で保存する。リン酸緩衝化生理食塩水(PBS) 100 mlのMilli-Q 水に対して： pH 7.4に調整し、濾過滅菌する。 (Ca⁺⁺およびMg⁺⁺非含有PBSはICN Cell Biology and Tissue Culture より購入、カタログNo.18-604-54) トリプシン／ベルセン(TV)作業溶液(TV x l) PBS（Ca⁺⁺よびMg⁺⁺非含有）中： 0.25%（w/v）トリプシン（凍結乾燥したもの） 0.04%（w/v）EDTAまたはEGTA または：１リットルのMilli-Q 水に以下のものを加える：トリプシン粉末（ブタ、Difco） 2.5 g EDTAまたはEGTA 0.4 g NaCl 7.0 g Na₂HPO₄12H₂O 0.3 g KH₂PO₄ 0.24 g KCl 0.37 g D-グルコース 1.0 g Tris 3.0 g フェノールレッド 1.0 ml pH 7.6に調整し、濾過滅菌し、アリコートに分け、凍結保存する。 EGTA: エチレン-グリコール-ビス(β-アミノ-エチルエーテル)N,N,N',N'- 四酢酸［エチレン-ビス(オキシ-エチレンニトリロ)]四酢酸 EDTA: エチレンジアミン四酢酸 EDTAまたはEGTAを使用する。EGTAはES/PGC細胞に対して損傷を与えることが少ないので、EGTAが好ましい。ゼラチン作業溶液 Milli-Q 水に1%のゼラチン 60℃に加熱してゼラチンを溶かす。温かいうちに濾過滅菌する。組織培養プレートをゼラチン処理するため：１．上記ゼラチン溶液で皿を覆い、30分間放置する。２．ゼラチンを吸い出し、皿を空気乾燥する。ヌクレオシド原液 Milli-Q 水 100 ml アデノシン(Sigma) 80 mg グアノシン(Sigma) 85 mg シチジン(Sigma) 73 mg ウリジン(Sigma) 73 mg チミジン(Sigma) 24 mg １．37℃まで温めて溶解させる。２．温かいうちに濾過滅菌し、アリコートに分ける。３．４℃または-20℃で保存する。４．ＥＳ細胞培地中で使用するためのヌクレオチドの融解： (a)融解するとヌクレオチドが溶液から出て来る； (b)使用前に37℃に温めて再可溶化する。非必須アミノ酸(1:100) - Commonwealth Serum Laboratories; カタログNo.09751301 最小必須培地(Eagle)用100x濃縮物： (100 mlのES細胞培地に1.0 mlを添加する) mg/10 ml Milli-Q水グリシン 7.5 L-アラニン 8.9 L-アスパラギン・H₂O 15.0 L-アスパラギン酸 13.3 L-グルタミン酸 14.7 L-プロリン 11.5 L-セリン 10.5 Whitten培養培地 KCl 0.0356 KH₂PO₄ 0.0162 MgSO₄・7H₂O 0.0294 NaCl 0.4 NaHCO₃ 0.2106 グルコース 0.1 ピルビン酸ナトリウム 0.0036 乳酸カルシウム 5H₂O 0.0527 乳酸ナトリウム 0.2416 ml Milli-Q 水 100 ml 最終ミリオスモル濃度が250〜280になるように水またはNaClを加えて溶液を調整する。濾過滅菌し、4℃で2週間保存する。作業溶液： 10 ml Whitten培地 1.5 g BSAフラクションV（Miles Pentex，Diagnstic division，Kankakee ，II.，USA;コードNo.81-001-4）濾過滅菌し、5% O₂:5% CO₂:90% N₂中で39.5℃、95%湿度のもとで平衡化する。 FBSバッチ試験 FBSの各バッチは、ES細胞増殖を支持する能力およびこのような細胞の未分化状態を維持する能力において異なる。以下の手順はFBSの適切なバッチを同定するために使用される。2〜20継代由来のES細胞を使用する。第１日 ESコロニーを分割し、支持細胞を含有しないがLIFを含有する培養皿にプレートする。３日間インキュベートする。第４日トリプシン処理して細胞およびコロニーを剥がす。細胞数を数え、ES細胞培地およびLIF(血清無添加)を含有する、ゼラチン処理した6 cmの皿に以下のように分配する：各処理につき２つのプレートを用いる。低密度培養皿は５日間インキュベートする。高密度培養皿は３日間インキュベートする。第７日高密度細胞を固定し、ヘマトキシリンで染色する。第９日低密度細胞を固定し、アルカリホスファターゼによって染色する。 LIFアッセイこの手順は、白血病抑制因子(LIF)の効力をアッセイするのに用いられる。第１日 10cmの培養皿１枚分の集密なＳＴＯ細胞を５枚の皿に分割する。ＳＴＯ培地を用いて２〜３日間インキュベートする。第３／４日細胞が集密になったら、培地を DMEM + 10% FBS に交換する。３日間インキュベートする。第６／７日馴らし培地(CM)を回収し、４℃で保存する。＊低密度ＥＳ細胞培養物を上記のように調製する。各処理に３枚の皿を用いる。細胞を固定し、アルカリホスファターゼによって染色する。繊維芽細胞支持細胞層の調製胚多能性細胞を胎児繊維芽細胞の層上でin vitro培養する。この繊維芽細胞は、多能性胚細胞の増殖に必要な広範な因子（例えば、増殖因子、サイトカイン、ＥＳ細胞多能性の維持に必須な諸因子）を提供する。ブタ胎児繊維芽細胞の単離：１．無菌的解剖により発生中のブタ胎児（好ましくは発生16〜30日）を子宮から摘出する。２．胎児から皮膚層を除去する。３．発生中の内蔵を避けながら、軟組織を切り取る。白色の（繊維芽細胞を含有する）組織が皮膚層の直ぐ下に見いだされる。４．切り取った組織をPBS（Ca⁺⁺およびMg⁺⁺非含有）中で洗浄する。1000 rpmで５分間遠心する。５．上清を除去する。６．組織をトリプシン／ベルセン作業溶液中で20分間インキュベートする。７．強くピペットで取ることにより細胞を分離する。 1000 rpmで５分間遠心する。８．上清を除去する。９．ＳＴＯ細胞培地中に細胞を再懸濁する。大きい細胞塊を安定させる。 10．上清中の細胞（大きい細胞塊は含まれない）をゼラチン処理した組織培養プレートにプレートする。細胞を5% CO₂、95% 空気(37.5℃、95% 湿度)雰囲気下で、繊維芽細胞の集密な層が出現するまで（約4〜5日）インキュベートする。 11．細胞継代を続けて細胞数を増加させてもよいし、または使用時まで細胞を凍結あるいは不活性化させてもよい。凍結ストック由来の胎児繊維芽細胞支持細胞の培養：支持細胞層を形成するため、幾つかの異なる種類のマウス支持細胞(STO細胞) ならびにブタおよびウシ胎児繊維芽細胞が使用できる。これらは以下のものを含む： (１)ヒトLIFを発現するように改変されたBradley/BaylorマウスSTO支持細胞(All an Bradley，Institute for Molecular Genetics，Baylor College of Medicine ，Texas Medical Center，Houston，Texas，USAからの寄贈) (２)マウスLIFを発現するように改変されたRobertson/ColumbiaマウスSTO支持細胞(Elizabeth Robertson，Columbia University，New York，USA からの寄贈) (３)幾つかのブタ胎児繊維芽細胞系 (４)幾つかのウシ胎児繊維芽細胞系（繊維芽細胞系(3)および(4)は上に記述した手順を用いて本発明者らによって引き出された。）支持細胞層の作成手順は以下の通りである：１．10 cmの組織培養（組織養生）皿をゼラチン／Milli-Q 水溶液で30分間すすぐ。ゼラチン液を吸い出し、皿を空気乾燥させる。３．10 mlのSTO細胞培地を15 mlの遠心管に入れる。４．液体Ｎ₂容器から凍結培地中に凍結させた支持細胞層細胞を取り出す。５．バイアルを両手で、または37℃の水浴中で暖めて細胞を融解する。６．STO細胞を遠心管内の培地に移す。７．1000 rpmで５分間遠心する。８．10 mlの培地に細胞を再懸濁し、ゼラチン処理組織培養皿に移す。９．37℃で３日間インキュベートする。支持細胞層STO細胞／胎児繊維芽細胞の分割：この手順は、１個の集密なプレート／皿から細胞数を拡大するのに使用される；細胞をプレートから離し、集密以下の密度で新しいプレートに移す。１．10 cmの組織培養皿５枚をゼラチン処理する。２．インキュベートしたSTO細胞を顕微鏡で調べ、集密度をチェックする。３．STO支持細胞単層が集密であれば（細胞が皿の底を覆っている、またはほぼ覆っている）、PBS（Ca⁺⁺およびMg⁺⁺非含有）を用いて穏やかに1分間洗浄する。４．PBS を吸い出し、1 mlのトリプシン/ベルセン作業溶液を1分間（または細胞が離れ出すまで）加える。顕微鏡でチェックする。５．強くピペッティングすることにより細胞を離し、1.0 mlのSTO細胞培地を（すなわち、STO細胞培地：トリプシン/ベルセン作業溶液＝１：１の比で）加えてトリプシンを中和し、そして10から15 mlのSTO細胞培地を含有する遠心管に移す。皿に残った細胞を、上記遠心管のSTO細胞培地を若干用いて洗浄する。1000 rp mで５分間遠心し、上清を吸い出し、ペレットを1 mlのSTO細胞培地に再懸濁する。細胞を再懸濁して単細胞懸濁液を作成する。STO細胞培地を用いて50 mlにする。５枚の培養皿のそれぞれに10 mlずつ分注し、集密になるまでインキュベートする（約３日）。支持細胞層の不活性化：本発明者らは支持細胞層の不活性化するために２つの別な方法を用いる。これは細胞の分裂を停止させる： (１)マイトマイシン処理：１．STO細胞／胎児繊維芽細胞の集密度について培養皿をチェックする。２．マイトマイシン-C溶液を融解し、希釈せずに使用する。３．支持細胞プレートからSTO細胞培地を吸い出す。４．マイトマイシン-Cの10 mlアリコートをプレートに加え、37℃で1〜3時間インキュベートする。５．マイトマイシン-Cを吸い出し、細胞を1 x PBS(Ca⁺⁺またはMg⁺⁺非含有)中で1 分間洗浄する。６．PBSを吸い出し、1 mlのトリプシン溶液を1分間加える。７．強くピペッティングすることにより細胞を離し、遠心管内のSTO細胞培地に移す。８．1000 rpmで５分間遠心する。９．細胞ペレットを1 mlのES細胞培地に再懸濁する。 10．ES細胞の添加に備えて、皿にプレートする。 (２)γ線照射：１．STO細胞／胎児繊維芽細胞の集密度について培養皿をチェックする。２．細胞をトリプシン処理して、単細胞懸濁液とする。３．STO細胞培地中で細胞を照射する（3000ラド）。４．1000 rpmで５分間遠心する。５．細胞ペレットを1 mlのES細胞培地に再懸濁する。６．ES細胞培地を含有するゼラチン処理組織培養皿に細胞を移し、細胞が皿に接着するまで37℃のインキュベーターに入れておく。注：細胞が集密でない場合は、血球計数器を用いて細胞数をかぞえ、Nunc 4-ウエルプレートの１ウエルにつき1 mlの培地に細胞 5x10⁴個の密度で接種する。10 cmの培養皿１枚分の不活性化細胞を以下のものに分割できる： 10枚の4-ウエルプレート(Nunc 組織培養プレート)、または８枚の3.5 cm組織培養皿、または３枚の6 cm組織培養皿、または２枚の20 cm組織培養皿。全能性の証明：Ａ．胚盤胞注入胚細胞系の生殖系列キメラ動物を形成する能力は、全能性についての決定的な試験である。これは、マウスについて確定された技法と実質的に同一な、種々の哺乳動物種に対する技法を用いて、胚盤胞注入実験によって達成することができる。下記の実施例１４参照。また、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell s：A Practical Approach(E.J．Robertson 編)，IRL Press，Oxford中のBradley ，Production and Analysis of Chimeric Mice，pp.113-52(1987)参照。しかし、ブタの胚はマウスの胚より大きいので、ブタを操作するためにはホールディング(holding)ピペットは若干大きいものでなければならない。Ｂ．ES細胞/PGC細胞および桑実胚の同時培養過排卵させた動物より発生の桑実段階にある胚を外科的に集める。次に、例えばブタ胚については、酸性タイロード溶液を用いて透明帯を崩壊させ、そしてES 細胞/PGC細胞を透明帯崩壊桑実の存在下で培養する。ES/PGC細胞は暴露された桑実細胞に接着する。そして、Whitten培地で一晩培養後、胚を同調化させたレシピエントに移す。好ましくは、透明帯を崩壊させた桑実は透明帯を全く含まない。しかし、ES細胞/PGC細胞が桑実細胞の少なくとも幾つかに直接接近できる限り、その状態は必要ではない。Ｃ．桑実注入胚盤胞腔の形成に先立って、ES細胞およびPGC細胞を桑実胚に注入することが可能である。この技法は、胚盤胞注入と類似している。ES細胞またはPGC細胞を注入ピペットに取り、これを透明帯の下に挿入する。次に、桑実胚の細胞と接するように上記細胞をピペットから出す。次に注入された桑実胚をWhitten培地（ブタ）または他の適切な培地で一晩培養し、胚盤胞を形成させる。Ｄ．核移入および胚クローニング ES細胞およびPGC細胞は、in vitro成熟、in vitro培養、in vitro受精によって誘導された除核接合体に融合させるか、または外科的に回収することができる。上首尾な融合の後、胚を同調化レシピエントに移すことができる。例えば、in vitroまたはin vivo回収したブタの卵母細胞を、1.5% BSAフラクションV および7μg/mlサイトカラシンB(Sigma)を補給したWhitten培地中で操作する。斜角のついたマイクロピペットを用いて卵母細胞から中期板(metaphase plate)を除去する。ESまたはPGC単細胞（トリプシン処理して単細胞懸濁液を形成させた後の）を、斜角のついたマイクロピペットを用いて、この細胞が卵母細胞の原形質膜と接するように、透明帯を通して挿入する。融合は28 V/cmの交流電場に5秒間置き、次いで100マイクロ秒の80 V/cm直流パルスを与えて達成される。融合が観察された後、胚を39℃で、5% CO₂、5% O₂、90% N₂のもとで、1.5% BSAを補給したWhitten培地の微小液滴中で、同調化させたレシピエントに移るまでインキュベートする。実施例１１マウスES細胞の培養 ES細胞は自然に多数の異なる細胞型に分化することができる。この分化を妨げる培養条件は、これらの細胞の未分化形態での連続継代にとって非常に重要であり、キメラマウスに貢献しうる。Ｉ．培養条件 ES細胞を、0.1%のゼラチン(PBSまたはMilli-Q 水を用いて調製)で10分間処理したポリスチレン細胞培養皿で増殖させる。有糸分裂的に不活性化した繊維芽細胞の支持細胞層は、サイトカイン源を提供する。上記繊維芽細胞は、不死細胞系である初代マウス胚繊維芽細胞(PMEF)またはSTO繊維芽細胞である。用いる培地は、グルコース、アミノ酸、およびヌクレオシドを補給したDMEMである。Terato carcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach(E.J．Robertson 編)，IRL Press，Oxford中のRobertson，Embryo-Derived Stem Cell Lines，(1 987)参照。この培地に、LIFを加える(最終濃度10³U/ml Esgro，AMRAD)。FBSを15 %まで加える。FBSのバッチは、ES細胞の増殖を低い分化レベルで（すなわち、稀に個々の細胞が分化するのみである）支持する能力に基づいて選択される。ES細胞は5〜10% CO₂雰囲気下で、37℃で増殖させる。ＩＩ．日常的継代 ES細胞は、コロニーが大きくなり過ぎて分化するのを防ぐため、頻繁に継代しなければならない。これは、２〜４日ごとに細胞を1:10から1:40の比に分割することにより達成される。実施例１２細胞の遺伝子操作本実施例に記述する一般的手順は、例えば異なる細胞系または異なる製造者により提供される装置を使用するかもしれない個々の実験状況に容易に適合させることのできる指針を提供する。本実施例は、使用した具体的手順、およびα1-3 ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が相同組換えによって破壊された１組のマウスES細胞系を創出するにあたって得た結果をも提供する。本実施例に提供されている一般的手順は、マウスES細胞に適合させている。しかし、これらの手順はブタES細胞についても実質的に類似している。Ｉ．エレクトロポレーションによるＤＮＡのES細胞への導入Ａ．必要数のプレートに0.1%のゼラチン(PBSまたはMilli-Q 水に溶解)を塗布する。（通常 2 x 6-ウエルプレートおよび8-ウエルプレート1枚）Ｂ．10⁷個の胚繊維芽細胞をDMEES（ES細胞培地の等価物）中に融解する；3000 ラドで照射して不活性化する。Ｃ．照射した細胞を数え、遠心にかけ、DMEES中に10⁶個/mlとなるよう再懸濁する。Ｄ．プレートからゼラチンを吸い出し、2.5 mlの培地中に7 x 10⁵個／ウエル( 6-ウエルプレート)の密度で；1 mlの培地中に7 x 10⁴個／ウエル(24-ウエルプレート)の密度で細胞をプレートする。37℃で、5〜10% CO₂のもとで、3〜4時間インキュベートする。Ｅ．ES細胞を250 mlのフラスコに入れた5 mlのPBS-EGTAの中で洗浄し、室温で 4分間放置する。Ｆ．PBSを除去し、5 mlのトリプシン(CSL)を加え、室温で2〜4分間放置する。細胞を洗浄し、10 mlのDMEESを加え、細胞数をかぞえる。実験には約5 x 10⁶から2 x 10⁷個のES細胞が必要とされる。Ｇ．細胞を遠心にかけ、10 mlのPBSに再懸濁する。再度遠心し、540μlのPBS に再懸濁する。50μlを10 mlのDMEESに希釈し、培養して平板効率を測定する。Ｈ．5〜10μgのＤＮＡを10 ulのPBS中の細胞に加え(全容量、500μl)、滅菌エレクトロポレーションキュベット（例えばBiorad）に移す。Ｉ．0.22 kV、500μFDでエレクトロポレーションを実施する（時定数は約8.4 にすべきである）。これはBiorad Gene Pulser Unit(Biorad カタログ番号16520 78)をキャパシタンス拡大装置(Biorad カタログ番号1652087)または類似の装置と共に用いて達成される。Ｊ．一定したピペット操作で細胞を10 mlのDMEESに再懸濁し、溶解細胞由来のＤＮＡの塊を壊す。Ｋ．細胞を遠心し、5 mlのDMEESに再懸濁する。Ｌ．50μlを取り、50μlのトリパンブルー溶液を加え、生存細胞を数える。Ｍ．希釈平板培養により培養して平板効率を測定する。 II．選択条件ネオマイシン耐性遺伝子を発現しないES細胞は、培地mlあたり200〜500μgのG 418を用いた処理により選択的に殺される。抗生物質含有培地は、毎日交換する。エレクトロポレーションされなかった細胞集団もまた、感受性細胞がG418処理に対していかに真性に応答するかを見るため、処理される。6 〜10日後、抗生物質に耐性な細胞は健全なコロニーとして明白になる。これらの細胞は標的設定構築物によって形質転換されて、そして相同組換えに関してスクリーニングすることができる（すなわち、相同組換え対ランダムな組み込みについてスクリーニングされる）。選択皿より耐性コロニーをマウスピペットで吸い上げ、分散させて単細胞懸濁液とする。これらの細胞の半分を凍結させ、残り半分を増殖させて相同組換えが起こったかどうかを確認する。コロニーが小さい場合は、全コロニーを24ウエルプレートで拡大させてから半分を冷凍し、残り半分を遺伝子分析のためにさらに拡大することが時には好ましい。 III．選択後、遺伝子分析のためES細胞コロニーを拾い上げるＡ．方法１：コロニーの半分を凍結させる１．コロニーを拾い上げる前日に：ａ）必要数のプレートに0.1%のゼラチン(PBSに溶解)を塗布する。拾い上げるべき24個のコロニーにつきプレート２枚；１枚は凍結用で、他の１枚はクローン拡大用である。20枚 x 24-ウエルプレートを用いて開始する。ｂ）照射した繊維芽細胞を数え、遠心にかけ、DMEESに再懸濁する。ｃ）10枚のプレートからゼラチンを吸い上げ、約10⁵個(5 x 10⁴個まで少なくとも可)／ウエルとなるように1 mlのDMEES中にプレートする。37℃、10% CO₂ で、一晩（または最低１時間）インキュベートする。ｄ）他の10枚のプレートからゼラチンを吸い上げる。２．コロニーを拾い上げる日に：ａ）ES細胞の培地を、コロニーを拾い上げる前、および拾い上げている間中規則的に交換する（浮遊細胞を除去するため）。ｂ）栓付きパスツールピペットで吸い上げる。24個のコロニーを処理したなら、新しいピペットを用いる。望ましいチップは、直径がコロニーの約半分で、1〜2 cmのくびれを有する。チップは垂直で清潔でなければならない。注: ピペットに吸い上げた後、新しく引き出したガラスを用いて所望の切断点でガラスに擦りつけ、曲げる。）ｃ）マルチチップレザバーに以下のラベルをつける： 1 PBS-EGTA 2 トリプシン-ベルセン 3 DMEES 4 2 X 凍結混合物（FCSに溶解した20% DMSO）ｄ）マルチピペッタを用いて、50μlのPBS-EGTAを96-ウエルプレートの24 個のウエルに分注する。ｅ）顕微鏡で：上手に吸い上げたパスツールピペットをマウスピペットチューブに連結する。プレートからコロニーを排除し、96-ウエルプレートの１個のウエルに移す（最小限の容量で）。ピペットの内容物を吐き出す；泡が位置の指標となる。24個またはできるだけ多数のコロニーを<10〜15分以内に拾い上げる（好ましくは、６の倍数個）。ｆ）フード(hood)に戻って: マルチピペッタを用いて100μlのトリプシンを各ウエルに加え、室温で２分間放置する。ｇ）10〜15回、ピペットで吸い上げ、吐き出して細胞を分散させ、次に10 0μlのDMEESを加える。（これはトリプシン添加後4 〜6 分以内に行なわなければならない。）ｉ）一つ置きにチップを取り付けた12チャンネルピペットを用いて、細胞懸濁液を凍結プレートと拡大プレートの２つに分ける。125μlをゼラチン処理した24ウエルプレート（凍結用）に移す；残りの約125μlを支持細胞層を有する24 ウエルプレート（ＤＮＡ分析用）に移す。プレートにラベルを貼り、１個のクローンが各トレーの同一ウエルに行くように注意深く並べる。ｊ）125μlの2 x 凍結混合物を凍結用プレートの各ウエルに加え、渦を巻くように動かして良く混合する。ｋ）ジッパーで閉じる袋またはプラスチックラップ内に封じて、平衡化したスチロホームの箱に収めて-70℃のフリーザーに入れる。プレート間にスチロホームシートを差し込む。ｌ）拡大用プレートを遺伝子型分析に十分な細胞が得られるまでインキュベートする。Ｂ．方法２：24ウエルに拡大した後、凍結する１．コロニーを拾い上げる前日に：ａ）必要数のプレートに0.1%のゼラチン(PBSに溶解)を塗布する。10枚 x 24-ウエルプレートを用いて開始する。ｂ）照射した繊維芽細胞を数え、遠心にかけ、DMEESに再懸濁する。ｃ）プレートからゼラチンを吸い上げ、約10⁵個／ウエルとなるように1 m lのDMEES中にプレートする。37℃、10% CO₂で、一晩（または最低１時間）インキュベートする。ｄ）他の10枚のプレートからゼラチンを吸い上げる。２．コロニーを拾い上げる日に：ａ）半分のコロニーを上記（方法１）に記述するように拾い上げる。しかし、細胞懸濁液を凍結用および拡大用プレートに分ける代わりに、全細胞懸濁液を拡大用プレートに入れる。ｂ）（毎日培地を交換しながら）３〜４日後になると、細胞は凍結させるのに十分なほど増殖する。１度に１枚のプレートを処理しながら（慣れると２枚扱える）、各ウエルから培地を吸い上げる。PBS/EGTAを4分間みなぎらせる。同時に、ピペットチップを準備して、12チャンネルマルチピペッタの一つ置きのチャンネルに取り付ける。PBSを吸い上げる。ｃ）100μlのトリプシンを加え（マルチピペッタおよび一つ置きのチャンネルを用いて）、室温で２分間放置する。ｄ）10〜15回、ピペットで吸い上げ、吐き出して細胞をプレートの横列１のウエルに分散させ、チップを交換し、次に100μlのDMEESを加える。各横列についてこれを繰り返す。（これはトリプシン添加後６分以内に行なわなければならない。）ｅ）一つ置きにチップを取り付けた12チャンネルピペットを用いて、125 μlをゼラチン処理した24ウエルプレート（凍結用）に移す。残りの細胞はＤＮＡ分析用に増殖させる。プレートにラベルを貼り、凍結用トレーを拡大用トレーと対応するように並べることが極めて重要である。ｆ）125μlの2 x 凍結混合物を凍結用プレートの各ウエルに加え、渦を巻くように動かして良く混合する。ｇ）ジッパーで閉じる袋またはプラスチックラップ内に封じて、平衡化したスチロホームの箱に収めて-70℃のフリーザーに入れる。プレート間にスチロホームシートを差し込む。ｈ）拡大用トレーに1 mlのDMEESを加える。（良好な平板効率を与えるに十分な支持細胞が存在するであろう）。３〜４日間、遺伝子型分析に十分な細胞が得られるまでインキュベートする。ＩＶ．24-ウエルプレートで凍結させたES細胞クローンの融解所望の遺伝的変更を有すると同定された細胞を、-70℃に凍結した２組のプレートから回収する。プレートを層流フード(hood)に取り、プラスチックの袋から出す。各ウエルを温かい培地で満たし、興味の対象であるウエルに支持細胞を加える。プレートを37℃のインキュベーターに60分間入れ、次に培地を交換する。２〜３日後にコロニーが現れる。新規な冷凍ストックを設けるためにこれらのコロニーを拡大し、そして以下について試験する：１）核型分析；２）所望の遺伝的変更の確認；３）マイコプラズマ感染；および４）キメラを形成する能力。実施例１３ pNEOαGT10.8B構築物を用いたマウスES細胞ノックアウトの作成Ｉ．形質転換 μlあたり 1μg のpNEOαGT10.8B ＤＮＡ(XhoI消化により直鎖状形にした) （実施例９および図17参照）を含有する溶液5μlを用いて、合計1x10⁷個のE14 E S細胞をエレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレーションは、広いキュベット内で、600μl中で、25μF、350Vで0.5マイクロ秒間実施した。細胞を6m lのES完全培地に回収し、各々Neo^R STO細胞の支持細胞層を含有する6 x 100 mm のペトリ皿にプレートした。細胞をES完全培地で３日間培養し、次にmlあたり200〜350μgのG418を含有する培地に代えた。この培地を１日置きに交換した。９日後、個々のNeo^Rコロニーは同定および回収するのに十分なほど大きくなった。コロニーを20μlのPBS中に取り、20μlのトリプシンを加えた。ES完全培地中の、40μlの60%BRL馴らし培地を次に加えた。40μlのアリコートを２つの24-ウエルプレートそれぞれの各ウエルに移した。１つのプレートは、100μlのES完全培地中にSTO細胞の支持細胞層を含有していた。このプレートに、140μlの2x DMSO凍結混合物を加え、-80℃で保存した。第２の24-ウエルプレートの各ウエルは、ES完全培地中に1 mlの60% B RL馴らし培地を含有していた。このプレートを、コロニーが集密になるまで37℃ でインキュベートした。ＩＩ．相同組換えの確認集密コロニーから培地を吸い上げ、400μlの溶解緩衝液(10mM Tris pH 7.8，1 00mM NaCl，1mM EDTA，1% SDSおよび500μg/ml プロテイナーゼK)を加えた。細胞を37℃で一晩溶解し、400μlの1:1 フェノール／クロロフォルムを用いて抽出し、そして1 mlの95% エタノールおよび0.2M NaAcを含有するエッペンドルフチューブに移した。エッペンドルフ遠心機で13,000 rpmで遠心することによりＤＮＡをペレット化し、このペレットを80% エタノールで２回洗浄し、30μlの水に再溶解した。構築物の3'末端で相同組換えが起こっているES細胞クローンを同定するため、サザン分析（例えば、Sambrookら、前出参照）を用いた。15μlのＤＮＡのアリコートを、20単位の制限酵素BglIIを製造者の指示にしたがって用いて消化した。37℃で一晩インキュベートした後、750 ngのHindIII 消化ラムダＤＮＡをマーカーとして用いて、0.8%アガロースゲル(Tris酢酸、EDTA緩衝液に溶解)を通して１〜２ V/cmで一晩ＤＮＡを電気泳動した。Hybaid vacublotterを用いて、80cm Hgの真空で１時間ＤＮＡをZetaprobeナイロン膜に移した。この膜をHybraid ハイブリダイゼーションボトル中で、10mlの下記ハイブリダイゼーション混合物中で65℃で3時間プレハイブリダイズさせた： 0.25M Na₂HPO₄ pH 7.2 7% SDS 1mM EDTA 100 μg/ml サケ精子ＤＮＡ 10% PEG BRESATECギガプライム・オリゴラベリングキット（gigaprime oligo labeling kit）(カタログ番号GPK-1)を用いて、製造者の指示にしたがって、放射性標識化プローブＤＮＡを調製した。構築物pNeoαGT10.8B（実施例9および図17参照）の3'末端を越えた部分由来の約50ngの0.7kb EcoRI/XmnI ＤＮＡ断片を、³²P-dAT Pを用いて比活性5 x 10⁸cpm/μgまで標識した。変性プローブをHybaidボトル中のプレハイブリダイズしている膜に加え、65℃で一晩インキュベートした。膜をHybaidボトルから取り出し、0.5xSSC、前もって65℃に温めた0.1% SDSですすぎ、次に0.1xSSC、65℃の0.1% SDSで2〜3回、1回につき30分かけて洗浄した。次に、余分な水分を膜からぬぐい取り、プラスチックのラップで覆い、ホスホイメージャー(phospho-imager)スクリーンに16時間〜3日間暴露したイメージカント・ホスホイメージャー(Imagequant phospho-imager)上にイメージを視覚化させた。結果を図18に示す。これは上記および実施例９に記載の診断用0.7kb EcoRI/Xm nI ＤＮＡ断片で釣り上げた、ES細胞系由来のＤＮＡのサザンブロットである。 α1-3 ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子(α 1-3 Gal T)における相同組換え現象の診断に役立つ（実施例９参照）6.4kbのバンドが、試験した15のES細胞系のうち６つに見られる。この６つのノックアウト細胞系のすべては、不活性化対立遺伝子に関し異型接合であるように思われた。なぜなら、中断されていないα-1,3-Gal T遺伝子の診断に役立つ（実施例９参照）8.3kbのバンドもまた、６つのレーンのすべてに存在したからである。さらなる分析のために、以後「８Ｄ１」および「７Ｃ２」と称する２つの細胞系を選択した。細胞系８Ｄ１および７Ｃ２は、構築物の3'末端境界で相同組換えが起こったα-1,3-Gal T対立遺伝子を含有することがサザン分析により同定された。次に、長距離PCRを用いて、これらの細胞系において構築物の5'末端境界で相同組換えが起こったかどうかを確認した。２組のプライマーを別個のPCR実験に使用した：１）野性型プライマー： MGT-KOex8FおよびMGT-KOR1は、エキソン８および９の間のイントロンにまたがり、野性型α-1,3-GalT遺伝子由来の5.5kb 断片を増幅する（図19参照）。配列： MGT-KOex8F （配列番号：１４）（図４のヌクレオチド1014〜1046） MGT-KOR1 （配列番号：１５）（図４のヌクレオチド1779〜1811）２）ノックアウトプライマー： MGT-KOex8FおよびMGT-KONeoRは、「ノックアウト」対立遺伝子内のNeo^R遺伝子カセットのエキソン８にまたがり、ノックアウトされた対立遺伝子由来の5.5k b 断片を増幅する（図19参照）。配列： MGT-KONeoR （配列番号：１６）（ヌクレオチド323〜355;図１６）各反応は、50μlの反応容量中に約100 ngのゲノムＤＮＡを鋳型として含有し、また25mM Tris HCl(pH9.1)，16mM(NH₄)₂SO₄，250μM dNTPs，3.5mM MgCl₂，10 0 ngの各プライマー、2単位のTaq ポリメラーゼおよび0.025単位のPfuポリメラーゼを含有した。反応液を94℃で1分間加熱し、次に94℃15秒間、68℃6分間加熱を45サイクル実施し、その後72℃10分間の１工程を実施した。CBA/Cマウス由来の推定上の「ノックアウト」ES細胞系（野性型α-1,3-GalT対立遺伝子について異型接合である）由来のゲノムＤＮＡが、プライマーの各セットを用いて別個の反応において増幅された。各ＰＣＲの10μlアリコートをサザンブロッティング( Sambrookら，1989)により分析した。結果を図20に示す：ノックアウトプライマー： 1.3kb Neo^R遺伝子カセット（図16）にハイブリダイズした5.5kb断片は、7C2 ＤＮＡ(図20;レーン4)および8D1 ＤＮＡ（図示していない）よりもたらされた。このバンドはCBA/ｃＤＮＡ(図20; レーン3)からは生じなかった。野性型プライマー： α-1,3-GalT遺伝子プローブ（pａGT-S4.0のSalI消化により単離された）にハイブリダイズした5.5kb断片は、7C2 およびCBA/ｃＤＮＡ（図20；それぞれレーン１および２）および8D1 ＤＮＡ（図示していない）よりもたらされた。この産物はNeo^R遺伝子プローブとはハイブリダイズしなかった。これらの結果は、細胞系8D1および7C2における構築物の5'末端境界において相同組換えが起こったことを示している。実施例１４ ES細胞ゲノムを担持する動物の創出本実施例で提供する手順は、マウスES細胞に合わせてある。しかし、全般的な戦略はブタES細胞およびPGC細胞についても実質的に同じである。Ｉ．注入用ES細胞の調製注入の２〜３日前に、ES細胞を最初の密度に基づいて1:2，1:4，1:8 および1: 16の細胞密度で24-ウエルプレートの各ウエルに分割する。形態に基づいて、最も旺盛で、かつ最も分化していない培養物を選択する。ＩＩ．胚注入およびキメラマウスの作出過排卵させた、または自然に交配させた雌マウスより、交配の約3.5日後に胚を回収する。M16 培地(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practi cal Approach(E.J．Robertson編)，IRL Press，Oxford中のBradley，Production and Analysis of Chimeric Mice，pp.113-52(1987)参照)で一晩培養後、空洞を作って未分化胚芽細胞を形成したものに、約12から20のES細胞をマイクロインジェクションする。この顕微手術手順は、毛細管状ガラスで作った器具を用いて実施され、注入はマイクロメータ注射器を基礎とする水圧装置を用いて制御される。この手順を見るために、示差的干渉コントラストを備えた倒立顕微鏡を用いる。注入後、未分化胚芽細胞を偽妊娠雌マウスの子宮に移す。キメラマウスは、ES 細胞による外被色の寄与によって同定される。キメラマウスは宿主未分化胚芽細胞由来の灰色に横線の入った模様(agouti)の外被色、およびES細胞によってもたらされる鼠色の軟らかい毛(chinchilla)を示す。 C57B1/6J X CBA F2未分化胚芽細胞に注入することにより、中断されたα-1,3- Gal T対立遺伝子を担持するES細胞(8D1、7C2細胞を含む)からキメラマウスを創出した。個々のキメラマウスの、生殖系列を介してES細胞特性を伝える能力を精子のグルコースホスフェートイソメラーゼ(Gpi)分析により推定した［Bradley，前出(1987); Mannら，J．Reprod & Fert．99，505-512(1993)］。グルコースホスフェートイソメラーゼは、グルコース-6-ホスフェートからフラクトース-6-ホスフェートへの相互変換を触媒する。マウスは２つの主要対立遺伝子Gpi 1AおよびGpi 1Bを有する１つの構造的Gpi遺伝子座を有する。Gpi 1Aは、電気泳動の際ゆっくりした、陰極性に移動するバンドとして現れる、そしてBALB/cC129等の系統に存在するタンパク質をコードする。（ここで用いるES細胞は129系統マウスから誘導したものである。）Gpi 1Bは、Gpi 1Aより速く動く、そして天然ならびにC57 およびCBA（宿主未分化胚芽細胞を引き出すためここで使用された）等の系統に存在する酵素を決定する。異型接合体は２本の親バンドに加えて上記酵素の二量体構造を示す中間的バンドを有する。時折観察される多数の電気泳動パターンは、スルフヒドリル基の酸化によるものであり、組織特異的発現によるものではない。キメラマウスにおいては、Gpi 1A（129 系統由来）のGpi 1B（宿主未分化胚芽細胞由来）に対する比は、異なる組織中に存在するES細胞遺伝子型を有する細胞の比率を示す。精子におけるGpi 1A（ES細胞由来）の出現は、そのマウスが生殖系列を介してES細胞遺伝子型を伝えることができることを示唆している。 III．ES細胞に導入された遺伝子的変化について同型接合のマウスの創出 ES細胞由来の精子を有するキメラマウスをBALB/cマウスと交配した。129/OlaX BALB/c遺伝子型（すなわち、ES細胞遺伝子型について異型接合性）を有する子孫は灰色である。これら灰色マウスの半分は中断された対立遺伝子を有するものと予想された。中断された対立遺伝子についてのマウス異型接合体を、血液から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって同定した。不活性化されたα-1,3-Gal T遺伝子について同型接合のマウスを創出するため、異型接合マウス同志を交配した。子孫の４分の１は上記の中断された遺伝子について同型接合であることが予想された。血液から得たゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって同型接合体を同定した。ＰＣＲ戦略は、α-1,3-Gal T遺伝子のエキソン９のSal I部位にNeo^R遺伝子を挿入することに基づいていた（図13参照）。野性型プライマー：（配列番号：１７）（エキソン９のSal I部位の5'末端側の約40から60 bpへの配列に相同的、図４のヌクレオチド1257〜1278に対応）（配列番号．１８）（エキソン９のSal I部位の3'末端側の約175から195 bpへの領域に相同的、図４のヌクレオチド1511〜1492に対応）。野性型対立遺伝子から生ずる予想される断片サイズは、255 bpである（図21参照）。これらのプライマーは潜在的には、中断された対立遺伝子由来の1596 bp のPCR 断片をもたらすことも可能である。実際には、この断片は野性型および中断された対立遺伝子の両方が存在した場合、生成しなかった。恐らくより小さい 255 bpの産物が優先的に増幅されるからであろう。ノックアウトプライマー：（配列番号：１９）（図16のヌクレオチド1170〜1189に対応）Ｅ９Ｒ２：（野性型対立遺伝子を検出するために上に記載されているのと同一のプライマー）予想される断片サイズは364 pbである（図21参照）。マウスを離乳齢まで飼育し、尾から採血した。ヘパリンナトリウムをmlあたり約10 U添加した。100 mM Tris-酢酸pH 8.8，3.5 mM MgCl₂，0.2 mM dNTPs，および2単位のTth DNA ポリメラーゼを含有する50μlの反応容量中で1 μlのヘパリン処理血液（約10⁴個の有核細胞）を用いてPCR増幅を実施した。各反応液は野性型プライマーとノックアウトプライマーの両方を、各プライマーにつき2 ng/μl の濃度で含有していた。Tthポリメラーゼがヘパリン処理血液によって阻害されないことを確実にするため、各反応を２通りに実施した。反応の一方は２種類のＤＮＡサンプルを用いてスパイク(spike)を行った： i） 10 fg（約600分子）の直鎖状にしたKOプラスミドpNeoαGT10.8B ii）1 fg（約1000分子）のエキソン９を含む983 bp RT-PCR産物他方の反応は効果を増大させなかった。したがって、各血液サンプルについて２つの別個のＰＣＲ反応が計画された。さらに、ゲノムＤＮＡ鋳型を用いない、そして上記のスパイク(spike)を行なう、または行なわない対照PCR反応を実施した。各反応混合物は94℃で3分間加熱し、次に94℃40秒間、53℃40秒間、および72 ℃40秒間のインキュベーションを40サイクル行なった。各反応混合物の5μlアリコートを3%アガロースゲルを用いて電気泳動にかけた。そして、臭化エチジウムを用いて染色した後、ＤＮＡ断片をUVライトボックス上で可視化した。マーカーとしてHpaII消化 pUC19プラスミドＤＮＡを用いた。３匹のマウスおよび「ＤＮＡなし」の対照についてのＰＣＲ分析の結果を図22 に示す。マウス#42については、KO（ノックアウト）プライマーはスパイクを行う(+ spike)反応においてのみ364 bpのバンドをもたらした。野性型プライマーはスパイクを行う(+ spike)反応およびスパイクを行わない(- spike)反応において255 bpのバンドをもたらした。これらの結果は、マウス#42は野性型対立遺伝子について同型接合であることを示している。マウス#43については、野性型プライマーはスパイクを行う反応においてのみ255 bpのバンドをもたらした。KOプライマーは、スパイクを行う反応およびスパイクを行わない反応において364bp のバンドをもたらした。これらの結果は、マウス#43は中断された対立遺伝子について同型接合であることを示している。マウス#44については、KOプライマーはスパイクを行う反応およびスパイクを行わない反応において364 bpのバンドをもたらした。野性型プライマーは、スパイクを行う反応およびスパイクを行わない反応において255 bpのバンドをもたらした。これらの結果は、マウス#44は中断された対立遺伝子について異型接合であることを示している。対照PCR反応においては、鋳型が含まれなかった場合、はっきりした産物は何も得られなかった。pNeoαGT10.8B およびエキソン９ RT-PCR ＤＮＡのみが対照反応に含まれる鋳型であった場合、364 bpおよび255 bpのPCR産物が明白に現れた。実施例１５同型接合ノックアウトマウスの特徴付けＩ．Gal TノックアウトマウスにおけるGal T ｍＲＮＡの不在Ａ．ＲＮＡ単離 Bresatecによって供給されるRNAzol^TMBキット(BIOTECX Laboratories，Inc.， 6023 South Loop East，Houston，Texas 77033，USA)を用いて、全ＲＮＡを抽出した。この抽出手順は Chomczynskiら，Anal．Biochem．162: 156-159(1987)が記述する方法に基づくもので、グアニジニウム／フェノール溶液中でのホモジナイゼーション、クロロホルム抽出、２イソプロパノール沈殿、及び75% EtOH洗浄を含む。ＲＮＡをEtOH沈殿物として-20℃で保存し、そして水中での波長260 nm における吸光度を測定することにより量を計った。完全性および計量をアガロース／ホルムアルデヒドゲルを用いた電気泳動により確認した。Sambrookら，Mole cularC1oning: A Laboratory Manual，第2版(1989)参照。Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲ第１鎖ｃＤＮＡの合成は以下を包含した： − 腎臓、心臓、または肝臓由来の全ＲＮＡ 2μgを120 ngのオリゴdTプライマー(Gibco BRL，M-MLV 逆転写酵素キット)と共に65℃で5分間、5μlの10 mM Tr is-HCl，1 mM EDTA(pH 8)中でアニーリング − M-MLV 逆転写酵素キット(Gibco BRL)を用いて、20μlの最終反応容量で、 37℃で1〜2時間逆転写。各反応液は5mM DTT，0.1μg/μl BSA，1mM dNTPs，40 U のヒト胎盤 RNAse インヒビター(Bresatec)，200UのM-MLV 逆転写酵素、および1 X濃度のアソシエイテッド(associated)RTase緩衝液を含んでいた。Ｃ．ｃＤＮＡのＰＣＲ分析オリゴdTプライマーをつけたｃＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅により、α-1,3-Gal T ｃＤＮＡの検出を行った。このＰＣＲ断片が生じないということは、対照ＰＣＲの結果と考え合わせると、α-1,3-Gal T ｍＲＮＡがＲＮＡ調製物中に存在しなかったことを示している。α-1,3-Gal Tプライマーがα-1,3-Gal T鋳型の増幅を支持したことを立証するため、各反応を２通りに計画し、一方の反応は0.1 fg （約100分子）の983 bpマウスα-1,3-Gal T ｃＤＮＡ産物（エキソン７から'3末端非翻訳領域にまたがるプライマー７ＦおよびmGT-3UR によってもたらされた）を用いてスパイクを行ったた。ｃＤＮＡ合成が起こったことを立証する第２の対照として、ｃＤＮＡ鋳型からフェロケラターゼＰＣＲ断片の作成を行った。１．プライマー： α-1,3-Gal T ｃＤＮＡを検出するためのプライマー：（配列番号：２０）（エキソン７内のヌクレオチド889 〜911 に対応）（図４）（配列番号：２１）（エキソン９内のヌクレオチド1492〜1511に対応）（図４）プライマー７Ｆおよび９Ｒ２は、ｃＤＮＡ鋳型から約619 bpの断片（図23参照）をもたらすことが予想された。これらのプライマーは、ｃＤＮＡ調製物中に存在するかもしれないゲノムＤＮＡに由来する断片をもたらすことはない。なぜなら、これらのプライマーは２つの大きいイントロンにまたがっているからである。（配列番号：２２）（'3末端非翻訳領域のヌクレオチド1866〜1888に対応; 図４）このプライマーをプライマー７Ｆと共に用いて、対照のスパイクを行うＰＣＲに用いるＤＮＡ断片を作成した。マウスフェロケラターゼｃＤＮＡを検出するためのプライマー(EcoRIリンカーを下線で示す)：（配列番号：２３）（ヌクレオチド215 〜235 に対応、Taketaniら、J．Biol．Chem．265:1 9377-80(1990)）（配列番号：２４）（ヌクレオチド888 〜908 に対応、Taketaniら、J．Biol．Chem．265:1 9377-80(1990)）これらのプライマーは、709 bpの断片（図23参照）をもたらすことが予想された。これらのプライマーは、ｃＤＮＡ調製物中に存在するかもしれないゲノムＤＮＡに由来する断片をもたらすことはない。なぜなら、これらのプライマーは５つのイントロンにまたがっているからである。反応容量は50μlで、４μlの第1鎖ｃＤＮＡ合成反応溶液、100 ngの各プライマー、2 mM MgCl₂、0.3 mM dNTPs、2UのTaq ポリメラーゼ(Bresatec)および1X濃度のTaq 反応緩衝液(Bresatec)から成っていた。反応液を94℃で2分間加熱し、次に94℃15秒間、58℃30秒間、72℃1分間加熱を29サイクル実施し、その後72℃4分間および4℃5分間の工程を各１回実施した。各ＰＣＲの10μlアリコートを2%アガロースゲルを用いた電気泳動にかけ、ＤＮＡ断片を臭化エチジウムで染色した後、UVライトボックス上で可視化した。図24は野性型マウス、および中断されたα-1,3-Gal T対立遺伝子について異型接合または同型接合のマウスの腎臓(K)、心臓(H)および肝臓(L)より単離したＲＮＡから生じるＰＣＲ断片を示す。図24(i)はｃＤＮＡ調製物のそれぞれから709 bpフェロケラターゼ断片が生じたことを示している。これは、逆転写反応によってｃＤＮＡ鋳型が作成されたこと、そしてこの鋳型はα-1,3-Gal T遺伝子プライマーにとって利用可能であったこと、を示している。983 bp α-1,3-Gal T ｃＤＮＡ産物を用いてスパイクを行う各反応には、619 bp α-1,3-Gal T断片が存在した（図24(ii)）。これは、α-1,3-Gal T ｃＤＮＡ（スパイクを行った）鋳型の増幅が起こったことを示している。スパイクを行わない反応では(図24(iii))、619 bp α-1,3-Gal T断片が野性型および異型接合性ＲＮＡから合成したｃＤＮＡ中に検出された。これは、α-1,3 -Gal T ｍＲＮＡが野性型および異型接合マウスの腎臓、心臓および肝臓に存在することを示している。上記619 bp断片は、スパイクを行わない同型接合ノックアウト反応では検出されなかった。これは、同型接合ノックアウトマウスにおいてはα-1,3-Gal T ｍＲＮＡが合成されないことを示している。ＩＩ．抗ＧＡＬ抗体および蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いた、同型接合ノックアウトマウスにおけるＧＡＬエピトープの発現試験Ａ．溶液溶液１〜５は10X等張である。１．1.68M NaCl（948.21 g/L）秤量の前に、塩を一晩熱いオーブンに入れて乾燥させる。２．1.68M KCl（125 g/L）秤量の前に、塩を一晩熱いオーブンに入れて乾燥させる。３．1.12M CaCl₂（165 g/L CaCl₂2H₂O）秤量の前に、塩を一晩熱いオーブンに入れて乾燥させる。４．1.68M MgSO₄（414 g/L MgSO₄7H₂O）熱いオーブンで乾燥させない。５．リン酸カリウム緩衝液 pH 7.2：ａ）1.68M KH₂PO₄（229 g/L）ｂ）1.12M K₂HPO₄（226 g/L K₂HPO₄3H₂Oまたは195 g/L K₂HPO₄）リン酸カリウム緩衝液は、等容量の溶液ａ）およびｂ）を混合することにより調製する。緩衝液のpH調製のため、少量のサンプルを取り、1:50に希釈し、pHメーターでpHを読む。６．Hepes 緩衝液 1M（CSL，Melbourne Australia）７．KDS BSS：下記の順序で二重蒸留水(DDW)に原液を加える：原液溶液の割合 DDW 1210 NaCl 121 KCl 3 CaCl₂ 3 MgSO₄ 1 リン酸カリウム緩衝液 2 Hepes 20 濾過滅菌して、4℃で保存する。８．KDS/BSS/2%HSA/0.02% アジ化物： KDS/BSS 244.5 ml ヒト血清アルブミン 5 ml （CSL，Melbourne Australia） MT-PBSに溶解した10%アジ化ナトリウム 0.5 ml ９．FITC希釈：KDS/BSSを用いて、7.5μlのFITC-IgGを600μlに希釈する。 10．赤血球溶解緩衝液：二重蒸留水に溶解した0.168M NH₄Cl 11．4%パラホルムアルデヒド(PFA) 溶液： A．NaH₂PO₄2H₂O 22.6 g/L B．NaOH 25.2 g/L C．40%パラホルムアルデヒド: 1）4 g のパラホルムアルデヒド(BDH，Kilsyth，Austrarila，#29447 )を10 mlの二重蒸留水に溶解する。有毒ガス換気フード内でスターラーで攪拌しながら70℃で2時間加熱し、溶液が透明になるまで2M NaOHを数滴加える。 2）次に、0.54 gのグルコースを加える。 3）RT を耐光性ボトルに保存する。 D．83 mlのＡおよび17 mlのＢを一緒に加える。 E．最終4%PFA固定液：90 mlのＤ + 10 mlのＣ，pH 7.4〜7.6; 1M HCl を用いてpHを調整する。 12．ハンクス溶液(Ca およびMg非含有)(HBBS)： KCl 400 mg KH₂PO₄ 60 mg NaCl 8 g NaHCO₃ 350 mg Na₂HPO₄2H₂O 68 mg グルコース 1 g H₂O 全体を1 リットルとする量 pHを7.0に調整する; 濾過滅菌する。 13．ヒツジ抗ヒトIgGおよびIgMフルオレセインイソチオシアネート(FITC)F(ab )₂断片(Silenus，Hawthorn，Australia)：Ｂ．方法１．マウスの眼から採血し、300〜400 ulを前もって冷やしておいたエッペンドルフチューブに集め、氷上に保存し、EDTA 20 mg/mlを最終濃度が2 mg/mlになるように加える。２．血液（適切なヒト対照血液を含む）を10 mlの平らなチューブに移し、前もって42℃に温めておいた10 ml の赤血球溶解緩衝液(0.168M NH₄Cl)を加える; 数分間または細胞が溶解するまでインキュベートする。３．遠心により細胞をペレット化する(800 x g、7分、4℃)。４．細胞を10 mlのKDS/BSS/2% HSA/0.02% NaN₃に再懸濁する。５．上記のように細胞をペレット化する。工程４及び５を繰り返す。６．細胞を1000 ulのKDS/BSS/2% HSA/0.1% NaN₃に再懸濁する; アリコートをＶ底FACSチューブに移す。７．上記のように細胞をペレット化する。８．細胞を100 ulのKDS/BSS/2% HSA/0.1% NaN₃に再懸濁する。９．50 ulの精製抗ＧＡＬ抗体（実施例１参照）、正常ヒト血清(NHS)またはHB BS/2% HSA/0.1% NaN₃を加えて、45分間インキュベートする。 10．2 mlのKDS/BSS/2% HSA/0.02% NaN₃を加える；細胞を上記のように遠心する。 11．ヒツジ抗ヒトIgGまたはIgM FITC F(ab)₂断片(Silenus)の1:80希釈物を50u l加える。 12．2 mlのKDS/BSS/2% HSA/0.02% NaN₃を加える；細胞を上記のように遠心する。 13．細胞を300 ulのKDS/BSS/2% HSA/0.02%NaN₃に再懸濁する。 14．サンプルをプラスチックの丸底FACSチューブに移し、3 ulのヨウ化プロピジウム(propidium)(100 ug/ml)を加える; これでサンプルを分析に付す準備が整う；氷上で保存する。 15．Beckman FACS scanを用いて、末梢欠血リンパ球に調節して、分析する。Ｃ．結果これらの実験の結果を以下に示す。ヒト末梢血リンパ球（陰性対照）へのヒト抗Ｇａｌ結合の結果は示していないが陰性であった。これらの実験は、ヒト抗Ｇａｌ（ＩｇＧ及びＩｇＭ）抗体がホモ接合性α１,３ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトマウス（マウス２１及びマウス９）の末梢血細胞に結合するとしても非常に弱く結合するに過ぎないことを証明している。これでかかるマウスにおいてガラクトースα１,３ガラクトース（ＧＡＬ）エピトープが期待通り欠けていることが確実である。対照的に、同じ系統の正常マウス（マウス１２９及びマウス１９）の末梢血細胞は、抗Ｇａｌ抗体の明確な結合を示している。 III．ＩＢ₄ レクチンを用いるホモ接合性ノックアウトマウス内でのＧＡＬエピトープのＦＡＣＳでの発現試験ＩＢ₄ レクチンは、末端α−Ｄ−ガラクトシル残基に対して独占的な親和性を有するので、このノックアウトマウスの特性決定に有用であることを以下に証明する。Ａ．溶液１．４％パラホルムアルデヒド（上を参照のこと）２．マウス緊張性（Tonicity）ＰＢＳ（ＭＴ−ＰＢＳ）Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２.２７ｇＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０.６２ｇＮａＣｌ８.７ｇＤＤＷで１リッターにする３．死細胞除去緩衝液（ＤＣＲＢ）： −４.５ｇのソルビトール −７.６ｇのグルコース・１水和物（無水物なら６.９３ｇ） −１２.５ｍｌのＫＤＳ／ＢＳＳ −ＤＤＷで１００ｍｌにする −濾過、４℃で保存 −無菌条件下でのみ開栓４．ＫＤＳ／ＢＳＳ（マウス緊張性、Ｈｅｐｅｓ緩衝平衡塩類溶液ｐＨ７.２）（上を参照のこと）５．赤血球溶解緩衝液（上を参照のこと）６．ＫＤＳ／ＢＳＳ／２％ＨＳＡ／０．０２％アジド（上を参照のこと）７．ハンクス平衡塩類溶液（Ｃａ及びＭｇ無し）（上を参照のこと）Ｂ．方法１．脾臓を取り出し、曲げた鉗子で保持し、そして９０℃で湾曲させた２７ゲージ針で注射して１００〜２００μｌの緩衝液を脾臓内に２回又は３回注入する（２.５ｍｌシリンジ）ことにより脾細胞を採取する。その湾曲針の平坦面を用いて、脾臓内に作った穴から細胞をもみ出す。嚢の中の細胞が無くなるまで注入と細胞のもみ出しを繰り返す。２．脾細胞を１０ｍｌ試験管に移し遠心分離して細胞を沈降させる（５００×ｇ，７分間，４℃）。３．上澄み液を除去して４２℃に予め温めた３ｍｌの赤血球溶解緩衝液を加え；数分間又は細胞が溶解するまでインキュベートする。１ｍｌのＨＩＦＣＳ (熱不活化ウシ胎児血清)で下層にして氷の上に５分間立てる。ＫＤＳ／ＢＳＳ／１０％ＨＩＦＣＳで１０ｍｌまで覆う。４．上の通りに遠心分離する。５．３ｍｌの死細胞除去緩衝液中に細胞を再懸濁させ；ピペットでよく混合する。６．脱脂綿を詰めたガラスピペットに通して、細胞を１０ｍｌ試験管内に集める。細胞を無理に通さずに重力で落ちるようにする。７．細胞を１ｍｌのＢＳＳ／１０％ＨＩＦＣＳで下層にする。８．上の通りに遠心分離する。９．上澄み液を除去する。１０．上の通りに遠心分離し；段階４及び５を繰り返す。１１．０.５ｍｌの冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を加える。１２．断続的に混合しながら氷の上で５分間インキュベートする。１３．２ｍｌの氷冷ＨＢＢＳを加えて上の通りに遠心分離する。１４．２ｍｌのＨＢＢＳで洗浄を繰り返してから１ｍｌのＨＢＢＳで洗浄する。１５．１００μｌのＫＤＳ／ＢＳＳ／２％ＨＳＡ／０.１％ＮａＮ₃中に細胞を再懸濁させ；Ｖ底ＦＡＣＳ試験管に移す。１６２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣＩＢ₄レクチン（Sigma，カタログ番号L 2 895）を５０μｌ、又はＨＢＢＳを５０μｌ加え；氷の上で３０分間インキュベートする。１７．２ｍｌのＫＤＳ／ＢＳＳ／２％ＨＳＡ／０.１％ＮａＮ₃ を加え；上の通り細胞を遠心分離する。１８．細胞を３００μｌのＫＤＳ／ＢＳＳ／２％ＨＳＡ／０.１％ＮａＮ₃ 中に再懸濁させる。１９．サンプルをプラスチック製丸底ＦＡＣＳ試験管に移すと、サンプルの分析の準備が整い；氷の上に保持する。２０．末梢血リンパ球をセットしてＦＡＣＳスキャナーで分析する。Ｃ．サンプル１．マウス１２９脾胞単独２．マウス１２９脾細胞＋ＩＢ₄ レクチン３．ヒトＰＢＬ単独４．ヒトＰＢＬ単独＋ＩＢ₄ レクチン。Ｄ．結果これらの実験の結果を以下に示す。これらの結果は、ＩＢ₄ レクチンがホモ接合性α１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が標的にされた（ＧａｌＫＯ）マウス（マウス２１）の脾細胞に結合するとしても非常に弱く結合するに過ぎないことを証明している。これでかかるマウスにおいてガラクトースα１,３ガラクトース（ＧＡＬ）エピトープが期待通り欠けていることが確実である。対照的に、同じ系統の正常マウス( マウス１９)の末梢血細胞は、ＩＢ₄ レクチンに強く結合する。 IV．ＧＡＬエピトープの存在についてのマウス組織の抗ＧＡＬ抗体を用いる免疫形態学的評価Ａ．試薬１．ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水ＮａＣｌ８ｇＫＣｌ０.２ｇトリス塩基３ｇ −８００ｍｌの蒸留水に溶かす。１ＭＨＣｌでｐＨを８.０に調節する。容量を１Ｌに調節する。オートクレーブにより滅菌する。室温で保存する。２．遮断緩衝液： −ＴＢＳ＋２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋１０％ウサギ血清。３．ペルオキシダーゼ複合体：ウサギ抗ヒトＩｇＧ（断片）と結合したDAKO（Denmark）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）及びウサギ抗ヒトＩｇＭ（断片）と結合したDAKO（Denmark）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）。複合体を両方とも別々に１０％マウス肝臓粉末上に４℃で一晩予備吸着させてから、Biofuge で１８,０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで Beckman Airf uge で３０ｐｓｉ（２.１ｋｇ／ｃｍ³）で３０分間遠心分離した。結合抗血清を１６％正常マウス血清を有する２％遮断緩衝液（ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ＋２％ウサギ血清）で１／５０に希釈した。４．マウス肝臓粉末調製： Antibodies，a Laboratory Manual，Harber と David Lane 編，Cold Spr ing Harbour Laboratories（1988）p663に手を加えて調製した。ａ）マウス緊張性リン酸緩衝生理食塩水（ＭＴ−ＰＢＳ）中でマウス肝臓の微細な懸濁液を調製する。どろどろした肝臓を５ｍｌプランジャーを有する篩に通す。あらゆる繊維状組織を捨てる。１ｇの組織を約１ｍｌのＭＴ−ＰＢＳ中に再懸濁すべきである。ｂ）その組織／生理食塩水懸濁液を５分間で氷に移す。ｃ）８ｍｌのアセトン（−２０℃）（Univar 6，Ajax Chemicals）を１０分間で加える。激しく混合する。時折り激しく混合しながら氷の上で３０分間インキュベートする。ｄ）１０,０００ｇでの遠心分離（Sorvall RC-5B 冷凍超高速遠心分離機で９,０００ｒｐｍ）により沈降物を集める。１０分間遠心分離する。ｅ）その沈降物を新たなアセトン（−２０℃）で再懸濁して激しく混合する。氷の上に１０分間据える。ｆ）１０,０００ｇで１０分間遠心分離する。沈降物をきれいな１枚の濾紙に移す。沈降物を一面に広げて室温で風乾する。ｇ）沈降物を乾燥した後、それを気密容器に移す。微粉末に壊れないあらゆる大きな破片を取り除く。４℃で乾燥保存する。当初の湿重量の約１０〜２０％の収率。アセトン粉末として用いるには、１％の最終濃度になるように加える。４℃で３０分間インキュベートする。１０,０００ｇで１０分間遠心分離する（Biofuge で１３,０００ｒｐｍ）。５．ＤＡＢ／Ｈ₂Ｏ₂／イミダゾール：ペルオキシダーゼ基質：３,３'−ジアミノベンジジン・４塩酸塩（ＤＡＢ）（Sigma，ミズーリ州） −１錠のＤＡＢ（使用１０分前に冷蔵庫から取り出す） −１錠の尿素Ｈ₂Ｏ₂（Sigma，ミズーリ州） −１５ｍｌのトリスＨＣｌ，ｐＨ７.６＋０.０１Ｍイミダゾール（０.０１０２ｇ）（Sigma，ミズーリ州）に加える −使用直前に作る。６．トリスＨＣｌ：２００ｍｌの２回蒸留水中に１.２１１ｇのトリス，ｐＨ７.６。７．動物血清源：マウス及びウサギ血清を院内で得た（St．Vincent's Hospital，Dept．of Clinical Immunology）。ヒツジ血清をオーストラリア Werribee のメルボルン大学 Veterinary Clinic and Hospital から得た。８．ハリスヘマトキシリン：ヘマトキシリン C.I.75290 １０ｇ（BDII，Poole，U.K．#34037）無水エタノール２００ｍｌカリウムミョウバン２００ｇ２回蒸留水２０００ｍｌ氷酢酸８０ｍｌ調製：１．ヘマトキシリンを無水エタノールに溶かす。２．２回蒸留水中にミョウバンを加熱して溶かす。３．溶液１及び２を混合する。４．使用直前に８０ｍｌの１％ヨウ化ナトリウム及び８０ｍｌの氷酢酸を加える。９．スコット水道水：炭酸水素ナトリウム１４ｇＭｇＳＯ₄ ８０ｇ水道水４リットルＢ．方法１．低温槽で関連組織を４μｍ片に切断する。２．組織は亀裂のないものであるべきである。３．スライドを３０分間風乾する。４．加湿チャンバー内で１０％遮断緩衝液を室温で６０分間適用する。５．作った組織で遮断抗体をファインポイントまで除去する。６．第１抗体、つまり抗ＧＡＬ、又は対照としての２％遮断緩衝液を５０μｌ適用して気泡がないことを確認し、加湿チャンバー内で室温で３０分間インキュベートする。７．トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で２分間ずつ３回洗浄する。８．第２抗体１：５０ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＭ（DAKO，Denmark）を適用し；加湿チャンバー内で室温で３０分間インキュベートする。９．トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で３分間ずつ３回洗浄する。１０．上のようにＴＢＳで洗浄する。１１．ＤＡＢ／Ｈ₂Ｏ₂／イミダゾールを１０分間インキュベートする。１２．水中で洗浄する。１３．ヘマトキシリンＣで１０秒間染色する。１４．水中で洗浄する。１５．スコット水道水中に１５秒間置く。１６．水中で洗浄する。１７．無水エタノール（Univar 214，Ajax chemicals）中で洗浄する（×３）。１８．無水キシレン（Univar 577，Ajax chemicals）中で洗浄する（×３）。１９．自動カバースリップ機（Tissue Tek）を用いてカバースリップをする。対照：１．緩衝液のみ＋ＰＯＤ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ（陰性）。２．緩衝液のみ＋ＰＯＤ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ（陰性）。３．ヒト腎臓（陰性）。４．ブタ腎皮質（陽性）。サンプル：１．マウス１２９ＳＶ（対照）腎臓２．マウス９（Ｇａｌノックアウト）腎臓３．マウス２１（Ｇａｌノックアウト）腎臓Ｃ．結果腎臓これらの結果は、ヒト抗ＧａｌＩｇＧ及びＩｇＭ抗体がα１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が標的にされた（ＧａｌＫＯ）マウス（マウス２１及びマウス９）の腎組織に結合しないことを示している。これでこれらの遺伝子が標的にされた（ＫＯ）マウスにおいてガラクトースα１,３ガラクトース(ＧＡＬ)エピトープが欠けていることが確実である。対照的に、これらの抗体は、同じ系統の正常マウス（１２９）の血管の内皮及び糸球体と強く反応する。Ｖ．ＩＢ₄ レクチンを用いるマウス組織の免疫形態学的検査Ａ．試薬１．遮断緩衝液：ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ＋１０％ヒツジ血清２．ＦＩＴＣＩＢ₄（Sigma，ミズーリ州，米国 #L-2895）１ｍｇを１ｍｌのＨＢＢＳで希釈してストック溶液を得てから、ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ＋２％ヒツジ血清で２０μｇ／ｍｌの最終容量に希釈する。３．ペルオキシダーゼ抗ＦＩＴＣ Boehringer 抗フルオレセインＰＯＤＦａｂ断片；２％遮断緩衝液で１／３００に希釈する。４．ＤＡＢ／Ｈ₂Ｏ₂／イミダゾール−上を参照のと５．トリスＨＣｌ−上を参照のと６．動物血清源−上を参照のと７．ハリスヘマトキシリン−上を参照のと８．スコット水道水−上を参照のとＢ．方法１．切片の調製；上の第４Ｂ節の段階１〜７と同じ。２．５０μｌのＦＩＴＣ結合ＩＢ₄（Sigma #1-2894）２０μｇ／ｍｌを適用し、加湿チャンバー内で３０分間インキュベートする。３．ＴＢＳで３分間洗浄する（×３）。４．オキシダーゼ結合抗ＦＩＴＣＦａｂ断片（Boehringer Mannheim）当たり５０μｌを適用し、ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ＋２％ヒツジ血清で１〜３倍に希釈する。加湿チャンバー内で３０分間インキュベートする。５．ＴＢＳで３分間洗浄する（×３）。６．顕微鏡用に加工する−第IVＢ節の段階１４〜２２と同じ。対照１．緩衝液のみ＋ＰＯＤ抗ＦＩＴＣ（陰性）。２．ヒト腎臓（陰性）。３．ブタ腎皮質（陽性）。サンプル第１実験：１．マウス１２９ＳＶ正常マウス心臓肝臓腎臓肺２．マウス６野生型心臓肝臓腎臓肺３．マウス７ヘテロ接合体ＫＯ心臓肝臓腎臓肺４．マウス９ホモ接合性ＫＯ心臓肝臓腎臓肺サンプル第２実験：１．マウス１９野生型心臓肝臓腎臓肺２．マウス２０ヘテロ接合体ＫＯ心臓肝臓腎臓肺３．マウス２１ホモ接合性ＫＯ心臓肝臓腎臓肺Ｃ．結果腎臓肝臓心臓肺これらの結果は、ＩＢ₄ レクチンは、α１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が標的にされた（ＧａｌＫＯ）ホモ接合性マウス（マウス２１及びマウス９）の腎臓、心臓、肝臓又は肺の組織に結合しないことを示している。これでこれらの遺伝子が標的にされた（ＫＯ）マウスにおいてガラクトースα１,３ガラクトース（ＧＡＬ）エピトープが欠けていることが確実である。対照的に、これらの抗体は、同じ系統の正常マウス及びヘテロ接合性ＫＯマウス（マウス１２９、マウス６、マウス７、マウス１９、マウス２０）のこれらの組織と強く反応する。 VI．ヒト血清による溶解に対するノックアウトマウスからの脾臓細胞の抵抗性ヒト血清による脾臓細胞の溶解を⁵¹Ｃｒ放出アッセイを使用して試験した。概略的には、上の実施例４を参照のこと。Ａ．マウス脾細胞の調製−Shortman，K.J.ら，Immunological Methods．1：27 3-287（1972）： −外膜に損傷を与えないように解剖して脾臓を取り出しそして注意して隔膜組織と脂肪を除去する。 −１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０(Gibco BRL)／１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＨＩ −ＦＣＳ）の入ったペトリ皿に入れる。（熱不活化＝５６℃で４０分間）。 −細胞をペトリ皿内に優しく梳き出して集め、５００×ｇで４℃で５分間遠心分離する。 −ＲＰＭＩ／１０％ＨＩＦＣＳを除去し、パスツールピペットを用いて３ｍｌの０.９％ＮＨ₄Ｃｌ（０.１６８Ｍ）中に穏やかに再懸濁させる。（全再懸濁操作及び移送操作にはパスツールピペット又は広口ピペットを用いること） −１０ｍｌ試験管に移し、１ｍｌのＨＩＦＣＳで下層にして、氷の上に５分間立てる。 −きれいな試験管に上澄み液を移し、５００×ｇで４℃で７分間遠心分離する。 −上澄み液を捨て、細胞を３ｍｌの死細胞除去緩衝液中に再懸濁し、ピペットでよく混合する。 −ガラスピペット内に詰めた脱脂綿に通して（重力のもとで行う、無理に通さない）、細胞を１０ｍｌ試験管内に集める。 −細胞を１ｍｌのＨＩ−ＦＣＳで下層にする。 −５００×ｇで４℃で７分間遠心分離する。 −上澄み液を除去し、細胞を５０μｌのＲＰＭＩ，１０％ＨＩ−ＦＣＳ中に再懸濁させる。細胞を氷の上で保存する。Ｂ．血清の調製：ヒト−正常ドナーのプールから全血を集め、室温で２時間放置する。凝血塊を‘オレンジスティック’で絞り；遠心分離して血清をプールする。半分を３ｍｌのアリコートに分けて−７０℃で保存する（正常ヒト血清）；他方の半分を熱不活化する。以下を参照のこと。ウシ胎児血清− Gibco BRL から購入して−２０℃で保存した。Ｃ．細胞計数１．５μｌの細胞を９５.０μｌのＲＰＭＩ，１０％ＨＩ−ＦＣＳに加える。２．１０μｌの細胞を取って、１０μｌのアクリジン・オレンジ／ＥｔＢｒ溶液（Lee，S.K．ら，Eur．J．Immunol．1975，5: 259-262）を加える。３．細胞を数える（生細胞＝緑色、死細胞＝橙色）。４．細胞生存度は、約９０〜１００％である筈である。５．細胞数を計算する。Ｄ．⁵¹Ｃｒ標識：標識： −細胞（２×１０⁷） −０.９％ＮａＣｌ溶液中の（⁵¹Ｃｒ）クロム酸ナトリウム (加える容量は上に示した細胞型及び（⁵¹Ｃｒ）クロム酸ナトリウムの比放射能に依存する) −ＲＰＭＩ／２％ＨＩＦＣＳを全部で２００μｌまで混合する。３７℃で１５分毎に穏やかに攪拌しながら上に示した時間インキュベートする。Ｅ．洗浄 −１０ｍｌ試験管内に４ｍｌのＨＩ−ＦＣＳを入れて渦を巻かせながら注意して上層で層間標識反応を起こさせ；５００×ｇで４℃で５分間遠心分離する。 −注意して円運動をさせながらガラスピペットを用いて上の２層を除去する。 −１ｍｌのＲＰＭＩ／２％ＨＩ−ＦＣＳ中に細胞を再懸濁させる。 −あと４ｍｌのＨＩ−ＦＣＳにより細胞懸濁物を沈殿させる。 −細胞沈殿物を１ｍｌのＲＰＭＩ／２％ＨＩ−ＦＣＳ中に再懸濁させ、氷の上で保存する。Ｆ．放出アッセイ： −９６ウェルマイクロタイタープレート（ICN-FLOW）でアッセイを行う。 −４重でアッセイを組むべきである。 −１８０μｌの総容量でアッセイを行う。アッセイ： −示した全ての容量はμｌで表されている −反応成分をＲＰＭＩ、血清及び⁵¹Ｃｒ標識細胞の順でプレートに加える −プレートシーラーでプレートを覆う。 −３７℃で４時間インキュベートする。 −プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。 −プレートシーラーを取り除き、各ウェルから８０μｌを取り、ガンマカウンターで放出されたクロムを計数する。 −下式に従って各ウェルについて比細胞溶解を計算する。各実験ポイントについて平均値及び標準偏差を計算する。各細胞型（野生型、ヘテロ接合体ＫＯ及びホモ接合性ＫＯ）について比細胞溶解（％）（Ｙ軸）に対するヒト血清（％）（Ｘ軸）のグラフを作成する。これらの実験の結果を図２５に示す。これらの結果は、ホモ接合性ノックアウトマウスからの脾細胞は、割り込みされた対立遺伝子についてヘテロ接合性のマウス又は野生型マウスから誘導された脾臓細胞に比較して、ヒト血清による細胞溶解に比較的抵抗性であることを示している。実施例１６卵子の顕微注射によるノックアウト動物の発生遺伝子導入動物は、定型的には、受精卵の前核内へのＤＮＡの顕微注射により生じさせる。一般に、この技術でそのゲノム内に導入遺伝子をランダムに組み込む。しかしながら、慣用的な遺伝子導入技術では、注入された導入遺伝子と内因性遺伝子の間の相同的組換えが起こる。例えば、Brinsterら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 86: 1087-91（1989）を参照のこと。以下に遺伝子ターゲティング構築物で卵子を顕微注射することによりブタにおけるα−１,３−ＧａｌＴ遺伝子を不活性化する操作を記載する。Ｉ．遺伝子ターゲティング構築物遺伝子ターゲティング構築物を同質遺伝子型ＤＮＡで調製すると、胚における相同的組換えの頻度が向上する。従って、この“ノックアウト”構築物は、顕微注射に用いる卵母細胞を受精させるために用いられる雄ブタから単離されるＤＮＡから調製される。ＤＮＡを尾又は耳組織から単離し、その雄ブタの両方のα− １,３−ＧａｌＴ対立遺伝子からのゲノミック断片であってエクソン８及び９を包含する断片をロングレンジ(long range)ＰＣＲ法又は慣用的なゲノミックライブラリー法を用いてクローン化する。各α−１,３−ＧａｌＴ対立遺伝子についてのクローンを制限断片長さ多形現象同定法（restriction fragment length po lymorphism identification）及びＤＮＡ配列決定法を用いて同定する。両方の対立遺伝子を標的とする構築物は、欠失を生じさせるか又は非相同性ＤＮＡ断片を挿入するかのいずれかによりエクソン９のコーディング配列を中断させることによって作られる。それらの構築物は、効率的な相同的組換えを促進するために少なくとも８ｋｂの相同性ＤＮＡを含有する。ノックアウト構築物をデザインする際に用いられる戦略に依存して、種々のアプローチを用いて遺伝子ターゲティング結果物を検出することができる。かかるアプローチの幾つか、及び構築物の構築のための対応する戦略を以下に示す。ａ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ：割り込みされているＤＮＡ断片の一方の側の相同性ＤＮＡを１ｋｂ未満になるように構築して、短い特性表示的(daignostic)断片をＰＣＲ増幅させる。（小断片の増幅は一般に比較的効率的である）。ｂ）逆転写／ＰＣＲ：エクソン９内に約１００ｂｐの欠失を作って、正確に標的設定された細胞内で短小化α−１,３−ＧａｌＴｍＲＮＡを合成させる。エクソン８から延びてその欠失部位を包含する断片を増幅するプライマーを用いて、その短小化ｍＲＮＡをＲＴ／ＰＣＲにより検出する。ｃ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現：ＧＦＰは、生物発光性クラゲ Aequorea victoria 由来のタンパク質である。それは青色光（３９５ｎｍ）を吸収し緑色光（５０９ｎｍ）の蛍光を発する。ＧＦＰは、遺伝子発現に有用なマーカーである。Chafieら，Green Fluorescent Pr oteinas a Marker for Gene Expression．Science 263: 802-5(1994)。ＧＦＰコーディング領域のインフレーム（in-frame）挿入により、α−１,３−ＧａｌＴ遺伝子をエクソン９内に割り込ませる。ＧＦＰ遺伝子の発現（結果として５０９ｎｍの蛍光を発する）は、正確に標的設定された細胞内のα−１,３−ＧａｌＴ遺伝子プロモーターにより推進される。 II．顕微注射のための胚の発生 Nottleら，(1993)．Proc Aust Soc for Reproductive Biol 26，33 に記載された通りに受精胚を発生させる。その手順は以下の操作を含む。ａ）ターゲティング構築物用のＤＮＡを提供する雄ブタから精子を集めて液体Ｎ₂ 中に冷凍保存する。ｂ）ドナー体若雌ブタの過排卵：若雌ブタを第２発情期に交尾させ、その後の発情サイクルの時期と一致するように妊娠２５日目と４０日目の間に流産させる。流産は、１ｍｇのクロプロステノール（プロスタグランジンＦ２α類似体）を筋肉内注射してから２４時間後に０.５ｍｇで２回目の注射をすることにより行われる。１０００i.u.のウマ柔毛膜性生殖腺剌激ホルモン（ｅＣＧ）又は妊馬血清ゴナドトロピンをクロプロステノールの２回目の注射と同時に注射し、続いて７２時間後に５００i.u.のヒト柔毛膜性生殖腺剌激ホルモン（ｈＣＧ）を注射することにより、若雌ブタを過排卵させる。ｃ）受精：ｈＣＧ注射２０〜３０時間後に、過排卵した若雌ブタをターゲティング構築物用のＤＮＡを提供した雄ブタからの精液で人工受精させてから、２〜４時間後に２回目の人工受精をさせる。ｄ）胚採取：ｈＣＧ注射５０〜５６時間後で前核の融合前に胚を外科的に採取する。卵管に１％ウシ胎児血清を含有する１５〜２０ｍｌのリン酸生理食塩緩衝液を大量に流す。低倍率顕微鏡を用いて卵管に流した液を調べることにより一細胞胚を回収する。 III．胚の顕微注射胚を１２０００×ｇで８分間遠心分離し細胞質を層にして、前核が見えるようにし、そして２５ｍＭＨｅｐｅｓ及び５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むダルベッコ最小必須培地中に保持する。微分干渉対照光学（differential inter ference contrast optics）を用いて、ＰＢＳ中の４〜１０ピコリットルのＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を前核に注射する。同質遺伝子型ＤＮＡでの遺伝子ターゲティングは、雄ブタから誘導される両方の対立遺伝子構築物を雄性前核内に同時注射することにより最大となる。 IV．顕微注射胚のレシピエント若雌ブタへの移植レシピエント若雌ブタの発情サイクルをドナーのものと同時にする。レシピエントを交尾させて上記の手順を用いて受精させ、５００i.u.のｅＣＧを注射する。顕微注射胚をドナー若雌ブタから採取した日と同じ日に、それらをレシピエントに外科的に移植する（卵管当たり２０〜４０）。Ｖ．相同的組換えのためのスクリーニング相同的組換えは、生まれた子ブタからの組織の分析により検出することができる。スクリーニング操作はＰＣＲ法を含み、その厳密な戦略は遺伝子ターゲティング構築物のデザインに依存する。多くのα〜１,３−ＧａｌＴｍＲＮＡ分子が一つのα−１,３−ＧａｌＴ遺伝子から発現細胞内で合成されるので、このＲＴ／ＰＣＲアプローチは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅よりも高感度であり得る。このＲＴ／ＰＣＲスクリーニング戦略は、割り込まれた遺伝子の転写がうまくゆくこと及び短小化ｍＲＮＡの相対的安定性にかかっている。一方、正確に標識設定された細胞内での非相同性遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の発現を促進する構築物で、胚をマーカー遺伝子発現について胚盤胞段階でスクリーニングするのが可能になる（即ち、胚盤胞内の蛍光を５０９ｎｍで測定することによりＧＦＰ発現を検出することができる）。これらの顕微注射胚を胚盤胞発生まで in vitro で培養し、蛍光についてスクリーニングし、そして蛍光発生胚をレシピエント内に移植するのである。実施例１７白血病阻害因子（ＬＩＦ）の新規な変種これまでの報告で、２種の型のマウスＬＩＦの存在が証明されている。その（Ｄ転写産物からの）もとの型は、AMRAD Corporation Ltd（キュービクトリア，オーストラリア）により発現されて商品化されている。この転写産物から誘導されるタンパク質産物（以下“Ｄ−ＬＩＦ”）は、AMRAD により“ESGRO”（商標）として販売されている。別の転写産物から誘導されるＬＩＦのもう１つの型（以下“Ｍ−ＬＩＦ”）は、米国特許出願第07/994,099号及び Rathjenら，Cell 6 2:1105-14（1990）に記載されている。本発明者らは、今回、第３の転写産物のＬＩＦ（以下“Ｔ−ＬＩＦ”）を見出した。それは、ＥＳ細胞及び Pera ら，Di fferentiation 42: 10（1989）に記載されたＧＣＴ２７テラトカルシノーマ誘導細胞系の如きヒトテラトカルシノーマ誘導細胞系において見出される。このＴ−ＬＩＦタンパク質は細胞内で見出され、両方とも細胞外である他の２種の型のＬＩＦとは対照的である。その転写産物をＲＡＣＥＰＣＲ法（以下を参照のこと）を用いてマウスＥＳ細胞及びヒトＧＣＴ２７テラトカルシノーマ誘導細胞系からクローン化し、そして標準的方法を用いて配列決定した。Ｔ−ＬＩＦ転写産物の存在は、ＥＳ細胞ｍＲＮＡのＰＣＲ分析及びＧＣＴ２７ＲＮＡ上のＲＮＡアーゼ保護により確認した。この転写産物は、既知のエクソン２及びエクソン３配列にスプライスされるＬＩＦ遺伝子の第１イントロン内に位置する新規な第１エクソンを含む。そのマウスのヌクレオチド配列（配列番号２５）及び推論されるアミノ酸配列（配列番号２６）を図２６に示す。そのヒトのヌクレオチド配列（配列番号３１）及び推論されるアミノ酸配列（配列番号３２）を図２７に示す。ＣＯＳ細胞発現系内で発現させると、マウスＴ−ＬＩＦ転写産物はグリコシル化されていない１７ｋＤのタンパク質を産生する（Ｄ−ＬＩＦは分泌過程の間にゴルジ体内でグリコシル化される）（図２８）。Ｔ−ＬＩＦの翻訳は、エクソン２内の第１インフレーム開始コドン（ATG）で始まって１５８アミノ酸のタンパク質を産生する。このタンパク質は、プロセシングを受けていないＤ−ＬＩＦタンパク質よりも４５アミノ酸短く、シグナル配列の開裂により生ずる成熟Ｄ−ＬＩＦ産物よりも２２アミノ酸短い。Ｔ−ＬＩＦタンパク質はシグナル配列を含有しないために、細胞を出てゆかないのでグリコシル化されない。ＬＩＦのＴ型は、培養液中でＥＳ細胞の分化を阻止するのに有効である。方法ＲＡＣＥｃＤＮＡクローニングＣＰ１マウスＥＳ細胞（Bradley ら，Nature 309: 255-56(1984)）からの細胞質ＲＮＡ（１０μｇ）をマウスＬＩＦｃＤＮＡの残基５００〜４８４にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド 5'-ACACGGTACTTGTTGCA-3’（配列番号２７）から逆転写した。そのＲＮＡを２０pmolのプライマー及び２μｌの１０×アニーリング緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、６０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、４００ｍＭＫＣｌ）に全容量が１６μｌになるように加え、８５℃に５分間加熱し、そして室温までゆっくり冷却した。Frohman ら（Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 85: 8998-9002(1988)）に記載の通りに伸長反応を行った。０.０５×ＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７.６，１.０ｍＭＥＤＴＡ）で平衡にした２ｍｌ Sephacryl S-400（Pharmacia）カラムでゲル濾過することにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去した。ｃＤＮＡ放射性ピークに相当する５０μ ｌの画分をプールし、減圧遠心分離により濃縮し、そして２３μｌのＨ₂Ｏ中に再懸濁させた。このｃＤＮＡの３'末端をｄＧ残基でテイリングするため、３μ ｌの１０ｍＭｄＧＴＰ及び６μｌの５×テイリング緩衝液(Bethesda Research Laboratories)を加えてその混合液を３７℃で６０分間、次いで７０℃で１５分間インキュベートした。エタノールで沈降させた後、そのｃＤＮＡ鋳型を５００ μｌのＨ₂Ｏ中に再懸濁させた。マウスＬＩＦ特異性オリゴヌクレオチド 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3'( 残基３８９〜３６５)（配列番号２８）及びアンカーオリゴヌクレオチド 5'- CCATGGCCTCGAGGGCCCCCCCCCCCCCC-3'（配列番号２９）を用いてＰＣＲを行った。７μｌのｃＤＮＡ鋳型及び３４pmolの各オリゴヌクレオチドを含有する５０μｌの最終容量でＰＣＲを行った。反応条件は Perkin-Elmer Cetus により推奨される通りで、ＭｇＣｌ₂の最終濃度は１.５ｍＭであった。Ｔａｑポリメラーゼ(Pe rkin-Elmer Cetus)を加える前に、反応混合液を９４℃に５分間加熱することによりＤＮＡを変性した。各ＰＣＲサイクル（全部で３５）は、９４℃で２分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング、及び７２℃で３分間の伸長からなるものであった。最終伸長（７２℃で３０分間）後、サンプルをエタノールで沈降させ、ＳｍａＩ及びＸｈｏＩで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動により分析した。ＤＮＡを Geneclean を用いてアガロースゲルから精製してＳａｌＩ及びＳｍａＩ消化ＴＳＴ７１９Ｕ（Stratagene）内にクローン化した。適する組換えプラスミドを急速煮沸法により精製した。メーカーが推奨するところに従って Sequenase version 2.0（USB）で二本鎖配列決定を行った。ＬＩＦ活性の生物学的アッセイ未分化のマウスＥＳ細胞培養物（MBL5；Pease ら，Dev．Biol．141:344-52(19 90)，pp.15-30）をトリプシン処理して単細胞懸濁液にする。これらの細胞を遠心分離により沈殿させてＬＩＦなしの完全ＥＳ細胞培地（ＤＭＥＭ（Ｈｅｐｅｓなし）、１０％ＦＣＳ、１ｍＭ βＭＥ、１ｍＭグルタミン）中に再懸濁させる。次いで、これらの細胞を１ウェル当たり１ｍｌの無ＬＩＦＥＳ細胞培地を含有する２４ウェルマイクロタイタープレートに５×１０² 細胞／１６ｍｍウェルで播く。完全なＴ−ＬＩＦオープンリーディングフレームをＰＣＲ産物から再構築して Rathjenら，Cell 62:1105-14（1990）により記載された通りにＣＯＳ細胞発現ベクターｐＸＭＴ２内に挿入した。ＣＯＳ細胞の形質移入に用いたプラスミドを図２９に示す。これらのＣＯＳ細胞をエレクトロポレーションにより形質移入した。Ｔ−ＬＩＦを発現するＣＯＳ細胞からの上澄み液を上のＥＳ細胞に種々の希釈度（１／５、１／１０、１／５０、１／１００、１／５０、１／１０００）で加えて１０％ＣＯ₂ のインキュベーター内で４日間インキュベートした。Ｄ−ＬＩＦを発現するＣＯＳ細胞（ｐＤＲ１、Rathjen ら，Cell 62:1105-14(1990)）からの上澄み液を対照に用いた。細胞が４日後に形態学的にＥＳ細胞に似ておりかつどの型のＬＩＦともインキュベートしていない対照と全く別のものであるなら、存在するＬＩＦ活性を評価する。ＥＳ細胞もアルカリ性ホスファターゼについて染色する。というのは、未分化ＥＳ細胞はこのマーカーについて陽性となるからである。たとえＴ−ＬＩＦが細胞内で産生されても、十分な数の細胞が溶解して培養上澄み液中で十分な量のＬＩＦ活性を示す。Ｔ−ＬＩＦを発現するＣＯＳ細胞が溶解すると、より多くのＬＩＦ活性が放出される。Ｔ−ＬＩＦ転写産物のＰＣＲ検出ＥＳ細胞ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡをｄＧでテイリングしなかった以外は上記の通り調製したもの）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、２ｍＭＭｇＣｌ₂ を反応に用いた以外は上記の通りであった。オリゴヌクレオチド 5'-CACCTTTCGCTTTCCT-3 '(配列番号３０)及び 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3'（配列番号２８）を一反応当たり８０ピコグラムずつ用いた。ＰＣＲ反応の産物を上記の通りエタノール沈降させ、２％アガロースゲル上で電気泳動で分離し、そしてサザンハイブリダイゼーションを用いて検出するためにナイロン膜に転写した（図３０）。そのプローブは、ｐＤＲ１（Rathjen ら，Cell 62:1105-14(1990)）から単離した完全長Ｄ−ＬＩＦ転写産物であった。内部プライマー 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGG TCA-3'（配列番号２８）及び 5'-CTGTTGGTTCTGCACTGGA-3'（配列番号３３）を用いて全てのＬＩＦ転写産物を検出するように対照実験をデザインする。本発明のより深い理解のために上述の詳細な説明を示したに過ぎず、不必要な限定がそれから解釈されるべきではない。添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく幾つかの部分変更が当業者にとって明らかであるからである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/44 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ピアーズ，マーチンジェイ. オーストラリア国ヴィクトリア州 3195，モーディアロック，チュートストリート 37番地 (72)発明者クロフォード，ロバートジェイ. オーストラリア国サウスオーストラリア州 5020，ウエストレークスショア，ミラニコート７番地 (72)発明者ロビンズ，アランジェイ. オーストラリア国サウスオーストラリア州 5110，ウォータルーコーナー，バーカーロード，ロット８番地 (72)発明者ラスジェン，ピーターディー. オーストラリア国サウスオーストラリア州 5051，ブラックウッド，ミモーザアヴェニュー１番地 (72)発明者ダパイス，アンソニージェイ．エフ. オーストラリア国ヴィクトリア州 3103，バルウィン，バークロード 988 番地

Claims

【特許請求の範囲】１．（1）図４に示すブタ核酸配列（配列番号７）、（2）遺伝子コードの縮重の範囲内で（1）の配列に対応する配列、（3）α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するブタポリペプチドをコードしかつ標準的高ストリンジェンシー条件下で（1）又は（2）の配列に相補的な配列とハイブリダイズする配列、及び（4）（1）、（2）又は（3）の配列に相補的な配列、からなる群から選ばれる核酸配列を含む精製及び単離された核酸分子。２．請求項１の核酸分子で形質転換された宿主細胞。３．請求項２の核酸分子によりコードされるブタα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ。４．ブタα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入部位に所望のＤＮＡ配列を挿入することにより前記遺伝子を不活性化するのに有用なＤＮＡ構築物であって、第１及び第２相同配列により隣接される前記所望のＤＮＡ配列を含み、前記第１及び第２相同配列が前記挿入部位に隣接する第１及び第２ゲノム配列にそれぞれ十分に相同であり、前記ＤＮＡ構築物を前記α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有するブタ細胞内に導入したときに、前記ＤＮＡ構築物と前記ブタα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同的組換えを可能とするＤＮＡ構築物。５．前記挿入部位がブタα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエクソン４、エクソン７、エクソン８又はエクソン９内にある、請求項４のＤＮＡ構築物。６．前記所望のＤＮＡ配列が、ｎｅｏ^R遺伝子、ｈｙｇ^R遺伝子、及びチミジンキナーゼ遺伝子からなる群から選ばれる、請求項４のＤＮＡ構築物。７．前記所望のＤＮＡ配列が５'及び３'末端でＦＲＴＤＮＡ要素に接しており、かつ該３つのリーディングフレームの各々の停止コドンが該所望のＤＮＡ配列の３'側に挿入されている、請求項６のＤＮＡ構築物。８．マウスα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入部位に所望のＤＮＡ配列を挿入することにより前記遺伝子を不活性化するのに有用なＤＮＡ構築物であって、第１及び第２相同配列により隣接される前記所望のＤＮＡ配列を含み、前記第１及び第２相同配列が前記挿入部位に隣接する第１及び第２ゲノム配列にそれぞれ十分に相同であり、前記ＤＮＡ構築物を前記α−１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有するマウス細胞内に導入したときに、前記ＤＮＡ構築物と前記マウスα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同的組換えを可能とするＤＮＡ構築物。９．前記挿入部位がマウスα−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエクソン４、エクソン７、エクソン８又はエクソン９内にある、請求項８のＤＮＡ構築物。 10．前記所望のＤＮＡ配列が、ｎｅｏ^R遺伝子、ｈｙｇ^R遺伝子、及びチミジンキナーゼ遺伝子からなる群から選ばれる、請求項８のＤＮＡ構築物。 11．前記所望のＤＮＡ配列が５'及び３'末端でＦＲＴＤＮＡ要素に接しており、かつ該３つのリーディングフレームの各々の停止コドンが該所望のＤＮＡ配列の３'側に挿入されている、請求項10のＤＮＡ構築物。 12．少なくとも１の不活性化α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子を有する哺乳動物全能性細胞を生じさせる方法であって、前記全能性細胞が機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する哺乳動物種から誘導されるものであり、（a）前記哺乳動物種の全能性細胞として特徴付けられる複数の細胞を用意し；（b）前記α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入部位に所望のＤＮＡ配列を相同的組換えにより挿入することにより前記遺伝子を不活性化するのに有効な核酸構築物を前記全能性細胞内に導入し；そして（c）少なくとも１の不活性化α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子を有する全能性細胞を同定する、ことを含んでなる方法。 13．前記全能性細胞がマウスＥＳ細胞である、請求項12の方法。 14．前記全能性細胞がマウスの卵子である、請求項12の方法。 15．前記全能性細胞がブタＥＳ細胞である、請求項12の方法。 16．前記全能性細胞がブタＰＧＣである、請求項12の方法。 17．前記全能性細胞がブタの卵子である、請求項12の方法。 18．機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く哺乳動物を作出する方法であって、前記哺乳動物が機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する種に属するものであり、（a）少なくとも１の不活性化α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子を有する哺乳動物全能性細胞であって、機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する哺乳動物種から誘導される前記全能性細胞を用意し；（b）前記全能性細胞の有糸分裂子孫が発生中の胚の全部又は一部を構成するように前記全能性細胞を操作し；（c）前記胚から誘導される新生子を回収し；（d）前記新生子を飼育繁殖させて前記不活性化α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ対立遺伝子についてホモ接合性の哺乳動物を得る、ことを含んでなる方法。 19．前記全能性細胞がマウスＥＳ細胞であり、そして前記操作が前記ＥＳ細胞をマウス胚盤胞の内腔に注入すること及び前記注入胚盤胞をレシピエント雌マウス内に移植することを含む、請求項18の方法。 20．前記全能性細胞がマウス卵子であり、そして前記操作が前記卵子をレシピエント雌マウス内に移植することを含む、請求項18の方法。 21．前記全能性細胞がブタＥＳ細胞であり、そして前記操作が前記ＥＳ細胞をブタ胚盤胞の内腔に注入すること及び前記注入胚盤胞をレシピエント雌ブタ内に移植することを含む、請求項18の方法。 22．前記全能性細胞がブタＥＳ細胞であり、そして前記操作が前記ＥＳ細胞をブタ桑実胚内に注入することを含む、請求項18の方法。 23．前記全能性細胞がブタＥＳ細胞であり、そして前記操作が前記ＥＳ細胞と透明帯分断ブタ桑実胚との同時培養を含む、請求項18の方法。 24．前記全能性細胞がブタＥＳ細胞であり、そして前記操作が前記ＥＳ細胞と除核ブタ接合体とを融合させることを含む、請求項18の方法。 25．前記全能性細胞がブタ卵子であり、そして前記操作が前記卵子をレシピエント雌ブタ内に移植することを含む、請求項18の方法。 26．機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く哺乳動物であって、機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する種に属し、請求項18の方法により作出される哺乳動物。 27．マウスである、請求項26の哺乳動物。 28．ブタである、請求項26の哺乳動物。 29．機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠く天然に存在しない哺乳動物であって、機能性α−１,３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する種に属する哺乳動物。 30．マウスである、請求項29の哺乳動物。 31．ブタである、請求項29の哺乳動物。 32．（1）図２６に示す核酸配列（配列番号２５）、（2）遺伝子コードの縮重の範囲内で（1）の配列に対応する配列、（3）マウスＴ−ＬＩＦをコードしかつ標準的高ストリンジェンシー条件下で（1）又は（2）の配列に相補的な配列とハイブリダイズする配列、及び（4）（1）、（2）又は（3）の配列に相補的な配列、からなる群から選ばれる核酸配列を含む精製及び単離された核酸分子。 33．請求項32の核酸分子で形質転換された宿主細胞。 34．請求項32の核酸分子によりコードされるマウスＴ−ＬＩＦポリペプチド。 35．（1）図２７に示す核酸配列（配列番号３１）、（2）遺伝子コードの縮重の範囲内で（1）の配列に対応する配列、（3）ヒトＴ−ＬＩＦをコードしかつ標準的高ストリンジェンシー条件下で（1）又は（2）の配列に相補的な配列とハイブリダイズする配列、及び（4）（1）、（2）又は（3）の配列に相補的な配列、からなる群から選ばれる核酸配列を含む精製及び単離された核酸分子。 36．請求項35の核酸分子で形質転換された宿主細胞。 37．請求項35の核酸分子によりコードされるヒトＴ−ＬＩＦポリペプチド。 38．ヒト血清による非霊長類哺乳動物の細胞、組織及び臓器の超急性拒絶を取り除くか又は軽減する方法であって、前記ヒト血清を前記非霊長類細胞に曝す前に生理学的に許容できる量のガラクトース又は末端炭水化物が１位で結合したαガラクトースである糖を前記ヒト血清に加えることを含み、前記量のガラクトース又は糖が前記超急性拒絶を軽減するか又は取り除くのに十分である方法。 39．前記糖が、メリビオース、ガラクトースα１−３ガラクトース及びスタキオースからなる群から選ばれる、請求項38の方法。 40．ヒト血清による非霊長類哺乳動物の細胞、組織及び臓器の超急性拒絶を取り除くか又は軽減する方法であって、前記血清から免疫グロブリンを実質的に枯渇させることを含む方法。 41．ヒト血清による非霊長類哺乳動物の細胞、組織及び臓器の超急性拒絶を取り除くか又は軽減する方法であって、前記血清からＩｇＭ抗体を実質的に枯渇させることを含む方法。 42．ヒト血清による非霊長類哺乳動物細胞の超急性拒絶を取り除くか又は軽減する方法であって、前記血清から抗ＧＡＬＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を実質的に枯渇させることを含む方法。 43．ヒト血清による非霊長類哺乳動物細胞の超急性拒絶を取り除くか又は軽減する方法であって、前記血清から抗ＧＡＬＩｇＭ抗体を実質的に枯渇させることを含む方法。 44．抗ＧＡＬ抗体を実質的に含まないアフィニティー処理したヒト血清。 45．抗ＧＡＬＩｇＭ抗体を実質的に含まないアフィニティー処理したヒト血清。