KR101588474B1 - 영장류 동물의 초기 배아에의 외래 유전자 도입법 및 상기 도입법을 포함하는 트랜스제닉 영장류 동물을 작출하는 방법 - Google Patents
영장류 동물의 초기 배아에의 외래 유전자 도입법 및 상기 도입법을 포함하는 트랜스제닉 영장류 동물을 작출하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마모셋 등의 비인간 영장류 동물을 이용한 인간 질환 모델 영장류 동물의 작출을 위한 배아로의 유전자 도입 방법의 제공을 목적으로 하고, 비인간 영장류 초기 배아를 0.2 내지 0.3 M 수크로오스 용액에 넣어 위란강의 용적을 증가시키고, 초기 배아의 위란강에 프로모터에 작동 가능하게 연결한 인간 외래 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 주입하는 것을 포함하는, 비인간 영장류 동물 초기 배아에 외래 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 질환 모델 동물로서 이용할 수 있는 트랜스제닉 비인간 영장류 동물의 작출에 관한 것이고, 영장류 동물의 초기 배아에 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.
마우스나 래트를 이용하여 인간 질환 모델 동물이 여러가지 작출되어 있다. 인간의 질환에 관여하는 유전자를 비인간 동물에게 도입하거나, 또는 인간의 질환에 관여하는 유전자의 상동 유전자를 녹아웃하는 등의 유전자 조작에 의해 트랜스제닉 비인간 동물을 작출하고, 상기 트랜스제닉 비인간 동물을 인간 질환 모델 동물로서 이용할 수 있다. 그러나 마우스나 래트와 인간의 해부학적, 생리학적 및 유전적 차이로부터, 이들 동물을 이용하여 얻어진 결과로부터, 인간에 대한 임상적 응용이 적합한지를 추정하는 것은 곤란하다. 이 때문에 진화학적으로 인간에게 친척인 영장류를 이용한 트랜스제닉 동물의 이용이 요망되고 있었다.
트랜스제닉 비인간 동물을 작출하는 경우, 비인간 동물의 초기 배아에 인간의 질환에 관여하는 유전자 등의 외래 유전자를 도입할 필요가 있다. 종래부터 DNA 마이크로 주입법이나, 렌티바이러스 등의 바이러스를 벡터로서 이용하는 방법이 있었다. 그러나, 마이크로 주입법은, 배아의 손상이 크고 유전자 도입 효율이 낮아진다는 문제가 있었다(비특허문헌 1 참조). 이 비효율성을 보충하기 위해서는, 다수의 난모세포를 이용할 필요가 있었다. 그러나, 영장류나 가축 등에 있어서는 윤리적 및 경제적 이유로부터 다수의 난모세포를 준비하는 것은 곤란하였다. 이 때문에, 가축류에서 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법이 행해졌다(비특허문헌 2 내지 4 참조). 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법에 있어서는, 도입한 트랜스 유전자가 동물 개체에서 억제되어 버리는 문제가 있었다(비특허문헌 5 참조). 이 유전자 억제의 문제를 개선하기 위해서, 소 및 돼지에게 렌티바이러스 벡터가 이용되었다(비특허문헌 3 및 4 참조).
영장류에 대해서는, 트랜스제닉 붉은털원숭이(Macaca mulatta)의 작출이 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용하여 시도되었다(비특허문헌 5 및 6 참조). 그러나, 렌티바이러스를 이용한 경우에도, 도입 유전자의 발현은 태반에서 인정되었지만, 신생자에서는 인정되지 않았다(비특허문헌 6 참조). 또한, 인간 헌팅턴 유전자를 도입한 붉은털원숭이에 대해서도 보고되어 있지만(비특허문헌 7 참조), 상기 붉은털원숭이에 대해서도, 생존하고 있는 신생자에서는 도입 유전자의 발현은 인정되지 않으며, 도입한 트랜스 유전자의 생식계열 전파는 인정되지 않았다. 붉은털원숭이나 필리핀원숭이(Macaca fascicularis)는, 종래부터 실험용 비인간 영장류로서 이용되고 있었다. 그러나, 이들 영장류의 번식률이 낮기 때문에 모델 동물의 작출을 위한 출발 동물을 얻는 것이 곤란하고, 차세대 동물을 얻기까지 3년 정도가 걸릴 뿐 아니라, 차세대 동물로서 10개체 정도밖에 얻어지지 않는다는 문제가 있었다.
상기한 바와 같이, 영장류 등의 일부 포유동물에서는, 배아로의 높은 유전자 도입 효율을 얻을 수 없게 되어 있다.
마우스 등의 일부 동물에 있어서는, ES 세포를 이용하여 트랜스제닉 동물을 작출할 수 있다. 그러나, ES 세포를 이용하여 도입 외래 유전자의 생식계열에의 전파가 발생하는 트랜스제닉 영장류 동물은 작출되어 있지 않고 있다. 예를 들면, 본원 발명자는 마모셋(marmoset)의 ES 세포의 작출에 성공하였지만(특허문헌 1 참조), ES 세포를 이용한 기술에서는 생식계열 전파가 발생하는 트랜스제닉 영장류의 작출에는 성공하지 못했다.
한편, 인공수정 기술로서 위란강 정자 주입법이라는 기술이 있었다(특허문헌 2 참조). 상기 기술에서는, 예를 들면 난모세포의 투명대와 난세포의 간극인 위란강에 정자를 주입함으로써 수정을 촉진시킨다. 이 때, 난모세포를 미리 수크로오스 용액으로 처리하여, 위란강을 넓히는 경우도 있었다. 상기 기술은 예를 들면 투명대를 통과하는 능력이 저하된 정자를 인공적으로 난자 내에 침입시키는 기술이다. 인공수정을 목적으로 하기 위해, 1개의 난모세포에 단일한 정자를 넣은 것을 목적으로 하고, 1개의 세포에 다량의 DNA를 넣은 것은 목적으로 하고 있지 않았다. 상기 방법으로는 반드시 높은 수정률을 달성할 수 없어, 그 후 세포질에 직접 정자를 주입하는 세포질내 주입법으로 교체되었다.
Hammer, R. E. et al. Nature 315, 680-3 (1985)
Chan, A. W. et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 14028-33 (1998)
Hofmann, A. et al. EMBO Rep 4, 1054-60 (2003)
Hofmann, A. et al. Biol Reprod 71, 405-9 (2004)
Chan, A. W. et al., Science 291, 309-12 (2001)
Wolfgang, M. J. et al. Proc Natl Acad Sci USA 98, 10728-32 (2001)
S.H. Yang et al. Nature, vol. 453, N0. 7197, 921- (2008)
본 발명은 마모셋 등의 비인간 영장류 동물을 이용한 인간 질환 모델 동물의 작출을 위한 초기 배아에의 유전자 도입 방법의 제공을 목적으로 한다.
신세계 원숭이의 일종인 코몬마모셋(Callithrix jacchus)은, 인간에게 근연한 진원류에 속하는 초소형 원숭이로, 대형 원숭이에 비하여 번식 효율이 양호할 뿐 아니라 소형으로 취급이 용이하다는 이점을 가진다. 본 발명자들은 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 인간 질환 모델 마모셋을 외래 유전자 도입 또는 표적 유전자를 파괴함으로써 작출하는 것이 가능하게 되면, 신경이나 그 밖의 장기의 재생 의료의 개발에 크게 기여하는 것을 기대할 수 있을 것이라 생각하였다. 본 발명자들은 먼저 코몬마모셋의 ES 세포의 작출에 성공하였고(WO 2006/029093), ES 세포를 이용하여 트랜스제닉 코몬마모셋의 작출을 시도했지만 성공하지 못했다. 그래서 본 발명자들은 다른 기술로 트랜스제닉 코몬마모셋의 작출을 시도하기로 하여, 트랜스제닉 코몬마모셋 작출에서 필수가 되는 발생 공학적, 분자 생물학적 기술의 기초적 연구를 행하고, 트랜스제닉 코몬마모셋을 효율적으로 제조하기 위한 세포의 제조법 등에 대해서 예의 검토를 행하였다.
구체적으로는, 트랜스제닉 코몬마모셋을 작출하기 위한 필수적인 기술인 코몬마모셋의 초기 배아로의 유전자 도입법을 확립하였다. 특히, 종래부터 영장류에서는 초기 배아로의 외래 유전자의 도입 효율을 높이는 것이 곤란하여, 인간 유전자를 도입한 트랜스제닉 영장류의 제조에 성공하였다는 보고는 거의 없었다. 본 발명자들은, 초기 배아에 바이러스 벡터를 개재시켜 외래 유전자를 도입할 때에, 수크로오스를 포함하는 용액을 이용함으로써, 효율적으로 외래 유전자를 초기 배아에 도입할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 비인간 영장류 동물 초기 배아를 0.2 내지 0.3 M 수크로오스 용액에 넣어 수크로오스 처리하여 위란강의 용적을 증가시키고, 초기 배아의 위란강에 프로모터에 작동 가능하게 연결한 인간 외래 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 주입하는 것을 포함하는 비인간 영장류 동물 초기 배아에 외래 유전자를 도입하는 방법.
[2] 상기 [1]에 있어서, 수크로오스 처리에 의해, 초기 배아의 위란강 용적을 수크로오스 처리 전인 초기 배아의 위란강 용적의 1.2 내지 8배로 증대시키는 것인 방법.
[3] 상기 [1]에 있어서, 수크로오스 처리하지 않은 초기 배아에 주입 가능한 외래 유전자 양의 1.2 내지 8배 양의 외래 유전자를 초기 배아에 주입하는 것인 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 영장류 동물이 마모셋인 방법.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
[6] 상기 [5]에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 초기 배아이 자연 교배에 의해 얻어진 착상 전의 전핵기부터 상실배기까지의 배아인 방법.
[8] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 초기 배아가 인공수정에 의해 얻어진 전핵기부터 상실배기까지의 배아인 방법.
[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터를 배아당 1.3×103 내지 1.3×105 CFU의 역가로 주입하는 것인 방법.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 초기 배아에 외래 유전자를 도입하고, 상기 외래 유전자를 도입한 초기 배아를 대리모에게 이식하여 발생시키는 것을 포함하는, 도입 외래 유전자가 생식계열로 전파할 수 있는 트랜스제닉 비인간 영장류 동물을 작출하는 방법.
[11] 상기 [10]에 있어서, 외래 유전자가 인간의 질환에 관여하는 유전자인, 트랜스제닉 비인간 영장류 동물을 작출하는 방법.
[12] 상기 [11]에 있어서, 인간의 질환에 관여하는 유전자가, 인간 파킨슨병의 원인 유전자인 변이형 α-시누클레인(synuclein) 또는 인간 헌팅턴병의 원인 유전자인 변이형 헌팅틴(huntingtin) 유전자이고, 인간 질환 모델 영장류 동물이 인간 파킨슨병 모델 영장류 동물 또는 인간 헌팅턴병 모델 영장류 동물인, 트랜스제닉 비인간 영장류 동물을 작출하는 방법.
[13] 상기 [11]에 있어서, 외래 유전자가 비인간 영장류 동물에게 내재성 인간의 질환에 관여하는 유전자의 오르소로그 유전자를 녹아웃하기 위한 것으로, 트랜스제닉 비인간 영장류 동물이 인간 질환 모델 녹아웃 영장류 동물인, 트랜스제닉 비인간 영장류 동물을 작출하는 방법.
[14] 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 작출된, 도입 외래 유전자가 생식계열 전파능을 가지는 트랜스제닉 영장류 동물.
[15] 인간 파킨슨병의 원인 유전자인 인간 변이형 α-시누클레인 유전자 또는 인간 헌팅턴병의 원인 유전자인 인간 변이형 헌팅틴 유전자가 도입되어, 상기 유전자가 생식계열로 전파하는 트랜스제닉 영장류 동물.
[16] 상기 [15]에 있어서, 인간 파킨슨병 모델 영장류 동물 또는 인간 헌팅턴병 모델 영장류 동물인 트랜스제닉 영장류 동물.
[17] 상기 [15] 또는 [16]에 있어서, 영장류 동물이 마모셋인 트랜스제닉 영장류 동물.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2008-017955호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은, 바이러스 벡터의 위란강에의 주입 방법의 개요를 도시한 도면이다.
도 2는, 0.25 M 수크로오스 용액 중 또는 M2 배지 중에서 바이러스 벡터액을 주입한 직후의 배아를 나타내는 사진이다.
도 3은, 0.25 M 수크로오스 용액 중 또는 M2 배지 중에서 바이러스 벡터액을 주입하고, 2.5일, 3.5일, 8.5일 경과한 배아를 나타내는 사진이다.
도 4는, 트랜스제닉 코몬마모셋의 섬유아세포, 혈액 및 태반으로부터 추출한 샘플의 서던 블롯 분석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는, 태어난 트랜스제닉 코몬마모셋의 사진이다.
도 6은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 모근, 혈액 및 태반에서의 EGFP의 전사를 나타내는 사진이다.
도 7은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 태반에서의 EGFP의 발현을 나타내는 사진이다.
도 8은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 귀에서의 EGFP의 발현을 나타내는 사진이다.
도 9는, 트랜스제닉 코몬마모셋의 모근에서의 EGFP의 발현을 나타내는 사진이다.
도 10은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 말초혈의 FACS 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 11은, #666으로부터의 활동 중인 정자 및 IVF 배아 및 #584 및 야생형 동물로부터의 천연 배아의 RT-PCR 분석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는, IVF 배아의 낙사(落射) 형광 현미경법 분석에 의한 명시야와 암시야를 나타내는 사진이다.
도 13은, 변이형 α-시누클레인 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 구조를 도시한 도면이다.
도 14는, 체외 수정 (A) 및 발생한 상실배아 (B 및 C)의 사진이다.
도 15는, 마이크로세틀라이트 마커에 의한 친자 감정의 결과를 도시한 도면이다.
도 16은, 얻어진 산자(産仔)의 모근 샘플의 RT-PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은, 얻어진 인간 파킨슨병 모델 코몬마모셋의 사진이다.
도 2는, 0.25 M 수크로오스 용액 중 또는 M2 배지 중에서 바이러스 벡터액을 주입한 직후의 배아를 나타내는 사진이다.
도 3은, 0.25 M 수크로오스 용액 중 또는 M2 배지 중에서 바이러스 벡터액을 주입하고, 2.5일, 3.5일, 8.5일 경과한 배아를 나타내는 사진이다.
도 4는, 트랜스제닉 코몬마모셋의 섬유아세포, 혈액 및 태반으로부터 추출한 샘플의 서던 블롯 분석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는, 태어난 트랜스제닉 코몬마모셋의 사진이다.
도 6은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 모근, 혈액 및 태반에서의 EGFP의 전사를 나타내는 사진이다.
도 7은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 태반에서의 EGFP의 발현을 나타내는 사진이다.
도 8은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 귀에서의 EGFP의 발현을 나타내는 사진이다.
도 9는, 트랜스제닉 코몬마모셋의 모근에서의 EGFP의 발현을 나타내는 사진이다.
도 10은, 트랜스제닉 코몬마모셋의 말초혈의 FACS 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 11은, #666으로부터의 활동 중인 정자 및 IVF 배아 및 #584 및 야생형 동물로부터의 천연 배아의 RT-PCR 분석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는, IVF 배아의 낙사(落射) 형광 현미경법 분석에 의한 명시야와 암시야를 나타내는 사진이다.
도 13은, 변이형 α-시누클레인 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 구조를 도시한 도면이다.
도 14는, 체외 수정 (A) 및 발생한 상실배아 (B 및 C)의 사진이다.
도 15는, 마이크로세틀라이트 마커에 의한 친자 감정의 결과를 도시한 도면이다.
도 16은, 얻어진 산자(産仔)의 모근 샘플의 RT-PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은, 얻어진 인간 파킨슨병 모델 코몬마모셋의 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
신세계 원숭이의 일종인 코몬마모셋(Callithrix jacchus) 등의 마모셋은, 인간에게 근연한 진원류에 속하는 초소형 원숭이로, 대형 원숭이에 비하여 번식 효율이 양호할 뿐 아니라 소형으로 취급이 용이하다. 마모셋의 임신 기간은 약 144일로 짧다. 또한 12 내지 18개월만에 성적으로 성숙한다. 또한, 한번에 2 내지 3 마리의 새끼를 낳고, 1 마리의 암컷이 생애 40 내지 80 마리의 새끼를 낳는다.
마모셋 등의 영장류 동물의 인간 질환 모델 동물은, 영장류 동물에서 인간의 질환에 관여하는 인간 유전자에 상당하는 영장류 동물의 오르소로그 유전자 또는 인간의 질환에 관여하는 인간 유전자를 도입함으로써 이들 원인 유전자 단백질을 고발현시키거나, 영장류 동물의 오르소로그 유전자를 녹아웃하거나, 또는 인간의 질환에 관여하는 인간 유전자를 녹인함으로써 얻을 수 있다.
인간 질환으로는 파킨슨병, 헌팅턴병을 들 수 있다. 파킨슨병의 질환 모델 동물은, 영장류 동물에게 변이형 α-시누클레인 유전자를 도입하면 된다. 인간 야생형 α-시누클레인 유전자의 염기 서열을 서열번호 16에, α-시누클레인 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 17에 나타낸다. 인간 파킨슨병의 원인 유전자인 변이형 α-시누클레인 유전자는, α-시누클레인 단백질의 30번째 알라닌이 프롤린으로 변이하도록, 30번째 알라닌에 대응하는 서열번호 16의 101 내지 103번째 염기 서열(gca)이 ccc, cct, cca 또는 ccg로 변이하고 있다. 또한, 변이형 α-시누클레인 유전자는, α-시누클레인 단백질의 53번째 알라닌이 트레오닌으로 변이하도록, 53번째 알라닌에 대응하는 서열번호 16의 170 내지 172번째 염기 서열(gca)이 acu, acc, aca, acg로 변이하고 있다. 본 발명에서는, 인간의 야생형 α-시누클레인 유전자를 기본으로, α-시누클레인 단백질의 30번째 알라닌이 프롤린으로 치환되고, 추가로 53번째 알라닌이 트레오닌으로 치환된 염기의 변이를 가지는 변이 유전자를 파킨슨병의 원인이 되는 인간의 변이형 α-시누클레인 유전자라 한다. 예를 들면, 서열번호 16에 나타내는 염기 서열에 있어서, 101번째의 g가 c로, 170번째의 g가 a로 변이하고 있다. 또한, 변이형 α-시누클레인 단백질은, 서열번호 17에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 30번째 알라닌이 프롤린으로, 53번째 알라닌이 트레오닌으로 변이하고 있다(서열번호 18). 영장류 동물이 마모셋인 경우, 마모셋의 야생형 α-시누클레인 유전자는, 서열번호 16에 염기 서열을 나타내는 인간의 야생형 α-시누클레인 유전자의 170 내지 172번째 염기 서열이 gca인 것에 대하여 aca이고, 마모셋의 야생형 α-시누클레인 단백질은, 인간의 야생형 α-시누클레인 단백질의 53번째 아미노산이 알라닌인 것에 대하여 트레오닌이다. 따라서, 변이형 인간 α-시누클레인 단백질은 야생형의 마모셋 α-시누클레인 단백질의 30번째 알라닌이 프롤린으로 변이한 단백질과 동일하다. 서열번호 19에 인간 파킨슨병 모델 마모셋에 도입할 수 있는 변이형 α-시누클레인 유전자 배열의 일례를 나타낸다. 서열번호 19의 염기 서열에 있어서는, α-시누클레인 단백질의 30번째 알라닌에 대응하는 염기 서열(gca를 ccc로 변이)뿐만 아니라, 31번째 글리신에 대응하는 염기 서열도 야생형 유전자에 대하여 변이시키고 있다(gga를 ggg로 변이). 단, 31번째 글리신에 대응하는 염기 서열의 변이는 아미노산의 치환을 초래하지 않는다. 이 변이는, 변이형 유전자 선발시의 편의를 도모하기 위함이다. 즉, 30 내지 31번째 아미노산에 대응하는 염기 서열이 cccggg가 됨으로써, 새롭게 제한 효소 SmaI의 인식 배열(야생형에는 존재하지 않는 배열)이 발생하고, 변이체 선발시, SmaI에 의해서 소화되는 클론을 선발함으로써, 목적으로 하는 변이 도입체의 선발이 용이해진다.
예를 들면, 서열번호 19에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA 또는 서열번호 19에 나타내는 염기 서열에 있어서, 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 포함하는 DNA로서, 영장류 동물에게 도입한 경우, 인간의 파킨슨병의 증상을 나타내는 인간 파킨슨병 모델 영장류 동물을 얻을 수 있다. 여기서 1 또는 수개란, 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개를 말한다. 또한, 서열번호 19에 나타내는 염기 서열과 BLAST 등(예를 들면, 디폴트 즉 초기 설정의 매개변수를 이용하여)을 이용하여 계산했을 때에, 적어도 95 ％ 이상, 바람직하게는 97 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 가지고 있고, 또한 영장류 동물에게 도입한 경우, 인간의 파킨슨병의 증상을 나타낼 수 있는 DNA를 도입할 수도 있다. 또한, 서열번호 19에 나타내는 염기 서열에 스트린젠트 조건에서 혼성화하고, 또한 영장류 동물에게 도입한 경우, 인간의 파킨슨병의 증상을 나타낼 수 있는 DNA를 도입할 수도 있다. 여기서 스트린젠트 조건은, 예를 들면 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, pp. 1. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]에 기재된 조건이다. Sambrook 등에 따르면, 5×SSC, 0.5 ％ SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 전세정용 용액과 약 55 ℃, 5×SSC, 하룻밤 혼성화 조건을 들 수 있다. 또한, 보다 고온의 혼성화와 세정도 포함된다. 그 때, 프로브의 길이 등의 각종 요인에 따라서 온도 및 세정 용액의 염 농도는 적절하게 조절될 수 있다. 예를 들면, 5×SSC 이하에서 20 ℃ 이상의 범위의 조건을 채용할 수 있다.
인간의 변이형 α-시누클레인 유전자를 영장류 동물에게 도입한 경우, 얻어진 트랜스제닉 영장류 동물에 있어서, 그의 영장류 동물이 원래 가지는 α-시누클레인 유전자와 인간의 변이형 α-시누클레인 유전자가 공존한다. 인간의 변이형 α-시누클레인 유전자의 발현 산물이 인간의 파킨슨병의 증상을 나타내는 원인이 된다. 또한, 이 때, 상동 재조합 등에 의해 영장류 동물이 원래 가지는 α-시누클레인 유전자를 인간의 변이형 α-시누클레인 유전자로 대체할 수도 있다.
또는 헌팅턴병 질환 모델 영장류 동물은, 인간 헌팅틴 유전자(HTT 유전자)의 제1 엑손에 37 내지 876의 CAG 배열의 반복 배열이 존재하는 변이형을 영장류 동물에게 도입함으로써 작출할 수 있다.
이들 인간 질환의 원인 유전자를 영장류 동물에게 도입함으로써, 트랜스제닉 영장류 동물은 인간의 상기 질환의 병태를 나타내게 된다. 예를 들면, 파킨슨병 모델 영장류 동물의 경우, 생후 1 내지 수년 동안, 진전, 무동, 근강강(筋强剛), 자세 반사 장해, 신경 세포의 도파민의 감소 등의 증상을 나타내게 된다. 또는 헌팅턴병의 경우, 대뇌기저핵이나 전두엽의 위축, 치매 증상, 간질 등의 증상을 나타내게 된다. 질환에 따라서는, 그의 증상을 나타내게 되기까지 시간이 걸리는 경우가 있고, 본 발명에서는 증상을 나타내기 전의 원인 유전자를 도입한 트랜스제닉 영장류 동물도 질환 모델 동물이라 한다.
본 발명의 트랜스제닉 영장류 동물에 있어서는, 도입한 외래 유전자인 트랜스 유전자가 생식계열로 전파하고, 생식계열을 통해 자손에게 전파된다. 즉, 본 발명의 트랜스제닉 영장류 동물은 생식계열 전파능을 가지고, 자손에서도 트랜스 유전자의 발현이 인정되어, 인간 질환 모델 영장류 동물의 자손도 인간 질환 모델 영장류 동물로서 이용할 수 있다. 생식계열 전파는, 예를 들면 초대 트랜스제닉 영장류 동물로부터 생식세포(난자 또는 정자)를 채취하고, 그것을 정상 영장류 동물로부터 채취한 생식세포와 수정시키고, 수정란을 발생시켜 트랜스 유전자의 존재를 검출함으로써 확인할 수 있다.
트랜스제닉 영장류 동물의 작출은, 이하의 공정을 거쳐 작출한다. 따라서, 이하 공정의 각각을 최적화하고, 그것을 조합하여 비로소 효율적으로 트랜스제닉 영장류 동물을 작출하는 것이 가능해진다.
(a) 영장류 동물의 수정란을 채취하여 회수하는 공정, 또는 미수정란을 채취하여 난자를 체외 수정시키는 공정;
(b) 초기 배아에 외래 유전자를 도입하여 유전자 조작을 하는 공정;
(c) 수정란 또는 초기 배아를 보존하는 공정;
(d) 초기 배아를 암컷 영장류 동물 대리모에게 이식하고, 발생시키는 공정.
상기한 공정의 순서는 복잡하고, 반드시 (a)부터 (d)의 순서로 행해지는 것은 아니다.
이하, 각각의 공정에 대해서 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어서는, 주로 영장류에 속하는 마모셋을 예로 들고 있지만, 본 발명의 방법은 다른 영장류나 소 등 초기 배아의 위란강 용적이 작은 포유류에 적용할 수 있다.
(1) 마모셋의 미수정란을 채취하는 공정
미수정란은 마모셋의 난소를 자극함으로써 채취할 수 있다. 난소를 자극하는 방법으로서, 예를 들면 성성숙에 도달한 암컷의 마모셋에 난포 자극 호르몬(FSH)을 투여하고, 추가로 융모성 성선자극(CG) 호르몬을 투여하는 방법을 들 수 있다. FSH 및 CG는 마모셋의 것을 이용할 수도 있고, 인간을 포함한 다른 영장류에 속하는 종의 것을 이용할 수도 있다. 또한, 천연 호르몬을 이용할 수도 있고, 재조합 호르몬을 이용할 수도 있다. 입수 용이성의 관점에서 인간의 재조합 FSH(hFSH) 또는 CG(hCG)를 바람직하게 사용할 수 있다. 투여하는 FSH의 농도는 100 내지 1000 IU/㎖, 바람직하게는 100 내지 750 IU/㎖, 더욱 바람직하게는 100 내지 500이고, 투여하는 양은 10 내지 100 IU/마리이다. 투여는 6 내지 15일간, 바람직하게는 7 내지 15일간, 보다 바람직하게는 8 내지 15일간, 더욱 바람직하게는 9 내지 15일간, 더욱더 바람직하게는 10 내지 15일간, 특히 바람직하게는 10 또는 11일간 연속으로 투여한다. 투여 방법은 근육내 투여가 바람직하다.
FSH를 상기 기간 동안 매일 투여한 후, CG를 투여한다. 투여하는 CG의 농도는 100 내지 1000 IU/㎖, 바람직하게는 100 내지 750 IU/㎖, 더욱 바람직하게는 100 내지 500 IU/㎖이고, 투여하는 양은 10 내지 100 IU/마리이다. 투여는 FSH의 투여 후, 7 내지 21일, 바람직하게는 10 내지 15일, 더욱 바람직하게는 12일에 행한다. 투여 방법은 근육내 투여가 바람직하다.
CG의 투여로부터 15 내지 30, 바람직하게는 20 내지 25, 더욱 바람직하게는 21 또는 22 시간 후에 난포난자를 채취한다. 난포난자의 채취는, 예를 들면 외과적 수술법을 이용한 흡인 채취에 의해 행할 수 있다.
(2) 채취한 미수정란의 체외 성숙
채취한 난자를 영장류의 난자성숙에 적합한 배지 중에서 수시간 내지 수일, 바람직하게는 밤새 배양함으로써, 체외 성숙(IVM)시킨다. 체외 성숙에 이용하는 배지로는, Waymouth medium(인비트로젠(Invitrogen)사), IVM 배지(메디컬트(Medicult)사) 등을 사용할 수 있지만, IVM 배지가 체외 수정 후 배아의 발생률이 높은 점에서 바람직하다. 성숙시킨 난자를 정자를 이용하여 체외 수정에 의해 수정시킨다. 수정시킨 후에, ISM1 배지나 ISM2 배지에서 배양함으로써, 초기 배아까지 발생시킨다. 여기서, 초기 배아란 전핵기에서 배반포기의 배아를 말한다. 외래 유전자를 도입하고, 트랜스제닉 마모셋을 작출하기 위해서는, 전핵기(PN기부터 2PN기)로부터 상실배기의 배아가 바람직하다.
(3) 마모셋의 초기 배아의 보존
얻어진 마모셋의 초기 배아는 필요에 따라서 동결 보존한다.
이 때, 다가 알코올로서 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜만을 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 포유동물 초기 배아 또는 포유동물 ES 세포용 유리화 보존액(일본 특허 공개 제2007-105013호 공보)을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 유리화 보존액은 인산 완충액을 베이스로 하는 보존액이고, 수정 인산 완충액(PB1)에 프로필렌글리콜을 첨가한 PB10 및 PB1에 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, Percoll(등록상표) 및 수크로오스를 첨가한 PEPeS가 있다. P10은, PB1에 5 내지 15 ％(v/v), 바람직하게는 10 내지 15 ％(v/v), 특히 바람직하게는 10 ％(v/v)의 프로필렌글리콜을 첨가한 것이다. 또한, PEPeS는 PB1에 5 내지 15 ％(v/v), 바람직하게는 10 내지 15 ％(v/v), 특히 바람직하게는 10 ％(v/v)의 프로필렌글리콜, 25 내지 35 ％(v/v), 바람직하게는 30 ％(v/v)의 에틸렌글리콜, 15 내지 25 ％(v/v), 바람직하게는 20 ％(v/v)의 Percoll(등록상표) 및 0.2 M 내지 0.5 M, 바람직하게는 0.3 M의 수크로오스를 첨가한 것이다. 마모셋의 초기 배아를 유리화 보존액 P10에 1 내지 20 분간, 바람직하게는 3 내지 15 분간, 더욱 바람직하게는 5 내지 10 분간 침지한다. 침지는 실온(22 내지 25 ℃)에서 행하면 된다. 이어서 침지에 의해 전처리한 배아를 유리화 보존액 P10과 함께 동결 보존 튜브에 넣고, 수십초 내지 수분간, 바람직하게는 30 초 내지 2 분간, 더욱 바람직하게는 1 분간, 0 ℃ 내지 5 ℃, 바람직하게는 0 ℃에서 냉각한다. 그 후, P10에 넣은 상태에서, 유리화 보존액 PEPeS에 넣고 -196 ℃ 이하의 저온에서 동결하면 된다. 동결 보존한 초기 배아는, 예를 들면 동결 배아를 포함하는 동결 튜브를 액체 질소로부터 꺼내고, 10 초 내지 60 초, 바람직하게는 약 30 초간 실온에 놓고, 그 후 5 내지 10배량의 실온으로 유지한 융해용 용액을 주입하고, 융해시킨 후, 융해용 용액으로 배아를 세정하면 된다. 융해용 용액은 한정되지 않지만, 예를 들면 상기한 BP1에 0.2 내지 0.5 M, 바람직하게는 0.3 M의 수크로오스를 첨가한 용액을 사용할 수 있다.
(4) 마모셋 초기 배아의 유전자 조작에 의한 형질 전환
유전자 조작은 마모셋의 초기 배아에 있어서, 인간의 질환에 관여하는 유전자를 도입하거나, 또는 인간의 질환에 관여하는 마모셋에 있어서의 인간 유전자의 오르소로그 유전자를 녹아웃함으로써 행한다. 본 발명에서, 인간의 유전자를 도입한 마모셋 및 유전자를 녹아웃한 마모셋을 트랜스제닉 마모셋이라 부른다. 도입하는 유전자 또는 녹아웃하는 유전자는 질환의 종류에 따라 다르다. 인간의 질환에 관여하는 유전자를 도입하는 경우, 상기 유전자를 상동 재조합 등에 의해, 마모셋의 그의 유전자의 오르소로그 유전자와 치환할 수도 있다.
유전자의 도입 및 녹아웃은, 공지된 유전자 공학적 수법에 의해 행할 수 있다.
마모셋에 도입하는 DNA는, 마모셋 세포 중에서 발현 가능한 프로모터와 연결한다. 발현 가능한 프로모터로서, 예를 들면 CAG(닭 β액틴) 프로모터, PGK(포스포글리세린산 키나제) 프로모터, EF1α(연장인자(Elongation factor) 1α) 프로모터 등의 포유동물 세포 유래의 프로모터나, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 시미안바이러스 40(SV40; simian virus 40) 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 폴리오마바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터 등의 바이러스 프로모터를 들 수 있다. 이들 프로모터 중, CAG 프로모터 및 CMV 프로모터가 바람직하다. 또한, 유전자의 발현을 증강하는 인핸서를 조립할 수도 있다. 도입하고자 하는 유전자를 프로모터와 작동 가능하게 연결하고, 벡터에 도입한다. 벡터로는 도입 유전자를 동물의 생체 내에서 발현 유도시킬 수 있는 것이면 되고, 미리 프로모터가 조립된 벡터를 이용할 수도 있다. 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터가 바람직하다. 벡터 중에서도, 레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터가 바람직하다. 렌티바이러스로는, 예를 들면 인간 면역 부전 바이러스(HIV)를 들 수 있다. 예를 들면 SIN 벡터(SIN 제3세대 VSV-G 슈도타입 인간 면역 부전 바이러스 벡터(제3세대 렌티바이러스 벡터)(Miyoshi, H. et al., J Virol 72, 8150-7(1998))를 바람직하게 사용할 수 있다.
바이러스 벡터는, 초기 배아의 위란강 또는 배반포의 배반강에 주입(injection)하면 된다. 초기 배아는 인공수정에 의해 얻어진 배아일 수도 있고, 자연 교배에 의해 수정한 착상 전의 배아를 이용할 수도 있다. 주입하는 바이러스 벡터의 역가는 높은 것이 좋고, 예를 들면 배아 1개당 1.3×103 내지 1.3×105 CFU의 역가로 주입하는 것이 바람직하다. 초기 배아로는, 전핵기(PN기부터 2PN기)부터 상실배기의 배아가 바람직하다. 이 때, 세포질을 일시적으로 축소시키기 위해서, 초기 배아를 0.2 M 내지 0.3 M, 바람직하게는 0.25 M의 수크로오스에 넣어서 행한다. 이 조작에 의해 위란강의 용적이 커지고 바이러스액이 보다 대량으로 주입된다. 이 결과, 초기 배아에 많은 외래 유전자가 도입되어, 형질 전환이 발생하기 쉬워진다. 영장류 동물의 초기 배아를 이용한 경우, 위란강의 용적은 약 1.2배 내지 10배, 바람직하게는 약 1.2배 내지 8배, 더욱 바람직하게는 약 1.3배 내지 8배, 더욱 바람직하게는 약 1.5배 내지 8배, 또는 약 1.2 내지 6.5배, 바람직하게는 1.3 내지 6.5배로 증가한다. 일례로는, 마모셋의 전핵기 배아의 위란강의 용적은 약 31.5 pl이지만, 수크로오스 처리함으로써 약 231 pl로 약 7.3배 증가한다. 즉, 본 발명의 방법에서는, 수크로오스 처리에 의해, 영장류 동물의 초기 배아의 위란강 용적을 수크로오스 처리하지 않은 위란강의 용적에 대하여, 약 1.2배 내지 10배, 바람직하게는 약 1.3배 내지 8배, 더욱 바람직하게는 약 1.5배 내지 8배, 더욱 바람직하게는 약 2배 내지 8배로 증대시킨다. 증대 후 위란강의 용적은 100 내지 500 pl, 바람직하게는 150 내지 400 pl, 더욱 바람직하게는 200 내지 300 ㎕이다. 이 결과, 동시에 제조한 외래 유전자를 포함하는 벡터를 이용하는 경우, 수크로오스 처리한 초기 배아에서는, 수크로오스 처리하지 않는 초기 배아에 대하여, 약 1.2배 내지 10배, 바람직하게는 약 1.3배 내지 8배, 더욱 바람직하게는 약 1.5배 내지 8배, 더욱 바람직하게는 약 2배 내지 8배 양의 유전자를 초기 배아에 도입할 수 있다. 이 때 수크로오스 농도가 지나치게 높으면 배아에 대하여 독성을 나타내기 때문에, 수크로오스는 0.3 M 이하의 농도로 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 초기 배아에 유전자 도입을 행할 때에, 초기 배아를 수크로오스 처리하는 방법은, 위란강이 작아 충분한 양의 바이러스 벡터액을 주입할 수 없는 포유동물에게 적용할 수 있다. 이와 같은 배아의 위란강이 작은 포유동물로서, 영장류에 속하는 포유류, 소 등을 들 수 있다.
녹아웃 마모셋은 상동 재조합 등의 공지된 방법으로 제작할 수 있다. 상동 재조합이란, 세포 내에서 2개의 DNA 분자가 동일한 염기 서열을 통해 서로 재조합을 일으키는 현상이다. 상동 재조합에 있어서는, 표적으로 하는 유전자 부위의 배열을 중앙에서 분단하는 형태로, 프로모터와 외래 유전자를 연결한 트랜스퍼 벡터를 구축하고, 이를 초기 배아에 도입하면, 세포의 유전자와 트랜스퍼 벡터 상의 동일한 배열 부분 사이에서 교체가 일어나 사이에 끼워진 프로모터와 외래 유전자가 세포의 게놈 중에 삽입되어, 표적 유전자가 분단되어 기능을 상실하여 상기 유전자가 녹아웃된다. 트랜스퍼 벡터는, 표적 유전자의 염기 서열 정보를 기초로 설계·제작할 수 있으며, 상기 트랜스퍼 벡터를 이용하여 파괴하려고 하는 유전자를 상동 재조합하면 된다. 트랜스퍼 벡터는 문헌 [D. M. Glover 외 편, 가또 이꾸노신 감역(監譯) DNA 클로닝 4-포유류의 시스템-(제2판) TaKaRa] 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다. 벡터로는 상기한 여러가지 바이러스 벡터를 사용할 수 있지만, 렌티바이러스 벡터가 바람직하다. 또한, 리콤비나아제와 상기 리콤비나아제의 인식 부위를 이용한 방법에 의해서도 상동 재조합에 의해 표적 유전자를 녹아웃할 수 있다. 상기 방법에 있어서는, 마모셋에 녹아웃하고자 하는 표적 유전자를 상기 리콤비나아제의 인식 부위의 뉴클레오티드 배열로 끼운 DNA 및 상기 리콤비나아제의 상류에 프로모터를 연결한 DNA를 도입한다. 상기 리콤비나아제가 발현되면, 리콤비나아제 인식 부위에서 끼워진 표적 유전자가 절단되어 나와 기능을 상실한다. 이러한 방법으로서 Cre-loxP 시스템을 이용한 방법을 들 수 있다. Cre-loxP 시스템은 문헌 [Sauer, B. et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 85: 5166-5170, 1988]; 문헌 [Gu, H., et al., Cell, 73, 1155-1164, 1993] 등에 기재되어 있고, 이들 기재에 따라서 Cre-loxP 시스템을 이용하여 표적 유전자를 녹아웃한 마모셋 초기 배아를 작출할 수 있다.
(5) 유전자 조작을 행한 마모셋 초기 배아의 마모셋 대리모에의 이식
대리모에의 이식은, 공지된 방법으로 대리모의 자궁에 이식하면 된다.
이 때, 대리모가 되는 리시피언트(recipient) 마모셋과 배아의 도너가 되는 도너 마모셋은, 성주기(배란주기)의 동기화를 실시해둔다. 성주기 동기화는, 프로스타글란딘 등의 성 호르몬을 투여함으로써 행할 수 있다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 호르몬제를 이용한 난소 자극법의 검토
마모셋을 이용한 발생 공학의 기초 연구로서, 코몬마모셋의 난소 자극법의 검토를 행하였다.
성성숙에 도달한 암컷 개체에, 50 IU/마리의 인간 재조합 난포 자극 호르몬(hFSH)을 5일간, lO일간 및 11일간 계속하여 근육내 투여하고, hFSH 투여 개시로부터 12일 후에 75 IU/마리의 인간 융모성 성선자극 호르몬(hCG)을 근육내 투여하고, hCG 투여로부터 21 시간 내지 37 시간 후에 외과적 수법을 이용하여 난포난자를 흡인 채취하였다. 그 후 5 ％ CO2하에서 Waymouth medium(인비트로젠사)을 이용하여 하룻밤 배양하고, 난자의 체외 성숙(IVM) 배양을 행하여 체외 수정(IVF)을 행함으로써, 난소 자극법을 검토하였다.
그 결과, FSH 투여 기간 5일간, 10 일간 및 11일간에 있어서, 평균 채취 난자수는 각각 9.0±5.7개, 12.8±6.7개, 14.7±8.1개이고, 통계적으로 유의한 차는 인정되지 않았지만, hFSH 투여 기간이 길어짐에 비례하여 얻어지는 난자수가 많아지는 경향이 인정되었다. 또한 IVM율은 각각 30.2 ％, 84.5 ％ 및 67.4 ％이고, hFSH 투여일수가 10일, 11일의 그룹은 5일간의 그룹보다 유의(p<0.01)하게 높은 IVM율이 인정되었다. 또한 IVF율(0 ％, 35 ％ 및 40 ％)에서도 마찬가지로 유의(p<0.O 1)한 차를 보였다.
이어서 난자의 성숙 개시를 촉진시키는 인간 융모성 성선자극 호르몬(hCG)의 폭로 시간을 검토하였다. hCG 투여 후 21 내지 22 시간, 23 내지 25 시간 및 31 내지 37 시간에 난자를 채취하고, 채취된 난자의 개수, IVM율 및 체외 수정률에 대해서 검토하였다. 그 결과, 평균 채취된 난자의 개수는 각각 20.4±12.8개, 10.67±4.0개 및 3.67±1.5개이고, hCG 투여 후 21 내지 22 시간에 채란하면 유의(P<0.01)하게 채란 개수가 많았다. IVM율은 각각 72 ％, 54.3 ％ 및 100 ％이고, hCG 투여 후 31 내지 37 시간에 난자를 채취하면 유의(P<0.05)하게 IVM율이 높은 것으로 나타났다. 또한, 체외 수정률은 각각 36.3 ％, 22.8 ％ 및 76.7 ％였다.
이상의 결과로부터, 채취된 난자의 개수, 난자 성숙률 및 체외 성숙률과의 균형을 생각하면 hFSH의 투여는 10 또는 11일간이 적당하고, hCG의 폭로 시간은 21 내지 22 시간이 적당하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2 체외 수정법의 검토
체외 수정을 행하기 위해서는, 난포난자 채취, 난자의 체외 성숙, 체외 수정이라는 단계가 필요하다. 따라서, 체외 수정법의 검토 중 제1 단계로서, 체외 성숙 배지를 검토하였다. 지금까지 원숭이류의 난자성숙에 적합하다고 보고되어 있던 Waymouth 배지와 인간의 불임 치료로 이용되고 있는 IVM 배지(메디컬트사)를 비교하였다. 그 결과, IVM 배지의 난자 성숙률(39.7 ％)은 Waymouth 배지에서의 성숙률(61.5 ％)에 비하여 유의하게 낮지만, IVM 배지 중에서 성숙한 난자의 체외 수정 후 배반포까지의 발생률(22.2 ％)은 Waymouth 배지의 그것(4.3 ％)과 비교하면 유의하게 높았다.
이상으로부터, 체외 수정하는 배아는 IVM 배지에서 성숙시키고, 자궁에 이식하는 것이 좋은 것을 알았다.
실시예 3 코몬마모셋 초기 배아의 가복(假腹)에의 이식 방법의 조건 검토
체외 수정에 의해 얻어진 수정란 257개 및 자연 교배에 의해 수정한 수정란 49개를 자궁 및 난관에 이식하여, 이들 수정란의 발생능 및 이식법에 대해서 검토하였다. 체외 수정에 의해 얻어진 수정란을 이식한 결과, 3마리의 산자가 얻어져, 출생률은 1.2 ％였다. 한편, 자연 교배에 의한 수정란을 이식한 경우, 9마리의 산자가 얻어져, 출생률은 18.4 ％이어서, 자연 교배란의 출생률이 유의(P<0.01)하게 높았다. 또한, 수정란의 이식 부위에 대해서 난관(n=140) 및 자궁(n=166)에서 출생률을 비교하였다. 그 결과, 난관에 이식한 경우의 출생률은 2.1 ％, 자궁에 이식한 경우의 출생률은 5.4 ％로, 이식 부위에 의한 출생률의 유의한 차이는 인정되지 않았다.
실시예 4 코몬마모셋 배우자 및 초기 배아의 동결 보존 방법의 검토
코몬마모셋의 초기 배아의 보존은 아직 충분한 검토가 이루어져 있지 않다. 따라서, 상실역 내지 배반포의 보존 방법에 대해서 검토하였다. 이들 코몬마모셋 배아(n=6)를 본 발명자들이 개발한 유리화 보존액(일본 특허 공개 제2007-105013호 공보)을 이용하여 보존하였다. 이 배아를 12 내지 20일간 액체 질소 중에서 보존한 후, 가온액에 의해서 가온하였다. 그 결과, 모든 배아가 확장 배반포로의 발생이 인정되었다. 이로부터, 이 방법은 코몬마모셋 초기 배아에도 응용 가능하다는 것이 판명되었다.
실시예 5 렌티바이러스 벡터액의 주입법의 검토
PN(일전핵) 배아를 0.25 M 수크로오스 또는 수크로오스를 포함하지 않는 M2 배지 중에 넣고, 그 후 EGFP를 도입한 렌티바이러스 벡터를 위란강(난황주위강)에 주입하였다. 배반포기의 배아의 경우, 바이러스를 포배강에 주입하였다. 배아로의 주입은 DNA 주입 바늘을 이용하였다. 프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, PGK 프로모터 또는 EF1α 프로모터를 사용하였다.
도 1에 렌티바이러스 벡터의 위란강에 대한 도입 방법의 개요를 나타낸다.
도 2에 렌티바이러스 벡터액을 주입한 직후의 PN 배아의 사진을 나타낸다. 도 2A가 0.25 M 수크로오스 용액을 이용한 것, 도 2B가 M2 배지를 이용한 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이 수크로오스액 중에서 렌티바이러스 벡터액을 주입한 PN 배아에서는 바이러스액이 위란강의 전체에 인정되는 것에 대해, M2 배지 중에서 렌티바이러스 벡터를 주입한 PN 배아에서는 주입부 주변에만 렌티바이러스 벡터가 인정되었다.
도 3에 렌티바이러스액 주입 2.5일부터 8.5일의 PN 배아의 사진을 나타낸다. 도 3A가 0.25 M 수크로오스 용액을 이용한 것, 도 3B가 M2 배지를 이용한 것이다.
하기 표 1에 수크로오스를 이용한 경우와 이용하지 않는 경우의 유전자의 발현율을 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 수크로오스를 이용한 경우, GFP의 발현 효율이 현저히 높았다.
단, 수크로오스의 농도가 너무 높은 경우는, 배아에 대하여 독성이 인정된다.
실시예 6 코몬마모셋 초기 배아로의 유전자 도입
A. 방법
(1) 호르몬제를 이용한 난소 자극에 의한 미수정란 채취
마모셋은 2세를 초과한 연령의 것을 이용하였다.
성성숙에 도달한 암컷 개체에 50 IU/마리의 인간 재조합 난포 자극 호르몬(hFSH)을 11일간 계속하여 근육내 투여하고, hFSH 투여 개시로부터 12일 후에 75 IU/마리의 인간 융모성 성선자극 호르몬(hCG)을 근육내 투여하고, hCG 투여로부터 21 시간 내지 37 시간 후에 2.3 ㎖의 실린지 및 23게이지의 주사 바늘을 이용하여 외과적 수술에 의해 난포난자를 흡인 채취하였다. 난포난자의 흡인은 10 ％ FBS를 포함하는 Waymouth medium 중에서 행하였다. 배지 중에서 난모세포를 채취하고, 2회 세정하고, 5 ％ CO2, 38 ℃의 조건하에서 Waymouth medium을 이용하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 성숙 난모세포(중기 II)만을 모아 체외 수정(IV)에 이용하였다.
(2) 정액의 채취 및 정자의 제조
Ferti Care personel vibrator(Kuederling, I. et al., Am J Primatol 52, 149-54(2000))를 이용하여 마모셋의 정액을 채취하였다. 정액을 TYH 배지에 모아 3 ㎖의 TYH 배지로 2회 세정하였다. 300 ㎕의 TYH 배지를 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에 30 ℃, 10 분간 놓아 정자를 활동하게 하였다.
(3) 체외 수정(IVF)
히알루로니다아제 처리한 난모세포를 TYH 배지로 세정하고, 70 ㎕를 액적으로서 분주하였다. 70 ㎕ 중에는 최대 10개의 난모세포가 포함되어 있었다. 이 액적에 상기한 방법으로 제조한 정자 10 ㎕를 첨가하였다. 이 때의 최종 정자 농도는 5×109 정자/㎖였다. 정자 첨가로부터 26 내지 30 시간 후에 난모세포를 채취하고, ISM1 배지(메디컬트)로 세정하였다. 수정란을 ISM1 배지에서 48 시간 동안 배양하고, 마우스 태아 피더 세포를 포함하는 IISM2 배지에 옮겨 배양하였다.
(4) 배아의 채취 및 배아 이식
도너 및 리시피언트 코몬마모셋에 프로스타글란딘 F2α 아날로그인 클로프로스테놀(Cloprostenol)(Estrumate, Takeda Schering-Plough K. K.) 0.75 mg/마리를 황체기의 10일 후에 투여함으로써 배란주기를 동기화시켰다(Summers, P. M. et al., J Reprod Fertil 73, 133-8(1985)). 혈장 샘플 0.1 ㎖를 클로프로스테놀 투여 2, 9, 11 및 13일 후에 대퇴정맥으로부터 채취하고, 배란일을 RIA를 이용한 혈장 프로게스테론 레벨의 측정에 의해 결정하였다. 혈장 프로게스테론 레벨이 10 ng/㎖에 도달하는 일을 배란일(0일째)로 하였다. 배란일의 7 내지 10일 후에 도너 마모셋에 마취를 가하고, 난자를 코몬마모셋으로부터 채취하였다. 자궁경부와 양쪽 난관을 정중선 개복에 의해 체외에 꺼내고, 클램프로 끼워, 자궁 루멘을 근접 단부로부터 자궁경부까지 10 ％ FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 2.5 ㎖의 DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)으로 세정하였다. 세정에 이용한 배지를 자궁 루멘에 놓은 23게이지 주사 바늘을 이용하여 자궁저부로부터 회수하였다. 배아 채취의 4일 후에 클로프로스테놀을 더 투여하였다. 혈장 프로게스트스테론 농도를 DPC 프로게스테론 키트(Diagnostic Products Corp.)를 이용하여 결정하였다.
도너와의 배란 주기를 동기화시킨 리시피언트 코몬마모셋에 마취를 가하고, 자궁 및 난소를 정중선 개복에 의해 체외에 꺼내었다. 자궁경부로부터 자궁의 근접 단부에 자궁 루멘을 통과시켜, 23게이지의 주사 바늘을 뚫었다. 1개 내지 3개의 배아를 글라스 모세관 피펫을 이용하여 자궁 루멘에 이식하였다. 배아 이식 후, 리시피언트은 복부를 통하여 자궁의 촉진에 의해 임신을 모니터할 수 있게 될 때까지, 1주일에 1회 혈장 프로게스테론을 측정함으로써 임신 성립의 유무를 조사하였다.
(5) 렌티바이러스 벡터의 제조 및 도입
인간 배아성 신장 293T 세포를 10 ％ 가열 불활화 소태아 혈청, 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 250 ng/㎖ 암포테리신 B를 첨가한 DMEM 중에서 증식시켰다. CMES 중에 외래 DNA를 도입하기 위해서, SIN 벡터 시스템을 이용하였다. 4개의 상이한 프로모터 CAG, CMV, EF-1α 및 PGK 프로모터를 가지는 EGFP(Enhanced Green Fluorescence Protein)를 발현하는 3종의 벡터를 구축하고, 각각 CAG-EGFP, CMV-EGFP, EF1α-EGFP 및 PGK-EGFP라 명명하였다.
렌티바이러스 벡터는 Fugene 6 트랜스펙션 시약을 이용하여 293T 세포에 벡터와 패키징 구축물을 VSV-G 및 Rev 발현 구축물과 함께 동시 트랙스펙트함으로써 제작하였다. 트랜스펙션의 4일 후에, 배지에 포함되는 바이러스 입자를 회수하고, 0.22 ㎛ 필터에 통과시키고, 4 ℃, 25,000 rpm, 4 시간 동안 원심 분리하였다. 바이러스의 침전물을 ISM2 배지(메디컬트)에 1/1000 용적의 오리지널 렌티바이러스 벡터 상청과 함께 현탁하였다.
렌티바이러스 도입은, 코몬마모셋의 배아에 바이러스 용액을 주입함으로써 행하였다. 2PN(2전핵) 배아부터 상실배아까지, 배아를 0.25 M 수크로오스 중에 넣고, 그 후 바이러스를 위란강(난황주위강)에 주입하였다. 배반포기의 배아의 경우, 바이러스를 포배강에 주입하였다.
모든 배아의 주입은 마이크로 인젝터(Eppendorf femtojet express) 및 마이크로매누퓰레이터(Narishige micromanipulator)를 이용하여 행하였다.
(6) RT-PCR
Poly A+ RNA를 모근, 피부 소편 및 적혈구로부터 Quick Prep Micro mRNA 정제 키트(GE health care)를 이용하여 단리하였다. RNA 샘플은 Improm-II Reverse Transcription system(Promega)을 이용하여 역전사하였다. 각각의 Poly A+ RNA의 절반량은 제1쇄 cDNA 합성을 위해 역전사 효소와 반응시키고, 나머지의 절반량은 음성 대조로서, 역전사 효소없이 반응시켰다. 태반에 대해서는, RNA II kit(MACHEREY-NAGEL)를 이용하여 총 RNA를 단리하였다. 100 ng에서 1 ㎍의 총 RNA에 대해서 역전사를 행하였다.
PCR은 1/40 내지 3/20의 cDNA 합성 반응 혼액을 주형으로서 이용하여 행하였다. 10 ㎕의 PCR 혼합물은 1×PCR 버퍼(10 mM Tris-HCl [pH 9.0], 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl), 0.2 mM dNTPs, 0.2 ㎛의 프라이머 및 1.0 U의 Taq 폴리머라아제를 포함하고 있었다. EGFP 유전자 발현을 검출하기 위해서, 94 ℃ 30 초간의 변성, 62 ℃ 30 초간의 어닐링, 72 ℃ 30 초간의 신장으로 이루어지는 35 사이클의 PCR을 행하였다. 이용한 프라이머의 배열은 이하와 같았다.
5'-GCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGC-3'(EGFP5-5, 포워드 프라이머)(서열번호 1)
5'-TCACGAACTCCAGCAGGACCAT-3'(EGFP 3-1, 리버스 프라이머)(서열번호 2)
β액틴 발현을 검출하기 위해서, 94 ℃ 30 초간의 변성, 58 ℃ 30 초간의 어닐링, 72 ℃ 30 초간의 신장으로 이루어지는 30 사이클의 PCR을 행하였다. 이용한 프라이머의 배열은 이하와 같았다.
5'-TCCTGACCCTGAAGTACCCC-3'(β액틴 001, 포워드 프라이머)(서열번호 3)
5'-GTGGTGGTTGAAGCTGTAGCC-3'(β액틴 002, 리버스 프라이머)(서열번호 4)
(7) 면역 조직 화학 분석
조직을 OCT 컴파운드에 포매, 액체 질소 중에서 동결하고, 분석할 때까지 -80 ℃에 보존하였다. 덩어리를 5 ㎛의 절편으로 하고, 4 ％ 파라포름알데히드를 이용하여 4 ℃에서 30 분간 고정시켰다. 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 0.03 ％ 과산화수소수를 이용하여 실온에서 30 분간 처리함으로써 억제하고, 5 분간 물로 세정하고, 이어서 PBS로 2 분간 세정하였다. 슬라이드를 10 ％ 염소혈청(니치레이)을 이용하여 10 분간 실온에서 블록킹 처리하고, 토끼 항 P.v 항체와 4 ℃에서 오버나이트로 반응시켰다. PBS를 이용하여 3회 세정한 후, 슬라이드를 비오틴화 2차 항체, Simple Stain Mouse MAX PO(니치레이)와 실온에서 30 분간 반응시키고 PBS를 이용하여 3회 세정하였다. 결합한 모노클로날 항체의 국재는 DAB(3,3,-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 복합체에 의해 검출하였다. 그 후, 샘플을 HE(hematoxylin 및 eosin)로 염색하고, 포매하였다.
(8) FACS 분석
말초혈 샘플을 2000 rpm, 5 분간 원심 분리하고, 전혈세포를 채취하여 1 ㎖의 PBS로 세정하였다. 전혈세포를 0.13 M의 NH4Cl에 현탁하여 2000 rpm으로 5 분간 원심 분리하고, 1 ㎖의 PBS로 재차 세정하였다. 침전을 마우스 IgG1 항 마모셋 CD45, 6C9 항체와 함께 빙상에서 30 분간 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 세정하고, 2차 항체로서 APC 표지 항마우스 IgG 항체와 혼합하여 빙상에서 30 분간 인큐베이션하였다. 2차 항체와의 인큐베이션 후, 샘플을 PBS로 세정하고 200 ㎕의 PI 용액에 현탁하여 FACS 분석을 행하였다.
(9) 서던 블롯 분석
게놈 DNA를 피부, 전혈세포 및 태반의 섬유아세포로부터 DNeasy Blood and Tissue kit(Qiagen)를 이용하여 추출하였다. CAG-EGFP를 주입한 동물의 게놈 DNA는 BamHI에 의해 소화하고, CMV-EGFP를 주입한 동물의 게놈 DNA는 EcoRI를 이용하여 소화하였다. 서던 블롯 분석은 DIG system product(Roche)에 의해 행하였다. 즉, 5 ㎍의 게놈 DNA를 0.8 ％ 아가로스겔 상에서 25볼트로 오버나이트로 영동시키고, Hybond-N+ 나일론 멤브레인에 전사하였다. CMV-EGFP는 EcoRI로 소화하고, 그 후 PCR DIG probe synthesis kit에 의해 DIG로 표지하였다. 멤브레인을 DIG Easy Hyb Granules(Roche) 중에서 DIG 표지 프로브와 혼성화하였다. 멤브레인을 세정한 후, 혼성화한 프로브를 30 분간 블록킹 용액에 침지하고, 항 DIG 알칼리포스파타아제 콘쥬게이트와 반응시켰다. 멤브레인을 세정한 후, 혼성화한 프로브 CSPD를 이용하여 검출하고 X선 필름에 폭로하였다.
(10) 태반 및 새끼에서의 도입 유전자의 정량
태반의 작은 조각 및 성체 동물의 귀의 피부 샘플을 채취하고, 프로테이나아제 K 처리를 행하였다. 게놈 DNA를 Mag Extractor System MFX-9600 Magnia R Plus(도요보)를 이용하여 추출하였다. 또한, 성체 동물의 전혈 샘플 및 신생자의 모근으로부터, 각각 DNeasy Blood ＆ Tissue kit(Qiagen) 및 QIAmp DNA Micro kit(Qiagen)를 이용하여 추출하였다.
EGFP 도입 유전자의 검출은 이하의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 행하였다.
GFPF1: CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG(서열번호 5)
GFPR1: CACGAACTCCAGCAGGACCATG(서열번호 6)
내재성의 컨트롤 유전자인 β액틴 유전자의 검출은 이하의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 행하였다.
Comm-β-ActinF: TGTAGGTACTAACACTGGCTCGTGTGACAA(서열번호 7)
Comm-β-ActinR: GGGTGTTGAAGGTCTCAAACATGATCTGTA(서열번호 8)
EGFP와 β액틴의 유전자 도입 효율은 거의 동일하기 때문에, EGFP 도입 유전자의 상대적 정량은 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applera Corporation, Applied Biosystems) 및 the Master Mix of SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time, Takara Bio Inc)을 이용한 비교 CT법에 의해 행하였다.
(11) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH)
도입 유전자를 검출하기 위해서, 형광 in situ 하이브리다이제이션을 행하였다. 말초혈 샘플을 피토헤마글루티닌, 콘카나발린 A, 리포폴리사카라이드 및 2 메르캅토에탄올을 포함하는 RPMI1640 배지 중에서 수일간 배양하였다. 최종 농도 30 ㎍/㎖의 BrdU와 함께 수시간 동안 배양한 후에, 최종 농도 0.02 ㎍/㎖의 콜세미드를 배지에 첨가하여 추가로 수시간 동안 배양하였다. 림프구를 회수하고, 저장 용액 처리하여 적혈구를 제거하고, 침전을 메탄올/아세트산(3:1 vol/vol)을 이용하여 고정시켰다. 고정을 한 후, 세포를 슬라이드에 펼쳐 오버나이트로 풍건시킨 Hoechst33258을 이용하여 염색하고, 자외선 처리하였다.
CAG-EGFP를 디곡시게닌-11-dUTP를 이용하여 표지하고 프로브로 하여, 37 ℃ 오버나이트로 혼성화하였다. 스트린젠트 조건에서 슬라이드를 세정한 후, 항 Dig-Cy3을 이용하여 결합한 표지를 검출하였다. 염색체 분석은 Leica CW4000 FISH 및 Leica CW4000 karyo를 이용하였다.
B. 결과
(1) 렌티바이러스 벡터를 이용한 트랜스제닉 코몬마모셋의 작출
유전자 도입 배아로서, 체외 수정(IVF) 배아와 자연 교배에 의해 얻어진 착상전 배아를 모두 이용하였다. EGFP 유전자의 도입은 3종의 프로모터, CAG, CMV 및 EF1-α 프로모터를 포함하는 3종의 SIN 벡터를 이용하여 행하였다. 각각의 벡터는 CAG-EGFP, CMV-EGFP 및 EF1α-EGFP라 명명하였다. 제작한 SIN 벡터를 배아의 위란강에 주입하였다. 코몬마모셋의 초기 배아는 위란강이 작고, 충분한 양의 바이러스액을 주입할 수 없기 때문에, 바이러스를 주입하여도 도입 유전자의 발현율은 46 ％로 낮다. 따라서, 초기 배아를 0.25 M 수크로오스액에 넣고, 세포질을 일시적으로 축소시킴으로써 바이러스액의 주입량을 증가시키는 방법을 시도하였다. 배아는 전핵기에서 상실배기의 배아를 이용하였다. 포배기의 배아에 대해서는, SIN 벡터를 포배강에 주입하였다.
합계 27의 체외 수정(IVF) 배아 및 64의 자연 교배에 의해 얻어진 착상전 배아를 고역가(5.6×109 내지 5.6×1011 CFU(colony-forming units/㎖))의 SIN 벡터를 이용하여 주입하였다. 하기 표 2에 결과를 나타낸다. 27의 IVF 배아 중 16배아, 64의 착상전 배아 중 47배아에 대해서 0.25 M 수크로오스를 이용하여 렌티바이러스 벡터를 주입하였다(표 3). 0.25 M 수크로오스 처리에 의해 위란강의 용적은 1.2배 내지 6.5배로 증대되었다. IVF 배아 중 11의 배아에 대해서 및 착상전 배아 중 15의 배아에 대해서는, 포배기의 배아를 이용하여 0.25 M 수크로오스를 이용하지 않고 포배강에 SIN 벡터를 주입하였다. SIN 벡터의 주입 후 48 시간보다 나중에 EGFP 발현이 발생하기 때문에, IVF 배아 중 4배아, 착상전 배아 중 12배아는 주입 후 곧 리시피언트 동물에 이식하였다. 이 때문에, 배아 단계에서의 EGFP 발현은 측정하지 않았다. 렌티바이러스 벡터를 주입한 후 48 시간에서의 EGFP 발현율은 수크로오스 처리한 착상전 배아에서 89.7 ％이고, 처리하지 않은 포배기의 배아에서 92.9 ％였다. 48의 착상전 배아 및 17의 IVF 배아에 대해서, 형광 현미경하에서 EGFP의 발현이 인정되었다. 61의 착상전 배아 및 19의 IVF 배아를 배란 주기를 도너와 동기화시킨 리시피언트 동물에게 이식하였다. 각각의 리시피언트 동물에게는, 주기당 1 내지 3개의 배아를 이식하였다. 대리모의 총수는 51 마리였다. IVF 배아 또는 착상전 배아를 이식한 리시피언트 중 7 마리가 임신하였다. 그 중 3 마리는 각각 43, 62 및 82일 후에 유산되었다. 144 내지 147일째에, 나머지 4 마리로부터 총 5 마리의 건강한 새끼가 태어났다. 3 마리는 1 마리씩 낳고, 1 마리는 쌍둥이를 낳았다. 태어난 5 마리의 새끼 중, 4 마리가 암컷이고, 1 마리가 수컷이었다. 태어난 5 마리 중, 3 마리는 CAG-EGFP를 주입한 배아 유래이고, 2 마리는 CMV-EGFP를 주입한 배아 유래였다(표 4). 따라서, 프로모터로는 CAG 또는 CMV가 바람직하다. 또한, 표 3에 나타낸 바와 같이, 수크로오스 처리하지 않는 착상전(IVF) 배아를 이용한 경우, EGFP의 발현율은 40.8 ％이고, 수크로오스 처리한 착상전(IVF) 배아를 이용한 경우에는 97.7 ％였다. 이 EGFP의 발현율은 수크로오스 처리를 하면 유의하게 높았다(P<0.01).
No.594와 666은 쌍둥이
(2) 도입 유전자의 조립
산자에서의 도입 유전자의 조립, 전사 및 발현은 태반, 체모, 피부 및 혈액을 이용하여 검출하였다. 통상 마모셋은 분만 후에 태반을 먹어 버리기 때문에, 개체번호 N0.584, 588 및 594/666의 3개의 태반만 회수할 수 있었다. 코몬마모셋의 쌍둥이는 태반이 공통이기 때문에, N0.594와 666의 태반은 공통이다.
도입 유전자의 조립은 우선 출생 직후에 태반, 모근에 대해서, 이어서 생후 1 내지 2개월에 피부 및 혈액으로부터 추출한 게놈 DNA를 이용한 리얼 타임 PCR에 의해 측정하였다. 하기 표 5에 리얼 타임 PCR의 결과를 비트랜스제닉 코몬마모셋의 혈액에 대한 상대적인 EGFP 도입 유전자량으로 나타낸다. 개체번호 N0.584 및 588에 대해서는, 도입 유전자의 조립이 인정되었지만, N0.594/666은 매우 낮은 양의 조립밖에 인정되지 않았다. 체모, 귀의 단편 및 혈액에서의 도입 유전자의 조립은 개체번호 N0.584, 587, 594 및 666으로 인정되었다.
서던 블롯 분석은 개체번호 N0.584, 587, 594 및 666의 피부편의 배양 섬유아세포, 5 마리 모든 새끼의 혈액, 개체번호 N0.584, 588 및 594/666의 태반으로부터의 추출 DNA를 이용하여 행하였다. N0.588의 섬유아세포는 배양하여도 증식하지 않았기 때문에 얻어지지 못했다. 서던 블롯 분석에 의해 적어도 4카피의 도입 유전자가 N0.584에 조립되고, 2카피의 도입 유전자가 N0.587에 조립되어 있는 것을 알았다(도 4). 또한, N0.594 및 666의 섬유아세포 및 말초혈 세포 및 N0.588의 태반에서 게놈으로의 복수의 조립이 인정되었다. 개체번호 N0.588에서는 태반에만 도입 유전자의 조립이 인정되고, N0.594/666에서는 태반에의 조립은 인정되지 않았다(도 4).
도입 유전자의 염색체 상의 조립 부위를 특정하기 위해서, 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH)를 행하였다. 서던 블롯과 마찬가지로, FISH에서도 말초혈 림프구의 염색체의 복수의 부위로의 조립이 인정되었다. 또한, 모든 새끼에게서 도입 유전자의 조립 패턴이 상이한 여러 종류의 세포가 인정되었다(표 6). 개체번호 N0.584에서는 4개의 도입 유전자의 조립 부위가 2, 7, 11 및 13번 염색체에 인정되고, N0.587에서는 말초혈 림프구의 제3 및 12번 염색체에서 상이한 시그널이 인정되었다. 도입 유전자의 복수의 조립 패턴을 가지는 N0.588, 594 및 666의 말초혈 림프구 샘플에서는, 혼성화 시그널은 인정되지 않았다. 개체번호 N0.594는 적어도 3개의 상이한 타입의 도입 유전자의 조립이 인정되고, 6 이상의 패턴의 존재가 시사되었다. 개체번호 N0.666은 가장 많은 조립 패턴, 최대 13의 패턴을 가지고 있었다. 또한, 13의 조사한 핵형 중에서, 개체번호 N0.594는 조혈계의 키메라 쌍둥이였기 때문에, 8개의 샘플은 암컷의 핵형이었다.
도 5에 태어난 트랜스제닉 코몬마모셋의 사진을 나타낸다.
(3) 도입 유전자의 전사 및 발현
RT-PCR의 결과, EGFP 유전자 mRNA의 전사가 N0.588을 제외한 모든 새끼의 모근에서, 그리고 N0.584 및 587의 전혈에서 인정되었다. 태반 샘플에 있어서는, EGFP 유전자의 전사는 N0.584, 588 및 594/666의 모든 샘플에서 인정되었다(도 6).
모근, 피부편 및 태반 샘플을 이용하여 형광 현미경에 의해 EGFP의 형광을 직접 검출하였다. 절편 샘플을 제작하기 위해서, 귀 피부의 작은 조각 및 태반 샘플을 OCT 컴파운드(sakura-finetek)에 포매하고, 액체 질소로 동결시켜, 분석까지 -80 ℃에서 보존하였다. 조직 중에서의 EGFP의 발현을 확인하기 위해서, 면역 조직 화학 분석을 귀 피부의 작은 조각 및 태반 조직 샘플에 대해서 행하였다. 면역 조직화학 분석의 결과, EGFP가 귀의 피부 및 태반의 간질 세포에서 강하게 발현되고 있는 것을 알 수 있었다. N0.588을 제외한 모든 개체에서 모근과 피부에서의 EGFP의 발현이 인정되었다. N0.584 및 N0.588의 태반 샘플에서는, EGFP의 높은 수준의 발현이 인정되었지만, N0.594/666의 발현은 검출되지 않았다(도 7, 8 및 9).
말초혈 샘플에 대해서는, 유세포 분석기 분석(FACS)을 행하였다. FACS에 의해, N0.584 및 587에서 말초혈 세포에서의 EGFP의 발현이 인정되었다. 각각의 발현 수준은 각각 22.8 ％ 및 21.3 ％였다(도 10). 이들 혈액 세포에서는, 과립구, 림프구 및 마크로파지에서의 EGFP 발현 수준은 N0.584에서는 각각 43.4 ％, 15.9 ％, 36.5 ％이고, N0.587에서는 각각 47.7 ％, 9.25 ％ 및 32.0 ％였다. FACS의 결과는, RT-PCR의 결과에 대응하고 있었다.
상기한 바와 같이, 본 실시예에 있어서, 4 마리의 트랜스제닉 코몬마모셋에 있어서, 체세포에 도입 유전자가 조립될 뿐 아니라, 도입 유전자가 발현되고 있는 것으로 나타났다. 본 실시예의 결과는, 이용한 SIN 벡터가 트랜스제닉 코몬마모셋 작출을 위한 유전자 도입에 효과적인 것을 나타내고 있다. 또한, 본 실시예에서는, 렌티바이러스의 주입을 가능한 한 초기 배아의 단계에서 행한 것도 성공에 기여하였다.
종래의 방법과 본 실시예의 방법과의 기술적인 상위점은, 본 실시예의 방법에 있어서는, 자연 교배한 착상전 배아를 이용한 것, 고역가의 SIN 벡터를 이용한 것 및 0.25 M 수크로오스를 이용한 것이다.
실시예 7 트랜스제닉 코몬마모셋의 생식계열 전파
실시예 6에서 얻어진 성적으로 성숙한 트랜스제닉 코몬마모셋(#666 및 #584)을 이용하여 트랜스 유전자의 생식계열 전파의 유무를 확인하였다.
정액 샘플을 #666 개체로부터 모아, 살아 있는 정자를 TYH 배지 상에서의 swim-up법으로 모으고, RT-PCR 분석을 행하였다. 이어서, #666으로부터 모은 정액을 이용하여 이하의 방법으로 체외 수정(IVF: in vitro fertilization)을 행하고, 트랜스 유전자를 가지고 있는 생식세포의 수정능을 분석하였다.
히알루로니다아제 처리한 난모세포를 TYH 배지를 이용하여 세정하고, 70 ㎕의 액적 중에 넣었다. 각 TYH 액적은, 최대 10개의 난모세포를 포함하고 있었다. 정액 10 ㎕를 난모세포 인큐베이션 액적에 첨가하였다. 정자의 최종 농도는 5×106 정자/㎖였다. 26 내지 30 시간 동안 수정한 후, 난모세포를 수정 액적으로부터 제거하고, ISM1 배지(메디컬트; 노산(Nosan)사)로 세정하였다. 수정 배아를 48 시간 동안 ISM1 배지 중에서 배양하고, 그 후 마우스 태아 피더 세포를 포함하는 ISM2(노산) 배지에 옮겼다.
RT-PCR은 이하의 방법으로 행하였다.
Poly(A)+RNA는 Quick Prep Micro mRNA Purification Kit(GE Healthcare Biosciences)를 이용하여 조직 샘플로부터 단리하였다. RNA 샘플을 Improm-II Reverse Transcription System(Promega KK)을 이용하여 역전사하였다. 각각의 poly(A)+RNA 샘플의 절반을 역전사 효소와 반응시켜 제1쇄 cDNA를 합성하고, 나머지 절반은 역전사 효소와 반응시키지 않고 음성 대조군으로서 이용하였다. 생식계열 트랜스미션 분석을 위해, 2 내지 8개의 배아를 RT-PCR에 사용하였다. PCR은 1/10의 제1쇄 cDNA 및 Prime STAR HS PCR 효소(다카라)를 이용하여 행하였다. PCR 반응은 메이커의 프로토콜에 따라서 행하였다. EGFP 유전자 발현을 검출하기 위해서, 98 ℃ 10 초간의 변성, 60 ℃ 10 초간의 어닐링, 72 ℃ 30 초간의 신장으로 이루어진 35 사이클의 PCR을 행하였다. 이용한 프라이머는 EGFP5-4(5'-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-3')(서열번호 9) 및 EGFP3-3es(5'-GCTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3')(서열번호 10)였다. 이어서, PCR 산물의 1/12.5를 프라이머, EGFP5-6(5'-TCGAGCTGAAGGGCATCGAC-3')(서열번호 11) 및 EGFP3-1(5'-TCACGAACTCCAGCAGGACCAT-3')(서열번호 12)을 이용하여 재증폭하였다. 이 때, 98 ℃ 10 초간의 변성, 60 ℃ 10 초간의 어닐링, 72 ℃ 30 초간의 신장으로 이루어진 35 사이클의 PCR을 행하였다. β액틴 발현을 검출하기 위해서, 94 ℃ 10 초간의 변성, 60 ℃ 10 초간의 어닐링, 72 ℃ 30 초간의 신장으로 이루어진 35 사이클의 PCR을 행하였다. 프라이머는 β액틴 003(5'-TGGACTTCGAGCAGGAGAT-3')(서열번호 13), β액틴 006R(5'-CCTGCTTGCTGATCCACATG-3')(서열번호 14) 및 005R(5'-GAGCCACCAATCCACACTGA-3')(서열번호 15)을 이용하였다.
그 결과, #666의 생식세포 중에서 트랜스 유전자의 전달과 발현이 인정되었다. 도 11에, #666으로부터의 활동 중인 정자 및 IVF 배아 및 #584 및 야생형 동물로부터의 천연 배아의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 상측의 중앙은 EGFP를 이용한 RT-PCR 분석의 결과를 나타내고, 하측은 대조군으로서 발현된 β액틴 유전자를 나타낸다.
이어서, #666으로부터 모은 정액을 이용하여 체외 수정(IVF: in vitro fertilization)을 행하고, 트랜스 유전자를 가지고 있는 생식세포의 수정능을 분석하였다. 형광 현미경에 의해, 20 내지 25 ％의 IVF에 의한 배아가 EGFP를 강하게 발현하고 있는 것이 명백해졌다. 도 12에, IVF 배아의 낙사 형광 현미경법 분석에 의한 명시야 (A)와 암시야 (B)를 나타낸다. #666의 정자와 IVF 배아는 백색 화살표에 의해서 나타내고 있다. 남은 배아는 야생형이다. #666의 IVF 배아만이 EGFP를 발현하고 있었다. 도 12는, IVF 배아가 EGFP를 높게 발현하는 것을 나타낸다. 한편, 3개의 미착상된 살아 있는 천연 배아를 #584로부터 채취한 바, 이들 배아 중 하나는 EGFP를 강하게 발현하고 있었다. #666으로부터의 IVF 배아 및 #584로부터의 2개의 천연 배반포에 대해서, RT-PCR에 의해 EGFP 트랜스 유전자를 발현하고 있는 것이 확인되었다.
실시예 8 변이형 α-시누클레인(SNCA) 과잉 발현에 의한 파킨슨병 모델 코몬마모셋의 작출
인간의 가족성 파킨슨병(PARK1)에서는 α-시누클레인 유전자가 변이하고 있어, α-시누클레인 단백질은 아미노산 서열의 30번째 알라닌(A)이 프롤린(P)으로, 53번째 알라닌(A)이 트레오닌(T)으로 변이하고 있다. 코몬마모셋 α-시누클레인 유전자 상보적 DNA(cDNA)를 클로닝하고, 인간의 가족성 파킨슨병 변이형 α-시누클레인 유전자에 대응하는 변이형 α-시누클레인 유전자를 제작하고, EF1α 프로모터의 하류에 마모셋 변이형 α-시누클레인 유전자와 적색 형광 단백질 mRFP 유전자를 2A 펩티드 배열로 끼워 양유전자의 융합 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 이 때, 프로모터는 EF1α를 이용하였다. 도 13에 렌티바이러스 벡터의 구조를 나타낸다.
실시예 1 및 2에 기재된 방법으로, 난소 자극, 난소 채취를 행하고, 체외 성숙시킨 성숙 난자에 0.2 내지 0.3 M 수크로오스 용액 중에서 코몬마모셋 변이형 α-시누클레인 유전자와 적색 형광 단백질 mRFP 유전자를 2A 펩티드 배열로 끼워 양유전자의 융합 단백질을 발현하는 바이러스 벡터를 MII기의 난자에 주입하고, 그 후 인공수정(IVF)하였다. 변이형 α-시누클레인 유전자와 적색 형광 단백질 mRFP 유전자는 2A 펩티드에 의해 발현 후 분리하기 때문에, 양단백질은 1:1의 분자량으로 발현한다. MII기 난자에 유전자를 도입함으로써, 모자이크율이 낮은 트랜스제닉 동물의 작출이 가능해진다. 형광 현미경하에서 빨간 형광 단백질을 발현하고 있는 상실배아 수정란만을 대리모 코몬마모셋의 자궁 내에 이식하였다. 도 14에 체외 수정 (A) 및 발생한 상실배아(B 및 C)의 사진을 나타낸다.
그 결과, 2마리의 산자가 얻어졌다. 코몬마모셋 마이크로세틀라이트 마커를 이용한 친자 감정의 결과, 난자, 정자 제공 동물 유래의 개체인 것이 명백해졌다. 모근의 샘플을 이용하여 RT-PCR을 행한 결과, 얻어진 산자 2마리 모두가 mRFP, α-시누클레인 유전자를 모근에서 발현하고 있는 것으로 나타났다. α-시누클레인 유전자는 비유전자 도입 개체도 보유하고 있지만, 모근에서는 발현하지 않기 때문에 차이가 인정된다. 도 15에 마이크로라이트 마커에 의한 친자 감정의 결과를 나타낸다. 도면 중, 아래 2개의 샘플(I2343자1 및 I2343자2)은 태어난 새끼를 나타낸다. 도면에 도시한 바와 같이, 1CJ003-NED 마커 및 CJ091-FAM 마커의 유전자형이 샘플 IH555의 것과 일치하고, CJ081-VIC 마커가 I2991의 유전자형과 일치하고 있었다. 이 결과는, 태어난 새끼가 도너(I2991 및 IH555) 유래의 새끼인 것을 나타낸다. 도 16에 얻어진 산자의 모근 샘플의 RT-PCR의 결과를 나타낸다. 도 16의 좌측 및 중앙의 레인은 산자의 모근 샘플이고, 우측은 야생형 코몬마모셋의 샘플이다. 도 17에 얻어진 인간 파킨슨병 모델 코몬마모셋의 사진을 나타낸다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명에 의해 인간 질환 모델 동물로서 이용할 수 있는 트랜스제닉 마모셋 등의 트랜스제닉 영장류 동물의 작출을 위한 발생 공학적 기술이 제공된다. 본 발명의 기술을 이용함으로써, 영장류 동물의 초기 배아로의 효율적인 외래 유전자의 도입이 가능해지고, 트랜스제닉 영장류 동물을 효율적으로 작출할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Central Institute for Experimental Animals
<110> KEIO UNIVERSITY
<120> A method of introducing a foreign gene into an early embryo of a
primate and a method of producing a transgenic primate comprising
the method of introducing a foreign gene
<130> PH-3775-PCT
<150> JP2008-017955
<151> 2008-01-29
<160> 19
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 1
gcacaagctg gagtacaact acaacagc 28
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 2
tcacgaactc cagcaggacc at 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 3
tcctgaccct gaagtacccc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 4
gtggtggttg aagctgtagc c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 5
ctggtcgagc tggacggcga cg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 6
cacgaactcc agcaggacca tg 22
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 7
tgtaggtact aacactggct cgtgtgacaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 8
gggtgttgaa ggtctcaaac atgatctgta 30
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 9
caaggacgac ggcaactaca agacc 25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 10
gctcgtccat gccgagagtg a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 11
tcgagctgaa gggcatcgac 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 12
tcacgaactc cagcaggacc at 22
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 13
tggacttcga gcaggagat 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 14
cctgcttgct gatccacatg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 15
gagccaccaa tccacactga 20
<210> 16
<211> 1096
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (14)..(352)
<400> 16
gaattcatta gcc atg gat gta ttc atg aaa gga ctt tca aag gcc aag 49
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys
1 5 10
gag gga gtt gtg gct gct gct gag aaa acc aaa cag ggt gtg gca gaa 97
Glu Gly Val Val Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu
15 20 25
gca gca gga aag aca aaa gag ggt gtt ctc tat gta ggc tcc aaa acc 145
Ala Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr
30 35 40
aag gag gga gtg gtg cat ggt gtg gca aca gtg gct gag aag acc aaa 193
Lys Glu Gly Val Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys
45 50 55 60
gag caa gtg aca aat gtt gga gga gca gtg gtg acg ggt gtg aca gca 241
Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala
65 70 75
gta gcc cag aag aca gtg gag gga gca ggg agc att gca gca gcc act 289
Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr
80 85 90
ggc ttt gtc aaa aag gac cag ttg ggc aag gaa ggg tat caa gac tac 337
Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu Gly Lys Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr
95 100 105
gaa cct gaa gcc taa gaaatatctt tgctcccagt ttcttgagat ctgctgacag 392
Glu Pro Glu Ala
110
atgttccatc ctgtacaagt gctcagttcc aatgtgccca gtcatgacat ttctcaaagt 452
ttttacagtg tatctcgaag tcttccatca gcagtgattg aagtatctgt acctgccccc 512
actcagcatt tcggtgcttc cctttcactg aagtgaatac atggtagcag ggtctttgtg 572
tgctgtggat tttgtggctt caatctacga tgttaaaaca aattaaaaac acctaagtga 632
ctaccactta tttctaaatc ctcactattt ttttgttgct gttgttcaga agttgttagt 692
gatttgctat catatattat aagattttta ggtgtctttt aatgatactg tctaagaata 752
atgacgtatt gtgaaatttg ttaatatata taatacttaa aaatatgtga gcatgaaact 812
atgcacctat aaatactaaa tatgaaattt taccattttg cgatgtgttt tattcacttg 872
tgtttgtata taaatggtga gaattaaaat aaaacgttat ctcattgcaa aaatatttta 932
tttttatccc atctcacttt aataataaaa atcatgctta taagcaacat gaattaagaa 992
ctgacacaaa ggacaaaaat ataaagttat taatagccat ttgaagaagg aggaatttta 1052
gaagaggtag agaaaatgga acattaaccc tacactcgga attc 1096
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
100 105 110
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Pro Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
100 105 110
<210> 19
<211> 1096
<212> DNA
<213> Homosapiens
<400> 19
gaattcatta gccatggatg tattcatgaa aggactttca aaggccaagg agggagttgt 60
ggctgctgct gagaaaacca aacagggtgt ggcagaagca cccgggaaga caaaagaggg 120
tgttctctat gtaggctcca aaaccaagga gggagtggta catggtgtga caacagtggc 180
tgagaagacc aaagagcaag tgacaaatgt tggaggagca gtggtgacgg gtgtgacagc 240
agtagcccag aagacagtgg agggagcagg gagcattgca gcagccactg gctttgtcaa 300
aaaggaccag ttgggcaagg aagggtatca agactacgaa cctgaagcct aagaaatatc 360
tttgctccca gtttcttgag atctgctgac agatgttcca tcctgtacaa gtgctcagtt 420
ccaatgtgcc cagtcatgac atttctcaaa gtttttacag tgtatctcga agtcttccat 480
cagcagtgat tgaagtatct gtacctgccc ccactcagca tttcggtgct tccctttcac 540
tgaagtgaat acatggtagc agggtctttg tgtgctgtgg attttgtggc ttcaatctac 600
gatgttaaaa caaattaaaa acacctaagt gactaccact tatttctaaa tcctcactat 660
ttttttgttg ctgttgttca gaagttgtta gtgatttgct atcatatatt ataagatttt 720
taggtgtctt ttaatgatac tgtctaagaa taatgacgta ttgtgaaatt tgttaatata 780
tataatactt aaaaatatgt gagcatgaaa ctatgcacct ataaatacta aatatgaaat 840
tttaccattt tgcgatgtgt tttattcact tgtgtttgta tataaatggt gagaattaaa 900
ataaaacgtt atctcattgc aaaaatattt tatttttatc ccatctcact ttaataataa 960
aaatcatgct tataagcaac atgaattaag aactgacaca aaggacaaaa atataaagtt 1020
attaatagcc atttgaagaa ggaggaattt tagaagaggt agagaaaatg gaacattaac 1080
cctacactcg gaattc 1096
1/10
Claims (17)
- 전핵기부터 상실배기까지의 마모셋 배아를 0.2 내지 0.3 M 수크로오스 용액에 넣어 수크로오스 처리하여 위란강의 용적을 증가시키고, 상기 배아의 위란강에 프로모터에 작동 가능하게 연결한 인간 외래 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 주입하는 것을 포함하는, 마모셋 배아에 외래 유전자를 도입하는 방법.
- 제1항에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 GFP 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 수크로오스 처리에 의해 상기 배아의 위란강의 용적을 수크로오스 처리 전의 상기 배아의 위란강 용적의 1.2 내지 8배로 증대시키는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 수크로오스 처리하지 않은 상기 배아에 주입 가능한 외래 유전자의 양의 1.2 내지 8배 양의 외래 유전자를 상기 배아에 주입하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 배아당 1.3×103 내지 1.3×105 CFU의 역가로 주입하는 것인 방법.
- 제1항에 기재된 방법으로 상기 배아에 외래 유전자를 도입하고, 이 외래 유전자를 도입한 상기 배아를 대리모에게 이식하여 발생시키는 것을 포함하는, 도입 외래 유전자가 생식계열로 전파할 수 있는 트랜스제닉 마모셋을 작출하는 방법.
- 제6항에 있어서, 외래 유전자가 인간의 질환에 관여하는 유전자인, 트랜스제닉 마모셋을 작출하는 방법.
- 제7항에 있어서, 인간의 질환에 관여하는 유전자가 인간 파킨슨병의 원인 유전자인 변이형 α-시누클레인 또는 인간 헌팅턴병의 원인 유전자인 변이형 헌팅틴 유전자이고, 트랜스제닉 마모셋이 인간 파킨슨병 모델 영장류 동물 또는 인간 헌팅턴병 모델 영장류 동물인, 트랜스제닉 마모셋을 작출하는 방법.
- 제7항에 있어서, 외래 유전자가 비인간 영장류 동물에게 내재성의 인간의 질환에 관여하는 유전자의 오르소로그 유전자를 녹아웃하기 위한 것이고, 트랜스제닉 마모셋이 인간 질환 모델 녹아웃 영장류 동물인, 트랜스제닉 마모셋을 작출하는 방법.
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