JP5344732B2 - ヒトtpo受容体の膜貫通部位を有するキメラtpo受容体導入ノックイン非ヒト哺乳動物 - Google Patents
ヒトtpo受容体の膜貫通部位を有するキメラtpo受容体導入ノックイン非ヒト哺乳動物 Download PDFInfo
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Description
(1)TPO受容体の膜貫通部位が、
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、ノックイン非ヒト哺乳動物、
(2)非ヒト哺乳動物がげっ歯類であることを特徴とする(1)に記載のノックイン非ヒト哺乳動物、
(3)非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする(1)又は(2)に記載のノックイン非ヒト哺乳動物、
(4)a)TPO受容体の膜貫通部位が
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、非ヒト哺乳動物TPO受容体のゲノムDNA領域をクローニングする工程、
b)相同組換えによりES細胞に工程a)で得られた該非ヒト哺乳動物TPO受容体遺伝子を導入する工程、
c)凝集法又は注入法により、受精卵とES細胞を融合させ、キメラ胚を作出する工程、
d)偽妊娠非ヒト哺乳動物の子宮角にキメラ胚を移植してキメラ非ヒト哺乳動物を作出する工程、
e)該キメラ非ヒト哺乳動物を交配する工程を含む、
(1)〜(3)のいずれかに記載のノックイン非ヒト哺乳動物の作出方法、
(5)f)TPO受容体の膜貫通部位が
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、非ヒト哺乳動物TPO受容体のゲノムDNA領域をクローニングする工程、
g)相同組換えにより初期化した非ヒト哺乳動物の体細胞又は生殖細胞に工程f)で得られた該非ヒト哺乳動物TPO受容体遺伝子を導入する工程、
h)g)で得られた細胞核を、非ヒト哺乳動物の受精卵又は未受精卵に核移植する工程を含む、
(1)〜(3)のいずれかに記載のノックイン非ヒト哺乳動物の作出方法、
(6)(1)〜(3)記載のノックイン非ヒト哺乳動物に由来する細胞、
(7)造血幹細胞、多能性幹細胞、巨核球前駆細胞、巨核球又は血小板である、(6)記載の細胞、
(8)(1)〜(3)記載のノックイン非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法、
(9)(1)〜(3)記載のノックイン非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体が関与する疾患の治療剤のスクリーニング方法。
(10)ヒトTPO受容体が関与する疾患が抗癌剤による血小板減少性症状である(9)記載の治療剤のスクリーニング方法。
(11)(6)または(7)記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
(12)(6)または(7)記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体が関与する疾患の治療剤のスクリーニング方法。
(13) ヒトTPO受容体が関与する疾患が抗癌剤による血小板減少性症状である(12)記載の治療剤のスクリーニング方法。
に関する。
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、非ヒト哺乳動物TPO受容体を意味する。本発明のキメラTPO受容体は、非ヒト哺乳動物細胞においてヒトTPO受容体に作用する試験物質(アゴニスト又はアンタゴニスト)に対し細胞応答を示すTPO受容体であれば、膜貫通部位以外のアミノ酸配列は、上記GenBankに登録されている配列から1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入若しくは置換されたアミノ酸配列を有していてもよい。
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子で置換することにより、該キメラTPO受容体を発現させる事を可能にした、非ヒト哺乳動物を意味する。
a)TPO受容体の膜貫通部位が
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列ポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、非ヒト哺乳動物TPO受容体のゲノムDNA領域をクローニングする工程、
b)相同組換えによりES細胞に工程a)で得られた該非ヒト哺乳動物TPO受容体遺伝子を導入する工程、
c)凝集法又は注入法により、受精卵とES細胞を融合させ、キメラ胚を作出する工程、
d)偽妊娠非ヒト哺乳動物の子宮角にキメラ胚を移植してキメラ非ヒト哺乳動物を作出する工程、
e)該キメラ非ヒト哺乳動物を交配する工程を含む、
本発明のノックイン非ヒト哺乳動物の作出方法を使用することができる。
f)TPO受容体の膜貫通部位が
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、非ヒト哺乳動物TPO受容体のゲノムDNA領域をクローニングする工程、
g)相同組換えにより初期化した非ヒト哺乳動物の体細胞又は生殖細胞に工程f)で得られた該非ヒト哺乳動物TPO受容体遺伝子を導入する工程、
h)工程g)で得られた細胞核を、非ヒト哺乳動物の受精卵又は未受精卵に核移植する工程を含む、
請求項1〜3のいずれかに記載のノックイン非ヒト哺乳動物の作出方法。
BaF3細胞へのTPO受容体遺伝子導入と発現確認
ヒト及びマウスTPO受容体遺伝子は、cDNAライブラリーから既知のmRNA配列情報を基に設定したPCRプライマーを用いてPCR法によりクローニングし、動物細胞発現プラスミドの強制発現(CMV)プロモーターの下流に組み込んだ。構築した動物細胞発現プラスミドをマウス白血球由来の培養細胞であるBaF3細胞にトランスフェクションし、薬剤耐性マーカーを用いた選択により、受容体遺伝子が導入されたBaF3細胞を単離した。
TPO受容体遺伝子が導入されたBaF3細胞からRNAを抽出し、RT-PCRで導入した遺伝子のmRNA発現を確認した。
TPO受容体遺伝子を導入したBaF3細胞を用いた、TPOミメティクスのスクリーニング
ヒト型TPO受容体遺伝子を導入したBaF3細胞がTPO低分子リガンドに反応して増殖する活性を指標として、ハイスループットスクリーニングを実施し、ヒット化合物を得た。このようにして得られた化合物は国際公開第01/07423号パンフレット、国際公開第01/53267号パンフレット、国際公開第02/059099号パンフレット、国際公開第02/059100号パンフレット、国際公開第2005/014561号パンフレットに記載されている。以下の参考例、実施例においては、上記特許文献に記載された化合物を用いた。このようにして得られた化合物は、マウスのTPO受容体には反応しなかった。
CMVプロモーター下流にヒトTPO受容体遺伝子cDNAを繋いだコンストラクトを作製、マイクロインジェクション法にてトランスジェニックマウスを作製したが、Tgマウスは得られなかった。
ヒトTPOプロモーター下流にヒトTPO受容体遺伝子cDNAを繋いだコンストラクトを作製、マイクロインジェクション法にてトランスジェニックマウスを作製した。
Founderマウスから、Tgマウス3系統が樹立された。3系統共に、系統化を開始した初期の段階では、骨髄細胞におけるヒト型TPO受容体遺伝子mRNAの発現が観察されたが、継代を重ねた後では、系統1及び系統4のTgマウスにおけるヒト型TPO受容体遺伝子mRNAの発現は認められなかった。系統2においては、調べた同腹の3個体及び親の異なる6個体全てヒト型TPO受容体遺伝子mRNAの発現が認められた事から、この系統を用いて、in vitro及びin vivoの薬効試験を実施したが、参考例2で得られた化合物による血小板あるいは、巨核球の増殖促進作用は認められなかった。
ヒト・マウスキメラTPO受容体遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの作出と作出したマウスを用いた薬効試験
文献情報(Ziegler S, et al., Blood. 2002; 100(3): 1072-4.)を基に、プロモーター活性を有すると推測される、マウスTPO受容体遺伝子上流約2Kbpの領域を、マウスゲノムDNAをテンプレートとしてPCR によりクローニングした。cDNAライブラリーからPCRによりクローニングしたマウスTPO cDNA配列を基に、部位特異的突然変異導入法(Kunkel TA., Proc Natl Acad Sci U S A., 1985; 82(2):488-92.)を用いて塩基配列の置換を行い、マウスTPO受容体の膜貫通部位でヒトと異なる4つのアミノ酸をコードする塩基配列の全てを、ヒト型に置換した。哺乳動物細胞発現ベクターであるpCIベクター(プロメガ)にプロモーター領域と膜貫通部位をヒト型に置き換えたマウスTPO受容体cDNAを組み込み、大腸菌に形質転換を行った後に培養を行った。培養した大腸菌からプラスミドDNAを抽出し、Hind III及びPvu I で切り出して直鎖状にした約4.4 kbpのコンストラクトを精製後、C57BLマウス初期胚の雄性前核にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚を仮親マウスの子宮に移植し、得られた産仔の尾部組織から抽出したゲノムDNAを用いて、PCR法及びゲノミックサザンハイブリダイゼーション法により、遺伝子型を判定してTgマウスを得た。得られた17匹のfounderマウスから最終的に13系統のTgマウスラインを樹立し、薬効試験に用いた。樹立したTgマウス系統におけるTg個体は、複数コピーのヒト型TPO受容体遺伝子を保有しており、そのコピー数は確立した系統間で異なっていた(図1)。さらに、作製したTgマウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し、抽出したRNAを用いてRT-PCRによりmRNAの発現解析を行った。RT-PCRで得られた膜貫通部位を含むcDNAを、制限酵素(Esp I)で切断することにより、ヒト型、マウス型mRNAの区別が可能となるが、確立した全ての系統でヒト型のTPO受容体mRNAが発現している事を確認した(図2)。
参考例5で作製したトランスジェニックマウスにおいて、in vivoでの薬効評価が困難であった事を受けて、相同組換えの技術により、マウスゲノム上でTPO受容体遺伝子をコードしている核酸配列のうち、膜貫通部分に相当する配列のみををヒト型の遺伝子に置き換えたノックインマウスを作製し、薬効試験を行った。ノックインマウスの作製方法については、成書(八木健 編 「ジーンターゲティングの最新技術」(株)羊土社、2000年4月15日、p.14−114)や総説等で広く紹介されており、本マウスについてもこれらの公知の技術を用いて作製された。
NCBIやEBI等の公的なデータベースから入手可能なマウスゲノム配列のデータから、マウスTPO受容体遺伝子周辺の配列データを入手して、ターゲティングベクターの設計を行った。公的なデータベースから得た情報を元に、マウスTPO受容体遺伝子の膜貫通部位であると予想される領域がExon10に含まれる事を確認した(GenBank Accession Number; Z22657)。
参考例5で作製したトランスジェニックマウスの作製に使用した、DNAコンストラクトにおいては、すでにExon10に含まれるマウスTPO受容体遺伝子の膜貫通部位においてヒト型の遺伝子配列と異なる4つのアミノ酸配列をコードする核酸配列が、ヒト型に置換されているので、このコンストラクトから、Exon10を含む領域を切り出し、組換え体ES細胞の選択に利用するLoxP配列で挟んだNEO耐性遺伝子の配列を挿入すると共に、その両端に相同組換えに用いる、マウスゲノム配列と相同な左右のアーム部分をマウスゲノム配列からPCRによりクローニングし、結合した。さらに、ターゲティングベクターが染色体上にランダムに挿入された場合には、得られた組換えES細胞が死滅する様に、チロシンキナーゼ遺伝子の配列を、右側アーム部分の末端に付加し、ターゲティングベクターを構築した(図5)。構築したターゲティングベクター配列を、制限酵素サイトを利用したライゲーションにより、pBluescript SK+ ベクターに組み込み、ターゲティングベクターコンストラクトプラスミドを作製した(図6)。
作製したプラスミドを大腸菌に形質転換し、培養した後にプラスミドを抽出し、制限酵素(Not I)で切断した直鎖状のターゲティングベクターを精製し、ES細胞へのエレクトロポレーションに用いた。
C57BLマウス由来のES細胞にエレクトロポレーションでターゲティングベクターを導入し、ネオマイシンを添加したES細胞用培地で培養を行う事により、得られた273クローンを単離し、さらに培養を行いコロニーを得た。コロニーの一部からゲノミックDNAを抽出し、PCR及びサザンハイブリダイゼーションにより、目的とするTPO受容体遺伝子領域において正しく相同組換えが起こっていると考えられるクローンを選択した。その結果、28クローンについて相同遺伝子組換えが認められた。相同遺伝子組換えを確認した8クローンについて、膜貫通部位のヒト型配列挿入領域をPCRにより増幅し、シークエンスを行った結果、全てのクローンでヒト型の配列が確認された。この中から1クローンを選んでエレクトロポレーションによるCreベクターの導入を行い、ランダムにピックアップした118クローンについて、Neo耐性遺伝子削除領域でのPCRによる解析を行い、79クローンのNeo耐性遺伝子が削除されたクローンを単離した。この中から6クローン、対照としてNeo耐性遺伝子が削除されていない3クローンを選び、サザンハイブリダイゼーションによる解析並びに、ランダムインテグレーションの有無を確認する解析を行った。その結果、Creベクターの導入によりNeo耐性遺伝子領域が削除され、Creベクターによるランダムインテグレーションが起きていない4クローンが単離された。
Neo耐性遺伝子領域が削除され、Creベクターによるランダムインテグレーションが起きていない4クローンのES細胞から1クローンを選択し、ICRマウス8細胞期胚648個とES細胞を凝集させてキメラ胚を作製した。翌日に、発育状況が良好な胚を32匹の偽妊娠マウスの子宮角上部へ移植した。胚を移植した偽妊娠マウス22匹から46匹の産仔を得て、眼色から30匹のマウスがES細胞由来の体細胞を有するキメラマウスであることが判明した。その後これらのマウスを4週齡まで飼育し、体毛の毛色から、ES細胞由来の体細胞を有する割合がほぼ100%であると推定されるキメラ雄マウス6匹を得た。
作製したキメラ雄マウス6匹をそれぞれC57BL/6雌マウスと交配して産仔を得た。産仔の遺伝子型判定をPCR及びサザンハイブリダイゼーションで行ったところ、ほぼ半数がヒト型TPO受容体を片側のアリルに持つ、ヘテロマウスであることが確認された。また、6匹のキメラマウス全てについてヘテロマウスが得られた事から、ES細胞由来遺伝子のgermline transmissionが確認できた。
キメラ雄マウスとC57BL/6雌マウスと交配で得られたヘテロマウスの雌雄を交配し、産仔を得た。得られた産仔の遺伝子型は、野生型マウス:ヘテロマウス:ホモマウスの割合がほぼ1:2:1の割合で得られ、遺伝学的に予想される割合と一致した。得られたホモマウスは見かけ上は野生型マウスとの違いは観察できず、健康状態も良好であった。また、ホモマウス同士の交配により、ホモマウスの産仔が得られることから、生殖機能に関してもホモマウスには異常が無いことが確認された。
マウスTPO受容体の膜貫通部位をヒト型に置換したノックインヘテロマウス(以下、h−TPO KIヘテロマウスと略す)大腿骨より骨髄細胞を採取し、赤血球を除去後、ナイロンメッシュを通過させ、BIT9500培地(StemCell Technologies社製)に2.2x105cells/mlになるよう調整した。このh−TPO KIヘテロマウスの骨髄細胞から巨核球を分化させるために、MegaCultTM-C(StemCell Technologies社製)を用いて1ウェル当り50000cellsとなるように細胞を調製し、更に被検化合物を添加して8日間培養した。形成されたマウス巨核球のコロニーはMegaCultTM-Cに添付の説明書に準じて脱水、固定(冷アセトン、10分)した後、巨核球の持つアセチルコリンエステラーゼ活性を測定する為の染色を行い、マウス巨核球コロニーを検出した。顕微鏡下でアセチルコリンエステラーゼ活性を有する巨核球細胞3個以上からなるコロニー数をカウントした。陽性対照としてマウス及びヒトのTPOを用い、マウスTPO受容体とは反応しないが、ヒトTPO受容体とのみ反応するヒトTPO(hTPO)様活性を有する化合物A(参考例2で得られた化合物)を被検化合物として用いた。
野生型マウス骨髄から採取した細胞を用いた場合には、化合物Aによる巨核球への分化誘導はほとんど起こらず、コロニーは形成されなかったが、hTPO KIヘテロマウスの骨髄細胞は化合物Aにより、巨核球への分化が誘導され、化合物Aを0.2μM培地に添加することにより、ほぼhTPOと同数の巨核球コロニーが形成された(図7)。この結果より、h−TPO KIヘテロマウスはマウスTPO受容体とは反応せず、ヒトTPO受容体にのみ反応する、hTPO様活性を有する低分子リガンドの薬効評価に非常に有用なモデルとなる事が証明された。
実施例2に示した様に、h−TPO KIヘテロマウスがin vitroでの薬効評価試験に有用である事が確認されたので、化合物B(参考例2で得られた化合物)を用いたin vivoでの薬効試験を行った。
11週齡のh−TPO KIヘテロ雌マウスを試験に用い、対照群としては9週齡の野生型雄マウスを用いた。化合物の投与を行う前に、採血に伴う血小板数の変動の有無を、2週間の観察期間中、1週間に1回の採血を行い、末梢血中の血小板数を測定して調べた。採血は尾静脈から行い、採取した約50μlの血液を10mM EDTA-PBSにて5倍希釈し、Sysmex K-4500にて血小板数を測定した。化合物Bの投与量は25mg/kg に設定し、朝と夕方に1日2回(休日は1回)経口投与投与した。化合物Bの投与は2週間の連続投与とし、投与開始後3日目、1週間後、2週間後、3週間後に採血を行い、末梢血中の血小板数を測定した。
化合物Bの投与前2週間の観察期間において、マウスの末梢血小板数はほぼ一定の値を示した事から、1週間に1回の採血は血小板数にほとんど影響しない事が確認できた。一方、化合物Bの投与を行った場合には、投与開始後3日目でh−TPO KIヘテロマウスの血小板数は、Vhicle投与群及び野生型マウスへの化合物B投与群と比較して、約1.5倍に上昇し、投与開始1週間後には対照群の3.3倍、2週間後には6.6倍にまで上昇した。2週間の連続投与を終了した1週間後には、化合物Bを投与したh−TPO KIヘテロマウスの血小板数が対照群と比較して約2.6倍にまで低下して来る事から、化合物B投与による血小板数の上昇が可逆的である事が確認された(図8)。
以上の結果から、h−TPO KIマウスは、片側のアリルのみがヒト型のTPO受容体に置換されているヘテロマウスであっても、ヒト型のTPO受容体にしか作用しないTPOの低分子リガンドに良く応答し、末梢血中の血小板数の顕著な上昇を示す事が確認された。したがって、h−TPO KIマウスはヒト型のTPO受容体にしか作用しないTPOの低分子リガンドの薬効を評価するための動物モデルとして、極めて有用である事が示唆された。なお、本ノックインマウスのホモ接合型個体では、ヘテロ接合型個体と比較して、さらに低用量のTPO低分子リガンドに反応し、薬効評価を行える事が示唆されている。
実施例3に示した様に、h−TPO KIヘテロマウスがin vitroでの薬効評価試験に有用である事が確認されたので、化合物C(参考例2で得られた化合物)を用いたin vivoでの抗癌剤投与薬効試験を行った。
12週齡のh−TPO KIホモ雌マウスを試験に用いた。抗癌剤はパラプラチン注射液(カルボプラチン注射液、CBDCA ブリストル・マイヤーズ株式会社)を用いた。採血は眼窩静脈から行い、採取した約50μlの血液を10mM EDTA-PBSにて5倍希釈し、Sysmex K-4500にて血小板数を測定した。試験開始日にパラプラチン注射液114 mg/kgを尾静脈から投与した。パラプラチン注射液投与4時間後にVhicle(0.5%メチルセルロース水溶液)ならびに化合物Cを1日1回、14日間連日経口投与した。投与開始日、投与開始後4日目、7日目、11日目、14日目に採血を行い、末梢血中の血小板数を測定した。
パラプラチン注射液投与後のビークル投与群の血小板は投与4日目から減少し始め、投与11日目に投与前の8.7%まで減少し、その後回復傾向を示した。このことから、パラプラチン注射液を投与したh−TPO KIマウスは、ヒトにおける抗癌剤による血小板減少性症状を反映したモデルであることが確認された。
このマウスに化合物Cを投与した群では、化合物投与群の血小板数は,投与7日目に最低値を示したが、その後速やかに回復し、14日間投与によって投与前の52%まで回復した。ビークル群の血小板増加率が最低値を示した投与11日目では、血小板数、血小板増加率、いずれの平均値においても、化合物C投与群が有意に高値を示していた(図9)。
以上の結果から、このモデルは血小板減少性症状モデルとして有意義な病態モデルであり、こうした病態における血小板減少症治療薬の薬効評価を可能とするスクリーニング方法を提供する手段としても、極めて有用である事が示された。
Claims (12)
- a)TPO受容体の膜貫通部位が
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、マウスTPO受容体のゲノムDNA領域をクローニングする工程、
b)相同組換えによりES細胞に工程a)で得られた該マウスTPO受容体遺伝子を導入する工程、
c)凝集法又は注入法により、受精卵とES細胞を融合させ、キメラ胚を作出する工程、
d)偽妊娠マウスの子宮角にキメラ胚を移植してキメラマウスを作出する工程、
e)該キメラマウスを交配する工程を含む、
工程によって得られたヒトTPO受容体に作用する試験物質に対し細胞応答を示すノックインマウス。 - f)TPO受容体の膜貫通部位が
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、マウスTPO受容体のゲノムDNA領域をクローニングする工程、
g)相同組換えにより初期化したマウスの体細胞又は生殖細胞に工程f)で得られた該マウスTPO受容体遺伝子を導入する工程、
h)g)で得られた細胞核を、マウスの受精卵又は未受精卵に核移植する工程を含む、
工程によって得られたヒトTPO受容体に作用する試験物質に対し細胞応答を示すノックインマウス。 - a)TPO受容体の膜貫通部位のみが
(I)配列番号:1記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
(II)配列番号:1記載のアミノ酸配列において、8番目のヒスチジン以外の1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに置換されている請求項1または2記載のノックインマウス。 - TPO受容体の片側のアリルのみが置換されている請求項1〜3のいずれか一項に記載のノックインマウス。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のノックインマウスに由来する細胞。
- 造血幹細胞、多能性幹細胞、巨核球前駆細胞、巨核球又は血小板である、請求項5記載の細胞。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のノックインマウスを用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のノックインマウスを用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体が関与する疾患の治療剤のスクリーニング方法。
- ヒトTPO受容体が関与する疾患が抗癌剤による血小板減少性症状である請求項8記載の治療剤のスクリーニング方法。
- 請求項5または6記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体に対する試験物質の薬理効果の評価方法。
- 請求項5または6記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒトTPO受容体が関与する疾患の治療剤のスクリーニング方法。
- ヒトTPO受容体が関与する疾患が抗癌剤による血小板減少性症状である請求項11記載の治療剤のスクリーニング方法。
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