JP2002238562A - 遺伝子組換えウサギ及び体細胞核移植を用いた当該遺伝子組換えウサギの作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 体細胞核移植技術により遺伝子組換えウサギ
を作製する方法を提供する。 【解決手段】 遺伝子組換えウサギを得るために、体細
胞核移植技術によって作出したウサギ体細胞核移植胚
を、自然に受精した卵子と同様な性状を保持するによう
に、発生能に関わる因子を補足することにより得られる
再構築胚を使用することを特徴とする。当該再構築胚を
仮腹ウサギに移植することにより、遺伝子相同組換え等
の高度な遺伝子操作が行われた遺伝子組換えウサギの作
出が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、体細胞核移植法
を用いた遺伝子導入ウサギの作製に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、医薬品等の有用タンパク質生産の
方法として、遺伝子組換え動物の応用が進められてい
る。遺伝子組換え動物とは、遺伝子組換え技術を用いて
その動物本来の遺伝子情報とは異なる遺伝情報を導入さ
れた動物であり、その導入遺伝子およびそれによって発
現する形質が子孫に受け継がれるように人工的に創出さ
れた動物である。遺伝子組換え動物の作出は、1980年に
Gordonらが発生工学という手法を用いてマウスではじめ
てその成功を報告し(1)、その後、他の動物でも相次い
で成功が報告された(2)。現在、遺伝子組換え動物作出
の方法として、前核内注入法、胚性幹細胞（Embryonic
Stem cell：ＥＳ細胞）を用いる方法、体細胞核移植を
用いる方法の大きく分けて３つの方法が開発されてい
る。

【０００３】上記の方法を説明する前に、まず、いずれ
の方法にしても、動物個体の発生のメカニズムに従っ
て、遺伝子操作、胚操作が実施されているため、哺乳動
物の一般的な胚発生について述べる。簡単な胚発生の進
行を図１に示す。動物個体の発生は、成熟した未受精卵
子と精子が受精することによって開始される。つまり受
精によって胚発生を開始、新生児出生として発生を完結
させる“発生能”を獲得することになる。未受精卵子は
卵巣卵胞内で成熟し、第二減数分裂中期で停止した状態
で排卵される。受精は卵管の膨大部で通常行われる。受
精した卵子は精子由来の雄性前核（核相＝１ｎ）、及び
卵子由来の雌性前核（核相＝１ｎ）を形成し、やがて２
つの前核が融合し核相２ｎの正常二倍体となる。その
後、卵割と呼ばれる分裂を繰り返し、２細胞期、４細胞
期、８細胞期へ進む。一般に８細胞期以降からコンパク
ションと呼ばれる、割球が密に結合し割球の境界がわか
りにくい形態を示す桑実胚期（８−128細胞期）を経
て、胚盤胞へ成長する。胚盤胞は胚胞と呼ばれる腔を持
った形態を示し、栄養外胚葉と呼ばれる将来胎盤形成に
あずかる外側の一層の細胞と、将来、胎児を形成する内
部細胞塊と呼ばれる内側の細胞よりなる。胚盤胞期まで
発生した胚はその後、だんだん体積を増大させ、卵子は
透明帯と呼ばれる膜に包まれているが、この膜を破って
透明帯の外に脱出する。この透明帯を破った胚は、脱出
胚盤胞と呼ばれる。この脱出胚盤胞は、子宮まで卵管よ
り移動しており、子宮壁に“着床”する。この着床した
胚は胎盤を形成し、“受胎”が成立する。この受胎した
胚は、分化・増殖を続け、様々な組織・器官を形成（器
官形成期）し、出生に至る。

【０００４】このように動物個体は、精子と卵子が受精
してできた一個の細胞から分裂を繰り返し、それぞれの
細胞が予め決められたプログラムに従って、分化成熟
し、各組織へと発達しながら一個体として形成される。
従って、動物の遺伝形質を変え、さらに子孫への伝達を
可能にするためには、受精前もしくは受精直後の細胞に
対して遺伝子操作する必要がある。

【０００５】遺伝子組換え動物作出法の概略は図２に示
す通りである。まず遺伝子操作をinvitroまたは胚に直
接操作を加え遺伝子組換え卵子（胚）を得る。この遺伝
子操作を加えた胚を用意した仮腹となる雌動物（レシピ
エント）に胚移植を実施する。レシピエントより出生し
た新生児もしくは、その子供より遺伝子組換え動物が得
られる。以下、これまでに確立された遺伝子組換え動物
の作出方法について、概略（図３参照）、長所及び短所
について詳述する。

【０００６】まず、前核内注入法であるが、この方法
は、直接、受精卵の前核内に外来遺伝子を注入する方法
である。導入する遺伝子は目的遺伝子を発現させるため
に必要なプロモーター等をすべて備えた遺伝子として導
入され、プロモーターの選択によって目的臓器での外来
遺伝子の発現調節が可能である。有用タンパク質産生遺
伝子組換え動物も、この手法にならって作製され、目的
タンパク質を乳汁中、尿中に産生させることができる。
この方法の長所は操作が簡便であり、１〜10％というあ
る程度、安定した確率で遺伝子組換え動物を得られるこ
とにある。一方、短所としては、前核内に注入した外来
遺伝子の染色体へのランダムな挿入に依存した方法であ
るため、外来遺伝子の導入コピー数、導入部位を制御で
きず、得られた遺伝子組換え動物の外来遺伝子の発現は
様々である。従って、この方法では、遺伝子相同組換え
のような高度な動物ゲノムの遺伝子操作を行うことはで
きない。

【０００７】ここで、高度な遺伝子操作とは、例えば、
ゲノム上の目的遺伝子を相同組換え技術を用いて変異
または欠損させ、形質発現を抑制・欠損させるノックア
ウト型（機能喪失型）、目的遺伝子の、特にプロモー
ター下流に外来遺伝子を挿入し、目的遺伝子の特異性に
従って外来遺伝子を発現させるノックイン型、宿主の
目的遺伝子を異なる形質を示す他の遺伝子と交換するジ
ーン・リプレイスメント型、または特定部位を狙わず
に、あるリポーター遺伝子をプロモーターなしの状態で
染色体にランダムに導入し、ゲノム上の適当な遺伝子内
（またはプロモーターのすぐ後）に組み込まれた細胞の
みを選択する遺伝子トラッピング型などがある。

【０００８】次に胚性幹細胞（Embryonic Stem cell：
ＥＳ細胞）を用いる方法を説明する。ＥＳ細胞は胚盤胞
期の内部細胞塊から分離された細胞で(3,4)、その特徴
としては、全ての個体を構成する細胞に分化可能な全能
性の細胞であること、正常２倍体細胞であること、増殖
性が高いことがある。ＥＳ細胞を用いる方法の長所は増
殖性が高いため、in vitroで動物ゲノムに対して遺伝子
相同組換え等の高度な遺伝子操作が行えることにある。
一方、短所はマウス以外の動物では遺伝子組換え動物作
出可能なＥＳ細胞が確立されていないことにある。

【０００９】次に、体細胞核移植法は近年開発された技
術で、未受精卵子の核を体細胞の核に置換し、受精を経
ずに人為的に受精の刺激を模倣する処理を与え、発生を
開始させ産仔を得る方法である。本方法で得られた産仔
の核は、核を提供した細胞と同一であるため、得られた
産仔は体細胞クローンと呼ばれる。本方法の長所は、Ｅ
Ｓ細胞と同様に増殖性の高い体細胞であれば、動物ゲノ
ムに対して遺伝子相同組換え等を実施した遺伝子組換え
動物が作製できること、また得られる産仔はすべて用い
た体細胞のクローンであり、導入した外来遺伝子も胚や
動物を操作する以前に遺伝子組換え体細胞で解析し、発
現等の予測が可能であることである。一方、短所として
は、技術自体が完成されたものでなく、産仔数が少な
く、また全ての動物種において実施可能でないことであ
る。本方法については、本願発明の本質に関わるもので
あるため、その詳細を後述する。

【００１０】体細胞核移植は1997年にクローン羊“ドリ
ー”の誕生の報告が最初の成功例である(5)。本成功の
報告により、初めて分化をとげた体細胞よりクローン動
物が作製できることが明らかになり、また動物ゲノムの
遺伝子操作が可能な細胞がＥＳ細胞以外に見出されたと
いう意味でも画期的であった。本技術は、受精卵由来の
細胞（割球）での核移植技術を発展させたものであるの
でそれらを合わせて、説明する。体細胞核移植の概略を
図４に示す。核移植のポイントは「ドナー核を未受精卵
子の核と同様な未分化の状態に戻すこと（“初期化”と
呼ばれている）」、及び「受精によって獲得する“発生
能”を、精子を介さずに人工的に与えること（“活性
化”と呼ばれている）」が重要である。特にクローン羊
“ドリー”の誕生までは、受精卵胚由来の細胞と比較し
て、体細胞は分化が進んでおり、“初期化”することは
不可能であると考えられていた。クローン羊“ドリー”
を誕生させたWilmutらは成功の鍵として体細胞核のドナ
ーとして用いられる体細胞の細胞周期をレシピエントの
未受精卵子の細胞周期と同調させることで、“初期化”
が体細胞においても同様に行われたと述べている。ヒツ
ジを含め、ウシ、ヤギ、マウス、ブタ等でもこの方法で
体細胞クローンの成功を収めている(6-9)。特記すべき
点は、体細胞核移植技術の開発によって、これまでマウ
ス以外で作製不可能であった遺伝子相同組換え等の高度
な遺伝子組換え動物の作出が可能になったことにある。

【００１１】表１にこれまで説明してきた遺伝子組換え
動物作製法別の作製実績と可能な遺伝子操作について示
す。

【表１】

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】前述の如く、高度な遺
伝子操作が行われた遺伝子組換え動物を作製するために
は、体細胞核移植の技術は必須な技術となる。ところ
で、ウサギは中型の動物で、飼育管理が容易であり、ま
た妊娠期間が１ヶ月と短く、多産性であることから、有
用タンパク質生産のための遺伝子組換え動物としてひろ
く利用されている。ウサギにおける核移植研究は、1988
年にSticeらが受精卵由来の細胞でクローンウサギの誕
生を報告し(10)、その後、幾つかの研究室が報告してい
る(11,12)。しかし体細胞クローン研究については、in
vitroでの発生についての報告はあるものの(13)、in vi
voでの発生、体細胞クローン産仔の誕生の報告はない。
ウサギの体細胞核移植技術が完成されるか、またはそれ
に代わる方法が確立されないかぎりウサギにおける高度
な遺伝子操作が行われた遺伝子組換えウサギの作出は不
可能である。

【００１３】ウサギの体細胞核移植が成功しない原因と
しては、種差による卵子の性状の違い、及び最適な核移
植条件の違いなどが第一に考えられる。また、体細胞ク
ローン作出に成功した動物種においても、発生学的な観
点からも、妊娠後期の流産が高発する、過大児として出
生する傾向があるなど、手法自体が成熟したものではな
い(14)。マウス、ブタでの最初の体細胞クローンにおい
ては、“初期化”のプロセスに更に工夫を加えることに
よって成功したという事実もあり(15,16)、ウサギにお
いても今後の体細胞核移植技術の進歩を待つしか解決の
方法はないと考えられた。次に考えられる原因として
は、種差による着床、妊娠の違いがある。ウサギが最も
他の哺乳動物と異なる点として、“産後発情”があるこ
と、何らかの原因で妊娠が自然消滅することがあるこ
と、また、死んだ胎児を流産する多くの哺乳動物と異な
り、ウサギは胎児と胎盤を子宮の壁をとおして“再吸
収”することが挙げられる(17)。

【００１４】これらの事実から、ウサギは多産性の動物
であるものの、同時に環境の変化など様々な要因で胚の
発生が消滅しやすい動物であることが言える。実際、Ma
urerは、２−４細胞期胚を72および96時間培養後、移植
を行った結果、生存胎児こそ得られているものの、生存
率は低く、ウサギ胚は体外で培養しただけで、移植後の
受胎率が極めて低いことを示している(18)。またMoore
らは、ウサギ胚は他の哺乳動物種胚とは異なって、透明
帯をもたない胚は、移植しても産仔に発生しないことを
示している(19)。従って、多くの作製行程を必要とする
体細胞核移植によって再構築された胚は、スタートとな
る体細胞の性状、上述の核移植の行程などを経るうち
に、自然に受精した卵子（受精卵）と比較して明らかに
着床、妊娠の行程で消滅しやすい胚であると考えられ
る。このようにウサギは他の動物と比較して仔ウサギを
得にくい動物と考えられる。遺伝子組換え操作を実施し
た体細胞を用いる場合は、更に仔ウサギが得られる効率
は減少するものと考えられる。以上述べてきたように、
高度な遺伝子操作が行われた遺伝子組換えウサギを得る
ためには、現在の体細胞核移植の技術では遂行すること
ができず、新たな技術開発が切望される。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本願発明者等は、鋭意検
討の結果、体細胞核移植技術によって作出したウサギ体
細胞核移植胚が受精卵と同様な性状を保持する系を開発
することによって、高度な遺伝子操作が行われた遺伝子
組換えウサギを作出する系を完成するに至った。

【００１６】本願発明は、ウサギの選択、ドナー核提供
細胞の選別及び遺伝子導入、卵子の採取、体細胞核移植
による体細胞核移植胚の作製、卵子・体細胞核移植胚の
培養系、並びに体細胞核移植胚が受精卵と同様な性状を
保持する系、得られる再構築胚の仮腹ウサギへの移植、
並びに当該仮腹ウサギからの産仔さらにその子孫の産生
を主たる技術的要件とし、以下、発明を完成させるため
のそれぞれの要件を概説する。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明に使用されるウサギはニュ
ージーランド・ホワイト、ダッチ、日本白色種等のカイ
ウサギ種であれば、これらの単種でも、異品種間の交配
ウサギであってもいずれでも構わない。ただし、染色体
数は２ｎ＝４４であることが要件となる。

【００１８】体細胞核移植のドナー核を提供する体細胞
は、ウサギ由来の正常２倍体細胞であることが必要であ
る。体細胞の種類は正常２倍体細胞であれば特に限定さ
れない。しかし遺伝子組換え細胞を得るには、遺伝子組
換え等の操作が必要で、細胞を長期に渡って、生体より
分離後、in vitroで培養する必要があるため、その期間
中に細胞が損傷を受け、正常２倍体細胞の要件を逸脱す
る可能性がある。従って、本発明においては、ウサギ胎
児由来の線維芽細胞もしくは腎細胞、またはウサギ由来
の顆粒層細胞等の増殖速度が早く、増殖性の高い細胞が
好ましい。所望とする形質を有する遺伝子組換えウサギ
を作製するために、体細胞の核に対して外来遺伝子を導
入する等の遺伝子操作を行う。外来遺伝子を導入する方
法としては、エレクトロポレーションやリポフェクショ
ン等を分離した細胞に対して行うなど、一般的な遺伝子
導入方法が適用可能である。

【００１９】本発明に用いるウサギ未受精卵子及び受精
卵子は、ホルモン投与による過排卵処理によって得る。
未受精卵子については排卵処理のためのホルモン投与よ
り、１２時間目から１６時間目までに採卵し、１３時間
目から２６時間目の間に体細胞核移植の操作を終了す
る。受精卵子は、本発明の要件として、１細胞期から胚
盤胞期の卵子を用いる必要がある。未受精卵子はアクチ
ンのネットワーク（“細胞骨格”と呼ぶ）によって形態
を保っている。除核は卵子に微小なピペットを用いて未
受精卵子の核と共に周りの細胞質を吸い込み、ちぎり取
るような操作によって実施するが、そのままでは細胞骨
格を無理矢理壊してしまうため、卵子が崩壊してしま
う。従って除核のポイントは、あらかじめ未受精卵子の
細胞骨格がない状態にすることにある。細胞骨格を消失
させることで、卵子は柔らかい餅のような状態になり、
ピペットによって卵子を崩壊させることなく容易に核を
含んだ細胞質をちぎり取ることが可能となる。この細胞
骨格の消失は、サイトカラシンを用いることで実施でき
る。

【００２０】本発明の要件の１つである体細胞核移植胚
は、Sticeらが実施したドナー核として未受精卵由来細
胞による核移植法に準じて作製される。Sticeらの方法
では、ドナー核提供細胞と、除核未受精卵子の細胞融合
によってドナー核の移植が行われているが、ドナー核を
直接除核未受精卵子に移植する方法など、本発明におい
ては未受精卵子の核とドナー核が置換されることが重要
であり、いずれの方法でも構わない。

【００２１】ドナー核提供細胞と除核未受精卵子を融合
させることで核移植を実施する場合、市販の装置を用い
た電気融合法により融合させることができる。

【００２２】卵子の“活性化”刺激は電気的方法、薬剤
処理法が一般に用いられているが、本発明では特に方法
に規定はない。但し、活性化のタイミングは、排卵処理
後、18時間から26時間目に実施する。

【００２３】ウサギの受精卵子、体細胞核移植胚は適当
な血清を添加した培養液で胚盤胞期まで培養することが
可能である。本発明においては、CELGROSSER-H（住友製
薬）を用いることが好ましく、また添加する血清は、ロ
ットによる差を回避するため、Gibco BRL 社のKNOCKOUT
Serum Replacementを用いる。

【００２４】本発明の重要な要件は、体細胞核移植技術
により作出したウサギ体細胞核移植胚を、自然に受精し
た卵子と同様な性状を保持することであることである。
つまり本発明は、発生を完結するために必要で、ウサギ
体細胞核移植胚に不足している“因子”を補足するシス
テムに関するものである。ここで述べた“因子”とは、
成熟した未受精卵子が受精することによって獲得する
“発生能”に関わる因子のことである。この因子を補足
する方法は、以下の方法で実施可能である（図５）。

【００２５】１つ目の方法は、受精卵と体細胞核移植胚
の各割球（細胞）同士を混ぜ合わせキメラ胚を構築する
方法である（図５上）。この場合、受精卵由来細胞と体
細胞核移植胚由来細胞の間の相互作用によって受精卵の
もつ“発生能”に関する因子が補足される。キメラ胚の
作製方法は、両胚同士を混ぜ合わせる集合キメラ法と、
どちらかの胚にバラバラにされた他方の細胞を注入する
注入キメラ法がある。またドナー胚−注入細胞の組み合
わせは、受精卵子、体細胞核移植胚のどちらの組み合わ
せでも構わない。２つ目の方法は、体細胞核移植胚の核
を除核した受精卵子内に注入する方法、つまり受精卵の
核を体細胞核移植胚の核に置換する方法である（図５
中）。本方法では、直接、体細胞核移植胚由来の核に受
精卵子の細胞質が作用することになる。３つ目の方法は
受精卵子の細胞質もしくは精製された因子を体細胞核移
植胚に注入または培養液に添加し作用させる方法である
（図５下）。この３つのいずれかの方法により、体細胞
核移植技術により作出したウサギ体細胞核移植胚に、自
然に受精した卵子と同様な性状を保持させたウサギ再構
築胚の作製が可能となる。

【００２６】実際に、本願発明者らは、受精卵と体細胞
核移植胚の割球をキメラ化し、得られたキメラ胚を仮腹
ウサギに移植、その胎児を解析した結果、体細胞に導入
した外来遺伝子を胎児及び胎盤から検出し、本発明を完
成するに至った。これらの方法はいずれの方法もウサギ
胚においては技術的な見地より困難であり、予見し実
施、証明することは難しい。また本発明者らの発明の完
成によって、ウサギ体細胞核移植胚のin vivoでの分化
・増殖能が初めて明らかにされた。

【００２７】本発明は、遺伝子相同組換え等の高度な遺
伝子操作が行われた遺伝子組換えウサギの作製方法であ
る。遺伝子組換え動物を用いた医薬品等の生産システム
を完成させるためには、安定した確率、しかもある程度
以上の高率なシステムで、つまり最低１％以上の効率で
直接又は間接的に外来遺伝子の形質を持つ遺伝子組換え
動物を作出することが要件となる。本発明のキメラ胚由
来胎児の解析結果によれば、体細胞核移植胚数に対して
2.6％という高率で、胎児より導入遺伝子が検出され
た。また本発明の完成によって初めて、遺伝子組換えウ
サギ体細胞核移植由来の細胞のin vivoでの分化・増殖
が証明された。かくして本発明により、実際に高度な遺
伝子組換えウサギの作出が可能となった。

【００２８】以下、実施例にそって本発明をさらに詳細
に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定する
ものではない。

【００２９】

【実施例】実施例の概略を図６に示す。 《実施例１：ＧＦＰ遺伝子導入をした核移植ドナー細胞
の調製》核移植ドナー細胞はウサギの胎児線維芽細胞を
用いた。この線維芽細胞にＣＡＧプロモーター(20)調節
下のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）遺伝子(21)
とＰＧＫプロモーター(22)調節下のピューロマイシン耐
性遺伝子(23)を繋いだコンストラクト（図７）をELECTR
O CELL MANIPULATOR 600(BTX)を用いてエレクトロポレ
ーションにより導入した。遺伝子導入後、72時間目より
培地にピューロマイシンを１μg/mlになるように添加
し、遺伝子導入細胞を選別した。選別された細胞は、正
常の線維芽細胞と同様な形態を維持し、かつＧＦＰ蛋白
質の蛍光が認められた（図８）。

【００３０】《実施例２：未受精卵の採卵》未受精卵は
日本白色種メスウサギにＦＳＨを0.5Ｕ/bodyで皮下に12
時間間隔で５回投与し、最終ＦＳＨ投与12時間後にｈＣ
Ｇを100Ｕ/bodyで静脈内投与することで過排卵させた。
ｈＣＧ投与後１５−１６時間目に麻酔下、温めた0.3％
ウシ血清を含むＰＢＳ（ＰＢＳ/0.3％ＦＢＳ）を卵管よ
り潅流し成熟未受精卵を採卵した。採卵後、ヒアルロニ
ダーゼ処理及びピペッティングにより卵丘細胞を卵子よ
り除去した。卵子は体細胞核移植の操作中は、Ｍ２液内
で保持した。

【００３１】《実施例３：除核》未受精卵子をサイトカ
ラシンＤが最終濃度５μg/ml入ったＭ２液に15分さらし
た後、マイクロマニュピレーター下で、直径30μｍの尖
ったピペットで透明帯を破り、極体と未受精卵子核（メ
タフェースプレート）を周りの細胞質と共に除去した。
除核は、吸引した細胞質をアクリジンオレンジ(５μg/m
l)にて染色し、除核の確認を行った。

【００３２】《実施例４：ドナー細胞の注入》ドナー細
胞は、ＧＦＰ遺伝子を導入したウサギ胎児由来線維芽細
胞と、コントロールとして非遺伝子導入の細胞を用い
た。ドナー細胞は数世代培養後、血清飢餓（0.5％ＦＢ
Ｓ in D-MEM）または、コンフルエントの状態で長期培
養にてＧ１／Ｇ０期に同調した（約90％）。0.1％トリ
プシン液にて細胞を剥がし、マイクロマニュピレーター
下で、除核未受精卵の囲卵腔内にドナー細胞を注入し
た。

【００３３】《実施例５：除核未受精卵とドナー細胞の
融合及び活性化》除核未受精卵とドナー細胞の融合は、
電気的誘導によって行った。0.3Mマンニトール, 0.1mM
塩化カルシウム, 0.1mM塩化マグネシウム(融合培地溶
液：ＦＭ溶液)中で１mm間隔の白金線の張ったチャンバ
ーを用いて実施した。電気刺激はｈＣＧ投与後22時間目
に、マイクロマニュピレーター下、室温で、300V(3kV/c
m)、100μsのパルスを１回(ELECTRO CELL MANIPULATOL2
00,BTX)与えることによって行った。融合効率は約70％
であった。活性化は融合後、実体顕微鏡下、３０分目に
ＦＭ溶液中で、100V(１kV/cm)、100μsのパルスを連続
して３回与えることによって行った。

【００３４】《実施例６：体細胞核移植胚の培養》得ら
れた体細胞核移植胚は、次の操作まで５％ＫＳＲ（KNOC
KOUT Serum Replacement, Gibco BRL）を添加したCELGR
OSSER-H（住友製薬）（ＣＧ溶液）中で、38.5℃、５％
炭酸ガス培養器内で培養した。

【００３５】《実施例７：受精卵の採卵》受精卵は日本
白色種メスウサギにＦＳＨを0.5Ｕ/bodyで皮下に12時間
間隔で５回投与し、最終ＦＳＨ投与12時間後にｈＣＧを
30Ｕ/bodyで静脈内投与し、オスウサギと交配させた。
交配24時間目に麻酔下、温めた0.3％ウシ血清を含むＰ
ＢＳ（ＰＢＳ/0.3％ＦＢＳ）を卵管より潅流し受精卵を
採卵した。採卵した受精卵は操作まで、ＣＧ溶液中で培
養した。

【００３６】《実施例８：体細胞核移植胚と受精卵によ
るキメラ胚の作製》活性化後、約3.5日培養した体細胞
核移植胚（桑実胚期）の透明帯を、マイクロマニュピレ
ーター下、マイクロナイフでカットし、ピペッティング
により割球を分離した。４細胞期又は８細胞期に達した
受精卵の囲卵腔内に、サイトカラシンＤ ５μg/ml, コ
ルセミド 0.1μg/ml に15分さらした割球を、マイクロ
マニュピレーター下で１から５個、30〜40μmの先の尖
ったピペットで注入することでキメラ胚を作製した。

【００３７】《実施例９：キメラ胚の偽妊娠雌ウサギへ
の移植》実施例８で作製したキメラ胚を、偽妊娠雌ウサ
ギ（日本白色種）に移植した。偽妊娠の誘導は受精卵を
採取するため交配させた同時期に、該当メスウサギにｈ
ＣＧを30Ｕ/body 投与することによって行った。移植は
卵管内に約５〜20個ずつ胚を注入した。

【００３８】《実施例１０：胎児の採取およびＰＣＲサ
ンプルの調製》胎生15日目に、子宮より胎児を採材し
た。その際に正常に発育中の胚と発育が遅れているもし
くは退後している胚に分けて採材した。正常発育胚は、
更に胎盤と胎児に分けた。材料は、生理食塩液１mlを加
え、POLYTRON(KINEMATICA AG LITTAU)によりホモジネー
トにした。このホモジネート 100μlよりWizard Genomi
c DNA Purification kit (Promega)によりＤＮＡを抽出
した。抽出したＤＮＡは100μlの蒸留水に溶解した。

【００３９】《実施例１１：ＰＣＲ解析》ＤＮＡサンプ
ル１μlより、体細胞核移植胚のドナー細胞に起因する
ＧＦＰ遺伝子の検出をＰＣＲにより行った。アンチセン
スプライマーとして5'-TTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAG-3'、
センスプライマーとして5'-TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGT-
3'の配列をもつオリゴＤＮＡを用いた。ＰＣＲは３０μ
lスケール下、まず、95℃で９分、続いて、94℃で60
秒、55℃で60秒、及び72℃で60秒を35サイクル行い、最
後に72℃で５分の条件で実施し、ＰＣＲ反応産物の10μ
lを電気泳動した。

【００４０】《実施例１２：ウサギ体細胞核移植胚のin
vitroにおける発育成績》表２に体細胞核移植胚のin v
itroでの胚盤胞期までの発育成績を示す。培養細胞をド
ナー細胞として用いた場合、ＧＦＰ遺伝子導入細胞をド
ナー細胞として用いた場合、どちらも胚の卵割は80％程
度であった。胚盤胞胚への発生率は20％程度であった。
図９及び１０にそれぞれ胚盤胞胚の写真を示す。ＧＦＰ
遺伝子導入細胞をドナー細胞として、体細胞核移植を行
った胚は、すべての細胞でＧＦＰの蛍光が認められた。

【００４１】

【表２】

【００４２】《実施例１４：キメラ胚）図１１にキメラ
胚の写真を示す。体細胞核移植胚由来細胞を注入した受
精卵はキメラを形成し、in vitroの培養では殆どの操作
胚が胚盤胞胚まで発育した。体細胞核移植胚由来細胞の
胚での分布は様々であった。

【００４３】《実施例１５：ウサギ体細胞核移植胚−ウ
サギ受精卵キメラ胚の移植成績》表３に出産結果を示
す。７個の核移植桑実胚より２６個のキメラ胚を作製
し、２匹の仮腹メスウサギに移植した結果、２匹のウサ
ギが受胎し、２匹の胚操作由来の仔ウサギが得られた。

【００４４】

【表３】

【００４５】《実施例１６：ウサギ体細胞核移植胚−ウ
サギ受精卵キメラ胚の胎生１５日目における体細胞核移
植胚由来遺伝子のＰＣＲ解析成績》表４に解析結果を示
す。３９個の核移植桑実胚より２３６個のキメラ胚を作
製し、１１匹の仮腹メスウサギに移植した結果、６匹の
ウサギが受胎し、２７個の正常発育胚、１６個の退後胚
が得られた。これらをＰＣＲ解析（図１２）した結果、
１羽の胎児、２個の胎盤中にＧＦＰ遺伝子陽性のシグナ
ルが認められた。また２個の退後胚中にもＧＦＰ遺伝子
陽性のシグナルが認められた。

【００４６】

【表４】

【００４７】

【発明の効果】本発明により、体細胞核移植技術を用い
た高度な遺伝子操作が行われた遺伝子組換えウサギの作
出が可能となった。本方法を用いて作出される遺伝子組
換えウサギより医薬品等の有用物質を生産することが可
能となる。

【００４８】〔参考文献〕 1) Gordon, J. et al.: Genetic transformation of mo
use embryos by microinjection of purified DNA., Pr
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tyltransferase (PAC) as a new reporter gene in tra
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9(12):3465.

【図面の簡単な説明】

【図１】 哺乳類の発生を示す。

【図２】 遺伝子組換え動物作出方法の概略を示す。

【図３】 従来の遺伝子組換え動物の作出方法を示す。

【図４】 体細胞核移植の概略を示す。

【図５】 体細胞核移植技術により作出したウサギ再構
築胚を、自然に受精した卵子と同様な性状を保持するシ
ステムの概要を模式図として示す。

【図６】 ウサギ体細胞核移植胚−ウサギ受精卵キメラ
胚の作製方法及び遺伝子改変動物作出方法の概略図を示
す。

【図７】 遺伝子組換えウサギ体細胞作製に用いた導入
遺伝子（コンストラクト）を示す。図中、略語は以下の
とおりである。ＣＡＧｐ：ＣＡＧプロモーター、ＰＧＫ
ｐ：ホスホグリセレートリナーゼ−１（phosphoglycera
te linase-1）プロモーター、ｐａｃ：ピューロマイシ
ン遺伝子、ＧＦＰ gene：ＧＦＰ遺伝子、ｐ(Ａ)：ポリ
Ａシグナル。

【図８】 ＧＦＰ遺伝子を導入したウサギ胎児由来繊維
芽細胞（ａ：明視野像、ｂ：ＧＦＰ蛍光観察像）を示す
写真。

【図９】 未遺伝子導入のウサギ胎児由来体細胞をドナ
ー細胞として用いて核移植を行うことによって得られた
体細胞核移植胚の活性化処理後１４４時間目の胚（脱出
胚盤胞）を示す写真。

【図１０】 ＧＦＰ遺伝子導入のウサギ胎児由来体細胞
をドナー細胞として用いて核移植を行うことによって得
られた体細胞核移植胚の活性化処理後１４４時間目の胚
（脱出胚盤胞）を示す写真（ａ：明視野観察像、ｂ：Ｇ
ＦＰ蛍光観察像、Ｃ：Hoehst33342による核染色像）。

【図１１】 キメラ胚作製のin vitro観察像（ａ：キメ
ラ胚作製に用いた４−８細胞期の受精卵、ｂ：キメラ胚
作製に用いた体細胞核移植胚（桑実胚期、ＧＦＰ蛍光観
察）、ｃ：キメラ胚作製当日のキメラ胚像（ＧＦＰ蛍光
観察）、ｄ：キメラ胚作製後、３日目のキメラ胚像（明
視野観察）、ｅ：キメラ胚作製後、３日目のキメラ胚像
（ＧＦＰ蛍光観察））を示す写真。

【図１２】 ウサギ体細胞核移植胚-ウサギ受精卵キメ
ラ胚の胎生１５日目における体細胞核移植胚由来遺伝子
のＰＣＲ解析像を示す写真。 NTCK1_1, NTCK1_2,KTC21_2：実験Ｎｏ．（移植メスの区
分）を示す。 ＭＷ：分子量マーカー Nega.：ネガティブコントロール Posi．：ポジティブコントロール（２列目以降１０コピ
ーのｃＤＮＡ） En：胎児のサンプルＮｏ．（ｎは胎盤の番号と一致す
る） Pn：胎盤のサンプルＮｏ． Tn：退後胚のサンプルＮｏ． ・：ＰＣＲ陽性サンプル 矢印：ＰＣＲ産物電気泳動位置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高橋 清也 茨城県つくば市並木２−10−１ 202棟306 号 (72)発明者 渡部 聡 茨城県つくば市並木２−８ 122棟105号 (72)発明者 松田 純一 熊本県熊本市龍田弓削１−31−２ (72)発明者 上仲 一義 熊本県菊池郡西合志町須屋字みずき台3649 ガーデンコートみずき台Ｇ棟202号 (72)発明者 前田 浩明 熊本県熊本市壺川１−１−12 栄久ハイツ (72)発明者 野崎 周英 熊本県熊本市武蔵ヶ丘５−26−１ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA04 FA10 GA14 GA18 HA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC10 BA03 CA24 CA44

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウサギ由来未受精卵子の核が、当該未受
   精卵子とは異なる遺伝情報を有するウサギ由来体細胞の
   核（ドナー核）で置換されたウサギ由来体細胞核移植
   胚。
2. 【請求項２】 当該体細胞がウサギ由来の正常２倍体細
   胞である請求項１記載の体細胞核移植胚。
3. 【請求項３】 当該正常２倍体細胞がウサギ胎児由来の
   線維芽細胞もしくは腎細胞、またはウサギ由来の顆粒層
   細胞から選ばれる請求項２に記載の体細胞核移植胚。
4. 【請求項４】 当該ドナー核が、所望の形質を発現させ
   るよう遺伝子操作が行われることを特徴とする請求項１
   から３のいずれかに記載の体細胞核移植胚。
5. 【請求項５】 請求項１から４に記載の体細胞核移植胚
   にウサギ自然受精卵子由来の発生に関わる因子が補足さ
   れることにより構築されるウサギ由来再構築胚。
6. 【請求項６】 当該因子を補足するために、 ａ）受精卵子と体細胞核移植胚の割球細胞同士を混合、 ｂ）受精卵子の核を体細胞核移植胚の核で置換、または ｃ）受精卵子の細胞質もしくは精製された当該因子を体
   細胞核移植胚に注入または培養液に添加のいずれかが行
   われる請求項５記載の再構築胚。
7. 【請求項７】 請求項５または６に記載の再構築胚が移
   植された仮腹ウサギ。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の仮腹ウサギから産出さ
   れる産仔、またはその子孫であり、前記ドナー核の遺伝
   情報を有することを特徴とする遺伝子組換えウサギ。
9. 【請求項９】 体細胞核移植技術を用いた遺伝子組換え
   ウサギ作製方法において、 ａ）ウサギ由来未受精卵子の核を、当該未受精卵子とは
   異なる遺伝情報を有するウサギ由来体細胞の核（ドナー
   核）で置換することによりウサギ由来体細胞核移植胚を
   得る工程、及び ｂ）ａ）の体細胞核移植胚を仮腹ウサギに移植し、産仔
   またはその子孫を得る工程、からなる遺伝子組換えウサ
   ギの作製方法。
10. 【請求項１０】 前記体細胞核移植胚に、ウサギ受精卵
    子由来の発生に関わる因子を補足することによりウサギ
    再構築胚を構築し、当該再構築胚を仮腹ウサギに移植す
    るすることを特徴とする請求項９に記載の作製方法。
11. 【請求項１１】 受精卵子由来の発生に関わる因子を補
    足するために、 ａ）受精卵子と体細胞核移植胚の割球細胞同士を混合し
    キメラ胚を再構築する方法、 ｂ）受精卵子の核を体細胞核移植胚の核で置換する方
    法、または ｃ）受精卵子の細胞質もしくは精製された当該因子を体
    細胞核移植胚に注入または培養液に添加し作用させる方
    法のいずれかの方法が行われる請求項１０記載の作製方
    法。
12. 【請求項１２】 当該キメラ胚を作製するために、 ａ）受精卵子及び体細胞核移植胚を混合させる集合キメ
    ラ法、または ｂ）受精卵子または体細胞核移植胚のいずれかの胚に、
    バラバラにされた他方の細胞を注入する注入キメラ法の
    いずれかが行われる請求項１１記載の作製方法。
13. 【請求項１３】 前記体細胞がウサギ由来の正常２倍体
    細胞である請求項９に記載の作製方法。
14. 【請求項１４】 当該正常２倍体細胞がウサギ胎児由来
    の線維芽細胞もしくは腎細胞、またはウサギ由来の顆粒
    層細胞から選ばれる請求項１３に記載の作製方法。
15. 【請求項１５】 前記ドナー核が、所望の形質を発現さ
    せるよう遺伝子操作が行われることを特徴とする請求項
    ９から１４のいずれかに記載の作製方法。
16. 【請求項１６】 前記受精卵子が１細胞期から胎盤胞期
    の卵子である請求項１０から１２のいずれかに記載の作
    製方法。