JP4494340B2 - グルタミン酸トランスポーターｇｌａｓｔ機能欠損マウス - Google Patents

Description

本発明は、グルタミン酸トランスポーターの一種であるＧＬＡＳＴの機能が欠損しているＧＬＡＳＴノックアウトマウス及びその作製方法に関する。また、本発明は、該ノックアウトマウスの、正常眼圧緑内障モデルマウスとしての使用、及び該ノックアウトマウスを用いた、正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法にも関する。

正常眼圧緑内障は、緑内障のなかの一つのタイプに属するが、その有病率の高さから、最近特に注目されている疾患である。一般に縁内障とは、眼圧（眼球内の水圧）が高くなるために視神経が圧迫されて萎縮し、そのために視機能が障害を受け、視野が狭くなる疾患であり、そのまま放置しておくと、最終的には失明にいたる危険性が高い。他方、正常眼圧緑内障は、眼圧が正常範囲（ヒトでは通常１０〜２１ｍｍＨｇ）にあるにもかかわらず、眼圧が高い緑内障と同様の所見（視神経の萎縮及び視野欠損）を呈する病態である。緑内障は、先進諸国では、糖尿病に次いで失明原因の第２位にランクされており、日本人では４０歳以上の人の約３．５％に当たる約２００万人が罹患しているが、近年の疫学調査では、その７割が正常眼圧緑内障であると報告されている。正常眼圧緑内障は、ゆっくりと進行して自覚症状も少ないため、早期発見も難しく、また現在のところ、更に眼圧を下げること以外、決め手となる治療法がない。
近年、軽度かつ慢性的なグルタミン酸濃度の上昇によって誘発される網膜神経節細胞の変性脱落、すなわち神経細胞死が、緑内障や糖尿病性網膜症の原因の一つとして提唱されている（（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，４６６３−４６６６，１９９８；Ｈａｒａｄａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２９２，１３４−１３６，２０００）。
哺乳類の中枢神経系において、グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物質の１つであり、脳の高次機能に重要な役割を果たしているが、その反面、グルタミン酸の過剰な上昇が神経毒性を示し、各種の神経変性疾患や脳虚血後の遅延性神経細胞死を招くことが知られている。このグルタミン酸濃度を調節する機構の一つがグルタミン酸トランスポーターである。グルタミン酸トランスポーターは、神経終末から一旦放出されたグルタミン酸を細胞内に取り込み、シナプス間隙のグルタミン酸濃度を低く保つことを主要な役割とする機能分子である。
現在、哺乳動物の脳内のグルタミン酸トランスポーターとしては、神経細胞に存在する型のＥＡＡＣ１，ＥＡＡＴ４及びＥＡＡＴ５（Ｋａｎａｉ，Ｙ．＆ Ｈｅｉｄｉｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，４６７−４７１，１９９２；Ｆａｉｒｍａｎ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７５，５９９−６０３，１９９５；Ａｒｒｉｚａｌ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４，４１５５−４１６０，１９９７、並にグリア細胞に存在する型のＧＬＴ１及びＧＬＡＳＴ（別名ＧｌｕＴ−１）が知られており（Ｐｉｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，４６４−４６７，１９９２；Ｍｕｋａｉｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２４４，２３３−２３７，１９９５；Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１６，１４９−１５３，１９９３；Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１５９，１８３−１８６，１９９３；Ｓｔｏｒｃｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１０９５５−１０９５９，１９９２）、これらのグルタミン酸トランスポーターの機能異常と各種の神経細胞変性疾患との関連が知られている。
この様な状況の中で、ＧＬＡＳＴノックアウトマウス（Ｗａｔａｓｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０，９７６−９８８，１９９８；特開平１０−３３０８７号）を用いた実験から、ＧＬＡＳＴが、網膜内のミューラー細胞に存在すること、そしてＧＬＡＳＴノックアウトマウスでは野生型と比較して、虚血負荷後の網膜損傷が著しく増悪することが明らかとなり、このことから、網膜のミューラー細胞に存在するＧＬＡＳＴが緑内障の発症に関与していることが示唆されている（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，４６６３−４６６６，１９９８））。しかし、このＧＬＡＳＴノックアウトマウスでは、虚血負荷をかけない限り、網膜組織の損傷は観察されておらず、これを正常眼圧緑内障のモデルに用いることはできない。
既に、緑内障の治療薬の開発やその発症機序の解明のために、緑内障モデル動物として、遺伝的慢性緑内障モデルマウスや水負荷による高眼圧緑内障モデルウサギなどが存在するが、正常眼圧緑内障のモデル動物は、これまで全く知られていない。また、正常眼圧緑内障とＧＬＡＳＴとの関係を指摘している報告はなく、正常眼圧緑内障の発症機序は依然として不明である。
従って、正常眼圧緑内障モデル動物が得られれば、該疾患の治療に有効な治療薬の開発のために、その治療方法の確立のために、そしてまた該疾患の原因や発症機序の解明のために、極めて有益であると期待される。しかしながら、現在、正常眼圧緑内障モデル動物は知られておらず、従って、医学分野または医薬分野において、このようなモデル動物が切望されていた。

本発明者は、従来から存在するグルタミン酸トランスポーター遺伝子ＧＬＡＳＴの機能が欠損した通常のノックアウトマウス（ＧＬＡＳＴノックアウトマウス）を改良した結果、眼圧が正常範囲内にあるにもかかわらず、網膜神経節細胞が変性脱落し、その数が著しく減少した改良型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスを得ることができた。そして、このノックアウトマウスは、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして有用であることが判明した。
従って、本発明は、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させた、正常眼圧緑内障のモデルとしてのＧＬＡＳＴノックアウトマウス、特には、１）その眼圧が正常範囲にあり、かつ２）その網膜神経節の細胞数が、野生型マウスに比べて減少している、ＧＬＡＳＴノックアウトマウスを提供する。
本発明では、該ＧＬＡＳＴノックアウトマウスの眼圧は、通常２１ｍｍＨｇ以下、例えば１０〜２１ｍｍＨｇである。また、該ＧＬＡＳＴノックアウトマウスの網膜神経節の細胞数は、野生型マウスに比べて少なくとも２０％減少している。
本発明では、好ましくは、該ＧＬＡＳＴノックアウトマウスの遺伝的背景は、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの遺伝的背景と同一又は実質的に同一である。
具体的には、本発明は、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子領域内に、例えばその第６エキソンに、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されているＧＬＡＳＴノックアウトマウスを提供する。
本発明はまた、この様なＧＬＡＳＴノックアウトマウスの、正常眼圧緑内障のモデルマウスとしての使用をも提供する。
別の態様として、本発明は、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させたＧＬＡＳＴノックアウトマウスの作製方法を提供する。この作製方法は、下記１〜６の過程を含んで成る：
１）相同染色体上の１つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させた任意のマウスのＥＳ細胞を得ること、
２）過程１で得られたＥＳ細胞を用いて、該細胞を含んで成るキメラマウスを得ること、
３）過程２で得られたキメラマウスを正常Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、
４）過程３で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウスを正常Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、
５）過程４に記載した交配を、少なくとも合計５回繰り返して、その遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６系マウスに近づけたヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、及び
６）過程５で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス同志を交配して、ホモ接合型又はヘテロ接合型のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを得ること。
本発明の作製方法では、過程５において、過程４に記載した交配を少なくとも合計９回繰り返すことが好ましい。
本発明の作製方法により作製されたＧＬＡＳＴノックアウトマウスもまた、本発明に含まれ、しかも、この様にして作製されたＧＬＡＳＴノックアウトマウスもまた、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして使用することができる。
更に別の態様として、本発明は、上記の本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウス、又は上記の本発明の作製方法により作製されたのＧＬＡＳＴノックアウトマウスを、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして用いる使用方法を提供する。
従って、本発明は、この様なＧＬＡＳＴノックアウトマウスを用いた、正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法を提供する。特には、このスクリーニング方法は、
１）本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスに試験化合物を投与すること、
２）野生型マウスに試験化合物を投与すること、
３）上記の各マウスにおいて、投与前、及び投与してから一定期間後に、生存する視神経細胞の数量又機能を評価すること、及び
４）ノックアウトマウスと野生型マウスの検査結果を比較して、試験化合物の有効性を評価すること
を含んで成る。
本発明のスクリーニング方法では、生存する視神経細胞数又は視神経細胞機能を評価するために、網膜神経節の神経細胞数の計数に加え、網膜電位や視覚誘発電位の測定（Ｐｏｒｃｉａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．３９，３０７１−３０８１，１９９９）、Ｖｉｓｕａｌ Ｃｌｉｆｆテストなどの行動学的解析（Ｍａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３６，６２３−６３４，２００２）を併用して評価することが好ましい。

図１は、マウスＧＬＡＳＴ遺伝子のゲノム構造の概略（制限酵素部位及びエキソン部分）を示す。図中、各記号が示す制限部位に関与する制限酵素は以下の通りである。Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｂ：ＢａｍＨＩ。また、黒ボックスはエキソン（Ｅｘｏｎ）１〜１０番を示す。
図２は、実施例１において、マウスＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させるために破壊しようとする標的遺伝子領域（上段）、使用したターゲティングベクター（中断）、及び破壊されたＧＬＡＳＴ遺伝子（下段）の構造を示す。図中、各記号が示す制限部位に関与する制限酵素は以下の通りである。Ｐ：ＰｖｕＩＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｘ：ＸｈｏＩ。また、黒ボックスによりエキソン６〜８番（Ｅ６〜８）を示す。ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を、ＤＴ−ＡはジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を示す。
図３は、ホモ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス（ＧＬＡＳＴ−／−）及び野生型正常マウス（ＧＬＡＳＴ＋／＋）の網膜の病理切片像を示す。
図４は、出生後、指示した週齢における、ホモ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス（ＧＬＸＳＴ−／−）、ヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス（ＧＬＡＳＴ＋／−）、及び野生型正常マウス（ＧＬＡＳＴ＋／＋）の網膜神経節の細胞数を示す。これらの細胞数は、網膜神経節の病理切片内の神経細胞数を、ヘマトキシリン／エオシン染色後に計数した。縦軸は、３〜２２枚の切片から得られた切片１枚あたりの平均細胞数を表す。横軸は、各マウスの出生後の週齢を表す。
図５は、ホモ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス（ＧＬＡＳＴ−／−）及び野生型正常マウス（ＧＬＡＳＴ＋／＋）の網膜神経節における、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄの逆行性ラベリングにより標識された神経細胞を示す蛍光像を示す。

本発明において、マウスのグルタミン酸トランスポーターＧＬＡＳＴ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ／Ａｓｐａｒａｔａｔｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）とは、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ鎖によってコードされ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のことである（Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１５９，１８０３−１８６，１９９３））。この蛋白質は、ラットではＧｌｕＴ−１とも呼ばれており（Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１６，１４９−１５３，１９９３；Ｓｔｏｒｃｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１０９５５−１０９５９，１９９２）、両者はいわゆるカウンターパートである。
マウスＧＬＡＳＴの遺伝子（ゲノム）構造は既に解明されており、その詳細はＨａｇｉｗａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３，５０８−５１５，１９９６に記載されている。この遺伝子構造の概略を表１及び図１に示す。
ただし、マウスの系統によっては、マウスＧＬＡＳＴは、上記のコード核酸配列及びアミノ酸配列、更にはそのゲノム配列が、その機能が維持される範囲内で変異していること、例えば塩基やアミノ酸残基の置換、欠失、付加、又は挿入を受けていることもあり、本発明では、その様な変異体、例えば上記のコード核酸配列において、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入している変異体、あるいは上記アミノ酸配列において、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入している変異体なども、マウスＧＬＡＳＴに含む。

表１は、ＧＬＡＳＴ遺伝子のエキソンとイントロンの接合部位の配列を示す。エキソンの核酸配列は大文字で、イントロンの核酸配列は小文字で示している。
本発明において、グルタミン酸トランスポーターＧＬＡＳＴ遺伝子の機能の欠損とは、相同染色体上の１又は２つのＧＬＡＳＴ遺伝子座に存在する１又は２つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子領域において、その構造をコードする領域中、例えばエキソン中に、変異を導入することにより、あるいはＧＬＡＳＴ遺伝子の発現に関与する領域中、例えば、プロモーター領域やイントロン領域中に、変異を導入することにより、機能的なＧＬＡＳＴが発現しないようにすること、あるいはＧＬＡＳＴ遺伝子の発現が恒常的に抑制されていることを意味している。いずれの場合にしろ、内在性の１又は２つのＧＬＡＳＴ遺伝子が生体内で実質的に機能していない状態を指す。従って、本発明において、ＧＬＡＳＴノックアウトマウスは、２つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能が欠損しているホモ接合型及び１つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能が欠損しているヘテロ接合型を包含するが、該遺伝子の機能欠損の効果の点からホモ接合型マウスが好ましい。
この様な遺伝子の機能の欠損を、公知のノックアウトマウスの作製方法、例えばジーンターゲッティング法により達成することができる。また、上記の変異の導入は、ＧＬＡＳＴ遺伝子領域内の塩基の置換、塩基の欠損、又はその領域内への塩基の挿入であってもよい。
本発明において、「遺伝的背景が同一又は実質的に同一」とは、比較するマウス間において、注目する遺伝子型（ＧＬＡＳＴ遺伝子型）以外の全ての遺伝子型が９９％以上同一であることを意味する。具体的には、実施例において、Ｆ１のＧＬＡＳＴヘテロ接合型ノックアウトマウスを９世代以上正常Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと戻し交配し、１２９系統由来の遺伝子が全遺伝子の１％以下になったことを意味する。
１．本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウス
本発明は、相同染色体上の１又は２つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能が欠損した、正常眼圧緑内障モデルマウスとしてのＧＬＡＳＴノックアウトマウスを提供し、具体的には、１）その眼圧が正常範囲にあり、かつ２）その網膜神経節の細胞数が、野生型正常マウスに比べて減少している、ＧＬＡＳＴノックアウトマウスを提供する。特には、その遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６系マウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと同一又は実質的に同一であるものが好ましい。
野生型正常マウスの眼圧は、通常、１０〜２１ｍｍＨｇであるが、本発明のノックアウトマウスでもまた、その眼圧は正常範囲内にある。ただし、個体により、上記範囲を逸脱することもあるが、高眼圧といわれる範囲、例えば３０ｍｍＨｇ以上にまで達するものではない。マウスの眼圧は、例えば電子眼圧計を用いて、測定することができる。
また、本発明のノックアウトマウスでは、その網膜神経節の神経細胞数が、正常マウスに比べて、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％ほど減少している。網膜神経節の神経細胞数の減少は、慣用的な組織化学的な手法により、例えば切片を用いたヘマトキシリン／エオシン染色により、顕微鏡下に測定することができる。
更に、本発明のノックアウトマウスでは、野生型正常マウスに比べて、光刺激による網膜の電位変化の一種であるｂ波の低下も認められている。ｂ波はＧＬＡＳＴが存在するミューラー細胞を含む網膜内層の活動電位を反映するものであり、ＧＬＡＳＴによるグルタミン酸濃度調節機構が、視覚伝達においても重要な役割を持つことを示唆する（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，４６６３−４６６６，１９９８）。
この網膜神経節の神経細胞数の減少は、神経変性又は神経細胞死ととらえることができる。一般に、正常眼圧緑内障を含む緑内障では、視神経乳頭部の萎縮や網膜神経繊維の欠損が認められており、現在では眼圧依存性にせよ非依存性にせよ緑内障の最終病像は、網膜神経節細胞死であると考えられている。
従って、本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスは、その眼の性状、すなわち眼圧が正常範囲にあること、及び網膜神経節の細胞数が減少していることを考慮すると、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして使用することができる。
２．本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスの作製
第２の態様として、本発明は、本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスの作製方法を提供する。この方法は、下記過程１〜６を含んで成る：
１）相同染色体上の１つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させた任意のマウスＥＳ細胞を得ること、
２）過程１で得られたＥＳ細胞を用いて、該細胞を含んで成るキメラマウスを得ること、
３）過程２で得られたキメラマウスを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、
４）過程３で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して、次世代のヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、
５）過程４に記載した交配を、少なくとも合計５回繰り返して、その遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６系マウスに近づけたヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、及び
６）過程５で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス同志を交配して、ホモ接合型又はヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスを得ること。
上記過程５において、交配を少なくとも合計９回繰り返すことが好ましい。
正常眼圧緑内障モデルとして使用することができる本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを作製するために、基本的には、公知のノックアウトマウス作製方法、例えばジーンターゲティング法やジーントラップ法を用いることができる。基本的なノックアウトマウスの作製方法は、ＧＬＡＳＴ遺伝子の破壊を達成することができ、生存・繁殖の能力を消失していないマウスが得られるものである限り、特に制限はない。ノックアウトマウスの作製方法に関しては、例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）や八木健編集、『実験医学別冊ザ・プロトコールシリーズ ジーンターゲティングの最新技術』（２０００年、羊土社発行）を参照することができ、適宜、この発明の実施に応用することができる。
従って、まず、慣用的な方法により、例えばジーンターゲティング法に従って、上記過程１〜４を行うことができる。これらの過程は、本発明者らの研究グループによる特開平１０−３３０８７及びＷａｔａｓｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０，９７６−９８８，１９９８にも開示されている。
従来、上記過程４で得られたヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスの雌雄を交配して得られたホモ接合型又はヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスが既に開示されているが、このタイプのＧＬＡＳＴノックアウトマウスでは、野生型正常マウスと比べて、網膜神経節の細胞数に実質的な変化は認められなかった。ただし、該ＧＬＡＳＴノックアウトの眼に対して生理食塩水を１５０ｃｍ Ｈ_２Ｏの圧力で６０分間注入することより、網膜を一過的な虚血状態にした後にのみ、網膜神経節の細胞数の減少が観察されていた（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，４６６３−４６６６，１９９８）。
この様なことから、この様な従来のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを、正常眼圧緑内障のモデルとして用いることはできない。
本発明の作製方法に従って、この様な従来のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを更に改良することにより、先に示した正常眼圧緑内障たる本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを作製することができる。
以下に、標準的なノックアウトマウス作製方法であるジーンターゲティング法を例として、本発明のノックアウトマウスの作製方法を説明する。
過程１
（１）ターゲティングベクターの作製。
ジーンターゲティング法では、マウスＥＳ細胞内の染色体上のＧＬＡＳＴ遺伝子座を破壊するために、ターゲティングベクターを用いて、該遺伝子座に変異を導入する。
ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させるためには、ＧＬＡＳＴ遺伝子のいずれかの部分に、例えば１又は複数のエキソン部分に、塩基の欠失を生じさせ、点変異を導入し、又は他の遺伝子を挿入することができる。通常、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子が破壊されたＥＳ細胞をより容易に選択するために、選択マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。
そのような遺伝子として、ポジティブ選別に用いるマーカー遺伝子、例えばネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子を用いうる。このネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることにより目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的遺伝子を選別除去するためにネガティブ選別に用いるマーカー遺伝子を用いることもできる。このような遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（選別剤としてガンシクロビル、ＦＩＡＵ等を用い、それに対する感受性により非相同組換え体を選別除去する）、ジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子（ＤＴ−Ａにより発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体を選別除去する）が用いられる。あるいは、ポジティブ／ネガティブ選別を行うために、これらの組み合わせを用いることもできる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子及びジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（Ｙａｇｉ，Ｎａｄａ，Ｗａｔａｎａｂｅｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１４，７７−８６，１９９３）、あるいはネオマイシン耐性遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｔｈｏｍａｓ，Ｃａｐａｃｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３３６，３４８−３５２，１９８８）を挿入することが好ましい。
該遺伝子配列中、変異を導入する部分、例えば上記マーカー遺伝子を挿入する部分は、該遺伝子の機能が欠損する部位であれば特に限定されないが、通常エキソン部分である。
ＧＬＡＳＴ遺伝子のゲノム構造（制限酵素地図及び各エキソン−イントロン連結点）が既に知られており（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３，５０８−５１５，１９９６）、その構造の概略を図１及び表１に示す。マウスＧＬＡＳＴ遺伝子は１０個のエキソンを含み、いずれかのエキソンに、該遺伝子の欠損が生じるようにマーカー遺伝子を挿入することが好ましい。
上記の通りに該遺伝子の機能を破壊するために、標的遺伝子との相同組換が可能であり、その結果、標的遺伝子に変異を導入することができるターゲティングベクター（相同組換え用ＤＮＡ）を、ＧＬＡＳＴをコードする核酸配列（配列番号１）及びＧＬＡＳＴ遺伝子のゲノム配列の情報（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３，５０８−５１５，１９９６）を基にして、常用のＤＮＡ組換え技術、例えばＰＣＲ法や部位特異的変異導入法により、作製することができる。
例えば、該遺伝子の全部又はその断片を含むＤＮＡ分子を、使用するＥＳ細胞の基となった系統のマウスから慣用的な方法によって単離する。該ＤＮＡ分子は、ＧＬＡＳＴ遺伝子の全長、若しくは全長とともに該遺伝子の５′上流域及び／又は３′下流域をさらに含むＤＮＡ分子であってもよい。
次に、得られたＤＮＡ分子から、該遺伝子中、変異を導入する部位に相当する部分に、所望の変異を導入した、例えば、上記のマーカー遺伝子を導入した改変ＤＮＡ分子を調製する。塩基配列の改変は、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ分子の連結や、部位特異的変異など慣用の組換えＤＮＡ技術によればよい。このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。
（２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入、及び内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子との相同組換。
こうして得られたターゲティングベクターを、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、ＥＳ細胞中のＧＬＡＳＴ遺伝子との間で相同組換えを行わせる。ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション法やリポフェクション法等の、慣用のＤＮＡ導入法により行うことができる。ターゲティングベクターが導入された細胞内では、その染色体上のＧＬＡＳＴ遺伝子とターゲティングベクター上の対応部分との間で相同組換えが生じ、その内在性遺伝子内に、ターゲティングベクター中の改変された塩基配列、例えばマーカー遺伝子が挿入される。その結果、ＥＳ細胞は内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損し、例えば同時にマーカー遺伝子を含むことになる。ターゲティングベクター導入後の細胞を、例えばマーカー遺伝子の選別機能により、あるいは相同的組換えを確認するサザンブロッティング法、ＰＣＲ法等の常法によりスクリーニングすることにより、ＧＬＡＳＴ遺伝子機能を欠損したＥＳ細胞（以下、組換えＥＳ細胞と称す）を得ることができる。なお一般的には、この様な相同組換により相同染色体の一方のみのＧＬＡＳＴ遺伝子が破壊されたＥＳ細胞が得られる。
使用するマウスＥＳ細胞としては、一般的には既に樹立されている１２９系のＥＳ細胞が用いられる。その他、Ｃ５７ＢＬ／６系やＢＤＦ１系（Ｃ５７ＢＬ／６系とＤＢＡ／２系との交配によるＦ１）マウスを用いて、公知の方法（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．ｅｄ．），ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）に従って樹立したＥＳ細胞を用いることもできる。好ましくは、１２９系のＥＳ細胞が用いられる。
過程２，３
Ｆ１世代のヘテロ接合型ＧＬＡＳＴ遺伝子ノックアウトマウスの作製
次に、得られた組換えＥＳ細胞を発生させてキメラマウスを得る。そのために、組換えＥＳ細胞を、マイクロインジェクション法や凝集法により、胚盤胞期又は８細胞期等の正常なマウス胚に注入し、その様にして得られたキメラ胚を、擬妊娠状態にある雌性マウスの子宮角に移植し、この移植マウスを通常通り飼育して、キメラマウス仔を出産させることができる。好ましくは、組換えＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの胚に注入することが好ましい。
このキメラマウスは、通常、その体細胞及び生殖細胞として、組換えＥＳ細胞由来の細胞と正常細胞とを含んでなり、これを適当な系統の野生型マウス、好ましくはＣ５７ＢＬ／６系マウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配することによりヘテロ接合型のＦ１産仔が得られる。通常、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合型マウスを産出させる。交配に用いたキメラマウスの生殖細胞が、上記の組換えＥＳ細胞、すなわち相同染色体の一方に存在する内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子が破壊されているＥＳ細胞に由来していれば、該遺伝子の機能が欠損した所望のヘテロ接合型Ｆ１マウスを得ることができる。
上記行程において、ヘテロ接合型Ｆ１マウスを高効率に得るために、例えば、キメラ胚を作製する際に、組換えＥＳ細胞の起源マウスとは異なる体毛色のマウスに由来する正常宿主胚細胞を組み合わせれば、体毛色を観察することにより、生体における組換えＥＳ細胞の占める割合の高いキメラマウスやヘテロ接合型Ｆ１マウスの選択が容易となる。
Ｆ１世代において所期の遺伝子型が達成されているか否かは、その尾から抽出したＤＮＡに対して、サザンブロット法やＰＣＲ法により分析を行うことにより、確認することができる。
過程４，５，６
（１）本発明のＧＬＡＳＴ遺伝子ノックアウトマウスの獲得
本発明では、ＧＬＡＳＴ遺伝子ノックアウトマウスの遺伝的背景を、できるだけＣ５７ＢＬ／６系マウスに近づけることが好ましい。そのために、上記の通りに作製したＦ１ヘテロ接合型マウスを更にＣ５７ＢＬ／６系マウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配し、生まれてきたヘテロ接合型マウスを、再度Ｃ５７ＢＬ／６系野生型マウスと交配するという作業を繰り返す。この作業を、通常合計少なくとも５回、好ましくは少なくとも９回、より好ましくは少なくとも１５回行う。最後に、得られたヘテロ接合型マウスの雌雄を交配して、ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損した、本発明のホモ接合型又はヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ることができる。グルタミン酸トランスポーター遺伝子の機能欠損の効果の点からホモ接合型マウスが好ましい。
各世代において所期の遺伝子型が達成されているか否かは、上記と同様にサザンブロッティング法、ＰＣＲ法、塩基配列決定等の常法によればよい。
この様に作製することができる本発明のノックアウトマウスを、雄性・雌性の組合わせとして一旦得ておけば、それ以降は、必要に応じて適宜繁殖させることにより、容易に同じ遺伝子型のノックアウトマウスを必要数得ることができる。
（２）本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスの網膜及び眼圧の解析
最後に、上記の通りに作製したホモ接合型又はヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスにおいて、その眼圧が正常範囲にあること、及び網膜神経節の神経細胞が減少していることを確認する。この様な眼の性状が確認できない場合には、過程５に記載の交配を更に繰り返すことによって、上記性状を満たす本発明のノックアウトマウスを得ることができる。
本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスの眼圧は、通常約２１ｍｍＨｇ以下、例えば約１０〜２１ｍｍＨｇである。用いたＥＳ細胞の起源であるマウスの系統、又はキメラ胚の作製に用いた正常胚の起源であるマウスの系統によって、この眼圧範囲は多少変動しうるが、それを考慮しもて３０ｍｍＨｇ以下でなければならない。
本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスでは、その網膜神経節の神経細胞数が、野生型マウスに比べて、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％ほど減少している。
以下に、網膜神経節細胞数の計測方法と眼圧の測定方法の例を説明するが、これらの方法に限らず、公知の慣用的な方法を用いてよい。例えば、Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：４６６３−４６６６，１９９８やＨａｒａｄａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２９２，１３４−１３６，２０００を参照されたい。
これらの測定では、上記の本発明のホモ接合型又はヘテロ接合型ノックアウトマウスに対する対照マウスとして、それらのマウスを得る際に同時に出生した野生型正常マウス、あるいは単に正常（野生型）Ｃ５７ＢＬ／６系マウスを用いうる。
必要に応じて、上記の対照マウスの他に、上記のＦ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス若しくはその雌雄を交配することにより得られるホモ接合型又はヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス、又は戻し交配の途中で得られるヘテロ接合型ノックアウトマウスなどにおいても、上記の測定を行う。
網膜神経節細胞数の計測：
マウスの網膜神経節細胞数を、通常の組織化学的な手法により、又は逆行性ラベリング法により測定することができる。
（ａ）病理切片を用いた方法
１）試験対象マウスを、麻酔により鎮静させ、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液にて灌流固定する。
２）眼球を取り出して４℃の同液中で更に２時間固定する。
３）眼球をパラフィンに包埋した後、切片、例えば厚さ７μｍの切片を作製する。
４）ヘマトキシリン／エオシン染色を行い、顕微鏡下に、視神経を含む断面で神経節細胞数をカウントする。
（ｂ）逆行性ラベリングを用いた方法
１）麻酔により鎮静したマウスの頭部を固定する。
２）顕微鏡下で、エタノール噴霧した後、頭部をハサミで横切開し、頭蓋骨を露出させる。
３）縫合線と血管を確認後、グラインダーで手術用の穴をあけ、そこからマイクロシリンジで上丘実質に、例えば蛍光色素Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（一般名ａｍｉｎｏｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）やカルボシアニン蛍光色素、例えばＤｉＩ（一般名１，１０−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３０，３０−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を注入する。
４）皮膚をクリップで綴じた後、覚醒薬を腹腔内に注射して、回復を確認する。
５）手術後７日間通常通り飼育した後、処置マウスをエーテル麻酔にて死亡させ、眼球を取り出し、前眼部を除去する。
６）網膜を含む後眼部を４％パラホルムアルデヒド溶液に入れ、４℃で２０分間固定する。
７）網膜を取り出して伸展標本を作成する。
８）蛍光顕微鏡にて写真撮影後、蛍光ラベルされた網膜神経節細胞数をカウントする。
マウスの麻酔は、通常の動物実験に使用される麻酔剤であれば、マウスを死亡させない濃度範囲で、いずれのものを用いてもよい。例えばケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）／メデトミジン（１ｍｇ／ｍｌ）の１：１混合液（０．１５−０．２ｍｌ／マウス）を用いてよく、この場合アチパメゾール（５ｍｇ／ｍｌ）（０．１５−０．２ｍｌ／マウス）により覚醒させることができる。
眼圧の測定：
１）上記と同様に、通常の麻酔によりマウスを鎮静させる。
２）鎮静したマウスの眼圧を、電子眼圧計（例えばトノペンＸＬ、米国メドトロニック・ソーラン社製）を用いて測定する。
視覚機能又は視神経細胞の機能を評価するためには、網膜電図（Ｅｌｅｃｔｒｉｃｒｅｔｉｎｏｇｒａｍｓ，ＥＲＧ）を測定してもよい。これは、光刺激により網膜から得られる電気的反応を測定するものであり、生体における視神経細胞の神経伝達の活動度を表す、よい指標である。詳しくは、「現代の眼科学 改訂第８版」（所敬、金井淳編集、金原出版発行）や「視能矯正学 改訂第２版」（丸尾敏夫編集、金原出版発行）、又は非特許文献１（Ｈａｒａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：４６６３−４６６６，１９９８）を参照されたい。
以下に、その測定方法を簡単に説明する。
１）マウスを常法により麻酔した後、頭部ホルダーを用いてマウスの位置を固定する。
２）０．５％フェニレフリン及び０．５％トロピカミドを投与して、瞳孔を拡張させる。
３）炭素繊維電極を角膜表面に接触させ、基準電極を前頭皮下に接触させる。
４）３０分間暗順応させる。
５）光刺激装置（ＳＬＳ−３１００，Ｎｉｈｏｎ Ｋｏｄｅｎ，Ｊａｐａｎ）により、０．６又は１．２Ｊの強度で、１０μ秒間の閃光を与えて、網膜を刺激する。
６）得られた電位を、増幅器（ＭＥＢ−５３０４，Ｎｉｈｏｎ Ｋｏｄｅｎ）により、周波数の帯域を５０−１０００Ｈｚ及び１−１０００Ｈｚ（各々振動電位ＯＰ及びａ波又はｂ波を測定する場合）に設定して、増幅する。
７）２回の応答電位を、平均化して記録する。
８）データとして、ａ波、ｂ波、及び各種振動電位を解析する。
３．正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法
本発明のノックアウトマウスは、正常眼圧緑内障を予防及び／又は治療するために有効な化合物、特には網膜神経節の神経細胞を含む、視神経細胞の死もしくは変性、又はその機能の低下を抑制するために有効な化合物、あるいは視神経細胞又はその機能を回復させるために有効な化合物をスクリーニングするために用いることができる。
従って、本発明は、正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、
１）本発明のホモ接合型又はヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスに試験化合物を投与すること、
２）野生型正常マウスに試験化合物を投与すること、
３）上記の各マウスにおいて、投与前、及び投与してから一定期間後、生存する視神経細胞の数量又機能を評価すること、及び
４）ＧＬＡＳＴノックアウトマウスと野生型マウスの検査結果を比較して、試験化合物の有効性を評価すること
を含んで成るスクリーニング方法を提供する。
試験化合物が、正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療にとって有効であるか否かは、緑内障に特徴的な徴候を改善できるか否かを検査することのよって判定することができる。例えば、網膜神経節の神経細胞数を計数することにより、試験化合物の投与により、対照マウスに比べて、その数が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％回復していれば、その試験化合物は、医薬上有効であると判定してよい。また、網膜電位を測定することにより、試験化合物の投与により、対照値に比べて、例えばｂ波や振動電位の大きさが、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％回復していれば、その試験化合物は、医薬上有効であると判定してよい。
本発明のヘテロ接合型ノックアウトマウスは、出生後、週齢と共に網膜神経節の細胞数が徐々に低下していくことが判明している（図４）。従って、上記スクリーニング方法の１つの態様として、１）出生後直ぐに、１群のヘテロ接合型ノックアウトマウスには定期的に試験化合物を投与し、もう１群のヘテロ接合型ノックアウトマウスには試験化合物を投与せず、２）各週齢で、網膜神経節の細胞数を測定し、そして３）両者の比較から、網膜神経節の細胞数の経時的な低下を抑制する化合物を選別することもできる。
試験化合物としては、天然及び合成化合物の他、動植物の抽出物、発酵生成物、ペプチド、蛋白質、又は核酸分子など、任意の物質を用いることができる。所望の蛋白質を発現するための遺伝子ベクターであってもよい。試験化合物の投与経路も、試験化合物の性質が許す限り、種々の方法を試みてよく、例えば点眼や経口投与によることもできる。投与期間や投与様式も、試験化合物の効果を最大限にする様に選択される。この様な試験化合物の種類や投与方法は、製薬分野又は医学分野における通常の方法に従ってもよい。
更に、本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを、他の種類のノックアウトマウス又は他の種類の疾患モデルマウスと交配して、新たな疾患モデルマウスを作製することもできる。この様な、本発明のＧＬＡＳＴノックアウトマウスの使用もまた本発明に含まれる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
実施例１： ＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子機能欠損マウスの作成
（１）マウスＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子ＤＮＡの相同組換え用ＤＮＡの作成
１２９ＳＶマウスの肝から抽出したゲノムＤＮＡ（野生型マウスＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子）を、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化して得たゲノムライブラリーラムダＦＩＸＩＩについて、マウスＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子のｃＤＮＡの部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、１ｘ１０^６個のコロニーについて検索した結果、２６個の陽性クローンを得た。これを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩで不完全消化させて、第６エキソンから第８エキソンを含む、全長９ｋｂｐのゲノムＤＮＡをサブクローニングした（図２、上段）。次いで、ＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子を破壊するために、第６エキソンのＢａｍＨＩ以降１．５ｋｂｐを欠損させ、そこににネオマイシン耐性遺伝子を、さらに第８エキソンの下流にジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子を挿入した（図２、中段）。ゲノムＤＮＡとの相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が２．５ｋｂ、ネオマイシン酎性遺伝子とジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子との間が５ｋｂとなるように構築した。得られた構築体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫに挿入し、ＥＳ細胞への導入の際に制限酵素ＮｏｔＩで切断して線状化することによりターゲティングベクター（相同組換え用ＤＮＡ：ｐＧｌｕＴ１ＮｅｏＤＴ）を得た（図２、中断）。
（２）相同組換え用ＤＮＡの導入によるＥＳ細胞のＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子の欠損
相同組換え用ＤＮＡ７５μｇをマウスＥＳ細胞（Ｅ１４株）３ｘ１０^７個を含むエレクトロポレーション用緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４）に懸濁させ、Ｆｉｅｌｄ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ ２１０Ｖ／ｃｍ，Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ５００μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４時間から２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｓｉｎ，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で選択培養を行った。
Ｇ４１８耐性コロニーを、遺伝子導入後１９２時間後から、マイクロピペットを用いて６０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０と１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０とからなる溶液）を含む９６穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ ３０７７）に移し換え、数分間処理した後、ピペッティングすることによって単一細胞にし、これらを２４穴のマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ ３０４７）に移し換え、培養を継続した。採取したコロニーは、その長径がマイクロチップの内径の１／２以上に達したもので、この時の細胞数は、１ｘ１０^４〜１０^５個であった。エレクトロポレーション後の生存細胞数は、６．０ｘ１０^７個であった。Ｇ４１８耐性コロニー数は、２．４ｘ１０^２個で、生存細胞数の１／２．５ｘ１０^５であった。
２４穴のマイクロプレート上の細胞が３〜４日の培養でコンフルエントに達した段階で、細胞を０．２５％トリプシンで、３７℃で５分間処理後、順次、３５ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００１）又は６０ｍｍ（ＦＡＬＣＯＮ ３００２）の組織培養用シャーレ内で培養し、細胞の増殖を行った。なお、ＥＳ細胞の培養は、すべてフィーダー細胞上で行った。相同組換え体の確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。
サザンブロット解析については、Ｇ４１８耐性細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＰｖｕＩＩで消化後、第５イントロンのＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶ断片、０．５ｋｂをプローブとして用いて行った。破壊された対立遺伝子を含む相同組換え体（図２、下段）及び非相同組換え体の確認は、それぞれ、４．２ｋｂ及び７ｋｂのバンドの検出によって行った。相同組換え体コロニー数は、Ｇ４１８耐性コロニー２４２個中１個（２Ｂ７）であった。
（３）ＥＳ細胞及びその培養方法
ＥＳ細胞として、１２９／ＳｖＪ系マウス胚盤胞由来のＥ１４株を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコウ修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ，１１９６０−０１０ ＧＩＢＣＯ）に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、核酸混合液、非必須アミノ酸溶液及び１０^３ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ（ＡＭＲＡＤ）を添加したＳＣＭ培養液（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ １９８７）を用いた。
また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、ＤＭＥＭに１０％ＦＳＣを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢１３〜１４日のＩＣＲ系マウスの胎児を無菌的に採取し、カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−）で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝臓及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。次いで、得られた細切片を０．２５％トリプシン及び０．０４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ−（以下ＴＥ溶液という）で、室温で２０分間処理して細胞浮遊液を得た。
細胞浮遊液を１５００ｒｐｍ、５分間の遠心後、上清を除去し、１０％ＦＣＳ加ＤＭＥＭに懸濁させて２分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除いた細胞浮遊液を１００ｘ２０ｍｍの組織培養用シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ ３００３）に移し、３７℃，５％ＣＯ_２，９５％空気の条件で培養に供した。翌日、細胞浮遊液をＰＢＳ−で１回洗浄し、培養を継続した。継代は、３〜４日間隔で行い、継代が三代目までの細胞をフィーダー細胞として使用するためにマイトマイシン処理を施した。
コンフルエント状態にまで増殖したマウス胎児繊維芽細胞を２ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ７５μｌで３〜４時間処理し、ＰＢＳ−で３回洗浄後、ＴＥ溶液で室温で３分間処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、細胞数を５ｘ１０^５／ｍｌに調整し、６０ｘ１０ｍｍのゼラチンコートディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ３００２）に３ｍｌずつ分注した。以上のように作成したフィーダー細胞は、１週間以内に使用した。ＥＳ細胞の継代は、室温で５分間ＴＥ溶液で処理後、ピペッティングによってＥＳ細胞を単一細胞に分散させ、４ｘ１０^５個の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行った。
培養液は、２４時間間隔で交換し、継代間隔は、５６〜６４時間とした。また、凍結保存する際には、１ｘ１０^６個の細胞をＳＣＭに懸濁して凍結用チューブ（２ｍｌ，ＦＡＬＣＯＮ ４８１８）に移し、０．５ｍｌの凍結用培地（２０％ＤＭＳＯ添加ＤＭＥＭ）を滴下した後、−８０℃で一晩放置し、液体窒素中で保存した。
（４）ＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子欠損ＥＳ細胞によるキメラマウスの作成
（ａ）ＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子欠損ＥＳ細胞の胚盤胞への注入
ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に注入した後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配４日目に、Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いたＥＳ細胞は、継代２日目又は３日目にＴＥ溶液で処理を行った後、ゼラチンコートディッシュに３０分間静置することによって、フィーダー細胞を除去し、顕微操作に供するまで、氷上に静置した。
ＥＳ細胞の注入用ピペットは、外径１ｍｍの微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＰＮ−３）を用いて細かく引き延ばし、研磨器（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で、内径が約２０μｍとなるように先端を研磨し、さらにマイクロフォージ（Ｄｅ Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）で先端を鋭利に加工した。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばしたガラス管をマイクロフォージを用いて、外径５０〜１００μｍの部分で切断した後、さらに口径を１０〜２０μｍに加工して用いた。
注入用ピペットと保定用ピペットは、先端から約５ｍｍの部分を約３０度曲げて、マイクロマニピュレーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用いたチャンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラスを密蝋で接着させたものを用い、その上に約２０μｌの５％ＦＣＳ添加Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、その上面をミネラルオイル（Ｍ８４１０，Ｓｉｇｍａ）で覆った。一方のドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方には、拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。
顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。自然交配４日目に、子宮を灌流することによって採取したＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞１６０個にＥＳ細胞２Ｂ７を注入した結果、１２３個が生存し、成功率は７７％であった。１２３個を偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した結果、１０３個に着床が認められ、９５匹の産仔が得られた。離乳に至った８３匹の産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは３０匹で、このうち２６匹が、形態的に雄を示していた。これらのキメラマウスにおけるＥＳ細胞の寄与率は、１０〜９５％の幅であり、寄与率が６０％未満が１０例、６０％以上９０％未満が１４例、９０％以上が２例であった。
（ｂ）得られたキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配し、娩出される産仔（Ｆ１ヘテロ型マウス）がＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子欠損ＥＳ細胞由来であるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈する。ＥＳ細胞の寄与率の高い（７０％以上）９例（Ｎｏ．１，５，１３，２０，３３，４１，５４，６２，８１）のキメラマウスのうち、現在までに８例（Ｎｏ．１，５，２０，３３，４１，５４，６２，８１）について、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認された。
Ｎｏ．５とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配では、３回の分娩で合計２３匹の産仔が得られ、このうち、２３匹が野生色の毛色を示していた。また、Ｎｏ．３３とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスとの交配で得られた１５匹の産仔のうち、１２匹が野生色の毛色を示した。これらの野生色マウスのうち２３例についてサザンブロットによる解析を行った結果、１１例でＧＬＡＳＴ（ＧｌｕＴ−１）遺伝子の欠損を確認した。
（５）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスとの戻し交配
ＧＬＡＳＴ遺伝子の欠損が確認されたＦ１ヘテロ型雄マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系野生型雌マウスと交配させ、産仔を得た。その遺伝型をサザンブロットにより解析し、ＧＬＡＳＴ遺伝子の欠損が確認された次世代のヘテロ型雄マウスを選別した。再び、このヘテロ型雄マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌マウスと交配をさせ、更に次の世代のヘテロ型雄マウスを得た。この様にして、次々と同様の交配を合計９回繰り返し、世代を更新したＧＬＡＳＴ遺伝子欠損ヘテロ型マウスの雌雄を得た。最終的に、このヘテロ型マウスの雌雄を交配することによって、ＧＬＡＳＴ遺伝子欠損についてホモ型のＧＬＡＳＴノックアウトマウス（ＧＬＡＳＴ−／−）、ＧＬＡＳＴ遺伝子欠損についてヘテロ型のＧＬＡＳＴノックアウトマウス（ＧＬＡＳＴ＋／−）、及び野生型のマウス（ＧＬＡＳＴ＋／＋）を得た。これらのマウスを以下の測定に用いた。
実施例２： 眼圧の測定
実施例１で得られたホモ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス及び野生型正常マウスにおいて、生後１年の時点で、眼圧を測定した。各群４匹ずつを麻酔により鎮静させた後に、その眼圧を電子眼圧計により測定した。その結果、以下に示す。
野生型正常マウス： １９±４ｍｍＨｇ
ホモ型ノックアウトマウス： １５±３ｍｍＨｇ（平均値±標準偏差）
この結果から、ホモ型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスの眼圧は、正常範囲にあることが確認された。
実施例３： 網膜神経節細胞数の計測
種々の週齢で、実施例１で得られたホモ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス、ヘテロ接合型ＧＬＡＳＴノックアウトマウス、及び野生型正常マウスにおいて、網膜切片のヘマトキシリン／エオシン染色、及びＦｌｕｏｒｏ−ＧｏｌｄまたはＤｉＩによる網膜神経細胞の逆行性ラベリングにより、各マウスの網膜神経節の細胞数を測定した。
切片の染色による観察：
１）試験マウスを、ケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）／メデトミジン（１ｍｇ／ｍｌ）の１：１混合液（０．１５−０．２ｍｌ／マウス）により鎮静させ、４％パラホルムアルデヒド溶液にて灌流固定し、
２）眼球を取り出して４℃の同液中で更に２時間固定し、
３）眼球をパラフィンに包埋した後、切片、例えば厚さ７μｍの切片を作製し、そして
４）ヘマトキシリン／エオシン染色を行い、顕微鏡下に、網膜神経節領域の神経細胞を観察した。この顕微鏡像を図３に示す。
５）各マウス毎に、網膜神経節部分を含む切片中の神経細胞数を計測した。その結果を図４に示す。
逆行性ラベリングによる観察：
１）ケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）／メデトミジン（１ｍｇ／ｍｌ）の１：１混合液（０．１５−０．２ｍｌ／マウス）により鎮静させた後、マウスの頭部を固定し、
２）顕微鏡下で、エタノール噴霧した後、頭部をハサミで横切開し、頭蓋骨を露出させ、
３）縫合線と血管を確認後、グラインダーで手術用の穴をあけ、そこからマイクロシリンジで上丘実質にＦｌｕｏｒｏ−ＧｏｌｄまたはＤｉＩを注入し、
４）皮膚をクリップで綴じた後、アチパメゾール（５ｍｇ／ｍｌ）（０．１５−０．２ｍｌ／マウス）を腹腔内に注射して、回復を確認した。
５）手術後７日間通常通り飼育した後、処置マウスをエーテル麻酔にて死亡させ、眼球を取り出し、前眼部を除去し、
６）網膜を含む後眼部を４％パラホルムアルデヒド溶液に入れ、４℃で２０分間固定し、
７）網膜を取り出して進展標本を作成し、そして
８）蛍光顕微鏡にて、蛍光ラベルされた網膜神経節細胞の像を、写真撮影した。この像を図５に示す。
これらの結果（図３〜５）から、ホモ型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスでは、その網膜神経節の神経細胞数が、野生型マウス及びヘテロ型ノックアウトマウスに比べて、有意に低下していることが判明した。ヘマトキシリン／エオシン染色の結果（図３）、矢印で示す網膜神経節細胞数が減少している。また中央に位置する内顆粒層における細胞数（アマクリン細胞、双極細胞など）の減少と、それに伴う内顆粒層のひ薄化が観察された。また、ホモ型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスでは、生まれた時から細胞数が低下しているが、ヘテロ型ノックアウトマウスでも、経時的に細胞数が減少し、５週齢以降では、野生型マウスに比べて有意に低下していることが判明した（図４）。

本発明の、正常眼圧緑内障のモデルマウスとしての、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子が欠損したホモ型又はヘテロ型ＧＬＡＳＴノックアウトマウスは、該疾患の治療に有効な治療薬の開発のために、その治療方法の確立のために、そしてまた該疾患の病態生理、例えば発症原因、発症メカニズム又は進行メカニズムの解明のために、極めて有益であると期待される。

Claims (5)

1. 内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させたＧＬＡＳＴノックアウトマウスの作製方法であって、該ＧＬＡＳＴノックアウトマウスは、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させたＧＬＡＳＴノックアウトマウスであり、その遺伝的背景が、ＧＬＡＳＴ遺伝子を除いて、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの遺伝的背景と９９％以上同一であり、
   １）その眼圧が２１ｍｍＨｇ以下にあり、かつ
   ２）その網膜神経節の細胞数が、Ｃ５７ＢＬ／６系野生型マウスに比べて少なくとも２０％減少しており、
   下記１〜６の過程を含んで成る、作製方法：
   １）相同染色体上の１つの内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させた任意のマウスのＥＳ細胞を得ること、
   ２）過程１で得られたＥＳ細胞を用いて、該細胞を含んで成るキメラマウスを得ること、
   ３）過程２で得られたキメラマウスを正常Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、
   ４）過程３で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウスを正常Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、
   ５）過程４に記載した交配を、少なくとも合計９回繰り返して、その遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６系マウスに近づけたヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、及び
   ６）過程５で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス同志を交配して、ホモ接合型又はヘテロ接合型のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを得ること。
2. 請求項１に記載の作製方法を用いて作製した、内在性ＧＬＡＳＴ遺伝子の機能を欠損させたホモ接合型又はヘテロ接合型のＧＬＡＳＴノックアウトマウスであって、その遺伝的背景が、ＧＬＡＳＴ遺伝子を除いて、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの遺伝的背景と９９％以上同一であり、
   １）その眼圧が２１ｍｍＨｇ以下にあり、かつ
   ２）その網膜神経節の細胞数が、Ｃ５７ＢＬ／６系野生型マウスに比べて少なくとも２０％減少している、
   ＧＬＡＳＴノックアウトマウス。
3. 請求項２に記載のＧＬＡＳＴノックアウトマウスを用いた、正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法。
4. 正常眼圧緑内障の予防及び／又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、
   １）請求項２に記載のＧＬＡＳＴノックアウトマウスに試験化合物を投与すること、
   ２）野生型マウスに試験化合物を投与すること、
   ３）上記の各マウスにおいて、投与前、及び投与してから一定期間後に、生存する視神経細胞の数量又機能を評価すること、及び
   ４）ＧＬＡＳＴノックアウトマウスと野生型マウスの検査結果を比較して、試験化合物の有効性を評価すること
   を含んで成る、スクリーニング方法。
5. 生存する視神経細胞数又は視神経細胞機能を評価するために、網膜神経節の神経細胞数を計数し、及び／又は網膜電位を測定する、請求項４に記載のスクリーニング方法。

Images