JP2005532783A

JP2005532783A - ヒスタミン受容体ｈ３改変トランスジェニックマウス

Info

Publication number: JP2005532783A
Application number: JP2003541351A
Authority: JP
Inventors: ラブンバーグ，テイモシー・ダブリユー; リユング，ウエイピン
Original assignee: オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド
Priority date: 2001-11-05
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2005-11-04
Also published as: EP1444340A2; WO2003039245A3; US20060064766A1; WO2003039245A2; US7151200B2

Abstract

ヒスタミンＨ３受容体遺伝子において改変を有するトランスジェニック動物が、宿主動物への改変されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子の導入によって作成される。得られるトランスジェニック動物は機能的ヒスタミンＨ３受容体分子を生産しない。また、これらの動物から得られた細胞および細胞系は改変されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子を含有している。

Description

本発明は機能的なヒスタミンＨ３受容体タンパク質を欠如している動物を生産する、ヒスタミンＨ３受容体遺伝子が改変されているトランスジェニック非ヒト動物に関する。

ヒスタミンはグアニンヌクレオチド結合タンパク質を介して細胞内経路に連結される細胞表面受容体をとおしてシグナル伝達する多機能化学伝達物質である。この種の細胞表面受容体はＧタンパク質共役受容体またはＧＰＣＲと呼ばれる。現在、薬理学的に定義され、そしてＨ１、Ｈ２およびＨ３分類に分けられているヒスタミン受容体の３種のサブタイプが存在する（非特許文献１）。Ｈ１ヒスタミン受容体はクローン化されており（非特許文献２）、そしてアレルギー応答におけるヒスタミンの効果を遮断するためのジフェンヒドラミンのような薬物の標的である。Ｈ２ヒスタミン受容体はクローン化されており（非特許文献３）、そして胃における酸分泌においてヒスタミンの効果を遮断するためのラニチジンのような薬物の標的である。ヒスタミン受容体の第３のサブタイプは１９８３年に存在するという仮説が立てられた（非特許文献４）。それは中枢神経系におけるヒスタミン含有ニューロンにおいて前シナプスの自己受容体として、そして非ヒスタミン含有ニューロンにおいて前シナプスの異種受容体として機能すると信じられる。Ｈ３受容体の機能の１つは前シナプス部位において神経伝達物質の放出を調節することである。かくして、ヒスタミンＨ３受容体は中枢神経系において発現されるが、また、心臓、肺および胃においても薬理学的に同定されており、そして他の組織において存在するという仮説も立てられている。

ヒスタミンＨ３受容体シグナル伝達経路のイン・ビボの役割を詳細に調べるために、ヒスタミンＨ３遺伝子が相同的組み換えによって破壊されたトランスジェニックマウスが本発明において生成され、そしてヒスタミンＨ３受容体欠失繊維芽細胞が調製された。
Ｈｉｌｌｅｔａｌ．"ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＸＩＩＩ，ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｓｔａｍｉｎｅＲｅｃｅｐｔｏｒｓ"，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９７）４９（３）：２５３−２７８．Ｙａｍａｓｈｉｔａｅｔａｌ．（１９９１）"ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｌｏｎｉｎｇｏｆａｃＤＮＡＥｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅＢｏｖｉｎｅＨｉｓｔａｍｉｎｅＨ１Ｒｅｃｅｐｔｏｒ"，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，（１９９１）８８（２４）：１１５１５−１９．Ｇａｎｔｚｅｔａｌ．"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇｏｆａＧｅｎｅＥｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅＨｉｓｔａｍｉｎｅＨ２Ｒｅｃｅｐｔｏｒ"，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，（１９９１）８８（２）：４２９−３３．Ａｒｒａｎｇｅｔａｌ．"ＡｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＢｒａｉｎＨｉｓｔａｍｉｎｅＲｅｌｅａｓｅＭｅｄｉａｔｅｄｂｙａＮｏｖｅｌＣｌａｓｓＨ３ｏｆＨｉｓｔａｍｉｎｅＲｅｃｅｐｔｏｒ"，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９８３）３０２（５９１１）：８３２−７．

種々の細胞タイプにおけるヒスタミンＨ３受容体の機能的役割を理解するために、機能的なヒスタミンＨ３受容体を発現しないマウスが、胚性幹（ＥＳ）細胞における相同的組み換え（ＨＲ）によって生成され、そして本明細書において開示される。また、これらのマウスから誘導される細胞系が本明細書において開示される。それらから誘導された細胞系を含むこれらのマウスは、ヒスタミンＨ３受容体の機能を理解し、そしてヒト細胞におけるヒスタミンＨ３受容体等価物の機能または発現を調節する薬物の治療効果を評価するために価値ある動物モデルおよび道具を提供する。本発明のトランスジェニックマウスは野生型マウスに比較してスコポラミンの健忘効果に対する非感受性を表す。

本発明において生成されたヒスタミンＨ３受容体ノックアウトマウスは、ヒスタミンＨ３受容体遺伝子が相同的組み換え（ＨＲ）によって破壊された（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）モデルを提供する。ノックアウトマウスを生成する方法は４つの基本段階に分けることができる：
１．ヒスタミンＨ３受容体遺伝子のクローニングおよび胚性幹（ＥＳ）細胞のトランスフェクションのためのＤＮＡ構築物の作成；
２．ヒスタミンＨ３受容体遺伝子がＨＲによって破壊されたＥＳ細胞を単離すること；３．ノックアウトＥＳ細胞を注入されたマウスの胚からキメラマウスを生成すること；および
４．生殖系列伝達をとおしてノックアウトマウスを得るためにキメラマウスを繁殖させること。

本発明はヒスタミンＨ３受容体タンパク質をコードしているクローン化されたゲノムＤＮＡを利用し、そしてマウスのヒスタミンＨ３受容体遺伝子のクローニングおよびキャラクタライゼーションを記述する。改変されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子を有するトランスジェニック動物が生成される。天然に存在する遺伝子に対する改変は、修飾、欠失および置換であってもよい。修飾および欠失は天然に存在する遺伝子を非機能的にさせて、「ノックアウト」動物を生産する。天然に存在する遺伝子の第２の種由来の遺伝子への置換は、第２の種の遺伝子産物を生産する動物をもたらす。変異を有する遺伝子への天然に存在する遺伝子の置換は変異した遺伝子産物を生産する動物をもたらす。

これらのトランスジェニック動物は薬物アンタゴニストまたはアゴニストの研究、ヒトの疾病の動物モデルの生成ならびにヒスタミンＨ３受容体に媒介される応答に関連する障害または疾病の究極の処置のために重要である。ヒスタミンＨ３受容体の「ノックアウト」を担持するトランスジェニック動物は、ヒトにおけるヒスタミンＨ３受容体等価物が関与する疾病のための非ヒトモデルの確立のために有用である。

破壊したヒスタミンＨ３受容体遺伝子を担持するトランスジェニックマウスは、標的ＤＮＡ構築物の染色体における内因性遺伝子による相同的組み換えによって生成された。ＤＮＡ構築物はゲノムＤＮＡライブラリーから単離されたヒスタミンＨ３受容体のゲノムクローンから作成された。

用語「動物」は、ヒト以外のすべての脊椎動物を含むように本明細書では使用される。それはまた、胚および胎児期を含む発生の全期における個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」は、直接にもまた間接にも、細胞以下のレベルにおける計画的な遺伝子操作、例えば標的組み換えもしくはマイクロインジェクションまたは組み換えウイルスによる感染によって改変されたかまたは受け入れた遺伝情報を担持している１種以上の細胞を含有するすべての動物である。用語「トランスジェニック動物」は、古典的な交雑またはイン・ビトロ受精を包含することを意図せず、むしろ、１種以上の細胞が組み換えＤＮＡ分子によって改変されたか、またはそれを受け入れた動物を包含することを意味する。この組み換えＤＮＡ分子は、具体的には、特定の遺伝子座を標的としてもよく、染色体内に無作為に組み込まれてもよく、あるいはそれは染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。用語「生殖細胞系列トランスジェニック動物」は、遺伝子改変または遺伝情報が生殖系列細胞に導入され、それによって遺伝情報を子孫に伝達する能力を与えられたトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が実際に、その改変または遺伝情報のいくつかまたはすべてを保持する場合は、それらは同様にトランスジェニック動物である。

改変または遺伝情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来であっても、または特定の個々のレシピエントにのみ外来であってもよく、あるいはレシピエントによって既に保持されている遺伝情報であってもよい。後者の場合、改変または導入された遺伝子は、本来の遺伝子とは別に発現されても、または全く発現されなくてもよい。

改変されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子は、一般に、宿主動物にとって本来のものと同じヒスタミンＨ３受容体を完全にはコードしてはならず、そしてその発現生産物は、少量または多量の程度に改変されるか、または全部を欠如しているべきである。しかしながら、よりわずかに改変されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子が本発明の範囲内に入れられることは考えられる。

標的遺伝子を改変するために使用される遺伝子は、限定されるものではないが、ゲノム起源からの単離、単離したｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの調製、直接合成またはその組み合わせを含む広範な技術によって得ることができる。

トランスジーン導入のための標的細胞のタイプは胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はイン・ビトロにおいて培養した着床前の胚から得られてもよい［Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１５４−１５６；Ｍ．Ｏ．Ｂｒａｄｌｅｙｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９８５）８３：９０６５−９０６９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２２：４４５−４４８；Ｓ．Ａ．Ｗｏｏｄｅｔａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９９３）９０：４５８２−４５８４］。トランスジーンはＤＮＡトランスフェクションのような標準技術またはレトロウイルス媒介形質導入によってＥＳ細胞中に効率的に導入できる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と合体することができる。その後、導入したＥＳ細胞は胚を群体形成（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）し、そして得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１４６８−１４７４）。

ヒスタミンＨ３受容体は複雑なメカニズムの独立構成要素であるので、ヒスタミンＨ３受容体ＤＮＡによってコードされたものを含むタンパク質は、メカニズムへのそれらの寄与が理解されるには、個別にもそしてグループとしても両方試験されなくてはならない。個々の遺伝子およびそれらの発現産物の寄与を決定するという問題への１つのアプローチは、単離した遺伝子を使用して全能性ＥＳ細胞（本明細書に記述されるような）における本来の野生型遺伝子を選択的に不活性化させ、次いで、トランスジェニックマウスを生成することである。遺伝子を標的としたトランスジェニックマウスの生成における遺伝子を標的としたＥＳ細胞の使用は１９８７年に記述されており（Ｔｈｏｍａｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３−５１２）、そして他にも総説されている（Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８９）５６：１４５−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔ．（１９８９）５：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９８９）６：４８１−４９２；Ｗａｇｎｅｒ，ＥＭＢＯＪ．（１９９０）９：３０２５−３０３２；Ｂｒａｄｌｅｙｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：５３４−５３９）。

多くの技術を利用して染色体遺伝子中に特定の変化を挿入するための標的相同的組み換えを使用することによって、いずれかの遺伝子領域を不活性化するか、またはそれを所望のいずれかの変異に改変できる。相同的組み換えは、頻度１０^−６〜１０^−３において検出されると報告された（Ｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９８５）８２：１３９１−１３９５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−４２８；Ｓｏｎｇｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９８７）８４：６８２０−６８２４）。非相同プラスミド−染色体相互作用は一層頻度が高く、比較される相同的挿入を超える１０^５倍（Ｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９８５）８２：１３９１−１３９５）ないし１０^２倍（Ｔｈｏｍａｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−４２８；Ｓｏｎｇｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９８７）８４：６８２０−６８２４）のレベルにおいて起きる。

マウスＥＳ細胞における標的組み換えのこの低い割合を克服するために、種々の戦略が開発されて数少ない相同的組み換え体を検出または選択した。相同的改変事象を検出するための１つのアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して相同的挿入について形質転換体細胞のプールをスクリーニングし、続いて個々のクローンをスクリーニングする（Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８８）１６：８８８７−８９０３；Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９１）１０３：２２７−２３３）。あるいはまた、ポジティブ遺伝子選択アプローチが開発され、ここでは、相同的挿入が起きる場合にのみ活性になるマーカー遺伝子が構築されて、これらの組み換え体を直接選択することを可能にする（Ｓｅｄｉｖｙｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９８９）８６：２２７−２３１）。相同的組み換え体を選択するために開発されたもっとも強力なアプローチの１つは、改変の直接選択が存在しない遺伝子（例えばヒスタミンＨ３受容体）のために開発されたポジティブ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔ．（１９８９）５：７０−７６）。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターをもつので、高レベルにおいて発現されない遺伝子を標的とするのにより有効である。非相同的組み換え体はＤＮＡ構築物に隣接する単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用することによって選択される。構築物の非相同的挿入を有する細胞はＨＳＶチミジンキナーゼを発現し、それ故、ヘルペス薬物、例えばガンシクロビル（ＧＡＮＣ）もしくはＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフルラノシル）−５−ヨードウラシル）に対して感受性である。この対向選択によって、生き残る形質転換体における相同的組み換え体の数が増強できる。

本明細書において使用されるように「標的遺伝子」または「ノックアウト」は、限定されるものではないが、本明細書において記述される方法を含むヒト介在の方法によって非ヒト動物の生殖系列中に導入されたＤＮＡ配列である。本発明の標的遺伝子は同族の内因性遺伝子を具体的に改変するよう設計されるＤＮＡ配列を含む。

すべての前記応用は動物試験と最後には臨床試行において立証されねばならない。薬物標的の機能的役割を決定する１つのアプローチは、全動物において破壊された遺伝子からもたらされる欠陥を研究することである。本明細書において生成され、そして開示されるヒスタミンＨ３受容体ノックアウトマウスは、治療においてもっとも適当であるモジュレーターのタイプを決定する際に重要であるヒスタミンＨ３受容体の機能の定義を可能にしする。

本発明のノックアウトマウスにおいて検出されるすべてのヒスタミンＨ３受容体機能は、後に本発明のノックアウトマウスから単離することができる代替の新規ヒスタミンＨ３受容体サブタイプの存在の証拠を提供するであろう。

本発明のノックアウトマウスにおける機能的なヒスタミンＨ３受容体の不在は、例えば、ＲＮＡ解析、タンパク質発現検出、レポーター結合アッセイ、酵素活性アッセイおよび他のヒスタミンＨ３受容体機能研究において確認される。ＲＮＡ解析では、ＲＮＡサンプルがノックアウトマウスの種々の臓器から調製され、そしてヒスタミンＨ３受容体転写物が転写物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるノザンブロットにおいて検出される。

マウスのヒスタミンＨ３受容体に特異的であるポリ血清およびモノクローナル抗体が生産される。ノックアウトマウスにおけるインタクトのヒスタミンＨ３受容体の不在は、例えば、フローサイトメトリー分析、免疫組織化学的染色ならびにヒスタミンＨ３受容体特異抗体を用いる受容体結合および／または酵素活性アッセイにおいて研究される。あるいはまた、機能アッセイがノックアウトマウスから収集した種々の細胞タイプの調製物を用いて実施される。

Ｈ３受容体遺伝子を欠如するマウス（Ｈ３^−／−）は胚性幹細胞（１２９ＳＶＪ）における相同的組み換えにより生成され、そして生殖系列キメラがＣ５７Ｂ１／６Ｊバックグラウンドと交雑されて異型接合体Ｈ３^＋／−が生成される。Ｈ３^＋／＋およびＨ３^−／−マウスはＨ３^＋／−マウスの繁殖によって生成され、そして生殖系列の伝達はポリメラーゼ連鎖反応によって決定された。Ｆ２Ｈ３^−／−マウスは予期したメンデル頻度をもって生まれ、表現型として正常に見られ、繁殖性であり、そして成熟動物期をとおして生育可能と見られた。Ｈ３^＋／＋およびＨ３^−／−の成長曲線は、若干低いが統計的に有意な差異ではない平均体重を示すＨ３^−／−動物と並行している。本発明者らは結合研究ならびに選択的Ｈ３アンタゴニスト、チオペラミドを用いる薬理学的実験によってトランスジェニックマウスにおけるＨ３受容体の全不在を立証した。Ｈ３受容体は正常な（Ｈ３^＋／＋）マウスの脳ホモジネートにおける放射性リガンド結合により容易に検出できるが、一方Ｈ３^−／−マウスは^３Ｈ−Ｒ−α−メチルヒスタミン結合によって決定されるようにＨ３受容体結合部位の完全な喪失を例証した。異型接合体マウス（Ｈ３^＋／−）はＨ３^＋／＋マウス（０．４７ｎＭ）と同じ^３Ｈ−Ｒ−α−メチルヒスタミン結合親和力（０．４３ｎＭ）を有するが、約半数の全脳ホモジネートにおける結合部位の数（それぞれ、４７ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質対９１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）を有するのみであった。Ｈ３受容体は数種のサブタイプにおいて存在するかもしれないと示唆されている［Ｒ．Ｅ．Ｗｅｓｔ，Ｊｒ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９０）３８：６１０−６１３］ので、^３Ｈ−Ｒ−α−メチルヒスタミン、^３Ｈ−Ｎ−α−メチルヒスタミンまたは^３Ｈ−ヒスタミンを用いる結合研究がマウスの脳ホモジネートにおいて実施された。結合は高い（＞１００ｎＭ）濃度においてさえ検出できず、このことはすべてのＨ３結合が単一の遺伝子産物によるものであり、そしてＨ３受容体サブタイプの存在の反証になることを示している。

Ｈ３受容体は睡眠／覚醒行動の調節に関与していることが知られている。選択的Ｈ３アンタゴニストを用いる研究はラットおよびネコにおける覚醒の増進を示した［Ｍｏｎｔｉｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．（１９９１）２０５：２８３−２８７；Ｌｉｎｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲｅｓ．（１９９０）５２３：３２５−３３０］。機能的Ｈ３受容体の不在を確認するために、本発明者らはＷＴおよびＫＯマウスにおいてＨ３受容体アンタゴニスト・チオペラミドの効果を比較した。この化合物はＨ３^＋／＋マウスにおいて照明時に投与後最初の２時間には５５％覚醒を増進した。覚醒におけるこの増進は、注射後２時間の間の非急速眼球運動（ｎｏｎ−ｒａｐｉｄｅｙｅｍｏｖｅｍｅｎｔ）（ＮＲＥＭ）睡眠における６１％低下と関連したが、一方ＲＥＭ睡眠は影響されなかった（図１）。重要なことは、Ｈ３^−／−マウスの睡眠−覚醒状態に対してチオペラミドには効果がなく、このことは受容体が欠失されたことの行動による確認を提供する。

また、Ｈ３受容体は記憶および認識プロセスのコリン作動性調節と関連付けられた［Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉｅｔａｌ．，Ｂｅｈａｖ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．（１９９９）１０４：１４７−１５５；Ｂｌａｎｄｉｎａｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）１１９：１６５６−１６６４］。Ｈ３受容体アンタゴニストは受動回避においてスコポラミン誘導の健忘症を防ぐことが示されている。このことは本発明者らにステップ−スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）受動回避試験を用いてＨ３^−／−マウスにおける記憶を探索することを促した。この試験は明／暗選択と鋭い嫌悪条件づけ刺激（弱い足部ショック）を使用し、そしてコリンエステラーゼ阻害剤の認識／記憶亢進を例証するために使用された。基本の明／暗分配試験では、明るい小部屋か暗い小部屋において費やした時間においても、また明るい小部屋から暗い小部屋への移動数においてもＨ３^＋／＋とＨ３^−／−マウスとの間には差異はなかった。マウスの両セットが嫌悪刺激の想起を同等に保持できた基本の受動回避試験では、Ｈ３^＋／＋とＨ３^−／−マウスとの間には差異はなかった（図２Ｂ）。Ｈ３^＋／＋マウスがそれらの部屋への最初の曝露前に健忘性薬剤スコポラミン（ムスカリン性受容体アンタゴニスト）により前処置された場合、マウスは翌日の部屋への再入室において嫌悪刺激を想起することができなかった（図２Ｂ、右パネル）。しかしながら、Ｈ３^−／−マウスはスコポラミンの健忘効果に対して完全に不応答であって、そして未処置群と同様に応答した（図２Ｂ、左パネル）。これはチオペラミドがスコポラミンの効果を少なくとも部分的に防ぐことができることを示した従来の報告と一致する［Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉｅｔａｌ．，Ｂｅｈａｖ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．（１９９９）１０４：１４７−１５５；Ｂｌａｎｄｉｎａｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）１１９：１６５６−１６６４；Ｏｎｏｄｅｒａｅｔａｌ．，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓＡｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９８）３５７：５０８−５１３；Ｍｏｌｉｎｅｎｇｏｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．（１９９９）６３：２２１−２２７］。これらの知見は記憶機能および／または認識プロセスを調節するコリン作動性経路におけるヒスタミンとＨ３受容体についての決定的な役割を確立する。さらに、Ｈ３^−／−マウスはコリン作動性アンタゴニスト、スコポラミンの健忘性効果に抵抗性である。

次の実施例は本発明を具体的に説明する目的のために提出されており、そして本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。

Ｈ３ ^−／− 動物の生成
マウスＨ３Ｒ遺伝子クローンは１２９／Ｏｌａマウスゲノムライブラリーから分離され、そしてマウスＨ３Ｒ遺伝子の１３ｋｂをカバーするファージクローンが単離された。マウスＨ３Ｒ遺伝子の第２のエクソンを含有するＸｈｏＩＤＮＡフラグメントがノックアウト構築物を調製するために使用された。ネオマイシン耐性遺伝子を含有するカセットが使用されて遺伝子の第１のイントロンの一部と第２のエクソンの５’末端をカバーする０．７ｋｂ領域を置換した。ＨＳＶ−チミジンキナーゼカセットは構築物の３’末端において置換された。構築物におけるマウスＨ３Ｒ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子およびＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子は転写の同一方向において存在する。ＤＮＡ構築物はエレクトロポレーションによってＥ１４胚性幹細胞中に導入された。細胞はＧ４１８４００μｇ／ｍｌおよび０．２μＭガンシクロビルの存在下で培養された。破壊された遺伝子を有する胚性幹細胞はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって検出され、次いで、構築物の３’末端に隣接するＤＮＡプローブを用いるサザンハイブリダイゼーションによって確認された。キメラマウスは胚性幹細胞を注入された胚から生成された。生殖系列のマウスはオスのキメラマウスとメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊとの繁殖から得られた。破壊したＨ３Ｒ遺伝子について異型接合の生殖系列マウスはＰＣＲによって同定された。破壊したＨ３Ｒ遺伝子のみを含有するＨ３Ｒ−欠失マウスは異型接合マウスの交雑から得られた。

ヒスタミンＨ３受容体ＤＮＡ構築物によるＥＳ細胞のトランスフェクション
胚性幹（ＥＳ）細胞Ｅ１４（Ｈｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，１９８７，”ＨＰＲＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ）ＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏｓＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＧｅｒｍ−ｌｉｎｅＣｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｂｙＣｕｌｔｕｒｅｄＣｅｌｌｓ”．Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２６：２９２−２９５）は、胚性繊維芽細胞（ＥＦ）とともに、そして１０００Ｕ／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＦ）（Ｇｉｂｃｏ）を含有する培養基ＤＭＥＭ（１５％ＦＣＳ，１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭｂ−メルカプトエタノール、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕペニシリンおよび１００Ｕストレプトマイシン）中で混合培養することによって未分化期において維持された。ＥＦ細胞はＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，”Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌＬｉｎｅｓ”ＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤｃ：ＩＲＬＰｒｅｓｓ）（１９８７）ｐｐ．７１−１１２．）によって記述された方法にしたがって１５〜１７日齢マウス胎児から調製された１次繊維芽細胞培養物であった。ＥＦは培養基中で２時間１０ｍｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）により処理されて、支持細胞としての使用前に細胞分裂を停止した。

ＤＮＡトランスフェクションでは、ＤＮＡ構築物はＮｏｔＩ消化によって線状にされた。次いで、ＤＮＡは−２０℃で１時間氷冷エタノールの２倍量によって沈殿された。沈殿ＤＮＡは遠心によってペレット化され、７０％エタノール０．５ｍｌにより１回洗浄され、風乾され、次いで、リン酸バッファー生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）中１ｍｇ／ｍｌにおいて溶解された。ＥＳ細胞はトリプシン処理によって収穫され、そして培養基中６，２５ｘ１０^６細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。ＤＮＡ構築物（２０μｇ）がＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる２５０μＦで３４０ボルトにおけるエレクトロポレーションのためにＥＳ細胞懸濁液０．８ｍｌに添加された。

トランスフェクションされたＥＳ細胞は培養基においてＥＦを２．５ｘ１０^６／プレートで被覆した９０ｍｍプレート上に平板塗布された。２日後、細胞は４００μｇ／ｍｌＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｇｉｂｃｏ）および０．２μＭＧＡＮＣ（Ｃｙｔｏｓｉｎ，Ｓｙｎｔｅｘ）を含有する培地において薬物選別にかけられた。培養基は毎日交換された。大量の細胞死が明らかに４日目に始まり、そして大部分の死細胞は毎日の培地交換により除去された。生き残った細胞コロニーは７日目に顕微鏡下で観察され、そして１０日目には、それらは顕微鏡なしにプレート上に肉眼で見られた。

相同的組み換えについてトランスフェクションされたＥＳ細胞のＰＣＲスクリーニングトランスフェクション後１１日目のＥＳコロニーのサイズはＰＣＲスクリーニングのために十分に大きかった。細胞コロニーを収集するために、９０ｍｍプレートにおける培養基が吸引され、そしてＰＢＳ１０ｍｌが添加された。個々の細胞コロニーが立体顕微鏡によって位置を定められ、２０ｍｌ容量で回収され、そして９６穴プレート中に移された。ＥＳコロニーの単一細胞懸濁液を調製するために、９６穴プレートの１ウェル当たり０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）２５μｌが添加された。３７℃におけるトリプシン処理の８分後、培養基２５μｌが添加された。相同的組み換え現象についてのＰＣＲによるスクリーニングが実施される間、全ＥＳコロニーはマスタープレートとしての培養物においてなお維持された。マスタープレートを調製するために、各細胞サンプル６０μｌが、ＥＦ細胞で被覆され、そしてＧ４１８およびＧＡＮＣを含有する培養基１８０μｌ／ウェルを含有した９６穴プレートに移された。

第１ラウンドのＰＣＲスクリーニングでは、各細胞溶解物サンプルが、９６穴プレートにおいて１列のサンプルとして並べられた１２細胞コロニーから調製された。マスタープレートの調製後、プレートの各列における約９０μｌ／ウェルの残存する細胞サンプルが保存された。細胞は１分間の遠心によってチューブ中で沈降された。培地を流出させた後、細胞は蒸留水３０μｌを添加し、そして短時間回転することによって溶解された。細胞溶解物は、９５℃で１０分間の最初の加熱、室温への冷却、続く短時間回転させながらのプロテイナーゼＫ（水中１０ｍｇ／ｍｌ）１μｌの添加、プロテイナーゼＫ消化のための５０℃で９０分間、次いで、プロテイナーゼＫの熱失活のための９５℃で１０分間のインキュベーションによって調製された。

ＰＣＲは９６００ＧｅｎｅＡｍｐｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて実施された。反応混合液は、ＰＣＲバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２および０．００１％ｗ／ｖゼラチン）中、細胞溶解物５μｌ、２種のオリゴヌクレオチドプライマー各々４μＭ、各々ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ．ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ２００μＭ、および５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有した。反応条件は、９４℃で２分、６０℃で２分および７２℃で２分の３サイクル、次いで、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒および７２℃で１分の４０サイクル、続いて７２℃における７分であった。

３−４日培養後のマスタープレート上のＥＳ細胞は分裂（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）の準備が整っていた。ポジティブグループにおける細胞コロニーはＰＣＲの第２ラウンドによって個別にスクリーニングされてポジティブな個々のコロニーが同定された。培養におけるポジティブグループを維持するために、ウェル中の細胞は最初に培養基を除去し、ＰＢＳ５０μｌで１回洗浄し、０．２５％トリプシン４０μｌによって３７℃５分間処理することによってトリプシン処理し、続いて培養基９０μｌを添加された。次いで、細胞は再懸濁され、そして細胞サンプル２０μｌが、ＥＦで被覆され、Ｇ４１８およびＧＡＮＣを含有する培養基２００μｌで満たされたマスタープレートに移植された。残っている細胞（１１０μｌ／ウェル）はチューブ中に移された。細胞溶解物が調製され、そして相同的組み換えシグナルがＰＣＲによって増幅され、そして前項で記述されたようにハイブリダイゼーションによって検出された。

ゲノムのサザンハイブリダイゼーションによる相同的組み換えの確認
相同的組み換えはサザンハイブリダイゼーションによって確認された。ＰＣＲスクリーニングにおけるポジティブコロニーから得られたＥＳ細胞は培養において拡大され、そしてＤＮＡがＭａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）ｐｐ．２８０−２８１）による記述のように抽出された。推定されるノックアウト細胞系のゲノムＤＮＡサンプルが制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化され、１％アガロースゲル電気泳動によって分離され、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロットされ、そしてマウスのヒスタミンＨ３受容体遺伝子に特異的な〜４４０ｂｐＤＮＡフラグメントとハイブリダイズされた。このＤＮＡプローブは染色体に任意に組み込まれたＤＮＡ構築物にはハイブリダイズしなかった。

機能的なヒスタミンＨ３受容体のみが親のＥＳ細胞において検出され、そして破壊されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子のみがノックアウトＥＳ細胞中に見い出された。

胚注入によるキメラマウスの生成
３．５日の懐胎期におけるマウス胚が過排卵されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの子宮から採取された。約１０〜１５個のＥＳ細胞が胚の割腔中に注入された。注入された胚は２．５日の懐胎において偽妊娠ＣＤ１マウスの子宮中に移植された。これらの胚から発生したマウスは１７日後に出産された。使用したＥＳ細胞は優性なアグーチの毛色遺伝子を有する１２９Ｏｌａマウス株に由来したので、キメラマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚からの黒色毛色に対するＥＳ由来の細胞からのアグーチ毛色によって同定された。

キメラマウスの繁殖によって得られたＥＳ生殖系列マウス
キメラマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとともに繁殖された。これらの交雑はＥＳ細胞の生殖系列伝達を試験するために実施された。繁殖からの子孫のあるものは、キメラのオスが優性のアグーチ毛色遺伝子を担持しているＥＳ細胞由来の生殖系列細胞をもっている場合アグーチ色であることが期待される。マウスにおける破壊したヒスタミンＨ３受容体遺伝子は先の項において記述されたようにゲノムハイブリダイゼーションによって検出された。ゲノムＤＮＡは離乳期後の各アグーチマウスからの尾の約１ｃｍから精製された。ゲノムＤＮＡは既に記述されている（Ｌａｉｒｄｅｔａｌ．，前出）ように、フェノールおよびフェノール：クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿によって単離された。ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩにより消化され、そして先に述べたようにヒスタミンＨ３受容体遺伝子に特異的な３’隣接ＤＮＡとハイブリダイズされた。ヒスタミンＨ３受容体遺伝子は連鎖したＸ−染色体であるので、すべてのメスの生殖系列アグーチマウスは破壊されたヒスタミンＨ３受容体遺伝子に対して異型接合である。

異型接合ノックアウトマウスの繁殖から同型接合ノックアウトマウスの生成
メスの異型接合ノックアウトマウスがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスまたは野生型オスの同産の子と交配された。オスの子の半分が破壊された遺伝子のみを担持し、そしてメスの子の半分が破壊された遺伝子に対して異型接合であることが期待される。生き残っている子孫は先に述べたようにサザンハイブリダイゼーションによって遺伝子型が定められた。同型接合のメスのマウスは異型接合のメスとノックアウトのオスとのさらなる繁殖によって得られた。

ヒスタミンＨ３受容体ノックアウトマウスおよびマウス由来の細胞の特性決定
飼育ならびに睡眠、活性および体温の記録
個々に飼育したマウスは、動物が恒常的暗所（ＤＤ）に移された１つの研究以外は１２：１２明／暗（ＬＤ）周期において維持された。３か月齢において、動物は深い麻酔（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラミン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与）下で睡眠モニタリング用のＥＥＧおよびＥＭＧ電極ならびに体温および総運動活性記録用の腹腔内生体遠隔測定トランスデューサーを移植された。手術され、記録チャンバーに慣らされた後２週間目に、体温および運動活性が連続２日間基礎条件下でモニターされた。Ｈ３受容体の機能活性を試験するために、睡眠−覚醒状態に及ぼすＨ３受容体アンタゴニスト・チオペラミドの効果が試験された。マウスは１日目に生理食塩水を、そして次の日にチオペラミドを注射された。注射は明るい期間の開始時に実施し、そして睡眠ＥＥＧが次の６時間記録された。Ｈ３^＋／＋およびＨ３^−／−マウスの第２群が３か月齢においてランニングホイールケージに入れられた。運動活性はＬＤ１２：１２条件下で３週間記録され、次いで、動物は２週間恒常的暗所に移された。結果は図１，パネルＡ，ＢおよびＣに示される。

Ｈ３およびＨ _１受容体結合および活性の測定
膜フラクションの調製
マウスはガス（ＣＯ_２）によって犠牲にされ、そして直ちに断頭された。脳が切除され、使用まで−８０℃で保存された。前脳および小脳組織は氷冷５０ｍＭＮａ／Ｋリン酸バッファー，ｐＨ７．５中でｐｏｌｙｔｒｏｎを用いてホモジナイズされた。ホモジネートは４℃で２０分間５０，０００ｘｇにおいて２回遠心分離された。

ヒスタミンＨ３結合アッセイ
ヒスタミンＨ３受容体結合はＡｒｒａｎｇｅｔａｌ．（１９８３）前出の方法の変法によってアッセイされた。簡単に言えば、インヒビションカーブを試験するために、懸濁液の０．４ｍｌ分量（１０ｍｇ重量の組織）が１．５ｎＭ［^３Ｈ］−Ｒ−α−ＭｅＨＡとともに２５℃で６０分間インキュベートされた。特異的結合は１０μＭチオペラミドによって阻害される結合として定義された。この反応は氷冷バッファー５ｍｌの添加および０．３％ポリエチレンイミンを予めコーティングしたガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｂ）における急速濾過によって終結された。フィルターは氷冷バッファー５ｍｌ容量で３回洗浄され、そしてフィルター上に補足した放射能をＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０ｍｌ中でカウントした。

ヒスタミンＨ _１結合アッセイ
ヒスタミンＨ_１結合はＴｒａｎｅｔａｌ．（１９７８）の方法の変法によってアッセイされた。簡単に言えば、脳膜２５μｇがＰ４５０様タンパク質（Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９４）への結合を防ぐために［^３Ｈ］ピリルアミンおよび１μＭキニンとのリガンド結合アッセイに使用された（２５℃）。０．６２５〜１０ｎＭの［^３Ｈ］ピリルアミン濃度がＳｃａｔｃｈａｒｄ解析のために使用された。非特異的結合は５０μＭトリプロリジンの存在下で決定された。サンプルは上記と同じ方法においてカウントされた。

受動回避試験
装置は２つの小部屋からなった；１つ（９．５ｘ１８．５ｘ１６ｃｍ）は白い壁によって囲まれ、そして６０ワットランプによって照明され、そして他方（９．５ｘ１８．５ｘ１６ｃｍ）は黒い壁によって暗く囲まれている。小部屋はギロチンドア（４．５５４．５ｃｍ）によって分離された。全マウスは試験前６０分間暗いチャンバーに慣らされた。受動回避試験の第１日には、野生型およびノックアウトマウスが２群に分けられた。各遺伝子型の１群はスコポラミン（０．７５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．，試行前３０分）を注射され、一方、他の群は生理食塩水、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ，（１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を注射された。マウスは暗い箱への自由な接近を与える前の３０秒間照明した安全な小部屋に入れられた。マウスは暗い小部屋に逃げる傾向があった。全４個の足が暗い小部屋の鉄格子の床上にある時に、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）定電流フットショック（１ｍＡ，定電圧１２０Ｖ，５０Ｈｚ）が鉄格子に１秒間伝えられた。次いで、マウスはそれらのホームケージに戻された。２４時間後、電気ショックなしに操作が繰り返された。各マウスが暗い小部屋に入る前に経過した時間が測定された。動物が３００秒内に暗い小部屋に入らなかった場合３００秒の潜伏価が指定された。結果は図２、パネルＡおよびＢに示される。

パネルＡ，ＢおよびＣ：ヒスタミンＨ３受容体ノックアウト動物はＨ３アンタゴニスト・チオペラミドに対して非感受性である。両Ｈ３^＋／＋（Ｎ＝６）およびＨ３^−／−（Ｎ＝１０）マウスにおいて明るい期間（ｌｉｇｈｔｐｅｒｉｏｄ）の最初の２時間の間の各々３種のヴィジランス状態（覚醒、ＮＲＥＭおよびＲＥＭ睡眠）において費やされた平均（±ＳＥＭ）パーセント時間。白いバーは基礎となる日に媒質を注射された動物における結果を表し、一方黒いバーは翌日同じ時間にチオペラミドを注射した後の同じ動物により観察された結果を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１（ペアード・ツー・テールド（ｐａｉｒｅｄｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−検定）。パネルＡおよびＢ：Ｈ３ノックアウトマウスは受動回避（ｐａｓｓｉｖｅａｖｏｉｄａｎｃｅ）応答において示されるようにスコポラミンに対する感受性の低下を示す。左パネルは非処置Ｈ３^＋／＋（Ｎ＝２９）およびＨ３^−／−（Ｎ＝４５）マウスにおける結果を示す。マウスが受動的回避チャンバーに入る前に経過した平均（±ＳＥＭ）時間が記録された。右のパネルでは、Ｈ３^＋／＋マウス（Ｎ＝３７）およびＨ３^−／−マウス（Ｎ＝５２）は受動回避チャンバーにおける最初の試験前２０分に腹腔内注射によってスコポラミン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。注射は第２日の試験前には与えられなかった。（ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｃａｎ’ｓ検定、＊ｐ＜０．０５）。

Claims

体細胞および生殖細胞が内因性ヒスタミンＨ３受容体における破壊を含有するトランスジェニックマウスであって、該破壊が非機能的ヒスタミンＨ３受容体による標的置換によって生じ、そして該破壊が野生型ヒスタミンＨ３受容体マウスに比較してスコポラミンの健忘効果に対する非感受性を有する該マウスをもたらす、トランスジェニックマウス。
該マウスが生殖力があり、そして非機能的ヒスタミンＨ３受容体遺伝子をその子孫に伝達する、請求項１のマウス。
非機能的ヒスタミンＨ３受容体遺伝子がマウス胚盤胞への胚性幹細胞のマイクロインジェクションによって胚期におけるマウスの先祖に導入された、請求項１のマウス。
非機能的ヒスタミンＨ３受容体遺伝子がマウス胚盤胞への胚性幹細胞のマイクロインジェクションによって胚期において導入された、請求項１のマウス。
体細胞および生殖細胞が内因性ヒスタミンＨ３受容体遺伝子における破壊を含有し、該破壊が非機能的ヒスタミンＨ３受容体遺伝子による標的置換によって生じるトランスジェニックマウスを生産する方法であって、
（ａ）マウス胚性幹細胞中に選択可能なマーカーを含有するヒスタミンＨ３受容体遺伝子標的構築物を導入し；
（ｂ）胚性幹細胞をマウス胚盤胞中に導入し；
（ｃ）胚盤胞をレシピエントの偽妊娠マウスに移植し；
（ｄ）分娩まで胚盤胞を発生させ；
（ｅ）ゲノムが少なくとも１個の対立遺伝子において内因性ヒスタミンＨ３受容体遺伝子の破壊を含有するトランスジェニックマウスを同定し；そして
（ｆ）段階（ｅ）のマウスを繁殖して、ゲノムが内因性ヒスタミンＨ３受容体遺伝子の同型接合体の破壊を含有し、該破壊が野生型ヒスタミンＨ３受容体マウスに比較してスコポラミンの健忘効果に対する非感受性を有する該マウスをもたらす、トランスジェニックマウスを得ること：
を含む方法。
段階（ａ）の導入がエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって実施される、請求項５の方法。
請求項１のトランスジェニック動物から単離された細胞。