KR20050084318A - 인간 ｃｄ２０을 발현하는 트랜스제닉 마우스 - Google Patents

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앤드류 치-윤 찬
퀴안 공
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Abstract

본 발명은 일반적으로 CD20을 비롯한 인간 세포 마커를 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물 및 이러한 동물을 사용하여 인간 CD20을 보유하는 세포를 고갈시키는데 효과적인 작용제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 상기 트랜스제닉 동물은 항-CD20 요법의 안전성 및 효능 시험에도 유용하다.

Description

인간 ＣＤ２０을 발현하는 트랜스제닉 마우스 {Transgenic Mice Expressing Human CD20}
본 출원은 미국 회사이며 미국에 소재하는 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) (미국을 제외한 모든 국가에서의 출원인), 미국 국적이며 미국에 거주하는 앤드류 치-윤 찬(Andrew Chee-Yuen Chan) (미국의 경우에만 출원인), 중국 국적이며 미국에 거주하는 퀴안 공(Qian Gong) (미국의 경우에만 출원인) 및 루마니아 국적이며 미국에 거주하는 플라비우스 마틴(Flavius Martin) (미국의 경우에만 출원인)의 명의로 모든 국가를 지정국으로 하며 2003년 12월 11일자로 출원된 PCT 국제 특허 출원이며, 2002년 12월 16일자로 출원된 미국 가출원 제60/434,115호 및 2003년 6월 5일자로 출원된 미국 가출원 제60/476,481호를 우선권 주장하고, 이들 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
T 세포 및 B 세포 둘다는 분화 및 식별용 마커로 이용될 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 이러한 인간 B 세포 마커 중 하나가 인간 B 림프구로만 제한된 분화 항원 Bp35이며, 이것은 "CD20"이라고도 알려져 있다. CD20은 초기의 프리-B(pre-B) 세포 발생 동안에 발현되어 형질 세포 분화시까지 유지된다. CD20 분자는 세포 주기 개시 및 분화에 필요한 활성화 과정 중의 한 단계를 조절한다고 여겨진다.
CD20은 정상적인 B 세포 뿐만이 아니라, 계속되는 증식으로 B 세포 림프종을 야기시킬 수 있는 악성 B 세포에도 존재한다. 따라서, CD20 표면 항원은 이 항원에 특이적인 항체를 사용하여 B 세포 림프종을 표적화하기 위한 후보물질로서 기능하는 잠재력을 지닌다. 이들 항-CD20 항체는 정상적인 B 세포 및 악성 B 세포 둘다의 CD20 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하여, B 세포의 파괴 및 고갈을 유도한다. 종양을 파괴하는 잠재력을 지닌 화학적 작용제 또는 방사능 표지를 항-CD20 항체와 접합시켜, 상기 작용제가 신생물 B 세포에 특이적으로 전달되도록 할 수 있다.
CD20을 표적으로 하는 모노클로날 항체의 이용에 대해서는 기재된 바 있다 (예를 들어 문헌 ([Weiner, Semin. Oncol., 26, 43-51 (1999)], [Gopal and Press, J. Lab. Clin. Med., 134, 445-450 (1999)], [White et al., Pharm. Sci. Technol. Today, 2, 95-101 (1999)]) 참조). 리투크산(Rituxan) (상표명)은 림프종으로 새로 진단된 환자 또는 림프종이 재발된 환자에게 단일 작용제로서 또는 화학요법과 병용되어 널리 사용되어 온 키메라 항-CD20 모노클로날 항체이다 ([Davis et al, J. Clin. Oncol., 17, 1851-1857 (1999)], [Solal-Celigny et al., Blood, 94, abstract 2802 (1999)], [Foran et al., J. Clin. Oncol., 18, 317-324 (2000)]). 방사성표지된 항체 접합체의 이용에 관하여도 기재된 바 있다 (예를 들어 베크사르(Bexxar) (상표명), [Zelenetz et al., Blood, 94, abstract 2806 (1999)]).
또한, CD20을 표적으로 하는 항체의 용도는 특히 자가면역을 비롯한 기타 상태에 관하여도 기재된 바 있다. 예를 들어, 항-CD20 항체 요법은 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 및 강직성 척추염의 치료에 평가되어 왔거나 평가되고 있다 [Protheroe et al., Rheumatology 38:1150 (1999)]. 기타 자가면역 상태, 예를 들어 자가면역 혈소판감소증 및 호중구감소증 및 자가면역성 용혈성 빈혈 등이 B 세포 고갈을 일으키는 항-CD20 항체 처치에 관하여 조사되어 왔다 ([Trape et al., Haematologica 88:223 (2003)], [Arzo et al., Annals of Rheumatic Diseases 61:922 (2002)]).
인간 림프종 및 기타 장애에서 CD20이 유의한 역할을 수행함에도 불구하고, 상기 인간 마커를 발현하는 동물 모델은 없다. 따라서, 질환 연구 및 제약상 약물 개발을 위한 관련 동물 모델이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 인간 세포 마커, 구체적으로는 CD20을 발현하는 비-천연 발생 비-인간 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 트랜스제닉 동물은 CD20 관련 질환 또는 상태, 예를 들어 암에 관한 신규 치료제를 확인하고 시험하는 시스템을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 동물은 CD20 관련 요법의 효능 및 독성 시험에 유용하다.
본 발명은 게놈에 이종 CD20, 바람직하게는 인간 CD20을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 발생 트랜스제닉 동물을 제공한다. 상기 뉴클레오티드 서열이 인간 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결되어, 인간 CD20이 B 림프구의 표면에서 발현되는 것이 바람직하다. 본 발명의 트랜스제닉 동물에게 항-인간 CD20 항체를 투여하면, 인간 CD20을 발현하는 B 림프구가 고갈된다. 한 실시양태에서, 인간 CD20 트랜스제닉 마우스는 인간 CD20이 세포상에서, 이 발현 세포에 항-인간 CD20 항체가 결합하여 상기 세포를 사멸시키기에 충분한 수준으로 발현되어 말초 B 세포 및(또는) 순환하는 B 세포의 적어도 약 75％, 더욱 바람직하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 99％, 심지어는 100％를 고갈시킨다는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에 따라, 동물의 게놈이 상동성 내인성 CD20 유전자를 포함하는 경우에는 상기 유전자를 파괴시키거나 녹아웃시켜서 상기 내인성 분자가 세포 표면상에서 발현되지 못하게 한다.
추가로, 본 발명은 B 세포 림프종을 치료할 수 있는지를 확인할 작용제를 B 림프구상에서 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 동물에게 투여하는 단계, 및 B 림프구의 수가 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종을 치료할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 CD20을 발현하는 세포를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는지를 확인할 작용제를 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 동물에게 투여하는 단계, 및 상기 세포의 림프구의 수가 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 인간 CD20을 발현하는 세포를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 이러한 방법에 따라 확인된 작용제도 제공한다.
또한, 본 발명의 동물은 항-CD20 치료제를 본 발명의 트랜스제닉 동물에 투여함으로써 상기 치료제의 독성을 평가하는 데에도 유용하다. 치료 특이성, 독성 및 효능은, 작용제에 의한 효과를 야생형 동물 또는 작용제를 처치하지 않은 트랜스제닉 동물에서의 효과와 비교하여 결정할 수도 있다.
본 발명의 비-인간 트랜스제닉 동물은 특정 작용제의 인간 투여에 관한 안전성 지표를 추가로 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 다른 작용제를 트랜스제닉 동물에게 투여할 수 있고, 인간에게 생체내 사용하기 위한 인간화 항체 또는 작용제의 안전성 및 허용성에 관한 지표로서 상기 작용제를 상기 동물에게 투여한 결과로서 발생되는 독성 또는 부작용을 모니터링하거나 확인할 수 있다. 단기적으로 발생할 수 있는 부작용으로는 두통, 감염, 열병, 오한, 동통, 구역, 무력증, 인두염, 설사, 비염, 주입 반응(infusion reaction) 및 근육통 등이 있다. 단기적인 부작용은 처치후의 일수(day)로 측정한다. 장기적인 부작용으로는 특정 세포형의 세포독성, 혈소판감소증으로 인한 출혈 사건, 염증 반응 및(또는) 알레르기 반응으로 인한 매개자의 방출, 면역계의 억제 및(또는) 항-치료제 항체의 발생, 말단 기관에의 독성 및 감염률이나 악성도의 증가 등이 있다. 장기적인 부작용은 처치후의 개월수로 측정한다.
본 발명의 또다른 측면은 항-CD20 작용제의 효능을 결정하는 방법을 포함한다. 효능은 소정 범위의 투여량의 작용제를 인간 CD20을 갖는 트랜스제닉 동물 세트에게 투여하고, 상기 작용제에 의해 인간 CD20을 보유하는 세포가 감소되는 하나 이상의 투여량을 측정하여 결정할 수 있다.
도 1은 트랜스진(transgene)이 없는 마우스 (Tg-), 트랜스진에 대한 이형접합 마우스 (Tg+/-) 및 동형접합 마우스 (Tg+/+)에서 유래된 마우스 B220+ 세포에서의 인간 CD20 발현을 나타낸다.
도 2는 B 세포 분화 및 성숙 동안 각종 세포 표면 마커 (CD43, IgM, IgD)의 발현에 대한 개략도를 제공한다. Tg+ 마우스에서, hCD20은 프리-B 세포, 미성숙 B 세포 및 성숙 B 세포상에서 발현된다.
도 3은 골수의 B 세포에서의 인간 CD20 발현에 대하여 Tg+ 마우스를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 세포를 FITC (BD 파르밍겐(BD Pharmingen))에 접합시킨 항-인간 CD20으로 염색하였다. B220 및 CD43의 존재에 대한 세포 게이팅(gating)을 통해, 여러 B 세포 집단으로 분류할 수 있다. 게이팅을 위해서, 세포를 PerCP (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-B220 Ab 및 PE (형광, BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-CD43 Ab로 염색하였다.
도 4는 비장의 B 세포에서의 인간 CD20 발현에 대하여 Tg+ 마우스를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 세포를 FITC (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-인간 CD20으로 염색하였다. B220 및 CD21에 대한 세포 게이팅을 통해, 여러 B 세포 집단으로 분류할 수 있다. 게이팅을 위해서, 세포를 PerCP (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-B220 Ab 및 PE (형광, BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-CD21 Ab로 염색하였다. 인간 CD20을 보유하는 B 세포는 T1 대역, 변연대 및 T2/소포성 대역(Follicular zone)에서 발견되었다.
도 5는 장간막 림프절의 B 세포에서의 인간 CD20 발현에 대하여 Tg+ 마우스를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 세포를 FITC (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-인간 CD20으로 염색하였다. B220 및 CD21에 대한 세포 게이팅을 통해, 여러 B 세포 집단으로 분류할 수 있다. 게이팅을 위해서, 세포를 PerCP (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-B220 Ab 및 PE (형광, BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-CD21 Ab로 염색하였다.
도 6은 파이어반(Peyer's Patch)의 B 세포에서의 인간 CD20 발현에 대하여 Tg+ 마우스를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 세포를 FITC (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-인간 CD20으로 염색하였다. B220 및 CD38에 대한 세포 게이팅을 통해, 여러 B 세포 집단으로 분류할 수 있다. 게이팅을 위해서, 세포를 PerCP (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-B220 Ab 및 PE (형광, BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-CD38 Ab로 염색하였다. 인간 CD20을 함유하는 B 세포는 성숙 B 세포 및 배중심 B 세포이다.
도 7은 Tg+ 마우스로의 항-인간 CD20 mAb 투여 및 인간 CD20을 보유하는 세포의 존재 또는 부재에 대한 분석에 관한 개략도이다. 항-인간 CD20 모노클로날 항체를 1 mg의 단일 투여량으로 제0일에 투여하였다. 제-1일, 제1일, 제2일, 제3일, 제4일, 제7일, 제14일 및 제21일에 샘플을 채취하였다. 말초혈 비장, 림프절, 골수 및 파이어반과 같은 여러 조직의 샘플을 전술한 바와 같이 FACS로 분석하였다. 항-CD20 모노클로날 항체의 혈청 수준도 모니터링하였다.
도 8은 항-인간 CD20 mAb m2H7 (BD 파르밍겐)로 처치한 트랜스제닉 마우스에서 말초 B 세포가 고갈됨을 보여준다. 상기 항체를 도 7의 개략도에 약술한 바와 같이 총 1 mg의 투여량으로 트랜스제닉 마우스에 투여하였다. 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어반에 대한 FACS 분석을 실시하여 전술한 바와 같이 게이팅하였다.
도 9는 항-인간 CD20 mAb m2H7로 처치한 트랜스제닉 마우스에서 성숙 말초 림프절 B 세포가 고갈됨을 보여준다. 상기 항체를 도 7의 개략도에 약술한 바와 같이 총 1 mg의 투여량으로 트랜스제닉 마우스에 투여하였다. 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어반에 대한 FACS 분석을 실시하여 전술한 바와 같이 게이팅하였다.
도 10은 항-인간 CD20 mAb m2H7로 처치한 트랜스제닉 마우스에서의 비장 T2 B 세포 및 소포성 B 세포 고갈을 나타낸다. 상기 항체를 도 7의 개략도에 약술한 바와 같이 총 1 mg의 투여량으로 트랜스제닉 마우스에 투여하였다. 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어반에 대한 FACS 분석을 실시하여 전술한 바와 같이 게이팅하였다.
도 11은 항-인간 CD20 mAb m2H7로 처치한 트랜스제닉 마우스에서 재순환하는 성숙 B 세포가 고갈됨을 보여준다. 상기 항체를 도 7의 개략도에 약술한 바와 같이 총 1 mg의 투여량으로 트랜스제닉 마우스에 투여하였다. 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어반에 대한 FACS 분석을 실시하여 전술한 바와 같이 게이팅하였다.
도 12는 항-인간 CD20 mAb m2H7로 처치한 트랜스제닉 마우스에서 성숙 B 세포가 고갈되며 파이어반 배중심 B 세포는 고갈에 대해 내성이 있음을 보여준다. 상기 항체를 도 7의 개략도에 약술한 바와 같이 총 1 mg의 투여량으로 트랜스제닉 마우스에 투여하였다. 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어반에 대한 FACS 분석을 실시하여 전술한 바와 같이 게이팅하였다.
도 13은 항-CD20 mAb 투여 후의 B 세포 고갈 및 회복을 나타낸다. 제1일에 항체를 마우스에게 투여하였다. 항체 처치후 제6일에 말초혈에서는 인간 CD20을 발현하는 B 세포가 검출가능하지 않았다. 제6주에는 항체 제거 후에 hCD20+ 세포가 검출되기 시작했다. 제14주에는 B 세포가 정상적인 수준으로 회복되었다고 여겨진다. 회복은, CD20을 발현하지 않던 전구 B 세포가 이후에 인간 CD20+을 보유하는 성숙 B 세포가 되었기 때문이다.
도 14는 단기적인 항-CD20 mAb 요법에 대한 비장 배중심 B 세포의 내성을 지시하는 FACS 플롯을 보여준다. 마우스를 면역화하지 않거나 제1일에 양의 적혈구 (SRBC; Sheep Red Blood Cell)를 복강내 주사하여 면역화함으로써 비장에서 배중심을 유도하였다. 배중심은 제7일에 나타났다. 제8일에는 마우스 군 중 하나를 항-CD20 항체 m2H7로 처치하였다. 대조군 세트의 마우스에는 mIgG2a 이소형(isotype) 대조군 항체를 처치하였다. 제12일에는 마우스의 비장 세포를 분석하였다. 배중심을 염색하는 PNA (PeaNut Agglutinin, 피넛 응집소)를 사용하였다. SRBC로 면역화되지 않은 마우스의 비장에서는 검출가능한 배중심 세포가 나타나지 않았지만, 면역화된 마우스의 비장은 0.3％의 PNA 염색 세포를 나타낸다. T2/소포성 B 세포는 항-CD20 항체 처치로 고갈되었지만, 비장의 변연 중심 B 세포는 상기 항체에 내성이 있었다.
도 15는 항-CD20 mAb를 처치한 마우스 및 대조군에서의 T 세포-비의존성 반응을 보여준다. 제0일에 마우스를 m2H7 또는 이소형 대조군 항체 mIgG2a로 처치하였다. 제3일 내지 제7일에는 B 세포 고갈이 발생하였다. 제7일에는 스트렙토콕쿠스 뉴모니아애(Streptococcus Pneumoniae) IV를 마우스에게 정맥내 주사하여 다당류에 대한 반응을 유도하였다. T 세포-비의존성 반응은 제11일에 발생하였다. 상기 결과는 항-인간 CD20 m2H7의 처치가 변연대 및 B1 세포의 B 세포 반응에 영향을 미치지 않으며, 즉 고갈되지 않은 MZ 및 B1 B 세포가 T-비의존성 항원에 대한 보호를 부여함을 입증한다.
도 16은 Tg+ 마우스에서 BR3 및 2H7 항체를 처치한 효과를 비교한 것을 보여준다. 인간 CD20을 코딩하는 박테리아 인공 염색체를 발현하는 인간 CD20 트랜스제닉 마우스 (hCD20+ 마우스라 지칭함)에게 항-CD20 mAb (제9일에 100 ㎍을 1회 주사함), BR3-Fc (제1일 내지 제12일에 격일로 100 ㎍씩 주사함) 또는 항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 배합물을 복강내 주사하였다. 각 군은 4 마리의 마우스로 구성되었다. 마지막 주사를 하고 2일이 지난 후에 마우스를 희생시켜 hCD20+ B 세포에 대해 분석하였다. 비장, 혈액, 림프절 및 파이어반의 FACS 분석을 B 세포 마커 (CD21+CD23+)에 대해 실시하였다. 항-CD20 mAb 요법은 비장에서 T2 및 소포성 B 세포는 고갈시켰지만 변연대 B 세포는 고갈시키지 못하였고, BR3-Fc 처치는 비장에서 T2/소포성 B 세포 및 변연대 B 세포를 감소시켰다.
도 17은 항-CD20 mAb 처치가 파이어반에 효과가 없음을 보여준다. 인간 CD20을 코딩하는 박테리아 인공 염색체를 발현하는 인간 CD20 트랜스제닉 마우스 (hCD20+ 마우스라 지칭함)에게 항-CD20 mAb (제9일에 100 ㎍을 1회 주사함), BR3-Fc (제1일 내지 제12일에 격일로 100 ㎍씩 주사함) 또는 항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 배합물을 복강내 주사하였다. 각 군은 4 마리의 마우스로 구성되었다. 마지막 주사를 하고 2일이 지난 후에 마우스를 희생시켜 hCD20+ B 세포에 대해 분석하였다. 비장, 혈액, 림프절 및 파이어반의 FACS 분석을 B 세포 마커 (CD21+CD23+)에 대해 실시하였다. BR3-Fc 또는 2H7 또는 이들 2종의 배합물 그 어느 것도 파이어반의 배중심 B 세포에는 영향을 미치지 않았다.
도 18은 형질 세포가 장기적인 항-CD20 mAb 처치 후에 고갈되지 않음을 보여준다. 인간 CD20에 대해 양성인 트랜스제닉 Tg+ 마우스에게 전술한 바와 같이 항-인간 CD20 mH27 항체를 처치하였다. 마우스의 골수 및 비장에서 신디칸 (CD-138 형질 세포 마커)에 양성인 세포를 검출함으로써 상기 마우스를 형질 세포의 존재 또는 부재에 대해 분석하였다. 또한, 항-인간 CD20 처치 후에 IgA 또는 IgM 양성 형질 세포의 수를 모니터링하였다. 상기 결과는 Tg+ 마우스의 형질 세포가 항-인간 CD20 항체 처치에 영향을 받지 않음을 보여주며, 이것은 상기 Tg+ 마우스가 여전히 항체 생성 능력이 있음을 지시한다.
도 19는 Tg+ 마우스에서 PK-136 mAb에 의해 NK 세포가 고갈됨을 보여준다. PK-136 mAb (마우스 NK1.1에 특이적임)를 생성하는 하이브리도마 클론은 ATCC로부터 입수하였다. 4개 군의 인간 CD20 트랜스제닉 마우스에게 대조군 mAb, PK-136, 항-CD20 mAb 및 PK-136/항-CD20의 배합물을 각각 복강내 주사하였다. 복강내 투여된 투여량은 다음과 같았다:
대조군 mAb: 1회 복강내 투여시 200 ㎍씩, 1주 동안 3회 복강내 투여
PK-136: 1회 복강내 투여시 200 ㎍씩, 1주 동안 3회 복강내 투여
항-CD20 mAb: 1회 복강내 투여시 10 ㎍씩, 1회 투여.
항체 처치 후에 말초혈, 간 및 비장의 NK 세포를 분석하였다. 데이타는 평균±표준 오차 (n = 8)로 표현하였다.
도 20은 Tg+ 마우스에서 NK 세포가 2H7-매개된 B 세포 고갈에서 역할을 수행함을 보여준다. PK-136 mAb (마우스 NK1.1에 특이적임)를 생성하는 하이브리도마 클론은 ATCC로부터 입수하였다. 4개 군의 인간 CD20 트랜스제닉 마우스에게 대조군 mAb, PK-136, 항-CD20 mAb 및 PK-136/항-CD20의 배합물을 각각 복강내 주사하였다. 복강내 투여된 투여량은 다음과 같았다:
대조군 mAb: 1회 복강내 투여시 200 ㎍씩, 1주 동안 3회 복강내 투여
PK-136: 1회 복강내 투여시 200 ㎍씩, 1주 동안 3회 복강내 투여
항-CD20 mAb: 1회 복강내 투여시 10 ㎍씩, 1회 투여.
항-CD20 mAb의 복강내 주사 후 제3일에 말초혈, 림프절 및 비장의 림프구를 분석하였다. 데이타는 평균±표준 오차 (n = 8)로 표현하였다.
도 21A는 인간 CD20의 아미노산 서열 (서열 1) (진뱅크 접속 번호 BC002807)을 보여주고, 도 21B는 인간 CD20의 cDNA 서열 (서열 2) (진뱅크 접속 번호 BC002807)을 보여주며, 도 21C는 인간 CD20의 게놈 서열 (서열 3) (진뱅크 접속 번호 AH005353)을 보여준다. 도 21D는 뮤린 CD20의 cDNA 서열 (서열 4) (진뱅크 접속 번호 M62541)을 보여준다.
도 22는 인간 CD20 트랜스제닉 마우스의 말초혈 세포상에서의 인간 CD20 발현 수준을 인간 말초혈 세포상에서의 CD20 발현 수준과 비교한 대표적인 비교예를 나타낸다. 인간 공여자 및 hCD20Tg+ 마우스로부터 말초혈 세포를 수득하고, 표지된 항-인간 CD20 항체 (mH27)로 염색하였다. 세포를 FACS로 분석하고 인간 CD19+ 및 B220+ 집단에 대해 게이팅하였다. 그래프상의 수치는 평균 형광 강도를 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 다음과 같은 용어는 하기하는 의미를 갖는다:
용어 "구조물" 또는 "표적화 구조물"은 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 표적화 영역은 표적 조직, 표적 세포 또는 표적 동물의 내인성 서열에 실질적으로 상동성이며 표적화 구조물을 표적 조직, 표적 세포 또는 표적 동물의 게놈 내로 통합시키는 서열을 포함한다. 전형적으로, 표적화 구조물은 특정 관심 유전자 또는 특정 관심 핵산 서열, 마커 유전자 및 적절한 제어 서열을 포함한다.
용어 "CD20"은 특정한 면역계 세포상에서 발현되는 세포 표면 단백질, 구체적으로는 B 림프구로 제한된 분화 항원 Bp35를 지칭한다. "천연 발생 CD20"은 자연계에서 수득되는 단백질의 아미노산 서열을 가지며, 대립유전자 변이체, 이소형 및 말단절단(truncated) 형태 등을 비롯한 천연 발생 변이체 형태를 포함한다. 더욱 구체적으로, "CD20"은 인간 CD20 (AH003353; 진뱅크 접속 번호 M27395 및 J03574)을 포함한다. 인간 CD20 및 뮤린 CD20의 대표적인 아미노산 서열, cDNA 서열 및 게놈 서열을 도 21에 나타내었다. 본 발명은 또한 CD20 변이체도 고려한다. 상기 변이체는 통상적으로 공지된 기술을 통해 공급원 서열과 비교할 때 변화된 것으로서, 천연 발생 인간 CD20의 생물학적 활성을 보유하는 것이 바람직하다. 상기 변이체는 천연 발생 인간 CD20의 아미노산 위치 170 및 172에서는 변화되지 않는 것이 바람직한데, 문헌 [Polyak et al., Blood 99:3256 (2002)]에 기재된 바와 같이 상기 위치가 여러가지 상이한 항-인간 CD20 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프의 일부인 것으로 밝혀졌기 때문이다.
유전자의 "파괴"는 DNA 단편이 배치되어 내인성 상동성 서열과 재조합되는 경우에 발생한다. 이러한 서열 파괴 또는 서열 변형으로는 DNA 서열의 삽입, 미스센스(missense), 프레임쉬프트(frameshift), 결실 또는 치환이나 대체, 또는 이들의 임의의 조합 등을 들 수 있다. 삽입은 동물, 식물, 진균, 곤충, 원핵 또는 바이러스 기원의 것일 수 있는 전체 유전자의 삽입을 포함한다. 파괴는 예를 들어 정상적인 유전자 생성물의 생성을 부분적으로 또는 완전하게 억제하거나 또는 정상적인 유전자 생성물의 활성을 증진시킴으로써 정상적인 유전자 생성물을 변경시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 파괴는 유전자의 유의한 발현이 없는 널(null) 파괴이다.
용어 "내인성 좌위"는 트랜스제닉이 될 숙주 동물에서 발견되는 천연 발생 유전자 좌위를 포함하는 의미이다.
용어 "이종"은 폴리펩티드 또는 유전자와 관련되어 사용될 때 트랜스제닉 비-인간 숙주 동물에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 트랜스제닉 비-인간 숙주 동물에서 발견되지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 지칭한다. 따라서, 인간 CD20 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스는 이종 CD20 유전자를 갖는다고 할 수 있다. 트랜스진은 PCR, 웨스턴 블럿 또는 써던 블럿 등을 비롯한 각종 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 용어 "인간 내인성 프로모터"는 트랜스제닉 동물을 형성할 동물에 도입될 인간 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 천연적으로 결합되어 있는 프로모터이다.
용어 "비-인간 동물"은 포유동물, 조류, 파충류 및 양서류 등과 같은 임의의 척추동물을 포함하는 것이다. 적합한 포유동물로는 설치류, 비-인간 영장류, 양, 개 및 소 등이 있다. 적합한 조류로는 닭, 거위 및 칠면조 등이 있다. 바람직한 비-인간 동물은 래트 및 마우스 등을 비롯한 설치류 족에서 선택되며, 가장 바람직한 것은 마우스이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "천연 발생" 또는 "천연적으로 결합되어 있는"이 대상물에 적용된 경우에는 그 대상물이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 가리킨다. 예를 들어, 자연계 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하며 실험자가 의도적으로 변형시킨 것이 아닌 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생이다.
핵산에 대한 용어 "실질적인 상동성"은 2개의 핵산 또는 그의 지정된 서열을 최적으로 정렬하여 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가진 상태로 비교하는 경우에 이들이 서로와 약 80％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 81％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 83％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 84％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 85％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 86％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 87％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 88％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 89％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 91％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 92％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 93％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 94％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 96％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 97％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 98％의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 99％의 서열 동일성을 갖는다는 것을 지시한다. 별법으로, 상기 절편들이 선택적인 혼성화 조건하에서 상기 가닥의 상보체에 혼성화되는 경우에는 실질적인 상동성이 존재한다. 2개의 서열을 정렬하고 동일성(％)를 확인하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 동일성(％) 결정에는 여러가지 컴퓨터 프로그램을 활용할 수 있다. 핵산 서열 동일성(％)을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있으며, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 등과 같이 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용할 수 있다. 당업자는 비교될 서열 전장에 걸친 최대 정렬 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 결정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
"전사 조절 서열"은 그와 작동가능하게 연결된 단백질 코딩 서열의 전사를 유도하거나 제어하는 개시 신호, 인핸서 및 프로모터 등과 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 트랜스진의 전사는 발현이 의도되는 세포형에서 재조합 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 서열 (또는 다른 전사 조절 서열)의 제어를 받는다. 또한, 재조합 유전자가 CD20의 천연 발생 형태의 전사를 제어하는 서열과 동일하거나 상이한 전사 조절 서열의 제어를 받을 수 있음도 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 본원에 기재한 방법 등과 같은 인간 개입의 방법에 의해 세포 내로 도입된 핵산 서열 (예를 들어 CD20을 코딩하는 핵산 서열)을 의미한다. 트랜스진은 그것이 도입된 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 세포에 부분적으로 또는 전체적으로 이종일 수 있으며, 즉 외래의 것일 수 있다. 트랜스진은 1개 이상의 전사 조절 서열 및 선택된 핵산의 최적 발현에 필요할 수 있는 임의의 다른 핵산, 예를 들어 인트론을 포함할 수 있다.
"트랜스제닉 동물" 또는 "Tg+"는 구별없이 사용되며 임의의 비-천연 발생 비-인간 동물을 포함하는 것이고, 이때 상기 동물의 1개 이상의 세포가 당업계에 공지된 트랜스제닉 기술 등과 같은 인간 개입에 의한 방법으로 도입된 인간 CD20을 코딩하는 이종 핵산을 함유한다. 핵산은 미세주사법 또는 재조합 바이러스를 사용한 감염법 등과 같은 신중한 유전자 조작 방법을 통해 전구 세포에 도입함으로써 직접적으로 또는 간접적으로 세포에 도입된다. 용어 유전자 조작은 전형적인 교배육종(cross-breeding)을 포함하는 것이 아니라 재조합 DNA 분자의 도입을 가리키는 것이다. 상기 분자는 염색체 내에 통합될 수도 있고 염색체외 복제되는 DNA일 수도 있다. 용어 "Tg+"는 인간 CD20에 대해 이형접합 및(또는) 동형접합인 동물을 포함한다.
"CD20 관련 질환"은 세포상에서의 CD20의 발현, B 세포의 이상 증식 또는 이상 활성화와 관련되어 있거나 또는 항-CD20 항체 처치를 받았던 질환 또는 장애를 지칭한다. 예를 들어, 키메라 항-CD20 항체는 림프종 환자를 치료하는데 사용되어 왔다. 항-CD20 요법 처치를 실시해 왔던 다른 질환 또는 상태로는 자가면역 상태 또는 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 및 강직성 척추염 등이 있다. 기타 상태로는 혈액 또는 골수 이식 후의 엡스테인 바르(Epstein Barr) 바이러스 관련 질환, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 관련 다중심성 캐슬맨병, C형 간염 바이러스 관련 한성글로불린혈증 맥관염, 자가면역성 용혈성 빈혈을 수반하는 림프세포증식성 장애 및 ANCA 관련 맥관염 등이 있다.
A. 본 발명의 방식
본 발명은 이종 CD20 마커를 발현하는 트랜스제닉 동물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 인간 CD20 트랜스제닉 동물은 인간과 동일한 유형의 B 세포상에 CD20을 발현한다. 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 제조하려던 이전의 시도는 적절한 B 세포 구획에서 인간 CD20의 발현을 달성하지 못하였거나 충분한 수준으로 달성하지 못하였는데, 이는 트랜스진으로 효과적인 전사 제어 영역을 혼입하지 못했기 때문이다.
본 발명은 인간 대상체와 유사한 방식으로 반응하는 세포를 갖는 트랜스제닉 동물을 제공한다. 항-인간 CD20 항체를 본 발명의 트랜스제닉 동물에게 투여하면, 인간 CD20을 발현하는 B 림프구가 고갈된다. 한 실시양태에서, 인간 CD20 트랜스제닉 마우스는 인간 CD20이 세포상에서, 이 발현 세포에 항-인간 CD20 항체가 결합하여 상기 세포를 사멸시키기에 충분한 수준으로 발현되어 말초 B 세포 및(또는) 순환하는 B 세포의 적어도 약 75％, 더욱 바람직하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 99％, 심지어는 100％를 고갈시킨다는 것을 특징으로 한다. 인간에서도 유사한 반응이 관찰된다. 이들 동물 모델은 CD20 마커에 대한 모노클로날 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않는 작용제의 스크리닝에 사용할 수 있다. 추가로, 트랜스제닉 동물을 이용하여 항-CD20 지시된 요법의 효능 및 독성을 시험할 수 있다.
B. DNA 구조물
전형적으로, 본 발명의 이종 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 벡터, 바람직하게는 DNA 벡터로 삽입되어 적합한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 분자를 복제한다. DNA 구조물은 녹아웃 동물을 위한 표적화 벡터 제조에도 유용할 수 있다.
CD20 좌위를 단리하고 클로닝하여 전달하기 위해서 효모 인공 염색체 (YAC)를 사용할 수 있다. 전체 좌위를 클로닝하여 1개 또는 수개의 YAC 클론에 함유시킬 수 있다. 다수개의 YAC 클론을 사용하고 이들이 중첩되는 상동성 영역을 함유한다면, 이들을 효모 숙주 균주 내에서 재조합하여 전체 좌위를 함유하는 단일 구조물을 생성할 수 있다. 포유동물 선별 카세트를 사용하여 YAC 아암을 추가로 변형시켜, 앞서 약술한 방법에 의한 배아 줄기 세포 또는 배아로의 구조물 도입 보조를 개선할 수 있다.
박테리아 인공 염색체 (BAC) 라이브러리는 높은 안정성 및 비교적 커다란 인서트(insert), 조작 용이성 및 샷건(shotgun) 서열결정으로 인해 관심 유전자에 대한 인간 서열을 제공할 수 있다. BAC 라이브러리는 평균 크기 100 내지 150 kb의 인서트를 함유한다. BAC 클론은 300,000개 염기쌍이나 되는 크기의 인서트를 보유할 수 있다 ([Shizuya, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797], [Kim, et al., (1996) Genomics 34 213-218], [Swiatek, et al., (1993) Genes and Development 7:2071-2084]). 인간 및 마우스의 게놈 BAC 라이브러리가 구축되어 시판되고 있다 (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재하는 인비트로젠(Invitrogen)). 게놈 BAC 라이브러리는 인간 및 뮤린 CD20 유전자 서열 뿐만이 아니라 전사 제어 영역의 공급원으로 기능할 수도 있다.
인간 CD20을 코딩하는 핵산은 당업자에게 공지되어 있다. 인간 CD20의 대표적인 cDNA 서열 (서열 2), 게놈 서열 (서열 3) 및 아미노산 서열 (서열 1)을 도 21에 나타내었다. 그 밖의 서열은 진뱅크, 예컨대 접속 번호 AH003353에서 찾을 수 있다. 뮤린 CD20의 대표적인 cDNA (서열 4)는 도 21D에 나타내었다.
이종 트랜스진은 트랜스제닉 비-인간 동물에서 발현될 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 배선 조절 DNA 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 절편, 또는 주어진 절편 또는 서열의 상류 (5') 또는 하류 (3') 서열에 작동가능하게 (즉, 기능적으로) 연결된 유전자 서열을 의미한다. 근처의 서열은 종종 원하는 세포형에서의 핵산 절편 또는 서열의 프로세싱(processing) 및(또는) 발현에 영향을 미친다.
바람직하게는, 이들 조절 서열은 게놈에서 기원하며, 1개 이상의 인트론을 포함한다. 예를 들어, 트랜스제닉 구조물은 CD20을 코딩하는 유전자의 5'-플랭킹(flanking) 영역에 위치하여 숙주 세포에서 유전자를 복제하고 발현시킬 수 있는 방식으로 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 조절 서열은 CD20과 천연적으로 결합되어 있는 내인성 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 상기 서열이 유래된 동물에서의 발현 수준과 유사한 수준의 조직 특이적 발현을 제공한다. 발현을 최적화하는데 있어서 추가의 플랭킹 서열이 유용하다면, 존재하는 서열을 프로브로서 사용하여 이러한 서열을 클로닝할 수 있다. 트랜스진의 프로세싱 또는 발현을 최대화하는데 필요한 추가의 서열은 게놈 서열에서 유래될 수 있다.
별법으로, 프로모터는 트랜스제닉 숙주 동물에서 상응하는 내인성 유전자와 결합되어 있는 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 뮤린 유전자 CD20 유전자를 상응하는 인간 유전자와의 통합으로 파괴하는 경우, 상응하는 인간 유전자를 통합시켜 내인성 뮤린 CD20에 대한 뮤린 전사 제어 영역에 작동가능하게 연결시키는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 조절 서열은 적절한 세포에서 항체를 사용한 검출법 등과 같은 표준 방법을 이용하여 검출될 수 있는 발현 수준의 트랜스진 발현을 제공한다. 한 실시양태에서, 조절 서열은 인간 CD20 트랜스진의 발현을 인간 세포상에서의 CD20 발현의 40％ 이상의 수준으로 제공한다.
본원에 기재한 바와 같이, 트랜스진을 코딩하는 발현 시스템 또는 구조물은 상기 DNA 서열의 3' 비번역 영역 하류를 포함할 수도 있다. 이러한 영역은 발현 시스템의 RNA 전사체를 안정화시켜서 상기 발현 시스템으로부터 원하는 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다. 3' 비번역 영역 중에서 본 발명의 구조물에 유용한 것은 폴리A 신호를 제공하는 서열이다. 이러한 서열은 예를 들어 SV40의 작은(small) t 항원, CD20 비번역 영역 또는 당업계에 공지된 다른 3' 비번역 서열로부터 유래할 수 있다.
임의로, 발현 시스템 또는 구조물은 프로모터 서열 및 신호 서열을 코딩하는 DNA 서열 사이에 5' 비번역 영역을 포함한다. 이러한 비번역 영역은 프로모터가 유래된 것과 동일한 제어 영역으로부터 유래된 것일 수도 있고 또는 프로모터가 유래된 것과 상이한 유전자로부터 유래된 것, 예를 들어 다른 합성, 반합성 또는 천연 공급원으로부터 유래한 것일 수도 있다.
추가로, 트랜스진과 천연적으로 결합되어 있는 것이 아닌 다른 프로모터 서열 또는 다른 전사 조절 서열을 이용할 수 있다. 예를 들어, 이종 프로모터는 발현 수준 또는 조직 특이적 발현을 증진시킬 수 있다. 프로모터가 비-인간 동물 또는 원하는 조직 유형에서 기능하기만 한다면 상이한 강도의 각종 프로모터를 이용할 수 있다. 많은 프로모터들이 당업자에게 공지되어 있다.
발현 시스템은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현 시스템은 더 큰 플라스미드의 일부로서 제조될 수 있다. 이러한 제조는 당업계에 공지된 바와 같은 효율적인 방식으로 정확한 구조물을 클로닝하고 선별할 수 있게 한다. 발현 시스템은 플라스미드상의 편리한 제한 부위 사이에 위치시킬 수 있어서, 나머지 플라스미드 서열로부터 쉽게 단리하여 원하는 포유동물로 혼입할 수 있다. 인간 CD20을 코딩하는 DNA 구조물은 조직 특이적 발현을 위해 천연적으로 결합되어 있는 전사 조절 서열을 포함하는 박테리아 인공 염색체를 포함하는 것이 바람직하다.
플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 각종 방법은 당업계에 공지되어 있다. 유전자 재조합 절차 뿐만이 아니라 원핵 세포 및 진핵 세포 둘다를 위한 다른 적합한 발현 시스템에 관해서는 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17]을 참조한다.
C. 트랜스제닉 동물의 생성
녹아웃 및 녹인(knock-in)을 포함하는 본 발명의 트랜스제닉 동물을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (일반적으로는 문헌 [Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)] 참조). 한 실시양태에서, 트랜스제닉 마우스의 생성은 임의로 뮤린 마커의 유전자 좌위를 파괴하는 단계, 및 인간 마커를 코딩하는 유전자를 뮤린 게놈으로 바람직하게는 내인성 유전자와 동일한 위치에서 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 인간 CD20을 뮤린 게놈에 도입한 트랜스제닉 마우스 모델을 생성한다 (huCD20+; 다르게는 huCD20Tg+라고도 지칭함). 뮤린 림프구상에는 내인성 뮤린 CD20 폴리펩티드가 존재하지만, 공지된 항-인간 CD20 모노클로날 항체는 뮤린 B 세포에 결합하지 않는다. 따라서, 내인성 뮤린 CD20 유전자를 파괴할 필요는 없으나 원한다면 파괴할 수도 있다. 내인성 뮤린 CD20을 파괴하지 않은 경우에는 인간 CD20을 코딩하는 유전자를 뮤린 CD20을 코딩하는 유전자 위치 이외의 위치에 삽입하는 것이 바람직하다.
내인성 좌위의 불활성화
바람직한 실시양태에서, 내인성 좌위의 불활성화는 배아 줄기 세포에서 상동성 재조합을 통한 표적화된 파괴에 의해 달성된다. 한 실시양태에서, DNA를 숙주 세포에 도입하고 내인성 좌위에서 재조합하여 내인성 CD20의 생성을 파괴한다. 표적화 구조물은 당업계에 공지된 표준 방법 (예를 들어 문헌 ([Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York], [E. N. Glover (eds.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II], [M. J. Gait (ed.), 1984, Oligonucleotide Synthesis], [B. D. Hames ＆ S. J. Higgins (eds.), 1985, Nucleic Acid Hybridization], [B. D. Hames ＆ S. J. Higgins (eds.), 1984, Transcription and Translation], [R. I. Freshney (ed.), 1986, Animal Cell Culture; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986], [B. Perbal, 1984, A Practical Guide To Molecular Cloning], [F. M. Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc.]을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적화 구조물은 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있는데, 이때의 서열들은 합성, 천연 공급원으로부터의 단리, 조작, 클로닝, 라이게이션, 시험관내 돌연변이 유발, 프라이머 복구 등에 적용될 수 있다. 다양한 단계에서, 연결된 서열들을 클로닝하고 제한 분석, 서열결정 등으로 분석할 수 있다.
표적화 DNA는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 표적화 DNA는 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성, 이중 가닥 DNA 주형의 닉(nick)-번역, 서열의 중합효소 연쇄 반응 증폭 (또는 리가제 연쇄 반응 증폭), 관심 서열 (예를 들어 클로닝된 cDNA 또는 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 전술한 조합 중 임의의 것으로부터의 서열)을 보유하는 원핵 또는 표적 클로닝 벡터의 정제, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, YAC, 코스미드, BAC, 박테리오파지 DNA, 다른 바이러스 DNA 또는 복제 중간체 또는 이들의 정제된 제한 단편의 정제 뿐만이 아니라 원하는 뉴클레오티드 서열의 단일 가닥 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 다른 공급원으로부터 수득할 수 있다. 또한, 상동성 길이는 당업계에 공지된 방법으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 소정의 내인성 표적 DNA 서열(들)의 서열 조성 및 복잡성을 기초로 하여 선택할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 표적화 구조물은 파괴될 CD20 유전자 영역 또는 그의 일부에 상동성인 제1 서열 (또는 아암) 및 상기 유전자의 제2 영역 또는 그의 일부에 상동성인 제2 서열을 포함하는 표적화 영역을 포함한다. 표적화 구조물은 바람직하게는 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열 사이에 위치하는 양성 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 양성 선별 마커는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동적으로 연결될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 표적화 구조물은 바람직하게는 표적화 구조물의 상동성 아암 중 하나 또는 둘다의 밖에 위치하는 선별가능한 음성 마커, 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스 tk (HSV-tk) 유전자 등을 비롯한 1개 초과의 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 선별가능한 음성 마커는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동적으로 연결될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,464,764호, 동 제5,487,992호, 동 제5,627,059호 및 동 제5,631,153호 참조).
일단 적절한 표적화 구조물이 제조되면, 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 상기 표적화 구조물을 적절한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 본 발명에는 다양한 기술을 이용할 수 있으며, 예를 들어 전핵 미세주사법, 배선으로의 레트로바이러스-매개된 유전자 이동법, 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화법, 배아의 전기천공법, 정자-매개된 유전자 이동법 및 인산칼슘/DNA 공동침전법, 핵으로의 DNA 미세주사법, 무손상 세포와 박테리아 원형질체의 융합법, 형질감염법, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴 등과 같은 다중양성자를 사용한 방법 등을 들 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제4,873,191호, [Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152], [Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321], [Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814], [Lavitrano et al., 1989, Cell, 57:717-723] 참조). 포유동물 세포를 형질전환시키기 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 ([Gordon, 1989, Intl. Rev. Cytol., 115:171-229], [Keown et al., 1989, Methods in Enzymology], [Keown et al., 1990, Methods and Enzymology, Vol. 185, pp. 527-537], [Mansour et al., 1988, Nature, 336:348-352]) 참조).
본 발명의 실시에는 상동성 재조합이 가능한 임의의 세포형을 사용할 수 있다. 이러한 표적 세포의 예로는 인간, 소 종, 양 종, 뮤린 종, 유인원 종과 같은 포유동물을 비롯한 척추동물 및 기타 진핵 유기체, 예컨대 섬유상 진균 및 다세포 고등 유기체, 예컨대 식물로부터 유래된 세포 등이 있다.
바람직한 세포형은 전형적으로 시험관내 배양한 이식전(pre-implantation) 배아로부터 수득된 배아 줄기 (ES) 세포를 포함한다 (예를 들어 문헌 ([Evans, M. J. et al., 1981, Nature 292:154-156], [Bradley, M. O. et al., 1984, Nature 309:255-258], [Gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069] 및 [Robertson et al., 1986, Nature 322:445-448]) 참조). 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 표적화 구조물을 도입할 ES 세포를 배양하고 준비한다 (예를 들어 문헌 ([Robertson, E. J. ed. "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, a Practical Approach", IRL Press, Washington D. C., 1987], [Bradley et al., 1986, Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371], [Hogan et al., in "Manipulating the Mouse Embryo": A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N. Y., 1986], [Thomas et al., 1987, Cell 51:503], [Koller et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10730], [Dorin et al., 1992, Transgenic Res. 1:101] 및 [Veis et al., 1993, Cell 75:229]) 참조). 표적화 구조물이 삽입된 ES 세포는 이들이 도입될 발생 중인 배아와 동일 종의 배아 또는 포배에서 유래한다. 전형적으로, ES 세포는 내부 세포괴(cell mass)로의 통합 능력 및 포유동물의 배아에 포배 발생 단계에서 도입될 때 개체의 배선에 기여하는 능력으로 선별된다. 따라서, 이러한 능력이 있는 임의의 ES 세포주가 본 발명을 실시하는데 사용하기 적합하다.
표적화 구조물을 세포에 도입한 후, 성공적인 유전자 표적화가 일어난 세포를 확인한다. 전형적으로, 표적화된 유전자로의 표적화 구조물의 삽입은 세포를 마커 유전자의 발현에 대하여 확인함으로써 검출된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 표적화 구조물로 형질전환된 세포에 선별가능한 마커를 발현하지 않는 세포에 대해 선택한 적절한 작용제를 처치한다. 특정 조건하에서는 선별가능한 마커 유전자를 발현하는 세포만이 생존하고(하거나) 성장한다. 예를 들어, 도입된 네오마이신 내성 유전자를 발현하는 세포는 화합물 G418에 내성이 있지만, neo 유전자 마커를 발현하지 않는 세포는 G418로 인해 사멸한다. 표적화 구조물이 또한 스크리닝 마커, 예를 들어 GFP를 포함하고 있다면, 형광하에서 세포 콜로니를 스크리닝하여 상동성 재조합을 확인할 수 있다. 상동성 재조합이 일어난 세포에서는 GFP 유전자가 제거되어 형광을 발하지 않는다.
별법으로, 양성-음성 선별 기술을 이용하여 상동성 재조합을 선별할 수 있다. 상기 기술은, 형질감염된 세포 성장의 선별, 즉 양성 선별을 위한 제1 약물, 예를 들어 네오마이신-유사 약물을 세포 집단에 첨가하는 방법을 포함한다. 이어서, FIAU와 같은 제2 약물을 첨가하여 음성 선별 마커를 발현하는 세포를 사멸, 즉 음성 선별한다. 음성 선별 마커를 함유하고 발현하는 세포는 선별 작용제에 의해 사멸되지만, 음성 선별 마커를 함유하지 않고 발현하지 않는 세포는 생존한다. 예를 들어, 상기 구조물이 비-상동성 삽입된 세포는 HSV 티미딘 키나제를 발현하므로 간시클로비르 (GANC) 또는 FIAU (1-(2-데옥시 2-플루오로-B-D-아라비노플루라노실)-5-요오도우라실) 등과 같은 헤르페스 약물에 감응성이다 (예를 들어 문헌 ([Mansour et al., Nature 336:348-352 (1988)], [Capecchi, Science 244:1288-1292, (1989)], [Capecchi, Trends in Genet. 5:70-76 (1989)] 참조). 다른 방법으로는 선택적인 단일 작용제의 첨가가 요구되는 조절된 양성 선별법 등이 있다 (예를 들어 US 20030032175 A1 참조).
성공적인 재조합은 선별된 세포의 DNA를 분석하여 상동성 재조합을 확인함으로써 식별될 수 있다. 당업계에 공지된 각종 기술, 예를 들어 PCR 및(또는) 써던 분석을 이용하여 상동성 재조합 사건을 확인할 수 있다.
이어서, 선별된 세포를 동물 (예를 들어 마우스)의 포배 (또는 생존가능한 동물을 생성하는데 적합한 다른 발생 단계의 세포, 예를 들어 상실배)에 주사하여 키메라를 형성한다 (예를 들어 문헌 [Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL, Oxford, pp. 113-152 (1987)] 참조). 별법으로, 선별된 ES 세포는 해리된 마우스 배아 세포와 응집되어 응집 키메라가 형성되도록 할 수 있다. 이어서, 키메라 배아를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 배아를 수용하도록 한다. 생식 세포에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 키메라 자손을 이용하여, 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 키메라 자손 마우스를 이용하여 CD20 유전자가 이형접합 파괴된 마우스를 생성한다. 이형접합 트랜스제닉 마우스를 교배할 수 있다. 전형적으로, 이러한 교배로 얻은 자손 중 1/4은 CD20 유전자에서 동형접합 파괴되어 있음이 당업계에 공지되어 있다.
내인성 좌위의 불활성화에 관한 상기 방법 이외의 추가의 바람직한 불활성화 방법이 이용가능하며, 예를 들어 특정 관심 유전자의 일시적 제어를 이용하기 위한 tet 전사 시스템의 사용 [Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9302-9306 (1994)] 또는 조직 특이적 제어를 위한 데옥시시클린 전사 조절 제어의 도입 [Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10933-10938 (1996)] 등을 들 수 있다.
기능적 불활성화에 바람직한 추가의 방법으로는 loxP 부위가 관심 유전자를 플랭킹하도록 삽입되고 cre 재조합효소가 활성화되어 유전자를 결실시키는, 유전자 좌위의 표적화된 녹아웃을 위한 부위 특이적 재조합 시스템인 cre-lox 결실의 이용 등이 있다 [Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-527 (1994)].
별법으로, 안티센스 또는 RNAi 방법을 이용하여 원하는 좌위의 전사를 억제함으로써, 내인성 좌위의 기능적 파괴를 일으킬 수 있다 (넉다운(knock-down) 방법). 이러한 상황하에서는, 지정된 좌위의 표적 특이적인 관심 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 생성되고, 성공적인 표적화가 기능적 단백질의 생성 억제를 초래한다.
내인성 CD20의 소실에 대해 동형접합인 녹아웃 마우스는 WO 02/062946에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 간략하게 말하자면, 한 실시양태에서, CD20-결핍 마우스는 배아 줄기 (ES) 세포에서 상동성 재조합을 통한 뮤린 CD20 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성될 수 있다. 뮤린 CD20의 제2 세포외 루프의 일부, 제4 막횡단 도메인 및 큰 카르복실-말단 세포질 도메인을 코딩하는 엑손을 네오마이신 내성 유전자로 대체한 표적화 벡터를 생성할 수 있다. 뮤린 CD20의 뉴클레오티드 서열은 당업자에게 공지되어 있다 (진뱅크 접속 번호 M62541; WO 02/062946). 한 실시양태에서, 적절한 유전자 표적화는 아미노산 위치 157에서 말단절단되고 Neo 유전자 서열에 의해 코딩되는 88개 아미노산의 단백질과 융합된 이상 CD20 단백질을 생성한다.
DNA 형질감염 후에, 표적화된 대립유전자를 보유하는 neo-내성 ES 세포 클론은 써던 블럿 분석으로 결정할 수 있다. 1종의 ES 세포 클론의 세포들을 포배에 주사하여 대리모로 이동시킬 수 있다. 고도로 키메라인 수컷 자손 (털 색상에 따라 80 내지 100％)을 C57BL/6 (B6) 암컷과 교배시켜 상기 돌연변이를 이들의 자손에게 전달할 수 있다. CD20 유전자 파괴에 대하여 동형접합인 마우스를 이형접합 자손 교배에 의해 멘델 법칙에 따라 기대되는 빈도로 수득할 수 있다.
CD20의 적절한 표적화는 동형접합 자손으로부터의 게놈 DNA의 PCR 분석을 통해 추가로 입증될 수 있다. CD20-/- 마우스에서 야생형 CD20 mRNA의 존재 또는 부재는 CD20-/- 마우스의 비장세포로부터 생성된 cDNA를 PCR 증폭시켜 확인할 수 있다. CD20-/- 마우스에서 세포 표면 CD20 단백질 발현의 부재는 B220+ 비장세포를 뮤린 항-CD20 모노클로날 항체로 염색하여 추가로 입증할 수 있다. CD20 유전자가 표적화 돌연변이되면, 세포 표면 CD20 단백질이 발현되지 않는다.
비-인간 동물로의 트랜스진 도입
본 발명의 트랜스제닉 비-인간 동물은 트랜스진을 상기 동물의 배선에 도입하여 생성시키는 것이 바람직하다. 각종 발생 단계의 배아 표적 세포를 사용하여 트랜스진을 도입할 수 있다. 배아 표적 세포의 발생 단계에 따라 여러가지 방법을 이용한다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 임의의 동물의 특정 계통(들)은 일반적 건강의 양호성, 배아 수율의 양호성, 배아의 전핵 가시성(visibility)의 양호성 및 생식 적합성의 양호성에 대해 선택된다. 트랜스제닉 마우스를 생성하는 경우에는 C57BL/6 또는 C57BL/6×DBA/2 F1 또는 FVB 계통과 같은 종이 흔히 사용된다 (미국 보스톤 매사츄세츠주에 소재하는 챨스 리버 랩스(Charles River Labs), 미국 메인주 바르 하버에 소재하는 더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory), 또는 타코닉 래버러토리즈(Taconic Labs.)로부터 구입할 수 있음). 바람직한 종은 H-2b, H-2d 또는 H-2q 반수체형을 갖는 종, 예를 들어 C57BL/6 또는 DBA/1 등이다. 또한, 누드 마우스를 이용하여 인간 종양 세포를 트랜스제닉 마우스에 도입할 수 있다. 누드 마우스의 교배 및 유지는 누드 마우스가 감염 및 질환에 대한 감수성이 더 커서 더 어렵다. 본 발명의 실시에 사용되는 계통(들)은 그 자체가 트랜스제닉일 수 있고(있거나) 녹아웃일 수 있다. 초기 녹아웃 포유동물 및 트랜스제닉 포유동물 둘다의 제조에는 동일한 계통을 사용하는 것이 바람직하다. 이것은 이후의 교배 및 역교배를 더욱 효율적으로 만들 것이다.
트랜스진의 배아로의 도입은 당업계에 공지된 임의의 수단, 예를 들어 미세주입법, 전기천공법 또는 리포펙션법(lipofection)으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 수정란(들)의 전핵에 구조물을 미세주입하여 발생 중인 포유동물(들)의 세포에 상기 구조물의 카피가 1개 이상 보유되도록 함으로써 트랜스진을 포유동물에 도입할 수 있다. 트랜스진 구조물을 수정란에 도입한 후에는, 상기 수정란을 다양한 시간 동안 시험관내 인큐베이션하거나 대리 숙주에 재이식하거나 또는 둘다를 수행할 수 있다. 성숙시까지 시험관내 인큐베이션하는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 통상적인 방법 중 하나가 배아를 종에 따라 약 1 내지 7일 동안 시험관내 인큐베이션한 후에 대리 숙주에 재이식하는 것이다.
재이식은 표준 방법을 이용하여 수행된다. 통상적으로, 대리 숙주를 마취하고 배아를 수란관에 삽입한다. 특정 숙주로 이식되는 배아의 수는 종에 따라 달라질 것이지만, 통상적으로는 해당 종이 천연적으로 생성하는 자손의 수에 필적한다.
레트로바이러스 감염을 이용하여 트랜스진을 비-인간 동물에 도입할 수도 있다. 발생 중인 비-인간 배아를 포배 단계까지 시험관내 배양할 수 있다. 이 동안에, 할구는 레트로바이러스 감염에 대하여 표적화될 수 있다 [Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264]. 할구의 효율적인 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 달성된다 [Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986]. 전형적으로, 트랜스진의 도입에 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 상기 트랜스진을 보유하는 복제-결핍 레트로바이러스이다 ([Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931], [Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152]). 형질감염은 바이러스-생산 세포의 단층상에서 할구를 배양함으로써 쉽고 효율적으로 달성된다 ([Van der Putten, 상기 문헌], [Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388]). 별법으로, 감염은 더욱 후기 단계에 수행될 수도 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포를 포배강에 주사할 수 있다 [Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628]. 혼입은 오직 트랜스제닉 비-인간 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 일어나기 때문에, 대부분의 창시자(founder)는 트랜스진에 대해 모자이크일 것이다. 추가로, 창시자는, 일반적으로 자손에서는 분리될 게놈의 여러 위치에 레트로바이러스의 다양한 트랜스진 삽입체를 함유할 수 있다. 또한, 트랜스진은 임신 중(midgestation) 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염을 통해 배선에 도입될 수도 있다 [Jahner et al. (1982), 상기 문헌].
트랜스진 도입을 위한 표적 세포의 3번째 유형은 배아 줄기 세포이다. 트랜스진은 DNA 형질감염법 또는 레트로바이러스-매개된 형질도입법에 의해 ES 세포에 효율적으로 도입될 수 있다. 이어서, 이와 같이 형질전환된 ES 세포를 비-인간 동물로부터의 포배와 합할 수 있다. 이후, ES 세포는 배아를 콜로니화하고, 생성되는 키메라 동물의 배선에 기여한다.
한 실시양태에서, 도 21에 나타낸 바와 같은 인간 CD20을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 클론을 미세주사법 또는 형질감염법을 통해 FVB 마우스 수정란 또는 ES 세포에 도입할 수 있다. 배아를 약 1 내지 7일 동안 시험관내 인큐베이션한 후에 대리 숙주에 이식한다. ES 세포를 천연 교배된 숙주 동물로부터의 포배와 합하고, 상기 포배를 대리모에게 재이식한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 비-인간 숙주의 내인성 CD20 유전자는 이종 CD20 유전자의 상동성 통합으로 인해 기능적으로 파괴되어, 이종 CD20 유전자가 실질적으로 내인성 CD20 유전자를 대체하고, 바람직하게는 내인성 CD20 유전자의 코딩 서열을 완전하게 대체한다. 이종 CD20 유전자가 상동성 통합의 결과로서 내인성 CD20 유전자의 조절 서열 (예를 들어 인핸서 프로모터)에 연결되어 상기 이종 유전자가 내인성 CD20 유전자 좌위의 조절 요소의 전사 제어하에서 발현되는 것이 바람직하다. 이러한 대체 대립유전자에 동형접합인 비-인간 숙주는 본원에 기재된 방법에 따라 생성될 수 있다. 이러한 동형접합 비-인간 숙주는 일반적으로 이종 CD20을 발현하지만, 내인성 CD20 단백질은 발현하지 않는다. 일반적으로, 이종 CD20 유전자의 발현 양상은 천연 발생 (비-트랜스제닉) 비-인간 숙주에서 내인성 CD20 유전자가 발현되는 양상을 실질적으로 모방할 것이다.
예를 들어, 내인성 뮤린 CD20 유전자 서열 대신에 인간 CD20 유전자 서열을 가지며 내인성 뮤린 조절 서열에 의해 전사 제어되는 트랜스제닉 마우스를 생성할 수 있다. 일반적으로, 인간 CD20은 천연 발생 비-트랜스제닉 마우스에서 뮤린 CD20과 유사하게 발현될 것이다.
일반적으로, 상동성 유전자 대체에는 대체형 표적화 구조물이 사용된다. 표적화 구조물의 내인성 CD20 유전자 서열 사이에서 이중-교차 상동성 재조합이 일어나서 이종 CD20 유전자 절편이 표적화 통합된다. 통상적으로, 트랜스진의 상동성 표적화 영역은 내인성 CD20 유전자 절편을 플랭킹하는 서열을 포함하기 때문에, 상동성 재조합은 내인성 CD20의 결실 및 이종 유전자 절편의 상동성 통합을 동시에 야기한다. 실질적으로 전체 내인성 CD20 유전자는 단일 표적화 사건 또는 다중 표적화 사건 (예를 들어 개개의 엑손의 순차적 대체)에 의해 이종 CD20으로 대체될 수 있다. 1종 이상의 선별가능한 마커는 통상적으로 양성 또는 음성 선별 발현 카세트의 형태이며, 표적화 구조물에 위치시킬 수 있다. 일반적으로, 선별가능한 마커는 이종 대체 영역의 인트론 영역 내에 위치시키는 것이 바람직하다.
트랜스제닉 마우스의 교배
트랜스진 인간 CD20을 포함하는 트랜스제닉 마우스를 뮤린 CD20이 결여된 트랜스제닉 마우스와 교배시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 마우스는 인간 CD20을 포함하고 뮤린 CD20이 결여된 것이다. 제조 방식은 각각이 원하는 녹아웃 구조물 또는 트랜스진 중 하나를 함유하는 일련의 포유동물을 생성하는 것이다. 이러한 포유동물을 일련의 교배, 역교배 및 선별을 통해 함께 번식시켜 궁극적으로는 모든 원하는 녹아웃 구조물 및(또는) 트랜스진을 함유하는 단일 포유동물을 생성하는데, 상기 포유동물은 녹아웃(들) 구조물 및(또는) 트랜스진(들)의 존재를 제외한 다른 점에 있어서는 야생형에 유사유전자형(congenic) (유전적으로 동일함)이다.
전형적으로, 교배 및 역교배는 교배 과정에서 각각의 특정 단계의 목적에 따라 동일 부모의 자손끼리 교배하거나 또는 부모 종을 자손과 교배하여 수행될 수 있다. 특정한 경우에 있어서, 녹아웃 구조물 및(또는) 트랜스진 각각을 적당한 염색체 위치에 함유하는 단일 자손을 생성하기 위해서 다수의 자손을 생성할 필요가 있을 수 있다. 추가로, 궁극적으로 원하는 유전자형을 수득하기 위해서는 여러 세대에 걸쳐 교배 또는 역교배를 실시할 필요가 있을 수도 있다.
상동성 재조합 또는 랜덤 통합에 의해 인간 좌위가 일단 숙주 게놈에 도입되고 각종 트랜스제닉 또는 돌연변이된 동물의 적절한 교배에 의해 불활성화된 내인성 CD20 좌위를 갖는 숙주 동물이 생성되면, 내인성 CD20을 생성하는 천연적인 능력은 결여되어 있으나 인간 CD20을 생성하는 능력은 지닌 숙주를 생성할 수 있다.
D. 트랜스진 존재의 입증
대리 숙주의 트랜스제닉 자손은 임의의 적합한 방법으로 원하는 조직, 세포 또는 동물에서 트랜스진의 존재 및(또는) 발현에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 종종 트랜스진의 적어도 일부에 상보적인 프로브를 사용하는 써던 블럿 또는 노던 블럿 분석으로 수행된다. 트랜스진이 코딩하는 단백질에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석은, 트랜스진 생성물의 존재를 스크리닝하기 위한 별법의 방법 또는 추가의 방법으로서 이용될 수 있다. 전형적으로, 꼬리 조직으로부터의 DNA를 준비하고, 트랜스진에 대하여 써던 분석 또는 PCR로 분석한다. 별법으로, 트랜스진의 존재 및 발현을 분석하는데에는 임의의 조직 또는 임의의 세포형을 사용할 수 있지만, 트랜스진의 존재 및 발현은 트랜스진을 최고 수준으로 발현한다고 여겨지는 조직 또는 세포에서 써던 분석 또는 PCR로 시험한다.
트랜스진의 존재를 평가하는 별법의 방법 또는 추가의 방법으로는 적합한 생화학적 검정법, 예를 들어 효소 및(또는) 면역학적 검정법, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색법, 유동 세포계측 분석법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 혈액 분석 역시 혈액 중에서 트랜스진 생성물의 존재를 검출하고 또한 트랜스진이 각종 유형의 혈액 세포 및 다른 혈액 성분들의 수준에 미치는 영향을 평가하는데 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 CD20의 발현은 인간 CD20에 대한 것이며 검출가능하게 표지된 항체를 사용하고 표지된 세포를 FACS로 분석함으로써 비장, 골수, 말초혈, 림프절 및 파이어반으로부터의 면역 세포에서 검출할 수 있다.
본 발명의 트랜스제닉 마우스에서의 발현 양상 시험은 인간 B 계통 세포에서 발견되는 정상적 인간 CD20의 발현을 반영(mirroring)하는 것으로 나타났다. T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 수상돌기 세포 및 호중구 등의 세포 및 표현형적 특징의 비율(％)로써 검사한 다른 면역학적 파라미터는 동일 부모로부터의 트랜스제닉 음성 및 양성 자손 간에 유사성을 나타내었다.
E. 트랜스제닉 동물의 용도
본 발명의 트랜스제닉 동물은 CD20 발현 및 인간에서의 기능에 관한 모델을 대표한다. 따라서, 이들 동물은 기능 및 관련 사건의 메카니즘을 연구하는데 유용하며, 암 및 자가면역 상태 등을 비롯한 CD20 관련 인간 질환을 치료하고 진단하는데 유용한 생성물 (예를 들어 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체 등)을 제조하고 시험하는데 유용하다.
몇몇 실시양태에서, 트랜스진에 의해 발현된 인간 CD20은 인간 세포에서 발휘하는 것과 유사한 기능적 성질을 보유한다. 예를 들어, 인간 CD20을 발현하는 B 림프구는 항-인간 CD20 항체에 의해 인식되고, 인간에서와 마찬가지로 인간 CD20 항체 투여에 대한 반응으로 트랜스제닉 동물로부터 유사하게 고갈된다. 실시예에 더욱 상세하게 기재한 바와 같이, 본 발명의 트랜스제닉 마우스의 B 림프구는 항-인간 CD20 항체, 예를 들어 리투크산 처치에 대한 반응으로 고갈된다. 한 실시양태에서, 인간 CD20 트랜스제닉 마우스는 인간 CD20이 세포상에서, 이 발현 세포에 항-인간 CD20 항체가 결합하여 상기 세포를 사멸시키기에 충분한 수준으로 발현되어 말초 B 세포 및(또는) 순환하는 B 세포의 적어도 약 75％, 더욱 바람직하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 99％, 심지어는 100％를 고갈시킨다는 것을 특징으로 한다. 인간에서도 유사한 반응이 관찰된다.
따라서, 한 실시양태에서는 본 발명의 트랜스제닉 동물을 사용하여 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자, 이뮤노어드헤신 등과 같은 작용제를 표적 에피토프, 예를 들어 인간 CD20 영역과의 결합에 대하여 시험 (예를 들어 인간 안전성 및 효능 시험)한다. 기타 작용제로는 Fc 영역을 함유하거나 함유하지 않는 항체의 항원 결합 단편, 단일쇄 항체, 미니바디(minibody) (중쇄만을 갖는 항체), 다량체인 항-인간 CD20 항원 결합 영역 중 하나를 갖는 이종다량체성 이뮤노어드헤신 등을 들 수 있다. 기타 작용제로는 CD20에 결합하지만 CD20을 활성화시키지 않는 CD20 리간드의 변이체일 수 있는, CD20-B 세포 고갈을 억제하거나 CD20-B 세포 고갈을 일으키는 소분자 등을 들 수 있다. 예를 들어, 이러한 작용제가 CD20을 발현하는 세포, 예를 들어 악성 B 세포를 고갈시키는 효과는 트랜스제닉 동물에서의 B 림프구 수준을 시험 작용제의 투여 이전 및 투여 이후에 측정함으로써 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 동물에게 작용제를 투여하고 B 림프구의 수가 감소되는지 여부를 결정함으로써, B 세포 림프종을 치료할 수 있는 작용제 및 인간 CD20을 발현하는 B 림프구를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "B 세포 고갈"은 약물 또는 항체 처치 이후에 동물 또는 인간에서의 B 세포 수준이 이러한 처치 이전의 수준에 비해 감소된 것을 지칭한다. B 세포 수준은 본원에 기재한 바와 같은 공지된 검정법으로 측정할 수 있다. B 세포 고갈은 부분적이거나 완전할 수 있다. 작용제에 의해 유도된 B 세포 고갈 수준은 질환 또는 장애의 증상 감소 또는 완화와 상관관계가 있는 양인 것이 바람직하다. 추정적 작용제의 효과 (즉, CD20을 발현하는 B 림프구를 고갈시키는 능력)는 CD20을 발현하는 트랜스제닉 동물에서 순환하는 B 림프구의 기저 수준을 측정하고 동일 동물에서의 투여 후 수준과 비교함으로써 평가할 수 있다. 항-인간 CD20 항체 (예를 들어 리투크산)과 같은 공지된 치료제에 대하여 B 세포 고갈의 효능 비교를 수행하여 CD20 관련 상태에 대한 추정적 작용제의 치료 효과를 평가할 수 있다. 별법으로, B 림프구의 기저 수준은 인간 CD20을 발현하는 제1 트랜스제닉 동물의 여러 조직 (예를 들어 비장, 골수, 말초혈, 림프절, 파이어반)에서 측정될 수 있다. 이어서, 추정적 작용제를 인간 CD20을 발현하는 제2 트랜스제닉 동물에게 투여할 수 있다. 이어서, 상기 동물을 희생시키고 B 림프구의 수준을 분석한다. 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 동물에서 B 림프구의 수가 감소한 것은, 상기 작용제가 인간 대상체에서 B 세포 림프종과 관련한 암성 세포를 감소시키고(시키거나) B 세포 림프종을 치료하는 효과를 갖는다는 지표이다. 또한, 조합 요법을 시험하여 원하는 세포형을 고갈시키는 효과를 결정할 수도 있다. 예를 들어, 항-인간 CD20 항체를 Br3-Fc 등과 같은 또다른 작용제와 조합함으로써 항-인간 CD20에 의한 사멸에 내성을 가질 수 있으며 CD20을 보유하는 임의의 B 세포를 고갈시킬 수 있다.
또한, B 림프구 회복은 일련의 트랜스제닉 동물에서 시간에 따른 세포 수준을 측정하여 평가할 수 있다. 인간 CD20에 대한 작용제의 특이성은 상기 작용제가 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 마우스에 미치는 효과를 야생형 마우스 (CD20 마커를 발현하지 않음)에 미치는 효과와 비교하여 평가할 수 있다. 또한, 작용제의 효과를 위약 또는 대조군 물질, 예를 들어 비-특이적 Ab 또는 다른 대조군 작용제의 효과와 비교할 수도 있다. 상기 작용제는 인간 CD20을 보유하는 대부분의 세포 또는 모든 세포를 표적으로 하지만, T-비의존성 면역 반응을 자극하는 항원에 대한 면역 반응성을 제공하는 세포에는 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다.
추가로, 이러한 작용제의 투여 후에 트랜스제닉 동물에서 면역 반응이 개시되는 것은 상기 작용제가 인간에서 동일 효과를 일으킬 것이라는 지표이기 때문에, 상기 동물은 인간에서의 잠재적 면역 반응을 평가하는데 유용한 모델이다. 이러한 트랜스제닉 동물에서의 면역 반응에 대한 효과는 예를 들어 사이토킨 수준, 항체 생성 또는 T 세포 반응의 변화 등을 통해 검출할 수 있다. 추가로, 상기 트랜스제닉 동물을 유전자조작하여 표적 세포 (예를 들어 종양, 바이러스)를 함유하도록 한 후에 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자를 투여할 수도 있다.
항-CD20 항체 또는 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자를 트랜스제닉 동물에게 투여한 후의 항체 결합을 검출하기 위해서는 임의의 적합한 검정법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 동물의 혈액 샘플을 채취하고 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사성면역검정법 (RIA) 또는 웨스턴 블럿 검정법 등과 같이 당업계에 공지된 스크리닝 검정법을 이용하여 항-CD 항체-CD 복합체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 일반적으로, 이들 검정법 각각은 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어 항체)를 이용하여 특정 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 따라서, 본 발명에서는 이들 검정법을 이용하여 동물의 혈액 혈청에 함유된 이뮤노글로불린 (예를 들어 IgG, IgA 등)과 상기 동물의 특정 세포의 표면상에 함유된 인간 CD 마커 사이에 형성된 CD-항체 복합체를 검출한다.
CD 마커-항체 복합체는 예를 들어 항체-CD 마커 복합체를 인식하고 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 상기 복합체는 임의의 각종 다른 면역검정법을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체를 방사능 표지하여 방사성면역검정법 (RIA)에 사용할 수 있다. 방사능 동위원소는 감마 계수기 또는 섬광계수기 등의 수단 또는 자가방사기록법으로 검출할 수 있다.
항체 또는 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자 또는 다른 작용제를 트랜스제닉 동물에게 투여한 후의 면역 반응을 검출하기 위해서는, 예를 들어 동물의 혈장 또는 혈청 내 사이토킨, 항체 또는 T 세포 집단의 농도 변화를 측정하는 임의의 적합한 절차를 이용할 수 있다. 예를 들어, 생체내 사이토킨 농도 변화는 각종 면역검정법, 예를 들어 효소 면역검정법 (EIA), 방사성면역검정법 (RIA) 또는 ELISPOT 검정법 등을 통해 검출할 수 있다. 검정될 수 있는 사이토킨의 예로는 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF), 인터루킨 1 내지 12 (IL-1 내지 IL-12) 등이 있다.
예를 들어, 항체, 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자 또는 다른 작용제를 투여한 트랜스제닉 동물로부터 혈장을 수득할 수 있다. 사이토킨 농도는 효소에 접합시킨 항체와 사이토킨과의 상호 작용을 검출하는 EIA로 측정할 수 있다. 효소 활성은 적절한 기질, 바람직하게는 발색 기질과의 반응을 통해 예를 들어 분광광도법, 형광측정법 또는 가시적 수단으로 검출할 수 있는 화학적 부분을 생성하는 방식으로 검출된다 ([Voller, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD], [Voller, et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978)], [Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981)], [Maggio, (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980], [Ishikawa, et al., (eds.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981]). 항체를 검출가능하게 표지할 하는데 사용될 수 있는 효소로는 말레이트 데히드로게나제, 스타필로콕쿠스(staphylococcal) 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알콜 데히드로게나제, 알파-글리세로포스페이트, 데히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린스테라제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 검출은, 효소의 발색 기질을 이용하는 비색 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 효소에 대한 기질의 반응 정도를 유사하게 제조된 표준물질과 비교하는 가시적 비교를 이용하거나 RIA를 이용하여 검출을 수행할 수도 있다.
또한, 항-사이토킨 항체 또는 항-CD20 분자를 형광 화합물로 표지할 수도 있다. 형광 표지된 항체를 적당한 파장의 광에 노출시키면 그의 존재를 검출할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 형광 표지 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플루오레사민이다. 또한, 형광 방출 금속, 예를 들어 152Eu 또는 기타 란탄계 금속을 사용하여 항체를 검출가능하게 표지할 수도 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 등과 같은 금속 킬레이팅기를 사용하여 항체에 부착시킬 수 있다. 또한, 항체를 화학발광 화합물에 커플링시켜서 상기 항체를 검출가능하게 표지할 수도 있다. 이때, 화학발광-태그가 부착된 항체의 존재는 화학적 반응 과정 동안에 발생하는 발광을 검출하여 결정한다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 태로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르 등이 있다. 유사하게, 생체발광 화합물을 사용하여 항체를 표지할 수 있다. 생체발광은 촉매성 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는, 생물학적 시스템에서 발견되는 유형의 화학발광이다. 생체발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출하여 결정한다. 표지에 중요한 생체발광 화합물은 루시퍼린, 루시퍼라제 및 에쿼린이다.
본 발명의 비-인간 트랜스제닉 동물은 특정 작용제의 인간 투여에 관한 안전성 지표를 추가로 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 다른 작용제를 트랜스제닉 동물에게 투여할 수 있고, 인간에게 생체내 사용하기 위한 인간화 항체 또는 작용제의 안전성 및 허용성에 관한 지표로서 상기 작용제를 상기 동물에게 투여한 결과로서 발생되는 독성 또는 부작용을 모니터링하거나 확인할 수 있다. 단기적으로 발생할 수 있는 부작용으로는 두통, 감염, 열병, 오한, 동통, 구역, 무력증, 인두염, 설사, 비염, 주입 반응 및 근육통 등이 있다. 단기적인 부작용은 처치후의 일수로 측정한다. 장기적인 부작용으로는 특정 세포형의 세포독성, 혈소판감소증으로 인한 출혈 사건, 염증 반응 및(또는) 알레르기 반응으로 인한 매개자의 방출, 면역계의 억제 및(또는) 항-치료제 항체의 발생, 말단 기관에의 독성 및 감염률이나 악성도의 증가 등이 있다. 장기적인 부작용은 처치후의 개월수로 측정한다.
본 발명의 또다른 측면은 항-CD20 작용제의 효능을 결정하는 방법을 포함한다. 효능은 소정 범위의 투여량의 작용제를 인간 CD20을 갖는 트랜스제닉 동물 세트에게 투여하고, 작용제에 의해 인간 CD20을 보유하는 세포가 감소되는 하나 이상의 투여량을 측정하여 결정할 수 있다.
세포, 조직 또는 이들로부터 유래된 다른 물질을 포함하는 본 발명의 트랜스제닉 동물은 질환, 특히 CD20을 보유하는 세포와 관련되어 있거나 그에 의해 매개되는 질환의 모델로서 이용될 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 미니돼지(micro-pig), 염소 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 비비원숭이, 원숭이 및 침팬지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 종의 동물을 사용하여 질환 동물 모델을 생성할 수 있다. 이들 시스템은 다양한 용도로 이용될 수 있다. 이러한 검정법은 질환의 증상을 완화시킬 수 있는 화합물 등과 같은 작용제를 확인하도록 고안한 스크리닝 전략법의 일부로 활용할 수 있다. 따라서, 동물-기재의 모델 및 세포-기재의 모델은 질환 치료에 효과적일 수 있는 약물, 의약품, 요법제 및 개입제를 확인하는데 이용될 수 있다.
세포-기재의 시스템을 사용하여, 질환의 증상을 완화시키는 작용을 할 수 있는 화합물을 확인할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포 시스템을 질환의 증상 완화력을 발휘할 것이라고 여겨지는 화합물에 노출시키되, 노출된 세포에서 그러한 질환의 증상 완화가 유발될 만큼의 충분한 농도 및 충분한 시간 동안 노출시킬 수 있다. 노출 후에는 세포를 시험하여, 질환에 걸린 세포의 하나 이상의 표현형이 변경되어 더욱 정상적이거나 더욱 야생형인 비-질환 표현형과 유사해졌는지의 여부를 결정한다.
기타 용도는 당업자에게 매우 명백할 것이다.
하기하는 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지만, 본 발명이 이것으로 제한되지는 않는다.
실시예 1
본 실시예는 인간 CD20 BAC 트랜스제닉 (Tg+) 마우스의 생성 및 hCD20+ 마우스에서 항-인간 CD20 항체 처치가 미치는 효과에 대한 연구를 기재한다.
인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재)으로부터의 CITB 인간 BAC-D-클론 번호 117H19를 사용하여 인간 CD20 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 인간 림프구로부터 인간 CD20을 코딩하는 DNA를 단리하여 인비트로젠으로 송부하였다. 인비트로젠은 인간 BAC 라이브러리로부터의 클론을 사용한 필터에 대하여 DNA를 시험하여 클론 117H19임을 확인하였다. 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성하려던 이전의 시도는 성공적이지 못했는데, 이는 부분적으로는 트랜스진 구조물에 충분한 전사 제어 영역을 포함시키지 못했던 것에 기인한 것일 수 있다. 클론 117H19로 제조한 인간 CD20 BAC 구조물을 마우스 FVB 근친계의 수정란에 미세 주사하여 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 수정란을 1 내지 7일 동안 인큐베이션한 후에 대리 마우스에게 이식하였다. 인간 CD20 발현의 FACS 분석을 기초로 하여 마우스를 스크리닝하였다. 도 1의 FACS 플롯으로 알 수 있는 바와 같이, 트랜스진에 대한 이형접합 마우스 (Tg+/-) 및 동형접합 마우스 (Tg+/+)는 B220+ B 세포상에 인간 CD20을 발현하였다. 뮤린 CD20 유전자를 의도적으로 파괴하지는 않았다.
도 2는 B 세포 분화 및 성숙 동안 각종 세포 표면 마커 (CD43, IgM, IgD)의 발현에 대한 개략도를 제공한다. Tg+ 마우스에서, hCD20은 프리-B 세포, 미성숙 B 세포 및 성숙 B 세포상에서 발현되었다. 인간 CD20은 인간과 동일한 세포형에서 발견되며, 이들 세포형에서 인간 B 세포상에서보다는 약간 더 낮은 수준으로 발현되었다.
FITC (BD 파르밍겐)에 접합시킨 항-인간 CD20 항체를 이용하여 Tg+ 마우스를 골수, 비장, 장간막 LN 및 파이어반의 B 세포에서의 인간 CD20 발현에 대해 스크리닝하였다 (결과는 도 3 내지 도 6에 나타냄). B220 및 CD43, CD21 또는 CD38에 대한 세포 게이팅을 통해, 여러 조직으로부터의 B 세포를 다양한 집단으로 분류할 수 있다. 게이팅을 위해서, 세포를 PerCP (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 접합시킨 항-B220 Ab 및 PE (형광, 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))에 접합시킨 항-CD43 Ab, 항-CD21 Ab 또는 항-CD38 Ab로 염색하였다.
CD20 트랜스제닉 마우스의 말초혈 세포상에서의 인간 CD20 발현 수준을 인간 말초혈 세포상에서의 인간 CD20 발현 수준과 비교하였다. 여러 상이한 인간 공여자 및 hCD20Tg+ 마우스로부터 말초혈 세포를 수득하였고, 표지된 항-인간 CD20 항체 (mH27)로 염색하였다. 세포를 FACS로 분석하고 인간 CD19+ 및 B220+ 각각에 대하여 게이팅하였다. 대표적인 그래프를 도 22에 나타내었다. 그래프상의 수치는 평균 형광 강도를 나타낸다. 평균 형광 강도의 비교를 기초로 할 때, 그래프상의 수치는 트랜스제닉 세포상에서의 인간 CD20 발현이 인간 세포상에서의 인간 CD20 발현의 약 40％ 수준임을 보여준다.
이러한 결과는 트랜스제닉 마우스의 많은 여러 조직에서 수득된 B 세포가 인간 CD20 마커를 발현함을 보여준다. 인간 CD20 마커는 성숙 B 세포상에서 우세하게 발견되지만, 인간에서 관찰되는 프로파일과 유사하게 프리-B 세포 및 미성숙 B 세포상에서도 발견될 수 있다.
이어서, 트랜스제닉 마우스에 항-인간 CD20 mAb m2H7을 처치하여 이러한 항체 처치가 B 세포 고갈을 일으키는지 여부를 결정하였다. 항체 m2H7은 BD 파르밍겐 (미국 캘리포니아주 산 디에고 소재), 이바이오사이언스(eBioscience) 또는 칼바이오켐(Calbiochem)에서 구할 수 있다. m2H7의 항-인간 CD20 활성을 리투크산의 항-인간 CD20 활성과 시험관내 검정법으로 비교하였을 때, 활성이 유사한 것으로 나타났다. 리투크산 등과 같은 인간화 항체는 세포 사멸 연구에도 이용될 수 있는데, 이는 생체내 세포 사멸이 인간화 항체에 대한 면역 반응을 우려하지 않아도 될 만큼 충분히 짧은 시간 내에 일어나기 때문이다.
항체 m2H7을 도 7의 개략도에 약술한 바와 같이 총 1 mg의 투여량으로 트랜스제닉 마우스에 투여하였는데, 상기 양은 70 kg의 사람인 경우에 3.5 mg에 해당하는 것이다. 화살표로 표시한 일수에 말초혈, 비장, 림프절, 골수 및 파이어반에 대한 FACS 분석을 실시하였다. 항-CD20 mAb의 혈청 수준을 모니터링하였다.
Tg+ 마우스에 항-CD20 mAb (m2H7)를 단독 처치하면 말초혈 B 세포, 성숙 말초 림프절 B 세포, 비장의 T2 및 소포성 B 세포를 고갈시킨다 (도 8 내지 도 11 참조). 그러나, 특정 B 세포 서브세트는 세포 표면에서 항-CD20 항체 수준이 거의 포화 수준에 이를 정도로 매우 높음에도 불구하고 상기 항-CD20 항체에 의한 사멸에 내성이 있다는 것도 관찰되었다. 이들 내성 B 세포는 비장에서는 변연대 B 세포였고 (도 10), 파이어반 (도 12) 및 비장 (도 14) 둘다에서는 배중심 B 세포였다. 도 14에서, 제1일에 마우스에게 항-CD20 mAb를 100 ㎍의 제1 투여량으로 주사하고 제3일에는 100 ㎍의 제2 투여량으로 주사하였다 (50 ㎍의 단일 투여량이면 B 세포를 포화시키기에 충분한 것 같음). T2/소포성 B 세포는 고갈되었으나, 파이어반으로부터의 배중심 B 세포는 항-CD20 mAb와 결합하긴 하지만 그에 의한 사멸에는 내성이 있는 것으로 나타났다.
항-인간 CD20 항체 처치 후의 B 세포 회복을 연구하였다. 제1일에 마우스에게 항체를 투여하였다. 도 13은 항체 처치후 제6일에 말초혈에서는 B 세포가 검출가능하지 않았음을 보여준다. 제6주에는 항체 제거 후에 hCD20+ 세포가 검출되기 시작했고, 제14주에는 B 세포가 정상적인 수준으로 회복되었다고 여겨졌다. 회복은, CD20을 발현하지 않던 전구 B 세포가 이후에 인간 CD20+을 보유하는 성숙 B 세포가 되었기 때문이다.
도 14는 단기적인 (단일 주사) 항-CD20 mAb 처치에 대한 비장 배중심 B 세포의 내성을 입증하는 FACS 플롯을 보여준다. 마우스를 면역화하지 않거나 제1일에 양의 적혈구 (SRBC)를 복강내 주사하여 면역화함으로써 비장에서 배중심을 유도하였다. 배중심은 제7일에 나타났다. 제8일에는 마우스 군 중 하나를 m2H7로 처치하였다. 대조군 세트의 마우스에는 mIgG2a 이소형 대조군 항체를 처치하였다. 제12일에는 마우스의 비장 세포를 분석하였다. 배중심을 염색하는 PNA (피넛 응집소)를 사용하였다. SRBC로 면역화되지 않은 마우스의 비장에서는 검출가능한 배중심 세포가 나타나지 않았지만, 면역화된 마우스의 비장은 0.3％의 PNA 염색 세포를 나타내었다. T2/소포성 B 세포는 항-CD20 항체 처치로 고갈되었지만, 비장의 변연 중심 B 세포는 상기 항체에 내성이 있었다.
다음으로, B 세포 고갈 후에 마우스가 T-비의존성 면역 반응을 일으킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 제0일에 마우스를 m2H7 또는 이소형 대조군 항체 mIgG2a로 처치하였다. 제3일 내지 제7일에는 B 세포 고갈이 발생하였다. 제7일에는 스트렙토콕쿠스 뉴모니아애 IV를 마우스에게 정맥내 주사하여 다당류에 대한 반응을 유도하였다. T 세포-비의존성 반응은 제11일에 발생하였다. 도 15에 나타낸 결과는 항-인간 CD20의 처치가 변연대 및 B1 세포의 B 세포 반응에 영향을 미치지 않으며, 즉 고갈되지 않은 MZ 및 B1 B 세포가 T-비의존성 항원에 대한 보호를 부여함을 입증한다. 상기 데이타는 항-CD20 mAb의 처치에도 불구하고 체액성 면역, 구체적으로는 T-비의존성 B 세포 반응 (이 경우에)의 몇가지 측면이 유지되었음을 입증한다.
요약하면, 인간 CD20 트랜스제닉 동물은 혈액, 골수, 비장, 림프절 및 파이어반의 성숙 B 세포, 프리-B 세포 및 미성숙 B 세포상에 인간 CD20을 발현하였다. 트랜스제닉 세포상에서의 인간 CD20 발현 수준을 FACS로 측정할 때 인간 세포상에서의 CD20 발현 수준의 약 40％였다. 마우스에게 항-인간 CD20 항체를 처치하면 비장에서는 변연대 B 세포를 제외하고 (도 10) 파이어반 (도 12) 및 비장 (도 14) 둘다에서는 배중심 B 세포를 제외하고는 처치 후 3 내지 4일 이내에 B 세포가 고갈되었다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, B 세포 사멸은 ADCC, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 또는 아팝토시스(apoptosis) 또는 상기 3가지의 조합에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 항-인간 CD20을 처치한 마우스에서는 T-비의존성 항원에 대한 반응이 관찰되었는데, 이것은 비장 변연대 B 세포가 항-인간 CD20 항체에 의한 고갈에 내성이 있다는 것과 일치한다. 항-인간 CD20 항체에 의한 사멸에 내성이 있는 B 세포는 T-비의존성 면역 반응을 정체시키고(시키거나) 모든 B 세포를 고갈시키고자 하는 경우에는 조합 요법이 필요할 수 있다는 지표를 제공한다. 인간 CD20을 발현하는 B 세포의 회복은 항-인간 CD20 항체 처치 후 14주가 지난 후에 관찰되었는데, 대개가 전구 B 세포의 성숙으로 인한 것으로 여겨진다. 이러한 결과는 리투크산을 처치한 인간에서 관찰되는 것과 유사하였다.
실시예 2
본 실시예는 B 세포의 조정/고갈에 있어서 항-CD20 mAb 및 BR3 길항제 처치 사이의 상승작용을 입증한다. BR3-Fc는 이뮤노글로불린 서열 (이 경우에는 인간 IgG1)의 불변 도메인에 융합된 인간 BR3의 세포외 도메인을 갖는 이뮤노어드헤신이다.
인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 마우스 (hCD20+ 마우스라고 지칭함)에게 항-CD20 mAb (제9일에 100 ㎍을 1회 주사함), BR3-Fc (제1일 내지 제12일에 격일로 100 ㎍씩 주사함) 또는 항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 배합물을 복강내 주사하였다. 각 군은 4 마리의 마우스로 구성되었다. 마지막 주사를 하고 2일이 지난 후에 마우스를 희생시켜 hCD20+ B 세포에 대해 분석하였다. 비장, 혈액, 림프절 및 파이어반의 FACS 분석을 B 세포 마커 (CD21+CD23+)에 대해 실시하였다.
상기 결과는 항-CD20 mAb 요법이 혈액 및 림프절 내의 순환하는 성숙 B 세포의 99％ 초과를 고갈시키며, BR3-Fc 처치는 혈액 및 림프절 내의 순환하는 성숙 B 세포를 감소시킨다는 것을 지시한다 (도 16). 항-CD20 mAb 요법은 비장에서 T2 및 소포성 B 세포는 고갈시켰지만 변연대 B 세포는 고갈시키지 못하였고, BR3-Fc 처치는 비장에서 T2/소포성 B 세포 및 변연대 B 세포를 감소시켰다.
항-CD20 mAb와 BR3-Fc의 조합물은 상승작용을 하여 비장에서 모든 집단의 B 세포를 고갈시켰다. 항-CD20 mAb에 의한 고갈은 대부분의 변연대 B 세포와 일부의 소포성/T2 비장 B 세포를 남겨두었고, BR3-Fc에 의한 고갈은 변연대 및 일부의 소포성/T2 B 세포에 대해 우세하게 일어났다 (도 16). 따라서, 이들 두가지 시약의 조합은 비장에서 B 계통 세포를 완전하게 고갈시켰다. BR3-Fc 또는 2H7 또는 이들2가지 배합물 그 어느 것도 파이어반의 배중심 B 세포에는 영향을 미치지 않았다 (도 17). 항-CD20 mAb 처치는 형질 세포에 유의한 영향을 미치지 않았으며 (도 18), 이것은 항-CD20 항체를 처치한 마우스에서 면역 반응의 몇몇 측면이 유지됨을 지시한다.
이러한 결과는 조합 요법이 대부분의 B 세포를 고갈시키는데 효과적임을 보여준다. 인간과 마찬가지로, 트랜스제닉 마우스의 일부 B 세포는 항-CD20 항체에 의한 사멸에 내성이 있다. 조합 요법은 비장에서 B 세포의 고갈에 항-CD20 항체에 대한 내성을 제공한다. 이것은 트랜스제닉 마우스가 항-CD20 내성 세포 또는 고도의 침습성 종양을 가진 상황에서 더욱 효과적일 수 있는 작용제 조합물을 확인하는데에도 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 3
본 실험에서는 천연 킬러 세포가 항-CD20 mAb-매개된 B 세포 고갈에서 역할을 수행함을 입증한다.
PK-136 mAb (마우스 NK1.1에 특이적임)를 생성하는 하이브리도마 클론은 ATCC로부터 얻었다. 4개 군의 인간 CD20 트랜스제닉 마우스에게 대조군 mAb, PK-136, 항-CD20 mAb 및 PK-136/항-CD20의 배합물 각각을 복강내 주사하였다. 복강내 투여된 투여량은 다음과 같았다:
대조군 mAb: 1회 복강내 투여시 200 ㎍씩, 1주 동안 3회 복강내 투여
PK-136: 1회 복강내 투여시 200 ㎍씩, 1주 동안 3회 복강내 투여
항-CD20 mAb: 1회 복강내 투여시 10 ㎍씩, 1회 투여.
항-CD20 mAb의 복강내 주사 후 제3일에 말초혈, 림프절 및 비장으로부터의 림프구를 분석하였다. 데이타는 평균±표준 오차 (n = 8)로 표현하였다.
상기 결과는 PK-136 처치가 시험한 조직 (간, 비장 및 혈액)에서 NK 세포 집단을 대략 80％ 내지 90％ 감소시킨다는 것을 지시하였다 (도 19). 대다수의 NK 세포 부재시에는 2H7-매개된 B 세포 고갈이 덜 효율적이었다 (도 20). 따라서, NK 세포는 항-CD20 mAb-매개된 B 세포 고갈에서 역할을 수행한다.
본원에서 언급한 모든 간행물 (특허 및 특허 출원 등을 포함함))은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
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ccatttcagg tcaaaggaaa aatgataatg aattcattga gcctctttgc 5280 tgccatttct ggaatgattc tttcaatcat ggacatactt aatattaaaa tttcccattt 5340 tttaaaaatg gagagtctga attttattag agctcacaca ccatatatta acatatacaa 5400 ctgtgaacca gctaatccct ctgagaaaaa ctccccatct acccaatact gttacagcat 5460 acaatctctg ttcttggtaa gtgttcttgg taagtgtgag attggatttc tctccaggga 5520 ggaaggatga cttgtttatt atgagcatga actctgaatt ccagaccacc tgtgtttgtc 5580 tgcttcaact gattattcat accttacttt ctatcagcaa tacacattaa ccatctgttg 5640 tgtgccaaaa gttgtgttaa gagttagggt tataaagatg ctgtctcctg tactagcagt 5700 tctcacagct attcattact tgtctaaaga attgatctct taatcgttca attatagtca 5760 acaataactt actgaacacc aacaatgttc tttgtgccat tattacattt tcaccttcat 5820 tcttctgttg tttttcaggg cattttgtca gtgatgctga tctttgcctt cttccaggaa 5880 cttgtaatag ctggcatcgt tgagaatgaa tggaaaagaa cgtgctccag acccaaatct 5940 gtaagtagta gcctccagca ccgtggtcaa tgtctgctgc ccttgaagat ttattcagac 6000 ttgagtttta ataaatgact tgataaggat ataagcacct gcaaaaaaat tttggcattt 6060 aaaggcatat aataaatgac ataagtagca taaaaaccag gaggtatttg ataaatgttt 6120 gtggagattg ttgacaaagg tgtcagttgt aaaagtaaag aatggtttgt ttaattttct 6180 gttttagaac atagttctcc tgtcagcaga agaaaaaaaa gaacagacta ttgaaataaa 6240 agaagaagtg gttgggctaa ctgaaacatc ttcccaacca aagaatgaag aagacattga 6300 aattattcca atccaagaag aggaagaaga agaaacagag acgaactttc cagaacctcc 6360 ccaagatcag gaatcctcac caatagaaaa tgacagctct ccttaa 6406 <210> 4 <211> 1388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CD20 <400> 4 gaattccttt tttttttttt tttttaaaga tttatttatt attatatgta agtacactgt 60 agctatcttc aagtacttga gatagaagag gccaactgat ctcagctgtg agtggctaat 120 ttggccctta agccttggag ccttggagcc ttggagaccc aggcgtttga aaactcaatg 180 agtggacctt tcccagcaga gcctacaaaa ggtcccctcg ccatgcaacc tgctccaaaa 240 gtgaacctca aaaggacatc ttcactggtg ggccccacac aaagcttctt catgagggaa 300 tcaaaggctt tgggggctgt ccaaatcatg aatggcctct tccatattac cctgggggga 360 ctgctgatga tccccacagg ggtcttcgca cccatctgtt tgagtgtatg gtaccctctc 420 tggggaggca ttatgtacat tatttcagga tcactcctgg cagctgcagc agaaaaaacc 480 tccaggaaga gtttggtcaa agcaaaagtg ataatgagct ctctaagcct ctttgctgcc 540 atttctggaa taattctttc aatcatggac atacttaaca tgacactttc tcatttttta 600 aaaatgagaa gactggagct tattcaaact tccaagccgt atgttgatat ctacgactgt 660 gaaccatcta attcctcaga gaaaaactcc ccatctacac agtactgtaa cagcattcag 720 tctgtgttct tgggcattct gtcggcgatg ctgatctctg ccttcttcca gaaacttgtg 780 acagctggta ttgtggagaa tgagtggaaa agaatgtgta ccagatccaa atctaatgtg 840 gttctgctgt cagctggaga aaaaaatgag cagacgatta aaatgaaaga agaaatcatt 900 gagctaagtg gagtatcttc ccaaccaaag aatgaagagg aaattgaaat tattccagtg 960 caggaggaag aagaagaaga agcagaaata aattttccag cacctcccca agagcaggaa 1020 tccttgccag tggaaaatga gatcgctcct taaactcttt tcttttctaa gcattattgt 1080 ttagagagct tccaagacac atagttaccc tcatctcttg tggccttcca caatctattc 1140 tccatatttt cacagcttaa ctttgcatag agaagccaca tctagctctc cttcacattt 1200 gaagaatgca gtgattataa aagattgtct tttgccttgc ttagggagtc ttacactggc 1260 agaaacgctg aagaatccaa ttctcattca ccttttcctt ggatgtgtgt ctcagtagtg 1320 gtaatggttt ttccgcattt cctccatcag cagttacagc agaaggagtc agagagttca 1380 gggaattc 1388

Claims (17)

  1. 인간 CD20을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈을 갖는 비-인간 트랜스제닉 동물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 인간 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스제닉 동물.
  3. 제2항에 있어서, 세포가 인간 CD20을 발현하는 트랜스제닉 동물.
  4. 제3항에 있어서, 인간 CD20이 B 림프구의 표면상에서 발현되는 트랜스제닉 동물.
  5. 제3항에 있어서, 인간 CD20이 B 림프구상에서, 이 발현 세포에 항-인간 CD20 항체가 결합하여 상기 세포를 사멸시키기에 충분한 수준으로 발현되어 B 세포 고갈이 일어나는 트랜스제닉 동물.
  6. 제1항에 있어서, 게놈에서 인간 CD20에 실질적으로 상동성인 CD20 분자를 코딩하는 내인성 유전자가 파괴된 트랜스제닉 동물.
  7. 제6항에 있어서, 내인성 유전자가 뮤린 CD20을 코딩하는 것인 트랜스제닉 동물.
  8. a) 제1항 또는 제6항의 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계,
    b) B 세포 림프종을 치료할 수 있는지를 확인할 작용제를 제1항 또는 제6항의 동물에게 투여하는 단계, 및
    c) 상기 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하고, 이때 상기 동물에서 작용제 처치 후에 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수 감소로써 상기 작용제가 B 세포 림프종을 치료할 수 있는 작용제임을 확인하는 것인, B 세포 림프종을 치료할 수 있는 작용제를 확인하는 방법.
  9. 제8항에 따라 확인된 작용제.
  10. a) 제1항 또는 제6항의 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계,
    b) 인간 CD20을 발현하는 세포를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는지를 확인할 작용제를 제1항 또는 제6항의 동물에게 투여하는 단계, 및
    c) 상기 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하고, 이때 상기 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수 감소로써 상기 작용제가 CD20을 발현하는 세포를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는 작용제임을 확인하는 것인, 인간 CD20을 발현하는 세포를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는 작용제를 확인하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 방법.
  12. 제11항에 따라 확인된 작용제.
  13. 제1항 또는 제6항의 트랜스제닉 동물로부터 유래된 세포 또는 조직.
  14. 제1항 또는 제6항에 있어서, 설치류인 트랜스제닉 동물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 설치류가 마우스인 트랜스제닉 동물.
  16. a) 제1항 또는 제6항의 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계,
    b) 작용제를 제1항 또는 제6항의 동물에게 투여하는 단계,
    c) 상기 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하며, 이때 상기 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수 감소로써 상기 작용제가 CD20을 발현하는 세포를 고갈시키거나 사멸시킬 수 있는 작용제임을 확인하는 단계, 및
    d) 상기 동물을 단기적인 부작용 또는 장기적인 부작용에 대해 모니터링하는 단계
    를 포함하는, 항-인간 CD20 요법의 안전성을 시험하는 방법.
  17. a) 제1항 또는 제6항의 동물 세트에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계,
    b) 작용제를 여러가지 투여량 세트로 각각의 동물에게 투여하는 단계, 및
    c) 각 투여 이후에 상기 동물에서 인간 CD20을 발현하는 B 림프구의 수준을 측정하는 단계, 및
    d) 작용제에 의해 대부분의 B 세포가 고갈되는 하나 이상의 투여량을 결정하는 단계
    를 포함하는, 항-인간 CD20 요법의 효능을 시험하는 방법.
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