KR20240036000A - 유전자 이식 마우스 라인의 방법 및 용도 - Google Patents

유전자 이식 마우스 라인의 방법 및 용도 Download PDF

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쿠미 사쿠라이
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후지필름 어바인 싸이언티픽, 인크.
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Abstract

특정 실시양태에서, 전사 조절 하에 OCT4를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 유전자 이식 마우스가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 또한 본원에 개시된 것은 유전자 이식 마우스로부터 수득된 배아, 줄기 세포 및 생식계열 세포를 포함한다. 추가 실시양태에서, 본원에 개시된 것은 유전자 이식 마우스를 생성하는 방법 및 유전자 이식 마우스로부터 수득된 배아를 사용하여 제품을 평가하는 방법을 포함한다.

Description

유전자 이식 마우스 라인의 방법 및 용도
본 출원은 35 U.S.C § 119(e)에 따라 2021년 6월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 63/213,335에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
유전적으로 조작된 뮤린 모델은 전체 동물 수준에서 유전자 기능을 연구하는 데 중요하다. 유전자 손실 기능 전략을 대표하는 유전자 녹아웃(Gene knockout) 마우스 및 기능 획득 접근법을 대표하는 유전자 이식 마우스가 관심 유전자 또는 단백질의 분자 및 세포 기능을 평가하기 위해 활용될 수 있다. 일반적으로, 유전자 이식 마우스는 수정란(난모세포 또는 접합자)에 유전자 이식 구성물을 미세주입함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 이식유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터는 유전자 이식 마우스의 후속 생성을 위해 난자 내로 도입될 수 있다.
발달 동안, 착상-전 배아는 산모 전사체의 유전적 제어 하에 있는 대사적으로 중단된 미분화 단일 세포로부터 항상성 메커니즘 및 자신의 기능화한 게놈을 발달시킨 역동적인 다세포의 배아로, 단 며칠 만에 빠르게 변화한다 (Leese 1991; Lane 2001; Gardner et al. 2005). 피루베이트-기반 대사에 의존하고, 에너지 생산을 위해 오로지 미토콘드리아 산화적 인산화에 의존하는 초기 배아는, 단세포 유기체와 마찬가지로, pH 및 삼투압 조절을 위한 많은 주요 조절 기능이 부족하다. 8- 내지 16-세포 단계로 압축된 이후에는, 고도의 해당작용(glycolytic) 대사로의 대사 조절 변화가 있다. 동시에, 배아의 생리가 체세포의 생리와 더욱 비슷해짐에 따라 다른 세포 메커니즘의 기능적 복잡성에도 뚜렷한 변화가 있다. 실험실에서 상당한 문제를 야기하는 것은 초기 배아에서의 항상성 조절의 초기 조잡한 특성 및 착상-전 발달의 후기 단계를 통한 이의 후속 발달이다. 유리한 시험관내 환경을 유지하는 것은, 특히 하나 이상의 관심 유전자 또는 단백질의 조절과 함께 생존력을 극대화하고 진행 중인 발달을 촉진하는 데 필수적이다.
생식관에서 직면하게 되는 "정상" 조건에 비해, 배양 내 발달 동안 배아를 둘러싼 환경의 교란(Perturbation)은 감소된 배아 생존력 및 손상된 발달을 초래한다. 이와 같이, 배아 발달 및 독성을 평가하기 위한 민감하고 재현가능한 방법 및 검정에 대한 필요성이 있다.
발명의 요약
특정 실시양태에서, 전사 조절 하에서 OCT4를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 유전자 이식 마우스가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 또한 본원에 개시된 것은 유전자 이식 마우스로부터 수득되는 배아, 줄기 세포 및 생식계열 세포를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 본원에 개시된 것은 유전자 이식 마우스를 생성하는 방법 및 유전자 이식 마우스로부터 수득된 배아를 사용하여 제품을 평가하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사 조절 하에서 옥타머-결합 전사 인자 4(OCT4)를 포함하는 융합 단백질의 안정한 발현을 포함하는 유전자 이식 마우스가 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 융합 단백질의 유전자 발현은 생식계열 DNA를 통해 안정적으로 전달된다. 일부 예에서, OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 배아가 생성될 수 있고, 여기서 난모세포가 OCT4::EGFP 융합 단백질을 포함하는 정자와 수정되고, 정자는 유전자 이식 마우스로부터 유래된다. 일부 예에서, OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 줄기 세포는 유전자 이식 마우스로부터 유래된다. 일부 예에서, OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 생식계열 세포는 유전자 이식 마우스로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 또한, 박테리아 인공 염색체(BAC) 구성물을 접합자에 미세주입하는 단계를 포함하는 유전자 이식 마우스를 제조하는 방법이 본원에 개시되고, 여기서 구성물은 마우스 OCT4 유전자좌에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하고, 접합자는 대리모 마우스의 생식관에 이식되고, 그에 따라 유전자 이식 마우스를 제조한다.
일부 실시양태에서, 추가적으로, 보조 생식술(ART), 질환의 치료, 약물 스크리닝 또는 면역 조절에 사용되는 제품을 평가하기 위한 방법이 본원에 개시되고, 상기 방법은 (a) OCT4를 포함하는 융합 단백질의 안정한 발현을 포함하는 유전자 이식 배아를 수득하는 단계; (b) 유전자 이식 배아를 배양하는 단계; (c) 융합 단백질의 발현을 평가하는 단계; 및 (d) 제품의 허용성 또는 불충분을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가로, 본원에 기재된 유전자 이식 마우스, 본원에 기재된 배아, 본원에 기재된 줄기 세포 또는 본원에 기재된 생식계열 세포를 포함하고, 선택적으로 사용 지침서를 포함하는 키트가 본원에 개시된다.
도 1a-도 1b는 48시간에서의 본원에 기재된 유전자 이식 배아 및 대조군 배아에 대한 차선의 오일 노출의 효과를 보여준다. 도 1a는 연구 프로토콜을 도시한다. 방법 A는 본원에 기재된 유전자 이식 배아를 사용한 연구 프로토콜을 지칭한다. 방법 B는 대조군 배아를 사용한 연구 프로토콜을 지칭한다. 도 1b는 본원에 기재된 유전자 이식 배아와 대조군 배아 사이의 검출된 할구의 비교를 보여준다.
도 2a-도 2c는 동결보존된 본원에 기재된 유전자 이식 배아 및 대조군 배아에서의 차선 조건의 효과를 보여준다. 도 2a는 연구 설계를 도시한다. 방법 A는 본원에 기재된 유전자 이식 배아를 사용한 연구 프로토콜을 지칭한다. MEA는 대조군 배아를 이용한 마우스 배아 검정을 지칭한다. 본원에 기재된 유전자 이식 배아 및 대조군 배아 사이의 검출된 할구의 비교는 48시간(도 2b) 및 96시간(도 2c)에 도시된다.
도 3은 48시간에서의, 만료된 ART 배지 A에서 배양된 대조군 배아 및 본원에 기재된 유전자 이식 배아에서의 OCT4-GFP의 비정상적인 발현을 보여준다. 방법 A는 본원에 기재된 유전자 이식 배아의 사용을 지칭한다. MEA는 대조군 배아를 이용한 마우스 배아 검정을 지칭한다.
도 4는 96시간에서의, 만료된 ART 배지 A에서 배양된 대조군 배아 및 본원에 기재된 유전자 이식 배아에서의 OCT4-GFP의 비정상적인 발현을 보여준다. 방법 A는 본원에 기재된 유전자 이식 배아의 사용을 지칭한다. MEA는 대조군 배아를 이용한 마우스 배아 검정을 지칭한다.
정의
본 개시내용에 따른 실시양태는 이하에 보다 충분히 설명될 것이다. 그러나 본 개시내용의 양태는 다른 형태로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 실시양태로 한정되는 것으로 이해되어서는 안 된다. 오히려, 이들 실시양태는 본 개시내용이 철저하고 완전해지도록 제공되는 것이고, 본 개시내용의 범위를 당업자에게 충분히 전달할 것이다. 본원의 설명에서 사용된 기술용어는 특정 실시양태를 설명하려는 목적을 위한 것일 뿐, 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어 포함)는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 통상적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 맥락에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에 그렇게 명시적으로 정의되지 않는 한 이상화되거나 지나치게 공식적인 의미로 해석되어서는 안 된다는 것이 추가로 이해될 것이다. 이하에 명시적으로 정의되지는 않았지만, 이러한 용어는 이들의 통상적인 의미에 따라 해석되어야 한다.
본원의 설명에 사용된 기술용어는 단지 특정 실시양태의 설명의 목적을 위한 것일 뿐, 본 개시내용을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
본 기술의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 조직 배양, 유기 화학 약리학, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989)]; [Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))]; [the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))] 참조.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 개시내용의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 제외되거나 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시를 위해, 명세서가 복합체가 구성성분 A, B 및 C를 포함한다고 명시하는 경우, A, B 또는 C 중 임의의 것 또는 이들의 조합은 단독 또는 임의의 조합으로 부인될 수 있고 생략될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
모든 수치 지정, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은, 범위를 포함하여, 적절하게 1.0 또는 0.1의 증분으로, 또는 대안적으로 +/- 15% 또는 대안적으로 10% 또는 대안적으로 5% 또는 대안적으로 2%의 편차로 달라지는 근사치이다. 항상 명시적으로 명시되지는 않지만, 모든 수치 지정은 용어 "약"이 선행되는 것이 이해되어야 한다. 또한, 항상 명시적으로 명시되지는 않지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며, 이의 등가물이 당업계에 알려져 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 개시내용의 설명 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백히 달리 나타내지 않는 한, 복수형도 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 양 또는 농도 등과 같은 측정가능한 값을 지칭하며, 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 기재된 요소들을 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 구성되는"은, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때, 조합에서 임의의 본질적인 중요성의 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성된 조성물 또는 방법은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 다른 요소를 배제하지 않을 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "구성된"은 미량을 초과하는 다른 성분 및 기재된 실질적인 방법 단계를 배제함을 의미할 것이다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "허용되는," "유효한" 또는 "충분한"은 본원에 개시된 임의의 구성성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 지칭하며, 이는 상기 구성성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 적합하다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 관련된 나열 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 서열," "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이 용어는, 비제한적으로 푸린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 추가로 구성되는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 중합체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인핸서"는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소에 대해 인코딩하는 DNA 서열의 영역을 지칭한다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복은 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성," "외인성" 또는 "이종성(heterologous)"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내의 소정의 유전자와 자연적으로 연결되는 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 대해 병치(juxtaposition)로 배치되는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제 결합 부위, 전사 개시 부위 및/또는 TATA 박스를 함유하고, 관련된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 유전자의 전사 및 발현을 보조하거나 촉진하는 DNA 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전사 조절 하에서"는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 폴리뉴클레오티드 서열, 일반적으로 DNA 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 가동되도록 연결되는 것에 의존하는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 적어도 2개의 공유 결합된 아미노산의 쇄를 지칭한다. 폴리펩티드는 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 본원에 제공된 단백질은 본원에 제공된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 단백질은 본원에 제공된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단백질"은 세포에 구조 또는 효소 활성을 제공할 수 있는 아미노산 잔기의 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "코딩 서열"은 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인코딩"은, 핵산 서열에 적용될 때, 천연 상태에 있는 경우 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 경우, 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 생성할 수 있는 폴리펩티드를 "인코딩"한다고 말하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 상보물이며, 인코딩 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동등한" 또는 "생물학적으로 동등한" 또는 "유사한"은 특정 분자, 생물학적 또는 세포 물질을 지칭할 때 상호교환적으로 사용되며, 원하는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의미한다. 동등한 폴리펩티드의 비제한적 예는, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 60%, 또는 대안적으로 적어도 65%, 또는 대안적으로 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 높은 엄격도(stringency)의 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보물에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 높은 엄격도의 조건은 본원에 기재되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 이의 등가물은 참조 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 야생형 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%의 동일성, 또는 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 대한 상보물에 의해 인코딩되는 폴리펩티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가동되도록 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오티드가 세포에서 기능할 수 있게 하는 방식으로 배열되는 것을 의미한다.
또한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 전사 및 번역된 후 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩할 수 있는 적어도 하나의 개방형 해독틀(ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "유전자 산물" 또는 대안적으로 "유전자 발현 산물"은 유전자가 전사되고 번역될 때 생성되는 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리포터 유전자"는 생존성 마커의 조절 영역에 작동가능하게 연결될 수 있고 시각화되거나 그렇지 않으면 평가되어 이의 발현을 결정할 수 있는 유전자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 리포터 유전자는 형광성 또는 발광성 단백질이다. 형광 단백질은 비제한적으로 청색/UV 단백질, 예컨대 TagBFP, mTagBFP2, 아주라이트, EBFP2, mKalama1, 시리우스, 사파이어 및 T-사파이어; 청록색 단백질, 예컨대 ECFP, 세룰린(cerulean), SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, 단량체성 미도리쉬-사이안(Midoriishi-Cyan), TagCFP 및 mTFP1; 녹색 단백질, 예컨대 EGFP, 에메랄드, 슈퍼폴더(Superfolder) GFP, 단량체성 아자미 그린(Azami Green), TagGFP2, mUKG, mWasabi 또는 클로버; 황색 형광 단백질, 예컨대 EYFP, 시트린, 비너스, SYFP2, ZsYellow1 및 TagYFP; 단량체성 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), mKOk, mKO2, mOrange 및 mOrange2를 포함할 수 있는, 리포터 유전자로서 사용하기 위한 오렌지색 단백질; 적색 단백질, 예컨대 HcRed1, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, mApple, mRuby 및 mRuby2; 및 mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune 및 NirFP를 비제한적으로 포함하는 원적색 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YPE) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 예를 들어 항체에 의해 인식되는 에피토프 태그(예를 들어 HIS, FLAG, HA)이거나, 이를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 아미노산 또는 펩티드모방 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 각 도메인을 촉진하거나 이와 상호작용할 수 있는 유연한 형태, 정렬된 2차 구조를 형성할 수 없는 것, 또는 소수성 또는 하전된 유연한 특성을 포함하는 하나 이상의 특성을 갖는다. 유연한 단백질 영역에서 전형적으로 발견되는 아미노산은 비제한적으로 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 링커 서열의 길이는 기능 또는 활성에 유의미하게 영향을 주지 않으면서 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 단일 단백질로서 전사 및 번역되도록 개별적으로 인코딩되어 결합하는 적어도 2개의 도메인의 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 유기체, 바이러스 또는 염색체외 DNA의 게놈의 뉴클레오티드 서열의 변경을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "~를 안정적으로 발현하다" 또는 "~들을 안정적으로 발현하다"는 게놈에 대한 외래 유전자의 통합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C-말단," "카복실-말단," "카복시-말단," "C-말단 미부(tail)," "C-말단 단부" 또는 "COOH-말단"은 유리 카복실 기(-COOH)에 의해 끝나는 아미노산 쇄의 단부를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "N-말단," "아미노-말단," "NH2-말단," "N-말단 단부" 또는 "아민-말단"은 유리 아민 기(-NH2)를 가리키는 아미노산 쇄의 시작을 지칭한다. 단백질이 메신저 RNA로부터 번역될 때, 이는 N-말단에서 C-말단으로 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "박테리아 인공 염색체 구성물" 또는 "BAC 구성물"은 박테리아에서 형질전환 및 클로닝에 사용되는 DNA 구성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생식계열"은 유전 물질을 후손에게 전달하는 다세포 유기체 세포의 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생식계열은 난자, 정자 및 수정된 난자를 형성하는 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 배지 내에서의 세포 또는 유기체의 시험관내 증식을 지칭한다. 배양에서 성장한 세포의 자손은 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있다는 것(즉, 형태학적, 유전적 또는 표현형적으로)이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포유동물"은 포유동물강으로 분류된 임의의 종을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마우스"는 무스 무스클루스(Mus musculus)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "독자 생존가능한"은 특정 환경 조건 하에서 생존하거나 살아갈 수 있는 동물 또는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "번식 능력이 있는"은 자손을 낳을 수 있는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자손" 또는 "후손"은 살아있는 유기체에서 태어난 어린 개체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생식관" 또는 "생식계"는 생식 과정에 기여하고 이를 돕는 일련의 기관을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대리모"는 또 다른 동물 대신에 자손을 낳기 위해 배아 이식 또는 인공 수정에 의해 임신되는 암컷 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 이식"은 숙주 게놈에 통합되었거나 숙주 세포에서 복제할 수 있고 하나 이상의 세포 산물의 발현을 일으킬 수 있는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 예시적인 이식유전자는 형질전환되지 않은 상응하는 세포 또는 동물에 비해 신규한 표현형을 숙주 세포 또는 그로부터 발달된 동물에 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 이식 동물"은 세포의 적어도 일부에서 염색체외 요소로 존재하거나 생식세포 계열 DNA에 안정적으로 통합된 비-내인성 핵산 서열을 갖는 비-인간 동물, 일반적으로 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자 이식 동물은 유전자 이식 마우스이다.
유전자 이식 과정(Transgenesis)은 관심 유전자에 연결된 리포터 유전자를 갖는 마우스와 같은 유전자 이식 포유동물을 생성하기 위해 사용된다. 분자 유전학 및 유전 공학의 방법은, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al.)]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.)]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, eds.)]; [Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3.sup.rd Edition (F. M. Ausubel et al., eds.)]; 및 [Recombinant DNA Methodology (R. Wu ed., Academic Press)]의 최신판에 일반적으로 기재되어 있다. 따라서, 유전자 이식 기술은 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Transgenic Mouse: Methods and Protocols (M. Hofker and J. Deursen, Eds.) in Methods in Molecular Biology (Vol. 209)] 참조 (이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미세주입"은 유리 마이크로피펫을 사용하여 물질을 현미경 수준으로 주입하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보조 생식술" 또는 "ART"는, 본원에 사용된 바와 같이, 암컷 생식세포(난자 또는 난모세포) 및 수컷 생식세포(정자)를 모두 다루는 모든 번식 처리를 포함한다. 시험관내 수정(IVF)은 불임 부부가 아이를 임신하는 데 도움을 주기 위해 사용되는 여러 보조 생식술 중 하나이다. IVF는 실험실 절차에서 암컷의 난소로부터 난자를 제거하고 정자와 수정시키는 절차를 지칭한다. 수정된 난자(배아)는 후일의 사용을 위해 동결보존되거나 자궁으로 옮겨질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "상실배"는 투명대(zona pellucida) 내에 함유된 고체 뭉치(ball)에 약 16개의 세포를 포함하는 초기 단계 배아를 지칭한다. 상실배는 할구로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "배반포"는 태반을 형성할 주변 벽(영양외배엽 또는 TE), 양막 낭(amniotic sac)을 형성할 유체로 채워진 공동(할강(blastocoel)) 및 태아가 발생하는 소위 내부 세포괴(ICM, inner cell mass)로 불리는 세포의 내부 클러스터를 갖는 세포의 뭉치(ball of cell)로 구성된 초기 배아 발달의 구조를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 옥타머-결합 전사 인자 4(Oct-4 또는 OCT4; 또한, POU 도메인, 클래스 5, 전사 인자 1(POU5F1)로도 지칭됨)는 미분화된 배아 줄기 세포의 자가-재생(self-renewal)에 관여하는 단백질이다. OCT4는 N-말단 도메인, POU 도메인 및 C-말단 도메인의 세 가지 도메인을 함유한다. N-말단 및 C-말단 도메인은 모두 전사활성화에 관여하지만, C-말단 도메인의 활성은 세포 종류에 특이적이며 인산화를 통해 조절된다. POU-도메인은 세포 종류-특이적 조절 인자에 의한 결합을 위한 상호작용 부위로서 기능한다.
마우스 배아 검정(MEA)은 독성 및 차선의 화합물을 검출하기 위해 활용되는 기능적 및 독성학적 생물검정(bioassay)이다. MEA는 인간 물질을 포함하지 않고 배양 배지와 환경의 적용성을 검사하는 최적 표준(gold standard)이었다. MEA를 수행하기 위해 사용되는 기본 기술 및 프로토콜은 문헌 [In Vitro Fertilization and Embryo Transfer: A Manual of Basic Techniques　(Don P. Wolf, Editor), 1988, pages 57-75]; 및 [Mouse Embryo Assay for Assisted Reproduction Technology Devices: Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, issued by the U.S. Food and Drug Administration]에 제시되어 있고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 간략하게는, 검정은 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG) 및 인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG)을 사용한 암컷 마우스의 과배란을 포함한다. hCG 주입 시점에서 마우스를 수컷과 함께 배치하고, hCG 24시간 후에 죽여서 1 세포 배아를 수득하거나, 주입 36시간 후에 죽여서 2 세포 배아를 수득한다. 1 세포 배아는 2개의 극체가 가시적인 경우 사용을 위해 선택되고; 2 세포 배아는 형태학적으로 정상으로 보이는 경우 사용을 위해 선택된다. 테스트 물품이 마우스 배아에 대해 임의의 독성을 나타낼 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 배아는 1 세포 시스템이 사용되는 경우에는 약 96시간 동안, 또는 2세포 시스템의 경우 72시간 동안 일반 배양 조건(예를 들어, 37℃ 및 5% CO2) 하에서 테스트 물품에서 항온처리될 수 있다. 대안적으로, 배양은 또한 5일 또는 6일 이상 연장될 수 있다. 배아 배양의 완료 시, 배아는 발달(예를 들어, 배반포 발달)에 대해 평가될 수 있다. 승인은 확장된 배반포로 발달된 80% 이상의 배아를 포함할 수 있다.
유전자 이식 마우스
특정 실시양태에서, 옥타머-결합 전사 인자 4(OCT4)를 포함하는 융합 단백질의 안정한 발현을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 유전자 이식 마우스가 본원에 개시된다. 일부 예에서, 융합 단백질은 전사 조절 하에 있다. 일부 예에서, 융합 단백질의 유전자 발현은 생식계열 DNA를 통해 안정적으로 전달된다.
일부 실시양태에서, OCT4 단백질은 마우스 OCT4이다. OCT4 단백질은 전장 OCT4 또는 이의 단편, 예를 들어, 이의 기능성 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 단편"은 야생형 OCT4와 동등한 기능, 예를 들어 전사 활성화, 미분화 배아 줄기 세포의 자가-재생 및/또는 배아 세포의 전분화능과 같은 동등한 기능을 유도할 수 있는 OCT4 단편을 지칭한다. 일부 예에서, OCT4 단백질은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50개 이상의 잔기의) 결실을, N-말단, C-말단 및/또는 단백질 내의 내부 영역에 포함한다. 일부 예에서, OCT4 단백질은 도메인의 결실, 예를 들어 N-말단 도메인, C-말단 도메인 및/또는 POU 도메인의 결실을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 야생형 OCT4 단백질을 포함한다. 다른 경우에, OCT4 단백질은 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 돌연변이를 포함한다.
OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 80%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 96%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 98%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1로 구성된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 형광 태그된 OCT4 단백질이다. 일부 예에서, 형광 태그는 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)을 포함하는 형광 단백질이다. 일부 경우에, 형광 단백질은 GFP 또는 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)이다. 일부 경우에, 형광 단백질은 야생형 단백질, 예를 들어 야생형 GFP 또는 eGFP이다. 다른 경우에, 형광 단백질은 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 GFP 또는 eGFP 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 형광 단백질은 GFP(예를 들어, eGFP)이다. 일부 예에서, GFP(예를 들어, eGFP)는 전장 GFP이다. 다른 예에서, GFP(예를 들어, eGFP)는 이의 단편, 예를 들어 이의 기능성 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 단편"은 형광을 생성할 수 있는 GFP 단편을 지칭한다. 일부 예에서, GFP(예를 들어, eGFP)는 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50개 이상의 잔기의) 결실을, N-말단, C-말단 및/또는 단백질 내의 내부 영역에 포함한다. 일부 예에서, GFP(예를 들어, eGFP)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, GFP(예를 들어, eGFP)는 A206K 돌연변이를 포함한다.
일부 예에서, 형광 단백질은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 GFP이다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 80%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 96%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 98%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, GFP는 서열번호: 2로 구성된다.
형광 단백질(예를 들어, GFP 또는 eGFP)은 OCT4 단백질의 N-말단, C-말단 또는 내부 부위에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에, 형광 단백질(예를 들어, GFP 또는 eGFP)은 OCT4 단백질의 C-말단에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 생식계열은 비제한적으로 정자, 난모세포, 줄기 세포 또는 접합자로부터 선택된다. 일부 경우에, 생식계열은 정자로부터 선택된다. 일부 경우에, 생식계열은 난모세포로부터 선택된다. 일부 경우에, 생식계열은 줄기 세포로부터 선택된다. 일부 경우에, 생식계열은 접합자로부터 선택된다.
일부 예에서, 유전자 이식 마우스는 독자 생존가능하고 번식 능력이 있는 마우스이다. 일부 예에서, 유전자 이식 마우스는 자손에 안정적으로 통합된 융합 단백질을 포함하는 자손을 생성할 수 있는 독자 생존가능한 수컷이다. 다른 예에서, 유전자 이식 마우스는 자손에 안정적으로 통합된 융합 단백질을 포함하는 자손을 생성할 수 있는 독자 생존가능한 암컷이다.
일부 경우에, 접합자에서 융합 단백질의 유전자 발현은 2-세포 단계, 3-세포 단계 또는 4-세포 단계 세포 발달로부터 시작한다.
특정 실시양태에서, 상기한 유전자 이식 마우스를 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 방법은 마우스 OCT4 유전자좌에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하거나, 대안적으로 이로 본질적으로 구성되거나, 추가적으로 이로 구성되는 구성물을 이용한 접합자의 미세주입을 포함하거나, 대안적으로 이로 본질적으로 구성되거나, 추가적으로 이로 구성되며, 접합자는 대리모 마우스의 생식관에 이식되며, 그에 따라 유전자 이식 마우스를 제조한다. 일부 예에서, 구성물은 박테리아 인공 염색체(BAC) 구성물이고, 구성물은 마우스 OCT4 유전자좌에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하거나, 대안적으로 이로 본질적으로 구성되거나, 추가적으로 이로 구성된다. 일부 경우에, 유전자 이식 마우스는 리포터 유전자를 안정적으로 발현한다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자 유전자좌는 유전자 이식 마우스의 생식계열 DNA를 통해 안정적으로 전달된다. 생식계열은 정자, 난모세포, 줄기 세포 또는 접합자로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 예에서, 형광 단백질은 비제한적으로 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)로부터 선택된다. 하나의 양태에서, GFP는 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)이다. 하나의 양태에서, eGFP는 A206K 돌연변이를 포함하거나, 대안적으로 이로 본질적으로 구성되거나, 추가적으로 이로 구성된다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 80%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 85%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 96%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 98%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2를 포함하는 형광 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 2로 구성된 형광 단백질을 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 하나의 양태에서, 코딩 서열은 OCT4 단백질을 인코딩한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 80%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 96%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 98%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질은 서열번호: 1로 구성된다.
일부 실시양태에서, 리포터 유전자 및 유전자 코딩 서열(예를 들어, OCT4)은 링커에 의해 분리된다. 하나의 양태에서, 링커는 Ala, Gly 또는 이의 조합을 복수 포함하는 아미노산 서열을 인코딩한다. 하나의 양태에서, 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하고, 여기서 n은 1 내지 10으로부터 선택되는 정수; 선택적으로 1 내지 6, 1 내지 4, 및 1 내지 3으로부터 선택되는 정수; 추가로 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택되는 정수이다. 하나의 양태에서, 링커는 (서열번호: 3)를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 리포터 유전자는 코딩 서열(예를 들어, OCT4)의 N-말단, C-말단 또는 내부 영역에서 작동가능하게 연결된다. 하나의 양태에서, 링커는 리포터 유전자를 코팅 서열(예를 들어, OCT4)의 C-말단에 연결한다.
일부 실시양태에서, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 예에서, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 80%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 96%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 98%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, OCT4 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호: 4로 구성된다.
일부 실시양태에서, 구성물은 OCT4::EGFP 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 예에서, 구성물은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 80%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 85%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 96%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 98%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 서열번호: 5로 구성된다.
일부 예에서, 구성물은 OCT4::EGFP 융합 단백질의 발현을 매개한다. 일부 경우에, OCT4::EGFP 융합 단백질은 접합자에 안정적으로 통합된다.
일부 예에서, 구성물 내의 OCT4 유전자좌는 근위 인핸서 요소의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 배아가 본원에 개시되고, 여기서 난모세포는 OCT4::EGFP 융합 단백질을 포함하는 정자로 수정되고, 정자는 상기한 유전자 이식 마우스로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 상기한 유전자 이식 마우스로부터 유래되는 OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 줄기 세포가 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 상기한 유전자 이식 마우스로부터 유래된 OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 생식계열 세포가 본원에 개시된다.
제품 평가 방법
특정 실시양태에서, 보조 생식술(ART), 질환의 치료, 약물 스크리닝 또는 면역 조절에 사용되는 제품을 평가하기 위한 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 방법은 (a) OCT4를 포함하는 융합 단백질의 안정한 발현을 포함하는 유전자 이식 배아를 수득하는 단계; (b) 유전자 이식 배아를 배양하는 단계; (c) 융합 단백질의 발현을 평가하는 단계; 및 (d) 제품의 허용성 또는 불충분을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 OCT4 단백질에 융합된 형광 단백질이다. 일부 예에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)로부터 선택된다. 일부 경우에, 형광 단백질은 GFP 또는 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)로부터 선택된다. 일부 경우에, eGFP는 돌연변이, 예를 들어 A206K 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 평가 단계는 융합 단백질의 시간적 및/또는 공간적 발현 패턴을 결정하는 단계를 포함한다. 평가 단계는 융합 단백질의 핵 국소화 및/또는 세포질 국소화를 시각화하는 것을 포함할 수 있다. 핵 국소화는 융합 단백질을 핵 내로 이동시키는 것뿐만 아니라 핵에서 융합 단백질에 의해 DNA를 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 평가 단계는 융합 단백질의 시간적 및/또는 공간적 발현 패턴을 대조군과 비교하여 배아 발달에 이상이 발생했는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 대조군은 정상적인 발달을 통해 진행된 배아와 동등한 배아로부터의 융합 단백질의 시간적 및/또는 공간적 발현 패턴을 지칭한다.
일부 경우에, 평가 단계는 4-세포 또는 8-세포 단계에 일어난다. 일부 경우에, 융합 단백질은 4-세포 단계의 핵에서 지배적으로 국소화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지배적으로(predominately)"는 핵에서 국소화된 융합 단백질의 적어도 또는 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상을 지칭한다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 50%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 60%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 70%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다.
일부 예에서, 평가 단계는 4-세포 또는 8-세포 단계에서 융합 단백질의 발현의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 융합 단백질은 4-세포 단계의 핵에서 지배적으로 발현된다(예를 들어, 핵에서 발현되는 융합 단백질의 적어도 또는 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상). 일부 경우에, 적어도 또는 약 50%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 60%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 70%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다.
일부 예에서, 평가 단계는 8-세포 단계에서 일어난다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 약 100%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다.
일부 예에서, 평가 단계는 8-세포 단계에서 융합 단백질의 발현의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 약 100%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다.
일부 예에서, 평가 단계는 상실배 단계에서 일어난다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%, 90% 또는 95% 이상의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80% 이상의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90% 이상의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95% 이상의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다. 일부 경우에, 약 100%의 융합 단백질은 핵에서 국소화된다.
일부 예에서, 평가 단계는 상실배 단계에서 융합 단백질의 발현의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80%, 90% 또는 95% 이상의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80% 이상의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90% 이상의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95% 이상의 융합 단백질은 핵에서 발현된다. 일부 경우에, 약 100%의 융합 단백질은 핵에서 발현된다.
일부 예에서, 평가 단계는 배반포 단계에서 일어난다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 융합 단백질은 내부 세포괴(ICM)에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 70% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 국소화된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 국소화된다. 일부 경우에, 약 100%의 융합 단백질은 ICM에서 국소화된다. 일부 경우에, 융합 단백질은 영양아층(trophoblast)에서 국소화되지 않는다.
일부 예에서, 평가 단계는 배반포 단계에서 융합 단백질의 발현의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 융합 단백질은 내부 세포괴(ICM)에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 70% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 80% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 90% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 발현된다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 95% 이상의 융합 단백질은 ICM에서 발현된다. 일부 경우에, 약 100%의 융합 단백질은 ICM에서 발현된다. 일부 경우에, 융합 단백질 영양아층에서 발현되지 않는다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 약 24시간 내지 약 96시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 96시간, 약 36시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 72시간 또는 약 48시간 내지 약 96시간의 배양 즈음 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 36시간 내지 약 96시간의 배양에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 36시간 내지 약 72시간의 배양에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 36시간 내지 약 48시간의 배양에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 48시간 내지 약 96시간의 배양에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 48시간 내지 약 72시간의 배양에서 검출가능하다. 일부 예에서, 융합 단백질은 예를 들어 형광 단백질의 형광에 기초하여 검출되는 시각적 검사를 통해 검출된다. 또 다른 예에서, 융합 단백질은 핵산 발현 분석을 통해 검출된다. 추가 예에서, 융합 단백질은 단백질 발현 분석을 통해 검출된다.
일부 예에서, 융합 단백질은 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간의 배양에 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 36시간의 배양에 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 48시간의 배양에 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 72시간의 배양에 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 약 96시간의 배양에 검출가능하다. 일부 예에서, 융합 단백질은, 예를 들어 형광 단백질의 형광에 기초하여 검출되는 시각적 검사를 통해 검출된다. 다른 예에서, 융합 단백질은 핵산 발현 분석을 통해 검출된다. 추가 예에서, 융합 단백질은 단백질 발현 분석을 통해 검출된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 2-세포 단계, 3-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 상실배 단계 또는 배반포에서 검출가능하다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 2-세포 단계, 3-세포 단계, 4-세포 단계 또는 8-세포 단계 세포 발달에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 4-세포 단계 세포 발달에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 8-세포 단계 세포 발달에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 16-세포 단계 세포 발달에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 상실배 단계 세포 발달에서 검출가능하다. 일부 경우에, 융합 단백질은 배반포 단계 세포 발달에서 검출가능하다. 일부 예에서, 융합 단백질은, 예를 들어 형광 단백질의 형광에 기초하여 검출되는 시각적 검사를 통해 검출된다. 다른 예에서, 융합 단백질은 핵산 발현 분석을 통해 검출된다. 추가 예에서, 융합 단백질은 단백질 발현 분석을 통해 검출된다.
일부 예에서, 평가 단계는 배양 과정 동안 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 격일 또는 연속된 날마다 일어난다. 일부 경우에, 1회 이상의 평가 단계는 배양 과정의 시작으로부터 약 24시간 내지 약 96시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 96시간, 약 36시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 72시간 또는 약 48시간 내지 약 96시간에 일어난다.
일부 실시양태에서, 평가 단계는, 예를 들어 a) 특정 발달 단계에서 유전자 이식 배아의 적어도 하나의 이미지를 포착하는 단계, b) 이미지에 기초하여 융합 단백질의 위치를 결정하는 단계; 및 c) 융합 단백질의 위치를 대조군과 비교하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대조군은 특정 발달 단계의 동등한 유전자 이식 배아에서의 융합 단백질의 위치일 수 있고, 동등한 유전자 이식 배아는 정상 배아 발달로 진행되었다.
일부 실시양태에서, 평가 단계는 대조군으로 융합 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 발현 수준은 광 방출 및/또는 강도를 시각적으로 또는 이들에 대한 장치를 사용하여 측정하거나, 핵산 발현을 결정하거나, 단백질 발현을 결정함으로써 결정된다.
일부 예에서, 예를 들어, 4-세포 단계, 8-세포 단계 또는 상실배 단계에서, 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 있는 경우, 제품은 허용된다. 일부 예에서, 배반포 단계 동안 ICM에서 국소화 또는 발현이 있는 경우 제품은 허용된다.
일부 경우에, 4-세포 또는 8-세포 단계에서 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만으로 있는 경우, 제품은 허용되지 않는다. 일부 경우에, 8-세포 단계에서 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 없는 경우, 제품은 허용되지 않는다.
일부 경우에, 상실배 단계에서 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만으로 있는 경우, 제품은 허용되지 않는다. 일부 경우에, 상실배 단계에서 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 없는 경우, 제품은 허용되지 않는다.
일부 경우에, 배반포 단계의 ICM에서 융합 단백질의 국소화 또는 발현이 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만으로 있는 경우, 제품은 허용되지 않는다. 일부 경우에, 배반포 단계의 ICM에서 융합 단백질의 국소화 또는 발현이 없는 경우, 제품은 허용되지 않는다. 일부 경우에, 배반포 단계의 영양아층에서 융합 단백질의 국소화 또는 발현이 있는 경우 제품은 허용되지 않는다.
일부 실시양태에서, 제품은 보조 생식술(ART)과 함께 사용하기 위한 것이다. 제품은 비제한적으로 배지, 배지 보충액, 플라스틱 기구, 튜브, 피펫, 피펫 팁 등을 포함하는 소모품 또는 난자 또는 배아와 접촉하게 되는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 플라스틱 및 유리 기구는 보조 생식용 바늘, 실험실 장갑, 보조 생식용 카테터 및 보조 생식용 마이크로툴, 예컨대 피펫 또는 실험실에서 배아를 노출(denude), 미세 조작, 고정 또는 이동시키기 위해 사용되는 다른 장치를 포함할 수 있다. IVF 소모품은 비제한적으로 주사기, IVF 조직 배양 접시, IVF 조직 배양 플레이트, 피펫 팁, 접시, 플레이트, 및 생식세포, 배아 또는 조직 배양 배지와 물리적으로 접촉하게 되는 다른 용기를 포함하는 보조 생식용 실험실 용품을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, IVF 소모품은 배아에 접촉될 실험실 용품 또는 다른 보조 생식용 장치에 대한 최종 헹굼으로서의 사용뿐만 아니라 IVF 또는 다른 보조 생식용 절차를 위한, 배아의 흡인, 항온처리, 이동 또는 보관에 사용되는 배지의 재구성을 위한 고품질 멸균, 발열원-미함유 물을 생성하기 위해 의도된 정수 시스템 및 보조 생식용 물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제품은 바늘, 카테터, 마이크로툴, 실험실 용품, 주사기, 조직 배양 접시, 조직 배양 플레이트, 피펫 팁, 접시, 플레이트, 물, 정수 시스템, 배지, 배지 보충액 또는 배아와 물리적으로 접촉하게 되는 다른 장치 또는 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 보조 생식술(ART)에 사용되는 제품을 평가하기 위한 방법은 형태학(morphology)-기반 배아 등급화 변동성(embryo grading variability)을 감소시킬 수 있다. 일부 예에서, 방법은 선택적으로 배아 배양 후 48시간 후에 융합 단백질의 핵 국소화의 시각화를 가능하게 할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 마우스 배아 검정(MEA)과 같은 동등한 검정과 비교하여 위양성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 제품은 질환과 관련된 단백질 또는 유전자이다. 제품은 또한 뮤린 모델로 사용하기 위한 단백질 또는 유전자를 포함하는 유전자 이식 마우스를 포함할 수 있다. 질환은 암일 수 있다. 일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 다른 경우에, 암은 혈액학적 악성종양이다. 단백질 또는 유전자는 암과 관련될 수 있고, 선택적으로 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양과 관련될 수 있다. 단백질 또는 유전자는 종양 관련 항원일 수 있다. 예시적인 종양 관련 항원은 비제한적으로 CD19; CD20; CD22(Siglec 2); CD37; CD 123; CD22; CD30; CD 171; CS-1; 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 인간 표피 성장 인자 수용체(HER1); 강글리오시드 G2(GD2); TNF 수용체 계열 구성원 B 세포 성숙(BCMA); 전립선-특이적 막항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1, ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3); 또는 종양 관련 당단백질 72(TAG72)를 포함한다. 단백질 또는 유전자는 또한 정상 대상체에서의 단백질 또는 유전자의 발현과 비교하여 암 대상체에서 과발현되거나 억제된 단백질 또는 유전자일 수 있다.
일부 예에서, 제품은 뮤린 모델로 사용하기 위한 단백질 또는 유전자를 포함하는 유전자 이식 마우스, 및/또는 자가면역 질환과 관련된 단백질 또는 유전자이다. 단백질 또는 유전자는 정상 대상체에서의 단백질 또는 유전자의 발현과 비교하여, 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체에서 과발현되거나 억제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제품은 배아의 발달과 관련된 단백질 또는 유전자이다. 단백질 또는 유전자는 단백질-단백질 상호작용(들) 또는 유전자 발현(들), 대사 과정, 세포 형태형성, 세포 분열, 세포 증식, DNA 복제, 세포 분화 또는 DNA 복구 및 전사를 조절하는 것과 관련될 수 있다. 단백질 또는 유전자는 세포 통신(cellular communication), 세포사멸(apoptosis), 면역 반응, 하우스키핑(housekeeping) 또는 조직 특이적 기능과 관련될 수 있다. 예시적인 단백질 또는 유전자는, 비제한적으로 다능성 줄기 세포(PS)-특이적 마커, 예컨대 Sox 유전자 패밀리(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15, 및 Sox18); Klf4 및 Klf5와 같은 Klf 유전자 패밀리; 또는 NANOG와 같은 나노그(Nanog) 유전자 패밀리; TGF-베타 슈퍼패밀리 및 이들 각각의 수용체와 관련된 마커; 크립틱(cryptic) 단백질 패밀리(예를 들어, Cripto-1)와 관련된 마커; 인테그린 패밀리와 관련된 마커(예를 들어, 인테그린 알파 6(CD49f) 및 인테그린 베타 1(CD29)); 다음과 관련된 마커: 포도칼릭신 패밀리(PODX-1), FGF 패밀리(예를 들어, FGF4 및 FGF-5), 포크헤드 박스 전사 인자 패밀리(예를 들어, FoxD3), 전사 인자의 T-박스 패밀리(예를 들어, TBX3 및 TBX5), 발달성 전분화능 관련 분자의 패밀리(예를 들어, Dppa2, Dppa3/Stella, Dppa4 및 Dppa5/ESG1), LRR 패밀리(예를 들어, 5T4), 카드헤린 패밀리(예를 들어, E-카드헤린), 막횡단 단백질의 커넥신(connexin) 패밀리(예를 들어, 커넥신-43 및 커넥신-45), "기타" 범주의 F-박스 패밀리(예를 들어, FBOXO15), 케모카인/케모카인 수용체 패밀리(예를 들어, CCR4 및 CXCR4) 또는 ATP-결합 카세트 트랜스포터(예를 들어, ABCG2)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 배아 줄기 세포는 유전자 이식 배아로부터 추가로 수득된다. 하나 이상의 배아 줄기 세포는 복수의 배아 줄기 세포를 생성하기 위해 배양될 수 있다. 복수의 배아 줄기 세포는 후속적으로 약물과 함께 배양될 수 있다. 융합 단백질의 발현은 약물의 허용성 또는 불충분을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 일부 경우에, 약물은 질환, 선택적으로 암 또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 경우에, 약물은 면역 반응을 조절하는 데 사용된다.
배아 발달의 정성적 분석은, 예를 들어 형광 단백질 발현을 시각화하기 위해 UV 광을 포함할 수 있는 광 현미경을 이용해 시각적으로 색상, 광 강도 또는 형광을 평가함으로써 발달 중인 배아를 분석하여 달성될 수 있다. 또한, 공초점 현미경이 발달 중인 배아를 평가하는 데 활용될 수 있다. 일부 경우에, 배아 발달은 배아 관찰경(예를 들어, 엠브리오우스코프(EmbryoScope)® 타임-랩스 시스템, 유니센스 페르틸리테크 에이/에스(Unisense Fertilitech A/S))을 통해 관찰되며, 여기서 발달 중인 배아의 사진은, 예를 들어 대략 5, 10, 20, 30분마다 또는 그 초과의 시간마다 원하는 대로 촬영될 수 있고, 배아 발달의 모든 단계를 추적하기 위해 타임-랩스 비디오가 생성될 수 있다.
키트 및 제조 물품
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법을 수행하기 위한 키트뿐만 아니라 본 개시내용의 방법을 수행하기 위한 지침을 제공한다. 키트는 상기한 융합 단백질을 도입하기 위한 구성물, 변형된 난자(예를 들어, 난모세포 및/또는 접합자), 유전자 이식 배아 및/또는 상기한 유전자 이식 마우스 및 사용 지침서 중 하나 이상을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 추가적으로는 이들로 구성된다.
키트는 또한 본 개시내용의 방법과 함께 사용하기 위한 배양 배지 및/또는 보충액을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 배양 배지는, 비제한적으로 보조 생식 절차에 사용되는 생식 배지 및 보충액을 포함한다. 배지는 준비, 유지 관리, 이동 또는 보관의 목적을 위해 배아와 직접적으로 물리적 접촉을 하게 되는 다양한 물질의 액체 및 분말 버전(예를 들어, 물, 생식세포 또는 배아를 처리하기 위해 사용되는 산성 용액, 헹굼 용액, 시약, 정자 분리 배지 또는 배지를 덮기 위해 사용되는 오일)을 포함할 수 있다. 보충액은 단백질, 혈청, 항생제 등과 같은 배지의 특정 특성을 향상시키기 위해 배지에 추가되는 특정 시약을 포함할 수 있다. 수정 가능하게는, 이들 제안된 키트 구성요소가 당업자의 사용을 위해 관레적인 방식으로 패키징될 수 있다.
부분 서열 목록
OCT4 단백질 서열 - 서열번호: 1
GFP 단백질 서열 - 서열번호: 2
OCT4::EGFP 융합 단백질 서열 - 서열번호: 4
구성물 서열 - 서열번호: 5
실시예
이들 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 제공될 뿐이며, 본원에 제공된 청구범위의 범위를 한정하지 않는다.
실시예 1 - OCT4-GFP 유전자 이식 마우스 제조
재료 및 방법
BAC 클로닝 및 미세주입
Oct4 융합 단백질의 발현을 위해 박테리아 인공 염색체(BAC) 구성물을 사용하였다. 단량체 EGFP를 Oct4(Pou5f1) 유전자좌 내로 재조합-변형(recombineer)하였다. EGFP를 OCT4의 C-말단에 삽입하였다. 리포터 단백질 및 OCT4 사이의 입체 장애를 최소화하기 위해, 유연한 아미노산 링커 코딩 서열(S(GGGGS)3; 서열번호 3)을 유전자 코딩 서열 및 리포터 유전자 사이에 삽입하였다.
B6SJLF1(잭슨 라보레이토리(Jackson Laboratory), 메인 주, 바 하버 소재) 암컷 난자 공여를 이용하였다. PMSG(수확 3일 전, 정오, 동물당 5U: 프로스펙(Prospec), 이스라엘 레호보트 소재, #HOR-272) 및 hCG 호르몬(수확 1일 전, 정오, 동물당 5U, 시그마(SIGMA), 미주리주 세인트루이스 소재, #CG5-1VL)을 순차적으로 주입한 후. 암컷을 수확 하루 전에 B6SJLF1 수컷과 교미시켰다. B6SJLF2 배아를 E0.5에서 수확하고, 각각의 이식유전자에 대한 BAC 구성물을 전핵에 주입하였다. 주입된 배아를 허위-임신 대리모의 생식관에 이식하였다(ICR: 찰스 리버(Charles River), 매사추세츠 윌밍턴 소재). 착상 20일 후, 갓 태어난 새끼의 수를 세고, 7-10일령에 발가락 생체 검사를 수행하여 PCR 유전형 분석을 위한 DNA를 추출하였다.
유전형 분석
유전형 분석을 위해 두 가지 PCR 방법인 통상적인 PCR 및 qPCR을 활용하였다. 통상적인 PCR의 경우, 어닐링 온도는 58℃였다. eGFP 서열을 검출하기 위해 다음과 같은 프라이머를 사용하였다:
eGFP (산물 크기 = 227 bp)
TMF738 정방향: 5'- ATCTTCTTCAAGGACGACGGCAAC -3'(서열번호: 6)
TMF739 역방향: 5'- TCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTG -3'(서열번호: 7)
내부 대조군(마우스 Fndc3a 유전자: 산물 크기 = 400 bp)
TMF725 정방향: 5'- GAGCTTCTGGTATTAGCGTTAGGT -3'(서열번호: 8)
TMF726 역방향: 5'- TCCACAATGACAAAGACATGAGGT -3'(서열번호: 9)
택맨(Taqman) qPCR 프로토콜을 CFX-BioRAD qPCR 설정에서 사용하였다. EGFP의 δCt 값을 알려진 동형접합성(HO) 및 반접합성(HEMI) 대조군 및 내인성 참조(ApoB 유전자)와 비교함으로써, EGFP 이식유전자 유전자형을 결정하였다.
다음과 같은 PCR 조건을 사용하였다: 95℃ 3분 -> (95℃ 15초 -> 60℃ 30초) 시간 40사이클.
표 1은 사용된 프로브 및 qPCR 프라이머를 보여준다.
G0 여교배(backcrossing)
유전자 이식 대립유전자를 단리하기 위해, PCR-양성 G0 파운더(founder)를 B6SJLF1 동물로 여교배시켰다. Oct4-GFP 자손을 G3 세대까지 여교배하여 이식유전자 카피 수를 안정화시켰다.
이미지화를 위한 배아 수확
반접합성(HEMI) 수컷을 B6J 암컷과 교배시켰고, HEMI 암컷을 B6J 수컷 또는 Tg(Pou5f1-EGFP)2Mnn/J(잭슨 라보레이토리, Cat # 004654: TgOG2) HO 수컷과 교배시켰다. B6J 암컷과 TgOG2 암컷을 후속 호르몬 주사(PMSG: 짝짓기 3일 전 및 5U의 hCG: 짝짓기 1일 전)에 의해 과잉 배란하게 하였다. 동물을 밤새(1 세포 배아 수확의 경우) 또는 2일(2 세포 단계 배아 수확) 동안 함께 수용하였다. 배아를 수확하고, 플래너(PLANER) BT-37 항온처리기(오리지오(Origio), 덴마크 말로브 소재)에서, 37℃, 5% CO2, 5% O2, 90% N2에서 평형화된 미네랄 오일이 위에 놓여진 KSOM 액적에서 배양하였다.
이미지화
니콘(Nikon) 현미경을 사용하였다. 배율을 11.5x로 설정하였다. 형광 이미지화 매개변수를 동일한 이득/노출 시간으로 고정하여 한배의 새끼들(litters) 또는 각 배아 간의 신호 강도를 비교하였다. 명시야 이미지를 자동 노출 설정으로 촬영하였다.
정자 동결보존
문헌 [Nakagata, N. (2011) Cryopreservation of Mouse Spermatozoa and In Vitro Fertilization. In: Hofker M., van Deursen J. (eds) Transgenic Mouse Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 693. Humana Press]에 설명된 바와 같이, 확립된 프로토콜을 사용해 정자 동결보존을 수행하였다.
결과
B6SJLF2 수정된 난모세포를 공여자 균주로 사용하여 미세-주입을 수행하였다. 142개의 배아를 주입하였고, 36마리의 새끼가 태어났으며, 7마리의 G0 동물이 이식유전자를 보유한 것으로 확인되었다.
유전자 이식 대립유전자를 단리하기 위해, 7마리의 양성 G0 동물을 야생형 B6SJLF1 동물과 각각 여교배시켰다. 7마리의 파운더 중 5마리는 생식계열을 통해 이식유전자 배열을 전달하였다(5마리의 파운더 유래의 후속 라인(line) 또는 자손을 각각 라인 A, B, C, D 또는 E로 명명함). 초기에, 유전형 분석을 통상적인 PCR에 의해 수행하여 마우스 게놈에서 mEGFP 삽입을 검출하였다. 각 라인에서 mEGFP 발현 강도의 차이를 관찰한 후, qPCR-dCT 검정을 개발하여 각 라인에서 mEGFP의 상대 카피 수를 측정하였다.
독립 라인을 개발하기 위한 사육 과정에서, 라인 B에서의 이식유전자 카피 수의 일반적이지 않은 변동(fluctuation)이 세대 간에 관찰되었다. G2 세대에서 조차 동일한 한배 새끼 내에서 mEGFP 카피 수의 변화가 관찰되었다. 이식유전자 카피 수 변동의 원인은 여전히 밝혀지지 않았다. 그러나, 적어도 2세대 동안 B6SJL F1 야생형 마우스에 대한 각 라인에서의 이식유전자의 여교배 이후, 카피 수의 변동이 사라졌다. 이식유전자 배열을 수반한 염색체 내 재조합으로 인해 변동이 발생했을 가능성이 있다.
mEGFP 신호를 내부 대조군(ApoB 유전자의 2배체 카피)에 대해 정규화함으로써 상대 mEGFP 카피 수를 결정하였다.
HO 마우스가 독자 생존가능하고 번식 능력이 있는지 확인하고, OCT4-mEGFP 신호 증가를 시도하기 위해, G3 HEMI 수컷을 G3 HEMI 암컷과 교배시켰다. 유전자형을 qPCR-dCT 방법에 의해 결정하였다: HO 유전자형을 각 라인의 HEMI 대조군과 비교하여 GFP 이식유전자의 이중 투여량에 의해 결정하였다. HO 동물은 라인 A, B, C 및 E에 대해 독자 생존가능한 것으로 확인되었다. 카이 제곱 분석은 라인 C의 HEMI 상호교배로부터의 자손의 유전자형이 예측된 멘델 비율을 따르는 것을 보여준다. 결과가 시사하는 바는, HO 라인 A 배아가 HEMI 및 WT와 비교하여 증가된 생존력을 갖고, 라인 B HO 배아는 감소된 생존력을 가지며, 라인 A 및 C의 HO가 번식 능력이 있음이 확인되었다는 것이다. 라인 B의 HO가 교배하여 배아를 생산할 수 있지만; 라인 B HO 암컷은 HO 또는 HEMI 라인 B 수컷과 교배했을 때 어떠한 새끼도 낳지 않았다.
HEMI 또는 HO 수컷을 과잉 배란된 B6J 암컷(부계)과 교배시켰다. 배아를 수확하고, mEGFP 신호를 통상적인 형광 입체현미경 또는 공초점 형광 현미경에 의해 관찰하였다. 배아를 5개 라인으로부터 수확하였다. GFP 발현을 니콘 입체 현미경 하에 검사하였다. 배아를 1 세포 단계부터 배반 단계까지 배양하고, 매일 관찰하였다. 발현을 8-세포 단계(96시간)부터 배반포 단계(120시간)까지 관찰하였다. 이는 OG2 GFP 발현과 유사하였다. 각 라인에서 발현 수준은 mEGFP 카피 수에 비례하였다. 라인 B는 가장 높은 GFP 발현 수준을 가졌고, 라인 D는 가장 낮았다. mEGFP 발현은 각 세포에서 점상 패턴으로 관찰되었다. 이러한 패턴은 OG2GFP와는 분명히 상이하였다. 이는, OG2 라인의 경우처럼 단순히 Oct4 프로모터로부터 생성되는 mEGFP가 아니라 IS 구성물이 OCT4에 융합된 mEGFP를 갖기 때문이다.
실시예 2 - 보조 생식술에 대한 정량적 생물검정의 개발
POU5F1의 핵 국소화를 활용하고 착상-전 동안 불리한 배양 조건 및 후생적 결함을 검출하기 위해 GFP-태그된 POU5F1을 발현하는 Pou5f1-GFP 유전자 이식 마우스 라인을 생성하였다. 또한, Pou5f1-GFP 발현을 이용하여 살아있는 세포에서의 세포 계수를 위해 할구 핵을 시각화하였다. Pou5f1-GFP 배아를 최적 또는 차선의 오일 오버레이에서 96시간 동안 배양하여 마우스 배아 발달의 상이한 단계(2PN에서 확장/해칭(hatching) 배반포까지)에서 POU5F1-GFP 발현을 관찰하였다(실험, n > 3).
Pou5f1-GFP 단세포 배아(신선 또는 냉동)를 대조군 또는 차선의 오일 오버레이(5, 7.5 또는 10% 불순물 함유 오일(adulterated oil))로 연속 단일 배양 배지-컴플리트(Continuous Single Culture Medium-Complete)(CSCM-C, 후지필름 어바인 사이언티픽(FUJIFILM Irvine Scientific))에서 최대 96시간 연속된 테스트 조건에서 배반포로 배양하고 매일 관찰하였다. 표준 마우스 배아 검정(MEA)에 전형적으로 사용되는 B6 단세포 배아도 동시에 배양하였다. 이들 배아를 48시간(% ≥8세포) 및 96시간(% 배반포)에 평가하였다.
Pou5f1-GFP를 발현하는 유전자 이식 마우스는 독자 생존가능하고 번식 능력이 있었으며, 성공적인 생식계열 전달 및 시간적 및 공간적으로 조절된 유전자 발현이 확인되었다. 접합성(Zygotic) Pou5f1-GFP 유전자 발현은 4-세포 단계 부근에서 시작하여 72시간 동안 배양한 후 최고조에 도달했다. 마우스 배아에서의 POU5F1-GFP의 핵 국소화는, 4-세포 단계 부근에서 GFP 발현을 검출하자마자 살아있는 세포의 세포를 계수하고 할구의 핵을 시각화하도록 할 수 있었다. 차선의 오일 오버레이로 배양된 Pou5f1-GFP 배아는 (대조 오일 군과 비교하여 48시간 및 96시간에) 발달의 현저한 지연을 보여주었다. POU5F1-GFP의 모자이크 패턴화된 발현이 차선의 오일 오버레이로 배양된 일부 배아에서 관찰되었다. Pou5f1-GFP 배아 배양은 통계적 유의성을 갖고 5, 7.5 및 10% 차선 조건을 검출한 반면 표준 MEA(≥80% 통과 기준)는 28.3%의 비율로 5% 차선 조건을 통과하였다. 도 1a-1b 및 도 2a-2c를 참조하라. 신선한 Pou5f1-GFP 배아 및 동결된 Pou5f1-GFP 배아 사이에는 성능 차이가 없었다. 불리한 배양 조건에서 배양된 Pou5f1-GFP 배아는 배아 등급화에 있어 감소된 주관성을 가졌고, 이는 후생적 부작용으로 이어졌다. 도 3 및 도 4를 참조하라.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 예시적으로 기재된 본 기술은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소, 요소들, 한정 또는 한정들의 부재 시에 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는(comprising)," 포함하는(including)," "함유하는" 등의 용어는 제한 없이 광범위하게 해석되어야 할 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어 및 표현은 한정이 아니라 설명의 용어로서 사용되었고, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서, 도시되고 기재된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 일부의 배제의 의도가 없지만, 청구된 본 기술의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것은 인식된다.
따라서, 본원에 제공된 물질, 방법 및 실시예는 바람직한 양태를 대표하면서, 예시적이고, 본 기술의 범위에 대한 한정으로서 의도되지 않는 점을 이해해야 한다.
본 기술은 본원에서 광범위하게 일반적으로 기재되어 있다. 포괄적 개시내용 내에 속하는 더 좁은 종류(species) 및 하위 포괄적 그룹도 본 기술의 일부를 형성한다. 이는, 삭제된 물질이 본원에 구체적으로 언급되었는지 여부에 관계없이 속(genus)으로부터 임의의 청구 대상(subject matter)을 제거하는 부정적 한정 또는 단서와 함께 본 기술의 포괄적 설명을 포함한다.
또한, 본 기술의 특징 또는 양태가 마쿠시(Markush) 그룹의 측면에서 기재되는 경우, 당업자는 본 기술이 그에 따라 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 측면에서도 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 이의 전체가 참조로 명시적으로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
다른 양태는 이하의 청구범위 내에 제시된다.
SEQUENCE LISTING <110> FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC, INC. <120> METHOD AND USE OF A TRANSGENIC MOUSE LINE <130> 106556-0470 <140> PCT/US2022/034294 <141> 2022-06-21 <150> 63/213,335 <151> 2021-06-22 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 351 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asp Gly Ser Ala Gly Leu Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro Arg Thr 20 25 30 Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gly 35 40 45 Ser Glu Val Leu Gly Ile Ser Pro Cys Pro Pro Ala Tyr Glu Phe Cys 50 55 60 Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val Gly Leu Gly Leu Val Pro 65 70 75 80 Gln Val Gly Val Glu Thr Leu Gln Pro Glu Gly Gln Ala Gly Ala Arg 85 90 95 Val Glu Ser Asn Ser Glu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Cys Ala Asp Arg 100 105 110 Pro Asn Ala Val Lys Leu Glu Lys Val Glu Pro Thr Pro Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Asp Met Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu 130 135 140 Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly 145 150 155 160 Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile 165 170 175 Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Leu Lys Asn Met Cys Lys Leu 180 185 190 Arg Pro Leu Leu Glu Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn 195 200 205 Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ser Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg 210 215 220 Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Trp Ser Leu Glu Thr Met 225 230 235 240 Phe Leu Lys Cys Pro Lys Pro Ser Leu Gln Gln Ile Thr His Ile Ala 245 250 255 Asn Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn 260 265 270 Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ile Glu Tyr Ser Gln Arg Glu 275 280 285 Glu Tyr Glu Ala Thr Gly Thr Pro Phe Pro Gly Gly Ala Val Ser Phe 290 295 300 Pro Leu Pro Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro 305 310 315 320 His Phe Thr Thr Leu Tyr Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe 325 330 335 Pro Ser Val Pro Val Thr Ala Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn 340 345 350 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: GFP protein sequence <400> 2 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 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gatgactgcc tccatttctg tcttctgtta 9660 gagacagaaa agcctgagaa accgacagcc attttggggg gggggggtcc ggttcacacg 9720 ctgcaactta gaaagcacac tcaactggcc atctgttata ccctccccac ctggtcccaa 9780 ccatcactgt gtactactga gaagaaggca gccttagcca caccctcgag tgcccctgcc 9840 gttctattgc tcatacatcg attgatatcc ctgtttcaac tttgaaaaaa aaaaattttt 9900 ttttttttgt ggtgtgtgca tgcctgctac tgtacacctg tgggcgtcag aggtggtcct 9960 ctgcaccctc cggccagtac cgcatccagg gtgagtcaga tgatttcctg tggtttgggc 10020 ctcaaggctt ctcacctcca gaggcttcta gcctgctgcc ttgctttctc tgtcgcactc 10080 tagtacagca ggagttttct tcgcactccg gagtgttgtc agctcctggg gcatggacat 10140 ttggctactt agagtgtgct gtgtaggttt tcatttagag ctgaacagag ggatggatct 10200 tattacccca gcccttgaga cactgaggca ggagagcttc ctagtgagtc cctgtttcaa 10260 tatcttcact aatactgtgt catactttgg gactttcttt cttcctttct ttcttttgat 10320 tttttttttt tttatatgag tacagtgtac ctgtcttcag acacacacca gaagagggca 10380 tcagatccta ctacagaagg ttgtgagcca ccttgtggtt gctgggaatt gaactccgga 10440 tctccggaag agaagtccgt ataccaactt ctgtattagt cagggttctc tagagtcaca 10500 gaacttatgg acagtctcta gatagtaaag gaatttattg atgacttaca gtcggcagcc 10560 caattcccaa caatggttca gtcgcagctg tgaatggaag tccaaggatc tagcagttac 10620 ttagtctcac gcagcaagca ggcgaaggag caagagctag agcttaactg ctgagccatg 10680 tgtttcttga gtaaagggat tacatgctcg ttcgtctggt caattctgca gccttaaaac 10740 ttcttcagaa tagggtgaca ttttgtcctc agtggggcgg ttttgagtaa tctgtgagca 10800 gataggaact tgctggggta ctgcacagaa ctctgggtag tgtggtactg tagatggcta 10860 ggttctgggg ggggaaagag ccatctatgt cacctaggaa tagagtgaat aacatttata 10920 taatcagacc agcccttgag gaggctgaga tcttttcatg gggcacccta gggtcacagt 10980 cccagctggt gtgactctga caagtctgcc tttctcacta cagtcccagg acatgaaagc 11040 cctgcagaag gagctagaac agtttgccaa gctgctgaag cagaagagga tcaccttggg 11100 gtacacccag gccgacgtgg ggctcaccct gggcgttctc tttggtgggt ctcccccagc 11160 atgttctgat ctcacggctc ttaatgtagg cgcaaggggg tggggcatct taggagctgc 11220 ttctccacag gtaagggagg attagacgct tgtagcttga actgtcagag gtgggggctt 11280 gggctccctt cttgctgcct cactcactct gtttgatcgg cctttcagga aaggtgttca 11340 gccagaccac catctgtcgc ttcgaggcct tgcagctcag ccttaagaac atgtgtaagc 11400 tgcggcccct gctggagaag tgggtggagg aagccgacaa caatgagaac cttcaggagg 11460 tgaggagtgg caggatgtgt gcaatgtctg ccaggcacag tcccttctgc tgcttccatt 11520 cctggcttga aactcctccc tctccaaccg gagctcgcag gagaagttct gtgtccttat 11580 tctgctgcta tgaattggaa tccagagcct taacatttgc taatcaatca ggctctctcc 11640 ttctgagtca ccctctgccc ccaccagcct gacaatggtc cctccccaga accccgtcta 11700 gtgctggtga aggctcagac ctaggtctac cagccccttc cagagcccct ttcagtaacc 11760 cctggctctg gggccacatc cagtcaatgc tcccttagca caatccctta gcggtttgtt 11820 cttcagtccc atctcaaggt ggggctgttg ccaagtcaaa tactaaagtt gctcttgtcg 11880 cccccatctt cccctgccca gatatgcaaa tcggagaccc tggtgcaggc ccggaagaga 11940 aagcgaacta gcattgagaa ccgtgtgagg tggagtctgg agaccatgtt tctgaagtgc 12000 ccgaagccct ccctacagca gatcactcac atcgccaatc agcttgggct agagaaggat 12060 gtgagtgcca agatcctgcc ctgtggtacc tggatgtttc cctgttccca ttccccaccc 12120 cccccacccc cccaccccca ccgccgccac cgctgactgc agcatcccag agcttatgat 12180 ctgatgtcca tctctgtgcc catcctaggt ggttcgagta tggttctgta accggcgcca 12240 gaagggcaaa agatcaagta ttgagtattc ccaacgagaa gagtatgagg ctacagggac 12300 acctttccca gggggggctg tatcctttcc tctgccccca ggtccccact ttggcacccc 12360 aggctatgga agcccccact tcaccacact ctactcagtc ccttttcctg agggcgaggc 12420 ctttccctct gttcccgtca ctgctctggg ctctcccatg cattcaaact ctggcggagg 12480 cgggagcggg gggggtggct ccggcggcgg agggagcatg gtgagcaagg gcgaggagct 12540 gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt 12600 cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat 12660 ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg 12720 cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc 12780 catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa 12840 gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg 12900 catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag 12960 ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat 13020 ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc 13080 catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccaagct 13140 tagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc 13200 cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatga ggcaccagcc ctccctgggg 13260 atgctgtgag ccaaggcaag ggaggtagac aagagaacct ggagctttgg ggttaaattc 13320 ttttactgag gagggattaa aagcacaaca ggggtggggg gtgggatggg gaaagaagct 13380 cagtgatgct gttgatcagg agcctggcct gtctgtcact catcattttg ttcttaaata 13440 aagactggga cacacagtag atagctgaat tttgttttcc ttcagttcct agagagcctg 13500 cggttggaga aagccagtaa tggattctca aaccccaggt gatcttcaaa acaggcgcca 13560 ttgaaaccat tggagttcca caaaatgccc agggatagtt ggggttggag cccaacctat 13620 agaggaaggc attgcatatt cgccatccta gaggcggtaa gtctctgcta gctgatggac 13680 atcacctcat agccattgtc tggcagccgc cttctttcct cttgtcactc tgggagttct 13740 ggtgggctta tactttaaaa aaaagagttt ttttgggggg gttaagattt attttattta 13800 tatgggtaca ctgtagctgt cttctagaca caccagaaga gggcatggga tcccattaca 13860 gatggttgtg agccaccatg tggttgctgg gaattgaact caggacctct ggaagagcag 13920 tcagtgctct taaccgctga gccatctctc cagccctcaa actctttttt ttcttttcct 13980 tcaagatgag ttctgtgtag tcctggcgga ccaggttggc ctcagatcag cctgcctctg 14040 cctccgcagt gctgagatta aaggcccgtg ccactctagg ctaaattgtt atgcttctat 14100 tctagctgat gaccaccttt tttgggcgta gtagtgctgg gagtagggtc tgtacacatg 14160 tctacaatgc cagaataggt caaaggcttt agatctcaag gaactggatt tatagagagt 14220 tgggagcagc catgtaggtt ctgagaacca aacctgggtc ctctgcaaga agagccattg 14280 gctttttgtt tttgtttgtt ttgagacatt tctcggtgta gccctggcta tctggaactc 14340 tgtaggccag gctgtccctg aactcagatc cagtctatcc atccctgcct tccaagagct 14400 gggattaagg tcatgtacca ccacaggcca gctagccata gctcctaact gctgaaccat 14460 ttatttattt atttatttta tttttttggt ttttcgagac agggtttctc tgtatagctc 14520 tggatgtcct ggaactcact ttgtaaacca gtctggcctc gaactcagaa atctgcttgc 14580 ctctgcctcc ccagtgagtg ctgggatcaa 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ctttatttgg gaataaagac taagctctga aaagctagtc 15480 ccagagactc agctggtggt gatactagct agcggtggca tgaggatgcc ttgggaatgt 15540 gctctgggtc cttcagggtg ctttagccga tgccattcaa gaacatgagt agggttaggg 15600 tattgtggca gagcacttgc ctggtatatg ctggcttcag caaaataaaa ccataccttc 15660 taggaatggt ttctgggacc ggtgctctaa ctgcaggtat cctggcatcc atggaggcaa 15720 ggctttattc cttgtgactg ggcttgtagc tcactggaaa cttggaggct gcaacatctt 15780 tggcaggaaa ccatcttttc tgtcacttca tttgcaagca ttctccagcc ttgagtcagt 15840 ctttagcaat ggacctttcc ctgtggtcat tccctttgga gaaagacatt cctcaaagtc 15900 catggtaact ttgaatgagt gttttgcatg tacacatgcg tgagtgtgca tgcgctctca 15960 cacacgcacg cacatgcaca cgcgtgcaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 16020 cacacacaca ctgcttcagc ccttaggagc cattcttcta ttattatgtt tgagtgctct 16080 gcctgaatgt gcacctgcag gccagaagag ggcatcagat cccttttaga gatggtcaca 16140 agccatcatg ttgttgctgg aaattgggac ttctggaaga gcagccagtg tacccttaat 16200 tgctgagcca tcttactgcc caagatacat tcttacactg tgcctgaccc tgagccacat 16260 ctgtgtcctg actgcaaagt caagatgcca ttatggcatc ctggatgcta tagccagtgc 16320 aggccagagg gtaccagatg tcacagccat cacaccaacc caggctctgc tctctagcaa 16380 aaagaagctg gacaggactc cctaagggag tgagtgttcc tgagaaaccc tttgagtaac 16440 ttgcctctgg gtaactggta gccagaacag gaggctaaga ctgggatata ggaacttgga 16500 gattagggat gttaagtaga gcatacgcat agcacaaaag atacttggct ttggatatga 16560 gctgttgacg ccttcaatcc atcacaactc ccattctgaa tgctctatcc cgactacatg 16620 agggatttga ggctagcctg gattacacag tgagaccttg tattaaaaaa gagttgggtg 16680 tctcctccag agaggatctg ggtttgaacc tcagcaccta catagtggct agcaattatc 16740 cctccagttc ccagagaacc cagtgccctc ttctggcttc tgccggtatt gcatgcaagt 16800 gtgataccca atcatgcagg caaacaaagc agccttgaat tgacctgctc tcctctagtt 16860 ttgagacagt gttagtatgg ttttttatgt atagtgctgg gactccaaac atgggcaagt 16920 caggtgcttg ctaggcagtg ctcttctagt gagacatctc tttgttccct gtctcccaga 16980 ttgctttgta tagtctagtc ctaaccattg ttcccacata gtagcttgtc atgcatttat 17040 gggtgaaagc taacctgggt gtctgctgtg cccgtgcacc ccccttccct gccttctaag 17100 acctcagtct gaggctgttc aaagatctag aattcaaggt gctgacaggt gaccccactt 17160 acccactggc tatcagagca gctctggcga aaatgagacg ttggcgatcg cgtggcactt 17220 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 17280 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 17340 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 17400 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 17460 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 17520 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 17580 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 17640 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 17700 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 17760 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 17820 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 17880 ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 17940 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 18000 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 18060 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 18120 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 18180 cactgattaa gcattggtaa tttgatatcg agctcgcttg gactcctgtt gatagatcca 18240 gtaatgacct cagaactcca tctggatttg ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt 18300 tttattggtg agaatccaag cactagtaac aacttatatc gtatggggct gacttcaggt 18360 gctacatttg aagagataaa ttgcactgaa atctagaaat attttatctg attaataaga 18420 tgatcttctt gagatcgttt tggtctgcgc gtaatctctt gctctgaaaa cgaaaaaacc 18480 gccttgcagg gcggtttttc gaaggttctc tgagctacca actctttgaa ccgaggtaac 18540 tggcttggag gagcgcagtc accaaaactt gtcctttcag tttagcctta accggcgcat 18600 gacttcaaga ctaactcctc taaatcaatt accagtggct gctgccagtg gtgcttttgc 18660 atgtctttcc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcggactg 18720 aacggggggt tcgtgcatac agtccagctt ggagcgaact gcctacccgg aactgagtgt 18780 caggcgtgga atgagacaaa cgcggccata acagcggaat gacaccggta aaccgaaagg 18840 caggaacagg agagcgcacg agggagccgc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 18900 ctgtcgggtt tcgccaccac tgatttgagc gtcagatttc gtgatgcttg tcaggggggc 18960 ggagcctatg gaaaaacggc tttgccgcgg ccctctcact tccctgttaa gtatcttcct 19020 ggcatcttcc aggaaatctc cgccccgttc gtaagccatt tccgctcgcc gcagtcgaac 19080 gaccgagcgt agcgagtcag tgagcgagga agcggaatat atccctaggt ataaacgcag 19140 aaaggcccac ccgaaggtga gccagtgtga ctctagtaga gagcgttcac cgacaaacaa 19200 cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg atgcgatcgc 19260 ctggagatcc ttactcga 19278 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 atcttcttca aggacgacgg caac 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 tcctcgatgt tgtggcggat cttg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Claims (62)

  1. 전사 조절 하에 옥타머 결합 전사 인자 4(OCT4)를 포함하는 융합 단백질의 안정한 발현을 포함하되, 융합 단백질의 유전자 발현이 생식계열 DNA를 통해 안정적으로 전달되는 것인, 유전자 이식 마우스.
  2. 제1항에 있어서,
    융합 단백질이 형광 태그된 OCT4인, 유전자 이식 마우스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    형광 태그가 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)로부터 선택된 형광 단백질인, 유전자 이식 마우스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질이 선택적으로 A206K 돌연변이를 포함하는, GFP 또는 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)인, 유전자 이식 마우스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질이 서열번호: 2 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는, 유전자 이식 마우스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    전사 조절이 OCT4 유전자좌에 의해 조절되는, 유전자 이식 마우스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질이 OCT4 유전자좌의 C-말단에 작동가능하게 연결된, 유전자 이식 마우스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    OCT4 유전자좌가 근위 인핸서 요소의 결실을 추가로 포함하는, 유전자 이식 마우스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    OCT4가 서열번호: 1 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는, 유전자 이식 마우스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    생식계열이 정자, 난모세포, 줄기 세포 또는 접합자(zygote)로부터 선택되는, 유전자 이식 마우스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 이식 마우스가 독자 생존 가능하고 번식 능력이 있고, 융합 단백질 유전자 발현이 유전자 이식 마우스 자손에 안정적으로 통합되는, 유전자 이식 마우스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합자에서 융합 단백질의 유전자 발현이 2-세포 단계, 3-세포 단계 또는 4-세포 단계 세포 발달로부터 시작되는, 유전자 이식 마우스.
  13. OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는 배아로서, 난모세포가 OCT4::EGFP 융합 단백질을 포함하는 정자와 수정되고, 정자가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 이식 마우스로부터 유래되는, 배아.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 이식 마우스로부터 유래된 OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는, 줄기세포.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자 이식 마우스로부터 유래된 OCT4::EGFP 융합 단백질을 발현하는, 생식계열 세포.
  16. 박테리아 인공 염색체(BAC) 구성물을 접합자에 미세주입하는 단계를 포함하는 유전자 이식 마우스를 제조하는 방법으로서, 구성물이 마우스 OCT4 유전자좌에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하고, 접합자가 대리모 마우스의 생식관 내로 이식되고, 그에 따라 유전자 이식 마우스를 제조하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    유전자 이식 마우스가 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 것인, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    리포터 유전자 유전자좌가 유전자 이식 마우스의 생식계열 DNA를 통해 안정적으로 전달되는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    생식계열이 정자, 난모세포, 줄기 세포 또는 접합자로부터 선택되는 것인, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 유전자가 형광 단백질을 인코딩하는 것인, 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)로부터 선택되는 것인, 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질이 선택적으로 A206K 돌연변이를 포함하는, GFP 또는 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)로부터 선택되는 것인, 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 유전자가 서열번호: 2 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 형광 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 유전자가 서열번호: 1 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 OCT4 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 것인, 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 유전자 및 유전자 코딩 서열이 링커에 의해 분리되고, 링커가 (서열번호: 3)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 유전자가 OCT4 유전자좌의 C-말단에 작동가능하게 연결되는 것인, 방법.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질 및 OCT4를 포함하는 폴리펩티드가 서열번호: 4와 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는, 방법.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    구성물이 서열번호: 5와 적어도 70%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  29. 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    OCT4 유전자좌가 근위 인핸서 요소의 결실을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    구성물이 OCT4::EGFP 융합 단백질의 발현을 매개하는 것인, 방법.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    OCT4::EGFP 융합 단백질이 접합자 내로 안정적으로 통합되는, 방법.
  32. 보조 생식술(ART), 질환의 치료, 약물 스크리닝 또는 면역 조절에 사용되는 제품을 평가하기 위한 방법으로서,
    (a) OCT4를 포함하는 융합 단백질의 안정한 발현을 포함하는 유전자 이식 배아를 수득하는 단계;
    (b) 유전자 이식 배아를 배양하는 단계;
    (c) 융합 단백질의 발현을 평가하는 단계; 및
    (d) 제품의 허용성 또는 불충분을 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    융합 단백질이 OCT4에 융합된 형광 단백질인 것인, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    형광 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 또는 청록색 형광 단백질(CFP)로부터 선택되는 것인, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광 단백질이 선택적으로 A206K 돌연변이를 포함하는, GFP 또는 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)로부터 선택되는 것인, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가하는 단계가 융합 단백질의 핵 국소화 또는 세포질 국소화를 시각화하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    핵 국소화가 핵 내 DNA에 결합하는 융합 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가하는 단계가 융합 단백질의 시간 및 공간적 발현을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가하는 단계가 4-세포 단계, 8-세포 단계 또는 배반포 단계, 바람직하게는 8-세포 단계에서 일어나는, 방법.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 4-세포 단계에서 핵에서 지배적으로 국소화되거나 발현되는 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    융합 단백질의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상이 4-세포 단계에서 핵에서 국소화되거나 발현되는 것인, 방법.
  42. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 8-세포 단계에서 핵에서 국소화되거나 발현되는 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    융합 단백질의 적어도 80%, 90% 또는 95% 이상이 8-세포 단계에서 핵에서 국소화되거나 발현되는 것인, 방법.
  44. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 배반포 단계에서 내부 세포괴(inner cell mass, ICM)에서 국소화되거나 발현되는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    융합 단백질의 적어도 80%, 90% 또는 95% 이상이 배반포 단계에서 ICM에서 국소화되거나 발현되는 것인, 방법.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    1) 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 있고/있거나,
    2) ICM에서 융합 단백질의 국소화 또는 발현이 있는 경우,
    제품이 허용되는, 방법.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-세포 또는 8-세포 단계에서 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만으로 있는 경우, 제품이 허용되지 않는, 방법.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    8-세포 단계에서 융합 단백질의 핵 국소화 또는 발현이 없는 경우, 제품이 허용되지 않는, 방법.
  49. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    ICM에서 융합 단백질의 국소화 또는 발현이 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만으로 있는 경우, 제품이 허용되지 않는, 방법.
  50. 제32항 내지 제46항 또는 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    ICM에서 융합 단백질의 국소화 또는 발현이 없는 경우, 제품이 허용되지 않는, 방법.
  51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양이 시험관내에서 이루어지는, 방법.
  52. 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 대략:
    약 24시간 내지 약 96시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 96시간, 약 36시간 내지 약 72시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 72시간 또는 약 48시간 내지 약 96시간의 배양; 또는
    약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간의 배양 시 검출가능한, 방법.
  53. 제32항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 2-세포 단계, 3-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 상실배 단계(morula stage) 또는 배반포 단계 세포 발달에서 검출가능한, 방법.
  54. 제32항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    제품이 바늘, 카테터, 마이크로툴(microtool), 실험실 용품(labware), 주사기, 조직 배양 접시, 조직 배양 플레이트, 피펫 팁(tip), 접시, 플레이트, 물, 정수 시스템, 배지, 배지 보충액, 또는 배아와 물리적으로 접촉하게 되는 다른 장치 또는 시약으로부터 선택되는 것인, 방법.
  55. 제32항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    제품이 질환과 관련된 단백질 또는 유전자인 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    질환이 암 또는 자가면역 질환인 것인, 방법.
  57. 제32항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    제품이 배아의 발달과 관련된 단백질 또는 유전자인 것인, 방법.
  58. 제32항에 있어서,
    유전자 이식 배아로부터 하나 이상의 배아 줄기 세포를 수득하는 단계, 및
    하나 이상의 배아 줄기 세포를 배양하여 복수의 배아 줄기 세포를 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    복수의 배아 줄기 세포를 약물과 함께 항온처리하는 단계,
    융합 단백질의 발현을 평가하는 단계, 및
    약물의 허용성 또는 불충분을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    약물이 질환의 치료, 선택적으로 암 또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 것인, 방법.
  61. 제59항에 있어서,
    약물이 면역 반응을 조절하는 데 사용하기 위한 것인, 방법.
  62. 제1항 내지 제12항의 유전자 이식 마우스, 제13항의 배아, 제14항의 줄기 세포, 또는 제15항의 생식세포를 포함하고, 선택적으로 사용 지침서를 포함하는, 키트.
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