KR101117422B1 - 줄기세포의 분화능 평가방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 이하의 공정을 포함하는 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성을 평가하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
(1) 평가 대상인 줄기세포를 비인간 포유동물의 원하는 조직의 원기중에 이식하는 것,
(2) 이 조직 원기를 인 비트로로 배양하는 것,
(3) 배양한 이 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도를 지표로, 이 줄기세포가 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성을 판정하는 것.
Description
본 발명은, 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다.
최근 줄기세포 연구의 진보에 의해 다분화능을 나타내는 여러 가지의 줄기세포가 수립되어 있다. 임상 레벨로 이들 줄기세포를 이용하여 장기나 조직을 적절히 재생하기 위해서는, 사용하는 줄기세포가, 목적 장기로 적절히 분화되고, 또 정상적인 조직 형태를 구축할 수 있는 것을 미리 확인해 두는 것이 중요하다.
현재까지 수립된 줄기세포 중 ES세포나 iPS세포는, 매우 효율적으로 증식하고, 여러 가지의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있지만(비특허문헌 1), 이것을 그대로 생체 내에 이식하면, 대부분의 경우 정상적인 조직 구축에 기여할 수 없으며, 기형종을 형성해 버린다(비특허문헌 2). 한편, 간엽계(間葉系) 줄기세포(MSC) 등의 체성(體性) 줄기세포는, 인 비트로(in vitro)로의 계대 배양에서는 종종 증식 정지(replicative senescence)를 일으키지만, 생체 내에 이식하면 종양 형성없이 여러 가지의 세포로 분화되어, 정상적인 조직 구축에 기여한다(비특허문 헌 3). 그러나, 상기 2개의 성질 중, 줄기세포가 어떤 성질을 갖고 있는지를 확인하기 위해서는, 많은 반복 배양이나 분화 유도 시험을 행해야 하기 때문에, 많은 시간을 허비해 버린다. 따라서, 조직이나 장기로 확실하게 분화되는 줄기세포를 신속히 개발하기 위해, 여러 가지의 줄기세포가 전술의 어떤 성질을 갖는지, 그리고 줄기세포가 기형종 형성을 일으키지 않도록 개량되어 있는지를 간편히 스크리닝하는 방법의 확립이 요구되고 있다.
[비특허문헌 1] Nagata M. et al., J. Gene Med., vol. 5; p.921, 2003
[비특허문헌 2] Asano T. et al., Methods Mol. Bio., vol. 329: p.459, 2006
[비특허문헌 3] Hara M. et al., J. Autoimmun., vol. 30; p.163, 2008
본 발명의 목적은, 줄기세포가 생체 내에서 기형종 등의 종양을 형성하는 세포인지, 또는 생체 내에서 종양 형성없이 여러 가지의 세포로 분화되어, 정상적인 조직 구성에 기여할 수 있는 세포인지를 간편히 검정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자 등은, 예의 검토한 결과, 줄기세포를 형광 유전자의 도입 등에 의해 형광 표지하고, 포유동물의 태아 신장 원기(原基)에 주입하여 얻어지는 형광 이미지에서의 세포의 분산 정도에 기초하여, 줄기세포의 종양 형성능의 유무를 용이하게 판정할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 이하의 공정을 포함하는, 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 평가하는 방법:
(1) 평가 대상인 줄기세포를 비인간 포유동물의 원하는 조직의 원기중에 이식하는 것,
(2) 이 조직 원기를 인 비트로로 배양하는 것,
(3) 배양한 이 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도를 지표로, 이 줄기세포가 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성을 판정하는 것.
[2] 평가 대상인 줄기세포가, 이식되는 조직 원기의 세포와 식별할 수 있도 록 표지되어 있는, [1] 기재의 방법.
[3] 표지가 형광 표지인, [2] 기재의 방법.
[4] 조직이 신장인, [1] 기재의 방법.
[5] 줄기세포가 간엽계 줄기세포인, [1] 기재의 방법.
본 발명의 방법을 이용하면, 줄기세포가 생체 내에서 기형종 등의 종양을 형성하는 세포인지, 또는 생체 내에서 종양 형성없이 여러 가지의 세포로 분화되어, 정상적인 조직 형성에 기여할 수 있는 세포인지를 간편히 검정할 수 있다.
본 발명은, 이하의 공정을 포함하는 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 평가하는 방법을 제공하는 것이다:
(1) 평가 대상인 줄기세포를 비인간 포유동물의 원하는 조직의 원기중에 이식하는 것,
(2) 이 조직 원기를 인 비트로로 배양하는 것,
(3) 배양한 이 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도를 지표로, 이 줄기세포가 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성을 판정하는 것.
본 명세서중, 「줄기세포」란, 자기 복제능 및 분화?증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기세포란, 그 자체로는 개체가 될 수 없지만, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 다분화능 줄기세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포란, 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
다능성 줄기세포로서는, 배성(胚性) 줄기세포(ES세포), EG세포, iPS세포 등을 들 수 있다. ES세포는, 내부 세포 덩어리를 피더세포 위에서 배양함으로써 제조할 수 있다. EG세포는, 시원 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF를 포함하는 배지중에서 배양함으로써 제조할 수 있다(Cell, 70:841-847, 1992). iPS세포는 체세포(예컨대 선유아세포, 피부세포 등)에 Oct3/4, Sox2 및 Klf4(필요에 따라 추가로 c-Myc 또는 n-Myc)를 도입함으로써 제조할 수 있다(Cell, 126: p. 663-676, 2006; Nature, 448: p.313-317, 2007; Nat Biotechnol, 26: p.101-106, 2008; Cell 131: 861-872, 2007). 체세포의 핵을 핵이식하는 것에 의해 제작된 초기 배를 배양하는 것에 의해 수립된 줄기세포도, 다능성 줄기세포로서 또한 바람직하다[Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999)], Rideout III 등[Nature Genetics, 24, 109(2000)].
다분화능 줄기세포로서는, 간엽계 줄기세포, 조혈계 줄기세포, 신경계 줄기세포, 골수 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 체성 줄기세포 등을 들 수 있다. 다분화 능 줄기세포는, 바람직하게는 간엽계 줄기세포이다. 간엽계 줄기세포란, 골아세포, 연골아세포 및 지방아세포의 등 모두 또는 몇 개에 대한 분화가 가능한 줄기세포 또는 그 전구세포의 집단을 광의로 의미한다. 간엽계 줄기세포는 신장의 에리스로포이에틴산생세포에 대한 분화능을 가질 수 있다(Transplantation 85: 1654-1658, 2008). 다분화능 줄기세포는, 자체 공지의 방법에 의해, 생체로부터 단리할 수 있다. 예컨대 간엽계 줄기세포는, 포유동물의 골수액, 말초혈, 제대혈 등으로부터 공지의 일반적인 방법으로 채취할 수 있다. 예컨대 골수 천자 후의 조혈 줄기세포 등의 배양, 계대에 의해 인간 간엽계 줄기세포를 단리할 수 있다[Journal of Autoimmunity, 30(2008) 163-171]. 다분화능 줄기세포는, 전술의 다능성 줄기세포를 적절한 유도 조건하에서 배양하는 것에 의해서도 얻을 수 있다.
평가 대상이 되는 줄기세포는, 바람직하게는 ES세포, EG세포, iPS세포, 다분화능 줄기세포(예컨대 간엽계 줄기세포) 등이다.
본 발명에서 이용되는 줄기세포가 유래하는 포유동물로서는, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 기제목, 개, 고양이 등의 식육목, 인간, 원숭이, 빨간털원숭이, 마모셋원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 들 수 있다. 수립된 줄기세포의 암원성(癌原性)은, 마우스 등에서는 보이지 않아도 개나 원숭이 등의 대형 포유동물의 줄기세포에서 확인되는 케이스가 보고되어 있는(Xiao-Bing Zhang, et al. JCI 118; 1502, 2008) 것 등의 이유로부터, 본 발명의 방법은, 기제목, 식육목 및 영장류의 줄기세포의 평가에 유리하다.
본 발명의 방법은, 예컨대 줄기세포에 의한 특정 조직의 재생 의료를 행하는 것에 앞서서, 그 줄기세포가 원하는 조직을 구성하는 세포로 적절히 분화할 수 있는지의 여부를 평가할 목적으로 실시된다. 따라서, 평가 대상이 되는 줄기세포는, 원하는 조직(예컨대 신장)을 구성하는 세포로 생체 내에서 분화하는 것이 기대되는 줄기세포이다.
「생체 내에서의 원하는 조직을 구성하는 세포에 대한 분화」란, 줄기세포를 생체 내의 이 원하는 조직 또는 그 조직의 원기 내에 이식한 경우에, 줄기세포가 이 조직을 구성하는 세포로 분화하는 것을 의미한다. 예컨대 다능성 줄기세포 등에 대해서는, 원래는 모든 조직이나 세포로 분화할 능력을 갖고 있음에도 상관없이, 생체 내의 조직에 이식하면 이 조직을 구성하는 세포로 분화되지 않고 기형종을 발생시켜 버리는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 본 발명의 방법을 이용하면, 줄기세포를 생체 내에 이식했을 때에, 이와 같이 기형종 등의 종양을 형성하지 않고 적절히 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 간편히 평가할 수 있다.
「조직」의 종류는, 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예컨대 신장, 뇌, 척수, 위, 췌장, 간장, 갑상선, 골수, 피부, 근육, 폐, 소화관(예: 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 말초혈, 고환, 난소, 태반, 자궁, 뼈, 골격근 등을 들 수 있다.
「조직의 원기(原基)」란, 포유동물의 태자(胎仔)에서의 이 조직의 발생 상당 부위를 말한다. 예컨대 신장의 원기인 메타네프론을 예시할 수 있다. 메타네프 론은, 포유동물 태자의 요관아(尿管芽) 발아 부위의 주위, 보다 자세히는 체근과 측판 사이에 위치한다. 메타네프론은, 바람직하게는 후신(後腎) 형성 중배엽이다.
본 발명에서 이용되는 조직의 원기는, 통상 평가 대상인 줄기세포가 분화하는 것이 기대되고 있는 조직의 원기이다. 예컨대 평가 대상인 줄기세포가 신장을 구성하는 세포(예컨대 에리스로포이에틴산생세포)로 분화하는 것이 기대되고 있는 경우에는, 이 줄기세포를 신장의 원기에 이식한다. 조직의 원기가 유래하는 포유동물로서는, 전술의 것을 들 수 있다. 평가 대상인 줄기세포의 동물종과 조직의 원기의 동물종은 동일하여도 좋고, 상이하여도 좋다. 예컨대 인간의 줄기세포를 평가하기 위해, 이 줄기세포를 돼지나 래트 등의 비인간 포유동물의 조직의 원기중에 이식할 수 있다.
조직의 원기는 포유동물의 태자로부터 생체 외에 적출된다. 후신 조직은 래트에서는 통상 E11.5, 마우스에서는 E9.5로 형성되기 시작하기 때문에, 조직의 원기로서 메타네프론을 사용하는 경우에는, 상기 스테이지 이후의 태자가 통상 사용된다. 바람직하게는 래트에서 E14 이후, 마우스에서 E12 이후, 보다 바람직하게는 래트에서 E14～16, 마우스에서 E12～14이다. 그 외의 포유동물에서도, 같은 스테이지의 태자를 적합하게 사용할 수 있다. 그러나, 그 전후의 스테이지도, 조건을 선정하는 것에 의해 적용 가능하다. 태자로부터의 조직의 원기의 적출은, 실체 현미경 등을 이용하여, 행하는 것이 가능하다.
조직 원기 중에 대한 줄기세포의 이식은, 실체 현미경 하에서 머니퓰레이터나 마이크로 피펫 등을 이용하여 행해진다. 이식하는 세포의 수는 조직 원기의 크 기 등에 기초하여 적절하게 설정할 수 있지만, 예컨대 래트의 신장 원기를 사용하는 경우에는, 통상 약1000～10000개의 줄기세포가 주입된다. 또한, 줄기세포는 통상, 생체 외로 적출된 조직 원기중에 이식되지만, 줄기세포를, 포유동물의 태자 내에 있는 조직 원기 중에 이식하고, 그 후, 이 줄기세포를 함유하는 조직 원기를 태자로부터 생체 외로 적출하여도 좋다. 신장 원기에 대한 줄기세포의 주입에 대해서는, Yokoo T, et al. J Am Soc Nephrol 17; 1026, 2006 등을 참조.
이식하는 줄기세포는, 바람직하게는 단리 정제된 것이다. 「단리 정제」란, 목적으로 하는 줄기세포 이외의 세포를 제거하는 조작이 이루어져 있는 것을 의미한다. 줄기세포의 순도는, 본 발명의 방법에 의해 평가할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상(예컨대 실질적으로 100%)이다.
평가 대상인 줄기세포는, 이식되는 조직 원기의 세포와 식별할 수 있도록 표지되어 있는 것이 바람직하다. 표지의 종류로서는, 형광 표지, 발광 표지, 방사선 동위체 표지 등을 들 수 있지만, 측정이 간편하고, 상세한 분석이 가능하기 때문에, 형광 표지 또는 발광 표지가 바람직하며, 형광 표지가 가장 바람직하다. 형광 또는 발광에 의한 줄기세포의 표지는, 줄기세포에 형광 표지 유전자 또는 발광 표지 유전자를 도입함으로써 행할 수 있다. 형광 또는 발광 표지 유전자에는, 형광 또는 발광을 갖는 단백질을 코드하는 유전자, 및 대응하는 형광 기질 또는 발광 기질과 혼합함으로써 형광 또는 발광을 발생시키는 효소를 코드하는 유전자가 포함된다. 전자로서는 GFP, RFP, YFP, CFP, EGFP, 버섯 오렌지 등의 형광 단백질을 코드 하는 유전자를 들 수 있다. 후자로서는, 루시페라아제, β-갈락토시다아제, 페록시다아제 등의 효소를 코드하는 유전자를 들 수 있다. 루시페라아제의 기질(발광)로서는, 루시페린(및 필요에 따라서 ATP) 등을 들 수 있다. β-갈락토시다아제의 기질(발광)로서는, 루시페린 갈락토시드 기질(6-O-β-갈락토피라노실루시페린) 등을 들 수 있다. 페록시다아제의 기질로서는, 루미놀(및 필요에 따라 과산화수소) 등을 들 수 있다.
줄기세포에 대한 발광 또는 형광 표지 유전자의 도입은, 자체 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대 목적으로 하는 세포 내에서 기능 가능한 프로모터의 하류에 기능적으로 상기 표지 유전자가 연결된 컨스트럭트(발현 벡터)에 의해, 줄기세포를 인 비트로로 트랜스펙트하고, 이 세포를 적당한 배지중에서 배양하는 것에 의해, 이 표지 유전자를 줄기세포 내에 도입할 수 있다.
트랜스펙션의 방법으로서는, 생물학적 방법, 물리적 방법, 화학적 방법 등을 나타낼 수 있다. 생물학적 방법으로서는, 예컨대 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 특이적 수용체를 이용하는 방법, 세포 융합법[HVJ(센다이바이러스), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 전기적 세포 융합법, 미소핵 융합법(염색체 이입)]을 들 수 있다. 또한 물리적 방법으로서는, 현미 주입(마이크로인젝션)법, 전기 천공(일렉트로포레이션)법, 유전자총(파티클건)법을 이용하는 방법을 들 수 있다. 화학적 방법으로서는, 인산칼슘 침전법, 리포펙션법, DEAE-덱스트란법, 프로토플라스트법, 적혈구 고스트법, 적혈구막 고스트법, 마이크로 캡슐법을 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 플라스미드 벡터, PAC, BAC, YAC, 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터 등을 들 수 있고, 적절하게 선택할 수 있다.
프로모터의 종류는, 표지 유전자가 도입된 세포 내에서, 이 표지 유전자의 발현을 유도 또는 촉진할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이 프로모터로서는, SRα 프로머터, CMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터, ROSA26 등을 들 수 있다.
상기 발현 벡터는, 목적으로 하는 mRNA의 전사를 종결하는 배열(폴리 A, 일반적으로 터미네이터라고 불림)을 갖고 있는 것이 바람직하다. 그 외, 표지 유전자를 더 고발현시킬 목적으로, 스플라이싱 시그널, 인핸서 영역, 진핵 유전자의 인트론의 일부를, 프로모터 영역의 5' 상류, 프로모터 영역과 번역 영역 사이 또는 번역 영역의 3' 하류에 연결하는 것도 가능하다. 또한, 상기 발현 벡터는, 도입된 표지 유전자가 안정적으로 내장된 클론을 선택하기 위한 선택 마커 유전자(예: 네오마이신 내성 유전자, 하이글로마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 등의 약제 내성 유전자)를 더 포함할 수 있다.
또한, 발광 또는 형광 표지 유전자가 도입된 포유동물로부터 적출된 줄기세포를 이용하여도 좋다. 이 포유동물은 자체 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예컨대 포유동물의 수정란이나, 미수정란, 정자 및 그 전구세포 등의 생식 세포에, 인산칼슘 공침전법, 전기 천공(일렉트로포레이션)법, 리포펙션법, 응집법, 현미 주입(마이크로인젝션)법, 유전자총(파티클건)법, DEAE-덱스트란법 등의 유전자 도입법에 의해, 발광 또는 형광 표지 유전자를 도입하고, 그 생식 세포에 유래하는 자손 동물을 얻는 것에 의해, 발광 또는 형광 표지 유전자가 도입 된 포유동물을 제조할 수 있다.
생식세포에 대한 유전자 도입에 있어서는, 목적으로 하는 표지 유전자를, 대상이 되는 포유동물의 세포 내에서 기능 가능한 프로모터의 하류에 연결한 컨스트럭트(발현 벡터)를 이용하는 것이 일반적으로 유리하다.
구체적으로는, 대상이 되는 포유동물의 세포 내에서 기능 가능한 프로모터의 하류에, 표지 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 발현 벡터를, 대상이 되는 포유동물의 수정란 등에 마이클로 인젝션하고, 그 수정란을 위(僞)임신 동물의 자궁 내에 이식하는 것에 의해, 표지 유전자를 고발현하는 유전자 도입 포유동물을 작출할 수 있다.
발현 벡터로서는, 플라스미드 벡터, PAC, BAC, YAC, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있고, 적절하게 선택할 수 있다.
프로모터의 종류는, 표지 유전자가 도입된 포유동물 내에서, 이 표지 유전자의 발현을 유도 또는 촉진할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 프로모터로서, 조직 비특이적인 것을 이용함으로써, 발광 또는 형광 표지 유전자를 편재적으로 발현하는 포유동물을 제조할 수 있다. 이 포유동물로부터 적출된 조직을 이용하면, 1회의 시험으로 다수 종류의 조직의 보존 효과를 동시에 평가하는 것이 가능하다. 조직 비특이적인 프로모터로서는, SRα 프로모터, CMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터, ROSA26, β 액틴 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 조직 특이적 프로모터를 이용하면, 발광 또는 형광 표지 유전자를 목적으로 하는 조직에 특이적으로 발현하는 포유동물을 제조할 수 있다. 예컨대 α1 AT 프로모터를 이용하면 간 장 특이적으로, β 액틴 프로모터를 이용하면 골격근 특이적으로, 에놀라아제 프로모터를 이용하면 신경 특이적으로 각각 표지 유전자를 발현시킬 수 있다.
상기 발현 벡터는, 목적으로 하는 mRNA의 전사를 종결하는 배열(폴리 A, 일반적으로 터미네이터라고 불림)을 갖고 있는 것이 바람직하다. 그 외, 표지 유전자를 더 고발현시킬 목적으로, 스플라이싱 시그널, 인핸서 영역, 진핵 유전자의 인트론의 일부를, 프로모터 영역의 5' 상류, 프로모터 영역과 번역 영역간 또는 번역 영역의 3' 하류에 연결하는 것도 가능하다. 또한 상기 발현 벡터는, 도입된 표지 유전자가 안정적으로 내장된 클론을 선택하기 위한 선택 마커 유전자(예: 네오마이신 내성 유전자, 하이글로마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 등의 약제 내성 유전자)를 더 포함할 수 있다.
다음에, 줄기세포가 이식된 조직 원기를 인 비트로로 배양한다. 조직 원기의 배양은, 통상의 기관 배양의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대 디쉬에 적절한 배지를 가하고, 그 위에 필터를 띄우며, 필터를 통해 배지가 조직 원기에 공급되도록 필터 위에 조직 원기를 배치하고, 디쉬를 인큐베이터 내에 정치함으로써, 조직 원기를 배양할 수 있다. 배양 조건은, 조직 배양 기술에서 통상 이용되고 있는 배양 조건을 이용할 수 있다. 예컨대 배양 온도는 통상 약 30℃～40℃의 범위이고, 바람직하게는 약 37℃가 예시된다. CO2 농도는 통상 약 1%～1O%의 범위이고, 바람직하게는 약 5%가 예시된다. 습도는 통상 약70%～100%의 범위이고, 바람직하게는 약95%～100%가 예시된다. 배양 기간은, 평가에 충분한 길이이면, 특별히 한정되지 않 고 적절하게 설정할 수 있지만, 래트의 신장 원기를 이용한 경우에는, 통상 7～14일간 정도이다.
그리고, 배양한 이 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도를 지표로, 이 줄기세포가 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성이 판정된다. 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도는, 현미경이나, 적절한 이미징 장치를 이용하여 행할 수 있다. 형광 등에 의해 줄기세포가 표지되어 있는 경우에는, 이 표지를 검출할 수 있는 현미경이나, 적절한 이미징 장치가 이용된다. 후술의 실시예에 도시하는 바와 같이, 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는 줄기세포는, 증식과 함께 조직 원기 내에서 분산되고, 이 조직을 구성하는 세포로 분화된다. 줄기세포가 형광 등으로 표지되어 있는 경우에는, 이 표지의 분산으로서, 세포의 분산을 용이하게 검출할 수 있다. 한편, 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 없고, 기형종 등의 종양을 형성해 버리는 줄기세포는, 조직 원기 내에서 분산되지 않으며, 세포 덩어리의 형태를 나타내고, 기형종 등의 종양을 형성한다. 세포의 증식과 함께, 세포 덩어리의 크기가 커진다. 줄기세포가 형광 등으로 표지되어 있는 경우에는, 이 표지의 덩어리로서, 세포 덩어리를 용이하게 검출할 수 있다. 상기 판정은, 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도(또는 유무)와 줄기세포가 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성 사이의 이와 같은 플러스의 상관에 기초하여 행해진다.
즉, 배양 후의 조직 원기 내에서, 이식한 줄기세포 유래의 세포가 증식과 함 께 분산되는 경우에는, 이 줄기세포는 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성이 높다고 판정할 수 있다. 한편, 배양 후의 조직 원기 내에서, 이식한 줄기세포 유래의 세포가 분산되지 않고, 세포 덩어리의 형태를 나타낸 경우에는, 이 줄기세포는 생체 내에서 이 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 없으며, 기형종 등의 종양을 형성해 버릴 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 예컨대 줄기세포에 의한 특정한 조직의 재생 의료를 행하는 것에 앞서서, 그 줄기세포가 원하는 조직을 구성하는 세포로 적절히 분화할 수 있는지의 여부를 평가할 수 있기 때문에, 줄기세포의 품질 컨트롤에 유용하다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면, 다능성 줄기세포로부터 인 비트로로 분화시킨 다분화능 줄기세포나 단분화능 줄기세포를 이용하여 재생 의료를 행하는 경우에, 충분히 분화되어 있지 않고, 기형종 등의 종양 형성능을 갖는 세포가 혼입되어 있지 않은지, 용이하게 평가할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면, iPs세포가 소정의 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지, 또는 미분화인 상태로 초기화되어 있고 기형종 형성능을 갖고 있는지를 평가할 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트에는, 본 발명의 방법에서 이용되는, 생체 외로 분리된 원하는 조직의 원기(예컨대 메타네프론 등)가 포함된다. 조직의 원기는, 적절한 조직 보존액(예컨대 ET-Kyoto액 등)중에서 동결되어 있어도 좋다.
본 발명의 키트는, 또한 본 발명의 방법에서 평가 대상인 줄기세포를 이식되 는 조직 원기의 세포와 식별할 수 있도록 표지하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 이 시약으로서는, 형광 표지 시약, 발광 표지 시약, 방사선 동위체 표지 시약 등을 들 수 있다. 이 시약으로서는, 예컨대 전술의 형광 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터나, 효소를 발현할 수 있는 발현 벡터와, 이 효소에 대응하는 형광 기질 또는 발광 기질과의 조합 등을 든다. 또한, 본 발명의 키트는 전술의 방법에 의해 발현 벡터를 줄기세포로 트랜스펙트하기 위한 시약을 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는, 또한 본 발명의 방법에서 사용되는 여러 가지의 시약이나 툴[예컨대 조직 원기중에 줄기세포를 이식하기 위한 툴(머니퓰레이터, 마이크로 피펫 등), 조직 원기를 인 비트로로 배양하기 위한 디쉬, 필터, 배지, 상기 본 발명의 방법이 기재된 지시서, 표지를 검출 가능한 현미경이나 적절한 이미징 장치 등]을 포함할 수 있다.
그 외, 본 발명의 키트를 이용함으로써, 본 발명의 방법에 의해 용이하게 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 평가할 수 있다.
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하에 기술하는 실시예에 의해 전혀 한정되는 것이 아니다.
(실시예 1)
iPS를 대표로 하는 줄기세포는 여러 가지의 유전자를 도입함으로써 수립되지만, 수립된 줄기세포의 암원성은, 마우스 등에서는 보이지 않아도 개나 원숭이 등 의 대형 동물의 줄기세포에서 확인되는 케이스가 보고되어 있다(Xiao-Bing Zhang, et al. JCI 118:1502, 2008). 그래서 본 시험에서는, 녹색 형광 단백(GFP)으로 표지한 원숭이 Es세포(Nagata M, et al. J Gene Med 5;921, 2003), 및 적색 형광 단백인 버섯 오렌지가 도입된 돼지(Matsunari H, et al. Cloning stem cells 10;313, 2008)로부터 수립된 MSC를 이용하였다.
이 원숭이 Es세포는, 생체 내에 이식하면 기형종을 형성하는 것, 및 이 돼지 MSC는, 신장 원기 내에 이식하면 신장을 구성하는 에리스로포이에틴산생세포로 분화할 수 있는 것이 알려져 있다(Transplantation 85:1654-1658, 2008).
테스트하는 줄기세포의 래트 태아 신장 원기에 대한 주입은 공지기술에 따른다(Yokoo T, et al. J Am Soc Nephrol 17; 1026, 2006). 구체적으로는, 100～10000개의 세포(원숭이 ES세포 또는 돼지 MSC)를 실체 현미경 하에서 마우스 피펫을 이용하여 래트 태아 신장 원기중에 주입하였다. 주입 후의 신장 원기를 정법에 의해 필터가 있는 2중 배양 접시 위에서 10～14일간, 기관 배양하였다. 배양 후의 신장 원기를 형광 현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 원숭이 ES세포를 이입한 경우에는, 이입한 세포가 하나의 덩어리가 되고, 기형종을 형성하는 모습이 형광 이미지에 의해 확인되었다(도 1). 기형종의 형성은, 광학 현미경에서도 확인되었다(도 2). 한편 돼지 MSC는, 종양을 형성하지 않고 신장 원기중에 분산되어, 신장으로 분화하였다(도 3).
(실시예 2)
임신 래트로부터 15일령의 태자(胎仔) 래트를 분리하고, 실체 현미경 하에서 태자 래트로부터 신장 원기를 적출하여, 필터가 있는 2중 배양 접시의 필터 위에 정치하였다. 한편, 공지기술의 방법(Takahashi K, et al. Nature Protocols 12;2, 2007)으로써 수립된 마우스 iPS세포를 1000～10000개의 세포 현탁액으로 하고, 실체 현미경 하에서 마우스 피펫을 이용하여, 상기 래트 신장 원기중에 주입하였다. 세포 주입 후의 래트 신장 원기는, 정법에 의해 14일간, 기관 배양을 행하였다. 배양 후의 신장 원기를 형광 현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, ES세포와 마찬가지로, 마우스 iPS세포를 이입한 경우에는, 이입한 세포가 하나의 덩어리가 되고, 기형종을 형성하는 모습이 형광 이미지에 의해 확인되었다(도 4).
본 발명의 방법을 이용하면, 줄기세포가 생체 내에서 기형종 등의 종양을 형성하는 세포인지, 또는 생체 내에서 종양 형성없이 여러 가지의 세포로 분화되어, 정상적인 조직 형성에 기여할 수 있는 세포인지를 간편히 검정할 수 있다.
본 출원은 국제 출원 PCT/JP2008/073849(출원일: 2008년 12월 26일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
도 1은 원숭이 ES세포를 이입한 메타네프론의 형광 이미지의 시간 경과에 따른 변화를 도시한다.
도 2는 원숭이 ES세포를 이입한 메타네프론의 가시광 이미지를 도시한다. 기형종이 형성되고, 3개의 배엽계에 대한 분화가 확인되었다.
도 3은 돼지 MSC를 이입한 메타네프론의 형광 이미지의 시간 경과에 따른 변화를 도시한다.
도 4는 마우스 iPS세포를 이입한 메타네프론의 형광 이미지의 시간 경과에 따른 변화를 도시한다.
Claims (6)
- 이하의 공정을 포함하는, 줄기세포가 생체 내에서 원하는 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있는지의 여부를 평가하는 방법:(1) 평가 대상인 줄기세포를 비인간 포유동물의 원하는 조직의 원기중에 이식하는 것,(2) 상기 조직 원기를 인 비트로로 배양하는 것,(3) 배양한 상기 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도를 지표로, 상기 조직 원기에서의 이식된 줄기세포 유래의 세포의 분산 정도 또는 유무와 줄기세포가 생체 내에서 상기 조직을 구성하는 세포로 분화될 가능성 사이의 플러스 상관에 기초하여, 상기 줄기세포가 생체 내에서 상기 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성을 판정하는 것
- 제1항에 있어서, 공정 (3)에서 배양 후의 조직 원기 내에서, 이식한 줄기세포 유래의 세포가 증식과 함께 분산되는 경우에는, 상기 줄기세포는 생체 내에서 상기 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 있을 가능성이 높다고 판정하고, 배양 후의 조직 원기 내에서, 이식한 줄기세포 유래의 세포가 분산하지 않고, 세포 덩어리의 형태를 나타낸 경우에는, 상기 줄기세포는 생체 내에서 상기 조직을 구성하는 세포로 분화할 수 없고, 종양을 형성해 버릴 가능성이 높다고 판정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 평가 대상인 줄기세포가 이식되는 조직 원기의 세포와 식별할 수 있도록 표지되어 있는 방법.
- 제3항에 있어서, 표지가 형광 표지인 방법.
- 제1항에 있어서, 조직이 신장인 방법.
- 제1항에 있어서, 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 방법.
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