WO2006129696A1 - 哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列を含む発現ベクター及びその利用 - Google Patents
哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列を含む発現ベクター及びその利用 Download PDFInfo
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- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Definitions
- the present invention relates to a recombinant expression vector in which a marker gene is incorporated so as to be placed under the control of the promoter sequence of a Vasa homolog gene derived from a mammal, and a transgene incorporating the recombinant expression vector.
- the present invention relates to a method for obtaining a non-human mammal or ES cell or tissue stem cell germ cell.
- Vasa homologous genes have been identified in many multicellular animal species, including flat-animal (planar) force humans.
- the mouse Vasa homolog gene (Mvh) is registered as the gene name Ddx4 (gene ID: 13206) in the mouse gene data bank.
- the Mvh locus containing the entire transcription unit (exon) is located on mouse chromosome 13 with a length of about 53 kb, a protein gene (RIKEN CDNA9130023D20) located about 9.5 kb upstream of the transcription direction and about 3.2 kb downstream. Located between Tubulin-2 pseudogenes.
- Mvh gene expression is detected in all germ lineages of oogenesis and spermatogenesis, starting from the embryonic migrating primordial germ cell, through the gonad primordial germ cell, to the meiotic haploid germ cell Is done. Its expression specificity is common to all mammalian species, including vertebrates, especially humans. The expression of this Vasa homolog gene has been identified so far Among the germline-expressed genes, they exhibit extremely strict germline specificity (Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139–149, 2000).
- JP-A-2002-65261 an ES cell line into which a marker gene has been introduced so as to be placed under the control of Vasa gene or its homologous gene expression is cultured in the presence of a germ cell differentiation promoting factor.
- a method for obtaining a germ cell is described, which comprises selecting a cell having germ cell differentiation ability using marker gene expression as an index.
- the marker gene is transferred to the ES cell by homologous recombination so that the marker gene is placed under the control of the expression of the Vasa gene inherent in the ES cell or its homologous gene. Has been introduced to the stock.
- An object of the present invention is to provide a method for easily selecting cells having the ability to differentiate into germ cells using marker gene expression as an index without complicated operations such as homologous recombination. .
- the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and have developed a recombinant expression vector in which a marker gene is incorporated so as to be placed under the control of the promoter sequence of a Vasa homolog gene derived from a mammal.
- the introduced transgenic non-human mammal was prepared, and it was found that cells having a proliferative cell differentiation ability could be selected from the transgenic non-human mammal using the expression of the marker gene as an index.
- the present invention has been completed based on these findings. [0008] That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
- a method for obtaining germ cells comprising collecting cells having germ cell differentiation ability as an indicator.
- a method for obtaining a germ cell comprising collecting a cell having germ cell differentiation function using marker gene expression as an index.
- a 3′-untranslated region (UTR) sequence of a mammal-derived Va sa homolog gene is linked downstream of the marker gene, wherein any of (1) to (4) The method described.
- the marker gene is a gene encoding a fluorescent protein, a drug resistance gene, or a chemiluminescent enzyme gene.
- a mammalian-derived V is located downstream of the marker gene.
- a test substance is introduced into a transgenic non-human mammal into which a marker gene has been incorporated so as to be placed under the control of the promoter sequence of a Vasa homolog gene derived from a mammal and into which a recombinant expression vector has been introduced.
- a method of screening a germ cell differentiation promoting factor which comprises administering a test substance that induces expression of the marker gene.
- a test substance is administered to a transgenic non-human mammal into which a marker gene has been incorporated so as to be placed under the control of the promoter sequence of a Vasa homolog gene derived from a mammal and into which a recombinant expression vector has been introduced. Characterized in that a substance having toxicity to germ cells is assayed using the expression of the marker gene as an indicator. Toxicity test method.
- test substance in an ES cell or tissue stem cell into which a marker gene has been incorporated and a recombinant expression vector has been introduced so as to be placed under the control of the promoter sequence of a Vasa homolog gene derived from a mammal
- a test method for toxicity to germ cells characterized by culturing cells under the condition that the expression of the marker gene is induced and assaying a substance having toxicity to germ cells using the number of cells as an index.
- Vasa homologue gene a germ cell-specific gene, is specific to late primordial germ cells that have settled in the gonad and must not be expressed in earlier undifferentiated early germ cells or ES cells. Therefore, in the present invention, Vasa homologous gene expression derived from a mammal is used as a germ cell differentiation index.
- the differentiation of various cell types including the three germ layers occurs in the same manner as in vivo, and the appearance frequency of germ cells is considered to be extremely low.
- Vasa homolog gene expression can be expressed by GFP (green fluorescent protein of luminescent jellyfish) and lacZ (bacteria-derived galactosidase enzyme; blue color by chromogenic substrate or fluorescent color by luminescent substrate.
- GFP green fluorescent protein of luminescent jellyfish
- lacZ bacteria-derived galactosidase enzyme; blue color by chromogenic substrate or fluorescent color by luminescent substrate.
- a recombinant expression vector in which the marker gene was inserted was constructed so as to be placed under the control of the expression of the Vasa homolog gene.
- the use of foreign gene expression vectors using the expression control region of the Vasa homolog gene has excellent characteristics for gene function analysis and tissue engineering applications through the germline.
- the marker gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene whose expression can be easily detected or measured.
- GFP green fluorescent protein
- RFP red fluorescent protein
- BFP Blue fluorescent protein
- YFP yellow fluorescent protein
- Examples include a gene encoding a protein, a chemiluminescent enzyme gene such as lacZ, or a drug resistance gene such as neomycin, and an artificially synthesized gene obtained by adding various mutations to these genes may be used.
- the mammal-derived Vasa homolog gene referred to in the present invention means a Vasa gene in a mammal (for example, mouse, human, pig, ushi, hidge, rat, etc.).
- a mammal for example, mouse, human, pig, ushi, hidge, rat, etc.
- Such Vasa homologue genes are known, for example, mouse (Fujiwara, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12258-12262, 1994), human (Castrillon, DH et al. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 9585-9590, 2000), rat ( Komiya et al "Dev. Biol., 162, 354-363, 1994) and the like.
- the expression regulatory region of the Mvh gene was identified by the following two methods.
- the first method is a promoter activity assay method in which genomic DNA upstream of the first exon is isolated in various lengths and a firefly lucif erase enzyme protein or the like is used as a reporter gene.
- promoter activity means the transcriptional activity possessed by the basic promoter and the transcription promoting activity possessed by the enhancer, and the expression regulatory sequence having such promoter activity is referred to as “promoter sequence”.
- the DNA sequence upstream of the transcription start site including the GC-rich basic promoter, is prepared to a certain length, linked to a promoter vector with ludferase, and the germ cell culture strain EG (Embryonic Germ)
- the gene is introduced into cells by the ribofusion method, and then the expression activity is detected by the ludferase enzyme activity assay.
- upstream means “upstream from the transcription start point”.
- the weak activity observed in upstream l.Okb is considered to indicate that of the basic promoter, as shown in Fig. 2, that l.Okb activity does not differ depending on the cell type and this part. This is also supported by the fact that the loss of A causes a complete loss of transcriptional activity ( Figure 1).
- the transcriptional activity of 3.0 kb is seen to be cell type-specific, and when EG cells are mixed with gonad somatic cell line (M15), the expression is enhanced due to the behavior of endogenous Vasa expression. Matches. Therefore, the upstream region of 1.0 kb to 3.0 kb It has been found that at least the major germline specific expression regulatory sequences are included.
- the Vasa expression regulatory region tested in the above cultured cell line is obtained by transgene (Tg) mice obtained by microinjecting an exogenous gene into a mouse fertilized egg. Verified.
- Tg transgene
- a transgenic mouse with a 3.0-GFP gene in which a GFP gene is linked as a reporter to the upstream transcription region of 3.0 kb GFP expression specific to testicular germ cells is detected. Its GFP expression is identified as cells that emit green fluorescence under a fluorescence microscope, and strong positivity is observed in meiotic sperm cells from meiotic cells (Fig. 3). This result was the same when a wider upstream region of 8.0 kb, 5. Okb was used.
- Mvh gene expression is controlled by at least two types of regulation: a specific transcription promoting activity by the upstream transcription region (approximately 3.0 kb) and a translational activation by the 3'-downstream region including the untranslated region. The element was found to be valid.
- SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shows the position of about 3 kb upstream from the transcription start point of the Mvh gene that can be used in the recombinant expression vector of the present invention and the base sequence from the transcription start point.
- the base sequence of the 3′-untranslated region (UTR) sequence of the Mvh gene that can be used in the recombinant expression vector of the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- the promoter sequence of the mammalian-derived Vasa homolog gene that can be used in the recombinant expression vector of the present invention is not limited to the mammalian species from which it is derived, but the animal into which the expression vector is introduced or the animal into which the introduced cell is derived. Use the same kind of Preferably it is. Moreover, it is preferable that it is expressed specifically in the separated germ cells.
- the recombinant expression vector of the present invention may appropriately include elements used in ordinary expression vectors such as a selectable marker gene such as an ampicillin resistance gene and an origin of replication. it can.
- a cell obtained by introducing the recombinant expression vector described in (1) above examples include ES cells and tissue stem cells.
- tissue stem cells mesenchymal cells, particularly bone marrow mesenchymal cells and the like can be used.
- cells such as ES cells and tissue stem cells cells derived from mammals or birds can be used, preferably cells derived from mammals can be used, and particularly preferably derived from mice or humans. Cells can be used.
- mouse 129 strain male-derived E14 cell line and E14TG2a cell line derived therefrom human ES cell line H9 (Thomson et al., Science, 282, 1145- 1147, 1998).
- a method for introducing a recombinant expression vector into a cell a method known to those skilled in the art can be used. Specifically, an electopore poration method, a calcium phosphate method, a lipolysis method or the like can be used, and a commercially available transfer reagent such as Lipofectamine 2000 (Invitrogen) can also be used.
- transgenic non-human mammal into which the recombinant expression vector of the present invention has been introduced.
- the method for producing the transgenic non-human mammal of the present invention is not particularly limited.
- the transgenic non-human mammal can be prepared by introducing the recombinant expression vector of the present invention into a fertilized egg or the like.
- the recombinant expression vector of the present invention is introduced into a fertilized egg of a non-human mammal, the fertilized egg is transplanted into a pseudopregnant female non-human mammal, and the non-human mammal Strength It can be produced by delivering a non-human mammal introduced with the recombinant expression vector.
- non-human mammals examples include rodents such as mice, mice, musters, monoremots, rats, and rabbits, as well as nu, cats, goats, hidges, rushes, pigs, monkeys and the like. Forces that can be used Mice are the most preferred among rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, and rabbits from the standpoint of ease of production, breeding, and use.
- Introduction of the recombinant expression vector of the present invention at the fertilized egg cell stage can be carried out so as to be maintained in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
- the presence of the recombinant expression vector of the present invention in the embryo cells of the produced animal after gene transfer means that all the progeny of the produced animal have the recombinant expression vector of the present invention in all the germ cells and somatic cells. It means to do.
- the offspring of this type of animal that has inherited the gene has the recombinant expression vector of the present invention in all its germ cells and somatic cells.
- the transgenic animal of the present invention After confirming that the transgenic animal of the present invention stably retains the gene by mating, it can be subcultured as a gene-bearing animal in a normal breeding environment. By obtaining a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes and mating these male and female animals, all the offspring can be bred to have the gene.
- the transgenic non-human mammal is a transgenic mouse
- the recombinant expression vector of the present invention is microinjected into the male pronucleus of a mouse fertilized egg, the obtained egg cell is cultured, then transplanted into the oviduct of a pseudopregnant female mouse, and then the transplanted animal is bred and born mouse
- the transgenic mouse of the present invention can be prepared by selecting a pup mouse having the expression vector.
- the fertilized egg of the mouse any mouse can be used as long as it can be obtained by mating mice derived from 129Zsv, C57BL / 6, BALBZc, C3H, SJLZWt, and the like.
- the selection of a pup mouse having the recombinant expression vector of the present invention is performed by extracting DNA from the tail of the mouse and the like, and using the introduced recombinant expression vector as a probe. It can be carried out by the lysis method or the PCR method using specific primers.
- cells having germ cell differentiation ability are collected from the transgenic non-human mammal introduced with the above-described recombinant expression vector of the present invention using the expression of the marker gene as an index.
- a featured method for obtaining germ cells is provided.
- the germ cells obtained are preferably germ stem cells.
- the germ stem cells referred to here may be either sperm stem cells or egg stem cells.
- a foreign gene When a foreign gene is expressed using the above-mentioned Mvh gene upstream region of 3.0 kb as a control promoter sequence, its expression can be limited only after the meiosis phase of spermatogenic cells.
- This specificity can be used to analyze the function of gene products specific to the spermatogenesis process and to track the intracellular behavior of the foreign proteins.
- One specific example is the case of intracellular localization of the Vasa-GFP fusion protein. Due to the antibody staining method, MVH protein is localized in the cytoplasm during the spermatogenesis of the mouse, resulting in a granule structure during meiosis and a single giant granule structure adjacent to the nuclear membrane in sperm cells.
- CB Chromatoid Body: CB
- the CB structure is a complex of protein and RNA components, and is an intracellular organ presumed to play a role as a translational control device in spermatogenesis.
- the expression of germ cell-specific Vasa-GFP fusion protein allows observation of this CB structure under non-fixed conditions. Expression by the 3.0 kb upstream region does not inhibit physiological functions such as spermatogenesis, which is about 1/5 lower than endogenous Mvh gene expression, and its influence on fertility. As shown in Fig.
- MVH-GFP by the foreign gene showed localization in cytoplasmic granules under spermatocytes and CB structure in sperm cells, consistent with the behavior of endogenous MVH proteins.
- This property makes it possible to measure the behavior of the CB structure over time in real time and provides a new means to purify factors related to its formation and function from non-fixed sample cartridges. .
- the same method is applied to protein factors involved in spermatogenesis and is visible. It can be used for mechanical labeling and identification of coupling factors.
- a large DNA containing the entire genome gene of Mvh (or Vasa homolog gene of various animals) can be used as a BAC vector ( Cosmid, PI phage) can be used in which a foreign expression gene is incorporated into the Mvh gene in the vector.
- the full-length Mvh gene is a sequence containing about 60 kb from at least about 3.0 kb upstream of the transcription start point to about 3.0 kb downstream of the translation stop point, and the incorporated form is a translation codon downstream of the translation start point.
- the foreign gene cDNA in a framed manner, or to insert or replace a gene with a ribosome binding sequence (ires) added upstream of the foreign gene.
- a reporter gene in which an RFP gene is incorporated into a BAC clone having an approximately 150 kb genomic DNA containing the Mvh gene is given.
- the Bac-Vas-RFP vector into which the RFP gene cDNA has been inserted in line with the translation start point of the second exon, can be transferred to cultured cells by the lipofussion method or by DNA microinjection. Used to create a transgenic mouse.
- Bac-Vas-RFP recombinant ES cells can be selected based on drug resistance (in this case, selection based on G418 resistance using a Neo resistance gene).
- drug resistance in this case, selection based on G418 resistance using a Neo resistance gene.
- primordial germ cells, spermatogenic cells, and ovum cell types are differentiated in culture from ES cells (Toyooka, Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 11457-11462, 2003; Hubner, K. et al, Science, 300, 1251-1256 2003; Geijsen, N. et al., Nature, 427, 147-154, 200 4).
- ES cells introduced with the recombinant expression vector of the present invention can distinguish germ cells positive for Mvh expression as RFP red fluorescent cells by inducing differentiation under culture, and cell sorter operation can generate each force under culture conditions. Only germ cells separated in stages can be purified ( Figure 6B).
- germ cells in the testis and ovary that is, spermatogenic cells, spermatogenic cells up to sperm, and ovarian cell strength matured ovum Up to oocyte-forming cells are identified as red fluorescent cells by RFP expression (FIG. 6C).
- the adult testis has sperm stem cells that are responsible for the periodic spermatogenesis, and has characteristics different from primordial germ cells and spermatogonia, which are undifferentiated proliferating cells.
- the culture method has been established in recent years, and it is possible to obtain sperm and offspring derived from cultured sperm stem cells by transplantation into living testis. (Kanatsu-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2 003).
- the above Bac-Vas-RFP can also visualize and discriminate this sperm stem cell.
- oocyte stem cells which become oocyte-forming stem cells, was also reported in the adult ovary. This cell type is identified as an Mvh expression positive cell located in or outside the basement membrane that surrounds the entire ovary (Johnson, J. et al, Nature, 428, 145-150, 2004).
- the oocyte in the ovary has a globular form with a large cytoplasm, whereas the oocyte stem cell has a flat shape in a cross-sectional view of the tissue.
- oocyte stem cells outside the basement membrane are observed as RFP positive cells as well as oocytes (Fig. 7B). Furthermore, as shown in FIG. 7C, when dispersed ovarian cells are placed in culture, all oocytes in meiosis do not proliferate, but are RFP-positive and proliferative cells or flat-shaped cells. The observation of cells that remain intact also indicates that cell labeling with the Bac-Vas-RFP vector enables identification and purification of oocyte stem cells.
- the characteristic of the recombinant expression vector of the present invention using the expression regulatory region of the mammalian Vasa homolog gene as described above is that germ cells can be identified from the living tissue of an individual transgenic animal using the expression vector. It is possible, and is particularly effective in the operation of selecting and culturing germ stem cells specifically, and it is possible to realize the addition of foreign characters such as fluorescent labeling, drug selectivity, or new physiological function factors by expressing foreign genes. it can. The same specificity can also be used in cultured cell systems, and not only in mice but also in other animal species such as humans, gene transfer into cultured cells derived from various living tissues such as ES cells and tissue stem cells. Induction or transformation into germline lineage in culture The ability to separate cultured cells, particularly the ability to separate and cultivate cells that have been separated into germ stem cells. This demonstrates excellent properties in establishing pure cultures of germ stem cells.
- the test substance is further administered to a transgenic non-human mammal introduced with the above-described recombinant expression vector of the present invention, and the test substance that induces the expression of the marker gene is selected.
- Screening method for germ cell differentiation promoting factor, and ES cell or tissue stem cell introduced with the above-described recombinant expression vector of the present invention is cultured in the presence of a test substance, and a test substance that induces expression of the marker gene is selected.
- a screening method for germ cell differentiation promoting factors is provided.
- the germ cell differentiation promoting factor obtained by the above screening method is also within the scope of the present invention.
- the type of the test substance is not particularly limited.
- the library include a synthetic compound library (such as a combinatorial library) and a peptide library (such as a combinatorial library).
- Test substances for screening can be natural or synthetic, and can be tested on any number of candidate test substance mixtures (including libraries, etc.), regardless of whether a single candidate test substance is independently tested. You may do. It is also possible to screen a fraction of a mixture such as a cell extract and repeat the fractionation to isolate a substance that ultimately induces the expression of a marker gene.
- a test substance is administered to a transgenic non-human mammal introduced with the above-described recombinant expression vector of the present invention, and the substance has toxicity to germ cells using the expression of the marker gene as an index.
- a test for toxicity to germ cells wherein ES cells or tissue stem cells introduced with the above-described recombinant expression vector of the present invention are cultured in the presence of a test substance, and the expression of the marker gene is characterized. It is characterized by assaying substances having toxicity to germ cells using the number of cells induced as an index. A method for testing toxicity to germ cells is provided.
- the kind of substance (test substance) having toxicity to germ cells is not particularly limited.
- peptides, polypeptides, synthetic compounds (low molecular organic compounds, high molecular organic compounds, etc.), microorganisms examples include fermented materials, extracts from organisms (including plant or animal tissues, microorganisms, cells, etc.), or libraries thereof.
- the library examples include synthetic compound libraries (such as combinatorial libraries) and peptide libraries (such as combinatorial libraries).
- the test substance may be natural or synthetic, and even if a single candidate test substance is independently tested, the test substance may be tested on any number of candidate test substance mixtures (including libraries, etc.). May be.
- endocrine disrupting substances can be evaluated by the toxicity test method of the present invention as substances having toxicity to germ cells.
- Example 1 Assay of transcriptional regulatory region of Mvh gene
- the Mvh genomic gene region was prepared from a clone containing the first exon of the 129 mouse genomic library (EMBL3: Clontech) and based on the restriction map of the insert DNA.
- Upstream 5.0 kb, 3.0 kb, and 1.0 kb are the Kpnl site located approximately 5.0 kb upstream from the Smal site in the first exon, the Pstll site located approximately 3.0 kb upstream, and the EcoRV located approximately 1.0 kb upstream.
- An OLuc assay vector was created.
- 8.0 Luc was constructed as a vector based on the l.OLuc vector, with an approximately 7.8 kb Notl genomic fragment existing just before the first exon of the genome inserted and replaced.
- 3.0 A luc is a vector obtained by deleting the Xbal / Sacl fragment (corresponding to upstream -400 to -900) from the 3.0 Luc vector (see FIG. 1).
- EG cells used as gene transfer host cells are primordial germ cells of mouse embryo 8.5 days after fertilization
- the mosquito is also an established cultured cell and is grown in DMEM medium containing 10% FCS (usual fetal serum), bFGF (100 ng / ml), and LIF (10,000 units / ml).
- FCS usual fetal serum
- bFGF 100 ng / ml
- LIF 10,000 units / ml.
- the test sample was a cell cultured at a density of about 1 million cells / well in a 12-well plate.
- Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used for gene transfer using 2 g of one specimen, and the transfer method was in accordance with its use manual.
- CMV-Renilla Luc vector (pRL-CMV: Promega) was used and introduced simultaneously at a ratio of 100: 1 for each assay introduction. On the first day after introduction, cell samples were collected and enzyme activity was measured using Dual Luciferase Assay System (Promega). Figure 1 shows the relative activity ratios for the endogenous control CMV-Renilla Luc.
- Fig. 2 shows the results of the assay using various mouse cell lines as hosts for the 3.0 Luc vector that showed significant expression promoting activity.
- the cell lines used were the EG cells (Matsui, Y. et al., Cell, 70, 841-847, 1992) and M15 (day 10.5 embryonic mouse fetal gonad feeder cell line) (Larsson, SH et al ., Cell, 81, 391-401, 1995),? 19 (embryonic tumor cell line) ( ⁇ 108 ⁇ 716, MW & Rogers, BJ, Dev. Biol, 89, 503-508, 1982), STO (fiber Blast cell line) (Martin, G "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634-7639, 1981), ES (CCE; embryonic stem cell line) (Robertson, E. et al, Nature, 323, 445-449, 1986).
- the measurement method was the same as in FIG. As a result, it was shown that 3.0Luc vector has an expression promoting activity specific to EG cells derived from germ cells. As shown in Fig. 2, a slight expression is also observed in ES cells. A remarkable expression is observed in EG cells. In other words, it has been confirmed that there is no or very low expression in ES cells. This does not indicate that introduction into ES cells is ineffective, but is a result that confirms the characteristics of activation after reproductive differentiation after introduction into ES cells. In addition, the expression of the endogenous Mvh gene is markedly enhanced after germ cells are established in the gonads, which can also be observed by culturing EG cells with gonad feeder cell lines.
- the 3.0-GFP vector was obtained by ligating the fragment lacking the Luciferase gene portion of the 3.0Luc vector prepared in Example 1 and the EcoRI-Sail fragment of the EGFP gene isolated from the pEG FP-promoter vector (Clontech). Created.
- Fig. 8 shows the structure of the 3.0-GFP vector.
- a 10 ng / 1 DNA solution which has been cut and linearized at the Seal site in the vector, is microinjected into the pronucleus of a mouse (B6C3F1) fertilized egg, so that the Tg containing the 3.0-GFP vector is incorporated. Three mouse strains were established.
- it can be prepared by transferring a fertilized egg microinjected with an expression vector DNA into the oviduct of a pseudopregnant mouse and delivering a transgenic mouse from the foster parent mouse.
- a litter mouse is a recombinant mouse means that the tail tip of the mouse is cut, the genomic DNA extracted from the tissue force is treated with EcoRI restriction enzyme, then developed by agarose electrophoresis, and a GFP fragment 32P-labeled probe is used. This was determined by Southern blot analysis. The resulting recombinant mouse offspring were established as mouse strains in which expression vectors were incorporated into different chromosomal sites by individual breeding.
- Tg mouse lines incorporating the 3.0-GFP vector prepared as described above showed exactly the same results.
- the adult testis of the obtained Tg mouse exhibits green fluorescence derived from GFP even at the organ level under a fluorescent stereomicroscope.
- Figure 3 shows a tissue section of the Tg mouse testis. The testis was fixed with 4% paraformaldehyde solution, then frozen, and TO-PR03 iodide solution (Molecular Pbobes) was used for nuclear staining to visualize the tissue. As a result, GFP fluorescence was detected in the spermatogenic force of spermatogenic cells in the seminiferous tubule in the sperm cell layer.
- the primers used here were 5'-GATTAAAGCAAACGAACATA-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5 CCCACTGCACATAGGAC TTAT-3' (SEQ ID NO: 4), and the resulting 2.3 kb product was a translational stop codon force. Completely includes about 600b of the area.
- the PCR reaction was performed using Ex-taq or LA-taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) and repeating a cycle of 94 ° C for 1 minute, 58 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 3 minutes 27-30 times.
- the PCR reaction conditions are used in common in all examples unless otherwise specified, and hence the description is omitted in the following examples.
- the PCR product is subcloned into the pGEM-T Easy vector (Promega), excised using the Notl sites at both ends of the cloning site, and aligned with the Notl site downstream of the GFP of the 3.0-GFP vector. This was used as the 3.0-GFP-UTR vector. Creation of Tg mice is the same as in Example 2.
- FIG. 4 shows GFP fluorescence observation and tissue section observation of the adult testis and fetal testis in the obtained 3.0-GFP-UTR Tg mouse.
- the expression of GFP fluorescence during fetal period was weak compared with adult testis, but significant expression was observed.
- the tissue sections could be detected by the fluorescent antibody method using a combination of anti-GFP antibody (1/500 dilution; Clontech) and Oregon Green-anti-rabbit IgG (1/500 dilution; Molecular Probes).
- Mvh 3.0 kb showed an activity that causes specific expression of a gene linked downstream to spermatogenic cells in the testis.
- a 3.0-VASA-GFP Tg mouse was created as an example of analyzing the behavior of a protein molecule that was visualized and labeled using its specificity.
- a VASA-GFP fusion cDNA is ligated downstream of Mvh 3.0 kb, and changes in the intracellular distribution of VASA protein are visualized by GFP fluorescence.
- the construction of the vector was based on the modification of the 3.0-GFP vector.
- a plasmid clone containing Mvh full-length cDNA (or a cDNA prepared from testis mRNA) can be used as a saddle, and the Mvh full-length translation region has a BamHI site at the 5 'end and a Kpnl site at the 3' end.
- the primer used was 5'-BamH ⁇ GAAGCTATCATGGGAGATGAA-3 '( SEQ ID NO: 5) and 5′-KpnI-GGCCCATGATTCGTCATCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 6).
- a cDNA having a Kpnl site at the 5 'end and a Sail site at the 3' end is prepared by PCR reaction.
- the primers used were 5'-Kpnl-ACCATGGTGAGCAAGGGCG AG-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'- Salll-CTACTCAGACAA TGCGATGC-3' (SEQ ID NO: 8).
- the Mvh plas mid was opened with Kpnl / Sall, and then the Kpnl / Sall cleaved fragment from the other GFP plasmid was ligated.
- Mvh and GFP are linked via the two codons of the Kpnl site to form one fusion cDNA.
- a fragment of this Mvh-GFP cDNA excised by BamHI / Sall digestion was inserted into an open vector obtained by excising the GFP cDNA by Bglll / Sall digestion to construct a 3.0-VASA-GFP vector.
- the method for preparing a Tg mouse and observing the fluorescence image of its testis tissue is the same as in the above-described Examples. As shown in Fig. 5, the expression of VASA-GFP fusion protein was confirmed in spermatocytes and sperm cells in this Tg mouse testis. Chromatoid body visualization and its live cells It was possible to observe the dynamics.
- Example 5 Visualization of germ cells using BAC-Vasa-RFP gene
- BAC clone E. coli was isolated from the mouse genomic BAC library (Clontech) using about 140 kb of mouse genomic DNA containing the Mvh locus. A DNA fragment that causes homologous recombination within this BAC clone is prepared by PCR using Pfo polymerase (Promega).
- Pfo polymerase Pfo polymerase
- plasmid DNA obtained by subcloning the RFP cDNA (Clontech) fragment into pUC-loxP-Neo-loxP in advance is used as a saddle type.
- the 5 'and 3' primers used are 5'-50mer [homologous sequence A] -TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5'-50mer [homologous sequence B] -GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3' (SEQ ID NO: 10)
- the homologous sequence A is a 50 base sequence up to the translation start point ATG of Mvh in the second exon of Mvh
- the homologous sequence B is a complementary base sequence of 50 bases thereafter.
- the resulting PCR product was mixed with the recombinant competent BAC clone E.
- BAC DNA was prepared on a Nucleobond-ax column (Macherey-Nagel) and used for Tg mouse production and introduction into ES cells (Fig. 6A).
- Lipofectamin 2000 was used for introduction into ES cell (E14) wild type, and the recombinant clone was selected for G418 drug resistance.
- ES cells million cells / ml
- DMEM medium containing 10% FCS suspension culture plates
- Unc suspension culture plates
- ES cells form cell clumps and undergo three germ layer differentiation in culture.
- BAC-Vasa-RFP recombinant RFP red fluorescence positive cells were clearly observed after about 3 days, and germ cells differentiated in culture were identified (Fig. 6B).
- BAC-Vasa-RFP Tg mice primordial germ cells in the testis, ovary and fetal gonads were also detected as clear RFP red fluorescent cells (Fig. 6C).
- visualization of ovarian oocytes is the first achievement of this Tg, and one reason is the long life of the RFP protein used as a reporter.
- this remarkable reporter expression is detected earlier than when using the upstream 3.0 kb promoter, and it is possible to detect the primordial proliferating cell force in the male and female fetal gonads, consistent with the endogenous Mvh expression. (Fig. 6D).
- Example 6 Identification and culture of germ stem cells using BAC-Vasa-RFP
- a transgenic non-human mammal capable of highly sensitively detecting the expression of a Vasa homolog gene that is not expressed in undifferentiated stem cells but is specifically expressed in differentiated germ cells.
- a cultured cell line was established.
- the expression vector of the present invention can be used for the selective acquisition of transgenic non-human animal primordial germ cells and germ stem cells, and for the establishment of cultured cell lines derived from them, and to the germ cells that are the basis of ES cell lines. Provides an excellent experimental system for testing the differentiation potential of.
- the present invention can be carried out relatively easily without requiring a complicated operation such as introduction by homologous recombination of genes.
- FIG. 1 shows the results of measuring the promoter activity by luciferase activity using various promoter fragments of the Mvh gene.
- FIG. 2 shows the results of measuring promoter activity by luciferase assay using various mouse cell lines as hosts using 3.0 Luc vector.
- FIG. 3 shows a tissue section image of the testis of a 3.0-GFP transgenic mouse.
- FIG. 4 shows GFP fluorescence observation and tissue section observation of adult testis and fetal testis in 3.0-GFP-UTR transgenic mice.
- FIG. 5 shows GFP fluorescence observation and tissue section observation of the testis of 3.0-VASA-GFP transgenic mice.
- FIG. 6 shows the results of visualizing germ cells using the BAC-Vasa-RFP gene.
- FIG. 7 shows the results of germline stem cell identification and culture using BAC-Vasa-RFP.
- FIG. 8 shows the structure of the 3.0-GFP vector.
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Abstract
本発明の目的は、相同組み換えなどの煩雑な操作を行うことなく簡便に、マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を選別する方法を提供することである。本発明によれば、哺乳動物由来のＶａｓａホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法が提供される。
Description
明 細 書
哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列を含む発現べ クタ一及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に 置かれるようにマーカー遺伝子が組み込まれて!/、る組み換え発現ベクター、並びに 当該組み換え発現ベクターを導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物、又は ES細 胞若しくは組織幹細胞力 生殖細胞を取得する方法などに関する。
背景技術
[0002] ショウジヨウバエを用いた遺伝子解析により、 Oskar, Vasa, Tudor, Nanosの遺伝子 が生殖細胞の決定機構における中核的機能を持つことが明ら力となった (Rongo, C, et al, Development, 121, 2737-2746, 1995)。これらの遺伝子はいずれも卵細胞开 成にぉ ヽて極顆粒に蓄積され、この母性決定因子を持つ割球が生殖細胞運命を決 定される。 Vasa遺伝子は、 ATP依存性 RNAヘリカーゼをコードし、その機能は mRNA 力もタンパク質への翻訳制御に関わると考えられている（Liang, L., et al, Developme nt, 120, 1201-1211, 1994)。また、その酵素機能を担う構造が進化的に強く保存され て!、ることから、扁形動物（プラナリア）力 ヒトまで多くの多細胞動物種で Vasaホモ口 グ遺伝子が同定されている。マウス Vasaホモログ遺伝子 (Mvh)は、マウス遺伝子デー タバンクにおいて、遺伝子名， Ddx4 (gene ID: 13206)として登録されている。全転写単 位（ェキソン）を含む Mvh遺伝子座はマウス 13番染色体上に約 53kbの長さで位置し、 転写方向上流の約 9.5kbにある蛋白質遺伝子 (RIKEN CDNA9130023D20)と、下流約 3.2kbの Tubulin-2偽遺伝子の間に位置する。これらの構造的特徴は、霊長類の Vasa ホモログ遺伝子でも共通する。
[0003] Mvh遺伝子発現は、胎児期の移動期始原生殖細胞から始まり、生殖腺始原生殖細 胞を経て、減数分裂後の半数体生殖細胞まで、卵形成および精子形成のすべての 生殖細胞系譜に検出される。その発現特異性は、脊椎動物、特にヒトを含む全ての 哺乳動物種に共通である。この Vasaホモログ遺伝子の発現は、これまでに特定され
た生殖細胞発現遺伝子の中にお 、ても、極めて厳格な生殖細胞特異性を示すもの である (Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139—149, 2000)。
[0004] 特開 2002— 65261号公報には、 Vasa遺伝子またはそのホモログ遺伝子発現の制 御下に置かれるようにマーカー遺伝子を導入した ES細胞株を、生殖細胞分化促進 因子の存在下で培養し、マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分ィ匕能を有 する細胞を選択することを特徴とする、生殖細胞の取得方法が記載されている。特開 2002- 65261号公報の方法では、 ES細胞にもともと内在する Vasa遺伝子またはそ のホモログ遺伝子の発現の制御下にマーカー遺伝子が置かれるように、マーカー遺 伝子は、相同組換えにより ES細胞株に導入されている。
[0005] また、 Tanaka, M. Et al, PNAS, Vol.98, No.5, p2544- 2549, 2001には、メダカの Vas a遺伝子プロモーターに緑色蛍光蛋白質 (GFP)を連結した Vasaベクターを導入する ことによって作成したトランスジエニックメダカが記載されている。 Tanaka, M. Et al, P NAS, Vol.98, No.5, p2544-2549, 2001では、雌雄の生殖細胞ができる前の細胞系譜 が観察されており、これを培養するなどして生殖細胞を分離することは行われていな い。また、 Vasaベクターを導入したトランスジエニック哺乳動物の作成については未だ 報告がない。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、相同組み換えなどの煩雑な操作を行うことなく簡便に、マーカー遺伝子 の発現を指標として生殖細胞分化能を有する細胞を選別する方法を提供することを 解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、哺乳動物由来の Vasaホモ ログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるようにマーカー遺伝子が組み込 まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を作成 し、トランスジエニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生 殖細胞分ィ匕能を有する細胞を選別できることを見出した。本発明は、これらの知見に 基づ 、て完成したものである。
[0008] 即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
(I) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれ るようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクターを導入したトラン スジエニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分 化能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
[0009] (2) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれ るようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクターを導入した ES細 胞又は組織幹細胞を培養し、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分ィ匕 能を有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
(3) ES細胞又は組織幹細胞力 哺乳類又は鳥類由来の細胞株である、（2)に記 載の方法。
[0010] (4) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列力 転写開始点から 3kb上流の位置力も転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、（1)から（3 )の何れかに記載の方法。
(5) 該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来の Va saホモログ遺伝子の 3'—非翻訳領域 (UTR)配列が連結されている、（1)から (4)の 何れかに記載の方法。
[0011] (6) マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は 化学発光酵素遺伝子である、 (1)から（5)の何れかに記載の方法。
(7) マーカー遺伝子が、 GFP、 RFP、 BFP、 YFP、又は lacZ遺伝子である、（1)から（ 6)の何れかに記載の方法。
(8) 生殖細胞が生殖幹細胞である、（1)から（7)の何れかに記載の方法。
[0012] (9) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれ るようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクター。
(10) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列が、転写開始点か ら 3kb上流の位置力も転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、 (9)に記 載の組み換え発現ベクター。
(I I) 該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来の V
asaホモログ遺伝子の 3'—非翻訳領域 (UTR)配列が連結されている、（9)又は（10 )に記載の組み換え発現ベクター。
[0013] (12) マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は 化学発光酵素遺伝子である、（9)から（11)の何れかに記載の組み換え発現べクタ
(13) マーカー遺伝子が、 GFP、 RFP、 BFP、 YFP、又は lacZ遺伝子である、（9)から (12)の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
(14) (1)から（8)の何れかに記載の方法のために使用する、（9)から（13)の何れ かに記載の組み換え発現ベクター。
[0014] (15) (9)から（14)の何れかに記載の組み換え発現ベクターを有する細胞。
(16) ES細胞又は組織幹細胞である、（15)に記載の細胞。
(17) (9)から（ 14)の何れかに記載の組み換え発現ベクターを導入したトランスジ エニック非ヒト哺乳動物。
[0015] (18) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれ るようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクターを導入したトラン スジ ニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を誘起 する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング 方法。
[0016] (19) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれ るようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクターを導入した ES細 胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現を誘起 する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング 方法。
(20) (18)又は（19)に記載の方法により得られる生殖細胞分化促進因子。
[0017] (21) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置か れるようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクターを導入したトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を指標 として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への
毒性試験方法。
[0018] (22) 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれ るようにマーカー遺伝子が組み込まれて 、る組み換え発現ベクターを導入した ES細 胞又は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現が誘起 されて 、る細胞数を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特 徴とする生殖細胞への毒性試験方法。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明の実施方法および実施態様について詳細に説明する。
( D本 明の み ¾ 現ベクター
ES細胞カゝら始原生殖細胞への分ィ匕を識別するには、 ES細胞には発現せず、分ィ匕 した生殖細胞に特異的に発現する形質を指標にする必要がある。生殖細胞特異的 遺伝子である Vasaホモログ遺伝子は、生殖巣内に定住した後期始原生殖細胞に特 異的であり、それ以前の未分ィ匕初期胚細胞や ES細胞には発現が認められないことか ら、本発明では、哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子発現を生殖細胞の分ィ匕指標と して用いることとした。但し、 ES細胞の浮遊培養で形成される胚様体では、生体内と 同様に三胚葉を含む様々な細胞種の分化が起こり、生殖細胞の出現頻度は極めて 少ないと考えられる。そのため、従来の分子遺伝学的検出法や免疫組織学的染色 法では正確な識別ができない。本発明では、この問題を克服する手段として、 Vasaホ モログ遺伝子発現を GFP (発光クラゲの緑色蛍光蛋白質)および lacZ (バクテリア由来 のガラクトシダーゼ酵素;発色基質によって青色呈色或いは発光基質によって蛍光 発色が可能となる）遺伝子などのマーカー遺伝子の発現に置き換える遺伝子改変操 作を施し、 Vasaホモログ遺伝子の発現の制御下に置かれるように上記マーカー遺伝 子を挿入した組み換え発現ベクターを構築した。
[0020] Vasaホモログ遺伝子の発現制御域を用いた外来遺伝子の発現ベクターの利用は、 生殖細胞系譜を介した遺伝子機能解析および組織工学的応用に優れた特性を持 つ。本発明で用いるマーカー遺伝子とは、その発現を容易に検出または測定できる 遺伝子である限り、その種類は特に限定されず、例えば、 GFP (緑色蛍光蛋白質)、 R FP (赤色蛍光蛋白質)、 BFP (青色蛍光蛋白質)、 YFP (黄色蛍光蛋白質)等の蛍光
蛋白質をコードする遺伝子、 lacZなどの化学発光酵素遺伝子、又はネオマイシン等 の薬剤耐性遺伝子を挙げることができ、これらに各種の変異を付加した人為的合成 遺伝子を使用してもよい。
[0021] 本発明で言う哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子とは、哺乳動物（例えば、マウス 、ヒト、ブタ、ゥシ、ヒッジ、ラット等）における Vasa遺伝子を意味する。このような Vasaホ モログ遺伝子は公知であり、例えば、マウス（Fujiwara, Y. et al.， Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 91, 12258-12262, 1994)、ヒト（Castrillon, D.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 9585-9590, 2000)、ラット（Komiya et al" Dev. Biol., 162, 354-363, 1994) 等に記載されている。
[0022] 以下、哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子がマウスの場合を例に挙げて具体的に 説明する。
Mvh遺伝子の発現調節領域の特定は、以下の 2つの方法で行った。
第一の方法は、第 1ェキソン上流のゲノム DNAを様々な長さで単離して、ホタル lucif erase酵素蛋白質等をレポーター遺伝子としたプロモーター活性検定法である。本発 明において、プロモーター活性とは、基本プロモーターが有する転写活性およびェ ンハンサ一が有する転写促進活性を意味し、かかるプロモーター活性を有する発現 調節配列を、「プロモーター配列」と称する。具体的には、 GC-rich基本プロモーター を含む転写開始点上流部 DNA配列を一定の長さに調製し、 ludferaseを持つプロモ 一ターベクターに連結し、生殖細胞培養株である EG(Embryonic Germ)細胞にリボフ ェクシヨン法で遺伝子導入した後、発現活性を ludferase酵素活性測定法で検出する 手法である。その結果、図 1に示すように、強い転写促進活性は、転写開始点から上 流約 3.0kbの範囲内に存在することが判明した。以下、特に断らない限り、「上流」とは 「転写開始点から上流」を意味する。上流 l.Okbに見られる弱い活性は基本プロモー ターのそれを示すものと考えられ、これは図 2に示すように l.Okbの活性ィ匕には細胞 種による差違がな ヽことやこの部分の欠失が転写活性の完全な喪失をもたらすこと ( 図 1)からも支持される。一方、 3.0kbの転写促進活性は細胞種特異性が見られるほ カゝ、 EG細胞を生殖腺体細胞株 (M15)と混合培養した際に発現増強が見られることは 、内在性 Vasa発現の挙動と一致する。従って、上流域の 1.0 kbから 3.0 kbの領域には
少なくとも主要な生殖細胞特異的発現調節配列が含まれることが判明した。
[0023] さらに第二の方法として、上記の培養細胞系で検定された Vasa発現調節域は、外 来遺伝子をマウス受精卵に顕微注入して得られるトランスジエニック (Tg)マウスによつ て検証された。例として、転写上流域 3.0 kbに GFP遺伝子をレポーターとして連結し た 3.0-GFP遺伝子のトランスジエニックマウスでは、精巣内生殖細胞に特異的な GFP 発現が検出される。その GFP発現は蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を発する細胞として識 別され、強陽性は減数分裂期に入った精母細胞から減数分裂後の精子細胞に観察 される（図 3)。この結果は、より広範囲の上流域 8.0 kb, 5. Okbを用いた場合にも同様 であった。
[0024] し力し、これら上流域のみを用いたトランスジエニックマウスでは、 Mvhが持つ胎児 期始原生殖細胞や卵母細胞などの雌性生殖細胞での発現は検出感度以下であり、 上流域以外の領域にもその発現増強を担う制御配列の存在が示される。一つの可 能性として、 Mvh遺伝子の 3'-非翻訳領域が生体内生殖細胞における長期的蛋白質 発現を担う翻訳活性化制御を持つことが推定される。実際に、 Mvh翻訳域の末尾に ある翻訳停止コドンから下流 2.3kbを 3.0-GFP遺伝子の下流に連結した 3.0-GFP-UT R遺伝子のトランスジエニックマウスでは、胎児期始原生殖細胞にも弱 、ながら GFP発 現を可視化することができ、 GFP抗体染色によっても有意な発現性を確認することが できる（図 4)。
[0025] 以上の結果から、 Mvh遺伝子の発現制御には転写上流域 (約 3.0kb)による特異的 転写促進活性と、非翻訳領域を含む 3'-下流域による翻訳活性化の少なくとも 2つの 制御エレメントが有効であることが判明した。
[0026] 本発明の組み換え発現ベクターにおいて用いることができる Mvh遺伝子の転写開 始点から約 3kb上流の位置力も転写開始点までの塩基配列を、配列表の配列番号 1 に示す。また、本発明の組み換え発現ベクターにおいて用いることができる Mvh遺伝 子の 3'—非翻訳領域 (UTR)配列の塩基配列を、配列表の配列番号 2に示す。なお 、本発明の組み換え発現ベクターにおいて用いることができる哺乳動物由来の Vasa ホモログ遺伝子のプロモーター配列は、由来する哺乳動物種に限定されないが、発 現ベクターを導入する動物または導入する細胞が由来する動物と同じ種のものを用
いることが好ましい。また、分ィ匕した生殖細胞に特異的に発現するものであることが好 ましい。
[0027] 本発明の組み換え発現ベクターには、上記した要素の他にも、アンピシリン耐性遺 伝子などの選択マーカー遺伝子、及び複製起点など、通常の発現ベクターに使用さ れる要素を適宜含めることができる。
[0028] (2)本発明の組み換え発現ベクターを導入した細胞及びトランスジエニック非ヒト哺乳 動物
本発明によれば、上記（1)に記載した組み換え発現ベクターを導入して得られる細 胞が提供される。本発明の組み換え発現ベクターを導入するための細胞としては、 E S細胞、及び組織幹細胞などを挙げることができる。組織幹細胞としては、間葉系細 胞、特に骨髄間葉系細胞等を使用することができる。また、 ES細胞及び組織幹細胞 などの細胞は、哺乳類又は鳥類由来の細胞などを使用することができ、好ましくは、 哺乳類由来の細胞を使用することができ、特に好ましくは、マウス又はヒトに由来する 細胞を使用することができる。本発明で用いることができる ES細胞株の具体例として は、マウス 129系統雄由来 E14細胞株およびこれに由来する E14TG2a細胞株、ヒト ES 細胞株 H9 (Thomson et al.， Science, 282, 1145-1147, 1998)等を挙げることができる 。これらの細胞に本発明の組み換え発現ベクターを導入し、生殖細胞及び分化した 細胞を分離することができる。
[0029] 組み換え発現ベクターを細胞に導入する方法は、当業者に公知の方法を用いるこ とができる。具体的には、エレクト口ポーレーシヨン法、リン酸カルシウム法、又はリポ フエクシヨン法等を用いることができ、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社)など市販のト ランスフエクシヨン試薬を用いて行うこともできる。
[0030] 本発明によればさらに、本発明の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェ-ッ ク非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法は特に限定されないが、例え ば、本発明の組み換え発現ベクターを受精卵などに導入することにより作製すること ができる。具体的には、非ヒト哺乳動物の受精卵に本発明の組み換え発現ベクター を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物
力 該組み換え発現ベクターが導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作 製することができる。
[0031] 非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ノ、ムスター、モノレモット、ラット、ゥサギ等 のげつ歯類の他、ィヌ、ネコ、ャギ、ヒッジ、ゥシ、ブタ、サル等を使用することができる 力 作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモッ ト、ラット、ゥサギ等のげつ歯類が好ましぐそのなかでもマウスが最も好ましい。
[0032] 受精卵細胞段階における本発明の組み換え発現ベクターの導入は、対象哺乳動 物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行うことがで きる。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の組み換え発現べク ターが存在することは、作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のす ベてに本発明の組み換え発現ベクターが存在することを意味する。遺伝子を受け継 いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の組み換 え発現ベクターを有する。
[0033] 本発明のトランスジエニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認 した後、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。 導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動 物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を有するように繁殖継代することが できる。
[0034] 以下、トランスジエニック非ヒト哺乳動物がトランスジエニックマウスの場合を例に挙 げて具体的に説明する。本発明の組み換え発現ベクターをマウス受精卵の雄性前 核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの 輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記発現べク ターを有する仔マウスを選択することにより、本発明のトランスジエニックマウスを作製 することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、 129Zsv、 C57BL/6, B ALBZc、 C3H、 SJLZWt等に由来するマウスの交配により得られるものなら任意の ものを使用できる。
[0035] 本発明の組み換え発現ベクターを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より D NAを抽出し、導入した組み換え発現ベクターをプローブとするドットハイブリダィゼ
ーシヨン法や、特異的プライマーを用いた PCR法等により行うことができる。
[0036] (3)生殖細胞の取得方法
本発明によればさらに、上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したトラン スジエニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分 化能を有する細胞を回収することを特徴とする生殖細胞の取得方法、並びに上記し た本発明の組み換え発現ベクターを導入した ES細胞又は組織幹細胞を培養し、該 マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分ィヒ能を有する細胞を回収することを 特徴とする生殖細胞の取得方法が提供される。
[0037] 取得される生殖細胞としては、生殖幹細胞が好ましい。ここで言う生殖幹細胞は、 精子幹細胞、又は卵子幹細胞の何れでもよい。
[0038] 上記した Mvh遺伝子上流域 3.0kbを制御プロモーター配列として、外来遺伝子を発 現する場合、その発現を精子形成細胞の減数分裂期以降にのみ限定することが可 能である。この特異性は精子形成過程に特異的な遺伝子産物の機能解析やその外 来蛋白質の細胞内挙動を追跡することに利用することができる。一つの具体例として 、 Vasa-GFP融合タンパク質の細胞内局在性の場合を挙げる。抗体染色法によって、 MVH蛋白質はマウス精子形成過程で細胞質内において均等分散状の局在から、減 数分裂期には顆粒構造ィ匕し、精子細胞では核膜に隣接する 1個の巨大顆粒構造 (C hromatoid Body： CB)に局在する変化を示すことが判明している (Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139-149, 2000)。 CB構造は、蛋白質と RNA成分の複合体であり、精 子形成における翻訳制御装置としての役割が推定される細胞内器官である。生殖細 胞特異的な Vasa-GFP融合タンパク質の発現は、この CB構造の非固定条件下の観 察を可能にする。 3.0 kb上流域による発現は、内在性 Mvh遺伝子発現に比べて約 1/ 5程度と低ぐ精子形成やその稔性への影響など生理的機能阻害は生まれない。図 5に示すように、外来遺伝子による MVH- GFPは、内在性 MVH蛋白質の挙動と一致し て、精母細胞下では細胞質内顆粒、精子細胞内では CB構造への局在を示した。こ の特性は、 CB構造の継時的挙動をリアルタイムで計測することを可能にするほか、そ の形成や機能に関わる因子を非固定試料カゝら精製するための新規の手段を提供す る。同様の方法によって、精子形成に関わる蛋白質因子についても適用され、可視
的標識化と共役因子の同定に用いることができる。
また、 内在性 Mvh遺伝子の発現特異性を忠実に再現する外来ベクター構築法の 一つとして、 Mvh (或!/、は各種動物の Vasaホモログ遺伝子）ゲノム遺伝子全長を含む 長大 DNAを BACベクターなど（Cosmid, PIファージ）にクローン化したものを用いて、 そのベクター内で外来発現遺伝子を Mvh遺伝子内に組み込む形態を用いることがで きる。この場合、全長 Mvh遺伝子とは、少なくとも転写開始点の上流約 3.0kb力ゝら翻 訳終止点下流約 3.0kbまでの約 60kbを含む配列であり、組み込む形態は翻訳開始点 の下流に翻訳コドンフレームを合わせた形で外来遺伝子 cDNAを挿入する、もしくは リボソーム結合配列 (ires)を外来遺伝子上流に付加した遺伝子を挿入或いは置換す ることが有効である。一つの具体例として、 Mvh遺伝子を内包する約 150kbゲノム DNA を持つ BACクローンに RFP遺伝子を組み込んだレポーター遺伝子の実施例を挙げる 。図 6Aに示すように、 RFP遺伝子 cDNAが第 2ェキソンの翻訳開始点に合わせて挿入 された Bac-Vas- RFPベクターは、リポフエクシヨン法などによる培養細胞への遺伝子 導入或 ヽは DNA顕微注入法によるトランスジエニックマウス作成に用いられる。 ES細 胞を宿主細胞とした遺伝子導入では、内包する薬剤耐性 (この場合には Neo耐性遺 伝子による G418耐性による選別）によって Bac-Vas-RFP組み換え体 ES細胞を選別す ることができる。 ES細胞からの培養下において、始原生殖細胞、精子形成細胞、およ び卵子までの細胞種が分ィ匕することは、近年の研究において明らかにされている（T oyooka, Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 11457-11462, 2003; Hubner, K. et al, Science, 300, 1251-1256 2003; Geijsen, N. et al., Nature, 427, 147—154, 200 4)。従って、本発明の組み換え発現ベクターを導入した ES細胞は、培養下の分化誘 導によって Mvh発現陽性の生殖細胞を RFP赤色蛍光細胞として識別することができ、 セルソーター操作によって、培養条件下力 各発生段階に分ィ匕した生殖細胞のみを 精製することが可能である（図 6B)。また、 Bac-Vas-RFPベクターを組み込んだトラン スジ ニックマウス系統 (BR-15)では、その精巣および卵巣内の生殖細胞、即ち精原 細胞力 精子までの精子形成細胞と卵原細胞力 成熟卵子までの卵形成細胞が RF P発現による赤色蛍光細胞として識別される（図 6C)。その顕著なレポーター発現は 、上流 3.0kbプロモーター配列を用いた場合よりも早期から検出され、内在性 Mvh発
現と一致して、雌雄の胎児期生殖腺内の始原生殖細胞力 検出することが可能であ る（図 6D)。
[0040] また、成体精巣には、その周期的精子形成を担う精子幹細胞が存在し、未分化生 殖細胞である始原生殖細胞や精原細胞とも異なる特性を持つことが知られて ヽる。ま た、近年その培養法が確立され、生体精巣への移植によって培養精子幹細胞に由 来する精子や産仔を得ることが可能であるなど、生殖工学技術の上で優れた新素材 となることが注目される (Kanatsu-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2 003)。上記の Bac-Vas-RFPは、この精子幹細胞をも可視化識別することができる。こ れは、マウス成体精巣細胞を精子幹細胞の培養条件で培養した場合、増殖した精子 幹細胞クローンが特異的に RFP陽性細胞として識別されることによって確認された（ 図 7A)。一方、最近、成体卵巣にも卵子形成の幹細胞となる卵子幹細胞の存在が報 告された。この細胞種は、卵巣全体を取り囲む基底膜内もしくはその外側に位置する Mvh発現陽性細胞として識別される (Johnson, J. et al, Nature, 428, 145-150, 2004)。 卵巣内の卵母細胞が大きな細胞質を持つ球状形態であるのに対して、この卵子幹 細胞は組織断面像にぉ 、て扁平な形態を持つ。 Bac-Vas-RFPマウス卵巣の組織試 料において、卵母細胞と同様に基底膜外の卵子幹細胞も RFP陽性細胞として観察さ れる（図 7B)。さらに、図 7Cに示すように、分散した卵巣細胞を培養下においた場合 、減数分裂期にある全ての卵母細胞は増殖しないにも拘わらず、 RFP陽性で増殖性 を持つ細胞や扁平形態のまま維持される細胞が観察されることも Bac-Vas- RFPベタ ターによる細胞標識ィ匕が卵子幹細胞の識別や精製を可能にすることを示す。
[0041] 上記したような哺乳類 Vasaホモログ遺伝子の発現調節域を用いた本発明の組み換 え発現ベクターの特性は、これを用いたトランスジエニック動物個体の生体組織から 生殖細胞を特定することが可能であり、特に生殖幹細胞を特異的に選別培養する操 作において有効であり、外来遺伝子発現によって蛍光標識化、薬剤選択性、或いは 新たな生理機能因子などの外来形質の付加を実現することができる。また、同様の 特異性は培養細胞系においても利用することができ、マウスに限らず、ヒトなど他の 動物種において、 ES細胞、組織幹細胞など各種の生体組織に由来する培養細胞に 遺伝子導入することによって、培養下に生殖細胞系譜へ分化誘導或いは分化転換
した細胞の分取、特に生殖幹細胞に分ィ匕した細胞の分離培養力 生殖幹細胞の純 粋培養を榭立することに優れた特性を発揮するものである。
[0042] (4)生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法
本発明によればさらに、上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したトラン スジ ニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を誘起 する被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング 方法、並びに上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入した ES細胞又は組織 幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被験物 質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法が提供 される。上記スクリーニング方法により得られる生殖細胞分ィ匕促進因子も本発明の範 囲内である。
[0043] 被験物質の種類は特には限定されな 、が、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成 化合物 (低分子有機化合物、高分子有機化合物など)、微生物発酵物、生物体 (植 物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む)からの抽出物、あるいはそれらの ライブラリーが挙げられる。ライブラリ一としては、合成化合物ライブラリー (コンビナトリ アルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど)など が挙げられる。スクリーニングの被験物質は、天然物でも合成物でもよぐまた候補と なる単一の被験物質を独立に試験しても、いくつ力の候補となる被験物質の混合物 ( ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合 物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、最終的にマーカー 遺伝子の発現を誘起する物質を単離することも可能である。
[0044] (6)生殖細胞への毒性試験方法
本発明によればさらに、上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入したトラン スジエニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を指標と して、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒 性試験方法、並びに上記した本発明の組み換え発現ベクターを導入した ES細胞又 は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現が誘起され て 、る細胞数を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴と
する生殖細胞への毒性試験方法が提供される。
[0045] 生殖細胞への毒性を有する物質 (被験物質)の種類は特には限定されな 、が、例 えば、ペプチド、ポリペプチド、合成化合物 (低分子有機化合物、高分子有機化合物 など）、微生物発酵物、生物体 (植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む )からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリ一としては、合 成化合物ライブラリー (コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー (コン ピナトリアルライブラリーなど)などが挙げられる。被験物質は、天然物でも合成物でも よぐまた候補となる単一の被験物質を独立に試験しても、いくつ力の候補となる被 験物質の混合物 (ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽 出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、 最終的にマーカー遺伝子の発現を誘起する物質を単離することも可能である。より具 体的には、内分泌撹乱物質 (環境ホルモン)などを生殖細胞への毒性を有する物質 として本発明の毒性試験方法で評価することができる。
[0046] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明はこれらの実施 例によって限定されるものではない。
実施例
[0047] 実施例 1： Mvh遺伝子の転写制御領域の検定
Mvhゲノム遺伝子領域は、 129マウスゲノムライブラリー（EMBL3:Clontech社）より同 遺伝子第 1ェキソンを含むクローンを単離し、そのインサート DNAの制限酵素地図に 基づいて調製した。上流域 5.0 kb, 3.0 kb, 1.0 kbとは第 1ェキソン内の Smal部位から 、それぞれ約 5.0 kb上流に位置する Kpnl部位、約 3.0 kb上流に位置する Pstll部位、 約 1.0 kb上流に位置する EcoRV部位までを含む断片であり、これらを Basic-Lucベタ ター (pGL3-basic; Promega社)のクロー-ング部位に対して 5し3'方向を合わせて揷 入し、 5.0Luc, 3.0Luc, l.OLucの検定ベクターを作成した。 8.0 Lucは、 l.OLucベクタ 一をもとにゲノム第 1ェキソン直前に存在する約 7.8 kbの Notlゲノム断片を挿入置換 したベクターとして作成した。 3.0 A lucは、 3.0Lucベクターから Xbal/Sacl断片（上流- 4 00〜- 900に対応）を欠失したベクターである（図 1を参照)。
[0048] 遺伝子導入の宿主細胞とする EG細胞は受精後 8.5日目マウス胚の始原生殖細胞
カも榭立された培養細胞であり、 10%FCS (ゥシ胎児血清）、 bFGF(100ng/ml), LIF(1 万単位/ ml)を含む DMEM培地で生育させる。検定試料は 12穴プレートに約百万細胞 /穴の密度で培養した細胞を 1試料とした。 1検体 2 gを用いる遺伝子導入には Lipof ectamine 2000 (Invitrogen社)を用い、導入法はその使用マニュアルに従った。導入 効率を標準化する内在的コントロールとして、 CMV-Renilla (ゥミシィタケ) Lucベクター (pRL-CMV: Promega社)を用い、各検定導入当たり 100 : 1の割合で同時導入した。 導入後 1日目に細胞試料を回収し、 Dual Luciferase Assay System (Promega社)を用 いて、酵素活性を測定した。図 1は、内在的コントロール CMV-Renilla Lucに対する、 活性相対比をグラフに示したものである。
[0049] 有意な発現促進活性を示した 3.0Lucベクターについて、各種のマウス細胞株を宿 主とした検定の結果を図 2に示す。用いられた細胞株は、上記の EG細胞（Matsui, Y. et al.， Cell, 70, 841-847, 1992)と M15 (10.5日目胚マウス胎児生殖腺支持細胞株）（ Larsson, S.H. et al.， Cell, 81, 391-401, 1995), ?19 (胚性腫瘍細胞株）（\108^716 ， M.W. & Rogers, B.J., Dev. Biol, 89, 503-508, 1982), STO (繊維芽細胞株）（Martin, G" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634-7639, 1981), ES (CCE;胚性幹細胞株）（R obertson, E. et al, Nature, 323, 445-449, 1986)である。
[0050] 測定方法は図 1と同様に行った。その結果、 3.0Lucベクターは生殖細胞に由来する EG細胞に特異的な発現促進活性を持つことが示された。図 2で示すように、 ES細胞 でも若干の発現は見られる力 顕著な発現は EG細胞に見られる。つまり、 ES細胞で の発現はない、もしくは極めて低いことを確認している。これは、 ES細胞への導入が 無効であることを示すのではなぐ ES細胞に導入した後、生殖分化すれば活性化す る特性を裏付ける結果である。また、内在的 Mvh遺伝子の発現は、生殖細胞が生殖 腺に定着した後に顕著に亢進し、それは EG細胞を生殖腺支持細胞株と混合培養す ることによつても観察される。この促進効果が 3.0Lucベクターでも再現される力否かの 検討を行った。比較として l.OLucベクターを用いて、 EG細胞単独と M15細胞との混合 (1 : 1)培養を宿主として、上記と同様の検定を行った結果は、 3.0Lucにおいて顕著な 促進効果が見られることを示した。以上の結果は上流域 1.0〜3.0の領域に Mvh発現 特異性を担う要因配列があることを示している。
[0051] 実施例 2： 3.0-GFPトランスジエニック (Tg)マウスの作成と性状解析
実施例 1で作成した 3.0Lucベクターの Luciferase遺伝子部分を欠失した断片と pEG FP- promoterベクター（Clontech社）から単離した EGFP遺伝子の EcoRI- Sail断片を連 結することによって 3.0-GFPベクターを作成した。 3.0-GFPベクターの構造を図 8に示 す。この DNAをベクター内の Seal部位で切断、線状化した 10ng/ 1の DNA溶液をマ ウス（B6C3F1)受精卵の前核内に顕微注入することによって、 3.0-GFPベクターを組 み込んだ Tgマウス 3系統を榭立した。
[0052] 具体的には、発現ベクター DNAを顕微注入した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移 植し、当該仮親マウスから遺伝子組み換え体マウスを分娩されることにより作成するこ とができる。産仔マウスが組み換え体であることは、当該マウスの尾部先端を切断し、 その組織力 抽出したゲノム DNAを EcoRI制限酵素処理した後、ァガロース電気泳動 で展開、 GFP断片を 32Pラベルしたプローブを用いてサザンブロット解析することによ つて判別した。得られた組み換え体マウス産仔は、それぞれ個別の交配繁殖を行うこ とによって、異なる染色体部位に発現ベクターを組み込んだマウス系統として榭立さ れた。
[0053] 上記のようにして作製した 3.0-GFPベクターを組み込んだ Tgマウス 3系統は、全く同 じ結果を示した。得られた Tgマウスの成体精巣は、蛍光実体顕微鏡下において臓器 レベルでも GFP由来の緑色蛍光を示す。図 3にその Tgマウス精巣の組織切片像を示 した。精巣は 4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、凍結切片とし、組織を可視 化する核染色には TO-PR03 iodide溶液（Molecular Pbobes社）が使用された。その 結果、 GFP蛍光は精細管内の精子形成細胞の精母細胞力 精子細胞の細胞層に 検出された。同様の検出は、胎児期生殖腺や卵巣についても行ったが、この 3.0-GF P Tgでは、その発現は検出されなかった。したがって、 Mvh上流プロモーター域は、 生体内では減数分裂期以降の雄性生殖細胞に発現することが判明した。
[0054] 実施例 3： 3.0-GFP-UTR Tgマウスの作成と性状解析
上流 3.0 kbでは、胎児期や卵巣内の発現が再現されなかった結果から、翻訳領域 下流にある非翻訳転写領域 (3'-UTR)の翻訳制御活性の存在が示唆された。このた め、実施例 2の 3.0-GFPの下流に Mvh遺伝子の 3'- UTRを連結した 3.0-GFP-UTR Tg
マウスの作成を行った。用いた 3'-UTR断片は、 Mvhゲノムクローン (マウス細胞の全ゲ ノム DNAも可能)を铸型にした PCR法によって単離した。ここで用いたプライマーは、 5 '-GATTAAAGCAAACGAACATA-3' (配列番号 3)と 5し CCCACTGCACATAGGAC TTAT-3' (配列番号 4)であり、得られる 2.3kb産物は翻訳の停止コドン力 非翻訳転 写領域の約 600bを完全に含む。 PCR反応は、 Ex-taqもしくは LA-taq (タカラ酒造社） を用い、 94°C1分、 58°C 2分、 72°C3分のサイクルを 27-30回反復する反応を用いた。 この PCR反応条件は、特記しない限り全ての実施例にぉ ヽても共通に用いられるた め、以降の実施例では表記は省略する。 PCR産物は、 pGEM-T Easyベクター（Prom ega社）にサブクローンした上で、そのクローユング部位両端にある Notl部位を利用し て切り出し、 3.0-GFPベクターの GFP下流にある Notl部位に方向を合わせて挿入した ものを 3.0-GFP-UTRベクターとした。 Tgマウスの作成は実施例 2と同様である。
[0055] 得られた 3.0-GFP-UTR Tgマウスにっ 、て、その成体精巣、胎児期精巣の生体で の GFP蛍光観察と組織切片観察を図 4に示した。胎児期の GFP蛍光発現は成体精 巣に比して微弱であるが、有意な発現が見られた。その組織切片では抗 GFP抗体 (1 /500希釈； Clontech社)と Oregon Green-抗 rabbit IgG ( 1/500希釈； Molecular Probes 社)の組合せで蛍光抗体法による検出が可能であった。これらの結果によって、 Mvh 遺伝子の発現特異性を用いる場合、上流 3.0 kbと下流域最長 2.3 kbの組合せが有 効であることが結！^される。
[0056] 実施例 4： 3.0-VASA-GFP Tgマウスの作成と可視化蛋白分子の挙動解析
上記の実施例 2の結果より、 Mvh 3.0 kbは下流に連結する遺伝子を精巣内精子形 成細胞に特異的発現をもたらす活性を示した。その特異性を利用して、可視化標識 した蛋白分子の挙動を解析する事例として、 3.0-VASA-GFP Tgマウスを作成した。こ れは、 Mvh 3.0 kbの下流に VASA-GFPの融合 cDNAを連結し、 VASA蛋白質の細胞 内分布の変動を GFP蛍光によって可視化することを図ったものである。ベクターの構 築は、 3.0-GFPベクターの改変を基本とした。先ず、 Mvh全長 cDNAを含む plasmidク ローン (もしくは精巣 mRNAから調製した cDNAを用いることも可）を铸型として、 Mvh 全長翻訳領域の 5'端に BamHI部位、 3'端に Kpnl部位を持つ cDNAを PCR反応によつ て作成する。用いたプライマーは、 5'- BamH卜 GAAGCTATCATGGGAGATGAA- 3' (
配列番号 5)と 5'- KpnI-GGCCCATGATTCGTCATCAA-3' (配列番号 6)である。同 様に、 GFP cDNAについても 5'端に Kpnl部位、 3'端に Sail部位を持つ cDNAを PCR反 応によって作成する。用いたプライマーは、 5'- Kpnl- ACCATGGTGAGCAAGGGCG AG- 3' (配列番号 7)と 5'- Salll- CTACTCAGACAA TGCGATGC -3' (配列番号 8)で ある。 2つの PCR断片は、 pGEM- T Easy plasmidにサブクローンした後、この Mvh plas midを Kpnl/Sallで開環した中に、もう一方の GFP plasmidから Kpnl/Sall切断した断片 を連結する。これによつて、 Mvhと GFPは Kpnl部位の 2つのコドンを挟んで連結され、 一つの融合 cDNAを構成する。この Mvh- GFP cDNAを BamHI/Sall切断で切り出した 断片を 3.0-GFPベクター力 Bglll/Sall切断で GFP cDNAを切り出した開環ベクター 内に挿入して、 3.0-VASA-GFPベクターを構築した。
[0057] Tgマウスの作成及びその精巣組織の蛍光像観察の方法は、上記の実施例と同じ である。図 5に示すように、この Tgマウス精巣では VASA-GFP融合蛋白質の発現が精 母細胞と精子細胞に確認され、その特徴的な細胞内の局在性として Chromatoid Bod yの可視化とその生細胞での動態の観察が可能であった。
[0058] 実施例 5： BAC-Vasa-RFP遺伝子を用いた生殖細胞の可視化
BACベクターを用いた Tg遺伝子の作成は、基本的に Leeらによって開発された方 法に準じて行った (Lee E-C et al. Genomics 73, 56-65, 2001)。マウスゲノム BACライ ブラリー (Clontech社)より、 Mvh遺伝子座を含む約 140 kbのマウスゲノム DNAをインサ ートとする BACクローン大腸菌を単離した。この BACクローン内で相同組み換えを起 こす DNA断片は Pfo polymerase (Promega社)を用いた PCRによって作成する。 RFP遺 伝子の挿入を図る場合、予め pUC- loxP- Neo- loxPに RFP cDNA (Clontech社)断片を サブクローンした plasmid DNAを铸型として用いる。用いる 5'及び 3'プライマーは、 5'- 50mer [相同配列 A]- TGTGGAATTGTGAGCGGATA- 3' (配列番号 9)と 5'- 50mer [相 同配列 B]-GTTTTCCCAGTCACGACGTT -3' (配列番号 10)であり、相同配列 Aは Mvh第 2ェキソンにある Mvhの翻訳開始点 ATGまでの 50塩基配列、相同配列 Bはそ れ以降の 50塩基の相補鎖配列である。得られた PCR産物を組み換え competentィ匕処 理した BACクローン大腸菌と混合して導入し、クロラムフエ-コール/カナマイシンプ レート状に培養して、薬剤耐性の大腸菌力 相同組み換え体 BACを含むクローンを
単離した。 BAC DNAは Nucleobond- axカラム（Macherey- Nagel社)で調製し、 Tgマウ ス作成、及び ES細胞への導入に用いられた (図 6A)。
[0059] ES細胞（E14)野生株への導入は Lipofectamin 2000を用い、その組み換え体クロー ンは G418薬剤耐性で選別された。胚様体の形成には、 10% FCSを含む DMEM培地 に ES細胞（百万細胞/ ml)を移し、浮遊培養用プレート (Nunc社)を用いた。この中で E S細胞は細胞凝集塊を形成し、培養下の三胚葉分化を行う。 BAC-Vasa-RFP組み換 え体の場合、約 3日以降に RFP赤色蛍光陽性の細胞が明瞭に観察され、培養下に 分ィ匕する生殖細胞の識別された（図 6B)。また、 BAC-Vasa-RFP Tgマウスでは、その 精巣、卵巣及び胎児生殖腺内の始原生殖細胞も明瞭な RFP赤色蛍光細胞として検 出された（図 6C)。このうち、卵巣内卵細胞の可視化は、この Tgにおいて初めて可能 になった成果であり、その理由の一つはレポーターとした RFP蛋白の長寿命が挙げら れる。また、この顕著なレポーター発現は、上流 3.0kbプロモーターを用いた場合より も早期から検出され、内在性 Mvh発現と一致して、雌雄の胎児期生殖腺内の始原生 殖細胞力 検出することが可能である（図 6D)。
[0060] 実施例 6： BAC- Vasa- RFPを用いた生殖幹細胞の識別と培養
実施例 5で作製した Tgマウス用いることによって、これまで可視化が困難、あるいは 不可能であった幹細胞の同定が可能であることが判明した。このマウス系統では、図 7に示すように卵巣の基底膜上或いはその組織外に位置する Mvh陽性の細胞を生 体組織の状態で赤色蛍光細胞として識別することができる。この利点は組織力 初 代培養を行う過程で、この推定卵子幹細胞を見失うことなぐその形態や生育状態を 追跡することを可能にする。例として、 BAC-Vasa-RFPマウスの生後 10日目仔マウス 卵巣の培養を示す。生体より摘出した卵巣を 0.25%トリプシン溶液 (Gibco社)で 5分間 の短時間分散処理を行うことにより、卵巣内の柔軟な糸且織部分を遊離細胞として回 収する。これらを 10%の FCSを含む DMEM培地に懸濁し、ゼラチンコートした培養プ レートで 1晚培養する。その後、培地は精子幹細胞用に開発された STEM培地 (Kanat su-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003)に置換を繰り返して、長 期培養を行う。この過程で巨大な細胞塊である卵胞や大きな球形細胞である卵母細 胞は浮遊状態にあるため、培養液交換で除去される。約 1週間目にはプレート底面
に付着した細胞層の中に RFP赤色蛍光、即ち Mvh陽性の生殖細胞が散在することが 観察された (図 7C)。その中の一部は、細胞分裂によって生じたコロニー形態を示す ものと単一細胞で紡錘形の形態を持つものに分類される。これらは、その大きさ、形 態や分裂能力から明らかに卵母細胞とは異なる細胞種であり、生体組織に見られた 卵子幹細胞に由来すると考えられる。この細胞種を培養下に同定できることは、蛍光 に基づく細胞選別からクローン細胞株の樹立の可能性を示すものである。一方、既 にその培養株化が可能となった精子幹細胞にっ 、ても、 BAC-Vasa-RFPマウスの精 巣由来細胞を用いた培養によって、赤色蛍光を持つ精子幹細胞の識別と細胞株化 が可能であることが判明した (図 7B)。精子幹細胞培養に用いた方法は、 Kanatsu-shi noharaら（Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003)によって報告された方法に準じた。 産業上の利用可能性
[0061] 本発明によれば、未分化幹細胞には発現せず、分化した生殖細胞に特異的に発 現する Vasaホモログ遺伝子の発現を高感度に検出することができるトランスジエニック 非ヒト哺乳動物並びに培養細胞系が確立された。本発明の発現ベクターは、トランス ジェニック非ヒト動物力 始原生殖細胞や生殖幹細胞の選択的取得及びそれらに由 来する培養細胞株を榭立するうえで、また ES細胞系の根幹となる生殖細胞への分化 能を検定するうえで、優れた実験系を提供する。また、本発明によれば、生殖細胞系 譜への寄与能力が低下している ES細胞クローンからも生殖細胞及びその産仔を得る ことが可能となる。また、本発明においては、遺伝子の相同組み換えによる導入とい つた複雑な操作を必要とせずに、比較的簡便に実施が可能である。
[0062] 本出願は、 2005年 6月 1日付の日本特許出願 (特願 2005— 161279)に基づく優 先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取り込まれる。また 、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取り込まれる。
図面の簡単な説明
[0063] [図 1]図 1は、 Mvh遺伝子の各種プロモーター断片を用いてルシフェラーゼアツセィに よりプロモーター活性を測定した結果を示す。
[図 2]図 2は、 3.0Lucベクターを用いて各種のマウス細胞株を宿主としてルシフェラー ゼアツセィによりプロモーター活性を測定した結果を示す。
[図 3]図 3は、 3.0-GFPトランスジエニックマウスの精巣の組織切片像を示す。
[図 4]図 4は、 3.0-GFP-UTRトランスジエニックマウスの成体精巣及び胎児期精巣の 生体での GFP蛍光観察と組織切片観察を示す。
[図 5]図 5は、 3.0-VASA-GFPトランスジエニックマウスの精巣の GFP蛍光観察と組織 切片観察を示す。
[図 6]図 6は、 BAC-Vasa-RFP遺伝子を用いて生殖細胞を可視化した結果を示す。
[図 7]図 7は、 BAC-Vasa-RFPを用いた生殖幹細胞の識別と培養の結果を示す。
[図 8]図 8は、 3.0-GFPベクターの構造を示す。
Claims
請求の範囲
[I] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物から、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分ィ匕能を 有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
[2] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入した ES細胞又 は組織幹細胞を培養し、該マーカー遺伝子の発現を指標として生殖細胞分ィ匕能を 有する細胞を回収することを特徴とする、生殖細胞の取得方法。
[3] ES細胞又は組織幹細胞力 哺乳類又は鳥類由来の細胞株である、請求項 2に記載 の方法。
[4] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列力 転写開始点から 3kb 上流の位置力も転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んでいる、請求項 1から 3 の何れかに記載の方法。
[5] 該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来の Vasaホ モログ遺伝子の 3'—非翻訳領域 (UTR)配列が連結されている、請求項 1から 4の何 れかに記載の方法。
[6] マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は化学発 光酵素遺伝子である、請求項 1から 5の何れかに記載の方法。
[7] マーカー遺伝子が、 GFP、 RFP、 BFP、 YFP、又は lacZ遺伝子である、請求項 1から 6 の何れかに記載の方法。
[8] 生殖細胞が生殖幹細胞である、請求項 1から 7の何れかに記載の方法。
[9] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクター。
[10] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列力 転写開始点から 3kb 上流の位置力 転写開始点までの塩基配列を少なくとも含んで 、る、請求項 9に記 載の組み換え発現ベクター。
[II] 該組み換えベクターにおいて、マーカー遺伝子の下流に、哺乳動物由来の Vasaホ
モログ遺伝子の 3'—非翻訳領域 (UTR)配列が連結されている、請求項 9又は 10に 記載の組み換え発現ベクター。
[12] マーカー遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性遺伝子、又は化学発 光酵素遺伝子である、請求項 9から 11の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
[13] マーカー遺伝子が、 GFP、 RFP、 BFP、 YFP、又は lacZ遺伝子である、請求項 9から 12 の何れかに記載の組み換え発現ベクター。
[14] 請求項 1から 8の何れかに記載の方法のために使用する、請求項 9から 13の何れか に記載の組み換え発現ベクター。
[15] 請求項 9から 14の何れかに記載の組み換え発現ベクターを有する細胞。
[16] ES細胞又は組織幹細胞である、請求項 15に記載の細胞。
[17] 請求項 9から 14の何れかに記載の組み換え発現ベクターを導入したトランスジェ-ッ ク非ヒト哺乳動物。
[18] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する被 験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法。
[19] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入した ES細胞又 は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現を誘起する 被験物質を選択することを特徴とする、生殖細胞分化促進因子のスクリーニング方法
[20] 請求項 18又は 19に記載の方法により得られる生殖細胞分ィ匕促進因子。
[21] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入したトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該マーカー遺伝子の発現を指標として、 生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴とする生殖細胞への毒性試 験方法。
[22] 哺乳動物由来の Vasaホモログ遺伝子のプロモーター配列の制御下に置かれるよう
にマーカー遺伝子が組み込まれている組み換え発現ベクターを導入した ES細胞又 は組織幹細胞を被験物質の存在下で培養し、該マーカー遺伝子の発現が誘起され て 、る細胞数を指標として、生殖細胞への毒性を有する物質を検定することを特徴と する生殖細胞への毒性試験方法。
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