KR20080016687A - 포유 동물 유래의 Ｖａｓａ 호몰로그 유전자의 프로모터배열을 포함하는 발현 벡터 및 그 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 상동 재조합 등의 번잡한 조작을 하지 않고 간편하게, 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물로부터, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 생식 세포의 취득 방법이 제공된다.

Description

포유 동물 유래의 Ｖａｓａ 호몰로그 유전자의 프로모터 배열을 포함하는 발현 벡터 및 그 이용{EXPRESSION VECTOR HAVING PROMOTER SEQUENCE OF Vasa HOMOLOGUE GENE DERIVED FROM MAMMAL AND USE THEREOF}
본 발명은, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터, 그리고 당해 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물, 또는 ES 세포 또는 조직 줄기 세포로부터 생식 세포를 취득하는 방법 등에 관한 것이다.
초파리를 사용한 유전자 해석에 의해, Oskar, Vasa, Tudor, Nanos 의 유전자가 생식 세포의 결정 기구(機構)에 있어서의 중핵적 기능을 갖는 것이 명확해졌다 (Rongo, C., et al, Development, 121, 2737-2746, 1995). 이들 유전자는 모두 난세포 형성에 있어서 극과립에 축적되며, 이 모성 결정 인자를 갖는 할구가 생식 세포의 운명을 결정한다. Vasa 유전자는, ATP 의존성 RNA 헬리카제를 코드하고, 그 기능은 mRNA 로부터 단백질에 대한 번역 제어에 관계되는 것으로 생각되고 있다 (Liang, L., et al, Development, 120, 1201-1211, 1994). 또, 그 효소 기능을 담당하는 구조가 진화적으로 강하게 보존되어 있으므로, 편형 동물 (플라나리아) 로부터 인간까지 많은 다세포 동물종에서 Vasa 호몰로그 유전자가 동정되어 있다. 마우스 Vasa 호몰로그 유전자 (Mvh) 는, 마우스 유전자 데이터 뱅크에 있어서, 유전자명, Ddx4 (gene ID : 13206) 로서 등록되어 있다. 전체 전사 단위 (엑손) 를 포함하는 Mvh 유전자좌는 마우스 13 번 염색체 상에 약 53kb 의 길이로 위치하고, 전사 방향 상류의 약 9.5kb 에 있는 단백질 유전자 (RIKEN cDNA9130023D20) 와, 하류 약 3.2kb 의 Tubulin-2 위유전자 (僞遺傳子) 사이에 위치한다. 이들의 구조적 특징은, 영장류의 Vasa 호몰로그 유전자에서도 공통된다.
Mvh 유전자 발현은, 태아기의 이동기 시원 생식 세포로부터 시작되며, 생식선 시원 생식 세포를 거쳐 감수 분열 후의 반수체 생식 세포까지, 난 형성 및 정자 형성의 모든 생식 세포 계보에 검출된다. 그 발현 특이성은, 척추 동물, 특히 인간을 포함하는 모든 포유 동물종에 공통된다. 이 Vasa 호몰로그 유전자의 발현은, 지금까지 특정된 생식 세포 발현 유전자 중에서도, 매우 엄격한 생식 세포특이성을 나타내는 것이다 (Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139-149, 2000).
일본 공개특허공보 2002-65261호에는, Vasa 유전자 또는 그 호몰로그 유전자 발현의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자를 도입한 ES 세포주를, 생식 세포 분화 촉진 인자의 존재 하에서 배양하고, 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 선택하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포의 취득 방법이 기재되어 있다. 일본 공개특허공보 2002-65261호의 방법에서는, ES 세포에 원래 내재하는 Vasa 유전자 또는 그 호몰로그 유전자의 발현의 제어 하에 마커 유전자가 놓이도록, 마커 유전자는 상동 재조합에 의해 ES 세포주에 도입되어 있다.
또, Tanaka, M. Et al, PNAS, Vol.98, No.5, p2544-2549, 2001 에는, 송사리의 Vasa 유전자 프로모터에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 연결한 Vasa 벡터를 도입함으로써 제조한 트랜스제닉 송사리가 기재되어 있다. Tanaka, M. Et al, PNAS, Vol.98, No.5, p2544-2549, 2001 에서는, 암수의 생식 세포가 생기기 전의 세포 계보가 관찰되어 있고, 이것을 배양하는 등의 생식 세포를 분리하는 것은 실시되고 있지 않다. 또한, Vasa 벡터를 도입한 트랜스제닉 포유 동물의 제조에 대해서는 아직 보고가 없다.
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 상동 재조합 등의 번잡한 조작을 하지 않고 간편하게, 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 선별하는 방법을 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 하였다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토하고, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물을 제조하고, 트랜스제닉 비인간 포유 동물로부터, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 선별할 수 있는 것을 알아냈다. 본 발명은, 이들 식견에 기초하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다.
(1) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물로부터, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포의 취득 방법.
(2) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 배양하고, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포의 취득 방법.
(3) ES 세포 또는 조직 줄기 세포가 포유류 또는 조류 유래의 세포주인, (2) 에 기재된 방법.
(4) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열이, 전사 개시점에서 3kb 상류 위치로부터 전사 개시점까지의 염기 배열을 적어도 포함하고 있는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(5) 그 재조합 벡터에 있어서, 마커 유전자의 하류에, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 3'-비번역 영역 (UTR) 배열이 연결되어 있는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6) 마커 유전자가 형광 단백질을 코드하는 유전자, 약제 내성 유전자, 또는 화학 발광 효소 유전자인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 마커 유전자가, GFP, RFP, BFP, YFP, 또는 lacZ 유전자인, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(8) 생식 세포가 생식 줄기 세포인, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(9) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터.
(10) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열이, 전사 개시점에서 3kb 상류 위치로부터 전사 개시점까지의 염기 배열을 적어도 포함하고 있는, (9) 에 기재된 재조합 발현 벡터.
(11) 그 재조합 벡터에 있어서, 마커 유전자의 하류에, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 3'-비번역 영역 (UTR) 배열이 연결되어 있는, (9) 또는 (10) 에 기재된 재조합 발현 벡터.
(12) 마커 유전자가, 형광 단백질을 코드하는 유전자, 약제 내성 유전자, 또는 화학 발광 효소 유전자인, (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 재조합 발현 벡터.
(13) 마커 유전자가, GFP, RFP, BFP, YFP, 또는 lacZ 유전자인, (9) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 재조합 발현 벡터.
(14) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 방법을 위해 사용하는, (9) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 재조합 발현 벡터.
(15) (9) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 재조합 발현 벡터를 갖는 세포.
(16) ES 세포 또는 조직 줄기 세포인, (15) 에 기재된 세포.
(17) (9) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물.
(18) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물에 피험 물질을 투여하고, 그 마커 유전자의 발현을 유기하는 피험 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법.
(19) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 피험 물질의 존재 하에서 배양하고, 그 마커 유전자의 발현을 유기(誘起)하는 피험 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법.
(20) (18) 또는 (19) 에 기재된 방법에 의해 얻어지는 생식 세포 분화 촉진 인자.
(21) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물에 피험 물질을 투여하고, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질을 검정하는 것을 특징으로 하는 생식 세포에 대한 독성 시험 방법.
(22) 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 피험 물질의 존재 하에서 배양하고, 그 마커 유전자의 발현이 유기되어 있는 세포수를 지표로 하여 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질을 검정하는 것을 특징으로 하는 생식 세포에 대한 독성 시험 방법.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 실시 방법 및 실시양태에 대해서 상세히 설명한다.
(1) 본 발명의 재조합 발현 벡터
ES 세포로부터 시원 생식 세포에 대한 분화를 식별하기 위해서는, ES 세포에는 발현되지 않고, 분화된 생식 세포에 특이적으로 발현되는 형질을 지표로 할 필요가 있다. 생식 세포 특이적 유전자인 Vasa 호몰로그 유전자는, 생식소 내에 정주한 후기 시원 생식 세포에 특이적이고, 그 이전의 미분화 초기 배아 세포나 ES 세포에는 발현이 관찰되지 않으므로, 본 발명에서는, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자 발현을 생식 세포의 분화 지표로서 사용하기로 하였다. 단, ES 세포의 부유 배양으로 형성되는 배양체 (胚樣體) 에서는, 생체 내와 동일하게 3배엽을 포함하는 다양한 세포종의 분화가 일어나 생식 세포의 출현 빈도는 매우 적은 것으로 생각된다. 그 때문에, 종래의 분자 유전학적 검출법이나 면역 조직학적 염색법으로는 정확한 식별을 할 수 없다. 본 발명에서는, 이 문제를 극복하는 수단으로서, Vasa 호몰로그 유전자 발현을 GFP (발광 해파리의 녹색 형광 단백질) 및 lacZ (박테리아 유래의 갈락토시다아제 효소 ; 발색 기질에 의해 청색 발색 또는 발광 기질에 의해 형광 발색이 가능해진다) 유전자 등의 마커 유전자의 발현으로 치환하는 유전자 개변 조작을 실시하고, Vasa 호몰로그 유전자의 발현의 제어 하에 놓이도록 상기 마커 유전자를 삽입한 재조합 발현 벡터를 구축하였다.
Vasa 호몰로그 유전자의 발현 제어역을 사용한 외래 유전자의 발현 벡터의 이용은, 생식 세포 계보를 통한 유전자 기능 해석 및 조직 공학적 응용에 우수한 특성을 갖는다. 본 발명에서 사용하는 마커 유전자란, 그 발현을 용이하게 검출 또는 측정할 수 있는 유전자인 한, 그 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 GFP (녹색 형광 단백질), RFP (적색 형광 단백질), BFP (청색 형광 단백질), YFP (황색 형광 단백질) 등의 형광 단백질을 코드하는 유전자, lacZ 등의 화학 발광 효소 유전자, 또는 네오마이신 등의 약제 내성 유전자를 들 수 있고, 이들에 각종 변이를 부가한 인위적 합성 유전자를 사용해도 된다.
본 발명에서 말하는 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자란, 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 인간, 돼지, 소, 양, 래트 등) 에 있어서의 Vasa 유전자를 의미한다. 이러한 Vasa 호몰로그 유전자는 공지되어 있고, 예를 들어 마우스 (Fujiwara, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12258-12262, 1994), 인간 (Castrillon, D. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 9585-9590, 2000), 래트 (Komiya et al., Dev. Biol., 162, 354-363, 1994) 등에 기재되어 있다.
이하, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자가 마우스인 경우를 예로 들어 구체적으로 설명한다.
Mvh 유전자의 발현 조절 영역의 특정은, 이하의 2 개의 방법으로 실시하였다.
제 1 방법은, 제 1 엑손 상류의 게놈 DNA 를 다양한 길이로 단리하여, 반딧불이 luciferase 효소 단백질 등을 리포터 유전자로 한 프로모터 활성 검정법이다. 본 발명에 있어서, 프로모터 활성이란, 기본 프로모터가 갖는 전사 활성 및 인핸서가 갖는 전사 촉진 활성을 의미하고, 이러한 프로모터 활성을 갖는 발현 조절 배열을 「프로모터 배열」 이라고 한다. 구체적으로는, GC-rich 기본 프로모터를 포함하는 전사 개시점 상류부 DNA 배열을 일정한 길이로 조제하고, luciferase 를 갖는 프로모터 벡터에 연결하고, 생식 세포 배양주인 EG (Embryonic Germ) 세포에 리포펙션법으로 유전자 도입한 후, 발현 활성을 luciferase 효소 활성 측정법으로 검출하는 수법이다. 그 결과, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 강한 전사 촉진 활성은, 전사 개시점으로부터 상류 약 3.0kb 의 범위 내에 존재하는 것이 판명되었다. 이하, 특별히 언급하지 않는 한, 「상류」 란 「전사 개시점으로부터 상류」 를 의미한다. 상류 1.0kb 에 보이는 약한 활성은 기본 프로모터의 그것을 나타내는 것으로 생각되고, 이것은 도 2 에 나타내는 바와 같이 1.0kb 의 활성화에는 세포종에 의한 차이가 없는 것이나 이 부분의 결실이 전사 활성의 완전한 상실을 초래하는 것 (도 1) 으로부터도 지지된다. 한편, 3.0kb 의 전사 촉진 활성은 세포종 특이성이 보이는 것 외에, EG 세포를 생식선 체세포주 (M15) 와 혼합 배양했을 때 발현 증강이 보이는 것은, 내재성 Vasa 발현의 거동과 일치한다. 따라서, 상류영역의 1.0kb 에서 3.0kb 의 영역에는 적어도 주요한 생식 세포 특이적 발현 조절 배열이 포함되는 것이 판명되었다.
또한, 제 2 방법으로서, 상기 배양 세포계에서 검정된 Vasa 발현 조절영역은, 외래 유전자를 마우스 수정란에 현미 주입하여 얻어지는 트랜스제닉 (Tg) 마우스에 의해 검증되었다. 예로서, 전사 상류영역 3.0kb 에 GFP 유전자를 리포터로서 연결한 3.0-GFP 유전자의 트랜스제닉 마우스에서는, 정소내 생식 세포에 특이적인 GFP 발현이 검출된다. 그 GFP 발현은 형광 현미경 하에서 녹색 형광을 발하는 세포로서 식별되고, 강양성은 감수 분열기에 들어간 정모 세포로부터 감수 분열 후의 정자 세포에 관찰된다 (도 3). 이 결과는, 보다 광범위한 상류영역 8.0kb, 5.0kb 를 사용한 경우에도 동일했다.
그러나, 이들 상류영역만을 사용한 트랜스제닉 마우스에서는, Mvh 가 갖는 태아기 시원 생식 세포나 난모 세포 등의 암컷 생식 세포에서의 발현은 검출 감도 이하이고, 상류영역 이외의 영역에도 그 발현 증강을 담당하는 제어 배열의 존재가 나타난다. 하나의 가능성으로서, Mvh 유전자의 3'-비번역 영역이 생체내 생식 세포에 있어서의 장기적 단백질 발현을 담당하는 번역 활성화 제어를 갖는 것이 추정된다. 실제로, Mvh 번역역의 말미에 있는 번역 정지 코돈으로부터 하류 2.3kb 를 3.0-GFP 유전자의 하류에 연결한 3.0-GFP-UTR 유전자의 트랜스제닉 마우스에서는, 태아기 시원 생식 세포에도 약하면서 GFP 발현을 가시화할 수 있고, GFP 항체 염색에 의해서도 유의한 발현성을 확인할 수 있다 (도 4).
이상의 결과로부터, Mvh 유전자의 발현 제어에는 전사 상류영역 (약 3.0kb) 에 의한 특이적 전사 촉진 활성과, 비번역 영역을 포함하는 3'-하류영역에 의한 번역 활성화의 적어도 2 개의 제어 엘리먼트가 유효한 것이 판명되었다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서 사용할 수 있는 Mvh 유전자의 전사 개시점에서 약 3kb 상류 위치로부터 전사 개시점까지의 염기 배열을, 배열표의 배열 번호 1 에 나타낸다. 또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서 사용할 수 있는 Mvh 유전자의 3'-비번역 영역 (UTR) 배열의 염기 배열을, 배열표의 배열 번호 2 에 나타낸다. 또, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서 사용할 수 있는 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열은, 유래되는 포유 동물종에 한정되지 않지만, 발현 벡터를 도입하는 동물 또는 도입하는 세포가 유래되는 동물과 동일한 종류의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 분화된 생식 세포에 특이적으로 발현되는 것인 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에는, 상기한 요소 외에도, 앰피실린 내성 유전자 등의 선택 마커 유전자, 및 복제 기점 등, 통상의 발현 벡터에 사용되는 요소를 적절히 포함시킬 수 있다.
(2) 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 세포 및 트랜스제닉 비인간 포유 동물
본 발명에 의하면, 상기 (1) 에 기재한 재조합 발현 벡터를 도입하여 얻어지는 세포가 제공된다. 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입하기 위한 세포로는, ES 세포, 및 조직 줄기 세포 등을 들 수 있다. 조직 줄기 세포로는, 간엽계 세포, 특히 골수 간엽계 세포 등을 사용할 수 있다. 또한, ES 세포 및 조직 줄기 세포 등의 세포는, 포유류 또는 조류 유래의 세포 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 포유류 유래의 세포를 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는, 마우스 또는 인간에서 유래되는 세포를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 ES 세포주의 구체예로는, 마우스 129 계통 수컷 유래 E14 세포주 및 이것에서 유래되는 E14TG2a 세포주, 인간 ES 세포주 H9 (Thomson et al., Science, 282, 1145-1147, 1998) 등을 들 수 있다. 이들 세포에 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입하고, 생식 세포 및 분화된 세포를 분리할 수 있다.
재조합 발현 벡터를 세포에 도입하는 방법은, 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 일렉트로포레이션법, 인산 칼슘법, 또는 리포펙션법 등을 사용할 수 있고, Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사) 등 시판되는 트랜스펙션 시약을 사용하여 실시할 수도 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물이 제공된다.
본 발명의 트랜스제닉 비인간 포유 동물의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 본 발명의 재조합 발현 벡터를 수정란 등에 도입함으로써 제조할 수 있다. 구체적으로는, 비인간 포유 동물의 수정란에 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입하고, 당해 수정란을 위임신 암컷 비인간 포유 동물에 이식하고, 당해 비인간 포유 동물로부터 그 재조합 발현 벡터가 도입된 비인간 포유 동물을 분만시킴으로써 제조할 수 있다.
비인간 포유 동물로는, 예를 들어 마우스, 햄스터, 모르모트, 래트, 토끼 등의 설치류 외에, 개, 고양이, 염소, 양, 소, 돼지, 원숭이 등을 사용할 수 있는데, 제조, 육성 및 사용의 간편함 등의 관점에서 보아, 마우스, 햄스터, 모르모트, 래트, 토끼 등의 설치류가 바람직하고, 그 중에서도 마우스가 가장 바람직하다.
수정란 세포 단계에서의 본 발명의 재조합 발현 벡터의 도입은, 대상 포유 동물의 배아 세포 및 체세포 모두에 존재하여 유지되도록 실시할 수 있다. 유전자 도입 후의 작출 (作出) 동물의 배아 세포에 있어서, 본 발명의 재조합 발현 벡터가 존재하는 것은, 작출 동물의 후대가 전부 그 배아 세포 및 체세포 모두에 본 발명의 재조합 발현 벡터가 존재하는 것을 의미한다. 유전자를 계승한 이 종류의 동물의 자손은 그 배아 세포 및 체세포 모두에 본 발명의 재조합 발현 벡터를 갖는다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은, 교배에 의해 유전자를 안정적으로 유지하는 것을 확인한 후, 당해 유전자 보유 동물로서 통상의 사육 환경에서 계대 사육할 수 있다. 도입 유전자를 상동 염색체의 양방에 갖는 호모 접합체 동물을 취득하고, 이 암수의 동물을 교배함으로써 모든 자손이 그 유전자를 갖도록 번식 계대할 수 있다.
이하, 트랜스제닉 비인간 포유 동물이 트랜스제닉 마우스인 경우를 예로 들어 구체적으로 설명한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터를 마우스 수정란의 수컷 전핵에 마이크로인젝션하고, 얻어진 난세포를 배양한 후, 위임신 암컷 마우스의 수란관에 이식하고, 그 후 피이식 동물을 사육하고, 태어난 새끼 마우스로부터 상기 발현 벡터를 갖는 새끼 마우스를 선택함으로써, 본 발명의 트랜스제닉 마우스를 제조할 수 있다. 상기 마우스의 수정란으로는, 예를 들어 129/sv, C57BL/6, BALB/c, C3H, SJL/Wt 등에서 유래되는 마우스의 교배에 의해 얻어지는 것이면 임의의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 갖는 새끼 마우스의 선택은, 마우스의 꼬리 등으로부터 DNA 를 추출하고, 도입된 재조합 발현 벡터를 프로브로 하는 도트 하이브리다이제이션법이나, 특이적 프라이머를 사용한 PCR 법 등에 의해 실시할 수 있다.
(3) 생식 세포의 취득 방법
본 발명에 의하면, 상기한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물로부터, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 생식 세포의 취득 방법, 그리고 상기한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 배양하고, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 생식 세포의 취득 방법이 제공된다.
취득되는 생식 세포로는, 생식 줄기 세포가 바람직하다. 여기에서 말하는 생식 줄기 세포는, 정자 줄기 세포, 또는 난자 줄기 세포의 어느 것이어도 된다.
상기한 Mvh 유전자 상류영역 3.0kb 를 제어 프로모터 배열로서 외래 유전자를 발현하는 경우, 그 발현을 정자 형성 세포의 감수 분열기 이후에만 한정하는 것이 가능하다. 이 특이성은 정자 형성 과정에 특이적인 유전자 산물의 기능 해석이나 그 외래 단백질의 세포내 거동을 추적하는 것에 이용할 수 있다. 하나의 구체예로서, Vasa-GFP 융합 단백질의 세포내 국재성(局在性)의 경우를 예시한다. 항체 염색법에 의해, MVH 단백질은 마우스 정자 형성 과정에서 세포질 내에서 균등 분산상의 국재로부터, 감수 분열기에는 과립 구조화되고, 정자 세포에서는 핵막에 인접하는 1 개의 거대 과립 구조 (Chromatoid Body : CB) 에 국재되는 변화를 나타내는 것이 판명되어 있다 (Toyooka, Y. et al, Mech. Dev., 93, 139-149, 2000). CB 구조는, 단백질과 RNA 성분의 복합체로서, 정자 형성에 있어서의 번역 제어 장치로서의 역할이 추정되는 세포내 기관이다. 생식 세포 특이적인 Vasa-GFP 융합 단백질의 발현은, 이 CB 구조의 비고정 조건 하의 관찰을 가능하게 한다. 3.0kb 상류영역에 의한 발현은, 내재성 Mvh 유전자 발현과 비교하여 약 1/5 정도로 낮아, 정자 형성이나 그 임성에 대한 영향 등 생리적 기능 저해는 발생되지 않는다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, 외래 유전자에 의한 MVH-GFP 는, 내재성 MVH 단백질의 거동과 일치하여, 정모 세포 하에서는 세포질내 과립, 정자 세포 내에서는 CB 구조에 대한 국재를 나타냈다. 이 특성은, CB 구조의 계시적 거동을 실시간으로 계측하는 것을 가능하게 하는 것 외에, 그 형성이나 기능에 관한 인자를 비고정 시료로부터 정제하기 위한 신규의 수단을 제공한다. 동일한 방법에 의해, 정자 형성에 관한 단백질 인자에 대해서도 적용되고, 가시적 표지화와 공액 인자의 동정에 사용할 수 있다.
또, 내재성 Mvh 유전자의 발현 특이성을 충실하게 재현하는 외래 벡터 구축법의 하나로서, Mvh (또는 각종 동물의 Vasa 호몰로그 유전자) 게놈 유전자 전장 을 포함하는 장대한 DNA 를 BAC 벡터 등 (Cosmid, P1 파지) 에 클론화한 것을 사용하여, 그 벡터 내에서 외래 발현 유전자를 Mvh 유전자 내에 삽입하는 형태를 사용할 수 있다. 이 경우, 전장 Mvh 유전자란, 적어도 전사 개시점의 상류 약 3.0kb 에서 번역 종지점 하류 약 3.0kb 까지의 약 60kb 를 포함하는 배열이고, 삽입하는 형태는 번역 개시점의 하류에 번역 코돈 프레임을 맞춘 형태로 외래 유전자 cDNA 를 삽입하거나, 또는 리보솜 결합 배열 (ires) 을 외래 유전자 상류에 부가한 유전자를 삽입 또는 치환하는 것이 유효하다. 하나의 구체예로서, Mvh 유전자를 내포하는 약 150kb 게놈 DNA 를 갖는 BAC 클론에 RFP 유전자를 삽입한 리포터 유전자의 실시예를 든다. 도 6A 에 나타내는 바와 같이, RFP 유전자 cDNA 가 제 2 엑손의 번역 개시점에 맞춰 삽입된 Bac-Vas-RFP 벡터는, 리포펙션법 등에 의한 배양 세포에 대한 유전자 도입 또는 DNA 현미 주입법에 의한 트랜스제닉 마우스 제조에 사용된다. ES 세포를 숙주 세포로 한 유전자 도입에서는, 내포하는 약제 내성 (이 경우에는 Neo 내성 유전자에 의한 G418 내성에 의한 선별) 에 의해 Bac-Vas-RFP 재조합체 ES 세포를 선별할 수 있다. ES 세포로부터의 배양 하에서, 시원 생식 세포, 정자 형성 세포, 및 난자까지의 세포종이 분화되는 것은 최근의 연구에 있어서 밝혀져 있다 (Toyooka, Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 11457-11462, 2003 ; Hubner, K. et al, Science, 300, 1251-1256 2003 ; Geijsen, N. et al., Nature, 427, 147-154, 2004). 따라서, 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포는, 배양 하의 분화 유도에 의해 Mvh 발현 양성의 생식 세포를 RFP 적색 형광 세포로서 식별할 수 있고, 셀소터 조작에 의해, 배양 조건 하에서 각 발생 단계에 분화된 생식 세포만을 정제하는 것이 가능하다 (도 6B). 또한, Bac-Vas-RFP 벡터를 삽입한 트랜스제닉 마우스 계통 (BR-15) 에서는, 그 정소 및 난소 내의 생식 세포, 즉 정원 세포로부터 정자까지의 정자 형성 세포와 난원 세포로부터 성숙 난자까지의 난 형성 세포가 RFP 발현에 의한 적색 형광 세포로서 식별된다 (도 6C). 그 현저한 리포터 발현은, 상류 3.0kb 프로모터 배열을 사용한 경우보다 조기부터 검출되고, 내재성 Mvh 발현과 일치하여, 암수 태아기 생식선 내의 시원 생식 세포로부터 검출하는 것이 가능하다 (도 6D).
또한, 성체 정소에는, 그 주기적 정자 형성을 담당하는 정자 줄기 세포가 존재하고, 미분화 생식 세포인 시원 생식 세포나 정원 세포와도 다른 특성을 갖는 것이 알려져 있다. 또, 최근 그 배양법이 확립되어, 생체 정소로의 이식에 의해 배양 정자 줄기 세포에서 유래되는 정자나 산자 (産仔) 를 얻는 것이 가능한 것 등, 생식 공학 기술 상에서 우수한 신소재가 되는 것이 주목된다 (Kanatsu-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003). 상기 Bac-Vas-RFP 는, 이 정자 줄기 세포도 가시화 식별할 수 있다. 이것은, 마우스 성체 정소 세포를 정자 줄기 세포의 배양 조건에서 배양한 경우, 증식된 정자 줄기 세포 클론이 특이적으로 RFP 양성 세포로서 식별됨으로써 확인되었다 (도 7A). 한편, 최근, 성체 난소에도 난자 형성의 줄기 세포가 되는 난자 줄기 세포의 존재가 보고되었다. 이 세포종은, 난소 전체를 둘러싸는 기저막내 또는 그 외측에 위치하는 Mvh 발현 양성 세포로서 식별된다 (Johnson, J. et al, Nature, 428, 145-150, 2004). 난소 내의 난모 세포가 큰 세포질을 갖는 구상 형태인 것에 대해, 이 난자 줄기 세포는 조직 단면 이미지에서 편평한 형태를 갖는다. Bac-Vas-RFP 마우스 난소의 조직 시료에 있어서, 난모 세포와 동일하게 기저막 밖의 난자 줄기 세포도 RFP 양성 세포로서 관찰된다 (도 7B). 또한, 도 7C 에 나타내는 바와 같이, 분산된 난소 세포를 배양 하에 둔 경우, 감수 분열기에 있는 모든 난모 세포는 증식되지 않음에도 불구하고, RFP 양성에서 증식성을 갖는 세포나 편평 형태 그대로 유지되는 세포가 관찰되는 것도 Bac-Vas-RFP 벡터에 의한 세포 표지화가 난자 줄기 세포의 식별이나 정제를 가능하게 하는 것을 나타낸다.
상기한 포유류 Vasa 호몰로그 유전자의 발현 조절영역을 사용한 본 발명의 재조합 발현 벡터의 특성은, 이것을 사용한 트랜스제닉 동물 개체의 생체 조직으로부터 생식 세포를 특정하는 것이 가능하고, 특히 생식 줄기 세포를 특이적으로 선별 배양하는 조작에 있어서 유효하고, 외래 유전자 발현에 의해 형광 표지화, 약제 선택성, 또는 새로운 생리 기능 인자 등의 외래 형질의 부가를 실현할 수 있다. 또한, 동일한 특이성은 배양 세포계에서도 이용할 수 있고, 마우스에 한정되지 않고, 인간 등 다른 동물종에 있어서, ES 세포, 조직 줄기 세포 등 각종 생체 조직에서 유래되는 배양 세포에 유전자 도입함으로써, 배양 하에 생식 세포 계보로 분화 유도 또는 분화 전환된 세포의 분취, 특히 생식 줄기 세포에 분화된 세포의 분리 배양으로부터 생식 줄기 세포의 순수 배양을 수립하는 것에 우수한 특성을 발휘하는 것이다.
(4) 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법
또한, 본 발명에 의하면, 상기한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물에 피험 물질을 투여하고, 그 마커 유전자의 발현을 유기하는 피험 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법, 그리고 상기한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 피험 물질의 존재 하에서 배양하고, 그 마커 유전자의 발현을 유기하는 피험 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법이 제공된다. 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 생식 세포 분화 촉진 인자도 본 발명의 범위 내이다.
피험 물질의 종류는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 합성 화합물 (저분자 유기 화합물, 고분자 유기 화합물 등), 미생물 발효물, 생물체 (식물 또는 동물의 조직, 미생물, 또는 세포 등을 포함한다) 로부터의 추출물, 또는 그들의 라이브러리를 들 수 있다. 라이브러리로는, 합성 화합물 라이브러리 (조합 라이브러리 등), 펩티드 라이브러리 (조합 라이브러리 등) 등을 들 수 있다. 스크리닝의 피험 물질은, 천연물이어도 되고 합성물이어도 되며, 또 후보가 되는 단일의 피험 물질을 독립적으로 시험해도 되고, 몇 개의 후보가 되는 피험 물질의 혼합물 (라이브러리 등을 포함한다) 에 대해서 시험해도 된다. 또, 세포 추출물과 같은 혼합물을 분획한 것에 대해서 스크리닝을 실시하고, 분획을 거듭하여 최종적으로 마커 유전자의 발현을 유기하는 물질을 단리하는 것도 가능하다.
(6) 생식 세포에 대한 독성 시험 방법
또한, 본 발명에 의하면, 상기한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물에 피험 물질을 투여하고, 그 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질을 검정하는 것을 특징으로 하는 생식 세포에 대한 독성 시험 방법, 그리고 상기한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 피험 물질의 존재 하에서 배양하고, 그 마커 유전자의 발현이 유기되어 있는 세포수를 지표로 하여 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질을 검정하는 것을 특징으로 하는 생식 세포에 대한 독성 시험 방법이 제공된다.
생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질 (피험 물질) 의 종류는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 합성 화합물 (저분자 유기 화합물, 고분자 유기 화합물 등), 미생물 발효물, 생물체 (식물 또는 동물의 조직, 미생물, 또는 세포 등을 포함한다) 로부터의 추출물, 또는 그들의 라이브러리를 들 수 있다. 라이브러리로는, 합성 화합물 라이브러리 (조합 라이브러리 등), 펩티드 라이브러리 (조합 라이브러리 등) 등을 들 수 있다. 피험 물질은, 천연물이어도 되고 합성물이어도 되고, 또 후보가 되는 단일의 피험 물질을 독립적으로 시험해도 되고, 몇 개의 후보가 되는 피험 물질의 혼합물 (라이브러리 등을 포함한다) 에 대해서 시험해도 된다. 또, 세포 추출물과 같은 혼합물을 분획한 것에 대해서 스크리닝을 실시하고, 분획을 거듭하여 최종적으로 마커 유전자의 발현을 유기하는 물질을 단리하는 것도 가능하다. 보다 구체적으로는, 내분비 교란 물질 (환경 호르몬) 등을 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질로서 본 발명의 독성 시험 방법으로 평가할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : Mvh 유전자의 전사 제어 영역의 검정
Mvh 게놈 유전자 영역은, 129 마우스 게놈 라이브러리 (EMBL3 : Clontech 사) 로부터 동 유전자 제 1 엑손을 포함하는 클론을 단리하고, 그 인서트 DNA 의 제한 효소 지도에 기초하여 조제하였다. 상류영역 5.0kb, 3.0kb, 1.0kb 란 제 1 엑손 내의 SmaI 부위로부터, 각각 약 5.0kb 상류에 위치하는 KpnI 부위, 약 3.0kb 상류에 위치하는 PstII 부위, 약 1.0kb 상류에 위치하는 EcoRV 부위까지를 포함하는 단편이고, 이들을 Basic-Luc 벡터 (pGL3-basic ; Promega 사) 의 클로닝 부위에 대하여 5'-3' 방향을 맞춰 삽입하고, 5.0Luc, 3.0Luc, 1.0Luc 의 검정 벡터를 제조하였다. 8.0Luc 는, 1.0Luc 벡터를 기초로 게놈 제 1 엑손 직전에 존재하는 약 7.8kb 의 NotI 게놈 단편을 삽입 치환한 벡터로서 제조하였다. 3.0Δluc 는, 3.0Luc 벡터로부터 XbaI/SacI 단편 (상류 -400∼-900 에 대응) 을 결실한 벡터이다 (도 1 을 참조).
유전자 도입의 숙주 세포로 하는 EG 세포는 수정 후 8.5 일째 마우스 배아의 시원 생식 세포로부터 수립된 배양 세포이고, 10% FCS (소 태아 혈청), bFGF (100ng/㎖), LIF (1 만 단위/㎖) 를 포함하는 DMEM 배지에서 생육시킨다. 검정 시료는 12 웰 플레이트에 약 백만 세포/구멍의 밀도로 배양한 세포를 1 시료로 하였다. 1 검체 2㎍ 을 사용하는 유전자 도입에는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사) 을 사용하고, 도입법은 그 사용 매뉴얼에 따랐다. 도입 효율을 표준화하는 내재적 대조군으로서, CMV-Renilla (바다 팬지) Luc 벡터 (pRL-CMV: Promega 사) 를 사용하고, 각 검정 도입당 100:1 의 비율로 동시 도입하였다. 도입 후 1 일째에 세포 시료를 회수하고, Dual Luciferase Assay System (Promega 사) 을 사용하여 효소 활성을 측정하였다. 도 1 은, 내재적 대조군 CMV-Renilla Luc 에 대한, 활성 상대비를 그래프에 나타낸 것이다.
유의한 발현 촉진 활성을 나타낸 3.0Luc 벡터에 대해서, 각종 마우스 세포주를 숙주로 한 검정 결과를 도 2 에 나타낸다. 사용된 세포주는, 상기 EG 세포 (Matsui, Y. et al., Cell, 70, 841-847, 1992) 와 M15 (10.5 일째 배아 마우스 태아 생식선 지지 세포주) (Larsson, S. H. et al., Cell, 81, 391-401, 1995), P19 (배성 종양 세포주) (McBurney, M. W. & Rogers, B. J., Dev. Biol., 89, 503-508, 1982), STO (섬유아세포주) (Martin, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634-7639, 1981), ES (CCE ; 배성 줄기 세포주) (Robertson, E. et al., Nature, 323, 445-449, 1986) 이다.
측정 방법은 도 1 과 동일하게 실시하였다. 그 결과, 3.0Luc 벡터는 생식 세포에서 유래되는 EG 세포에 특이적인 발현 촉진 활성을 갖는 것이 나타났다. 도 2 에서 나타내는 바와 같이, ES 세포에서도 약간의 발현은 보이지만, 현저한 발현은 EG 세포에 보인다. 즉, ES 세포에서의 발현은 없거나, 또는 매우 낮은 것을 확인하고 있다. 이것은, ES 세포로의 도입이 무효인 것을 나타내는 것은 아니고, ES 세포에 도입한 후, 생식 분화되면 활성화되는 특성을 뒷받침하는 결과이다. 또한, 내재적 Mvh 유전자의 발현은, 생식 세포가 생식선에 정착한 후에 현저히 항진되고, 그것은 EG 세포를 생식선 지지 세포주와 혼합 배양함으로써도 관찰된다. 이 촉진 효과가 3.0Luc 벡터에서도 재현되는지의 여부를 검토하였다. 비교로서 1.0Luc 벡터를 사용하여, EG 세포 단독과 M15 세포의 혼합 (1:1) 배양을 숙주로 하여, 상기와 동일한 검정을 실시한 결과는, 3.0Luc 에서 현저한 촉진 효과가 보이는 것을 나타냈다. 이상의 결과는 상류영역 1.0∼3.0 의 영역에 Mvh 발현 특이성을 담당하는 요인 배열이 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 2 : 3.0-GFP 트랜스제닉 (Tg) 마우스의 제조와 성상 해석
실시예 1 에서 제조한 3.0Luc 벡터의 Luciferase 유전자 부분을 결실한 단편과 pEGFP-promoter 벡터 (Clontech 사) 로부터 단리한 EGFP 유전자의 EcoRI-SalI 단편을 연결함으로써 3.0-GFP 벡터를 제조하였다. 3.0-GFP 벡터의 구조를 도 8 에 나타낸다. 이 DNA 를 벡터 내의 ScaI 부위에서 절단, 선상화한 10ng/㎕ 의 DNA 용액을 마우스 (B6C3F1) 수정란의 전핵 내에 현미 주입함으로써, 3.0-GFP 벡터를 삽입한 Tg 마우스 3 계통을 수립하였다.
구체적으로는, 발현 벡터 DNA 를 현미 주입한 수정란을 위임신 마우스의 난관에 이식하고, 당해 가친 (假親) 마우스로부터 유전자 재조합체 마우스를 분만시킴으로써 제조할 수 있다. 산자 마우스가 재조합체인 것은, 당해 마우스의 꼬리부 선단을 절단하고, 그 조직으로부터 추출한 게놈 DNA 를 EcoRI 제한 효소 처리한 후, 아가로오스 전기 영동으로 전개, GFP 단편을 32P 라벨한 프로브를 사용하여 서던블롯 해석함으로써 판별하였다. 얻어진 재조합체 마우스 산자는, 각각 개별의 교배 번식을 실시함으로써, 다른 염색체 부위에 발현 벡터를 삽입한 마우스 계통으로서 수립되었다.
상기와 같이 하여 제조한 3.0-GFP 벡터를 삽입한 Tg 마우스 3 계통은, 완전 히 동일한 결과를 나타냈다. 얻어진 Tg 마우스의 성체 정소는, 형광 실체 현미경 하에서 장기 레벨에서도 GFP 유래의 녹색 형광을 나타낸다. 도 3 에 그 Tg 마우스 정소의 조직 절편 상(像)을 나타냈다. 정소는 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시킨 후, 동결 절편으로 하고, 조직을 가시화하는 핵염색에는 TO-PRO3 iodide 용액 (Molecular Probes 사) 이 사용되었다. 그 결과, GFP 형광은 정세관 내의 정자 형성 세포의 정모 세포로부터 정자 세포의 세포층에 검출되었다. 동일한 검출은, 태아기 생식선이나 난소에 대해서도 실시했는데, 이 3.0-GFP Tg 에서는, 그 발현은 검출되지 않았다. 따라서, Mvh 상류 프로모터역은, 생체 내에서는 감수 분열기 이후의 수컷 생식 세포에 발현되는 것이 판명되었다.
실시예 3 : 3.0-GFP-UTR Tg 마우스의 제조와 성상 해석
상류 3.0kb 에서는, 태아기나 난소 내의 발현이 재현되지 않은 결과로부터, 번역 영역 하류에 있는 비번역 전사 영역 (3'-UTR) 의 번역 제어 활성의 존재가 시사되었다. 이 때문에, 실시예 2 의 3.0-GFP 의 하류에 Mvh 유전자의 3'-UTR 을 연결한 3.0-GFP-UTR Tg 마우스를 제조하였다. 사용한 3'-UTR 단편은, Mvh 게놈 클론 (마우스 세포의 전체 게놈 DNA 도 가능) 을 주형으로 한 PCR 법에 의해 단리하였다. 여기에서 사용한 프라이머는, 5'-GATTAAAGCAAACGAACATA-3' (배열 번호 3) 와 5'-CCCACTGCACATAGGACTTAT-3' (배열 번호 4) 이고, 얻어지는 2.3kb 산물은 번역의 정지 코돈으로부터 비번역 전사 영역의 약 600b 를 완전히 포함한다. PCR 반응은, Ex-taq 또는 LA-taq (타카라 주조사) 를 사용하고, 94℃ 1 분, 58℃ 2 분, 72℃ 3 분의 사이클을 27-30 회 반복하는 반응을 사용하였다. 이 PCR 반응 조건은, 특기하지 않는 한 모든 실시예에 있어서도 공통적으로 사용되기 때문에, 이후의 실시예에서는 표기는 생략한다. PCR 산물은, pGEM-T Easy 벡터 (Promega 사) 에 서브클론한 후, 그 클로닝 부위 양단에 있는 NotI 부위를 이용하여 잘라내고, 3.0-GFP 벡터의 GFP 하류에 있는 NotI 부위에 방향을 맞춰 삽입한 것을 3.0-GFP-UTR 벡터로 하였다. Tg 마우스의 제조는 실시예 2 와 동일하다.
얻어진 3.0-GFP-UTR Tg 마우스에 대해서, 그 성체 정소, 태아기 정소의 생체에서의 GFP 형광 관찰과 조직 절편 관찰을 도 4 에 나타냈다. 태아기의 GFP 형광 발현은 성체 정소에 비하여 미약하지만, 유의한 발현이 보였다. 그 조직 절편에서는 항 GFP 항체 (1/500 희석 ; Clontech 사) 와 Oregon Green-항 rabbit IgG (1/500 희석 ; Molecular Probes 사) 의 조합으로 형광 항체법에 의한 검출이 가능하였다. 이들 결과에 의해, Mvh 유전자의 발현 특이성을 사용하는 경우, 상류 3.0kb 와 하류영역 최장 2.3kb 의 조합이 유효한 것으로 결론된다.
실시예 4 : 3.0-VASA-GFP Tg 마우스의 제조와 가시화 단백 분자의 거동 해석
상기 실시예 2 의 결과로부터, Mvh 3.0kb 는 하류에 연결하는 유전자를 정소내 정자 형성 세포에 특이적 발현을 가져오는 활성을 나타냈다. 그 특이성을 이용하여, 가시화 표지된 단백 분자의 거동을 해석하는 사례로서, 3.0-VASA-GFP Tg 마우스를 제조하였다. 이것은, Mvh 3.0kb 의 하류에 VASA-GFP 의 융합 cDNA 를 연결하고, VASA 단백질의 세포내 분포의 변동을 GFP 형광에 의해 가시화하는 것을 도모한 것이다. 벡터의 구축은, 3.0-GFP 벡터의 개변을 기본으로 하였다. 먼저, Mvh 전장 cDNA 를 포함하는 plasmid 클론 (또는 정소 mRNA 로부터 조제한 cDNA 를 사용하는 것도 가능) 을 주형으로 하여, Mvh 전장 번역 영역의 5' 말단에 BamHI 부위, 3' 말단에 KpnI 부위를 갖는 cDNA 를 PCR 반응에 의해 제조한다. 사용한 프라이머는, 5'-BamHI-GAAGCTATCATGGGAGATGAA-3' (배열 번호 5) 와 5'-KpnI-GGCCCATGATTCGTCATCAA-3' (배열 번호 6) 이다. 마찬가지로, GFP cDNA 에 대해서도 5' 말단에 KpnI 부위, 3' 말단에 SalI 부위를 갖는 cDNA 를 PCR 반응에 의해 제조한다. 사용한 프라이머는, 5'-KpnI-ACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' (배열 번호 7) 와 5'-SalII-CTACTCAGACAA TGCGATGC-3' (배열 번호 8) 이다. 2 개의 PCR 단편은, pGEM-T Easy plasmid 에 서브클론한 후, 이 Mvh plasmid 를 KpnI/SalI 로 개환한 중에, 다른 일방의 GFP plasmid 로부터 KpnI/SalI 절단한 단편을 연결한다. 이에 의해, Mvh 와 GFP 는 KpnI 부위의 2 개의 코돈을 끼워 연결되고, 하나의 융합 cDNA 를 구성한다. 이 Mvh-GFP cDNA 를 BamHI/SalI 절단으로 잘라낸 단편을 3.0-GFP 벡터로부터 BglII/SalI 절단으로 GFP cDNA 를 잘라낸 개환 벡터 내에 삽입하여 3.0-VASA-GFP 벡터를 구축하였다.
Tg 마우스의 제조 및 그 정소 조직의 형광 이미지 관찰 방법은, 상기 실시예와 동일하다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, 이 Tg 마우스 정소에서는 VASA-GFP 융합 단백질의 발현이 정모 세포와 정자 세포에 확인되고, 그 특징적인 세포 내의 국재성으로서 Chromatoid Body 의 가시화와 그 생세포에서의 동태의 관찰이 가능하였다.
실시예 5 : BAC-Vasa-RFP 유전자를 사용한 생식 세포의 가시화
BAC 벡터를 사용한 Tg 유전자의 제조는, 기본적으로 Lee 들에 의해 개발된 방법에 준하여 실시하였다 (Lee E-C et al. Genomics 73, 56-65, 2001). 마우스 게놈 BAC 라이브러리 (Clontech 사) 로부터, Mvh 유전자좌를 포함하는 약 140kb 의 마우스 게놈 DNA 를 인서트로 하는 BAC 클론 대장균을 단리하였다. 이 BAC 클론 내에서 상동 재조합을 일으키는 DNA 단편은 Pfu polymerase (Promega 사) 를 사용한 PCR 에 의해 제조한다. RFP 유전자의 삽입을 도모하는 경우, 미리 pUC-loxP-Neo-loxP 에 RFP cDNA (Clontech 사) 단편을 서브클론한 plasmid DNA 를 주형으로서 사용한다. 사용하는 5' 및 3' 프라이머는, 5'-50mer [상동 배열 A]-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3' (배열 번호 9) 와 5'-50mer [상동 배열 B]-GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3' (배열 번호 10) 이고, 상동 배열 A 는 Mvh 제 2 엑손에 있는 Mvh 의 번역 개시점 ATG 까지의 50 염기 배열, 상동 배열 B 는 그 이후의 50 염기의 상보 사슬 배열이다. 얻어진 PCR 산물을 재조합 competent 화 처리한 BAC 클론 대장균과 혼합하여 도입하고, 클로람페니콜/카나마이신 플레이트상으로 배양하여, 약제 내성의 대장균으로부터 상동 재조합체 BAC 를 포함하는 클론을 단리하였다. BAC DNA 는 Nucleobond-ax 칼럼 (Macherey-Nagel 사) 으로 조제하고, Tg 마우스 제조, 및 ES 세포로의 도입에 사용되었다 (도 6a).
ES 세포 (E14) 야생주로의 도입은 Lipofectamine 2000 을 사용하고, 그 재조합체 클론은 G418 약제 내성으로 선별되었다. 배양체의 형성에는, 10% FCS 를 포함하는 DMEM 배지에 ES 세포 (백만 세포/㎖) 를 옮기고, 부유 배양용 플레이트 (Nunc 사) 를 사용하였다. 이 중에서 ES 세포는 세포 응집 덩어리를 형성하고, 배양 하의 3배엽 분화를 실시한다. BAC-Vasa-RFP 재조합체의 경우, 약 3 일 이 후에 RFP 적색 형광 양성의 세포가 명료하게 관찰되고, 배양 하에 분화되는 생식 세포가 식별되었다 (도 6b). 또, BAC-Vasa-RFP Tg 마우스에서는, 그 정소, 난소 및 태아 생식선 내의 시원 생식 세포도 명료한 RFP 적색 형광 세포로서 검출되었다 (도 6c). 이 중, 난소내 난세포의 가시화는, 이 Tg 에서 처음으로 가능하게 된 성과이고, 그 이유의 하나는 리포터로 한 RFP 단백의 장수명을 들 수 있다. 또, 이 현저한 리포터 발현은, 상류 3.0kb 프로모터를 사용한 경우보다 조기부터 검출되고, 내재성 Mvh 발현과 일치하여, 암수 태아기 생식선 내의 시원 생식 세포로부터 검출하는 것이 가능하다 (도 6d).
실시예 6 : BAC-Vasa-RFP 를 사용한 생식 줄기 세포의 식별과 배양
실시예 5 에서 제조한 Tg 마우스를 사용함으로써, 지금까지 가시화가 곤란, 또는 불가능했던 줄기 세포의 동정이 가능한 것이 판명되었다. 이 마우스 계통에서는, 도 7 에 나타내는 바와 같이 난소의 기저막 상 또는 그 조직 밖에 위치하는 Mvh 양성 세포를 생체 조직의 상태에서 적색 형광 세포로서 식별할 수 있다. 이 이점은 조직으로부터 초대 배양을 실시하는 과정에서, 이 추정 난자 줄기 세포를 놓치지 않고, 그 형태나 생육 상태를 추적하는 것을 가능하게 한다. 예로서, BAC-Vasa-RFP 마우스의 생후 10 일째 새끼 마우스 난소의 배양을 나타낸다. 생체로부터 적출한 난소를 0.25% 트립신 용액 (Gibco 사) 으로 5 분간의 단시간 분산 처리를 실시함으로써, 난소내의 유연한 조직 부분을 유리 세포로서 회수한다. 이들을 10% 의 FCS 를 포함하는 DMEM 배지에 현탁하고, 젤라틴 코트한 배양 플레이트에서 하룻밤 배양한다. 그 후, 배지는 정자 줄기 세포용으로 개발된 STEM 배 지 (Kanatsu-shinohara, M., et al, Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003) 에 치환을 반복하여 장기 배양한다. 이 과정에서 거대한 세포 덩어리인 난포나 큰 구형 세포인 난모 세포는 부유 상태에 있기 때문에, 배양액 교환으로 제거된다. 약 1 주째에는 플레이트 저면에 부착된 세포층 중에 RFP 적색 형광, 즉 Mvh 양성의 생식 세포가 산재하는 것이 관찰되었다 (도 7c). 그 중의 일부는, 세포 분열에 의해 생긴 콜로니 형태를 나타내는 것과 단일 세포로 방추형의 형태를 갖는 것으로 분류된다. 이들은, 그 크기, 형태나 분열 능력에서 명확하게 난모 세포와는 다른 세포종이고, 생체 조직에 보인 난자 줄기 세포에서 유래되는 것으로 생각된다. 이 세포종을 배양 하에 동정할 수 있는 것은, 형광에 기초하는 세포 선별로부터 클론 세포주의 수립 가능성을 나타내는 것이다. 한편, 이미 그 배양주화가 가능하게 된 정자 줄기 세포에 대해서도, BAC-Vasa-RFP 마우스의 정소 유래 세포를 사용한 배양에 의해, 적색 형광을 갖는 정자 줄기 세포의 식별과 세포주화가 가능한 것이 판명되었다 (도 7b). 정자 줄기 세포 배양에 사용한 방법은, Kanatsu-shinohara 들 (Biol. Reprod., 69, 612-616, 2003) 에 의해 보고된 방법에 준하였다.
본 발명에 의하면, 미분화 줄기 세포에는 발현되지 않고, 분화된 생식 세포에 특이적으로 발현되는 Vasa 호몰로그 유전자의 발현을 고감도로 검출할 수 있는 트랜스제닉 비인간 포유 동물, 그리고 배양 세포계가 확립되었다. 본 발명의 발현 벡터는, 트랜스제닉 비인간 동물로부터 시원 생식 세포나 생식 줄기 세포의 선택적 취득 및 그들에서 유래되는 배양 세포주를 수립하는 데에 있어서, 또한 ES 세포계의 근간이 되는 생식 세포에 대한 분화능을 검정하는 데에 있어서, 우수한 실험계를 제공한다. 또한, 본 발명에 의하면, 생식 세포 계보에 대한 기여 능력이 저하되어 있는 ES 세포 클론으로부터도 생식 세포 및 그 산자를 얻는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 있어서는, 유전자의 상동 재조합에 의한 도입 등의 복잡한 조작을 필요로 하지 않아 비교적 간편하게 실시가 가능하다.
본 출원은, 2005 년 6 월 1 일자의 일본 특허 출원 (일본국 특허출원 2005-161279호) 에 기초하는 우선권을 주장하는 출원이고, 그 내용은 본 명세서 중에 참조로서 도입된다. 또한, 본 명세서에서 인용한 문헌의 내용도 본 명세서 중에 참조로서 도입된다.
도 1 은, Mvh 유전자의 각종 프로모터 단편을 사용하여 루시페라아제 어세이에 의해 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2 는, 3.0Luc 벡터를 사용하여 각종 마우스 세포주를 숙주로 하여 루시페라아제 어세이에 의해 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3 은, 3.0-GFP 트랜스제닉 마우스의 정소의 조직 절편 이미지를 나타낸다.
도 4 는, 3.0-GFP-UTR 트랜스제닉 마우스의 성체 정소 및 태아기 정소의 생체에서의 GFP 형광 관찰과 조직 절편 관찰을 나타낸다.
도 5 는, 3.0-VASA-GFP 트랜스제닉 마우스의 정소의 GFP 형광 관찰과 조직 절편 관찰을 나타낸다.
도 6 은, BAC-Vasa-RFP 유전자를 사용하여 생식 세포를 가시화한 결과를 나타낸다.
도 7 은, BAC-Vasa-RFP 를 사용한 생식 줄기 세포의 식별과 배양 결과를 나타낸다.
도 8 은, 3.0-GFP 벡터의 구조를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi chemical corporation <110> RIKEN <120> An expression vector comprising a promoter sequence of Vasa homologue gene derived from mammal and use thereof <130> A61358A <160> 10 <210> 1 <211> 2789 <212> DNA <213> mouse <400> 1 tctgcagtaa actgaatctc cagttttcac gttatgtaga tccatctcca tgaatctggc 60 ctggccttgt gaatttctgg taactgatta gttgaaagtt gcaaatataa ttgtttaact 120 tcttatgcta gaattcaaga agccttgcaa ctattaccct ggtcctttgg agcgatgtcc 180 ctgacaagtg tgtccagttg aaatgcagca tccttacaga gtctgactga gattgtccaa 240 caaccttcag agcctaagtc agcctcttgg aaactattca attgttctgg ccatcccagc 300 cactagatgc cagagtagag aagtcacctt ggatgttaaa caaactggta ttggaggttg 360 gggataaact cagtagtaca gagcttgcct ggcacgctca agtacctagg ttcaaactct 420 ggcaatgcca aaaaagaaaa aagttgatag caaactctca gatgattcaa gttctaatta 480 gcatttgaat ggaattgtat gagatggtct cctgagccct ctcaatccct gagagagaat 540 tttttttgta agtcaatata ttatgcaata gtttgttata tagttgtact ggctaatttg 600 ggtcaagctg gagttatcac agaaaaagga gcttcagttg 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of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 accatggtga gcaagggcga g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 ctactcagac aatgcgatgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 9 tgtggaattg tgagcggata 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 10 gttttcccag tcacgacgtt 20 1

Claims (22)

  1. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물로부터, 상기 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 생식 세포의 취득 방법.
  2. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 배양하고, 상기 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포 분화능을 갖는 세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 생식 세포의 취득 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    ES 세포 또는 조직 줄기 세포가 포유류 또는 조류 유래의 세포주인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열이, 전사 개시점에서 3kb 상류 위치로부터 전사 개시점까지의 염기 배열을 적어도 포함하고 있는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터에 있어서, 마커 유전자의 하류에, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 3'-비번역 영역 (UTR) 배열이 연결되어 있는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커 유전자가 형광 단백질을 코드하는 유전자, 약제 내성 유전자, 또는 화학 발광 효소 유전자인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커 유전자가 GFP, RFP, BFP, YFP, 또는 lacZ 유전자인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생식 세포가 생식 줄기 세포인 방법.
  9. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서,
    포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열이, 전사 개시점에서 3kb 상류 위치로부터 전사 개시점까지의 염기 배열을 적어도 포함하고 있는 재 조합 발현 벡터.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터에 있어서, 마커 유전자의 하류에, 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 3'-비번역 영역 (UTR) 배열이 연결되어 있는 재조합 발현 벡터.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커 유전자가 형광 단백질을 코드하는 유전자, 약제 내성 유전자, 또는 화학 발광 효소 유전자인 재조합 발현 벡터.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커 유전자가 GFP, RFP, BFP, YFP, 또는 lacZ 유전자인 재조합 발현 벡터.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위해 사용하는 재조합 발현 벡터.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 발현 벡터를 갖는 세포.
  16. 제 15 항에 있어서,
    ES 세포 또는 조직 줄기 세포인 세포.
  17. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물.
  18. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물에 피험 물질을 투여하고, 상기 마커 유전자의 발현을 유기하는 피험 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법.
  19. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 피험 물질의 존재 하에서 배양하고, 상기 마커 유전자의 발현을 유기(誘起)하는 피험 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 생식 세포 분화 촉진 인자의 스크리닝 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 생식 세포 분화 촉진 인자.
  21. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 트랜스제닉 비인간 포유 동물에 피험 물질을 투여하고, 상기 마커 유전자의 발현을 지표로 하여 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질을 검정하는 것을 특징으로 하는 생식 세포에 대한 독성 시험 방법.
  22. 포유 동물 유래의 Vasa 호몰로그 유전자의 프로모터 배열의 제어 하에 놓이도록 마커 유전자가 삽입되어 있는 재조합 발현 벡터를 도입한 ES 세포 또는 조직 줄기 세포를 피험 물질의 존재 하에서 배양하고, 상기 마커 유전자의 발현이 유기되어 있는 세포수를 지표로 하여 생식 세포에 대한 독성을 갖는 물질을 검정하는 것을 특징으로 하는 생식 세포에 대한 독성 시험 방법.
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