JP2009513107A - 新規な胚様体(eb)の調製方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多分化能性または多能性細胞から胚様体(EB)を作製する方法であって、
(a)細胞凝集物が生成されるまで、多分化能性または多能性細胞の培養物懸濁液を、約0.1〜5×106細胞/mlの濃度で容器中で撹拌すること、および
(b)任意のステップとして懸濁液を希釈すること、及びEBが形成されるまで懸濁液をさらに撹拌することを含む、方法に関する。
本明細書の目的において、用語「幹細胞」は、幹細胞または生殖細胞(例としては、それぞれ胚性幹(ES)および生殖(EG)細胞が挙げられる)のいずれかを言う。最低限、幹細胞は、複数の異なる表現型の細胞を増殖および形成させることができ、および同じ培養の一部として、あるいは異なる条件下で培養したとき、自己複製することもできる。胚性幹細胞はまた、典型的にテロメラーゼ陽性およびOCT−4陽性である。テロメラーゼ活性は、TRAP活性アッセイによって(Kimら、Science 266(1997)、2011)、市販のキット(TRAPeze(登録商標) XK Telomerase Detection Kit、Cat. s7707;Intergen Co., Purchase N.Y.;もしくはTeloTAGGG(登録商標) Telomerase PCR ELISAplus, Cat. 2,013,89;Roche Diagnostics, Indianapolis)を用いて決定することができる。hTERT発現はまた、RT−PCRによって、mRNAレベルで評価することもできる。LightCycler TeloTAGGG(登録商標)hTERT定量キット(Cat. 3,012,344; Roche Diagnostics)は、研究目的のために市販されている。
2.所望の試験または分化処置に関して、図1に示すように、2つの異なるプロトコル(高密度細胞懸濁および低濃度細胞懸濁)が可能である;
3.高密度の細胞懸濁液からのEB生成(プロトコル1):約1〜5×106ES細胞/ml、好ましくは、1.5〜2.5×106ES細胞/ml、最も好ましくは、約2×106ES細胞/mlの密度の細胞懸濁液を調製し、ペトリ皿などの適切な容器に移す;
4.細胞凝集物が生成されるまで、約6時間、約50rpmで振動台上で懸濁液を攪拌する;
5.懸濁液を1:10または1:20に希釈し、好ましくはT25フラスコなどの適切な第二の容器に移す;
6.懸濁液を振動台上で約12〜18時間、好ましくは合計(ステップ(a)および(b))で16〜20時間、最も好ましくは18時間、攪拌する;任意に、
7.細胞凝集物を所望の最終濃度に分割する:試験化合物に添加する(任意);
8.低密度の細胞懸濁液からのEB生成(プロトコル2):約0.1〜0.5×106ES細胞/ml、最も好ましくは、0.2×106ES細胞/mlの密度の細胞懸濁液を調製し、ペトリ皿などの適切な容器に移す;
9.細胞凝集物が生成されるまで、約48時間、約50rpmで振動台上で懸濁液を攪拌する;
10.懸濁液を、ペトリ皿などの適切な容器中で所望の最終濃度、好ましくは100〜2000EB/10mlの濃度に希釈する;
11.懸濁中、またはコラーゲンを塗布した細胞培養皿などの適切な表面に細胞を播いた後、細胞を所望の組織に分化させる;任意に、
12.好ましくは、耐性マーカーの助けを借りて、所望の、分化した細胞タイプおよび組織の選択、例えば、ピューロマイシン選択を行う;そして任意に、
13.胚様体、細胞または組織を、実施例に記載したように、心臓毒性アッセイまたは移植などの治療のための種々の、in vitro試験において使用する。
(a)本発明の方法によって取得した胚様体(EB)を含む試験サンプルまたはそれらの分化した細胞または組織を、スクリーニングする試験物質と接触させること、および
(b)前記EB細胞または組織の表現型の反応性の変化を測定することを含み、対照と比較した反応性の変化によって有用な薬物または化合物の毒性が示される、方法に関する。
(i)Na+チャネル;
(ii)Ca2+/K+チャネル;
(iii)K+チャネル;
(iv)振幅及び/又は電場電位持続性(FDP);
(v)心臓細胞の変周期性または神経細胞性の細胞のバースト時間;
(vi)不整脈、EAD様減少;
(vii)pH値;
(viii)酸素分圧(pO2);
(ix)拍動の停止;
(x)AV解離収縮性(AV-dissociation contractility)の分析、NO作用及び/又は形態学的変化;
(ix)レポーター遺伝子の発現または活性;または
(iix)マーカー遺伝子の発現。
(i)蛍光を測定することによって、胚様体内の心臓細胞を測定すること、
(ii)心臓特異的バイオマーカーの測定、および
(iii)細胞生存度及び/又はアポトーシス事象の測定、を含む。
・高度に標準化された細胞培養モデル、均質かつ再現性のあるEBの生成;
・正常な生理学的ふるまいをする心房、心室およびペースメーカー細胞の存在(例えば、発現およびイオンチャネルの調節);
・全体的にin vitroベースのシステム、困難な細胞調製の必要がない;
・時間とコストの節約。
マウス胚性幹細胞(ES細胞、クローンD3、ATCC CRL 1934)を、心臓α−ミオシン重鎖(?−MHC)プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を含有するpαMHC−GFPベクターを用いて安定にトランスフェクトした。このベクターを得るために、マウスα−ミオシン重鎖遺伝子(Genbank 471441)のプロモーター領域を含有する5.5kbのフラグメントを、pEGFP−1ベクター(Clontech Laboratories)のポリリンカーに導入した。
ES細胞を実施例1に記載のように培養した。EBを生成するために、ES細胞を懸濁液中に培養した。0.2×106個/mlの密度で、10cmペトリ皿(Greiner, Darmstadt, Germany)上、20%FCS(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を含む10mlのIMDM中で、37℃、5%CO2、湿度95%の条件下で振動台(GFL3006、GFL、Braunschweig、Germany)上で、50rpm、48時間培養した。2日目、100〜2000のEBを10cm細菌皿(Greiner) に移し、10mlのIMDM、20%FCSとし、攪拌しながら、あるいは攪拌せずに、37℃、5%CO2、湿度95%の条件下でインキュベートした。5日目および7日目、または1日おきに、2000EB/10mlといった高濃度の懸濁液については、10mlの新鮮な培地と交換した。14日目、心臓細胞を表す蛍光領域を、10倍のAchroplan対物レンズ、GFP用HQフィルターセット(AF Analysentechnik、Tubingen、Germany)およびSensicam 12ビット冷却撮像システム(PCO Imaging、Kelheim、Germany)を備えたZeiss Axiovert 200Mを用いて蛍光顕微鏡検査によって検出した。
EB細胞を実施例1に記載のように培養した。1日目、30のEBを細菌学的な6−ウェルプレート(Greiner)の各ウェルに、20%FCSを含む3mlのIMDMとなるように移し、既知の胎児毒性の潜在性を有する試験化合物を図に示すように異なる濃度で添加した(溶媒:DMSO、DMSOの最終濃度:0.1%)。試験化合物を、in vitroでの胎児毒性試験で確認するためにEuropean Center for the Validation of Alternative Methods(ECVAM)(Brown、NA 2002; ATLA 30、177-198)によって推奨されている化合物のリストから選択した。各化合物濃度を3つの個別の実験において3回試験した。EBを37℃、5%CO2、湿度95%の条件下で培養した。5日目、培養物にを2mlの新鮮な培地を添加し、新鮮な試験化合物を添加した。14日目、各プレート上のEBを計数し、溶解緩衝液(20mMのトリス−HCl/0.5%のTritonX 100)中に溶解させ、蛍光強度をTecan Safire(登録商標)(Tecan、Crailsheim、Germany)を用いて476/508nmの波長で測定した。試験に導入した全てのEBが処置中、生存するわけではないので、値は100EBの仮の数字に正規化しておいた。次いで正規化された数字を対照値(0.1%DMSOのみ)に対するパーセントとして表した。分化において有意な変化が認められた場合(Student’s t検定)、化合物が胎児毒性を有するものと判定した。図5は、3つの異なる試験化合物、すなわち、フタル酸ジメチル(非胎児毒性)、バルプロン酸(弱い胎児毒性)およびメトトレキサート(強い胎児毒性)の効果を示す。*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.002。
EB細胞を実施例1に記載のように培養した。5日目、5つのEBを24−ウェル組織培養プレート(Falcon、Becton Dickinson)の各ウェルに、20%FCSを含む2mlのIMDMとなるように移し、37℃、5%CO2、湿度95%の条件下でインキュベートした。10日目に、培養物の半分を新鮮な培地と交換した。14日目に、蛍光顕微鏡検査によってEBが心臓分化しているかどうかを調べ、蛍光領域を持つEBの蛍光顕微鏡写真は、10倍のAchroplan対物レンズ、GFP用HQフィルターセット(AF Analysentechnik)およびSensicam 12ビット冷却撮像システム(PCO Imaging)を備えたZeiss Axiovert 200Mを用いて撮影した。心臓毒性化合物を図6に示すように異なる濃度で添加した(溶媒:DMSO、DMSOの最終濃度:0.1%)、0.1%のDMSOを陰性対照として使用した。EBを37℃、5%CO2、湿度95%の条件下で、さらに3日間インキュベートした。
Claims (44)
- 多分化能性または多能性細胞から胚様体を作製する方法であって、
(a)細胞凝集物が生成されるまで、多分化能性または多能性細胞の培養物懸濁液を容器中で撹拌すること、および
(b)任意のステップとして前記懸濁液を任意に希釈すること、及びEBが形成されるまで前記懸濁液をさらに撹拌することを含む方法。 - ステップ(a)の前に、前記細胞をマウス胚性線維芽細胞(フィーダー細胞)上で培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記多分化能性または多能性細胞は、胚性幹(ES)細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞は、マウスES細胞株に由来する、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)及び/又は(b)の培地は、IMDM20%FCSおよび5%CO2である、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)及び/又は(b)の培養条件は、37℃および湿度95%であることを含む、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 多分化能性または多能性細胞の前記培養物は、濃度が約1×106〜5×106細胞/mlである、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)の前記懸濁液を約6時間培養する、請求項7に記載の方法。
- 前記懸濁液を約16〜20時間培養する、請求項7または8に記載の方法。
- ステップ(b)の前記懸濁物をT25フラスコ内で培養する、請求項7乃至9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)での前記希釈は1:10である、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。
- 懸濁培養物中のEBの最終濃度は、約500/mlである、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞凝集物を分割して、所望の最終濃度にすることをさらに含む、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法。
- 多分化能性または多能性細胞の前記培養物は、濃度が約0.1×106〜0.5×106細胞/mlである、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法
- 前記懸濁液を約48時間培養する、請求項14に記載の方法。
- 得られたEBを濃度約100〜2000EB/10mlに希釈する、請求項14または15に記載の方法。
- 前記細胞を少なくとも1つの細胞タイプに分化させる条件下で、前記細胞を培養することをさらに含む、請求項1乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞タイプは、心筋細胞、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞、肝実質細胞、線維芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞および軟骨細胞から選択される、請求項17に記載の方法。
- 所望の細胞タイプを1以上の選択マーカー及び/又は試薬を用いて選択することをさらに含む、請求項1乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は遺伝子操作されたものである、請求項1乃至19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子を含む、請求項1乃至20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、細胞タイプ特異的制御配列に作動的に結合した選択マーカー遺伝子を含む、請求項1乃至21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択マーカーは、ピューロマイシンに対する耐性を付与する、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞は、細胞タイプ特異的制御配列に作動的に結合したレポーター遺伝子を含む、請求項1乃至23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の前記細胞タイプ特異的制御配列は、前記マーカー遺伝子の前記細胞タイプ特異的制御配列とほぼ同じである、請求項24に記載の方法。
- 前記レポーターは、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)の異なる色の種類から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子および前記レポーター遺伝子は、同じ組換え核酸分子に含有される、請求項22乃至26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子および前記レポーター遺伝子は、同じシストロンに含有される、請求項27に記載の方法
- 前記細胞タイプ特異的制御配列は、心房特異的及び/又は心室特異的である、請求項22乃至28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記制御配列は、αMHCまたはMLC2vのプロモーターのいずれかから選択される、心臓特異的制御配列である、請求項29に記載の方法。
- 請求項1乃至30のいずれか1項に記載の方法によって得た胚様体。
- 請求項31に記載の胚様体に由来する、分化した細胞または組織。
- 前記細胞が心筋細胞である、請求項32に記載の分化した細胞。
- 薬物を同定および/もしくは取得、または化合物の毒性を決定するための方法であって、
(a)請求項31の胚様体(EB)を含む試験サンプルを、スクリーニングする試験物質と接触させること、および
(b)試験物質がEBまたはレポーター遺伝子生成物の量に及ぼす影響、または対照サンプルと比較した活性を決定することを含む方法。 - 前記EBへ及ぼす影響は、分化した細胞の特徴である、請求項34に記載の方法。
- 前記方法は、マイクロウェルプレートまたはアレイ上で行われる、請求項34または35に記載の方法。
- 前記アレイは、マイクロ電極アレイ(MEA)である、請求項36に記載の方法。
- 前記胚様体は、心臓細胞からなる、請求項34乃至37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記胚様体の蛍光を決定することを含む、請求項34乃至38のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項34乃至39のいずれか1項に記載の方法であって、
(i)蛍光を測定することによって、胚様体内の心臓細胞の量を測定すること、
(ii)心臓特異的な特徴を測定すること、および、任意に
(iii)細胞生存度及び/又はアポトーシス事象を測定することを含む方法。 - 請求項31に記載の胚様体または請求項32もしくは33に記載の細胞もしくは組織を含む、薬学的組成物。
- 請求項31に記載の胚様体または請求項32もしくは33に記載の細胞もしくは組織を、特異的な遺伝子の機能損失アッセイ、外来遺伝子の機能取得アッセイ、催奇性/胎児毒性化合物の発生分析、薬理学的アッセイ、マイクロアレイシステム、病理学的細胞機能のためのモデル系の確立、選択的に分化した細胞を誘導するための、あるいは組織移植片のソースとしての、分化および成長因子の適用を調べるための、請求項1乃至30のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 培地成分、選択可能なマーカー、対照サンプル、マイクロアレイ、ベクター、プローブ、容器または多分化能性もしくは多能性細胞を含む、請求項1乃至30または34乃至40のいずれか1項に記載の方法に使用するためのキット。
- 請求項1乃至30及び34乃至40のいずれか1項に記載の方法に使用するための、細胞容器、細胞を撹拌及び/又は培養するための装置、培地およびその成分、多分化能性もしくは多能性細胞、ベクター、蛍光リーダーもしくは顕微鏡、またはマイクロアレイの使用。
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