KR100666607B1

KR100666607B1 - 이종의 ｃｄ４ｔ-세포 생산방법 및 이종의 ｃｄ４ｔ-세포를 생산하는 동물모델

Info

Publication number: KR100666607B1
Application number: KR1020050104826A
Authority: KR
Inventors: 박성회; 최은영; 정경천; 박효진
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단; 다이노나(주)
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2007-01-09
Also published as: KR20060052435A

Abstract

본 발명은 이종의 CD4 T 세포 생산방법, 및 이종의 CD4 T 세포를 생산하는 동물모델에 관한 것으로, 면역결핍 동물에 이종의 2종 주조직적합복합체(major histocompatibility complex class II, MHC II)를 발현하는 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 이식하여 상기 면역결핍 동물로부터 상기 이종동물의 MHC II가 제공하는 항원을 인식하는 CD4⁺CD8^- T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명을 통하여 사람을 비롯한 동물은 자신의 면역세포를 이종동물로부터 생산하여 제공받을 수 있으므로, 감염, 자가면역질환, 후천면역결핍증 및 악성종양 등의 면역기능 이상과 연관된 여러 질병의 치료에 유용하다.

MHC II, 교육, T 세포

Description

이종의 ＣＤ４Ｔ-세포 생산방법 및 이종의 ＣＤ４Ｔ-세포를 생산하는 동물모델{METHOD OF PRODUCING Xenogenic CD4 T-CELL AND ANIMAL MODEL PRODUCING Xenogenic CD4 T-CELL}

도 1은 마우스의 가슴샘세포(thymocytes)에 조직적합성 복합체 CIITA(MHC Class II transactivtor)를 발현시켜 MHC II의 발현을 유도하기 위한 DNA 구조체이다.

도 2는 도 1의 DNA 구조체가 삽입된 형질전환 마우스(Plck-CIITA ^Tg)와 정상 B6 마우스에서 MHC II의 발현을 유세포 분석으로 분석한 것이다.

도 3은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0마우스의 가슴샘세포의 발달을 정상 마우스(CIITA^+/0)와 CIITA 유전자 결핍 마우스(CIITA^0/0)와 비교한 것이다.

도 4는 정상 마우스(MHC II^+/0), MHC II 결핍마우스(MHC II^0/0) 및 Plck-CIITA^tg+MHC II^0/0 마우스의 가슴샘세포의 발달을 유세포분석으로 분석한 것이다.

도 5는 Plck-CIITA Tg 마우스의 골수 세포를 이식 받은 MHC II 유전자 결핍 마우스의 말초혈액 내에서 성숙한 CD4⁺CD8^-T 세포의 비율을 대조군과 비교한 것 이다.

도 6은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스, 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스에서 T 세포 수용체(TCR)의 다양성을 유세포분석으로 비교한 것이다.

도 7은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스, 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스의 말초 성숙 CD4⁺CD8^- 세포의 기능을 비교한 것이다.

도 8은 RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ 사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된(RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/-) 마우스 혈액 내에 렛(rat)의 T 세포를 유세포분석으로 측정한 것이다.

도 9는 골수이식 18주 후 RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스 혈액 내에 사람 유래의 T 세포를 유세포분석으로 측정한 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 CD4 T 세포를 생산하는 방법 및 이를 생산하는 동물모델에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 면역결핍 동물에 이종의 MHC II를 발현하는 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 함유하는 생체시료를 이식하여 상기 면역결핍 동물로부터 상기 이종동물의 MHC II가 제공하는 항원을 인식하는 CD4 T 세포를 생산하는 방법, 이를 생산하는 동물모델, 그의 임상적 적용에 관한 것이다.

[종래기술]

인체는 노출된 이물질에 대해 면역반응을 일으켜 세균의 침입으로부터 생체를 보호한다. 면역반응을 담당하는 세포는 주로 백혈구로서, 이중 특히 CD4⁺CD8^- T 세포(이하 "CD4 T 세포"라 함)와 CD4^-CD8⁺ T 세포(이하" CD8 T 세포"라 함), 그리고 B 세포가 항원에 특이적인 면역반응을 담당한다.

B 세포는 주로 항원에 대한 항체를 생산하며, CD8⁺ T 세포는 항원을 가진 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 반면에 CD4 T 세포는 보조 T 세포로 불리며, CD8 T 세포와 B 세포외에도 여러 백혈구의 면역반응을 유도하고 조절하는 면역계의 핵심 세포이다. 따라서 CD4⁺ T 세포의 기능 이상은 감염, 후천면역결핍증(Acquire Immune Deficiency Syndrome, AIDS), 자가면역질환 및 노화에 따른 면역기능 이상의 주된 요인으로 작용한다.

B 세포와 달리, T 세포는 MHC와 펩티드의 복합체(MHC-peptide complex)만을 인지할 수 있다. T 세포의 T 세포수용체(T Cell Receptor: 이하 "TCR"이라 함)는 가슴샘에 있는 가슴샘 피질 상피세포 표면의 MHC와 펩티드의 복합체를 인지하는 양성선택(positive selection)의 과정을 통하여, 자가 MHC에 존재하는 펩티드 항원을 선택적으로 인지할 수 있는 능력을 획득하며, 가슴샘 수질 상피세포와 가지세포(dendritic cells) 표면의 MHC와 펩티드의 복합체에 의해 자가항원에 반응하는 T 세포는 제거된다. 이때 MHC II를 인지하는 T 세포는 CD4 T 세포로 분화하고, MHC I를 인지하는 T 세포는 CD8 T 세포로 분화한다. 이 과정을 통하여 사람의 말초 혈액 및 조직에는 약 2.5 x 10⁷개의 다양한 종류의 TCR를 가지는 T 세포가 존재한다.

사람이 노화하면 가슴샘에서 충분한 T 세포를 생산할 수 없으므로 말초에 존재하는 T 세포 수용체의 다양성이 감소하고, T 세포의 기능이 감소하여 감염, 암발생 그리고 자가면역질환의 발생이 증가할 수 있다. 또한 후천면역결핍증은 사람면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV)에 의해 CD4 T 세포를 주로 선택적으로 파괴함으로써 면역기능을 감소시킨다. 따라서 노화, 감염, 자가면역질환, 후천면역결핍증 등의 질환을 치료하고, 항-종양 면역반응을 유도하기 위한 방안으로, 정상적인 기능을 가지며 다양한 TCR을 가지는 T 세포를 생산하여 보충할 수 있는 방법을 이용할 수 있다. 그러나, T 세포는 개체에 매우 특이적이어서, 자가 T 세포를 다른 개체 또는 이종 동물에서 생산하기 어려운 실정이다.

특히, 기존의 학설에 의하면 T 세포의 발달은 주로 가슴샘에서 이루어지며, 주로 가슴샘 피질 상피세포의 MHC II에 의해서 양성선택을 받는다. 따라서, 이종 동물에 사람 조혈줄기세포를 이식하면 T 세포가 발달하지 않거나, 발달하더라도 주로 이종 동물의 MHC II에 있는 항원만을 인식할 수 있는 CD4 T 세포가 발생하는 것으로 여겨져 왔다. 따라서 이들 CD4 T 세포를 다시 사람에게 투여하여도 충분한 기능을 가질 것으로 기대하기 어려웠었다.

그러나, 본 발명자는 1992년에 사람 태아 가슴샘 미성숙 T 세포에 MHC II 의 하나인 DR이 발현됨을 처음으로 증명하였으며(Park et al., 1992, Hum Immunol, 33:294-8), 1997년에 이들 가슴샘 미성숙 T 세포가 서로를 교육시켜 양성선택을 유도할 수 있음을 세계 최초로 보고하여(Choi et al., 1997, Hum Immunol, 54:15-20), 이로부터 이종 동물에서 T 세포간의 교육을 유도하여 이종 T 세포를 생산할 수 있는 가능성을 제기하였다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 사람을 비롯한 동물은 자신의 면역세포를 이종동물로부터 생산하여 제공받을 수 있으므로, 감염, 자가면역질환, 후천면역결핍증 및 악성종양 등의 면역기능 이상과 연관된 여러 질병의 치료에 유용한, 이종의 개체 또는 동물로부터 자신의 T 세포로부터 교육받은 CD4 T 세포를 생산하는 방법, CD4 T 세포, 및 CD4 T 세포를 생산하는 동물모델을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여,

본 발명은 자체의 2형 주조직적합복합체(Major Histocompatibility Complex Class II, 이하 MHC II) 단백질이 존재하지 않으며 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 면역결핍 동물에, MHC II가 존재하고 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 함유하는 이종 동물의 생체시료를 이식하는 단계; 및

상기 생체시료가 이식된 면역결핍 동물의 혈액, 비장 또는 림프절로부터 상기 이종 동물에 존재하는 MHC II가 제공하는 항원을 인지하는 CD4 T 세포를 분리 하는 단계

를 포함하는 이종의 CD4 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 T 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 이종의 CD4 T 세포를 생산하는 동물 모델로서,

자체의 MHC II 단백질이 존재하지 않으며 이종 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 면역결핍 동물로서,

MHC II가 존재하고 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 함유하는 이종 동물의 생체시료가 이식되어 상기 이종 동물에 존재하는 MHC II가 제공하는 항원을 인지하는 CD4 T 세포를 생산하는 동물모델을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 이종의 동물을 이용한 자가 T 세포 생산방법에 관한 것이다.

이종의 동물이라 함은, 생산하고자 하는 CD4 T세포를 갖는 자신을제외한 다른 개체 또는 분류학상으로 구분되는 다른 종의 동물을 의미하는 것이다. 예컨대 이종의 동물은 자신의 생체 일부, 예를 들면 혈액, 면역세포, 기관 등에 대하여 거부반응을 나타내는 동물이 이에 속한다.

본 발명에 있어서, 면역결핍된 동물은, 면역반응이 결핍되도록 인위적으로 또는 자연적으로 형성된 돌연변이이다. 본 발명의 바람직한 면역결핍 동물은, 자체의 MHC II 단백질이 존재하지 않으며 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 동물이다.

상기 면역결핍 동물은 자체의 MHC II 단백질을 발현하지 않은 것으로서 가 슴샘세포의 표면에 MHC II가 발현되지 않거나, MHC II의 교육(restriction) 기능이 차단되어 있는 것일 수 있다. 상기 발현저해 방법으로는 MHC II 단백질을 코딩하는 유전자가 결핍되거나, MHC II 유전자의 전사(transcription)가 결핍되거나, 또는 MHC II mRNA의 번역(translation)이 결핍될 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유전자를 녹아웃(Knock-out)시킨 것일 수 있다. MHC II 유전자의 전사가 결핍된 마우스로는 CIITA(MHC class II transactivator) 유전자 결핍 마우스가 있으나 이에 국한되지 않는다. 이는 면역결핍된 동물에 MHC II의 발현을 억제 또는 기능을 차단시킨 유전자 이식 동물을 교배하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명에서 언급하는 MHC II는, 면역결핍 동물에서 자연적으로 발현되는 모든 종류의 MHC II를 의미한다. 특히, 마우스는 I-A 및 I-E이며, 사람은 HLA-DP, HLA-DR 및 HLA-DQ이다.

또한 상기 면역결핍 동물은 RAG(recombination activating gene)-1 유전자, RAG-2, 및 인터루킨-2 수용체 γ사슬(IL-2Rγ) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 유전자가 결핍된 마우스, 또는 SCID(severe combined immunodeficiency) 마우스는 이종의 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 면역결핍 동물이다.

상기 면역 결핍동물의 예로는 마우스, 렛 또는 돼지가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

면역결핍된 동물의 구체적인 예로는 SCID 마우스, RAG-1 낫 아웃(knock-out) 동물, RAG-2 낫 아웃 동물 및 RAG-1 또는 RAG-2 유전자와 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자가 결핍된 동물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 기재한 유전자 이식 동물, 동물 교배 및 면역결핍된 동물은 당업자라면 공지의 기술로부터 용이하게 생산 및 실시가능하며, 상기 동물은 구입 또는 분양받아 사용할 수 있다.

일실시예로, RAG-1 및 인터루킨-2 수용체 γ 사슬 유전자가 결핍된 마우스와 MHC II 유전자가 결핍된 마우스를 각각 분양받아 이를 교배하여, RAG-1, 인터루킨-2 수용체 γ 사슬 및 MHC II가 모두 결핍된 마우스를 제조하였다.

자체의 MHC II 단백질이 존재하지 않으며 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 면역결핍 동물로서,

본 발명에 따른, 이종의 T 세포 생산방법은, 자체의 MHC II (Major Histocompatibility Complex Class II)단백질이 존재하지 않으며 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 면역결핍 동물에, MHC II가 존재하고 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 함유하는 이종 동물의 생체시료가 이식하고, 상기 생체시료가 이식된 면역결핍 동물의 혈액, 비장 또는 림프절로부터 상기 이종 동물에 존재하는 MHC II가 제공하는 항원을 인지하는 CD4 T 세포를 분리하는 단계를 포함한다.

상기 이종의 T 세포는, 가슴샘 미성숙 T 세포 및 성숙 T 세포일 수 있으며, 특히 가슴샘 미성숙 CD4 단일양성(single positive) T 세포의 표면에 MHC II가 존재하는 것이다.

상기 생체시료는, 예컨대 골수, 제대혈 또는 배아줄기세포에서 분화한 조혈줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 이종동물은 사람이나, 렛, 돼지, 원숭이 또는 유인원과 같은 동물로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 생체시료의 이식은 통상의 본 기술 분야에서 알려진 모든 방법으로 수행할 수 있다. 이식방법의 일예로는 정맥주사일 수 있으며, 예컨대 성숙 T 세포를 제거한 골수 세포(5 x 10⁶ 개) 혹은 CD34-양성 골수 또는 제대혈 조혈줄기세포(1-5 x 10⁵ 개)를 4-12주령의 마우스의 꼬리 정맥내에 주입하는 방법일 수 있다.

상기 이식된 동물은 1차 이식만 실시될 수 있으나, 2 내지 3 회 이식을 더욱 실시할 수 있으며, 이식 간격은 1주일 내지 4주일 수 있다. 바람직하기로는 동물의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 이식 후 4 내지 20주 이후에, 혈액, 비장 또는 림프절로부터 이식한 조혈줄기세포에서 유래한 T 세포에 의하여 교육된 CD4 T 세포를 분리할 수 있다.

이식된 동물로부터 유래한 혈액, 비장 또는 림프절로부터 CD4 T 세포를 분리하는 방법은 이종동물의 CD4 T 세포에 대한 항체를 이용하여, 마그네틱이 부착된 CD4 항체를 이용한 방법이거나 또는 형광 표지된 CD4 항체를 이용한 유세포 분석일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 마그네틱 비드(bead)가 부착된 항-이종동물 CD4 항체를 반응시킨 뒤 MACS(Milteny Biotech사 제품)를 이용하여 마그네틱 솔팅(magnetic sorting)을 할 수 있으며, 또는 형광물질이 부착된 항-이종동물 CD4 항체를 반응시킨 뒤 유세포분석기를 이용한 유세포 솔팅을 실시한다.

일실시예로, 본 발명에서는 RAG-1, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 및 MHC II가 모두 결핍된(RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/-) 마우스에 렛 또는 사람의 골수세포를 이식하였고, 이식된 마우스로부터 렛 또는 사람의 CD4 T 세포가 생산됨을 확인한 바 있다. 5 x 10⁶ 개의 렛 골수 조혈세포를 위 마우스의 꼬리 정맥에 주사하여 이식하면 15주 마우스내 렛 백혈구의 37.5%에서 CD4 T 세포를 얻을 수 있다.

본 발명의 이종의 CD4 T 세포 생산방법은, 미성숙 T 세포는 세포표면에 존재하는 MHC II를 통하여 다른 미성숙 T 세포를 교육, 즉 자신의 MHC II를 인지할 수 있는 T 세포를 선별할 수 있다는 사실에 근거한 것이며, 이를 위해선 생체를 제공하는 동물의 T 세포, 가슴샘세포 또는 가슴샘상피세포에서는 MHC II에 의한 교육을 차단시키는 것에 특징이 있다. 더불어 이식된 조혈줄기세포에서 유래한 가지세포(dendritic cells)에 의해서 자가항원에 대한 음성선택(negative selection)도 정상적으로 일어날 수 있다.

이에, 본 발명으로, 거부반응이 없는 자신의 CD4 T 세포를 용이하게 생산할 수 있으며, 생산된 CD4 T 세포는 다양한 항원에 대하여 반응성을 지녀, 면역반응의 저하로 인한 질환, 예컨대, 노화, 백혈병, 후천성면역결핍, 자가면역질환, 종양질환에 대한 치료제로 제공가능하다.

또한 본 발명은 이종의 CD4 T 세포를 생산하는 동물 모델에 관한 것으로, 상기 동물 모델은 MHC II가 전신 세포 표면에 결핍되어 있으며, 이종 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않으며, 또한 상기 동물 모델은 세포표면에 MHC II가 존재 하는 T 세포로 분화하는 이종 동물의 생체시료가 이식된 것으로, 이종 동물의 T 세포를 생산한다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 마우스의 T 세포에서의 MHC II 발현 유도

1-1. DNA 구조체 구축

사람 CIITA를 암호하는 cDNA 단편을 p56lck 근위 프로모터를 포함하는 p1017 카세트(Dr. Jae Kyun Shin at Sungkyunkwan University College of Medicine Suwon, Korea)의 BamHI 부위에 클로닝하여 도 1의 Plck-CIITA 마우스 제조용 DNA 구조체를 구축하였다. 도 1은 DNA 구조체로 lck 근위 프로모터, CIITA cDNA 및 hGH(human growth factor) 폴리 A 꼬리(poly A tail)가 5'에서 3'으로 순차적으로 위치되어 있다. CIITA는 MHC II 발현을 조절하는 중요한 인자이며, lck 근위 프로모터는 미성숙 T 세포에서 lck 유전자의 발현을 조절하는 프로모터이다.

또한 상기 도 1의 DNA 구조체를 hCD2 프로모터를 갖는 카세트(Dr. Dimitris Kioussis, National Institute for Medical Research, London, UK)로 클로닝하여 CD2-CIITA 마우스 제조용 DNA 구조체를 구축하였다.

1-2. 유전자 이식 마우스 제조

각 DNA 구조체는 C57BL/6(이하 "B6" 마우스라 함)의 수정란에 미세주입하였고, 태어난 마우스는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 유세포분석(flow cytometery)을 이용하여 사람의 CIITA 유전자가 삽입된 마우스를 선별 하였다. 유전자 조작된 마우스를 Plck-CIITA Tg 마우스로 명명하였다.

1-3. 유세포 분석

Plck-CIITA Tg 마우스와 정상 B6 마우스에서 CIITA의 발현에 의한 MHC II의 발현을 유세포 분석으로 확인하였다.

각 마우스에서 비장과 가슴샘을 적출한 뒤 10% 우태아혈청이 포함된 인산염완충식염수(phosphate buffered saline)에서 결합 조직을 제외한 각 면역세포들을 부유상태로 수득하였다. 각각을 다시 적혈구 용해 용액에 5분간 반응시켜 적혈구를 제거하고, 1000 rpm에서 10분간 원심하여 세포 침전(cell pellet)을 취하고, 적당량의 5% 우태아혈청이 포함된 인산염완충식염수에 부유하여 1 X 10⁶개의 세포를 분주하였다. 각 면역세포 및 가슴샘세포에서의 MHC II 발현을 비교하기 위하여, 각 시험관에 마우스 MHC II를 인지하는 항체와 각각 특정 세포를 인지할 수 있는 조합의 항체를 적당한 농도로 희석하여 10 ul씩 분주하였다. 이때 항체는 FITC(flouresecin isothiocyatnate), PE(phycoerythrin) 또는 APC(allophycocyanin)가 결합된 항체를 사용하였으며, T 세포와 각 단계별 미성숙 T 세포를 분석하기 위해 항 CD3 항체, 항 CD4 항체 및 항 CD8 항체를 사용하였고, B 세포를 선별하기 위해 B220 항체를 사용하였고, 대식구를 선별하기 위해 MAC-1 항체를 사용하였다.

항체와 세포부유액을 4℃에서 30분간 반응시킨 후 1000 rpm에서 10분간 원심하여 세포 침전만을 취하고, 1회 5% 우태아혈청이 포함된 인산염완충식염수로 세 척하여 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 세포 침전물에 200 ul의 인산염완충식염수를 넣어 부유하고, 유세포측정기(FACSCalibur, Becton-Dickinson사 제품)로 사중염색 유세포분석(four color flow cytometry)을 통해 각 세포별 MHC II 발현을 분석하였다.

도 2는 Plck-CIITA Tg 마우스와 정상 B6 마우스에서 MHC II의 발현을 유세포 분석으로 분석한 것으로, Plck-CIITA Tg 마우스는 굵은 실선으로 정상 B6 마우스는 가는 실선으로 그 결과를 나타내었다. 가슴샘세포는 발달 단계에 따라 CD4+CD8+인 이중 양성(double positive; DP), CD4+CD8-인 CD4 단일 양성(single positive; CD4 SP), CD4-CD8+인 CD8 SP로 나누고, 비장에서는 성숙 T 세포(T), B 세포(B), 대식구 (Mφ)로 나누어 MHC II의 발현을 비교하였다. 그 결과 Plck-CIITA Tg 마우스는 정상 B6 마우스에 비해 가슴샘 미성숙 T 세포에서부터 말초의 성숙 T 세포 모두 MHC II를 강하게 발현하나, B세포 또는 대식구에서는 MHC II 발현이 정상과 거의 같음을 알 수 있었다. 즉, Plck-CIITA Tg 마우스는 T 세포에서 MHC II를 발현시킨다.

실시예 2: 마우스에서의 T 세포간의 MHC II를 매개로 한 교육수행 검증

2-1. Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0마우스 제조

실시예 1의 Plck-CIITA Tg 마우스와 CIITA 유전자 결핍마우스(B6.129S2-C2ta ^tm1Ccum ^/J; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 교배하여 Plck- CIITA^tg+CIITA^0/0를 제조하였다. CIITA 유전자 결핍 마우스는 이미 플라벨 등에 의해 (Chang et al, 1996, Immunity, 4, 167-178) 생산된바 있다. CIITA 유전자 결핍 마우스는 MHC II 발현이 억제되고 이에 따라 가슴샘에서 CD4 SP 성숙 가슴샘세포 발달이 매우 저하되어 있는 것이 알려진 마우스이다. 그러므로 CIITA 유전자 결핍 마우스(CIITA^0/0)와 Plck-CIITA Tg 마우스와의 교배를 통해 얻어진 마우스는 오직 미성숙 가슴샘세포부터 성숙 T 세포까지 이르는 T 세포에서만 MHC II가 발현되고 가슴샘상피세포에 의해서는 정상적인 교육이 일어나지 않는다.

도 3은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0마우스의 가슴샘세포의 발달을 정상 마우스(CIITA^+/0)와 CIITA 유전자 결핍 마우스(CIITA^0/0)와 비교한 것으로, 각 마우스의 가슴샘을 적출한 후 항 CD4, CD8 항체로 염색하여 유세포 분석을 통해 분석한 결과이다. 도 3에서, CIITA 유전자 결핍 마우스(CIITA^0/0)에서는 가슴샘내 CD4 SP 가슴샘세포의 발달이 거의 이루어지지 않고 있으나(정상 마우스 5.2% -> CIITA^0/0마우스 0.8%), 반면에 Plck-CIITA^tg ⁺CIITA⁰ ^/0마우스의 가슴샘내에서는 CD4 SP 가슴샘세포가 성공적으로 발달하고 있는 것(8.5%)을 알 수 있다.

상기 결과로, Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스는 T 세포에서 발현된 MHC II를 매개로 T 세포를 성공적으로 교육시킬 수 있음을 확인되었다.

2-2. T 세포간 교육에서의 MHC II의 기능 검증

Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스에서, T 세포간의 교육이 가슴샘내 미성숙 T 세포의 MHC II에 의하여 이루어짐을 검증하고자 하였다.

Plck-CIITA^Tg 마우스와 MHC II 유전자가 결핍된 마우스(MHC II^0/0)를 교배하여 Plck-CIITA^{tg+MHC II0/0} 마우스를 제조하였다. 상기 Plck-CIITA^{tg+MHC II0/0} 마우스는 가슴샘 미성숙 T 세포에서 CIITA는 발현이 되지만 MHC II는 발현되지 않는다.

정상 마우스, MHC II^0/0 마우스 및 Plck-CIITA^{tg+MHC II0/0} 마우스 각각에서 가슴샘을 적출한 뒤 실시예 1에서 언급한 방법대로 항 CD4, CD8 항체로 염색하여 유세포 분석을 시행하였다.

도 4는 정상 마우스(MHC II^+/0), MHC II 결핍마우스(MHC II^0/0) 및 Plck-CIITA^{tg+MHC II0/0} 마우스의 가슴샘세포의 발달을 유세포분석으로 분석한 것이다. 도 4에서, 정상마우스에 비하여 MHC II 결핍마우스(MHC II^0/0) 및 Plck-CIITA^{tg+MHC II0/0} 마우스의 가슴샘에서 CD4 SP 가슴샘세포가 생성되지 않는 것을 볼 수 있다. 이는 CIITA의 발현만으로 가슴샘세포가 성숙될 수 없고, 이러한 가슴샘세포의 교육에 가슴샘세포에 발현된 MHC II가 직접적으로 관여함을 입증하는 것이다.

2-3.

CIITA의 영향을 받지 않고 발현되는 MHC II에 의해 CD4 SP 가슴샘세포가 발달했을 가능성을 배제하고자 하였다.

MHC II 유전자 결핍 마우스(MHC II^0/0)에 Plck-CIITA Tg 마우스와 B6.PL 마우스의 골수 세포를 이식하면 이식 받은 마우스 가슴샘에는 오로지 가슴샘 미성숙 T 세포에서만 MHC II가 발현되게 된다. B6.PL 마우스는 T 세포에 Th1.1 항원을 발현하며 Thy1.2를 발현하는 일반 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스와 구별되며 그 이외에는 일반 B6 마우스와 유전자 특성이 동일하다.

각각의 마우스에서 안와 정맥총으로부터 말초혈액을 0.1ml씩 채취한 후 앞에서 언급한 방법대로 적혈구를 용해 시키고, 항 CD4, CD8 항체와 항-MHC II 항체로 염색하여 유세포 분석을 시행하였다.

도 5는 Plck-CIITA Tg 마우스의 골수 세포를 이식 받은 MHC II 유전자 결핍 마우스의 말초혈액 내에서 성숙한 CD4 SP T 세포의 비율을 대조군과 비교한 것이다. 도 5에서 보는 바와 같이, MHC II 유전자 결핍 마우스에 정상 B6 마우스와 B6.PL 마우스의 골수 세포를 이식한 경우 CD4 SP T 세포가 말초혈액에서 관찰 되지 않은 반면, Plck-CIITA Tg 마우스와 B6.PL 마우스의 골수 세포를 이식한 경우 충분한 양(17.3%)의 CD4 SP T 세포가 생성되었다. 또한 Plck-CIITA Tg 마우스와 B6.PL 마우스의 골수를 이식받은 MHC II에 유전자 결핍 마우스의 성숙 CD4 T 세포가 MHC II를 발현하는 Plck-CIITA Tg 골수에서 유래한 T 세포(Thy1.2 ,양성; CD4 T 세포의 60.0%) 뿐만 아니라 MHC II를 발현하지 않는 B6.PL 골수에서 유래한 세포(Thy1.1 양성; CD4 T 세포의 25.5%)도 구성되어 있다는 것이다. 이는 MHC II를 발현하는 가슴샘 미성숙 T 세포(본 실시예의 경우 Thy1.2 세포)가 다른 미성숙 T 세포(본 실 시예의 경우 Thy1.1 세포)를 교육할 수 있을 보여준다.

상기한 실험으로, MHC II를 발현하는 가슴샘 미성숙 T 세포가 직접적으로 다른 가슴샘세포를 교육시키고 이러한 가슴샘세포간의 상호작용에 의해 성숙한 CD4 T 세포로 분화가 일어남을 알 수 있다.

실시예 3: MHC II를 발현하는 가슴샘 미성숙 T 세포간의 상호작용에 의해 생성된 CD4 T 세포의 TCR의 다양성 및 기능 검증

3-1. TCR의 다양성 검증

Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스에서 가슴샘 미성숙 T 세포 상호작용에 의해 생성된 CD4 T 세포의 TCR 다양성과 기능을 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스의 CD4 T 세포와 비교하였다.

각각의 마우스에서 가슴샘과 비장을 적출한 후 항 CD4, CD8, TCR Vβ 항체로 염색한 후 각각의 TCR Vβ의 비율을 비교하였다.

도 6은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스, 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스에서 TCR의 다양성을 유세포분석으로 비교한 것이다.

TCR은 알파와 베타 두 가지로 구성되어 있으며, 유전자 재조합에 의해 매우 다양한 종류의 알파, 베타 체인을 만들게 된다. 이렇게 다양한 TCR를 모두 분석할 수는 없지만, 이중 다양한 베타 체인(TCR Vβ)에 대한 항체가 개발되어 있어 이들 항체로 염색하여 대조군과 비교하는 방법으로 TCR의 다양성을 추측할 수 있 다.

각각 가슴샘세포중 CD4 SP, CD8 SP, 비장의 말초 성숙 림프구중 CD4 T 세포, CD8 세포로 나누어 다양한 TCR Vβ의 비율을 비교한 결과, Plck-CIITA^tg ⁺CIITA⁰ ^/0 마우스의 성숙 가슴샘세포와 말초 T 세포에서 다양한 TCR Vβ가 모두 검출되었고, 분포 양상 역시 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스의 TCR Vβ 분포와 유사한 양상을 나타내는 것이 확인되었다. 이는 MHC II를 발현하는 가슴샘세포에 의해서도 가슴샘상피세포에 의해 생성되는 T 세포와 유사하게 다양한 TCR를 가지는 성숙 CD4 T 세포가 발생함을 보여주는 것이다.

3-2. CD4 T 세포의 기능 검증

BALB/c (동종이형, allogeneic) 및 B6 (동계, syngeneic) 각각의 마우스 비장을 적출하여 비장 세포를 분리하여 부유시킨 후, 3000 cGy로 방사선 조사를 하고, 1000 rpm으로 10분간 원심하여 세포침전물을 수득하였다. 세포침전물은 10% 우태아혈청이 포함된 DMEM(Dolbeco's modified Eagle's medium)에 4 X 10⁶개/ml의 농도로 부유시키고, 비장세포를 항원제공세포로 96웰 플레이트에 웰당 1 X 10⁵개 또는 4 X 10⁵개씩 각각 분주하였다.

또한 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스, 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스 각각으로부터 비장을 적출하고, 비장세포를 5% 우태아혈청이 포함된 인산염완충식염수에 부유시킨 다음 마그네틱 비드가 결합되어 있는 항 CD4 항체를 비장세포에 첨가하였다. 4ㅀC에서 20분간 반응시킨 후 MACS(Milteny Biotech사 제품)를 이용하여 CD4 T 세포만을 분리하였다. CD4 T 세포를 10% 우태아혈청이 포함된 DMEM에 부유시키고, 96웰 플레이트에 분주해 놓은 BALB/c 또는 B6 비장세포에 웰당 1 X 10⁵개씩 분주하여 37℃ 에서 배양하였다. 배양 3일 후, 각 웰에 [³H]-티미딘 1 　μCi를 첨가하였다. 18시간 후 β-counter(Beckman사 제품)를 이용하여 [³H]-티미딘을 정량하였다. 정량값은 각각의 마우스에서 추출된 CD4 T 세포가 BALB/c 또는 B6 마우스의 비장세포를 인지해 증식하는 정도를 반영하는 것이다.

도 7은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스, 정상 B6 마우스 및 Plck-CIITA Tg 마우스의 말초 성숙 CD4 T 세포의 기능을 비교한 것이다. 도 7에서, 가슴샘세포와의 상호작용에 의해 발달된 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0마우스의 CD4 T 세포가 정상 B6나 Plck-CIITA Tg 마우스의 CD4 T 세포에 비하여, BALB/c (allogneic)와 B6(syngeneic) 비장세포에 반응해 증식하는 정도가 유의하게 증가하였다. 이는 가슴샘세포에 발현된 MHC II에 의해 교육받은 CD4 T 세포가 항원을 정상적으로 인지하고 기능하고 있음을 의미한다. 또한 오히려 반응이 대조군에 비해 큰 것은 Plck-CIITA^tg+CIITA^0/0 마우스의 가슴샘 발달과정 중 가슴샘 수질의 상피세포와 가지세포(dendritic cells)에 의한 음성선택(negative selection)이 일어나지 않은 결과에 의한 것이라고 할 수 있다.

실시예 4: 마우스에서의 렛의 CD4 T 세포의 생산

RAG-1 유전자 결핍 마우스(B6.129S7-Rag1^tm1Mom/J, Jackson Laboratory), 인터루킨-2 수용체 γ 사슬 유전자 결핍 마우스(B6.129S4-Il2rg^tm1Wjl/J, Jackson Laboratory)와 MHC II 유전자 결핍 마우스(B6.129-H2 ^dlAb1-Ea ^/J, Jackson Laboratory)를 교배하여 3 종의 유전자가 모두 결핍된(RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/-) 마우스를 제조하였다. 상기 마우스에 Sprague-Dawley(이하 SD) 렛 골수를 이식하였다. 골수 이식을 위하여 SD 렛의 넙다리뼈(femur)와 정강뼈(tibia)에서 골수를 채취한 뒤, Prakapas 등(Prakapas et al., 1993, Immunol Lett, 37:63-71)이 기술한 방법에 따라서 28% 소혈청알부빈(bovine serum albumin) 용액위에 골수세포층을 얹고 1,000g로 30분간 원심분리하고 경계부위에서 세포를 취하였다. 이들 세포를 5% 우태아혈청이 포함된 인산염완충식염수에 부유시킨 다음 마그네틱 비드가 결합되어 있는 항-랫 CD4 항체를 첨가하였다. 4℃ 에서 20분간 반응시킨 후 MACS(Milteny Biotech사 제품)를 이용하여 성숙 CD4 T 세포를 제거하고 남은 세포를 인산염완충식염수에 부유시켰다. RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스의 NK 세포를 제거하기 위하여 40??l 항-asialo-GM1 항체 복수를 RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스의 복강에 투여하고 하루 뒤 250rad의 방사선을 조사하였다. 다음날 분리한 렛 골수세포를 마우스당 5 x 10⁶개씩 꼬리 정맥에 투여하였다. 골수이식 2주후부터 1~2주 간격으로 마우스의 안와 정맥총에서 0.1 ml의 혈액을 채혈하여 렛에서 유래한 T 세포의 비율을 유세포 분석으로 측정하였다.

도 8은 골수이식 15주 후 RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스 혈액 내에 렛 유래의 T 세포를 유세포분석으로 측정한 것이다. 마우스 혈액내 단핵세포중 렛 MHC I-양성인 랫 백혈구는 92.7%이었으며(도 8 좌측그림), 렛 MHC I-양성 세포중 랫 CD4, 랫 CD8에 양성인 T 세포는 각각 37.5%, 20.1% 이었다(도 8 우측그림). 이는 MHC II가 결핍된 마우스의 혈액내에 렛에서 유래한 CD4 T 세포가 있음을 의미하는 것이다.

실시예 5: 마우스에서의 사람 CD4 T 세포의 생산

RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스에 사람 조혈줄기세포를 이식하여 사람 CD4 T 세포를 생산하였다. 사람 탯줄혈액에서 조혈줄기세포를 분리하기 위하여 탯줄혈액내 세포를 5% 우태아혈청이 포함된 인산염완충식염수에 부유시킨 다음 마그네틱 비드가 결합되어 있는 항-사람 CD34 항체를 첨가하였다. 4ㅀC에서 20분간 반응시킨 후 MACS(Milteny Biotech사 제품)를 이용하여 CD34-양성 조혈줄기세포를 분리하여 인산염완충식염수에 부유시켰다. RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스에 240rad의 방사선을 조사한 뒤, 다음날 분리한 CD34-양성 사람 조혈줄기세포를 마우스당 1 x 10⁵개씩 꼬리 정맥에 투여하였다. 골수이식 4주후부터 2주 간격으로 마우스의 안와 정맥총에서 0.1 ml의 혈액을 채혈하여 사람에서 유래한 T 세포의 비율을 유세포 분석으로 측정하였다.

도 9는 골수이식 18주 후 RAG1^-/-IL-2Rγ^-/-MHC II^-/- 마우스 혈액 내에 사람 유래의 T 세포를 유세포분석으로 측정한 것이다. 마우스 혈액내 단핵세포중 사람 CD45-양성인 사람 백혈구는 80.7%이었으며(도 9 좌측그림), 사람 CD45-양성 세포중 사람 CD4, 사람 CD8에 양성인 T 세포는 각각 5.5%, 5.6% 이었다(도 9 우측그림). 이는 MHC II가 결핍된 마우스의 혈액내서 사람에서 유래한 CD4 T 세포가 있음을 의미하는 것이다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 거부반응이 없는 자신의 CD4 T 세포를 이종동물을 사용하여 용이하게 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법으로 생산된 CD4 T 세포는 다양한 항원에 대하여 반응성을 갖는다. 이에, 상기 방법으로 생산된 CD4 T 세포는 면역반응의 저하로 인한 질환, 예컨대, 노화, 백혈병, 후천면역결핍증, 자가면역질환, 종양질환에 대한 치료제로 제공가능하다.

Claims

자체의 MHC II(Major Histocompatibility Complex Class II)단백질이 존재하지 않으며 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 사람을 제외한 면역결핍 동물에, MHC II가 존재하고 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 함유하는 이종 동물의 생체시료를 이식하는 단계; 및

상기 생체시료가 이식된 면역결핍 동물의 혈액, 비장 또는 림프절로부터 상기 이종 동물에 존재하는 MHC II가 제공하는 항원을 인지하는 CD4 T 세포를 분리하는 단계를 포함하는 이종의 CD4 T 세포를 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은 MHC II 단백질을 코딩하는 유전자가 결핍되거나, MHC II 유전자의 전사(transcription)가 결핍되거나, 또는 MHC II mRNA의 번역(translation)이 결핍된 것인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은 MHC II 단백질을 코딩하는 유전자의 낫-아웃(Knock-out), 또는 CIITA(Major Histocompatibility complex Class II transactivtor, MHC CIITA) 유전자가 결핍된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은 RAG(recombination activating gene)-1 유전자, RAG-2 유전자, 및 인터루킨-2 수용체 γ 사슬 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 저해된 동물, 또는 SCID(severe combined immunodeficiency) 동물로서 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 면역결핍 동물인 방법.
제 3항 또는 4항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은

(a) MHC II 유전자가 결핍된 SCID 동물;

(b) MHC II 유전자 및 RAG-1 유전자가 결핍된 동물;

(c) MHC II 유전자 결핍 및 RAG-2 유전자가 결핍된 동물;

(d) RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된 동물;

(e) RAG-2 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된 동물;

(f) CIITA 유전자가 결핍된 SCID동물;

(g) CIITA 유전자 및 RAG-1 유전자가 결핍된 동물;

(h) CIITA 유전자 및 RAG-2 유전자가 결핍된 동물;

(j) RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 CIITA 유전자가 결핍된 동물; 및

(j) RAG-2 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 CIITA 유전자가 결핍된 동물;

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은 마우스(mouse), 렛(rat), 또는 돼지인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 이종 동물은 사람, 렛, 돼지, 또는 원숭이인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 생체시료는 골수, 제대혈, 또는 배아줄기세포에서 분화된 조혈모세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 CD4T 세포를 분리하는 단계는 이종동물의 CD4T 세포에 대한 항체를 이용한 마그네틱 솔팅(magnetic sorting) 또는 유세포 솔팅(flow cytometric sorting) 방법으로 수행하는 것인 방법.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한항에 따른 방법으로 제조되며, 이종동물의 MHC II가 제공하는 항원을 인지하고, 상기 이종동물의 자가항원을 제외한 항원을 인식하는 T 세포 수용체(T cell receptor)를 포함하는 T 세포.
제 10 항에 있어서, 상기 T세포는 CD4 단일 양성 (single positive) 가슴 샘세포, 또는 성숙 CD4 T 세포인 것인 T 세포.
제 10 항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은

(a) MHC II 유전자가 결핍된 SCID 동물;

(b) MHC II 유전자 및 RAG-1 유전자가 결핍된 동물;

(c) MHC II 유전자 결핍 및 RAG-2 유전자가 결핍된 동물;

(d) RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된 동물;

(e) RAG-2 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된 동물;

(f) CIITA 유전자가 결핍된 SCID동물;

(g) CIITA 유전자 및 RAG-1 유전자가 결핍된 동물;

(h) CIITA 유전자 및 RAG-2 유전자가 결핍된 동물;

(j) RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 CIITA 유전자가 결핍된 동물; 및

(j) RAG-2 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 CIITA 유전자가 결핍된 동물;

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 T 세포.
자체의 MHC II 단백질이 존재하지 않으며 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 사람을 제외한 면역결핍 동물에, MHC II가 존재하고 T 세포로 분화할 수 있는 세포를 함유하는 이종 동물의 생체시료가 이식되어 상기 이종 동물에 존재하는 MHC II가 제공하는 항원을 인지하는 CD4 T 세포를 생산하는 동물모델.
제 13 항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은 MHC II 단백질을 코딩하는 유전자의 낫-아웃(Knock-out), 또는 CIITA(Major Histocompatibility complex Class II transactivtor, MHC CIITA) 유전자의 결핍에 의해 제조되는 것인 동물모델.
제 13 항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은 RAG(recombination activating gene)-1 유전자, RAG-2 유전자, 및 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 저해된 동물, 또는 SCID(severe combined immunodeficiency) 동물로서 이종의 T 세포에 대하여 면역반응을 유도하지 않는 것인 동물모델.
제 14항 또는 15항에 있어서, 상기 면역결핍 동물은

(a) MHC II 유전자가 결핍된 SCID 동물;

(b) MHC II 유전자 및 RAG-1 유전자가 결핍된 동물;

(c) MHC II 유전자 결핍 및 RAG-2 유전자가 결핍된 동물;

(d) RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된 동물;

(e) RAG-2 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 MHC II 유전자가 결핍된 동물;

(f) CIITA 유전자가 결핍된 SCID동물;

(g) CIITA 유전자 및 RAG-1 유전자가 결핍된 동물;

(h) CIITA 유전자 및 RAG-2 유전자가 결핍된 동물;

(j) RAG-1 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 CIITA 유전자가 결핍된 동물; 및

(j) RAG-2 유전자, 인터루킨-2 수용체 γ사슬 유전자 및 CIITA 유전자가 결핍된 동물;

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동물모델.
제 13 항에 있어서, 상기 동물모델은 마우스(mouse), 렛(rat), 또는 돼지인 동물모델.