ES2961258T3 - Líneas celulares para el cribado de receptores de aroma y olor - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se proporciona una línea celular con función receptora de olores mejorada que comprende un gen RTP1 endógeno activado, que expresa además una proteína RTP1. Además se proporciona en el presente documento un método para activar específicamente un gen RTP1 endógeno en una célula eucariótica usando una técnica derivada de CRISPR/Cas9. También se proporciona en el presente documento un método para identificar compuestos con efectos deseados tales como moduladores de perfume o aroma en dicha línea celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Líneas celulares para el cribado de receptores de aroma y olor
Campo
El campo técnico se dirige a los receptores y ensayos de olor y aroma que se pueden usar para identificar compuestos o moduladores de olor y/o aroma. Los ensayos se dirigen más específicamente a líneas celulares diseñadas que exhiben una actividad mejorada del receptor de olor.
Antecedentes
Los olores se codifican inicialmente en el sistema olfativo periférico (es decir, la nariz) a través de interacciones entre compuestos de aroma y sabor volátiles y proteínas del receptor de olor (OR) que residen en las membranas de las neuronas receptoras olfativas del tejido epitelial olfativo. Dichas interacciones se producen de forma combinatoria específica de olor, donde cualquier OR se puede activar por múltiples olores y, por el contrario, la mayoría de los olores son capaces de activar varios OR diferentes. Para un compuesto o mezcla de olor/aroma dado, estas interacciones del receptor generan señales neurofisiológicas en el cerebro y, en última instancia, dan lugar a una percepción consciente del olor. Aproximadamente ~400 genes OR en el genoma humano se pueden activar por miles o más estímulos de olor y es la complejidad inherente de las interacciones combinatorias entre los olores y los receptores lo que permite la amplitud de sensaciones olfativas que podemos percibir. Elucidar estas interacciones puede conducir al descubrimiento de productos beneficiosos que incluyen, pero no está limitado a, contrarrestadores de malos olores que bloquean la percepción de olores desagradables, nuevos ingredientes de sabores y fragancias que reemplazan compuestos no biodegradables o tóxicos, y potenciadores de olores que limitarían nuestra dependencia en compuestos difíciles de obtener de fuentes naturales.
Existe la necesidad de, por ejemplo, pero no está limitado a, nuevos procedimientos que puedan expresar funcionalmente OR en la superficie celular para una decodificación confiable de los códigos OR. Existe una necesidad adicional de un procedimiento que exprese funcionalmente los OR en células no olfativas (por ejemplo, pero no está limitado a, líneas celulares heterólogas) que sean susceptibles a cribado de alto rendimiento con librerías de compuestos de fragancias y sabores volátiles para una caracterización completa de la actividad OR. Esto podría acelerar significativamente el descubrimiento de contrarrestadores de malos olores, moduladores de olores y nuevos compuestos de sabor o fragancia altamente deseables.
El documento WO 2015/020158 A1 describe procedimientos para el cribado de compuestos de perfume de tipo almizcle entre sustancias candidatas que utilizan un receptor olfativo específico para un perfume de almizcle.
Ciertas proteínas que se derivan de las neuronas sensoriales olfativas pueden mejorar la localización de la superficie celular de los receptores de olor en las líneas celulares no olfativas. Estas proteínas funcionan ayudando en el tráfico de los receptores de olor desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi y la membrana plasmática de la célula. Se ha informado que la proteína 1 que transporta el receptor (RTP1), la proteína 2 que transporta el receptor (RTP2) y la proteína 1 que aumenta la expresión del receptor (REEP1) mejoran la localización del receptor de olor en la membrana plasmática y, por lo tanto, funcionan en células no olfativas. RTP1 y RTP2 se han utilizado en células heterólogas recombinantes para promover la expresión en la superficie de los receptores de olor (WO 2013/082522 A1). Se ha informado que<r>TP1 es la chaperona receptora de olor más eficaz. Se ha demostrado que esta proteína actúa, en parte, al interactuar con los receptores de olor en el retículo endoplásmico. Por lo tanto, una línea celular no olfativa que sea susceptible de cribaje de alto rendimiento y que contenga el gen de RTP1 se desea altamente para la decodificación integral de las interacciones combinatorias entre los olores y los receptores de olores.
Aún más deseable es una línea celular que produce consistentemente la proteína RTP1, que incluye, pero no está limitada a RTP1S, al expresar de manera estable el gen del locus endógeno RTP1. Sin embargo, las técnicas actuales para desarrollar líneas celulares que expresan establemente el gen de RTP1 endógeno implican enfoques de biología molecular ineficientes y engorrosos para la inserción de ADN en células cultivadas que de otra manera no expresarían el gen. Por lo tanto, se desea usar una técnica que evite tales enfoques para desarrollar una línea celular estable y que permita la expresión consistente de la RTP1 endógena sin la necesidad de usar procedimientos recombinantes.
CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición genómica altamente eficiente que se utiliza para generar modificaciones genómicas precisas, como inserciones y deleciones. Por ejemplo, un uso particular de CRISPR/Cas9 permite la expresión de un gen que de otro modo podría estar silenciado en una línea celular (véase, por ejemplo, Cheng y otros, Cell Research (2013) 23: 1163-1171 y Maeder y otros, Nature Methods (2013) 10: 977-979). Al incorporar un promotor transcripcional corriente arriba del gen, una línea celular puede expresar un gen endógeno que de otro modo estaría inactivo.
Sumario
La invención se refiere a una célula que comprende un ADN donante que se introduce en el sitio genómico objetivo corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno, en el que el ADN donante comprende un promotor en el que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1, y en el que la célula se deriva de una línea celular mamífera. También se divulga en la presente memoria una línea celular no olfativa con función mejorada del receptor de olor que comprende un gen de RTP1 endógeno activado.
También se divulga en la presente memoria una línea celular no olfativa que comprende un gen de RTP1 endógeno activado dentro de la célula que además expresa una proteína RTP1.
La invención se refiere a un método para activar un gen RTP1 endógeno en una línea celular de mamífero que comprende:
a. introducir un ARN guía complementario a un sitio genómico objetivo corriente arriba del gen de RTP1;
b. introducir una proteína nucleasa Cas para formar un complejo con el ARN guía; y
c. utilizar el complejo objetivo genómico ARN guía/Cas9 para administrar los elementos de activación del gen para el gen de<r>T<p>1 específicamente.
La invención se refiere además a un procedimiento para identificar un compuesto o mezcla de compuestos que activan, imitan, bloquean, inhiban, modulan y/o aumentan la actividad de un receptor olfativo en una célula no olfativa en la que la célula se deriva de una línea celular mamífera y comprende un ADN donante que se introduce en el sitio objetivo genómico corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno, en el que el ADN donante comprende un promotor en el que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1, en el que el procedimiento comprende además:
a. poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto o mezcla de compuestos que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora el receptor; y
b. determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Descripción de las figuras
LaFigura 1muestra un esquema del locus del gen de RTP1 endógeno y el sitio objetivo específico que se utilizó para la edición del genoma.
LaFigura 2muestra un esquema del procedimiento de inserción del promotor CMV.
LaFigura 3muestra un esquema de los alelos tipo salvaje y recombinados y las regiones de genoma correspondientes.
LaFigura 4muestra la caracterización de la integración del promotor CMV en la línea celular que se diseñó. LaFigura 5muestra la caracterización de la expresión del ARNm de RTP1 en la línea celular que se diseñó. LaFigura 6muestra la caracterización de la expresión de la proteína RTP1 en la línea celular que se diseñó. LaFigura 7muestra una curva dosis-respuesta del receptor de ratón Olfr741 en presencia de concentraciones crecientes de indol.
LaFigura 8muestra una curva dosis-respuesta del receptor de ratón Olfr742 en presencia de concentraciones crecientes de indol.
LaFigura 9muestra una curva dosis-respuesta del receptor de ratón Olfr96 en presencia de concentraciones crecientes de vulcanólido.
LaFigura 10muestra una curva dosis-respuesta del receptor humano OR11A1 en presencia de concentraciones crecientes de vulcanólido.
LaFigura 11muestra una curva dosis-respuesta del receptor de ratón Olfr740 en presencia de concentraciones crecientes de indol.
LaFigura 12muestra una curva dosis-respuesta del receptor humano OR1A1 en presencia de concentraciones crecientes de carvona- (-).
Descripción detallada
Para las descripciones en la presente memoria y las reivindicaciones adjuntas, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. De forma similar, "comprende", "comprenden", "que comprende", "incluye", "incluyen" e "incluyendo" son intercambiables y no pretenden ser limitantes.
Se debe entender además que cuando las descripciones de diversas realizaciones usan el término "que comprende", los expertos en la técnica entenderán que, en algunos casos específicos, una realización se puede describir alternativamente usando el lenguaje "que consiste esencialmente en "o que "consiste en".
En una realización, se proporciona una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de olor. En una realización adicional, se proporciona una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de olor que se selecciona del grupo que consiste en Olfr74l, Olfr742, Olfr96, Olfr740, OR1A1 y OR11A1.
En otra realización adicional en la presente memoria se proporciona una célula que comprende un promotor constitutivo corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno de tal manera que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1 endógeno.
En las neuronas sensoriales olfativas de ratón, el transcripto RTP1 contiene dos sitios de inicio de traducción alternativos que pueden conducir a dos formas distintas de la proteína RTP1: una versión larga (RTP1L) y una versión corta (RTP1S). Sin embargo, es la proteína RTP1S que se expresa predominantemente en las neuronas olfativas del ratón. Además, las células no olfativas (por ejemplo, pero no está limitado a HEK293T) que expresan de forma heteróloga la secuencia de codificación completa de RTP1 expresan predominantemente RTP1L, aunque la secuencia de codificación de RTP1S está contenida dentro de RTP1L. Sin embargo, se prefiere RTP1S para el cribado del receptor de olor en células no olfativas, ya que se sabe que RTP1S supera fuertemente a RTP1L con respecto a la expresión de OR en la superficie celular. Sorprendentemente, hemos encontrado que la activación endógena del gen de RTP1 completo conduce preferentemente a la expresión de RTP1S.
En una realización adicional, en la presente memoria, se proporciona una célula que comprende un promotor constitutivo corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno que impulsa la expresión de la versión corta del gen de RTP1, el RTP1S.
En la presente memoria se proporciona una línea celular no olfativa que comprende un gen de RTP1 endógeno que se activa dentro de la célula que además expresa la versión corta de una proteína RTP1, la RTP1S.
En otra realización más, el promotor constitutivo se selecciona del grupo que consiste en CMV, PGK, EFla y SV40. En una realización, el promotor es CMV, que se origina a partir del Citomegalovirus.
En una realización, en la presente memoria se proporcionada una célula que comprende un promotor inducible corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno de modo que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1 cuando está presente el operador correspondiente.
En una realización adicional, el promotor inducible es un promotor del Elemento de Respuesta a Tetraciclina (TRE) que se induce por administración de tetraciclina (o su análogo doxiciclina).
En una realización, la proteína nucleasa Cas es una proteína Cas9.
En una realización adicional, la proteína Cas9 se selecciona del grupo que consiste en Cas9, dCAs9 (Cas9 desactivado) y Cas9 nicasa.
En una realización, la secuencia de ARN guía (ARNg) se puede diseñar en base a reglas de última generación (Doench y otros, Nat Biotech (2014)) y herramientas de diseño de ARN guía disponibles públicamente para una orientación genómica eficiente (por ejemplo, wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp). Se pueden usar los brazos homólogos que tienen 800 pb de largo en cada lado de la ruptura de ADN de doble cadena específica que se genera por Cas9. Es útil revisar cuidadosamente el sitio de integración del promotor CMV para evitar un sitio de inicio de traducción no deseado antes del sitio de inicio RTP1 endógeno.
Preferentemente, la línea celular original que se utiliza para la ingeniería CRISPR/Cas9 debería ser de origen mamífero y portar el locus del gen de RTP1. Dichas líneas celulares incluyen, pero no se restringen a, HEK293, HEK293T, HeLa, CHO, OP6, HeLa-S3, HEKn, HEKa, PC-3, Calu1, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitelio de riñón de mono BS-C-1, fibroblastos de embriones de ratón BALB/3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; 10.1 fibroblastos de ratón, 293-T, 3T3, BHK, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COS-7, HL-60, LNCap, MCF-7, MCF-10A, MDCK II, SkBr3, células Vero, células olfativas inmortalizadas, células gustativas inmortalizadas y variedades transgénicas de las mismas. Las líneas celulares están disponibles en una variedad de fuentes conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassus, Virginia).
Por lo tanto, se selecciona una línea celular estable del grupo que consiste en HEK293, HEK293T, HeLa, CHO, OP6, HeLa-S3, HEKn, HEKa, PC-3, Calu1, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitelio de riñón de mono BS-C-1, fibroblastos de embriones de ratón BALB/3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; fibroblastos de ratón 10,1, 293-T, 3T3, BHK, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COS-7, HL-60, LNCap, MCF-7, MCF-10A, MDCK II, SkBr3, células Vero, células olfativas inmortalizadas, células gustativas inmortalizadas y variedades transgénicas de las mismas.
En otra realización más, el complejo permite la escisión de la secuencia de ácido nucleico objetivo adyacente a la secuencia de ARN guía y el complejo de proteína Cas9 que se entrega a la célula y en el que el procedimiento comprende además introducir un ADN donante que comprende un promotor CMV dentro la célula.
En una realización, la secuencia de ARN guía y el complejo de proteína Cas9 permite la escisión de la secuencia de ácido nucleico objetivo adyacente a la secuencia de ARN guía y el complejo de proteína Cas9 y en el que el procedimiento comprende además introducir un ADN donante que comprende un promotor CMV a través de la homología celular dirigida, mecanismo de reparación en el sitio de escisión.
En una realización adicional, una línea celular se modifica para expresar de manera estable el gen de RTP1 endógeno bajo el promotor CMV.
En una realización adicional, un ADN donante también puede comprender un casete de selección de antibióticos (por ejemplo, que contiene el gen de resistencia a la puromicina). El cultivo de células en medios de cultivo que contienen antibióticos después del suministro de ADN puede ser beneficioso, ya que elimina las células que no experimentaron una integración adecuada del ADN y, por lo tanto, permite seleccionar eficientemente las poblaciones de clones celulares recombinadas que adquirieron un marcador de resistencia, de ahí la integración que se desea del ADN del donante (por ejemplo, el promotor constitutivo CMV). Dicho gen de resistencia a antibióticos se puede eliminar posteriormente por ingeniería mediante sitios flanqueantes "frt" que se reconocen específicamente por la enzima Flipasa. Este casete luego se retira mediante la entrega de dicha enzima a las células.
En una realización, el complejo funciona apuntando a ubicaciones específicas en el genoma y reclutando más factores de transcripción que activan genes endógenos corriente abajo como RTP1 sin la necesidad de escindir el ADN. Esto se realiza fusionando la proteína Cas9 con un dominio de activación de la transcripción para formar un complejo en el que el complejo no es capaz de escindir la secuencia de ácido nucleico objetivo. El procedimiento proporciona un ADN objetivo que dirige al ARN guía (es decir, corriente arriba del gen de RTP1) del dominio de activación de la transcripción que se fusiona a Cas9. En lugar de escindir el ADN para permitir la integración del promotor, se une y recluta transitoriamente factores de transcripción que activan el gen sin la necesidad de diseñar o modificar el genoma. Esto se puede hacer mediante el uso de una versión desactivada de Cas9 que se llama dCas9, que se fusiona a factores transcripcionales específicos que reclutan elementos como VP64, VPR y SAM, o mediante el uso de un ARN guía modificado (por ejemplo, un ARN guía truncado). Esta proteína de fusión no escinde el ácido nucleico.
Una realización, que se proporciona en la presente memoria es un procedimiento que comprende introducir un ácido nucleico que codifica un receptor olfativo dentro la célula.
Una realización adicional, que se proporciona en la presente memoria es un procedimiento para identificar un compuesto que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo en una célula no olfativa, en el que la célula se deriva de una línea celular mamífera y comprende un ADN donante que se introduce en el sitio objetivo genómico corriente arriba de un locus del gen de<r>TP1 endógeno, en el que el ADN donante comprende un promotor en el que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1, en el que el procedimiento comprende además:
a. poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora el receptor y
b. determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
En una realización, el receptor olfativo es del grupo que consiste en un receptor de almizcle y de mal olor.
En una realización particular, el receptor de mal olor se selecciona de un receptor de escatol o indol.
En una realización particular, el receptor de almizcle se selecciona de un receptor de almizcle policíclico y un receptor de almizcle nitro.
En una realización, los ácidos nucleicos que codifican un receptor de olor se introducen en ausencia sustancial de una proteína Golf.
En una realización, se llevan a cabo las siguientes etapas:
1. editar el genoma de una línea celular usando la tecnología CRISPR/Cas9, que incluye: (1) diseñar un ADN que codifique un 'ARN guía' específico para el sitio de integración de ADN genómico deseado ubicado cerca del locus del gen de RTP1 endógeno; y (2) un 'ADN donante' para que se integre en el locus genómico que comprende un promotor transcripcional constitutivamente activo;
2. introducir los ADN diseñados en la etapa 1 en una línea celular de mamífero;
3. seleccionar una línea celular que tiene integrado el ADN del donante en el locus genómico deseado y que produce un ARNm de RTP1 mediante la activación del gen de RTP1 endógeno.
4. introducir una secuencia de ADN del receptor de olor dentro de la línea celular seleccionada.
5. poner en contacto un receptor, quimera o fragmento con un compuesto y analizar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor de olor.
Los procedimientos proporcionados en la presente memoria permiten el uso de líneas celulares para descubrir ingredientes tales como potenciadores o bloqueadores de olor para uso cosmético e industrial (por ejemplo, perfumes, potenciadores de perfume, potenciadores de sabor, desodorantes para el hogar y el cuerpo). Los nuevos ingredientes pueden proporcionar perfiles de fragancia, toxicidad y biodegradación más favorables y/o exhibir una mayor potencia.
En consecuencia, se divulga en la presente memoria un compuesto o mezcla de compuestos que activa, imita, bloquea, inhiba, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo en una célula no olfativa que se obtiene por uno cualquiera de los procedimientos divulgados en la presente memoria.
En una realización, se proporciona un sistema de expresión heterólogo de expresión funcional mejorada del receptor de olor que usa CRISPR/Cas9 para activar específica y constitutivamente el gen de RTP1 que se silencia (inactiva) en células HEK293T regulares.
Definiciones
Los siguientes términos tienen los significados atribuidos a éstos, a menos que se especifique lo contrario.
"Gen endógeno" se refiere a un gen que se origina dentro de un organismo, tejido o célula.
La expresión "efectos funcionales" incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirectamente o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Incluye, pero no está limitado a, la unión de ligandos, cambios en el flujo de iones, potencial de membrana, flujo de corriente, transcripción, unión a proteínas G, fosforilación o desfosforilación de GPCR, interacciones receptor-ligando de transducción de señales, concentraciones de segundo mensajero (por ejemplo, AMPc, GMPc, IP3 o Ca intracelular2+), in vitro, in vivo y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como aumentos o disminuciones de la liberación de neurotransmisores u hormonas.
La expresión "determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad" en el contexto de los ensayos significa ensayos para un compuesto que aumenta o disminuye un parámetro que está indirectamente o directamente bajo la influencia de un miembro de la familia OR, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Tales efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, pero no está limitado a, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), hidrodinámica (por ejemplo, forma), cromatográfica o propiedades de solubilidad, pinzamiento de parche, colorantes sensibles al voltaje, corrientes de células enteras, eflujo de radioisótopos, marcadores inducibles, expresión génica de OR de ovocitos; cultivo celular de tejidos con expresión de OR; activación transcripcional de genes OR; ensayos de unión a ligandos; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; ensayos de flujo de iones; cambios en los mensajeros intracelulares secundarios como AMPc, GMPc e inositol trifosfato (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisores, y similares.
El término "vector de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante con el propósito de expresar una secuencia de ácido nucleico de la invenciónin vitrooin vivo,de manera constitutiva o inducible, en cualquier célula, que incluye células procariotas, de levaduras, fúngicas, vegetales, de insectos o de mamíferos. El término incluye sistemas de expresión lineales o circulares. El término incluye sistemas de expresión que permanecen episomales o se integran en el genoma de la célula huésped. Los sistemas de expresión pueden tener la capacidad de autorreplicarse o no, es decir, conducir solo la expresión transitoria en una célula. El término incluye casetes de expresión recombinante que contienen solo los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante.
Por "célula huésped" se entiende una célula que contiene un vector de expresión y soporta la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas tales comoE. coli,o células eucariotas tales como levaduras, insectos, anfibios o células de mamíferos tales como células CHO, HeLa, HEK-293 y similares, por ejemplo, células cultivadas, explantes y célulasin vivo.
"Inhibidores", "activadores", "contrarrestantes" y "moduladores" de genes o proteínas OR se usan indistintamente para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas mediante el uso de ensayosin vitroein vivopara la transducción olfativa, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, potenciadores y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente la estimulación, disminuyen, evitan, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la transducción olfativa, por ejemplo, los antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen, estimulan, aumentan, activan la apertura, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o regulan la transducción olfativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (por ejemplo, proteínas de unión a odorantes y otros miembros de la familia de vehículos hidrófobos); proteínas G; quinasas (por ejemplo, homólogos de rodopsina quinasa y beta quinasas de receptores adrenérgicos que están involucradas en la desactivación y desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan los receptores. Los moduladores pueden incluir versiones genéticamente modificadas de miembros de la familia OR, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos de origen natural o sintéticos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y similares. Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, expresar miembros de la familia OR en células o membranas celulares, aplicar compuestos moduladores putativos, en presencia o ausencia de moléculas de aroma o gusto, por ejemplo, almizcles o malos olores, y luego determinar los efectos funcionales sobre la transducción olfativa, como se describió anteriormente. Las muestras o ensayos que comprenden miembros de la familia OR que se tratan con un posible activador, inhibidor o modulador se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de modulación.
La región del "dominio N terminal" comienza en el N-terminal y se extiende hasta una región cercana al comienzo de la primera región transmembrana. "Dominio transmembrana", que comprende las siete "regiones transmembrana", se refiere al dominio de polipéptidos OR que se encuentra dentro de la membrana plasmática, y también puede incluir los lazos citoplasmáticos (intracelulares) y extracelulares correspondientes. Las siete regiones transmembrana y los lazos extracelulares y citoplasmáticos se pueden identificar mediante el uso de procedimientos estándares, como se describe en Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982), o en Stryer. La estructura secundaria y terciaria general de los dominios transmembrana, en particular los siete dominios transmembrana de los receptores acoplados a proteínas G, como los receptores olfativos, son conocidos en la técnica. Por lo tanto, la secuencia de estructura primaria se puede diseñar o predecir en base a secuencias de dominio transmembrana conocidas, como se describe en detalle a continuación. Estos dominios transmembrana son útiles para ensayosin vitrode unión a ligandos, tanto en fase soluble como sólida.
El término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma de simple o doble cadena. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término abarca, además, estructuras similares a ácidos nucleicos con cadenas principales sintéticas. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular implícitamente abarca las variantes de estos modificadas de forma muy conservadora (por ejemplo, las sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias, así como la secuencia que se indica explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación, por ejemplo, de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye con residuos con base mezclada y/o desoxiinosina.
Receptor de olor u "OR" se refiere a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados a proteínas G que se expresan en células olfativas. Las células receptoras olfativas también se pueden identificar en base a la morfología o mediante la expresión de proteínas expresadas específicamente en células olfativas. Los miembros de la familia OR pueden tener la capacidad de actuar como receptores para la transducción olfativa.
El receptor de olor o los ácidos nucleicos "OR" codifican una familia de receptores acoplados a proteínas G con siete regiones transmembrana que tienen actividad de receptor acoplado a proteínas G, por ejemplo, se pueden unir a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promover la producción de mensajeros secundarios como IP3, AMPc, GMPc y Ca2+ a través de la estimulación de enzimas como la fosfolipasa C y la adenilato ciclasa.
Los polipéptidos "OR" se consideran como tales si pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G de los 7 dominios transmembrana codificada por un solo exón de ~ 1 kb de longitud y exhibe motivos característicos de aminoácidos específicos del receptor olfativo. Los siete dominios predichos se denominan dominios "transmembrana" o "TM", TM I a TM VII que se conectan por tres dominios predichos de "lazo celular interno" o "IC", IC I a IC III, y tres dominios predichos de "lazo celular externo" o "EC", EC I a EC III. Los motivos se definen como, pero no están limitados a, el motivo MAYDRYVAIC superpuesto a TM III e IC II, el motivo FSTCSSH superpuesto a IC III y TM VI, el motivo PMLNPFIY en TM VII, así como tres residuos C conservados en EC II, y la presencia de residuos altamente conservados de GN en TM I [Zhang y Firestein (2002), The Olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5 (2):124-33; Malnic y otros, The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584-9].
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como de polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a las porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en igual relación entre sí. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce por vía recombinante, y tiene dos o más secuencias a partir de genes no relacionados dispuestos para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente y una región de codificación a partir de otra fuente. Del mismo modo, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en igual relación entre sí (por ejemplo, una proteína de fusión).
Un "promotor" se define como una serie de secuencias de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente memoria, un promotor incluye las secuencias de ácidos nucleicos necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de polimerasa tipo II, un elemento TATA. Un promotor además incluye opcionalmente los elementos potenciadores o represores distales, que se pueden localizar hasta diversos miles de pares de bases a partir del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que se activa bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se activa bajo la regulación ambiental o de desarrollo.
Como se usa en la presente memoria, el término "recombinante" se refiere a un polinucleótido que se sintetiza o manipula de cualquier otra manerain vitro(por ejemplo, "polinucleótido recombinante"), mediante el uso de procedimientos para el uso de polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o para un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. "Medios recombinantes" también abarca la ligadura de ácidos nucleicos que tienen diversas regiones codificadoras o dominios o secuencias promotoras de diferentes fuentes en un casete de expresión o vector para expresión de, por ejemplo, expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que comprende un dominio de translocación de la invención y una secuencia de ácido nucleico amplificada que usa un cebador de la invención.
El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos que se identifican y/o utilizan en la presente memoria se enumeran a continuación:
Secuencia objetivo de ARN guía (SEQ ID NO: 1 ADN)
SEQ ID NO: 1
ctgcaatctcagttcagggcc
ADN donante para la reparación homóloga dirigida (SEQ ID NO:2 ADN)
SEQ ID NO: 2
cagltattcagtacacagtcagctacaagcaclgacatagagcUggcacatglclgcaaaccctacccacatgcIcggalatgUtgaaa tgaatgaattaatgaaccggtctggggtcaacagcttgaatttgtatacaggctccgccatttataggctaggtgagtcctaggctcctgat clgíactgcagcaalagtaatcataacUaagagacctccaaltgtgUUgaaaalggcaaaglgctgglcacaagatggctggggaagc cgagagagaglUatlaltattgclccalclaclaacaaaUlacatctccccatccclcalUcIcctlggclgcctaaggcatcalggllacc gtagcagccagatgctgatgatgcctccaggggacggcaaggtgaaactgagccagttcccagtcctcacctccccatactctttccag gccagggtgagatggtctgaagctcagtctctggtcaggtcccccactctgtcttggatcatttagacccgcggccgcggcgcgcctcg gaattcgattgaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggca gaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccg cccattc(.ccgca;catggctgai;l.aal.UUUlaUtalgcagaggi;cgaggccg(xU;ggcclcLgagctaltccagaagl.agl.gagga ggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgcatgcctgcaggtcggccgccacgaccggtgccgccaccatcccctgaccca cgcccctgacccctcacaaggagacgaccttccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccg ggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgacccggaccgccacatcgagcgggtc accgagctgcaagaaclcUcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaagglgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggl ctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctg gccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgc ccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcc IggagacctccgcgccccgcaacetccccUclacgagcggctcggcIlcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaeeg cgcacctggtgcalgacccgcaagcccggtgcctgacgcccgccccacgacccgcagcgcccgaccgaaaggagcgcacgaccc catggctccgaccgaagccacccggggcggccccgccgaccccgcacccgcccccgaggcccaccgactctagaggatcataatc agccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgtt gttaacttgittattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcgaagttcctat IccgaagUcctaltclctagaaagtataggaacUcaalcactaglgaaUcacgcgdgacaUgaUaUgactagUaUaataglaatca aUacggggtcallagUcalagcccatatalggagltccgcgUacataacUacggfaaalggcccgccIggctgaccgcccaacgac ccccgcccaUgacgtcaalaatgacgtatgUcccatagtaacgccaatagggaclUccaUgacgtcaatggglggaglatttacggta aactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat gcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtac alcaalgggcgtggatagcggtttgaclcacggggalUccaagtclccaccccaUgacglcaatgggaglUgUUggcaccaaaalc aacgggaclüccaaaatglcgLaacaaclccgccccadgacgcaaalgggcggUggcglglacgglgggagglclalataagcag agclcgütaglgaaccglgütaaacctcUcagagaclccclcctccccaagclclglcltctggcaaccIgcctggügccgtggaaac aggtlccactgcggacaaaggagggagctgggtcctgcUccIcctggtcUglcgalgaggalUUagaccgtggagactgcgclgcc clgccctgcaccIaccclcactclccgtgUclcactaaggtggaaaltgccUccclcactactgacgagaccalglglaaaagcgtgac cacagalgaglggaagaaagtcUctalgagaagatggaggaggcaaagccggclgacagctgggacctcalcalagaccccaaccl caagcacaatgtgctgagccctggttggaagcagtacctggaattgcatgcttcaggcaggtgagtagcccaggaaagtggatccctg caggccgcctctaggtccctagctctggggcaccttccaaggagaggaagattacgtagaacccaagtgtttagcttcaatctcactatt aggctggcgtagactggaagtcagagaaagagtccctaactgggaactacgacacttgagttggatttcagctcttctactgatcacctg tgttactcttcctctctgagtcacaatttttccgtctggaaaataaagacatagaatatacgtatgagtcctacacactgacattttacatatttt ctattttaacagtctcttaaaaagtagtttaaaaccagagaagaagggtttgaggcccactgggggtcgagacgtccgtgctctggtcctg ggaccggtüaaatclaUtaa
Olfr741 de ratón (SEQ ID NO: 3 ADN; SEQ ID NO: 4 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 3 atgaaaaccctcagcagccccagcaactccagcaccatcactggcttcatcctcttgggcttcgcctaccccagggaggggcaaattct cctctttgtgatcttcttcattgtttacatactcattcttatgggcaacgcttccatcatctgtgctgtgtactgtgatcagagactccacacccc catgtaccttctgctggccaacttctccttcatggagattggatatgtcacctccacagtccccaacatgttggccaacttccttícagacac caaggtcatctctttctctggatgcttcctgcagttctatttcttcttctcctttggttctacagaatgctttttcctggcagtcatggcatttgatc gataccttgccatctgtaggccactacattatccttctctcatgactgggcgcctccgaaacacccttgtgaccagttgctgggtgcttggtt tcctctggttccctgtacccatcatcatcatctcccagatgtccttctgtgggtccagaattatagaccacttcctgtgtgacccaggccctct tttggcccttgcctgttccagagtcccattgatagaggttttctggtccattataatgtctatgctcctggttattcctttcctcttcatcatggga acttac¿itattggtcctaagagctgtgtttagacttccttcaagagaaggacaaaaaaaggctttctccacttgcgggtctcatctcacagta gUtcactcUttattgclcagtgalgataatgtatclgagcccaacatctgagcatgaggccggaalgcagaagcUglaactctallUaUc tgtgggtacaccactgcUaatcctalgatalacaglctgaggaacaaagalalgaaaaatgccctacagaagaUUga
SEQ ID NO: 4 mktlsspsnsstitgfillgfayprcgqillfviffivyililmgnasiicavycdqrlhtpmylllanftfmcigyvtstvpnmlanflsd
mqklvtlfysvgtpJlnpmiyslrnkdmknalqkilrt
Olfr742 de ratón (SEQ ID NO: 5 ADN; SEQ ID NO: 6 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 5 atgaaaaccctcagcagccccagcaactccagcaccatcactggcttcatcctcttgggcttcccctgccccagggaggggcaaatcct cctctttgtgaccttcttcattgtttacatactcattcttatgggcaatgcttccatcatctgtgctgtgtactgtgatcagagcctccacacccc catgtacttcctgctggccaacttctccttcctggagatctggtatgtcacctccacagtccccaacatgttggccaacttcctttcagacac caaggtcatctctttctctggatgcttcctgcagttctatttcttcttctcctttggttctacagaatgctttttcctggcagtcatggcatttgatc gataccttgccatctgtaggccactacattatccttctctcatgactgggcacctctgcaacatccttgtgatcagttgctgggtgcttggttt cctclggttccctgtacccatcalcalcalctcccagatgtccUctglggglccagaallatagaccacücctglglgacccaggccclcU ttggcccttgcctgttccagagccccattgatggaggttttctggacaattataatgtctatgctcctggttattcctttcctcttcatcatggga acttacatattggtcctaagagctgtgtttagacttccttcaagagatggacaaaaaaaggccttctccacttgcgggtctcatctcacagta gtUcactctUtaUgclcaglgalgaaaatglatltgagcccaacalcIgagcatgaagclggaalgcagaagcUglaactctaUUattcl gtgggtactccactacttaatcctgtgatatacagtctgaggaacaaagatatgaaaaatgccctgcagaagattttaagaacataa SEQ ID NO: 6 mktlsspsnsíítitgfillgfpcprcgqillfvtffivyililmgna'íiicavycdqslhtpmyfllanfsflciwyvtstvpnmlanfl'idt kvisfsgcflqfyfffsfgstecfflavmafdrylaicrplhypslmtghlcnilviscwvlgflwfpvpiiiisqmsfcgsriidhflcd pgpllalacsraplmevfwtiimsmllvipflfimgtyilvlravfi'lpsrdgqkkafstcgshltvvslfycsvmkmylsptschca gmqklvtlfysvgtpllnpviyslnikdmknalqkilrt
Olfr96 de ratón (SEQ ID NO: 7 ADN; SEQ ID NO: 8 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 7
atgggaatcctttccacaggaaatcaaaGtgtcactgagtttgtaettettggtttccatgaagteeGtgggctgcacctcGtgtttttttctgt gUcaccatcclclatgcclccatcalcacagggaacatgclcaUgcaglgglggtggtgagctcccagaggcUcacacacccalgtat ttctUctggtgaatctgtccltcatagagaUgtctatacctccacaglggtgcccaaaatgctggaaggcUcttacaggaggccaccala tclglggclggctgcUgclccagllcUtgltUlggclctctggccacagatgaglgUUctgctggclglgatggcalatgalcgatatclc gcaaUlgtcaccctclacgalacccacacctcalggggcctcaalgglgcclggggllgglgctcacaglclggctglclggcltcalgg tagalggactagUgUgctclgatggcccagUgagatlctglggccccaacttagUgatcacttUacLglgatUUcacclUgalgglcc tggclígclcagalacccaagtggcccaggtgactacatUgUcIclctgtgglcUcctgaclglccccUtgggclggltctgatctcclat gclcagaUglaglgaclgtgctgagagUccUclgggaccagaagaaccaaggccüclccacalgclcclclcacctggclgtgglgl ccacgUctatggaacactcatgglattgtacaUglgccctctgctgltcaUclcagclcctctccaaggtcaUgccclgclctacacagl gglcaclccca(cltcaaccctgtcalctacaccttgaggaaccaggaggtgcagcaggcactaagaaggcllc(claclgcaaaccaa ctgaaalgtga
SEQ ID NO: 8 Mgilstgnqtvtcfvllgfhcvpglhllffsvftilyasiitgnmliavvvvssqrlhtpmyfflvnlsficivytstvvpkmlcgflqcat isvagcllqffvfgslatdecfllavmaydrylaichplryphlmgpqwclglvllvwlsgímvdglvvalmaqlrfcgpnlvdhfy cdfsplmvlacsdtqvaqvltfvlsvvfltvpfglvlisyaqivvtvlrvpsgtrrtkafstcsshlavvstfygtlmvlyivpsavhsqll skviallytvvtpifnpviytlrnqevqqaliTllyckptem
OR11A1 humano (SEQ ID NO: 9 ADN; SEQ ID NO: 10 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 9 atggaaattgtctccacaggaaacgaaactattactgaatttgtcctccttggcttctatgacatccctgaactgcatttcttgttttttattgtatt cactgctgtctatgtcttcatcatcatagggaatatgctgattattgtagcagtggttagctcccagaggctccacaaacccatgtatattttct tggcgaatctgtccttcctggatattctctacacctccgcagtgatgccaaaaatgctggagggcttcctgcaagaagcaactatctctgtg gctggttgcttgctccagttctttatcttcggctctctagccacagctgaatgcttactgctggctgtcatggcatatgaccgctacctggca atUgclacccactccaclacccaclcclgatggggcccagacggtacatggggctgglgglcacaacclggctctclggatUgtggla galggactggUgtggccctgglggcccagclgaggttctglggccccaaccacatlgaccagUUaclglgactUatgclUlcgtggg cclggcltgclcggalcccagaglggclcaggtgacaaclclcaUclgtclglgUctgcclcaclaltccUllggaclgaUctgacalcll atgccagaatlgtgglggcaglgclgagagUcctgclggggcaagcaggagaagggclUctccacalgclcelcccacctagclgla gtgaccacaüctatggaacgclcatgalctUtalgltgcaccctclgclglccatlcccagclcclctccaagglcUclccclgclctacac tgtggtcacccctclcUcaalcclgtgalclataccatgaggaacaaggagglgcatcaggcacUcggaagaltclctglatcaaacaa aclgaaacacltgallga
SEQ ID NO: 10 Mcivstgnctitcfvllgfydipclhflffivftavyvfiiignmliivavvssqrlhkpmyiflanlsfldilytsavmpkmlcgflqca tisvagcllqffifgslatacclllavmaydrylaicyplhypllmgprryniglvvttwlsgfvvdglvvalvaqlrfcgpnhidqfyc dfmlfvglacsdprvaqvlllilsvfcltipfgliltsyarivvavlrvpagasrrrafslcsshlavvKfygtlmifyvapsavhsqllsk vfsllytvvtplfnpviytmrnkevhqalrkilcikqtetld
Olfr740 de ratón (SEQ ID NO: 11 ADN; SEQ ID NO: 12 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 11
atgaaaaccttcagcagccccatcaactccagcaccaccactggcttcattctcttgggcttcccctgccccagggaggggcaaatcct cctctttgtgctcttctccattgtctacctgcttaccctcatgggcaacacttgcatcatctttgcagtatgctgggatcagagactccacaca cccalgtacctactgclggccaacUclccttcctggagatctggtatgUacclccacaglccccaacatgUggccaaUlccíctctgac accaaggtcatctctttctctggatgcttcctgcagttctatttcttcttctccttgggttctacagaatgccttttcctggcagtcatggcatttg atcgataccttgccatctgtaggccactacattatcctgctctcatgactgggagcctctgcaacatccttgtgatcagttgctgggtgcttg gtttcctctggttccctgttcccatcatcatcatctcccagatgtccttctgtgggtccagaattatagaccacttcctgtgtgacccaggccc tctattggccctcacctgttccagagccccattaatggaggttttctggacaattataacatctcttatcctgttcgttcctttcctcttcatcatg ggatcttatacattggtcctgagagctgtgttcagagttccttcaagagatggacaaaaaaaggctttctccacttgcggatctcatctcac agtagltttactcUUalggctcagtgalgataatglatctaagcccgacclctgagcatgaagclggaatgcagaagcltgtgactclaUU aUclglggUactccaclcaUaatcclglgatatacagtctgaggaacaaggalatgaaacatgccctgcagaagatUtaagaacataaSEQ ID NO: 12mktfsspinsstttgfillgfpcprcgqillfvlfsivylltlrngntciifavcwdqrlhtpmylllanfsflciwyvtstvpnrnlanflsdt kvisfsgcflqfyfffslgsteclflavmafdrylaiciplhypalmtgslcnilviscwvlgflwfpvpiiiisqmsfcgsriidhflcdp gpllaltcsraplmevfwtiitslilfvpflfimgsytlvlravfrvpsrdgqkkafstcgshltvvllfygsvmimylsptseheagmq klvtlfysvvtplinpviysl rnkd mkh al qki 1 rt
OR1A1 humano (SEQ ID NO: 13 ADN; SEQ ID NO: 14 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 13atgagggaaaataaccagtcctctacactggaattcatcctcctgggagttactggtcagcaggaacaggaagatttcttctacatcctctt cttgttcatttaccccatcacattgattggaaacctgctcatcgtcctagccatttgctctgatgttcgccttcacaaccccatgtattttctcctt gccaacclclccUggUgacatcUcUctcalcgglaaccatccclaagalgclggccaaccatclcUgggcagcaaatccatctclUlg ggggatgcctaacgcagatgtatttcatgatagccttgggtaacacagacagGtatattttggGtgcaatggcatatgatcgagctgtggi: catcagccgcccacttcactacacaacaattatgagtccacggtcttgtatctggcttattgctgggtcttgggtgattggaaatgccaatg ccctcccccacactctgctcacagctagtctgtccttctgtggcaaccaggaagtggccaacttctactgtgacattacccccttgctgaa gttatcctgttctgacatccactttcatgtgaagatgatgtacctaggggttggcattttctctgtgccattactatgcatcattgtctcctatatt cgagtcttctccacagtcttccaggttccttccaccaagggcgtgctcaaggccttctccacctgtggttcccacctcacggttgtctctttg taüatggtacaglcatgggcacgtalttccgcccUtgaccaattalagcctaaaagacgcagtgatcactgtaalgtacacggcaglgac cccaalgUaaalcclUcatclacaglctgagaaatcgggacalgaaggctgccctgcggaaaclctlcaacaagagaalctcctcglgaSEQ ID NO: 14mrcnnqsstlcfdlgvtgqqcqcdffyilflfiypitlignllivlaicsdvi'lhnpmyfllanlslvdiffssvtipkmlanhllgsksisf ggcltqmyfmialgntdsyilaamaydravai srplhyttimsprsciwliagswvignanalphtlltaslsfcgnqevanfycdit pllklscsdihfhvkmmylgvgifsvpllciivsyirvfstvfqvpstkgvlkafstcgshltvvslyygtvmgtyfrpltnyslkdavi tvmytavtpmlnpfiyslrnrdmkaalrklfnkriss
Etiqueta Flag (SEQ ID NO: 15 ADN; SEQ ID NO: 16 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 15
gattacaaggacgacgacgataag
SEQ ID NO: 16
dykddddk
Etiqueta Rho (SEQ ID NO: 17 ADN; SEQ ID NO: 18 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 17
atgaacgggaccgagggcccaaacttctacgtgcctttctccaacaagacgggcgtggtg
SEQ ID NO: 18
mngtegpnfyvpfsnktgvv
Etiqueta Lucy (SEQ ID NO: 19 ADN; SEQ ID NO: 20 PROTEÍNA)
SEQ ID NO: 19
atgagaccccagatcctgctgctcctggccctgctgaccctaggcctggct
SEQ ID NO: 20
mrpqiMNaMtlgla
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son ilustrativos para la invención.
Ejemplo 1
Estrategia de edición del genoma para inducir la activación constitutiva del gen de RTP1 endógeno en células HEK293T.
Se describe una estrategia para desarrollar una expresión funcional mejorada del receptor de olor en el sistema de expresión heterólogo. Aprovechando una nueva tecnología de edición del genoma llamada CRISPR/Cas9, un gen de RTP1 endógeno que está silenciado (inactivo) en las células HEK293T normales, se activa de manera específica y constitutiva mediante la introducción de un promotor constitutivo (CMV) corriente arriba de su secuencia de codificación. Figura 1) El gen de RTP1 se encuentra en el cromosoma 3 y se muestra la secuencia de ADN alrededor de su sitio de inicio. La endonucleasa Cas9 está dirigida por un ARN guía (gRNA) de 20 pares de bases (pb) homólogo al objetivo. Tras la entrega a las células (GeneArt CRISPR Nuclease (enriquecido con CD4) Vector Kit, cat # A21175), la molécula de ARN guía y la proteína Cas9 forman un complejo activo que induce la ruptura de ADN de doble cadena deseada (DSB) corriente arriba de la secuencia de codificación. Los cuadros indican el gen de RTP1 en el cromosoma 3 (cuadro lleno, secuencia de codificación (CDS); cuadro abierto, región no traducida (UTR) en el exón). La supuesta región promotora corriente arriba del gen de RTP1 está inactiva en las células HEK293T. Se muestra la secuencia objetivo de ARN guía (SEQ ID NO: 1) entre la posición -150 y 131 y un Motivo Adyacente Protospacer (PAM) desde -153 hasta -151 desde el codón de inicio (ATG) respectivamente. Figura 1) El sitio DSB para la nucleasa Cas9, 3pb lejos del motivo PAM, que se especifica por un triángulo, permite que se inserte un ADN donante (SEQ ID NO: 2). Figura 2) Se muestra un esquema del procedimiento de inserción del promotor CMV. La configuración superior muestra el locus del gen de RTP1 antes de la modificación y el esquema inferior muestra el locus RTP1 después de que un ADN donante se dirige al sitio DSB mediante Reparación por Homología Directa (HDR). El ADN del donante está compuesto por un brazo de homología 5', un casete de selección de puromicina flanqueado por FRT (Objetivo de Reconocimiento a Flipasa), el promotor CMV y un brazo de homología 3'. La integración del promotor CMV corriente arriba del gen de RTP1 se obtiene luego por el mecanismo celular HDR inherente a las células eucariotas. Un plásmido donante que contiene dos ADN se estira homólogo a las secuencias a cada lado del punto de entrada deseado, flanqueando el casete de selección de resistencia a la puromicina (Puror) y el ADN del<c>M<v>se cotransfecta en células HEK293T El HDR resulta en la introducción de Puror y CMV corriente arriba de la secuencia de codificación de RTP1. El casete de selección de puromicina se puede retirar posteriormente mediante el uso de la enzima Flipasa.
Ejemplo 2
Selección de una línea celular modificada que expresa endógenamente el gen de RTP1.
Varias etapas de control ayudan a caracterizar la modificación de la línea celular y su integridad. Figura 3) Muestra un esquema de los alelos tipo salvaje y los recombinados. Las líneas grises indican las posiciones relativas del amplicón de los resultados experimentales de PCR y RT-PCR para el genotipado de ADN y para los controles de expresión de ARN, respectivamente (no a escala). Figura 4) Se extrae el ADN genómico de la línea celular resistente a la puromicina y se realiza una PCR que discrimina entre el tipo salvaje no recombinado (WT) y las líneas celulares modificadas (Mod.). La PCR 1 amplifica una banda de 2,0 kb solo en células HEK293T de tipo salvaje pero no en una línea celular modificada. La línea modificada debería producir una banda de 4,0 kb con la pCr 1 pero no probablemente debido a la longitud y la complejidad de la estructura genómica. Los resultados de genotipado para la línea celular modificada no pudieron producir la banda de 2,0 kb que indica una integración homocigótica del promotor CMV. La integración adecuada del ADN del donante se probó adicionalmente con la PCR 2 y 3, como se indica. Figura 5) Después de la extracción del ARNm y la síntesis de ADNc, se realiza un experimento de RT-PCR para demostrar que el ARNm de RTP1 se expresa específicamente en la línea celular modificada pero no en las células HEK293T originales. Esto confirma que el promotor de CMV que se integró en el locus genómico objetivo conduce adecuadamente la expresión del gen de RTP1. La especificidad de las bandas de RT-PCR se confirmó por secuenciación directa de las bandas amplificadas. La transcripción reversa negativa (RT-) y las condiciones de PCR y GAPDH indican la ausencia de ADN genómico contaminante y la presencia de ADNc en todas las muestras, respectivamente.
Ejemplo 3
Caracterización de la expresión de la proteína RTP1.
La expresión de la proteína RTP1 en la línea celular modificada seleccionada se determinó por medio de análisis de transferencia Western mediante el uso de un anticuerpo específico para RTP1. Una forma de proteína larga (RTP1L) y una corta (RTP1S) se pueden originar a partir del gen de RTP1 endógeno. La estrategia de modificación del genoma que se describe en la presente memoria implicó la introducción del promotor CMV corriente arriba del codón de inicio de RTP1L para evitar cualquier modificación de la secuencia de codificación endógena; por lo tanto, se esperaba que RTP1L se expresara. Sin embargo, los resultados indican que la línea celular modificada estaba fuertemente sesgada hacia la expresión de RTP1S, lo que sugiere que el gen de RTP1 endógeno expresa preferentemente la versión corta sin edición del genoma adicional. Esta última es la versión preferida, ya que se sabe que promueve mejor la expresión del receptor de olor en la superficie celular. Figura 6) muestra las transferencias Western de la proteína RTP1. Las puntas de flecha indican los tamaños de proteína esperados para RTP1S - 25 kDa, RTP1L - 28 kDa y la proteína de control p-actina - 42 kDa. Se muestra la ausencia de la proteína RTP1 en una línea celular HEK293T de tipo salvaje (WT) y la presencia de RTP1S en la línea celular modificada (Mod.). Sorprendentemente, se puede ver una banda mucho más fuerte para RTP1S en comparación con RTP1L. La extracción de proteína de membrana se preparó de acuerdo con el kit de extracción de proteína de membrana Mem-Per Plus (Pierce, cat # 89842). Se utilizó como marcador de peso Chameleon Duo Pre-stained (LiCor, cat#92860000). El etiquetado se realizó con los siguientes anticuerpos primarios: Anti-RTPl de conejo (Invitrogen, cat#PA5-24028) y anti-p-actina de ratón (Pierce, cat#PIMA515739). La detección se realizó con los siguientes anticuerpos secundarios: anti-conejo de cabra (LiCor cat#925-32211) y anti-ratón de cabra (LiCor cat#925-68070). Las imágenes se realizaron en un Odyssey CLx (LiCor).
Ejemplo 4
Caracterización funcional de varios receptores de olor en la línea celular modificada.
Se realizaron experimentos de dosis-respuesta funcional para evaluar el nivel de mejora funcional de la actividad de los receptores de olor en la línea celular modificada. Los receptores de olor se modificaron en su N-terminal con secuencias o etiquetas cortas de polipéptidos [por ejemplo, Flag (SEQ ID NO: 15), Rho (SEQ ID NO: 17; 20 primeros aminoácidos del receptor de rodopsina bovina) o Lucy (SEQ ID NO: 19)], expresado transitoriamente en células WT o HEK293T modificadas, y se estimuló con compuestos olorosos para determinar la actividad de los receptores. Figuras 7 y 8) Usando un ensayo de unión a olores basado en células, se probó la actividad de Olfr741 (SEQ ID NO: 4) y Olfr742 (SEQ ID NO: 6) para indol en el diseño de la línea celular RTP1 y se comparó con HEK293T que carece de la expresión de la proteína RTP1. Los receptores de olor se transfectaron en ambas líneas celulares y se expusieron a concentraciones crecientes de indol. La actividad inducida por olor se detectó midiendo el nivel de aumento de AMPc en el citosol usando un kit basado en HTRF (CisBio, kit cAMP dynamic 2, cat#62AM4PEJ). Figura 9 y 10) Usando el mismo ensayo de unión a olores basado en células, se probó la actividad de Olfr96 (SEQ ID NO: 8) y OR11A1 (SEQ ID NO: 10) para vulcanólido en el diseño de la línea celular de expresión de RTP1 y se comparó con HEK293T que carece de la expresión de la proteína RTP1. La actividad de Olfr740 (SEQ ID NO: 12) para indol también se probó en ambos fondos celulares. Se registra un aumento de la actividad del receptor dependiente de la dosis para todos los OR en la línea celular RTP1 modificada y no en la línea celular de control no modificada que carece de expresión de RTP1. Además, la actividad de OR1A1 (SEQ ID NO: 14) para carvona- (-) se probó en ambos fondos celulares. Aunque OR1A1 se puede expresar en HEK293T regular, se registra un aumento más potente de la actividad del receptor dependiente de la dosis en la línea celular RTP1 modificada y se compara con la línea celular de control no modificada que carece de expresión de RTP1.
Claims (14)
1. Una célula que comprende un ADN donante introducido en el sitio objetivo genómico corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno, en la que el ADN donante comprende un promotor en el que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1, y en la que la célula se deriva de una línea celular mamífera.
2. La célula según la reivindicación 1, que comprende además un ácido nucleico que codifica un receptor de olor.
3. La célula según la reivindicación 2, en la que el receptor de olor se selecciona del grupo que consiste en receptores de olor de indol, escatol y almizcle.
4. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende una proteína Cas o una proteína dCas fusionada a un dominio de activación transcripcional.
5. Un procedimiento para activar un gen de RTP1 endógeno en una célula eucariota, en el que la célula se deriva de una línea celular mamífera, que comprende:
a. introducir un ARN guía complementario a un sitio genómico objetivo corriente arriba del gen de RTP1; y b. introducir una proteína nucleasa Cas para producir un complejo con el ARN guía para formar un complejo de ARN guía-proteína Cas.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además la introducción de un ADN donante que comprende un promotor en el sitio genómico objetivo corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno en el que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1.
7. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el complejo comprende además una proteína dCas9 fusionada a un dominio de activación transcripcional, en el que el dominio de activación impulsa la expresión del gen de RTP1.
8. El procedimiento según las reivindicaciones 5-7, en el que la proteína Cas es una proteína Cas9 o una nicasa Cas9.
9. El procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además la escisión de la secuencia de ácido nucleico objetivo adyacente a la secuencia de ARN guía con el complejo de ARN guía-proteína Cas.
10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, que comprende además la introducción de un ácido nucleico que codifica un receptor de olor en la célula.
11. Un procedimiento de identificación de un compuesto o mezcla de compuestos que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo en una célula no olfativa, en el que la célula se deriva de una línea celular mamífera y comprende un ADN donante introducido en el sitio objetivo genómico corriente arriba de un locus del gen de RTP1 endógeno, en el que el ADN donante comprende un promotor en el que el promotor impulsa la expresión del gen de RTP1, en el que el procedimiento comprende además:
a. poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto o mezcla de compuestos que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora el receptor; y
b. determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el receptor olfativo es del grupo que consiste en un receptor de almizcle y de mal olor.
13. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el receptor de mal olor se selecciona de un receptor de escatol o indol, y en el que el receptor de almizcle se selecciona de un receptor de almizcle policíclico y de nitro almizcle.
14. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que la célula de mamífero es una célula no olfativa, en particular una célula humana no olfativa.
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