ES2768338T3 - Procedimientos para identificar, aislar y utilizar receptores de odorantes y aromas - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento in vitro para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo seleccionado del grupo que consiste en receptores de odorantes o aromas que se activa por un compuesto seleccionado del grupo que consiste en el indol y el escatol, que comprende a) poner en contacto al menos un receptor, o una quimera o fragmento de la misma, con un compuesto, en el que el receptor es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; b) medir la medida en la que el compuesto bloquea, inhibe, modula o mejora la actividad del receptor; y c) identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula o mejora la respuesta del receptor olfativo.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para identificar, aislar y utilizar receptores de odorantes y aromas
Campo
El campo técnico está dirigido a receptores de odorantes y aromas y a ensayos que pueden utilizarse para identificar compuestos odorantes y/o aromas y, más específicamente, a inhibidores o neutralizadores de compuestos de mal olor tales como el indol, o el escatol.
Antecedentes
El olfato es uno de los sistemas sensoriales humanos más complejos y peor comprendidos. Desde la activación de los receptores olfativos (OR) hasta la percepción, hay muchos pasos que aún requieren una investigación más profunda. Si pudiéramos entender cómo el código OR de odorantes específicos y de mezclas se traduce en la percepción, entonces podríamos explotar ese conocimiento para aportar un beneficio significativo en varias áreas. Estas áreas incluyen moduladores de olor como los neutralizadores del mal olor que bloquean la percepción de los olores desagradables, nuevos ingredientes de sabor y fragancia que reemplacen a los compuestos no biodegradables o tóxicos, y potenciadores de olor que limitarían nuestra dependencia de compuestos difíciles de obtener de fuentes naturales. El paradigma combinatorio del "código olfativo" se centra en la observación de que un solo OR puede activarse mediante múltiples odorantes, y por otro lado la mayoría de los odorantes son capaces de activar varios OR. En el genoma del ratón hay -1200 OR distintos. Los humanos, por el contrario, tienen -400. En ambos casos, el repertorio de OR se activa con muchos miles de odorantes en el mundo y es esta complejidad combinatoria la que permite el abanico de sensaciones olfativas que podemos percibir. Sin embargo, desde el 2010 se han identificado odorantes o ligandos solo para 82 OR de ratón (-77%) y 17 OR de humano (-44%) utilizando procedimientos tradicionales de identificación de odorantes activadores (deorphanization). Además, no se ha comprobado la relevancia fisiológica de la mayoría de los ligandos para los OR humanos, identificados fundamentalmente in vitro.
En la literatura se han descrito diferentes procedimientos de identificación de odorantes de activación de OR [por ejemplo, Touhara 2007 Deorphanizing vertebrate olfactory receptors: Recent advances in odorant-response assays Neurochem Int 51, 132-139 and Saito y col. (2009) Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal 2, ra9 and Peterlin y col. (2014), The State of the Art of Odorant Receptor Deorphanization: a Report from the Orphanage, J Gen Physiol; 143(5): 527-42]. Muchos de estos procedimientos se basan exclusivamente en ensayos celulares en los que el Or se expresa en células no olfativas que son adecuadas para el cribado de alto rendimiento. Sin embargo, los OR a menudo quedan retenidos en el retículo endoplasmático de tales células heterólogas. Al fallar el desplazamiento hacia la superficie celular, los OR son por tanto incapaces de interactuar con el odorante [Min y col. (2004) Endoplasmic reticulum degradation impedes olfactory G-protein coupled receptor functional expression. BMC Cell Biol 5, 34]. Por tanto, un enfoque sistemático en el que de cientos a miles de líneas celulares diferentes, en el que cada línea celular posee una proteína OR única en la que puede evaluarse la actividad odorante, no es un enfoque adecuado para la decodificación completa de las interacciones combinatorias entre los odorantes y los OR ya que muchos o la mayoría de los receptores no funcionan correctamente en tales líneas celulares. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos procedimientos que puedan identificar de forma rápida y fiable el subconjunto relativamente pequeño de los OR, dentro de todo el abanico de OR que existen en un organismo, que se activan o se inhiben específicamente por uno o más odorantes. También existe la necesidad de un procedimiento que implique la identificación de OR a partir de las propias neuronas olfativas, en el que se presupone que los OR son completamente funcionales, evitando así los de sobra conocidos desafíos de los ensayos de OR en células no olfativas.
Los compuestos de mal olor tales como el indol, el escatol (3-metil-indol) y el p-cresol generan olores desagradables que surgen, por ejemplo, de las letrinas y otras fuentes del "baño" que contienen materia fecal. Por lo tanto, son convenientes neutralizadores del mal olor que enmascaran o reducen, por ejemplo, el olor humano de los compuestos. Hay una necesidad de identificar receptores de odorantes y, más particularmente, receptores de malos olores. También se han identificado receptores que se unen al indol y al escatol y se han descubierto y presentado los compuestos que se unen a esos receptores como moduladores potenciales del mal olor. Sin embargo, la rápida identificación del abanico completo de receptores que se unen a malos olores, particularmente receptores de indol o de escatol sigue siendo deseable debido a los numerosos OR que existen en los mamíferos. También se desean ensayos basados en nuevos receptores de mal olor para identificar nuevos compuestos potentes que se unen a estos receptores.
El documento WO 2012/169644 se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto inhibidor del mal olor que comprende: añadir una sustancia de ensayo y una sustancia causante de mal olor a por lo menos un receptor olfativo seleccionado del grupo que consiste en OR5P3, OR2W1, OR5K1, OR8H1, y un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad en la secuencia de aminoácidos con respecto a uno cualquiera de los polipéptidos mencionados; medir la respuesta del receptor olfativo a la sustancia causante del mal olor; -identificar, basándose en la respuesta medida, la sustancia de prueba que puede suprimir la respuesta del receptor olfativo; y seleccionar, como un inhibidor de mal olor, la sustancia de prueba que puede suprimir la respuesta del receptor olfativo; en el que el mal olor es un olor a escatol o un olor a indol.
Sumario
La invención está definida por las reivindicaciones enmendadas.
En el presente documento se proporciona un procedimiento para identificar receptores olfativos que se activan por un compuesto odorante o por un aroma, que comprende:
a) disociar un epitelio olfativo aislado que contiene neuronas olfativas nativas en células individuales de una especie de mamífero no humano en la que cada neurona expresa un receptor olfativo;
b) cargar las células olfativas con un tinte indicador que permita medir la actividad de unión a receptores de odorantes o aromas de los receptores olfativos;
c) poner en contacto los receptores olfativos con compuestos odorantes o de aroma de forma secuencial;
d) medir los cambios en la actividad neuronal inducida por el odorante o aroma;
e) aislar una o más neuronas olfativas que se activaron por un compuesto odorante o de aroma;
f) amplificar el ARNm de los receptores olfativos aislados;
g) secuenciar al menos una porción del transcriptoma del ARNm mediante secuenciación de nueva generación; y h) determinar la identidad de un grupo de receptores olfativos seleccionados del grupo que consiste en receptores de odorante y aroma mediante la comparación de la secuencia del transcriptoma con una secuencia del genoma de referencia de la misma especie y de otras especies de vertebrados.
Además, en el presente documento se proporciona un procedimiento para identificar receptores olfativos que se activan por un compuesto de mal olor, que comprende:
a) disociar un epitelio olfativo aislado que contiene neuronas olfativas nativas en células individuales de una especie de mamífero no humano en la que cada neurona expresa un receptor olfativo;
b) cargar las células olfativas con un tinte indicador que permita medir la actividad de unión a receptores de mal olor de los receptores olfativos;
c) poner en contacto los receptores olfativos con compuestos de mal olor de forma secuencial;
d) medir los cambios en la actividad neuronal inducida por odorante;
e) aislar una o más neuronas olfativas que se activaron por un compuesto de mal olor;
f) amplificar el ARNm de los receptores olfativos aislados;
g) secuenciar al menos una porción del transcriptoma del ARNm mediante secuenciación de nueva generación; y h) determinar la identidad de un grupo de receptores olfativos de mal olor comparando la secuencia del transcriptoma con una secuencia del genoma de referencia de la misma especie y de otras especies de vertebrados.
En el presente documento se proporciona, además, una secuencia aislada de ácido nucleico que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 85.
En el presente documento también se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada como se describe anteriormente que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86.
En el presente documento se proporciona además un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86.
También se proporciona además una célula que está modificada de forma recombinante para expresar un polipéptido, descrito anteriormente.
Además se proporcionan ensayos para identificar compuestos que se unen a receptores de odorantes de indol y/o escatol. En particular, en el presente documento se proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo que se activa por un compuesto seleccionado del grupo que consiste en indol y escatol, que comprende
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento con un compuesto;
b) ensayar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor; en el que el receptor es un polipéptido descrito anteriormente.
En una realización, la actividad del compuesto se determina comparando su unión con la del indol y/o el escatol. En otra realización, el receptor se pone en contacto con un compuesto en presencia de escatol y/o indol bajo condiciones que permiten la unión del compuesto junto con el escatol y/o el indol al receptor.
En una realización adicional, proporcionada en el presente documento, cuando se utiliza un ensayo funcional para medir la actividad de unión, el paso de medir una actividad de señalización de receptores proporcionados en el presente documento puede comprender la detección de un cambio en el nivel de un segundo mensajero. En otra realización, se proporciona la medición de una actividad de señalización en la que el paso de medir una actividad de señalización comprende la medición de la unión/acoplamiento o intercambio de nucleótidos de guanina, la actividad adenilato ciclasa, AMPc, la actividad proteína quinasa C, la actividad proteína quinasa A, la descomposición de fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, flujo de calcio, ácido araquidónico, la actividad MAP quinasa, la actividad tirosina quinasa, ensayo de melanóforos, un ensayo de inicialización de receptores o la expresión de genes reporteros. En una realización particular proporcionada en el presente documento, la medición de la actividad de señalización comprende utilizar un ensayo de fluorescencia o luminiscencia. Los ensayos de fluorescencia y luminiscencia pueden comprender el uso de fluoróforos sensibles a Ca2 incluyendo 00flu03Flu04 15 o Fura, (sondas moleculares); familia Ca3-kit (Molecular Device) y aequorina.
Descripción detallada de los dibujos
La figura 1 muestra una visión general esquemática del procedimiento de identificación de odorantes activadores (deorphanization) de receptores de mal olor.
La figura 2 muestra gráficos de imagenología de Ca2+ de 6 neuronas sensoriales olfativas independientes activadas específicamente tanto por indol como por escatol (50 pM de cada uno).
La figura 3 muestra genes de receptores de mal olor identificados usando los procedimientos indicados en el presente documento.
Las figuras 4A y 4B muestran receptores de mal olor humanos y otros receptores de mal olor de ratones dentro de las familias Olfr740 (4A) y Olfr665 (4B) identificadas utilizando los procedimientos indicados en el presente documento.
Las figuras 5A a 5E muestran la actividad con indol y escatol de los OR de ratón Olfr743, Olfr746 y Olfr740 en células HEK293T.
Las figuras 6A a 6J muestran la actividad con indol y escatol de los receptores humanos OR52N2, OR11G2, OR5AC2, OR4C15, OR8S1, OR11H6 y OR11H4 y de los receptores de ratón Olfr665 y Olfr740 en células HEK293T.
La figura 7 muestra la inhibición de la actividad del receptor de indol Olfr743 en células HEK293T de un compuesto de prueba.
Descripción detallada
Para las descripciones del presente documento y las reivindicaciones adjuntas, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. De forma similar, "comprende", "que comprende", "incluye", y "que incluye" son intercambiables y no pretenden ser limitativos.
Debe entenderse además que, cuando las descripciones de diversas realizaciones utilizan el término "que comprende", los expertos en la materia deben entender que, en algunos casos específicos, una realización puede describirse de forma alternativa utilizando el vocabulario "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".
Definiciones
Los siguientes términos tienen el significado que se les atribuye a menos que se especifique lo contrario.
"OR" se refiere a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados a proteína G que se expresan en células olfativas. Las células receptoras olfativas también pueden identificarse basándose en la morfología o por la expresión de proteínas expresadas específicamente en las células olfativas. Los miembros de la familia de OR pueden tener la capacidad de actuar como receptores para la transducción olfativa.
OR de "indol" y/o "escatol" se refiere a un miembro de la familia de receptores acoplados a proteína G que se expresa en una célula olfativa, uniéndose y/o activándose dichos receptores por el indol y/o el escatol en un ensayo de unión o de actividad para identificar ligandos que se unen y/o activan GPCR. Tales ensayos se describen a continuación. Los receptores de indol y/o de escatol del presente documento incluirán fragmentos, variantes, que incluyen las sintéticas y las producidas de forma natural, y quimeras que responden o se unen al indol y/o al escatol.
Los ácidos nucleicos de "OR" codifican una familia de GPCR con siete regiones transmembrana que tienen "actividad de receptor acoplado a proteína G", por ejemplo, pueden unirse a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promover la producción de segundos mensajeros tales como IP3, AMPc, GMPc y Ca2+ a través de la estimulación de enzimas tales como la fosfolipasa C y la adenilato ciclasa.
Los polipéptidos "OR" se consideran como tales si pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G de 7 dominios transmembrana codificados por un solo exón de ~1 kb de largo y exhiben motivos de aminoácidos específicos de receptores olfativos característicos. Los siete dominios se denominan dominios "transmembrana" o "TM" de TM I a TM VII conectados por tres dominios de "bucle celular interno" o "IC" de IC I a IC III, y tres dominios de "bucle celular externo" o "EC" de EC I a EC III. Los motivos se definen como, pero sin estar restringido a, el motivo MAYDRYVAIC que se superpone a TM III y IC II, el motivo FSTCSSH que se superpone a IC III y TM VI, el motivo PMLNPFIY en TM VII, así como tres restos de C conservados en EC II, y la presencia de restos de GN altamente conservados en TM I ((Zhang y Firestein (2002), The Olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5(2):124-33; Malnic y col., The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584-9).).
La región del "dominio N terminal" comienza en el extremo N-terminal y se extiende a una región cercana al comienzo de la primera región transmembrana. El "dominio transmembrana", que comprende las siete "regiones transmembrana", se refiere al dominio de los polipéptidos OR que se encuentra dentro de la membrana plasmática, y también puede incluir los correspondientes bucles citoplasmáticos (intracelulares) y extracelulares. Las siete regiones transmembrana y los bucles extracelulares y citoplasmáticos pueden identificarse utilizando procedimientos estándar, como se describe en Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982), o en Stryer. La estructura general secundaria y terciaria de los dominios transmembranal, en particular de los siete dominios transmembrana de los receptores acoplados a proteína G tales como los receptores olfativos, son conocidas en la técnica. Por tanto, la secuencia de la estructura primaria puede diseñarse o predecirse basándose en secuencias de dominio transmembrana conocidas, como se describe en detalle a continuación. Estos dominios transmembrana son útiles para los ensayos de unión a ligando in vitro, tanto en fase soluble como en fase sólida.
La frase "ensayo funcional" en el contexto de los ensayos para probar compuestos que modulan la transducción olfativa mediada por miembros de la familia OR incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirecta o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, un parámetro funcional, efectos físicos y químicos. Esto incluye la unión de ligandos, cambios en el flujo de iones, potencial de la membrana, flujo de corriente, transcripción, unión de la proteína G, fosforilación o desfosforilación de GPCR, interacciones receptor-ligando en la transducción de señales, concentraciones de segundos mensajeros (por ejemplo, AMPc, GMPc, IP3, o Ca2+ intracelular), in vitro, in vivo y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como aumentos o disminuciones de la liberación de neurotransmisores u hormonas. En el presente documento se incluyen ensayos funcionales para un compuesto que aumenta o disminuye un parámetro que está indirecta o directamente bajo la influencia de un miembro de la familia OR, por ejemplo, un parámetro funcional, efectos físicos y químicos. Tales ensayos funcionales o efectos pueden medirse por cualquier medio conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), hidrodinámica (por ejemplo, en la forma), propiedades cromatográficas, o propiedades de solubilidad, fijación de membranas, tintes sensibles al voltaje, corrientes de célula entera, descarga de radioisótopos, marcadores inducibles, expresión de genes OR de ovocito; expresión de OR en un cultivo celular; activación transcripcional de genes OR; ensayos de unión a ligando; voltaje, potencial de membrana y cambios en la conductancia; ensayos de flujo de iones; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como el AMPc, el GMPc y el inositol trifosfato (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisores, y similares.
Los "inhibidores", "activadores", "neutralizadores" y "moduladores" de los genes o proteínas OR se utilizan indistintamente para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas utilizando ensayos ex vivo, in vitro e in vivo para la transducción olfativa, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcialmente o totalmente la estimulación, disminuyen, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la transducción olfativa, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen, estimulan, aumentan, activan, facilitan, favorecen la activación, sensibilizan o regulan positivamente la transducción olfativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (por ejemplo, proteínas de unión a odorantes, ebnerina y otros miembros de la familia de transportadores hidrófobos); proteínas G; quinasas (por ejemplo, homólogos de la rodopsina quinasa y de quinasas de receptores beta adrenérgicos que participan en la desactivación y desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan los receptores. Los moduladores pueden incluir versiones modificadas genéticamente de miembros de la familia de los OR, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos producidos de forma natural y sintéticos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y similares. Tales ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, expresar miembros de la familia OR en las células o en membranas celulares, aplicar supuestos compuestos moduladores, en presencia o ausencia de moléculas de sabor o fragancia, por ejemplo, sabores dulces o malos olores, y luego determinar los efectos funcionales sobre la transducción olfativa, como describe anteriormente. Para examinar el alcance de la modulación, se comparan muestras o ensayos que comprenden miembros de la familia de los OR que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial con muestras control sin el inhibidor, activador o modulador. A las muestras control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor de actividad OR relativo del 100 %. La inhibición de un OR se logra cuando el valor de actividad OR relativo al control es de aproximadamente el 80 %, opcionalmente del 50 % o del 25-0 %. La activación de un OR se logra cuando el valor de actividad OR relativo al control es un 110 %, opcionalmente un 150 %, opcionalmente un 200-500 %, o un 1000-3000 % más alto.
Los términos "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado", como se usan en el presente documento, se refieren al estado de estar libre de otros compuestos distintos con los que el compuesto de la descripción está asociado normalmente en su estado natural, de forma que el objeto "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado" comprende al menos el 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % o 20 % y, preferentemente, al menos el 50 % o 75 % de la masa, en peso, de una muestra determinada. En una realización preferida, estos términos se refieren al compuesto de la descripción que comprende al menos el 95 % de la masa, en peso, de una muestra determinada. Como se usa en el presente documento, los términos "purificado", "sustancialmente purificado", y "aislado", cuando se refieren a un ácido nucleico o a una proteína, de ácidos nucleicos o proteínas, también se refieren a un estado de purificación o concentración diferente al producido de forma natural en el cuerpo de un mamífero, especialmente en el cuerpo humano. Cualquier grado de purificación o concentración mayor que el que se produce de forma natural en el cuerpo de un mamífero, especialmente en el cuerpo humano, incluyendo (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos con los que normalmente no está asociado en el cuerpo de un mamífero, especialmente en el cuerpo humano, están dentro del significado de "aislado". El ácido nucleico o la proteína, o las clases de ácidos nucleicos o proteínas, descritos en el presente documento, pueden aislarse o asociarse de otra manera con estructuras o compuestos con los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de procedimientos y procesos conocidos por los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado", cuando se refiere a un ácido nucleico o polipéptido, se refiere a un estado de purificación o concentración diferente al que se produce de forma natural en el cuerpo de un mamífero, especialmente en el cuerpo humano. Cualquier grado de purificación o concentración mayor que el que se produce de forma natural en el cuerpo, incluyendo (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados que se producen de forma natural, o (2) la asociación con estructuras o compuestos con los cuales no está normalmente asociado en el cuerpo, está dentro del significado de "aislado" como se usa en el presente documento. Los ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en el presente documento pueden aislarse o asociarse de otra manera con estructuras o compuestos con los cuales no están normalmente asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de procedimientos y procesos conocidos para los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, los términos "amplificar" y "amplificación" se refieren al uso de cualquier metodología de amplificación adecuada para generar o detectar un recombinante de un ácido nucleico expresado de forma natural, como se describe en detalle, a continuación. Por ejemplo, la descripción proporciona procedimientos y reactivos (por ejemplo, pares de cebadores de oligonucleótidos degenerados específicos) para la amplificación (por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa, PCR) de los ácidos nucleicos de la descripción expresados de forma natural (por ejemplo, genómicos o ARNm) o recombinantes (por ejemplo, ADNc) in vivo o in vitro.
La expresión "receptor 7- transmembrana" designa a un polipéptido que pertenece a una superfamilia de proteínas transmembrana que tienen siete dominios que abarcan la membrana plasmática siete veces (por lo tanto, los siete dominios se denominan dominios "transmembrana" o "TM" TM I a TM VII). Cada una de las familias de receptores olfativos y ciertos receptores gustativos pertenecen a esta superfamilia. Los polipéptidos de los receptores 7-transmembrana tienen estructuras primarias, secundarias y terciarias similares y características, como se discute con más detalle a continuación.
La expresión "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. La expresión también abarca estructuras similares a ácidos nucleicos con esqueletos sintéticos. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como también la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse mediante la generación, por ejemplo, de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye por restos de base mixta y/o desoxiinosina.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y a polímeros de aminoácidos no naturales. El término "heterólogo", cuando se utiliza haciendo referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma proporción entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para formar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente. De forma similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma proporción entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión o una quimera).
Como se usa en el presente documento, "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o manipulado de otra manera in vitro (por ejemplo, un "polinucleótido recombinante"), a procedimientos de utilización de polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en las células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. "Medios recombinantes" se refiere también a la ligación de ácidos nucleicos que tienen varias regiones o dominios codificantes o secuencias promotoras de diferentes fuentes en un casete de expresión o vector de expresión de, por ejemplo, expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que comprende un dominio de translocación de la descripción y una secuencia de ácido nucleico amplificada utilizando un cebador de la descripción.
La expresión "vector de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante con el fin de expresar una secuencia de ácido nucleico de la descripción in vitro o in vivo, de forma constitutiva o inducible, en cualquier célula, incluyendo una célula procariota, levadura, célula fúngica, célula vegetal, célula de insecto o de mamífero. La expresión incluye sistemas de expresión lineales o circulares. La expresión incluye sistemas de expresión que permanecen episomales o se integran en el genoma de la célula hospedadora. Los sistemas de expresión pueden tener la capacidad de autoreplicarse o no, es decir, de dirigir únicamente la expresión transitoria en una célula. El término incluye la expresión recombinante de "casetes que contienen solo los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante".
Por "célula hospedadora" se entiende una célula que contiene un vector de expresión y favorece la replicación o expresión del vector de expresión. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, de insecto, anfibio o mamífero tales como CHO, HeLa, HEK-293 y similares, por ejemplo, células cultivadas, explantes y células in vivo.
En una realización del presente documento se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que tiene al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 85.
En una realización del presente documento se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada como se describe anteriormente que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86.
En una realización adicional se proporciona en el presente documento una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86, o un fragmento biológicamente activo de tal polipéptido.
En una realización adicional del presente documento se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86, o un fragmento biológicamente activo de tal polipéptido.
En una realización adicional del presente documento se proporciona un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86, o un fragmento biológicamente activo de tal polipéptido.
Para los fines de la presente descripción, un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la descripción es un fragmento de tal polipéptido capaz de exhibir la actividad de señalización del receptor del cual es un fragmento. Tal fragmento puede exhibir el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o sustancialmente toda la actividad de señalización del receptor del que es un fragmento.
Un procedimiento permite a un experto en la materia identificar rápidamente el subconjunto relativamente pequeño de receptores de odorantes (OR), dentro del total de la población de ~1.200 OR que existen en el genoma de los roedores, cuyos homólogos genéticos humanos probablemente codifican una característica de olor específica en los seres humanos. La figura 1 es una visión general esquemática del procedimiento. El tejido olfativo intacto del epitelio del ratón (OE) se disocia mediante un tratamiento mecánico y enzimático en células individuales. Las neuronas sensoriales olfativas individuales (OSN) resultantes se colocan en cubreobjetos de vidrio y se cargan con un tinte indicador de calcio (por ejemplo, Fura-2) para detectar la actividad celular. Los cubreobjetos se colocan después en una cámara de perfusión y se bañan en una solución salina fisiológica. Los odorantes de prueba de mal olor se diluyen en una solución salina fisiológica y se perfunden sobre las células. La actividad de la OSN se detecta entonces realizando un seguimiento de los cambios en el flujo de calcio intracelular a través de un cambio en la fluorescencia de Fura-2 y un microscopio de fluorescencia. Es importante, en algunos casos, que solo uno o dos de los -1200 genes OR posibles se expresan en una determinada OSN. Esto significa que la actividad de una determinada OSN se dirige exclusivamente por un solo tipo de proteína OR expresada en la superficie celular. Un sistema semiautomático de imagenología de calcio con un sistema de inyección de odorante finamente controlado y una platina móvil permite el seguimiento de -2500 OSN en un solo experimento. Con -1200 genes OR en ratón, este rendimiento asegura un muestreo representativo de todo el abanico de OR. Utilizando una pipeta de vidrio se recogen una o más OSN que responden a uno o más odorantes de prueba y se desplazan en un microtubo para la posterior extracción de aRn, amplificación y secuenciación de nueva generación (NGS) de transcriptomas de las OSN. Se ha presentado en la literatura lasecuenciación de transcriptomas basada en NGS a partir de cantidades muy pequeñas de material inicial (<100 células). Sin embargo, no se ha aplicado todavía para el fin específico de identificación de odorantes activadores del receptor acoplado a proteína G (GPCR) que se sepa; en particular, de receptores olfativos. Utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, si se desea, se pueden agrupar varias OSN en el mismo microtubo. Después, las lecturas de secuencia de partida se mapean con respecto a un genoma de referencia, se inspeccionan visualmente para la alineación y anotación apropiadas, y se analizan para el mapeo de falsos positivos debidos a, por ejemplo, secuencias repetidas del genoma. El resultado es una lista de OR de ratón candidatos que probablemente se activen por el mismo o los mismos odorantes de prueba de mal olor utilizados para cribar las OSN de ratón. Las secuencias de proteínas OR de ratón candidatas se utilizan entonces para consultar (por ejemplo, BLASTP) bases de datos públicas del genoma del ratón para obtener una lista completa de secuencias de OR de ratón candidatas. Estos candidatos están relacionados por homología de secuencia (es decir, son parálogos) con las secuencias de OR derivadas de NGS identificadas originalmente de las neuronas que se activaron por indol y/o escatol. La lista completa de los parálogos de ratón (derivados de NGS y BLASTP) se utiliza después para consultar bases de datos públicas del genoma humano para obtener una lista de secuencias de OR humanas candidatas que están relacionadas (es decir, ortólogas) con las secuencias de OR de ratón. El resultado es una lista completa de Or candidatos de ratón y de humano que probablemente se activen por los odorantes de prueba. Para confirmar la actividad de los genes de OR candidatos resultantes, pueden clonarse ADNc de dichos genes en vectores de expresión disponibles y transfectarse en células cultivadas que puedan someterse a un cribado de alto rendimiento (por ejemplo, HEK293T). Las líneas celulares resultantes, conteniendo cada una de ellas un ADNc de un OR candidato expresado de forma recombinante, posteriormente pueden examinarse en un ensayo de actividad basado en células con los odorantes de prueba utilizados en la imagenología de calcio y otros odorantes relacionados con la estructura o la organoléptica.
En una realización particular, se aísla el epitelio olfativo que contiene la neurona olfativa nativa de un mamífero no humano (por ejemplo, un ratón) y se disocia en células individuales de acuerdo con, por ejemplo, Araneda y col. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756. En una realización particular, cada neurona expresa solo uno o dos receptores a la vez. El tejido olfativo utilizado para generar las neuronas olfativas es, en una realización, de un mamífero no humano que tiene datos disponibles públicamente sobre los receptores y las secuencias asociadas. Esto incluye tejido de ratón, rata y hámster. El protocolo de disociación debe optimizarse para asegurar una alta tasa de neuronas supervivientes registrables. En una realización particular se registraron un mínimo de aproximadamente 1500 neuronas sensoriales distintas.
En una realización adicional, el indicador se selecciona a partir de un tinte indicador de calcio fluorescente, una proteína indicadora de calcio, un indicador fluorescente de AMPc, una proteína reportera mediada por el elemento de respuesta a AMPc (CRE), un ensayo bioquímico HTRF de AMPc, un ensayo de beta-arrestina o un registro electrofisiológico. Particularmente, se selecciona un tinte indicador de calcio que puede utilizarse para realizar un seguimiento de la actividad de los receptores olfativos expresados en la membrana de las neuronas olfativas (por ejemplo, Fura-2 AM).
En una realización particular, los compuestos se examinan secuencialmente y se miden los cambios en la fluorescencia del tinte de calcio dependientes de los odorantes utilizando un microscopio de fluorescencia o un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
A modo de ejemplo, se aíslan neuronas olfativas después del cribado con uno o más compuestos de mal olor utilizando un microelectrodo de vidrio acoplado a un micromanipulador o una máquina FACS. Más particularmente, se aísla al menos 1 neurona. Las neuronas sensoriales olfativas de los ratones se criban mediante imagenología de Ca2+, de forma similar a los procedimientos descritos anteriormente (Malnic y col.; Areneda y col., 2004). Particularmente, se utiliza una platina de microscopio móvil motorizada para aumentar el número de células que pueden examinarse hasta al menos 1500 por experimento. Dado que hay aproximadamente 1200 receptores olfativos diferentes en el ratón y cada neurona sensorial olfativa expresa solo 1 o 2 de los 1200 genes de receptores olfativos, esta capacidad de cribado cubrirá prácticamente todo el repertorio de receptores de odorantes de ratones. En otras palabras, la combinación de imagenología de calcio para el cribado de neuronas sensoriales olfativas de alto rendimiento lleva a la identificación de casi todos los receptores de odorantes que responden a un perfil particular de odorantes. En un aspecto particular, pueden aislarse odorantes que responden tanto al indol como al escatol, dos compuestos de mal olor de letrinas comunes.
Para la imagenología de calcio de las neuronas olfativas, puede diseccionarse el epitelio olfativo principal de un ratón antes de la disociación neuronal. El epitelio olfativo diseccionado puede entonces transferirse a un tampón de disociación para la disociación mecánica y enzimática. Las neuronas disociadas pueden entonces sembrarse en un cubreobjetos permitiendo el cribado de miles de células por microscopía de fluorescencia y las células pueden cargarse con un tinte sensible al calcio (Fura-2 AM), por ejemplo, durante aproximadamente 30 minutos a 31 °C y transferirse al microscopio listo para el cribado. Las células se estimulan mediante la perfusión de soluciones diluidas de odorantes (en solución salina fisiológica) sobre las neuronas olfativas disociadas. Las células raras que responden al compuesto de mal olor se identifican, por ejemplo, estimulando los receptores con 50 pm de los compuestos de mal olor y luego realizando un seguimiento del flujo intracelular de Ca2+ indicado por los cambios en la fluorescencia de Fura-2. Después del análisis, las células que responden pueden recuperarse de un cubreobjetos de vidrio con una micropipeta de succión. Las células aisladas se agrupan entonces en una muestra para la posterior identificación de los genes de los receptores de odorantes expresados como ARNm en las células que responden.
En una realización particular, el ARNm de las neuronas olfativas se purifica y amplifica según el procedimiento descrito generalmente en Marko, N. F., y col., (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi:10.1186/1471-2164-6-27 (procedimiento de Eberwine). Al menos una porción del transcriptoma (hasta incluir todo el transcriptoma) se secuencia utilizando la secuenciación de nueva generación (NGS) o se hibrida con genes conocidos utilizando tecnologías de micromatrices. La NGS se discute y describe de menra general en Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11(1), 31-46; doi:10.1038/nrg262. En una realización particular, se agrupa un mínimo de 5 neuronas que presentan el mismo perfil de respuesta y el ARNm se amplifica mediante dos rondas consecutivas de transcripción in vitro (IVT). El ARNm se libera mediante lisis celular inmediatamente después de la recolección; no se lleva a cabo ningún paso de purificación ni de ADNasa. La amplificación se puede realizar de acuerdo con el kit de ARNa de MesageAmplI (Ambion, AMA1751) con los siguientes parámetros: dos rondas de IVT consecutivas de 14 horas de duración.
En una realización adicional, la identidad de un grupo o familia de genes de receptores olfativos de mal olor se determina (por ejemplo, hasta el número de neuronas recogidas) comparando los resultados de la NGS con una secuencia del genoma de referencia de la misma especie. Particularmente, los supuestos receptores de malos olores serán los ARNm más abundantes en la muestra de NGS derivada de la neurona olfativa o que estén presentes en más de una réplica biológica independiente. Debido a la naturaleza combinatoria del código olfativo (un compuesto activa muchos OR y un OR puede ser activado por muchos compuestos), el hecho de agrupar varias neuronas activadas por compuestos dados permite la recuperación de prácticamente todos los receptores responsables de la percepción de estas moléculas en un solo experimento de NGS. Por lo tanto, agrupar neuronas funcionalmente similares mejora enormemente el rendimiento y la velocidad de identificación de odorantes activadores.
Después se usan herramientas bioinformáticas estándar para identificar el o los receptores de odorantes humanos más estrechamente relacionados con otros posibles receptores de mal olor de mamíferos (no humanos) bajo el supuesto de que las secuencias de receptores homólogos conservan una función similar. Adipietro y col. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8(7): e1002821. doi:10.1371/journal.pgen.1002821. Pueden utilizarse parámetros por defecto del algoritmo BLASTP y/o BLASTN.
El receptor de mal olor humano o de mamíferos no humanos puede adaptarse a un ensayo funcional que puede utilizarse para identificar compuestos que imitan, bloquean, modulan y/o mejoran la actividad de un compuesto de mal olor. En particular, el ensayo puede ser un ensayo celular y el procedimiento para identificar compuestos puede ser un ensayo de cribado de alto rendimiento. Más particularmente, en el presente documento se proporcionan ensayos basados en receptores adaptables para el cribado de alto rendimiento de receptores con bibliotecas de compuestos para el descubrimiento de compuestos de modulación (por ejemplo, bloqueantes, potenciadores y enmascaradores).
En una realización particular, las secuencias del gen del receptor de mal olor se identifican a partir de las células sensibles al indol y al escatol como se indica a continuación: se calientan neuronas agrupadas a 75 °C durante 10 minutos para romper la membrana celular y hacer que su ARNm esté disponible para su amplificación. Este paso de amplificación es importante cuando se aplican tecnologías de NGS con una cantidad limitada de material de partida, típicamente entre 1 y 15 células. Una amplificación lineal de acuerdo con el procedimiento de Eberwine (IVT) asegura el mantenimiento de los niveles relativos de transcripción de los genes expresados. Se utilizan dos rondas consecutivas de transcripción in vitro durante la noche (14h) para producir cantidades suficientes de ARNc; El ARNc amplificado se utiliza entonces para generar una librería de ADNc HiSeq de Illumina. Las secuencias cortas resultantes de típicamente 75-150 pares de bases (comúnmente conocidas como "lecturas") se alinean frente al genoma de referencia del ratón (tal como la versión UCSC mm9 o mm10) con el fin de construir el transcriptoma completo de estas células. El análisis cuantitativo de los datos del transcriptoma produce una lista de genes transcritos de los receptores de odorantes y sus respectivos niveles de expresión. Los genes de receptores de odorantes que muestran los niveles más abundantes de ARNm (las "lecturas" más abundantes) o están presentes en más de una réplica del experimento se consideran supuestos receptores de indol y escatol.
Los genes OR de ratón predichos se utilizan entonces para extraer las últimas versiones de las bases de datos de genomas tanto de ratones como de seres humanos con el fin de identificar los receptores más estrechamente relacionados (es decir, la mayor similitud de secuencia) en el ratón (genes parálogos) y en el humano (genes ortólogos). Este procedimiento puede realizarse utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST (disponible públicamente en el sitio web del NCBI), una herramienta de búsqueda de similitudes de secuencia, en la que cada supuesta secuencia genética obtenida previamente del análisis inicial del transcriptoma se utiliza como secuencia de consulta. Los genes recién identificados que se han identificado por este procedimiento de extracción de datos también se consideran receptores de mal olor potenciales, bajo el supuesto de que los genes parálogos y ortólogos tienen una gran probabilidad de poseer actividades similares. En una realización particular, la comparación por pares de la homología de secuencia se lleva a cabo para identificar los receptores estrechamente relacionados en el ratón y en los humanos utilizando el siguiente esquema iterativo: Paso de secuencia de consulta BLASTN/BLASTP Resultado candidato de ratón 1 ^ Parálogo de ratón 1 y ortólogo humano 1 Parálogo de ratón ^ O rtó lo g o humano 2 Ortologo humano 1^-Parálogo humano 1 Ortólogo humano 2^-Parálogo humano 2 Parálogo = homólogo en la misma especie Ortólogo = homólogo en otras especies. Los genes parálogos se alinean entonces usando una herramienta de alineación múltiple para generar un árbol filogenético. Los datos funcionales in vitro pueden interpretarse a la luz de dicha relación filogenética entre receptores estrechamente relacionados pero distintos. Este paso es esencial en la identificación de familias completas de genes OR que respondan, en diversos grados, a los compuestos de prueba, por ejemplo indol y escatol. Para completar el procedimiento de identificación de odorantes activadores, los genes OR candidatos se expresan además in vitro para confirmar su actividad frente a los compuestos utilizados para aislar las neuronas sensoriales olfativas y otros compuestos de interés estructuralmente relacionados. En una realización, para completar el procedimiento de identificación de odorantes activadores, los genes OR candidatos se expresan además in vitro para confirmar la actividad contra los compuestos utilizados inicialmente para aislar dichas neuronas sensoriales olfativas. Los mismos genes OR candidatos expresados in vitro se criban además con otros compuestos de interés estructuralmente relacionados.
Los siguientes receptores han sido identificados directamente por secuenciación (NGS) del transcriptoma de las neuronas olfativas que responden a los malos olores del indol y del escatol (OR de ratón), utilizando el proceso y el procedimiento descritos en el presente documento. Los receptores de indol y escatol humanos con el mayor grado de identidad de aminoácidos con los OR de los ratones se identificaron posteriormente mediante la búsqueda en las bases de datos de genomas disponibles (tabla 1). Los receptores de ratón Olfr740 y Olfr665 se identificaron inicialmente a través del procedimiento de NGS descrito en el presente documento, después de escoger las células que respondieron a la exposición tanto al indol como al escatol. Los correspondientes receptores humanos homólogos, OR11G2 y OR52N2, respectivamente, se identificaron además mediante comparaciones de similitud de secuencias de aminoácidos. Como se demuestra en los ejemplos 4 y 5, los receptores de ratón candidatos Olfr740 y Olfr665 y sus homólogos humanos OR11G2 y OR52N2 se activaron in vitro por indol y por escatol y por lo tanto se describen como receptores de indol y/o escatol. De forma similar, los receptores de ratón candidatos Olfr 746, Olfr745, Olfr207, Olfr1211 y Olfr257 condujeron a la identificación de los receptores humanos OR11H4, OR11H6, OR5AC2, OR4C15 y OR8S1, respectivamente, siguiendo los mismos pasos. Estos genes OR humanos también respondieron tanto al indol como al escatol in vitro. Tomados en conjunto, siete de los siete supuestos receptores humanos probados e identificados por el procedimiento descrito en el presente documento se confirmaron como receptores de indol y de escatol, apoyando además el procedimiento para la identificación eficiente de los receptores de indol y de escatol humanos.
Este enfoque del procedimiento de identificación de odorantes activadores de receptores de odorantes tiene varias ventajas importantes sobre los procedimientos de RT-PCR de célula única previamente establecidos. En primer lugar, al agrupar múltiples neuronas que comparten propiedades de unión similares a los olores y/o aromas, un único experimento de secuenciación de ARNm (NGS) identifica prácticamente todos los receptores que se activan por los compuestos de mal olor diana. Por lo tanto, el rendimiento es mayor que el que se había logrado anteriormente. En segundo lugar, debido a que varias células pueden agruparse en una muestra, este enfoque permite la selección de genes a través de una comparación exhaustiva de las muestras replicadas a través de los experimentos. En tercer lugar, la NGS no requiere el uso de cebadores de PCR específicos para un OR. la NGS tampoco requiere el uso de cebadores degenerados específicos para los OR, que son problemáticos y a menudo conducen a falsos positivos debido a una amplificación de PCR no lineal o no específica. En particular, ya que las secuencias que codifican los OR se encuentran dentro de un único exón, la contaminación de la muestra con ADN genómico puede conducir fácilmente a una amplificación inespecífica de las secuencias del gen OR. En cuarto lugar, el análisis de RT-PCR es difícil de realizar en muestras agrupadas debido a la tasa inherente de falsos positivos. Se han realizado experimentos de hibridación de ARNm de célula única utilizando chips de micromatriz de ADN de alta densidad. Sin embargo, este enfoque es generalmente menos sensible que la NGS y se restringe aún más a los genes conocidos para los que se deben sintetizar las correspondientes sondas de ADN. Por lo tanto, el uso de la NGS es significativamente ventajoso para identificar rápidamente el OR y, en última instancia, da lugar a una selección más precisa de receptores candidatos en comparación con los enfoques estándar (por ejemplo, RT-PCR y micromatrices).
En una realización adicional, los receptores de ratón identificados de neuronas olfativas aisladas que responden tanto al indol como al escatol se modifican en su extremo N-terminal con una secuencia polipeptídica corta (por ejemplo, el receptor de rodopsina bovina - Rho, o Flag), se expresan transitoriamente en células HEK 293T y se estimulan por separado con indol y escatol para confirmar su identidad como receptores de indol/escatol fidedignos. La co-expresión de la subunidad alfa G humana Ga0lf (SEQ ID NO: 21) activa la vía de transducción de G que conduce a un aumento interno del AMPc al unirse al ligando apropiado. Los resultados confirman la identidad de Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), Olfr743 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) y Olfr746 (SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38) como receptores de indol-escatol.
En otro aspecto, se identificó el receptor humano OR52N2 (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12) debido a su similitud de secuencia con Olfr665 de ratón (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10), un receptor de indol/escatol aislado de neuronas olfativas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). Se identificó el receptor humano OR11G2 (SEQ ID NO: 13 y SEQ iD NO: 14) por su similitud de secuencia con el Olfr740 de ratón (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID nO: 2), un receptor de indol/escatol aislado de neuronas olfativas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). Se identificó el receptor humano OR5AC2 (SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76) por su similitud de secuencia con el Olfr207 de ratón (SEQ iD NO: 77 y SEQ ID NO: 78), un receptor de indol/escatol aislado de neuronas olfativas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). Se identificó el receptor humano OR4C15 (SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80) por su similitud de secuencia con el Olfr1211 de ratón (SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82), un receptor de indol/escatol aislado de neuronas olfativas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). Se identificó el receptor humano OR8S1 (SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84) por su similitud de secuencia con el Olfr257 de ratón (SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86), un receptor de indol/escatol aislado de neuronas olfativas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). El receptor de ratón Olfr665 (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10) se identificó directamente a partir de datos de NGS de neuronas olfativas aisladas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). El receptor de ratón Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) se identificó directamente a partir de datos de NGS de neuronas olfativas aisladas que responden tanto al indol como al escatol (ejemplo 6). El receptor de ratón Olfr736 (SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28) se identificó debido a su similitud de secuencia con el Olfr740 de ratón (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), un receptor indol/escatol aislado de neuronas olfativas y que no respondió al indol o al escatol probablemente debido a la falta de expresión en la superficie celular. El receptor de ratón Olfr747 (SEQ ID NO: 39 y SeQ ID NO: 40) y Olfr748 (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42) también se identificaron por su similitud de secuencia con el Olfr740 de ratón (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y excepcionalmente no respondieron al indol o al escatol a pesar de la expresión apropiada en la superficie celular evaluada por ensayos de inmunotinción. Esto recalca la naturaleza de diversificación de los receptores olfativos en los que secuencias muy similares no siempre comparten el mismo perfil de respuesta.
Los receptores se modifican con la secuencia Rho y se expresan de forma estable en células HEK 293T. La co­ expresión de la subunidad alfa G humana Ga-i5 activa la vía de transducción de Gq que conduce a un aumento interno de Ca2+ al unirse al ligando apropiado.
El proceso anterior y los resultados obtenidos hasta ahora sirven para validar el procedimiento para la identificación rápida y fiable de receptores de odorantes de mamíferos para compuestos de mal olor.
También se proporciona además una célula que está modificada de forma recombinante para expresar un polipéptido descrito anteriormente.
Además se proporcionan ensayos para identificar compuestos que se unen a receptores de odorantes de indol y/o escatol. En particular, en el presente documento se proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo que se activa por un compuesto seleccionado del grupo que consiste en indol y escatol, que comprende
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) ensayar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor; en el que el receptor es un polipéptido descrito anteriormente.
En una realización, la actividad del compuesto se determina comparando su unión con la del indol y/o el escatol. En otra realización, el receptor o una quimera o fragmento del mismo se pone en contacto con un compuesto en presencia de escatol y/o indol en condiciones que permiten la unión del compuesto junto con el escatol y/o indol al receptor.
En una realización adicional, un compuesto se pone en contacto con un receptor, o una quimera o fragmento del mismo que se activa por un compuesto seleccionado del grupo que consiste en el indol y el escatol en el que el receptor, o una quimera o fragmento del mismo, se expresa en una célula que está modificada de forma recombinante para expresar el polipéptido.
La actividad del compuesto puede determinarse utilizando sistemas de cribado in vivo, ex vivo, in vitro y sintéticos.
En otra realización, el contacto se realiza con liposomas o con membranas que forman vesículas por inducción con virus que contienen el polipéptido descrito en el presente documento.
En otra realización, los procedimientos para identificar compuestos que se unen a los receptores que se unen al escatol y/o al indol, puede realizarse en una fracción de membrana de células que expresan los polipéptidos descritos en el presente documento. En otra realización,
Los ejemplos siguientes son solo ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito de la invención como se establece en el sumario, en la descripción o en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
Cribado de neuronas sensoriales olfativas de ratón para identificar los receptores que se unen al indol y/o al escatol
Se aisló el epitelio olfativo que contenía la neurona olfativa nativa de un ratón y se disoció en células individuales y luego se transfirió a un tampón de disociación para una disociación mecánica moderada y enzimática. Para optimizar el protocolo de disociación, se siguió el procedimiento general para la elaboración del tampón de disociación fresco, tal como se establece en Araneda y col. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756 con las siguientes modificaciones: ADNasa I en lugar de ADNasa II, concentración de Ca2+ elevada a 5 mM y pH ajustado a 7,35 a 32 °. Las neuronas disociadas se sembraron entonces en un cubreobjetos que permitía el cribado de >2500 células por microscopía de fluorescencia. Las células se cargaron entonces con un tinte sensible a calcio (Fura-2 AM) durante 30 minutos a 31 °C y se transfirieron a un microscopio listo para el cribado. Las neuronas olfativas disociadas se cribaron como se ha descrito anteriormente (Malnic y col.; Araneda y col., 2004), pero con una platina de microscopio móvil motorizada para aumentar el número de células que pueden cribarse. Las células se estimularon entonces por la perfusión de soluciones diluidas de odorantes (en solución salina fisiológica) sobre las neuronas olfativas disociadas.
Las neuronas olfativas que respondieron al indol y al escatol se identificaron estimulando receptores con 50 pm de indol seguidos de 50 pm de escatol y realizando un seguimiento del flujo intracelular de Ca2+ indicado por cambios en la fluorescencia de Fura-2. En la figura 2 se muestran gráficos de imagenología del Ca2+ de 7 neuronas sensoriales olfativas independientes activadas específicamente tanto por el indol como por el escatol (50 pM de cada uno). Todas las células también se estimularon con 20 pM de forskolina (fork), un producto farmacológico activador de la enzima adenilato ciclasa ACIII, para confirmar la viabilidad e identidad neuronal de las células. Las unidades de escala de tiempo están en el eje X, 6 fotogramas por segundo. Intensidad media de fluorescencia, unidad fluorescente relativa como resultado de un registro radiométrico de 340/380 nm.
Ejemplo 2
Aislamiento y amplificación de ARNm de células sensibles al indol y al escatol para generar secuencias de ADNc del gen de "mal olor" para los receptores sensibles de indol y escatol
Las neuronas sensoriales olfativas activadas del ejemplo 1 se aislaron utilizando una micropipeta de succión de vidrio y luego se agruparon en una muestra para la posterior identificación de los genes de los receptores de odorantes expresados como ARNm en las células que respondieron. Las secuencias de genes del receptor de mal olor se identificaron en las células sensibles al indol y al escatol como se indica a continuación: Se aislaron cuatro conjuntos de más de cinco (5) neuronas olfativas (6, 10, 15 y 15 células cada uno) activadas por uno o más compuestos de mal olor, utilizando un microelectrodo de vidrio unido a un micromanipulador. Se diseñaron micropipetas a partir de vidrio borosilicatado (Artículo # B150-86-10, Sutter Instruments) y se sometieron a tracción con un puller de microelectrodos (Modelo P-1000, Sutter Instruments) en las siguientes condiciones: Calor, rampa de temperatura 20 °C; Tracción = 0; Vel = 120; Presión = 500. Las puntas de las pipetas sometidas a tracción se rompieron manualmente y se fijaron en un micromanipulador Newport (modelo MW3R) para aislar las neuronas sensoriales olfativas activadas por el indol y el escatol, como se determinó en un ensayo de imagenología de calcio. Las OSN activadas se aislaron por medio de una succión moderada aplicada en el extremo posterior de la micropipeta.
El ARNm de las neuronas se purificó y amplificó de acuerdo con el procedimiento de Eberwine (kit de ARNs MessageAmp II - Ambion, AM1751). Las neuronas agrupadas se calentaron a 75 °C durante 10 minutos en un tampón de resuspensión (sistema SuperScript III Cells Direct cDNA, 46-6321-Invitrogen) para romper la membrana celular y hacer que su ARNm esté disponible para su amplificación. Una amplificación lineal de acuerdo con el procedimiento de Eberwine (transcripción in vitro) asegura el mantenimiento de los niveles relativos de transcripción de los genes expresados. La primera hebra de ADNc se obtuvo de acuerdo con el kit Ambion con una incubación de 2 h a 42 °C. La síntesis de la segunda hebra de ADNc se realizó utilizando el mismo kit después de una segunda incubación durante 2 h a 16 °C. El ADNc de doble cadena se utilizó como molde para generar el correspondiente ARNc (14 h de incubación a 37 °C), que luego se purificó. Estos pasos de síntesis de ARNc se repitieron para una segunda IVT. Las dos rondas consecutivas de transcripción in vitro durante la noche (14 h) para producir cantidades suficientes de ARNc; El ARNc amplificado se utilizó entonces para generar una biblioteca de ADNc HiSeq de Illumina. La secuencia del transcriptoma completo se obtuvo entonces por secuenciación de nueva generación (NGS).
La identidad de los receptores olfativos de mal olor del ratón, específicamente de indol y/o escatol, se determinó comparando los resultados de la NGS con una secuencia del genoma de referencia de la misma especie. Para ello, las secuencias cortas resultantes de 150 pares de bases (comúnmente denominadas lecturas) derivadas de NGS se alinearon frente al genoma de referencia del ratón (versión de UCSC mm9 o mm10) para construir el transcriptoma completo de estas células. El análisis cuantitativo de los datos del transcriptoma produjo una lista de los genes transcritos de receptores de odorantes y sus respectivos niveles de expresión. Los genes de receptores de odorantes que mostraron niveles abundantes de ARNm (lecturas abundantes) o que estaban presentes en más de un experimento repetido se consideraron receptores candidatos de indol y escatol y se exponen en la figura 3, que resume los resultados representativos de NGS de 4 experimentos independientes de recogida de células con indol/escatol. Las barras representan genes de OR candidatos de indol/escatol con los ARNm más abundantes que se retuvieron después de la inspección visual. El eje Y representa los niveles de abundancia de ARNm normalizados al nivel de ARNm de OMP, teniendo en cuenta el número de OSN seleccionadas por muestra. Asterisco (*), receptores identificados en más de un experimento. Una OMP (proteína marcadora olfativa) es un biomarcador específico para las neuronas olfativas maduras. Mediante el acoplamiento de la imagenología de calcio y la NGS como se describe anteriormente, se identificaron las siguientes 5 secuencias de receptores como los supuestos OR de indol y de escatol de ratón: Olfr665 (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10), Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), Olfr741 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4), Olfr743 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) y Olfr745 (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
Ejemplo 3
Identificación de los receptores de mal olor de ratón y humanos
La identificación de un subconjunto de 5 OR de indol y de escatol entre ~1200 OR en el genoma del ratón mediante el acoplamiento de la imagenología de calcio y la NGS (ejemplos 1-2) permitió la identificación rápida de OR de ratón adicionales y de OR de indol y escatol nuevos mediante procedimientos in silico. Es probable que los OR con una identidad de aminoácidos general similar muestren perfiles de respuesta a los odorantes similares [Adipietro y col. (2012)], se aumentó una lista de OR de indol y escatol candidatos mediante la consulta de bases de datos públicas del genoma humano y de ratones con las secuencias de OR de ratones derivadas del análisis de NGS de neuronas sensoriales olfativas sensibles a indol/escatol aisladas por imagenología de calcio. La identidad de los receptores olfativos de mal olor de ratón se determinó comparando los resultados de la NGS con una secuencia del genoma de referencia de la misma especie. Los supuestos receptores de mal olor serán los ARNm más abundantes en la muestra de NGS derivada de la neurona olfativa o que estén presentes en más de una réplica biológica independiente, pero no en una muestra de control que carece de neuronas olfativas que responden al mal olor o a los malos orlores. Se utilizaron herramientas bioinformáticas estándar para identificar el o los receptores de odorantes humanos más estrechamente relacionados con el o los supuestos receptores de odorantes de los mamíferos (no humanos) bajo el supuesto de que los receptores de secuencia homóloga conservan una función similar (Adipietro y col. (2012)). Se utilizaron los parámetros por defecto del algoritmo BLASTP y/o BLASTN. En la tabla 1 se enumeran los receptores de odorantes (OR) de ratón identificados y los ortólogos humanos predichos.
_____________________________________ Tabla 1_____________________________________
OR de ratón identificados por NGS Ortólogos humanos Identidad de aminoácidos Olfr665 (SEQ ID NO: 10) OR52N2 (SEQ ID NO: 12) 77 %
Olfr740 (SEQ ID NO: 2) OR11G2 (SEQ ID NO: 14) 77 %
Olfr741 (SEQ ID NO: 4) OR11G2 (SEQ ID NO: 14) 73 %
___________________________________(continuación)__________________________________
OR de ratón identificados por NGS Ortólogos humanos Identidad de aminoácidos Olfr743 (SEQ ID NO:6) OR11G2 (SEQ ID NO: 14) 75%
Olfr745 (SEQ ID NO:8) OR11H6 (SEQ ID NO: 16) 82%
Las secuencias de proteínas humanas relacionadas están dentro de al menos un 60 % de identidad de secuencia con las secuencias de Or de ratón identificadas por NGS que figuran en la tabla 1. Se proporcionan niveles de identidad en relación con la comparación de secuencias de aminoácidos por pares después del algoritmo BLASTP. Se identificaron veintiséis (26) nuevos OR humanos y de ratones mediante consultas con BLASTP de bases de datos genómicas públicas (parámetros por defecto). Dieciséis (16) estaban estrechamente relacionados con los genes derivados de NGS Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), 741 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4), 743 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6), 745 (SEQ ID NO: 7 y SeQ ID NO: 8) y definen la familia 740. Diez (10) estaban estrechamente relacionados con el receptor derivado de NGS Olfr665 (SEq ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10) y definen la familia Olfr665. La figura 4 representa las relaciones filogenéticas de los genes OR candidatos indol y escatol de ratón y sus ortólogos humanos predichos pertenecientes a las familias de receptores Olfr740 (figura 4A) y Olfr665 (figura 4B). Las relaciones se obtuvieron mediante la reconstrucción del árbol filogenético NeighborJoining basado en la secuencia de la proteína. Los ortólogos humanos correspondientes se indican con flechas. Los nombres de genes OR humanos anotados como pseudogenes están marcados con una 'P'. Los pseudogenes son probablemente no funcionales. El OR11H7P es un pseudogén segregado (SP) con alelos funcionales conocidos. Los rombos (0) designan receptores inicialmente identificados por NGS. Para determinar las identidades de los aminoácidos para los OR candidatos de indol y escatol adicionales de ratón y humano, las secuencias de proteínas completas se alinearon manualmente basándose en motivos de aminoácidos altamente conservados en todo el abanico de OR (herramienta de alineación de secuencias de Bioedit, versión 7.0.5.3). La tabla 2 muestra las identidades de aminoácidos por pares para la familia Olfr740 de ratón y sus ortólogos humanos predichos. La tabla 3 muestra las identidades de aminoácidos por pares para la familia Olfr665 de ratón y sus ortólogos humanos predichos.
Tabla 2
Familia 740 de ratón y ortólogos humanos
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continuación
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Tabla 3
Familia 01fr665 de ratón y ortólogos humanos
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Ejemplo 4
Actividad de indol y escatol de los OR de ratón Olfr743, Olfr746 y Olfr740 en células HEK293T.
La actividad de los receptores de ratón candidatos Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), Olfr743 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) y Olfr746 (SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38) para los malos olores de indol y de escatol se confirmaron en ensayos celulares de AMPc. En las figuras 5A y 5B, se cotransfectaron secuencias de ADNc de Olfr743 (SEQ ID NO: 6) y Olfr740 (SEQ ID NO: 2) etiquetado con fLaG Rho (SEQ ID 18) con Gaolf (SEQ ID NO: 21) y se expusieron a concentraciones crecientes de indol (izquierda) o escatol (derecha). Las figuras 5C y 5D son experimentos repetidos que muestran una actividad similar de Olfr740 (SEQ ID nO: 2) con Olfr743 (SEQ ID NO: 6) con indol y escatol. En la figura 5E, la secuencia de ADNc de Olfr746 (SEQ ID NO: 38) marcada con FLAG Rho (SEQ ID 18) se cotransfectó con Gaolf (SEQ ID NO: 21) y se expuso a concentraciones crecientes de indol o escatol. La actividad inducida por odorante se detectó midiendo los niveles de AMPc en el citosol utilizando el enfoque HTRF (kit CisBio). Se muestra un aumento dependiente de la dosis de la actividad del receptor para los tres receptores de ambas moléculas. La cotransfección de células HEK con Gaolf(SEQ ID NO: 21) solo (sin receptor) se usaron como controles para la actividad no específica (control). La actividad se define como las relaciones de HTRF corregidas iniciales normalizadas a la señal más alta en el experimento. Los resultados se muestran en la figura 5. Los tres receptores muestran actividad específica dependiente de la dosis con respecto a los compuestos de mal olor y, como tales, validan el procedimiento de identificación de los receptores de estos compuestos. Los receptores de ratón Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y Olfr743 (SEQ ID No: 5 y SEQ ID NO: 6) fueron identificados a partir de neuronas olfativas aisladas que respondieron tanto al indol como al escatol. El receptor de ratón Olfr746 (SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38) se identificó in silico por medio de la extracción de las bases de datos utilizando Olfr740 (SEQ ID NO: 2) y Olfr743 (sEq ID NO: 6) como secuencias de consulta. Los receptores se modifican en su extremo N-terminal con la etiqueta FLAG y los primeros 20 aminoácidos del receptor de la rodopsina bovina (SEQ ID 18), expresados transitoriamente en células HEK 293T, y se estimulan separadamente con indol y escatol para confirmar su identidad como receptores indol/escatol fidedignos. La co-expresión de la subunidad alfa G humana Gaolf (SEQ ID NO: 21) activa la ruta de transducción de G que conduce a un aumento del AMPc interno al unirse al ligando apropiado. Los resultados confirman la identidad de Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), Olfr743 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) y Olfr746 (SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38) como receptores de indol-escatol.
Ejemplo 5
Actividad de indol y escatol de OR52N2, OR11G2, OR5AC2, OR4C15, OR8S1, OR11H6 y OR11H4 humanos y Olfr665 y Olfr740 de ratón en células HEK293T.
La actividad de los receptores de mal olor de indol y escatol humanos candidatos OR52N2 (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12), OR11G2 (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, OR5AC2 (SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76), OR4C15 (SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80), OR8S1 (SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84), OR11H6 (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16) y OR11H4 (SEQ ID NO: 49 y SEQ iD NO: 50) y los receptores de mal olor de indol y de escatol de ratón candidatos Olfr665 (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO 10) y Olfr740 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO 2) se confirmaron en ensayos celulares de flujo de calcio (figura 6). Se expusieron células que coexpresaban de forma estable OR52N2 humano etiquetado con Rho (figura 6A, B) u OR11G2 (Figura 6C) y Ga-i5 (SEQ ID NO: 25) a concentraciones crecientes de escatol o indol. La figura 6B es un experimento repetido que muestra una actividad similar de OR52N2 con indol y escatol. La actividad de OR52N2 u OR11G2 inducida por odorante se detectó midiendo el máximo cambio de fluorescencia del tinte Calcium 5 (Molecular Devices) después de la exposición al odorante. La actividad se define como las relaciones de unidades relativas de fluorescencia (RFU) corregidas iniciales normalizadas al valor más elevado de RFU del experimento. Se registró un aumento de la actividad del receptor dependiente de la dosis y se muestra una curva de respuesta a la dosis correspondiente para ambos compuestos. Una línea celular que carecía de un receptor, por ejemplo hOR52N2, se utilizó como control de la actividad inespecífica a altas concentraciones ("control de indol" y "control de escatol"). La actividad se define como las relaciones de unidades relativas de fluorescencia (RFU) corregidas iniciales normalizadas al valor más elevado de RFU del experimento. El receptor humano OR52N2 (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12) se identificó por su similitud de secuencia con el Olfr665 de ratón (SEQ ID NO: 10), un receptor de indol/escatol aislado de neuronas olfativas que responden tanto al indol como al escatol. El receptor humano OR11G2 (SEQ ID NO:

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento in vitro para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo seleccionado del grupo que consiste en receptores de odorantes o aromas que se activa por un compuesto seleccionado del grupo que consiste en el indol y el escatol, que comprende
a) poner en contacto al menos un receptor, o una quimera o fragmento de la misma, con un compuesto, en el que el receptor es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
b) medir la medida en la que el compuesto bloquea, inhibe, modula o mejora la actividad del receptor; y c) identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula o mejora la respuesta del receptor olfativo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 % de identidad de secuencia con una de dichas secuencias de aminoácidos.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende utilizar una célula que está modificada de forma recombinante para expresar un polipéptido como se ha definido anteriormente.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en HEK293, CHO, ovocitos de Xenopus, COS, levaduras, bacterias y células derivadas de la placoda olfativa.
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