JP5127783B2

JP5127783B2 - においセンサおよびにおい検知方法

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Publication number: JP5127783B2
Application number: JP2009153861A
Authority: JP
Inventors: 奈保子河西; 明佳島田; 倫子瀬山
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-06-29
Also published as: JP2011007741A

Description

本発明は、においセンサおよびにおい検知方法に関する。

「におい」は、分子量６０〜３００程度のにおい分子（揮発性化合物）の単体あるいは混合物に起因しており、現在６００万種程度のにおいがあるとされている。動物のにおいの認識は種によって異なり、ヒトの場合は１０００種類程度のにおいを嗅ぎ分けられるとされている。
哺乳類の嗅覚システムでは、におい分子Ａは、図１に示すように、嗅上皮１０１にある粘膜に溶け込み、嗅細胞１０２によって受容される。そして、嗅細胞１０２においてその受容による化学的信号が電気信号に変換され、嗅球１０３における糸球体１０４に投射され、さらに脳内すなわち嗅皮質に信号として伝達される。嗅皮質は大脳辺縁系に存在し、経験を基ににおいを識別することができる。嗅細胞１０２におけるにおい分子Ａの受容は、図２に示すように、におい分子Ａが嗅細胞１０２の嗅繊毛１０２ａ上に発現している嗅覚受容体に結合することで行われる。
ヒトの嗅覚受容体は、遺伝子レベルでは約５００種であり、実際に発現している嗅覚受容体は約４００種である。犬ではヒトの約２倍の種類の嗅覚受容体がある。このように、嗅覚受容体の種類が数百種であるのに対し、におい分子は数百万種である。しかし、１つのにおい分子は種類の異なる複数の嗅覚受容体に結合することができ、それに対して脳では、同一の嗅覚受容体と結合した異なるにおい分子を識別する高度な情報処理が行われているということが明らかになっている。さらに、におい分子が嗅覚受容体に結合したという情報が脳へ運ばれる際には、複数の嗅覚受容体の情報が混合し、さらに介在ニューロンからの投射を受けていることが分かっている。

一方、これまで、安全および環境の面から、有害なガスを検知するガスセンサ、悪臭の発生を検知する悪臭センサ等のにおいセンサが開発されている。においセンサの先駆けとなったのは、１９６９年に世界で初めて実用化された日本の半導体ガスセンサである。この開発を機に、種々の材料・原理を用いた研究開発が活発に行われるようになった。ガスセンサにおいては、固体電解質および酸化物半導体を用いる方法が現在でも最も有力であるとされている。
１９７２年には、環境問題の深刻化を受けて悪臭防止法が施行された。これにより、ＮＯ_Ｘ、ＣＯ_２、ＳＯ_Ｘ、Ｏ_３、フロン、ＮＨ_３、Ｈ_２Ｓ等の２２種類の特定悪臭物質に対する濃度調査の重要性が高まり、ガスセンサの開発が活発に行われるようになった。さらに、都市生活を営むうえで身のまわりにごく普通に存在するにおいに対する苦情もあったことから、物質濃度規制のみではなく複合臭も対象にする臭気指数規制が１９９５年の法改正（１９９６年施行）で導入され、ますますにおいセンサの必要性が高まった。

アメニティの分野においては、アロマテラピーや五感通信（高臨場感通信）等で嗅覚が注目されている（非特許文献１〜３）。総務省では、五感情報通信技術に関する調査研究会が設立され、２００６年に報告書が発表されている（非特許文献４）。しかし、特に嗅覚については、においに関する基礎的な知見があまり得られておらず、その通信への応用は遠い夢の話になっている。また、日本では清潔に対する意識の高まりから、口臭や体臭、老人臭を客観的に計測できるセンサの需要が高まっているものの、市販されているセンサの精度はまだ充分とは言えない。

医療分野では、健康状態と呼気や体臭との間に関連があるとされている。例えば、黄熱病では肉屋のにおいのような体臭、痛風では特徴的な汗のにおい、フェニルケトン尿病ではかび臭いにおいがするとされている。そのため、健康管理や病気の診断に、においセンサを応用することが期待されている。特に、呼気のにおいが健康管理や病気の診断に有効であるとされており、近年においセンサの開発が行われている（非特許文献５）。また、２００８年８月２４日付の読売新聞では、県立静岡がんセンターと大手香料会社の高砂香料工業が、癌患者から出る特有のにおい（病臭）を減らす研究を共同で始めたことが報じられている。

また、特に食品や香料の分野では、においは重要な知的財産であり、においを含む商品を商標化する動きがある。特許庁は、音やにおい、動き等の新しいタイプの商標の導入を検討するため、２００８年８月に研究会を発足した。これは、インターネットの普及等で企業が自社の製品やサービスを他社と区別する方法が多様化し、新しい権利の保護が必要になっているためであり、２０１０年に商標法改正案の提出を目指すとしている。しかし、そのためには、においを検出し、それを分析、分類するというにおい情報のデジタル化が必要になると考えられる。

以上のように、様々な分野において、においを高感度に検知し、識別する技術が求められている。
においを高感度に検出・識別する技術としては、これまで様々な技術が用いられてきた。それらの技術の基本は、複数の異なるセンサ素子を有する検出システムを用い、それら個々のセンサ素子からの情報をコンピュータ処理し、予め学習させて作成しておいたデータベースに基づいてにおいの識別を行うというものである。
においの検出については、半導体ガスセンサや、有機薄膜付き水晶振動子、導電性高分子デバイス等が開発されている（例えば、非特許文献６および７）。これらのにおいセンサは、いずれもセンサ表面ににおい分子が吸着したときの応答を捉えるものであり、センサ表面の特性を変えることで異なる吸着特性を持たせて、におい分子をセンサ表面に個別に吸着させて識別を行うものである。また、必要に応じて、においの識別のために、既知ににおい分子を用いて各センサの応答を予め学習させ、検知対象のにおいのパターン認識を行う方法も行われている。

［平成２１年３月１３日検索］、インターネット<URL:http://www.ntt.com/kaori/index.html> ［平成２１年３月１３日検索］、インターネット<URL:http://www.ntt-west-recruiting.jp/about/vision2.html> ［平成２１年３月１３日検索］、インターネット<URL:http://www.ntt.co.jp/RD/OFIS/vision/future senses.html> ［平成２１年３月１３日検索］、インターネット<URL:http://www.soumu.go.jp/joho_tsusin/policyreports/chousa/gokan/pdf/060922_1.pdf> 日経エレクトロニクス特集２００７年７月瀬山倫子他、プラズマ有機薄膜を用いたニオイセンサ、ＮＴＴ技術ジャーナル２００３．１２、ｐ４７−５０ M. Seyama, et al. Aroma sensing and indoor air monitoring by quartz crystal resonators with sensory films prepared by sputtering of biomaterials and sintered polymers, Biosensors and Bioelectronics 20, 814-824 (2004).

しかし、前記においセンサは、におい分子が吸着したときのセンサの応答を捉える技術であるため、類似した分子構造を有する複数のにおい分子に対する応答はほとんど同じである。そのため、検知対象のにおい分子の分子構造が類似していると、ヒトの嗅覚システムにおいては異なるにおいとして認識されるにおい分子であっても、前記においセンサでそれらを正確に識別することは困難である。特に、光学異性体の場合は、構造が類似していても異なるにおいであることが多く、前記においセンサで識別することは非常に難しい。
また、前記においセンサは、ほとんどのにおい分子に対して感度が低く、ヒトの嗅覚システムの感度には遠く及ばない。これらのにおいセンサでは、必要な感度を得ようとすると、検出システムを非常に大型化する必要がある。このように検出システムを大型化すると、においが発生している場所でにおいを検知することが困難になるため、においセンサの需要からかけ離れたものになってしまう。
さらに、試料中の水分がセンサの応答に干渉する場合には、水蒸気除去等の煩雑な前処理が必要となる。

前述したように、においは特に食品や香料の分野では重要な知的財産である。また、におい情報を含む通信には、においのデジタル化、におい情報のデータベース化、におい分子の分子構造との相関やマッピングが不可欠である。また、においを検知する技術の向上のためには、哺乳類における嗅覚神経系のさらなる理解が必要である。
以上のことから、においの記録、保存、伝達等のために、少なくともヒトの嗅覚システムに匹敵する感度と識別能を有するにおいセンサが望まれている。

本発明では、検出システムを大型化することなく、優れた感度でにおいを検知し、識別することができるにおいセンサ、およびにおい検知方法の提供を目的とする。

本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］基板と、該基板上に配置された、複数の嗅細胞および前記複数の嗅細胞のうち同じ嗅覚受容体を発現する複数の嗅細胞と結合した糸球体と、前記複数の嗅細胞の嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの該嗅細胞に結合する糸球体の応答を光学的に計測する計測手段と、を有し、前記複数の嗅細胞の応答を直接計測せずに、それら嗅細胞からの信号が集積された糸球体の応答を計測するにおいセンサ。
［２］電極が設けられた基板と、前記基板上の前記電極以外の部分に配置された複数の嗅細胞と、前記電極上に配置された、前記複数の嗅細胞と結合した糸球体と、前記複数の嗅細胞の嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの該嗅細胞に結合した糸球体の応答を電気的に計測する計測手段と、を有し、前記複数の嗅細胞の応答を直接計測せず、前記複数の嗅細胞のうち同じ嗅覚受容体を発現する複数の嗅細胞が結合し、それら嗅細胞からの信号が集積された糸球体の応答を計測するにおいセンサ。
［３］前記電極が、前記嗅細胞から糸球体に投射する神経伝達物質を酸化する酸化酵素、および前記酸化酵素と前記電極の間の電子の移動を媒介する電子移動メディエータが固定化された酵素電極である、前記［２］に記載のにおいセンサ。
［４］さらに、前記基板上に配置される前記嗅細胞を区画する、または前記嗅細胞と前記糸球体を区画する配列層を有する、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のにおいセンサ。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のにおいセンサを用いてにおいを検知するにおい検知方法。
［６］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のにおいセンサを用いてにおいを検知する方法であって、基板上に嗅細胞および糸球体を配置する配置工程と、前記嗅細胞および糸球体を培養し、前記嗅細胞と該嗅細胞に対応する糸球体とを結合させる培養工程と、前記糸球体の応答を計測する計測工程と、を有するにおい検知方法。
［７］前記［１］に記載のにおいセンサを用いてにおいを検知する方法であって、膜電位感受性蛍光色素、カルシウム感受性蛍光色素、神経伝達物質感受性蛍光色素からなる群から選ばれる１種以上の蛍光色素を糸球体に導入し、該蛍光色素が発する蛍光強度を計測して、前記糸球体の応答を計測する、前記［５］に記載のにおい検知方法。

本発明のにおいセンサは、検出システムを大型化することなく、優れた感度でにおいを検知することができる。
また、本発明のにおい検知方法によれば、高い感度でにおいを検知することができる。

ヒトの嗅覚システムを示した概念図である。図１の嗅覚システムにおける嗅細胞および糸球体の部分の拡大図である。本発明のにおいセンサの実施形態の一例を示した平面図である。本発明のにおいセンサの他の実施形態例を示した斜視図（Ａ）および平面図（Ｂ）である。本発明のにおいセンサの他の実施形態例を示した平面図である。本発明のにおいセンサの他の実施形態例を示した斜視図（Ａ）および平面図（Ｂ）である。本発明のにおいセンサの他の実施形態例を示した平面図である。本発明のにおいセンサの他の実施形態例を示した平面図である。

本発明のにおいセンサは、基板と、基板上に配置された嗅細胞を有していることを特徴とする。本発明のにおいセンサは、生体の嗅覚システムのしくみを利用したセンサであり、数百程度の種類の嗅細胞を用いることで、数万種のにおい分子を検出、識別することが可能な優れたセンサである。
以下、本発明のにおいセンサの実施形態の一例を示し、該においセンサを用いたにおい検知方法と共に詳細に説明する。

［第１実施形態］
本実施形態のにおいセンサ１は、図３に示すように、基板１１と、基板１１上に配置された嗅細胞１２と、におい分子に対する嗅細胞１２の応答を光学的に計測する図示しない計測手段（以下、「光学的計測手段」という。）とを有している。

基板１１は、生体親和性に優れたものが好ましい。例えば、ガラス、アクリル樹脂、ポリプロピレン等からなる透明基板、シリコン、シリコン酸化物等からなる基板、白金、金等からなる金属基板、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等の金属酸化物からなる基板、カーボンからなる基板が挙げられる。また、これらの基板に、嗅細胞１２の接着因子や、吸着性を高めるｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子や、Ｌａｍｉｎｉｎ、コラーゲン等の接着性タンパク質を塗布した基板を用いてもよい。
基板１１の形状は、基板１１上に配置した嗅細胞１２を利用してにおいが検知できる形状であればよく、平板状が好ましい。
基板１１の大きさは、特に限定されず、適宜選定することができる。

嗅細胞１２は、カエル等の両生類、魚類、マウス、ラット等の哺乳類から精製したものが使用できる。基板１１上に配置される嗅細胞１２は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。

嗅細胞の精製は、公知の精製方法が使用でき、例えば、Ｈｉｒｏｎｏ等による方法（Simultaneous recording of [Ca²⁺]i increases in isolated olfactory receptor neurons retaining their original spatial relationship in intact tissue, Journal of Neuroscience Methods, 42 (1992) 185-194.）、Ｗａｎｇ等による方法（Reconstruction of renal glomerular tissue using collagen vitrigel scaffold. Journal of Bioscience and Bioengineering, 99 (2005) 529-40.）が挙げられる。
また、前述の方法により精製した嗅細胞は、異なる嗅覚受容体をそれぞれ発現している複数種類の嗅細胞の混合であるため、さらに個別の嗅細胞ごとに分離することが好ましい。嗅細胞を分離する方法としては、例えば、抗体カラムを用いる方法が挙げられる。該方法は、嗅覚受容体の特定のアミノ酸配列に対応する抗体をカラムに固定しておき、その嗅覚受容体を表面に発現している嗅細胞を該カラムにより分離する方法である。

精製・分離した嗅細胞を基板１１上に配置する方法は、基板１１上に配置した嗅細胞１２の応答を個別に計測できるように配置できる方法であればよい。例えば、特定の種類の嗅細胞のみを含む懸濁液を、基板１１の特定の位置にスポッティングする方法、精製後に分離を行わず、異なる種類の嗅細胞が混ざった混合物を基板上に加えて、それら複数の嗅細胞１２を基板１１上にランダムに配置する方法が挙げられる。
また、いずれの場合も、基板１１上に嗅細胞１２を配置した後に、それら嗅細胞１２を培養して成長させてもよい。

基板１１上に配置する嗅細胞１２の量は、光学的計測手段により嗅細胞１２の応答を計測してにおいを検知するのに充分な量であればよく、１０^４〜１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であることが好ましい。

光学的計測手段は、嗅細胞１２に発現している嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの嗅細胞１２の応答を光学的に計測できる手段であればよく、例えば、蛍光計測法を用いる計測手段が挙げられる。具体的には、蛍光顕微鏡等の蛍光強度を計測できる装置等が挙げられる。

においセンサ１を用いたにおいの検知方法は、膜電位感受性蛍光色素、カルシウム感受性蛍光色素、神経伝達物質感受性蛍光色素からなる群から選ばれる１種以上の蛍光色素を嗅細胞１２内に導入し、該蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度を計測することにより行うことができる。

嗅細胞１２は、嗅覚受容体ににおい分子が結合に伴って膜電位が変化する。そのため、膜電位に依存して蛍光を発する膜電位感受性蛍光色素を電気刺激等によって嗅細胞１２内に導入しておくことにより、蛍光強度の変化により、におい分子に対する嗅細胞１２の応答を計測できる。
膜電位感受性蛍光色素としては、例えば、ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、ＤｉＢＡＣ４が挙げられる。

また、嗅細胞１２には、嗅覚受容体の他にカルシウムチャネルが発現しており、嗅覚受容体へのにおい分子の結合に伴ってカルシウムチャネルが開き、カルシウムイオンが嗅細胞１２内に移動する。そのため、カルシウムイオン感受性蛍光色素を嗅細胞１２内に導入しておくことにより、におい分子の嗅覚受容体への結合による、嗅細胞１２内へのカルシウムイオンの流入を蛍光強度の変化により計測することができる。これにより、におい分子に対する嗅細胞１２の応答を計測でき、におい分子を定量的に計測できる。
カルシウムイオン感受性蛍光色素としては、例えば、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４が挙げられる。

また、嗅細胞１２は、嗅覚受容体ににおい分子が結合すると、糸球体に神経伝達物質を投射するようになっている。そのため、神経伝達物質感受性蛍光色素を嗅細胞１２内に導入しておくことで、該蛍光色素の蛍光強度の変化から前記神経伝達物質を計測して、におい分子の定量的に検知することができる。
前記神経伝達物質としては、例えば、グルタミン酸が挙げられる。
神経伝達物質感受性蛍光色素としては、例えば、グルタミン酸蛍光プローブであるＥＯＳ（Glutamate(E) Optical Sensor）が挙げられる。
これらの蛍光色素を嗅細胞１２に導入する方法としては、細胞内への蛍光色素の導入に通常用いられる公知の導入方法が使用できる。

本実施形態のにおいセンサ１に用いる嗅細胞１２は、それぞれの嗅細胞１２が特定の嗅覚受容体を発現しており、該嗅覚受容体はそれぞれ特定のにおい分子と結合する。そのため、異なる嗅覚受容体を発現している複数の嗅細胞１２を基板１１上に配置し、それら嗅細胞１２の応答をそれぞれ非侵襲に計測することで、特定の嗅細胞１２の応答として、におい分子を検知し、識別することができる。
また、においセンサ１を用いるにおい検知方法では、既知のにおい分子を用いて、予めどのにおい分子によりどの嗅細胞１２が応答するかを調べておき、それら応答をデータベース化しておくことにより、そのにおいセンサで検知したにおい分子を容易に識別して同定することが可能となる。
このようなデータベース化を行った検知方法によれば、におい分子の分子構造と生体活性の相関を求めることができるようになる可能性もあると考えられる。

本実施形態のにおいセンサ１は、より明確な計測が行える点から、図４（Ａ）および図４（Ｂ）に示すように、基板１１上に、該基板１１に配置される嗅細胞１２を区画する配列層１３を有するにおいセンサ１Ａであることが好ましい。

配列層１３は、複数の微小な孔１４が形成されている。
配列層１３の材質を、配列層１３上では細胞が成長できないものであることが好ましい。これにより、各々の孔１４内に嗅細胞１２を別々に配置しやすくなり、それらの嗅細胞１２を別々に計測してにおい分子の識別を行うことが容易になる。
配列層１３の材質は、細胞が成長しにくい材質であればよく、例えば、疎水性の高い一般的なフォトレジストやシリコン系等の高分子、銀等の金属、ＳｉＯ_２等の金属酸化物が挙げられる。

においセンサ１Ａでは、精製した多種類の嗅細胞１２が、混合した状態でそれぞれの孔１４にランダムに配置されるようにしてもよく、精製後の多種類の嗅細胞の混合物から１種の嗅覚受容体を有する嗅細胞のみを分離し、所望の孔１４に同一種類の嗅細胞１２のみが配置されるようにしてもよい。
同一の孔１４内に複数種類の嗅細胞１２が配置される場合、各々の孔１４には同一種類の嗅細胞１２が２種以上配置されないようにすることが好ましい。また、同一の孔１４に同一種類の嗅細胞１２が配置される場合、同一の孔１４内における同一の嗅細胞１２の数は２以上であることが好ましい。

複数の微小な孔１４内に嗅細胞１２を配置する方法としては、例えば、精製した嗅細胞の混合物からそれぞれ分離した個別の嗅細胞をそれぞれ含む複数の懸濁液を、適度な濃度に希釈して、該懸濁液を孔１４の１つ１つにディスペンサーで供給する方法が挙げられる。また、配置後には、孔１４内で嗅細胞１２を培養してもよい。
また、においセンサ１Ａでは、前記蛍光色素は、嗅細胞１２内に導入せずに孔１４内に配置し、電気刺激等によって細胞内に取り込ませてもよい。

［第２実施形態］
以下、本発明の他の実施形態例であるにおいセンサ２、およびにおいセンサ２を用いたにおい検知方法ついて説明する。
においセンサ２は、図５に示すように、複数の電極２２が設けられた基板２１と、電極２２上に配置された嗅細胞２３と、におい分子に対する嗅細胞２３の応答を電気的に計測する図示しない計測手段（以下、「電気的計測手段」という。）とを有している。
基板２１は、生体親和性に優れ、かつ絶縁性に優れた基板を用いることができ、例えば、ガラス基板、シリコン酸化物からなる基板等が挙げられる。

電極２２の材料としては、生体親和性に優れた導電性を有する材料が好ましく、ＩＴＯ等の金属酸化物、白金、金等の金属が挙げられる。
電極２２の数および大きさは、特に限定されず、測定に用いる嗅細胞１２の種類、量に応じて適宜選定すればよい。電極２２は１つのみ設けられていてもよい。
電極２２の形成方法は、特に限定されず、例えば、フォトリソグラフィーによる形成方法等が挙げられる。

においセンサ２では、電極２２上に嗅細胞２３が配置されている。嗅細胞２３は、前述したにおいセンサ１における嗅細胞１２と同じである。
１つの電極２２上に配置される嗅細胞２３は、１種のみであってもよく、２種以上であってもよいが、１つの電極２２に１種の嗅細胞２３が配置されていることが好ましい。

電気的計測手段は、例えば、電極２２と接続される電流計を有し、電極２２で生じる電流を測定できる公知の装置を用いることができる。具体的には、複数の電極２２における各々の電流を同時に計測できる多チャネル電気生理計測システムが挙げられる。

においセンサ２では、電極２２上に配置された嗅細胞２３における、イオンチャネルによるイオンの移動によって発生する活動電位を計測することで、におい分子が嗅覚受容体に結合したときの嗅細胞２３の応答を計測し、におい分子を定量的に検知することができる。すなわち、各々の電極２２上の嗅細胞２３で発生する電気信号を個別に計測することで、それら電極２２上の嗅細胞２３の応答を非侵襲に検出することができる。これにより、におい分子の検知、識別を行うことができる。

また、嗅細胞は、糸球体への投射を神経伝達物質により行っているため、嗅細胞において産生される神経伝達物質を計測することでも、においの検知が行える。これは、Ｎ．Ｋａｓａｉ等による、神経伝達物質の１つであるグルタミン酸を検知するグルタミン酸センサアレイの技術に基づくものである（Real-time observation of evoked glutamate distribution in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters, 304 (2001) 112-116.）。
この場合、電極２２として、嗅細胞２３により産生される神経伝達物質を酸化する酸化酵素と、該酸化酵素と電極２２の間の電子移動を媒介す電子移動メディエータ（以下、「メディエータ」という。）を、電極上に塗布して固定化した酵素電極を用いる。

具体的には、神経伝達物質であるグルタミン酸を計測する場合、グルタミン酸酸化酵素およびメディエータを電極２２上に塗布して固定化しておき、電極２２の電位をメディエータの酸化電位よりも高い電位に保持しておく。これにより、グルタミン酸の酸化に伴って酸化酵素が還元型に変化し、還元型の酸化酵素をメディエータにより酸化型に戻し、それと同時に還元型に変化したメディエータが電極２２上で酸化されることで電極２２ではメディエータの酸化電流を検出することができる。すなわち、におい分子が結合した嗅細胞２３のみでグルタミン酸が産生され、それによりメディエータの前記酸化電流を検出することができるため、嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの嗅細胞２３の応答を計測することができ、におい分子の検知、識別が可能となる。
また、前述した方法の他にも、電界効果トランジスタのような半導体を用いた構造物を用いて、電極２２上の嗅細胞２３の応答を電気的に計測することもできる。

また、においセンサ２においても、用いる嗅細胞２３は、それぞれ特定の嗅覚受容体を発現しており、該嗅覚受容体はそれぞれ特定のにおい分子と結合する。そのため、各電極２２上に配置された嗅細胞２３の応答をそれぞれ非侵襲に計測することで、特定の嗅細胞２３の応答として、におい分子を検知し、識別することができる。
また、においセンサ１を用いるにおい検知方法と同様に、既知のにおい分子を用いて、嗅細胞２３の応答をデータベース化しておくことにより、そのにおいセンサで検知したにおい分子を容易に識別して同定することが可能となる。

また、においセンサ２においても、前述のにおいセンサ１と同様に、より明確な計測が行える点から、図６（Ａ）および図６（Ｂ）に示すように、基板２１上に、該基板２１に設けられた電極２２上に配置される嗅細胞２３を区画する配列層２４を有するにおいセンサ２Ａであることが好ましい。
配列層２４は、複数の微小な孔２５が形成されている。配列層２４は、においセンサ１Ａにおける配列層１３と同じものが使用できる。

においセンサ２Ａでは、精製した多種類の嗅細胞２３が、混合した状態でそれぞれの孔２５にランダムに配置されるようにしてもよく、精製後の多種類の嗅細胞の混合物から１種の嗅覚受容体を有する嗅細胞のみを分離し、所望の孔２５に同一種類の嗅細胞２３のみが配置されるようにしてもよい。
同一の孔２５内に複数種類の嗅細胞２３が配置される場合、各々の孔２５には同一種類の嗅細胞２３が２種以上配置されないようにすることが好ましい。また、同一の孔２５に同一種類の嗅細胞２３を配置する場合、同一の孔２５内における同一の嗅細胞２３の数は２以上であることが好ましい。
複数の微小な孔２５に嗅細胞２３を配置する方法は、においセンサ１Ａの場合と同じ方法が使用できる。

［第３実施形態］
以下、本発明のさらに他の実施形態例であるにおいセンサ３、およびにおいセンサ３を用いたにおい検知方法ついて説明する。
においセンサ３は、図７に示すように、基板３１と、基板３１上に配置された嗅細胞３２、および嗅細胞３２と結合した糸球体３３と、におい分子に対する糸球体３３の応答を光学的に計測する光学的計測手段とを有している。
基板３１は、においセンサ１の基板１１と同じものが使用できる。

嗅細胞３２は、においセンサ１の嗅細胞１２と同じものが使用できる。
基板３１上の嗅細胞３２の量は、光学的計測手段により、嗅細胞３２と結合している糸球体３３の応答を計測してにおいを検知するのに充分な量であればよく、１０^４〜１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であることが好ましい。

糸球体３３は、嗅細胞３２と同様に、カエル等の両生類、魚類、マウス、ラット等の哺乳類から精製したものが使用できる。糸球体の精製は、公知の精製方法が使用できる。また、糸球体の分離は、嗅細胞の分離と同様に抗体を固定化したカラムによる方法等により行うことができる。
基板３１上に配置する糸球体３３の量は、光学的測手段により糸球体３３の応答を計測してにおいを検知するのに充分な量であればよく、１０^４〜１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であることが好ましい。

糸球体３３は、同一の嗅覚受容体を発現している嗅細胞３２と結合している。すなわち、結合する嗅細胞３２と糸球体３３の組み合わせは、それらの種類によって決まっており、１種の糸球体３３と結合する嗅細胞３２は、特定の嗅覚受容体を発現する１種の嗅細胞３２のみである。ただし、同一の嗅覚受容体を発現する２つ以上の嗅細胞３２は、同一の糸球体３３と結合できる。
そのため、におい分子が結合した嗅細胞３２が投射する糸球体３３の応答を計測することで、においセンサ１を用いる方法と同様に、においを検知、識別することができる。

光学的計測手段は、嗅細胞３２に発現している嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの該嗅細胞３２に結合している糸球体３３の応答を光学的に計測できる手段であればよく、例えば、蛍光計測法を用いる計測手段が挙げられる。具体的には、蛍光顕微鏡等の蛍光強度を計測できる装置等が挙げられる。

糸球体３３は、嗅細胞３２から神経伝達物質により信号が伝えられることで、膜電位が変化する。そのため、においセンサ１と同様に、膜電位に依存して蛍光を発する膜電位感受性蛍光色素を糸球体３３に導入し、蛍光強度を計測することで、糸球体３３の応答を計測できる。また、においセンサ１と同様に、神経伝達物質感受性蛍光色素を糸球体３３に導入して、その蛍光強度の変化から糸球体３３の応答を計測することもできる。
膜電位感受性蛍光色素と神経伝達物質感受性蛍光色素は、どちらか一方のみを用いてもよく、両方を同時に用いてもよい。
これらの蛍光色素を糸球体３３に導入する方法としては、細胞内への蛍光色素の導入に通常用いられる公知の導入方法が使用できる。

嗅細胞３２は特定の糸球体３３に対して信号を投射するが、前述したとおり、同じ嗅覚受容体を発現する複数の嗅細胞３２が同一の糸球体３３に投射するため、同じ嗅覚受容体を発現する嗅細胞３２からの信号は１つの糸球体３３に集積される。そのため、個々の糸球体３３の応答を計測することで、嗅細胞３２の応答を直接計測するよりも、１段階解析が進んだ情報を得ることができる。また、糸球体３３の応答を計測することで、嗅細胞３２の応答を直接計測するにおいセンサ１に比べて、より少ない計測数で同等以上の感度が実現できる。

においセンサ３によるにおい検知方法としては、例えば、基板３１上に嗅細胞３２および糸球体３３を配置する配置工程と、嗅細胞３２および糸球体３３を培養し、嗅細胞３２と該嗅細胞３２に対応する糸球体３３とを結合させる培養工程と、糸球体３３の応答を計測する計測工程と、を有する方法が挙げられる。

まず、嗅細胞３２を生体から精製し、必要に応じて特定の嗅覚受容体を発現する嗅細胞３２ごとに分離する。また、嗅細胞３２とは別に、生体から糸球体３３を精製し、必要に応じて特定の嗅細胞３２と結合する糸球体３３ごとに分離する。また、膜電位感受性蛍光色素、神経伝達物質感受性蛍光色素のいずれか一方または両方を糸球体３３に導入する。これら蛍光色素の糸球体３３への導入方法は、細胞内に蛍光色素を導入するときに通常用いられる公知の導入方法を用いることができる。
配置工程では、これら嗅細胞３２と糸球体３３を、スポッティング等により基板３１上に配置する。

次に、基板３１上に配置した嗅細胞３２と糸球体３３を培養する。培養条件は、嗅細胞と糸球体の公知の培養条件を用いることができる。この培養により、嗅細胞３２と、該嗅細胞３２と対応する適切な糸球体３３とが、嗅細胞３２から延びる軸索と呼ばれる嗅神経により結合する。

計測工程では、においセンサ３表面に、においを検知する対象の試料を接触させ、蛍光強度の変化を計測する。これにより、におい分子が嗅細胞３２の嗅覚受容体に結合することに起因する糸球体３３の応答を計測し、においを検知することができる。
ただし、本実施形態のにおい検知方法は前述の工程には限定されず、予め作製しておいたにおいセンサ３を用いて行ってもよい。

［第４実施形態］
以下、本発明のさらに他の実施形態例であるにおいセンサ４、およびにおいセンサ４を用いたにおい検知方法ついて説明する。
においセンサ４は、図８に示すように、電極４２が設けられた基板４１と、基板４１上に配置された嗅細胞４３と、電極４２上に配置された、嗅細胞４３と結合した糸球体４４と、におい分子に対する糸球体４４の応答を電気的に計測する電気的計測手段とを有している。においセンサ４は、電極４２上に配置された糸球体４４の応答を電気的計測手段により電気的に計測する。
基板４１は、においセンサ２の基板２１と同じものが使用できる。また、嗅細胞４３および糸球体４４は、においセンサ３の嗅細胞３２と糸球体３３と同じものが使用できる。

電気的計測手段は、においセンサ２で挙げたものと同じものが使用できる。
嗅細胞４３の嗅覚受容体ににおい分子が結合すると、該嗅細胞４３と軸索により結合した糸球体４４にその信号が投射され、神経伝達物質を介して伝わる。嗅細胞４３から信号が投射された糸球体４４では、該投射により電気信号が発生するので、これを電極４２と接続した電気的計測手段により計測することで、糸球体４４の応答が計測できる。
また、においセンサ２と同様に、電極４２上に、神経伝達物質を酸化する酸化酵素と、該酸化酵素と電極４２の間で電子の移動を媒介するメディエータを固定化した酵素電極を用い、電極４２におけるメディエータの酸化電流を測定することで、糸球体４４の応答を計測してもよい。

においセンサ４を用いたにおい検知方法は、前述したにおいセンサ３を用いたにおい検知方法と同様に、嗅細胞４３を基板４１上の電極４２以外の部分に配置し、糸球体４４を電極４２上に配置する配置工程と、嗅細胞４３および糸球体４４を培養し、嗅細胞４３と該嗅細胞４３に対応する糸球体４４とを結合させる培養工程と、糸球体４４の応答を計測する計測工程と、を有する方法が挙げられる。
該方法は、嗅細胞４３と糸球体４４を、基板４１上の電極４２以外の部分と、電極４２上とに別々に配置する以外は、においセンサ３を用いたにおい検知方法と同様に行うことができる。
ただし、本実施形態のにおい検知方法は前述の工程には限定されず、予め作製しておいたにおいセンサ４を用いて行ってもよい。

以上説明した本発明のにおいセンサおよびにおい検知方法によれば、嗅細胞の嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの、嗅細胞または、嗅細胞と結合している糸球体の応答を光学的または電気的に計測することで、高感度でにおいを検知できる。
このように、本発明のにおいセンサおよびにおい検知方法は、生体における嗅覚システムを利用しているため、生体と同等の感度および識別能を実現できる。そのため、特定のにおい分子を対象とするガスセンサとしてだけでなく、医療分野においては疾病の診断や検査にも好適に用いることができる。また、これにより、特定の薬に対する客観的な薬理効果の実証も実現できると考えられる。さらに、用いる嗅細胞や該嗅細胞に対応する糸球体の種類をヒト以外のものにすることで、ヒトが検出できないにおいを検出、識別することもできるようになる。そのため、例えば犬の嗅細胞および糸球体を用いることで、有害なガスを回避することがより容易になると考えられる。

また、アメニティの分野では、気になる体臭を毎日気楽にチェックできるようになるうえ、個人のにおいを同定して個人認証を行うこともできると考えられる。
また、各におい分子に対する、嗅細胞および糸球体から脳への信号の投射を観察することができれば、脳内の情報処理に対する新しい知見が得られると考えられる。このような知見は、例えば、異なる化学物質でもヒトにとっては同じにおいと感じる、等といったにおいの分類を行い、においのデジタル化、データベース化を進めることで、においの出るテレビや、五感通信の重要な要素であるにおい通信の実現にも繋がるものである。さらに、におい通信においては、有害な物質を、同等のにおいと認識される他の無害な物質に変換することも可能となる。また、意識的に特定のにおいを発するという技術も可能になり、より臨場感を高めることができる。

さらに、本発明によりにおいの高度な識別が可能となれば、においの商標化も実現できると考えられ、においの知的財産としての価値を高めることができる。
また、本発明により、嗅覚に関してにおいのデータベースを向上させ、また分子構造との相関やマッピングを行うことは、脳神経系の基礎研究においても嗅覚における新たな知見を得ることができ、科学の大きな発展に繋がると考えられる。

尚、本発明のにおいセンサは前述のにおいセンサ１〜４には限定されない。例えば、さらに効率良くにおい分子を嗅細胞に導入する点から、基板上に配置された嗅細胞まで到達する流路が、微細加工によって設けられたおいセンサであってもよい。また、基板上に哺乳類の鼻空を模した構造を有するにおいセンサとしてもよい。また、においセンサの基板または電極表面に、嗅上皮にある粘膜を模したゲル層が設けられたにおいセンサであってもよい。
また、嗅細胞および糸球体を両方用いるにおいセンサ３、４は、前述したにおいセンサ１Ａ、２Ａと同様に、嗅細胞と該嗅細胞と結合する糸球体が同一の孔に配置されるようにした、配列層を有するセンサであってもよい。
また、本発明のにおいセンサは、嗅細胞または糸球体の応答を計測する計測する手段として、光学的計測手段と電気的計測手段の両方を備えていてもよい。
また、本発明のにおい検知方法は、前述の方法には限定されない。例えば、嗅細胞または糸球体の応答を、光学的な計測手段と電気的な計測手段の両方を用いて行ってもよい。

本発明のにおいセンサおよびにおいセンシング方法は、ヒトの嗅覚を超えるすぐれた識別能と検出感度を実現することもでき、セキュリティや環境、アメニティや医療等の様々な分野で広く利用が可能な技術である。また、これまで実現できなかったにおい通信、においの商標化も可能となると考えられる。さらに、嗅覚システムの解明にも繋がると考えられる。

１〜４においセンサ１１、２１、３１、４１基板２２、４２電極１２、２３、３２、４３嗅細胞１３、２４、３３、４３糸球体

Claims

基板と、該基板上に配置された、複数の嗅細胞および前記複数の嗅細胞のうち同じ嗅覚受容体を発現する複数の嗅細胞と結合した糸球体と、前記複数の嗅細胞の嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの該嗅細胞に結合する糸球体の応答を光学的に計測する計測手段と、を有し、前記複数の嗅細胞の応答を直接計測せずに、それら嗅細胞からの信号が集積された糸球体の応答を計測するにおいセンサ。
電極が設けられた基板と、前記基板上の前記電極以外の部分に配置された複数の嗅細胞と、前記電極上に配置された、前記複数の嗅細胞と結合した糸球体と、前記複数の嗅細胞の嗅覚受容体ににおい分子が結合したときの該嗅細胞に結合した糸球体の応答を電気的に計測する計測手段と、を有し、前記複数の嗅細胞の応答を直接計測せず、前記複数の嗅細胞のうち同じ嗅覚受容体を発現する複数の嗅細胞が結合し、それら嗅細胞からの信号が集積された糸球体の応答を計測するにおいセンサ。
前記電極が、前記嗅細胞から糸球体に投射する神経伝達物質を酸化する酸化酵素、および前記酸化酵素と前記電極の間の電子の移動を媒介する電子移動メディエータが固定化された酵素電極である、請求項２に記載のにおいセンサ。
さらに、前記基板上に配置される前記嗅細胞を区画する、または前記嗅細胞と前記糸球体を区画する配列層を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のにおいセンサ。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のにおいセンサを用いてにおいを検知するにおい検知方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のにおいセンサを用いてにおいを検知する方法であって、
基板上に嗅細胞および糸球体を配置する配置工程と、前記嗅細胞および糸球体を培養し、前記嗅細胞と該嗅細胞に対応する糸球体とを結合させる培養工程と、前記糸球体の応答を計測する計測工程と、を有するにおい検知方法。
請求項１に記載のにおいセンサを用いてにおいを検知する方法であって、
膜電位感受性蛍光色素、カルシウム感受性蛍光色素、神経伝達物質感受性蛍光色素からなる群から選ばれる１種以上の蛍光色素を糸球体内に導入し、
前記蛍光色素の蛍光強度を計測して、前記糸球体の応答を計測する請求項５に記載のにおい検知方法。