JP2016523546A - 匂い物質および香り受容体を特定、単離および使用する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、匂い物質または香り、特にインドールおよびスカトール悪臭に対する哺乳動物の嗅覚受容体の特異的ファミリーを特定するための新規の方法、並びにその活性を調節する化合物(遮断、増強、遮蔽または模倣する化合物)の発見に用いることができるアッセイにおける前記方法の使用を提供する。マウスのオーファン嗅覚受容体を、標的化合物に応答する嗅神経細胞から特定する。得られた受容体およびそのヒトのカウンターパートを、アッセイにおいて試験化合物に対してスクリーニングし、それによってそれらを匂い物質または香りの受容体、特に悪臭受容体と特定することができ、次いで、例えばヒトにおける悪臭の知覚を阻害するモジュレーターを発見することができる。
Description
本技術分野は、匂い物質および香り受容体、並びに匂い物質および/または香り化合物の特定に用いることができる、より具体的にはインドールまたはスカトールなどの悪臭化合物のインヒビターまたは抑制体の特定に用いることができるアッセイに関する。
背景技術
嗅覚は、ヒトの感覚系のうち、最も複雑でかつ十分な解明が進んでいないものの1つである。嗅覚受容体(OR)の活性化から知覚にかけては、なおもさらなる研究を要する多くのステップが存在する。個々の匂い物質および混合物に対するORコードがどのようにして知覚に変換されるかが解明されれば、この知見を様々な分野において顕著な利点をもたらすべく利用することができる。こうした分野には、匂いのモジュレーター、例えば不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または毒性化合物に代わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、並びに匂いの増強剤が含まれ、これらによって、天然源由来の供給源化合物に対する我々の依存性が制限されると考えられる。「嗅覚コード」の組み合わせの典型は、全ての単一のORは複数の匂い物質によって活性化されることができ、かつ逆にほとんどの匂い物質は複数のORを活性化しうるという所見に集約される。マウスゲノム中には、約1,200種の異なるORが存在する。一方で、ヒトは約400種のORを有する。どちらの場合にも、ORレパートリーは世界中の何千もの匂い物質によって活性化され、そしてこの組み合わせの複雑さによって、我々が知覚しうる嗅覚が広がる。しかし、2010年現在で従来の脱オーファン化法を用いて特定されているのは、わずか82種のマウスOR(約77%)および17種のヒトOR(約44%)に対する匂い物質またはリガンドのみである。さらに、主にインビトロで特定されたヒトORとの生理的関連性に関して試験が行われたリガンドは、ほとんどない。
嗅覚は、ヒトの感覚系のうち、最も複雑でかつ十分な解明が進んでいないものの1つである。嗅覚受容体(OR)の活性化から知覚にかけては、なおもさらなる研究を要する多くのステップが存在する。個々の匂い物質および混合物に対するORコードがどのようにして知覚に変換されるかが解明されれば、この知見を様々な分野において顕著な利点をもたらすべく利用することができる。こうした分野には、匂いのモジュレーター、例えば不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または毒性化合物に代わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、並びに匂いの増強剤が含まれ、これらによって、天然源由来の供給源化合物に対する我々の依存性が制限されると考えられる。「嗅覚コード」の組み合わせの典型は、全ての単一のORは複数の匂い物質によって活性化されることができ、かつ逆にほとんどの匂い物質は複数のORを活性化しうるという所見に集約される。マウスゲノム中には、約1,200種の異なるORが存在する。一方で、ヒトは約400種のORを有する。どちらの場合にも、ORレパートリーは世界中の何千もの匂い物質によって活性化され、そしてこの組み合わせの複雑さによって、我々が知覚しうる嗅覚が広がる。しかし、2010年現在で従来の脱オーファン化法を用いて特定されているのは、わずか82種のマウスOR(約77%)および17種のヒトOR(約44%)に対する匂い物質またはリガンドのみである。さらに、主にインビトロで特定されたヒトORとの生理的関連性に関して試験が行われたリガンドは、ほとんどない。
文献には様々なORの脱オーファン化法が記載されている[例えばTouhara 2007 Deorphanizing vertebrate olfactory receptors: Recent advances in odorant-response assays Neurochem Int 51, 132-139 and Saito et al (2009) Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal 2, ra9 and Peterlin et al. (2014), The State of the Art of Odorant Receptor Deorphanization: a Report from the Orphanage, J Gen Physiol; 143(5): 527-42]。これらの方法の多くは、ORがハイスループットスクリーニングに適した非嗅細胞で発現される細胞ベースのアッセイに専ら依拠している。しかし、ORは多くの場合、そのような異種細胞の小胞体内に保持されている。従って、細胞表面へのトラフィックなしでは、ORは匂い物質と相互作用することができない。[Min et al. (2004) Endoplasmic reticulum degradation impedes olfactory G-protein coupled receptor functional expression. BMC Cell Biol 5, 34]。従って、数百ないし数千の様々な細胞株において各細胞株が匂い物質活性を評価できる特有のORタンパク質を有する体系的なアプローチは、匂い物質とORとの間の組み合わせの相互作用の包括的解読に適したアプローチではない。何故ならば、受容体の多くまたはほとんどはこのような細胞株において正常に機能しないためである。従って、生体内に存在するORの全レパートリーの中から、1種以上の匂い物質によって特異的に活性化または阻害される比較的小さなORのサブセットを迅速かつ確実に特定することができる新規の方法が求められている。さらに、嗅神経細胞自体からのORの特定を含む方法であって、その際、ORが完全に機能的であるものと推定され、従って非嗅細胞におけるORアッセイの周知の困難が回避される前記方法も求められている。
悪臭化合物、例えばインドール、スカトール(3−メチルインドール)およびp−クレゾールは、例えばトイレや糞便を含む他の「バスルーム」の源から生じる不快な匂いを発生させる。従って、例えばヒトの匂い化合物を遮蔽または低減させる悪臭中和剤が望ましい。匂い物質受容体、より詳細には悪臭受容体を特定することが必要である。インドールまたはスカトールに結合する受容体は特定されつつあり、かつこうした受容体に結合する化合物が発見されつつあり、かつ悪臭の潜在的モジュレーターとして報告されつつある。しかし哺乳動物中には極めて多くのORが存在しているため、悪臭、特にインドールまたはスカトールに結合する受容体の完全なレパートリーの迅速な特定が継続的に望まれている。さらに、こうした受容体に結合する新規の有効な化合物を特定するための新たな悪臭受容体に依拠したアッセイが望まれている。
概要
本明細書においては、匂い物質および/または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の匂い物質または香り受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と匂い物質または香り化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質または香りにより誘発された神経細胞活性の変化を測定すること;
e)匂い物質または香り化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、匂い物質受容体および香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
本明細書においては、匂い物質および/または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の匂い物質または香り受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と匂い物質または香り化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質または香りにより誘発された神経細胞活性の変化を測定すること;
e)匂い物質または香り化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、匂い物質受容体および香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
さらに本明細書においては、悪臭化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること;
e)悪臭化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること;
e)悪臭化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
さらに本明細書においては、以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有する、単離された核酸配列が提供される。
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有する、単離された核酸配列が提供される。
さらに本明細書においては、上記の通りの単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が提供される。
さらに本明細書においては、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
さらに、インドールおよび/またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書においては、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および/または増強する化合物を特定するための方法であって、以下:
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること;
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること;
を含み、ここで、前記受容体は上記のポリペプチドであるものとする前記方法が提供される。
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること;
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること;
を含み、ここで、前記受容体は上記のポリペプチドであるものとする前記方法が提供される。
一実施形態においては、前記化合物の活性は、インドールおよび/またはスカトールへのその結合の比較により決定される。他の実施形態においては、前記受容体と化合物とは、スカトールおよび/またはインドールの存在下に、スカトールおよび/またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触される。
本明細書において提供されるさらなる一実施形態においては、結合活性の測定に機能アッセイが用いられる場合には、本明細書において提供される受容体のシグナル伝達活性を測定するステップは、セカンドメッセンジャーのレベルの変化の検出を含むことができる。他の実施形態においては、シグナル伝達活性の測定が提供され、その際、前記シグナル伝達活性を測定するステップは、グアニンヌクレオチド結合/カップリングまたは交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、プロテインキナーゼA活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウムフラックス、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性の測定、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイまたはレポーター遺伝子発現を含む。本明細書において提供される特定の一実施形態においては、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイの使用を含む。蛍光および発光アッセイは、Ca2+感受性フルオロフォア、例えば00flu03Flu04 15またはFura(Molecular probesprobes);Ca3キットファミリー(Molecular Device)およびイクオリンの使用を含むことができる。
詳細な説明
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および/または」を意味する。同様に、「含む」および「包含する」は互換的であり、かつ限定を意図するものではない。さらに、様々な実施形態の説明において「含む」という用語が用いられる場合、幾つかの特定の事例において、実施形態を「主に〜からなる」または「からなる」という用語を用いても説明することができることは、当業者の当然とするところであるものと理解されたい。
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および/または」を意味する。同様に、「含む」および「包含する」は互換的であり、かつ限定を意図するものではない。さらに、様々な実施形態の説明において「含む」という用語が用いられる場合、幾つかの特定の事例において、実施形態を「主に〜からなる」または「からなる」という用語を用いても説明することができることは、当業者の当然とするところであるものと理解されたい。
定義
以下の用語は、別段の記載がない限り、それらに与えられた意味を有する。
以下の用語は、別段の記載がない限り、それらに与えられた意味を有する。
「OR」とは、嗅細胞において発現されるGタンパク質共役受容体のファミリーの1つ以上のメンバーを指す。嗅覚受容体細胞は、形態に基づいて、または嗅細胞において特異的に発現されるタンパク質の発現によっても特定されることができる。ORファミリーメンバーは、嗅覚伝達のための受容体として作用する能力を有しうる。
「インドール」および/または「スカトールOR」とは、嗅細胞中で発現されるGタンパク質共役受容体のファミリーのメンバーを指し、その受容体は、GPCRに結合しかつ/またはGPCRを活性化させるリガンドを特定するための結合または活性アッセイにおいて、インドールおよび/またはスカトールと結合しかつ/またはインドールおよび/またはスカトールにより活性化される。このようなアッセイについて、以下に記載する。本明細書におけるインドールおよび/またはスカトール受容体には、インドールおよび/またはスカトールに応答または結合する、断片、合成のおよび自然に存在する変異体、並びにキメラが含まれる。
「OR」核酸は、「Gタンパク質共役受容体活性」を有する7つの膜貫通領域を有するGPCRのファミリーをコードし、例えば、それらは細胞外刺激に応答してGタンパク質に結合し、かつセカンドメッセンジャー、例えばIP3、cAMP、cGMPおよびCa2+の産生を、酵素、例えばホスホリパーゼCおよびアデニル酸シクラーゼの刺激を介して促進することができる。
「OR」ポリペプチドは、約1kbの長さの単一エクソンによりコードされる7つの膜貫通ドメインを有するGタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属し、かつ特徴的な嗅覚受容体特異的なアミノ酸モチーフを示すと考えられる。これら7つのドメインは「膜貫通」または「TM」ドメインTM I〜TM VIIと称され、これらは3つの「細胞内ループ」または「IC」ドメインIC I〜IC III、および3つの「細胞外ループ」または「EC」ドメインEC I〜EC IIIにより連結される。前記モチーフは、これらに限定されるものではないが、TM IIIおよびIC IIに重なるMAYDRYVAICモチーフ、IC IIIおよびTM VIに重なるFSTCSSHモチーフ、TM VIIにおけるPMLNPFIYモチーフ、並びにEC IIにおける3つの保存されたC残基、およびTM Iにおける高度に保存されたGN残基の存在と定義される。((Zhang and Firestein (2002), The Olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5(2):124-33; Malnic et al., The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584-9))。
「N末端ドメイン」領域は、N末端で始まり、かつ最初の膜貫通領域の始点に近い領域まで延びる。7つの「膜貫通領域」を含む「膜貫通ドメイン」とは、原形質膜内に存在するORポリペプチドのドメインを指し、これには対応する細胞質(細胞内)および細胞外ループも含まれうる。7つの膜貫通領域並びに細胞外および細胞質ループは、Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)またはStryerにおいて記載されているような標準的な方法を用いて特定することができる。膜貫通ドメインの一般的な二次および三次構造、特に嗅覚受容体のようなGタンパク質共役受容体の7つの膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている。従って、一次構造配列は、以下に詳細に説明するように、既知の膜貫通ドメイン配列に基づいて設計または予測されることができる。これらの膜貫通ドメインは、可溶性相および固相の双方でインビトロでのリガンド結合アッセイに有用である。
ORファミリーメンバーにより媒介される嗅覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における「機能アッセイ」という用語には、間接的または直接的に受容体の影響下にある任意のパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用の決定が含まれる。これには、リガンド結合、イオンフラックス、膜電位、電流、転写、Gタンパク質結合、GPCRリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達受容体−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度(例えばcAMP、cGMP IP3または細胞内Ca2+)のインビトロ、インビボおよびエキソビボでの変化が含まれ、さらに、他の生理学的作用、例えば神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少も含まれる。本明細書には、間接的または直接的にORファミリーメンバーの影響下にあるパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用を増加または減少させる化合物についての機能アッセイが含まれる。このような機能アッセイまたは作用は、当業者に知られている任意の手段によって測定されることができ、例えば分光学的特性(例えば蛍光、吸光度、屈折率)、流体力学的特性(例えば形状)、クロマトグラフ特性または溶解特性の変化、パッチクランプ、電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカー、卵母細胞OR遺伝子発現;組織培養細胞OR発現;OR遺伝子の転写活性化;リガンド結合アッセイ;電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化;イオンフラックスアッセイ;細胞内セカンドメッセンジャー、例えばcAMP、cGMPおよびイノシトール三リン酸(IP3)の変化;細胞内カルシウムレベルの変化;神経伝達物質放出などによって測定されることができる。
OR遺伝子またはタンパク質の「インヒビター」、「アクチベーター」、「抑制体」および「モジュレーター」は互換的に用いられ、嗅覚形質導入についてのエキソビボ、インビトロおよびインビボアッセイを用いて特定される阻害、活性化または調節分子を指し、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびそれらのホモログおよび模倣物を指す。インヒビターとは、例えば、結合することによって刺激を部分的または完全に遮断し、活性化を減少、妨害、遅延させ、嗅覚伝達を不活化、脱感作または下方調節する化合物であり、例えばアンタゴニストである。アクチベーターとは、例えば、結合することによって活性化を刺激、増大、開放、活性化、促進、増強させ、嗅覚伝達を感作または上方調節する化合物であり、例えばアゴニストである。モジュレーターには、例えば受容体と以下のものとの相互作用を変更する化合物が含まれる:アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質(例えば、匂い物質結合タンパク質、エブネリン(ebnerin)、および疎水性キャリアファミリーの他のメンバー);Gタンパク質;キナーゼ(例えば、受容体の不活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼのホモログ);およびアレスチン(これもまた、受容体を不活性化および脱感作する)。モジュレーターには、ORファミリーメンバーの遺伝的に改変されたバージョン、例えば活性が改変されたバージョン、並びに天然由来および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子などが含まれうる。インヒビターおよびアクチベーターについてのそのようなアッセイには、例えば、細胞または細胞膜におけるORファミリーメンバーの発現、フレーバーまたはフレグランス分子、例えば甘味物質または悪臭の存在または不在下での推定モジュレーター化合物の適用、および次いで上記のような嗅覚伝達に対する機能作用の決定が含まれる。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを用いて処理されたORファミリーメンバーを含むサンプルまたはアッセイを、このインヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較することによって、調節の程度が調べられる。(モジュレーターで処理されない)対照サンプルは、100%の相対的OR活性値に設定される。対照に対するOR活性値が約80%、場合により50%、または25〜0%である場合には、ORの阻害が達成される。対照に対するOR活性値が110%、場合により150%、場合により200〜500%、または1000%〜3000%超である場合には、ORの活性化が達成される。
本明細書において用いられる場合に、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その自然状態で結合している他の非類似化合物を含まない状態を指す。従って、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象物は、所与のサンプルを少なくとも0.5質量%、1質量%、5質量%、10質量%または20質量%、最も好ましくは少なくとも50質量%または75質量%含む。好ましい一実施形態においては、これらの用語は、所与のサンプルを少なくとも95質量%含む本発明の化合物を指す。本明細書で使用される場合に、「精製された」「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、1種の核酸または1種のタンパク質、複数の核酸または複数のタンパク質に関する場合には、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態をも指す。(1)他の随伴される構造体または化合物からの精製、または(2)哺乳動物、特にヒトの体内では通常では随伴されることのない構造体または化合物の随伴を含む、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものよりも高い精製または濃縮のいかなる程度も、「単離された」の意味に含まれる。本明細書に記載の1種の核酸若しくは1種のタンパク質または複数の核酸若しくは複数のタンパク質の群は、当業者に知られている様々な方法およびプロセスにより、単離されてもよいし、通常は自然にはこれらに随伴することのない構造体または化合物を伴っていてもよい。
本明細書で使用される場合に、「単離された」という用語は、核酸またはポリペプチドに関する場合には、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態を指す。(1)他の自然に生じる随伴構造体または化合物からの精製、または(2)体内では通常では随伴されることのない構造体または化合物の随伴を含む、体内で自然に生じるものよりも高い精製または濃縮のいかなる程度も、本明細書で使用される場合の「単離された」の意味に含まれる。本明細書に記載の複数の核酸または複数のタンパク質は、当業者に知られている様々な方法およびプロセスにより、単離されてもよいし、通常は自然にはこれらに随伴することのない構造体または化合物を伴っていてもよい。
本明細書において使用される場合に、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に説明するように、自然に発現された核酸の組換えの発生または検出に適した任意の増幅方法の使用を指す。例えば本発明は、本発明の自然に発現された(例えばゲノムまたはmRNA)または組換えの(例えばcDNA)核酸をインビボまたはインビトロで(例えばポリメラーゼ連鎖反応、PCRにより)増幅するための方法および試薬(例えば特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマー対)を提供する。
「7回膜貫通型受容体」という用語は、原形質膜を7回貫通する7つのドメインを有する膜貫通型タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する(従って、これら7つのドメインは「膜貫通」または「TM」ドメインTM I〜TM VIIと称される)。嗅覚および特定の味覚受容体のファミリーのそれぞれが、このスーパーファミリーに属する。以下でさらに詳細に説明するように、7回膜貫通型受容体ポリペプチドは、類似しかつ特徴的な一次、二次および三次構造を有する。
「核酸」または「核酸配列」という用語は、1本鎖または2本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを指す。この用語には、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドが含まれる。またこの用語には、合成骨格を有する核酸様構造体も含まれる。別段の記載がない限り、個々の核酸配列には、その保存的に改変された改変体(例えば縮重コドン置換体)および相補配列、ならびに明示された配列が暗に含まれる。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば1つ以上の選択されたコドンの第3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列の生成により達成されることができる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においては互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「異種」という用語は、核酸の部分に関して使用される場合には、当該核酸が、自然において互いに同一の関係では見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には組換えにより生成され、新たな機能的核酸を生成するために配置された無関係の遺伝子由来の2つ以上の配列を有し、例えばある供給源からのプロモーターおよび他の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が自然において互いに同一の関係では見出されない2つ以上の配列を含むこと(例えば、融合タンパク質またはキメラ)を示す。
本明細書で使用される場合に、「組換え」とは、合成されたかまたはさもなくばインビトロで操作されたポリヌクレオチド(例えば「組換えポリヌクレオチド」)、細胞または他の生物学的系における遺伝子産物の産生に組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド(「組換えタンパク質」)を指す。
「組換え手段」には、本発明のトランスロケーションドメインおよび本発明のプライマーを用いて増幅された核酸配列を含む融合タンパク質を発現させる、例えば誘導的または構成的に発現させるための発現カセットまたはベクターへの、異なる供給源からの様々なコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションも含まれる。
「発現ベクター」という用語は、本発明の核酸配列を、インビトロまたはインビボで、原核生物、酵母、真菌、プラン、昆虫または哺乳動物の細胞を含む任意の細胞において構成的または誘導的に発現させる目的での任意の組換え発現系を指す。この用語には、線状または環状の発現系が含まれる。この用語には、エピソームのままであるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現系が含まれる。この発現系は自己複製能力を有することも有しないこともでき、すなわち、細胞内で一過性の発現を駆動することができる。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最低限の要素のみを含む組換え発現「カセットが含まれる。
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現をサポートする細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞、例えばCHO、HeLa、HEK−293など、例えば培養細胞、外植片および生体内細胞であることができる。
一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13,配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71および配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する単離された核酸配列が提供される。
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13,配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71および配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する単離された核酸配列が提供される。
一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸配列が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸配列が提供される。
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードする、単離された核酸配列が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードする、単離された核酸配列が提供される。
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14および配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14および配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
本発明の目的のために、本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片は、断片になっている受容体のシグナル伝達活性を示すことができるポリペプチドの断片である。このような断片は、断片となっている受容体のシグナル伝達活性の60%、70%、80%、90%または実質的に全てを示すことができる。
この方法によって、当業者は、そのヒトの遺伝子のカウンターパートがヒトにおいて特定の匂い特性をコードするものと考えられる嗅覚受容体(OR)の比較的小さなサブセットを、齧歯類のゲノム中に存在する約1,200種のORの全集団の中から迅速に特定することが可能となる。図1は、この方法の概略図である。無傷マウスの嗅上皮(OE)組織を、機械的および酵素処理により単一細胞に解離する。生じる個々の嗅神経細胞(OSN)をガラスカバースリップ上に播種し、かつカルシウム指示色素(例えばFura−2)を負荷することにより細胞活性を検出する。このカバースリップを、次いで灌流チャンバー中に配置し、かつ生理食塩水に浸漬する。悪臭試験匂い物質を生理食塩水中で希釈し、かつ細胞に灌流する。その後、OSN活性を、Fura−2蛍光の変化および蛍光顕微鏡による細胞内カルシウムフラックスの変化のモニタリングにより検出する。重要なことには、いくつかの例では、可能性のある約1,200のOR遺伝子のうち1つまたは2つのみが、所与のOSNにおいて発現される。このことは、所与のOSNの活性が、細胞表面上で発現された単一種類のORタンパク質によってのみ駆動されることを意味する。細かく制御された匂い物質注入システムと可動ステージとを備えた半自動化カルシウムイメージングシステムでは、単一の実験で約2,500のOSNのモニタリングが可能である。マウスには約1,200種のOR遺伝子があるが、このスループットは全てのORレパートリーの代表的なサンプリングを保証する。1種以上の試験匂い物質に応答する1種以上のOSNをガラスマイクロピペットを用いて収集し、かつその後のRNAの抽出、増幅およびOSNのトランスクリプトームの次世代シーケンシング(NGS)のために、マイクロチューブへと移す。文献には、非常に少量(<100の細胞)の出発材料からのNGSベースのトランスクリプトームシーケンシングが報告されている。しかし本出願人の知る限り、これは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、特に嗅覚受容体の脱オーファン化という特定の目的ではまだ適用されていない。所望であれば、本明細書に記載の方法を用いて、複数のOSNを同一のマイクロチューブ内にプールすることができる。その後、生配列リードをリファレンスゲノムにマッピングし、適切なアライメントおよびアノテーションのために視覚的に検査し、かつ例えばゲノムの反復配列に基づく偽陽性マッピングについて解析する。その結果、マウスのOSNのスクリーニングに使用したのと同一の1種以上の悪臭試験匂い物質により活性化されると考えられる候補マウスORのリストが得られる。その後、この候補マウスORタンパク質配列を用いて公共マウスゲノムデータベースを検索し(例えばBLASTP)、それにより候補マウスOR配列の完全なリストを取得する。これらの候補は、もともとインドールおよび/またはスカトールによって活性化された神経細胞から特定されたNGS由来のOR配列に対する配列相同性によって関連している(すなわちパラロガスである)。その後、これらのマウスパラログ(NGSおよびBLASTP由来)の完全なリストを用いて公共ヒトゲノムデータベースを検索することによって、このマウスOR配列に関連する(すなわちオーソロガスな)候補ヒトOR配列のリストを取得する。その結果、試験匂い物質によって活性化されると考えられる候補のマウスおよびヒトのORの完全なリストが得られる。得られた候補OR遺伝子の活性を確認するために、これらの遺伝子のcDNAを利用可能な発現ベクターにクローニングし、かつハイスループットスクリーニングに適した培養細胞(例えばHEK293T)へトランスフェクトすることができる。その後、それぞれ組換えにより発現された候補OR cDNAを含む得られた細胞株を、カルシウムイメージングにおいて使用される試験匂い物質および他の構造的または官能的に関連する匂い物質を用いた細胞ベースの活性アッセイにおいてスクリーニングすることができる。
特定の一実施形態においては、例えばAraneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従って、非ヒト哺乳動物(例えばマウス)からのネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離し、かつ単一細胞に解離する。特定の一実施形態においては、各神経細胞は1度に1種または2種の受容体を発現する。一実施形態においては、嗅神経細胞の生成に使用される嗅覚組織は、受容体および関連する配列に関する公的に利用可能なデータを有する非ヒト哺乳動物に由来する。これには、マウス、ラットおよびハムスターの組織が含まれる。解離プロトコルは、記録可能な神経細胞の生存率が確実に高くなるように最適化されるべきである。特定の一実施形態においては、最低で約1,500の異なる感覚神経細胞を記録する。
さらなる実施形態においては、指示体を、蛍光カルシウム指示色素、カルシウム指示タンパク質、蛍光cAMP指示薬、cAMP応答配列(CRE)媒介性レポータータンパク質、生化学的cAMP HTRFアッセイ、β−アレスチンアッセイ、または電気生理学的記録から選択する。特に、嗅神経細胞の膜上で発現される嗅覚受容体の活性のモニタリングに使用可能なカルシウム指示色素を選択する(例えばFura−2 AM)。
特定の一実施形態においては、化合物を順次スクリーニングし、かつカルシウム色素蛍光の匂い物質依存性変化を、蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いて測定する。
例えば、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極またはFACS装置のいずれかを使用して1種以上の悪臭化合物をスクリーニングした後に、嗅神経細胞を単離する。より詳細には、少なくとも1つの神経細胞を単離する。マウス嗅神経細胞を、以前に記載された手順(Malnic et al.; Areneda et al., 2004)に類似したCa2+イメージングによりスクリーニングする。特に、電動式可動顕微鏡ステージを使用することによって、スクリーニング可能な細胞数を1回の試験当たり少なくとも1,500に増加させる。マウスには約1,200種の異なる嗅覚受容体が存在し、かつ各嗅神経細胞は1,200種の嗅覚受容体遺伝子のうち1つまたは2つしか発現しないため、このスクリーニング能力は、事実上、全てのマウス嗅覚受容体レパートリーを網羅する。換言すれば、ハイスループットの嗅神経細胞スクリーニングのためのカルシウムイメージングの組み合わせによって、匂い物質の特定のプロファイルに応答する嗅覚受容体がほぼ全て特定される。特定の一態様においては、2つの一般的なトイレの悪臭化合物であるインドールおよびスカトールの双方に応答する匂い物質を単離することができる。
嗅神経細胞のカルシウムイメージングのために、主嗅上皮を、神経細胞の解離前にマウスから切開することができる。切開された嗅上皮を、その後、機械的および酵素的解離のために解離バッファーに移すことができる。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により数千の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種することができ、かつ、これらの細胞にカルシウム感受性色素(Fura−2 AM)を例えば31℃で約30分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移すことができる。解離された嗅神経細胞上に(生理食塩水中の)匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激する。例えば受容体を悪臭化合物50μmで刺激した後、Fura−2蛍光の変化により示される細胞内Ca2+フラックスをモニタリングすることによって、悪臭化合物に応答する希少な細胞を特定する。解析の後、応答細胞を、吸引マイクロピペットを用いてガラスカバースリップから取り出すことができる。その後、単離された細胞を、これに続いて応答細胞中のmRNAとして発現される嗅覚受容体遺伝子を特定するためにプールして1つのサンプルとする。
特定の一実施形態においては、嗅神経細胞のmRNAを、Marko, N. F., et al., (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi: 10.1186/1471-2164-6-27に包括的に記載されている方法(Eberwine法)によって精製および増幅する。トランスクリプトームの少なくとも一部(トランスクリプトーム全体までを含む)を、次世代シーケンシング(NGS)を用いて配列決定するか、またはマイクロアレイ技術を用いて既知の遺伝子にハイブリダイズする。NGSは、Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11(1), 31-46; doi: 10.1038/nrg262において包括的に議論され、かつ説明されている。特定の一実施形態においては、同一の応答プロファイルを示す神経細胞を最低で5つプールし、かつ2回の連続するインビトロ転写(IVT)によりmRNAを増幅する。mRNAを、ピッキング後すぐに細胞溶解により放出する;DNアーゼなしで、かつ精製ステップを行わない。この増幅を、次のパラメーターを使用してMesageAmpII aRNA kit(Ambion, AMA1751)により行うことができる:連続する14時間にわたるIVTを2回。
さらなる一実施形態においては、NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体の群または遺伝子ファミリーを(例えば、ピッキングされた神経細胞の数と同数まで)特定する。特に、推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のNGSサンプル中でのmRNAの量が極めて多いか、または複数の独立した生物学的複製中に存在する。嗅覚コードの組み合わせの性質(1種の化合物が複数のORを活性化し、かつ1種ORが複数の化合物により活性化されうる)のために、所与の化合物によって活性化された複数の神経細胞をプールすることによって、単一のNGS試験においてこれらの分子を認識する役割を果たす受容体を事実上全て探索することが可能となる。従って、機能的に類似した神経細胞をプールすることによって、脱オーファン化のスループットおよび速度が大幅に改善される。
次に、標準的なバイオインフォマティクスツールを用いて、相同の受容体配列は類似の機能を保持するという仮定の下に、他の推定哺乳動物(非ヒト)の1種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連するヒトの1種以上の匂い物質受容体を特定する。Adipietro et al. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8(7): e1002821. doi:10.1371/ journal.pgen.1002821。BLASTPおよび/またはBLASTNアルゴリズムのデフォルトパラメーターを使用することができる。
ヒトまたは非ヒト哺乳動物の悪臭受容体を、悪臭化合物の活性を模倣、遮断、調節および/または増強する化合物の特定に用いることができる機能アッセイに適合させることができる。特にこのアッセイは細胞アッセイであってよく、かつ化合物を特定する方法はハイスループットスクリーニングアッセイであってよい。より詳細には、本明細書において提供されるのは、調節化合物(例えば、遮断、増強および遮蔽)を発見するための化合物ライブラリーを用いた受容体のハイスループットスクリーニングに適合可能な受容体ベースのアッセイである。
特定の一実施形態においては、悪臭受容体遺伝子配列を、インドールおよびスカトール感受性細胞から以下のように特定する:プールされた神経細胞を75℃に10分間加熱することにより細胞膜を破壊し、かつそのmRNAを増幅できるようにする。限られた量の出発材料、典型的には1〜15の細胞を用いてNGS技術を適用する場合には、この増幅ステップが重要である。Eberwine法による線形的増幅(IVT)によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。一晩(14時間)のインビトロ転写を連続して2回行うことにより、十分な量のcRNAを得る;次に、増幅されたcRNAを用いてIllumina HiSeq cDNA libraryを作成する。得られた典型的には75〜150の塩基対の短い配列(一般に「リード」と称される)をマウスのリファレンスゲノム(例えば、UCSCのバージョンmm9またはmm10)に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成する。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストが得られる。極めて高レベルの量のmRNAを示す(「リード」が極めて多い)かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子が、推定インドールおよびスカトール受容体と考えられる。
その後、予測マウスOR遺伝子を用いてマウスおよびヒトのゲノムデータベースの双方の最新版をマイニングすることによって、極めて密接に関連する(すなわち極めて高い配列類似性を示す)受容体を、マウスにおいて(パラロガス遺伝子)およびヒトにおいて(オーソロガス遺伝子)特定する。このプロセスは、配列類似性検索ツールであるBLAST検索アルゴリズム(NCBIのウェブサイトで公的に入手可能)を用いて行うことができ、その際、初期のトランスクリプトーム解析から予め得られた各推定遺伝子配列をクエリー配列として使用する。このデータマイニングプロセスから特定される新たに特定された遺伝子も、パラロガス遺伝子とオーソロガス遺伝子とが類似の活性を有する可能性が高いという仮定の下に、潜在的悪臭受容体と考えられる。特定の一実施形態においては、配列相同性のペアワイズ比較を行うことによって、以下の反復スキームを用いてマウスおよびヒトにおける密接に関連する受容体の特定を行う:ステップ検索配列BLASTN/BLASTP結果マウス候補1→マウスパラログ1およびヒトオーソログ1マウスパラログ1→ヒトオーソログ2ヒトオーソログ1→ヒトパラログ1ヒトオーソログ2→ヒトパラログ2 パラログ=同種におけるホモログ、オーソログ=異種におけるホモログ。パラロガス遺伝子を、その後、マルチアライメントツールを用いてアライメントすることによって系統樹を作成する。インビトロでの機能データを、密接に関連してはいるが異なる受容体間のそのような系統学的関係に照らして解釈することができる。このステップは、例えば、インドールおよびスカトールといった試験化合物に程度の差はあれ応答する完全なOR遺伝子ファミリーの特定において不可欠である。脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補OR遺伝子をさらに、嗅神経細胞の単離に使用された化合物および関心の持たれる他の構造的に関連する化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。一実施形態においては、脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補OR遺伝子をさらに、最初に前記嗅神経細胞の単離に使用された化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。インビトロで発現された同一の候補OR遺伝子を、さらに、関心の持たれる他の構造的に関連する化合物を用いてスクリーニングする。
本明細書に記載のプロセスおよび方法を用いて、インドールおよびスカトール悪臭に応答する嗅神経細胞(マウスOR)のトランスクリプトームのシーケンシング(NGS)を行うことにより、以下の受容体を直接特定した。次いで、マウスORに対して極めて高いアミノ酸同一性の程度を有するヒトのインドールおよびスカトール受容体を、利用可能なゲノムデータベースの検索により特定した(第1表)。インドールおよびスカトールの双方への曝露後に応答する細胞をピッキングした後に、本明細書に記載のNGS法によって、マウス受容体Olfr740およびOlfr665を最初に特定した。対応するヒト相同受容体OR11G2およびOR52N2のそれぞれを、さらにアミノ酸配列の類似性の比較により特定した。実施例4および5に示すように、候補マウス受容体Olfr740およびOlfr665、並びにそれらのヒトのカウンターパートOR11G2およびOR52N2は、インドールによりおよびスカトールによりインビトロで活性化されたため、これらをインドールおよび/またはスカトール受容体と称する。同様に、候補マウス受容体Olfr746、Olfr745、Olfr207、Olfr211およびOlfr257によって、同一のステップに従って、それぞれヒト受容体OR11H4、OR11H6、OR5AC2、OR4C15およびOR8S1を特定した。これらのヒトOR遺伝子も、インビトロでインドールおよびスカトールの双方に応答した。総合すると、本明細書に記載の方法によって特定された7種の試験された推定ヒト受容体のうち7種が、インドールおよびスカトール受容体として確認され、これはさらに、ヒトのインドールおよびスカトール受容体を効率的に特定するための前記方法を支持するものである。
匂い物質受容体の脱オーファン化へのこのアプローチは、以前に確立された単一細胞RT−PCR法に対して幾つかの主要な利点を有する。第1に、匂いおよび/または香りに対して類似の結合特性を共有する複数の神経細胞をプールすることにより、独自のmRNAシーケンシング試験(NGS)で、標的悪臭化合物により活性化される受容体が事実上全て特定される。従って、スループットは以前に達成されたものよりも高い。第2に、複数の細胞をプールして1つのサンプルとすることができるため、このアプローチによって、試験間での複製サンプルの総合的な比較による遺伝子の選択が可能となる。第3に、NGSはORに特異的なPCRプライマーの使用を必要としない。NGSはまた、問題が多くかつ多くの場合非線形的または非特異的PCR増幅のために偽陽性をもたらす、ORに特異的な縮重プライマーの使用を必要としない。特に、ORコード配列は単一エクソン内にあることから、ゲノムDNAでのサンプル汚染がOR遺伝子配列の非特異的増幅を容易に導きうる。第4に、RT−PCR解析は、固有の偽陽性率のため、プールされたサンプルに対して行うことは困難である。単一細胞のmRNAのハイブリダイゼーション試験は、高密度DNAマイクロアレイチップを用いて行われている。しかし、このアプローチは一般的にNGSより感度が低く、かつさらには、対応するDNAプローブを合成する必要がある既知の遺伝子に制限されている。
従って、NGSの使用はORの迅速な特定にとって著しく有利であり、かつ最終的には、標準的な(例えばRT−PCRおよびマイクロアレイ)アプローチよりも正確な候補受容体の選択をもたらす。
さらなる一実施形態においては、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞から特定されたマウス受容体を、そのN末端で短ポリペプチド配列(例えばウシロドプシン受容体−RhoまたはFlag)で修飾し、一過的にHEK293T細胞中で発現させ、かつインドールおよびスカトールで別々に刺激し、それによって、それらが真のインドール/スカトール受容体であることを確認する。ヒトGαサブユニットGαolf(配列番号21)の共発現によってGs伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部cAMPが増加する。その結果によって、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)がインドール−スカトール受容体であることが裏付けられる。
他の態様においては、ヒト受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)を、マウスOlfr665(配列番号9および配列番号10)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR11G2(配列番号13および配列番号14)を、マウスOlfr740(配列番号1および配列番号2)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR5AC2(配列番号75および配列番号76)を、マウスOlfr207(配列番号77および配列番号78)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR4C15(配列番号79および配列番号80)を、マウスOlfr211(配列番号81および配列番号82)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR8S1(配列番号83および配列番号84)を、マウスOlfr257(配列番号85および配列番号86)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。マウス受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した(実施例6)。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した(実施例6)。マウス受容体Olfr736(配列番号27および配列番号28)を、マウスOlfr740(配列番号1および配列番号2)とのその配列類似性ゆえにインドール/スカトール受容体と特定したが、これは嗅神経細胞から単離されたものであり、かつ恐らくは細胞表面発現の欠如のためにインドールにもスカトールに応答しない。マウス受容体Olfr747(配列番号39および配列番号40)およびOlfr748(配列番号41および配列番号42)も、マウスOlfr740(配列番号1および配列番号2)とのその配列類似性ゆえに特定されたが、例外的に、免疫染色アッセイによって評価された際には適切な細胞表面発現であるにもかかわらず、インドールにもスカトールに応答しない。このことは、高い類似性を示す配列が常に同一の応答プロファイルを共有するとは限らないという、嗅覚受容体の多様な性質を強調している。
受容体をRho配列で修飾し、かつHEK293T細胞中で安定的に発現させる。ヒトGαサブユニットGα15の共発現によってGq伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ca2+が増加する。
上記プロセスおよびここまでに得られた結果は、本プロセスが、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
さらに、インドールおよび/またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書において提供されるのは、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および/または増強する化合物を特定するための方法であって、以下:
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること、その際、前記受容体は上記ポリペプチドであるものとする、
を含む、前記方法である。
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること、その際、前記受容体は上記ポリペプチドであるものとする、
を含む、前記方法である。
一実施形態においては、前記化合物の活性を、インドールおよび/またはスカトールへのその結合の比較により決定する。他の実施形態においては、前記受容体またはそのキメラまたはその断片と前記化合物とを、スカトールおよび/またはインドールの存在下に、スカトールおよび/またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触させる。
さらなる一実施態様においては、化合物を、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される受容体またはそのキメラまたはその断片と接触させ、その際、前記受容体またはそのキメラまたはその断片を、ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞内で発現させる。
前記化合物の活性を、インビボ、エクスビボ、インビトロおよびシンセティックスクリーニングシステム用いて決定することができる。
他の実施形態においては、前記接触を、本明細書に記載のポリペプチドを含むリポソームまたはウイルス誘発出芽膜を用いて行う。
他の実施形態においては、スカトールおよび/またはインドールに結合する受容体に結合する化合物を特定するための方法を、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞からの膜画分上で実施されることができる。他の実施形態においては、
以下の実施例は単なる例示であり、要約、発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載される本発明の範囲の限定を意図するものではない。
以下の実施例は単なる例示であり、要約、発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載される本発明の範囲の限定を意図するものではない。
実施例
実施例1
インドールおよび/またはスカトールに結合する受容体を特定するためのマウス嗅神経細胞のスクリーニング、
マウス由来のネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離して単一細胞に解離した後、解離バッファーに移して穏やかに機械的および酵素的に解離した。解離プロトコルを最適化するために、新鮮な解離バッファーを作製するための一般的な手順を、Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従ったが、次の変更を加えた:DNアーゼIIに代えてDNアーゼIにし、Ca2+の濃度を5mMに高め、かつpHを32℃で7.35に調整した。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により2,500超の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種した。次いで、これらの細胞にカルシウム感受性色素(Fra−2 AM)を31℃で30分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移した。解離された嗅神経細胞を以前に記載された通りにスクリーニングしたが(Malnic et al.; Areneda et al., 2004)、電動式可動顕微鏡ステージを用いることで、スクリーニング可能な細胞数を増加させた。次いで、解離された嗅神経細胞上に(生理食塩水中の)匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激した。
実施例1
インドールおよび/またはスカトールに結合する受容体を特定するためのマウス嗅神経細胞のスクリーニング、
マウス由来のネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離して単一細胞に解離した後、解離バッファーに移して穏やかに機械的および酵素的に解離した。解離プロトコルを最適化するために、新鮮な解離バッファーを作製するための一般的な手順を、Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従ったが、次の変更を加えた:DNアーゼIIに代えてDNアーゼIにし、Ca2+の濃度を5mMに高め、かつpHを32℃で7.35に調整した。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により2,500超の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種した。次いで、これらの細胞にカルシウム感受性色素(Fra−2 AM)を31℃で30分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移した。解離された嗅神経細胞を以前に記載された通りにスクリーニングしたが(Malnic et al.; Areneda et al., 2004)、電動式可動顕微鏡ステージを用いることで、スクリーニング可能な細胞数を増加させた。次いで、解離された嗅神経細胞上に(生理食塩水中の)匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激した。
インドール50μmで、次いでスカトール50μmで受容体を刺激し、かつFura−2蛍光の変化により示される細胞内Ca2+フラックスをモニタリングすることによって、インドールおよびスカトールに応答する嗅神経細胞を特定した。図2に、インドールおよびスカトールの双方(各50μΜ)によって特異的に活性化された7つの独立した嗅神経細胞についてのCa2+イメージングトレースを示す。全ての細胞を、酵素アデニル酸シクラーゼACIIIの薬理学的活性化因子であるフォルスコリン(fork)20μΜでも刺激し、それにより細胞の生存能力および神経細胞の特定を確認した。x軸上の時間スケール単位は6秒のフレームである。平均蛍光強度は、レシオメトリックな340/380nmの記録の結果としての相対的な蛍光単位である。
実施例2
インドールおよびスカトール感受性細胞からのmRNAの単離および増幅による、インドールおよびスカトール感受性受容体に関する「悪臭」遺伝子のcDNA配列の作成
実施例1の活性化された嗅神経細胞をガラス吸引マイクロピペットを用いて単離した後に、引き続き、応答細胞中のmRNAとして発現された匂い物質受容体遺伝子を特定するためにプールして1つのサンプルとした。悪臭受容体遺伝子配列を、次のようにインドールおよびスカトール感受性細胞から特定した:1種以上の悪臭化合物によって活性化される5種超の嗅神経細胞(各6、10、15および15の細胞)の4つの組を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極を用いて単離した。マイクロピペットはホウケイ酸ガラス(品目#B150−86−10、Sutter Instruments)から設計され、かつ次の条件下で微小電極プラー(P−1000型、Sutter Instruments)を用いて引かれたものである:熱、傾斜温度+20℃;Pull=0、Vel=120;圧力=500。引かれたピペットチップを手ではずし、かつカルシウムイメージングアッセイにおいて決定される際にインドールおよびスカトールにより活性化される嗅神経細胞を単離するためにNewportマイクロマニピュレーター(MW3R型)上に固定した。活性化されたOSNを、マイクロピペットの後端に適用される穏やかな吸引により単離した。
インドールおよびスカトール感受性細胞からのmRNAの単離および増幅による、インドールおよびスカトール感受性受容体に関する「悪臭」遺伝子のcDNA配列の作成
実施例1の活性化された嗅神経細胞をガラス吸引マイクロピペットを用いて単離した後に、引き続き、応答細胞中のmRNAとして発現された匂い物質受容体遺伝子を特定するためにプールして1つのサンプルとした。悪臭受容体遺伝子配列を、次のようにインドールおよびスカトール感受性細胞から特定した:1種以上の悪臭化合物によって活性化される5種超の嗅神経細胞(各6、10、15および15の細胞)の4つの組を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極を用いて単離した。マイクロピペットはホウケイ酸ガラス(品目#B150−86−10、Sutter Instruments)から設計され、かつ次の条件下で微小電極プラー(P−1000型、Sutter Instruments)を用いて引かれたものである:熱、傾斜温度+20℃;Pull=0、Vel=120;圧力=500。引かれたピペットチップを手ではずし、かつカルシウムイメージングアッセイにおいて決定される際にインドールおよびスカトールにより活性化される嗅神経細胞を単離するためにNewportマイクロマニピュレーター(MW3R型)上に固定した。活性化されたOSNを、マイクロピペットの後端に適用される穏やかな吸引により単離した。
神経細胞のmRNAをEberwine法に従って精製および増幅した(MessageAmp II aRNA kit − Ambion, AM1751)。プールされた神経細胞を再懸濁バッファー中で10分間にわたって75℃に加熱し(Superscript III Cells Direct cDNA system, 46−6321−Invitrogen)、それによって細胞膜を破壊し、かつそのmRNAを増幅できるようにした。Eberwine法(インビトロ転写)による線形的増幅によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。第1鎖cDNAを、Ambionキットに従って42℃で2時間にわたるインキュベーションを行って得た。第2鎖cDNAの合成を、16℃で2時間にわたる第2のインキュベーション後に同一のキットを用いて行った。2本鎖cDNAを、対応するcRNAを生成するためのテンプレートとして使用し(37℃で14時間のインキュベーション)、その後これを精製した。このcRNA合成ステップを第2のIVTのために繰り返した。一晩(14時間)のインビトロ転写を連続して2回行うことにより、十分な量のcRNAを得た;次に、増幅されたcRNAを用いてIllumina HiSeq cDNA libraryを作成した。その後、全トランスクリプトームの配列を次世代シーケンシング(NGS)により得た。
NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭、特にインドールおよび/またはスカトールの嗅覚受容体を特定した。このために、得られたNGS由来の150の塩基対の短い配列(一般にリードと称される)をマウスのリファレンスゲノム(例えば、UCSCのバージョンmm9またはmm10など)に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成した。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストを得た。高レベルのmRNAを示す(リードが多い)かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子を候補インドールおよびスカトール受容体と考え、これを図3に示す。図3は、4つの独立したスカトール/インドール細胞ピッキング試験からの代表的なNGSの結果をまとめたものである。この棒グラフは、視覚的検査後に保持された極めて多いmRNAを有する候補インドール/スカトールOR遺伝子を表す。Y軸は、1サンプル当たりにピッキングされたOSNの数を考慮した、OMP mRNAのレベルに正規化されたmRNAの量レベルを表す。星印(*)は、受容体を複数の試験で特定したことを示す。OMP(嗅覚マーカータンパク質)は、成熟した嗅神経細胞のための特定のバイオマーカーである。上記の通りカルシウムイメージングおよびNGSを組み合わせることによって、以下の5種の受容体配列を、推定マウスインドールおよびスカトールORとして特定した:Olfr665(配列番号9および配列番号10)、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr741(配列番号3および配列番号4)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr745(配列番号7および配列番号8)。
実施例3
マウスおよびヒトの悪臭受容体の特定
カルシウムイメージングとNGSとの組み合わせによりマウスゲノムにおける約1,200種のORのうち5種のマウスインドールおよびスカトールORのサブセットを特定することによって(実施例1、2)、インシリコ法による付加的なマウスおよび新規のヒトインドールおよびスカトールORの迅速な特定が可能となる。類似する全体的なアミノ酸同一性を有するORは、類似の匂い物質応答プロファイルを示すものと考えられるため[Adipietro et al. (2012)]、候補インドールおよびスカトールORのリストを、カルシウムイメージングにより単離されたインドール/スカトール感受性嗅神経細胞のNGS解析に由来するマウスOR配列を用いた公共のマウスおよびヒトゲノムデータベースの検索により拡張した。NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭嗅覚受容体を特定した。推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のNGSサンプル中でmRNAが極めて高レベルの量であるか、または、複数の独立した生物学的複製において存在するが1種以上の悪臭に応答する嗅神経細胞を含まない対照サンプル中には存在しない。標準的なバイオインフォマティクスツールを使用して、相同配列受容体は類似の機能を保持するという仮定の下で(Adipietro et al. (2012))、推定哺乳動物(非ヒト)の1種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連する1種以上のヒト匂い物質受容体を特定した。BLASTPおよび/またはBLASTNアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いた。第1表に、特定されたマウス匂い物質受容体(OR)および予測ヒトオーソログを挙げる。
マウスおよびヒトの悪臭受容体の特定
カルシウムイメージングとNGSとの組み合わせによりマウスゲノムにおける約1,200種のORのうち5種のマウスインドールおよびスカトールORのサブセットを特定することによって(実施例1、2)、インシリコ法による付加的なマウスおよび新規のヒトインドールおよびスカトールORの迅速な特定が可能となる。類似する全体的なアミノ酸同一性を有するORは、類似の匂い物質応答プロファイルを示すものと考えられるため[Adipietro et al. (2012)]、候補インドールおよびスカトールORのリストを、カルシウムイメージングにより単離されたインドール/スカトール感受性嗅神経細胞のNGS解析に由来するマウスOR配列を用いた公共のマウスおよびヒトゲノムデータベースの検索により拡張した。NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭嗅覚受容体を特定した。推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のNGSサンプル中でmRNAが極めて高レベルの量であるか、または、複数の独立した生物学的複製において存在するが1種以上の悪臭に応答する嗅神経細胞を含まない対照サンプル中には存在しない。標準的なバイオインフォマティクスツールを使用して、相同配列受容体は類似の機能を保持するという仮定の下で(Adipietro et al. (2012))、推定哺乳動物(非ヒト)の1種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連する1種以上のヒト匂い物質受容体を特定した。BLASTPおよび/またはBLASTNアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いた。第1表に、特定されたマウス匂い物質受容体(OR)および予測ヒトオーソログを挙げる。
関連するヒトタンパク質配列は、第1表に挙げたNGSで特定されたマウスOR配列に対して少なくとも60%の配列同一性の範囲内にある。同一性レベルは、BLASTPアルゴリズム後のアミノ酸配列のペアワイズ比較に関連して与えられる。26種の新規のヒトおよびマウスのORを、公共のゲノムデータベースのBLASTP検索(デフォルトパラメーター)によって特定した。16種が、NGS由来遺伝子Olfr740(配列番号1および配列番号2)、741(配列番号3および配列番号4)、743(配列番号5および配列番号6)、745(配列番号7および配列番号8)に密接に関連していた。これらは740ファミリーを構成する。10種が、NGS由来受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)に密接に関連していた。これらはOlfr665ファミリーを構成する。図4は、候補マウスインドールおよびスカトールOR遺伝子と、Olfr740(図4A)およびOlfr665(図4B)受容体ファミリーに属するそれらの予測ヒトオーソログとの系統学的関係を示す。この関係は、タンパク質配列に基づく近隣結合法による系統樹の再構成により得られたものである。対応するヒトオーソログを矢印で示す。偽遺伝子であるとの注釈が付されたヒトOR遺伝子名に「P」の印を付した。偽遺伝子は非機能性であるものと考えられる。OR11H7Pは、既知の機能対立遺伝子を有する分離偽遺伝子(SP)である。ダイヤ形(◇)は、NGSにより最初に特定された受容体を示す。追加候補のマウスおよびヒトのインドールおよびスカトールORに関するアミノ酸同一性を決定するために、完全長のタンパク質配列を、全ORレパートリーにわたって高度に保存されたアミノ酸モチーフに基づいて手動でアライメントした(Bioedit sequence alignment tool, version 7.0.5.3)。第2表に、マウスOlfr740ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。第3表に、マウスOlfr665ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。
実施例4
HEK293T細胞中でのマウスOR Olfr743、Olfr746およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
インドールおよびスカトールの双方の悪臭に対する、候補マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)の活性を、細胞ベースのcAMPアッセイで確認した。図5Aおよび5Bにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr743(配列番号6)およびOlfr740(配列番号2)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドール(左)またはスカトール(右)の濃度増加に曝露した。図5Cおよび5Dは、インドールおよびスカトールを用いた場合のOlfr740(配列番号2)の活性およびOlfr743(配列番号6)の活性が類似していることを示す反復試験である。図5Eにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr746(配列番号38)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドールまたはスカトールの濃度増加に曝露した。匂い物質誘発活性を、HTRFアプローチ(CisBioキット)を用いて、細胞質ゾル内cAMPレベルの測定により検出した。受容体活性の用量依存性増加を、双方の分子に対して3種全ての受容体に関して示す。Gαolf(配列番号21)単独(受容体なし)を用いたHEK細胞の共トランスフェクションを、非特異的活性についての対照として使用した(対照)。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。結果を図5に示す。3種全ての受容体は、悪臭化合物に対する特異的な用量依存的活性を示し、かつそれ自体で、こうした化合物に対する受容体を特定するための方法の正当性を実証している。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)およびOlfr743(配列番号5および配列番号6)を、インドールおよびスカトールの双方に応答した単離された嗅神経細胞から特定した。マウス受容体Olfr746(配列番号37および配列番号38)を、Olfr740(配列番号2)およびOlfr743(配列番号6)を検索配列として使用したデータベースマイニングによってインシリコで特定した。これらの受容体を、そのN末端でFLAGタグで修飾し、かつウシロドプシン受容体の最初の20のアミノ酸(配列番号18)を一過的にHEK293T細胞中で発現させ、かつ別々にインドールおよびスカトールで刺激することによって、それらが真のインドール/スカトール受容体であることを確認した。ヒトGαサブユニットGαolf(配列番号21)の共発現によってGs伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部cAMPが増加する。この結果は、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)がインドール−スカトール受容体であることを裏付けるものである。
HEK293T細胞中でのマウスOR Olfr743、Olfr746およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
インドールおよびスカトールの双方の悪臭に対する、候補マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)の活性を、細胞ベースのcAMPアッセイで確認した。図5Aおよび5Bにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr743(配列番号6)およびOlfr740(配列番号2)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドール(左)またはスカトール(右)の濃度増加に曝露した。図5Cおよび5Dは、インドールおよびスカトールを用いた場合のOlfr740(配列番号2)の活性およびOlfr743(配列番号6)の活性が類似していることを示す反復試験である。図5Eにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr746(配列番号38)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドールまたはスカトールの濃度増加に曝露した。匂い物質誘発活性を、HTRFアプローチ(CisBioキット)を用いて、細胞質ゾル内cAMPレベルの測定により検出した。受容体活性の用量依存性増加を、双方の分子に対して3種全ての受容体に関して示す。Gαolf(配列番号21)単独(受容体なし)を用いたHEK細胞の共トランスフェクションを、非特異的活性についての対照として使用した(対照)。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。結果を図5に示す。3種全ての受容体は、悪臭化合物に対する特異的な用量依存的活性を示し、かつそれ自体で、こうした化合物に対する受容体を特定するための方法の正当性を実証している。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)およびOlfr743(配列番号5および配列番号6)を、インドールおよびスカトールの双方に応答した単離された嗅神経細胞から特定した。マウス受容体Olfr746(配列番号37および配列番号38)を、Olfr740(配列番号2)およびOlfr743(配列番号6)を検索配列として使用したデータベースマイニングによってインシリコで特定した。これらの受容体を、そのN末端でFLAGタグで修飾し、かつウシロドプシン受容体の最初の20のアミノ酸(配列番号18)を一過的にHEK293T細胞中で発現させ、かつ別々にインドールおよびスカトールで刺激することによって、それらが真のインドール/スカトール受容体であることを確認した。ヒトGαサブユニットGαolf(配列番号21)の共発現によってGs伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部cAMPが増加する。この結果は、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)がインドール−スカトール受容体であることを裏付けるものである。
実施例5
HEK293T細胞中でのヒトOR52N2、OR11G2、OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6およびOR11H4、並びにマウスOlfr665およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
候補ヒトインドールおよびスカトール悪臭受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)、OR11G2(配列番号13および配列番号14)、OR5AC2(配列番号75および配列番号76)、OR4C15(配列番号79および配列番号80)、OR8S1(配列番号83および配列番号84)、OR11H6(配列番号15および配列番号16)およびOR11H4(配列番号49および配列番号50)、並びに候補マウスインドールおよびスカトール悪臭受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)およびOlfr740(配列番号1および配列番号2)の活性を、細胞ベースのカルシウムフラックスアッセイにおいて確認した(図6)。細胞で安定的に共発現するRhoタグ付きヒトOR52N2(図6A、B)またはOR11G2(図6C)およびGαolf(配列番号25)を、スカトールまたはインドールの濃度増加に曝露した。図6Bは、インドールおよびスカトールを用いたOR52N2の類似の活性を示す反復試験である。匂い物質誘発OR52N2またはOR11G2活性を、匂い物質曝露後の最大のCalcium5色素(Molecular Devices)蛍光変化を測定することによって検出した。活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位(RFU)に正規化されたベースライン補正RFU比と定義される。受容体活性の用量依存的増加を記録し、かつ対応する用量反応曲線を双方の化合物について示す。受容体を欠く細胞株、例えばhOR52N2を、高濃度での非特異的活性についての対照として用いた(「インドール対照」および「スカトール対照」)。活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位(RFU)に正規化されたベースライン補正RFU比と定義される。ヒト受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr665(配列番号10)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11G2(配列番号13および配列番号14)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr740(配列番号2)に対するその配列類似性ゆえに特定した。これらの受容体をRho配列で修飾し、かつHEK293T細胞中で安定的に発現させた。さらなる例として、ヒト受容体OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6、OR11H4、並びにマウス受容体Olfr665およびOlfr740に関するインドールおよびスカトールの用量反応曲線を示す(図6D−J)。ヒト受容体OR5AC2(配列番号75および配列番号76)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr207(配列番号78)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR4C15(配列番号79および配列番号80)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr1211(配列番号82)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR8S1(配列番号83および配列番号84)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr257(配列番号86)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H6(配列番号15および配列番号16)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr745(配列番号8)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H4(配列番号49および配列番号50)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるOlfr746(配列番号38)に対するその配列類似性ゆえに特定した。マウス受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。ヒトGαサブユニットGα15の共発現によってGq伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ca2+が増加する。この結果は、本明細書に開示された方法が、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
HEK293T細胞中でのヒトOR52N2、OR11G2、OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6およびOR11H4、並びにマウスOlfr665およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
候補ヒトインドールおよびスカトール悪臭受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)、OR11G2(配列番号13および配列番号14)、OR5AC2(配列番号75および配列番号76)、OR4C15(配列番号79および配列番号80)、OR8S1(配列番号83および配列番号84)、OR11H6(配列番号15および配列番号16)およびOR11H4(配列番号49および配列番号50)、並びに候補マウスインドールおよびスカトール悪臭受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)およびOlfr740(配列番号1および配列番号2)の活性を、細胞ベースのカルシウムフラックスアッセイにおいて確認した(図6)。細胞で安定的に共発現するRhoタグ付きヒトOR52N2(図6A、B)またはOR11G2(図6C)およびGαolf(配列番号25)を、スカトールまたはインドールの濃度増加に曝露した。図6Bは、インドールおよびスカトールを用いたOR52N2の類似の活性を示す反復試験である。匂い物質誘発OR52N2またはOR11G2活性を、匂い物質曝露後の最大のCalcium5色素(Molecular Devices)蛍光変化を測定することによって検出した。活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位(RFU)に正規化されたベースライン補正RFU比と定義される。受容体活性の用量依存的増加を記録し、かつ対応する用量反応曲線を双方の化合物について示す。受容体を欠く細胞株、例えばhOR52N2を、高濃度での非特異的活性についての対照として用いた(「インドール対照」および「スカトール対照」)。活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位(RFU)に正規化されたベースライン補正RFU比と定義される。ヒト受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr665(配列番号10)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11G2(配列番号13および配列番号14)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr740(配列番号2)に対するその配列類似性ゆえに特定した。これらの受容体をRho配列で修飾し、かつHEK293T細胞中で安定的に発現させた。さらなる例として、ヒト受容体OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6、OR11H4、並びにマウス受容体Olfr665およびOlfr740に関するインドールおよびスカトールの用量反応曲線を示す(図6D−J)。ヒト受容体OR5AC2(配列番号75および配列番号76)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr207(配列番号78)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR4C15(配列番号79および配列番号80)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr1211(配列番号82)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR8S1(配列番号83および配列番号84)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr257(配列番号86)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H6(配列番号15および配列番号16)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr745(配列番号8)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H4(配列番号49および配列番号50)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるOlfr746(配列番号38)に対するその配列類似性ゆえに特定した。マウス受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。ヒトGαサブユニットGα15の共発現によってGq伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ca2+が増加する。この結果は、本明細書に開示された方法が、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
実施例6
HEK293T細胞におけるイリンドール受容体Olfr743の活性の阻害
本明細書に概説した手順を使用して特定した後に、得られた悪臭受容体細胞株を使用して、その活性と可能性として考えられるヒトの知覚とを調節する化合物の化学ライブラリーをスクリーニングすることができる。この試験を、実施例4と同一の条件下に行った。Rhoタグ付きOlfr743(配列番号6)と共にトランスフェクトされた細胞を、300μMの2−アセトナフトンの存在下または不在下に、インドールの濃度増加に曝露した。2−アセトナフトンは、インドールに対するOlfr743(配列番号6)の活性を阻害する。結果を第4表および図7に示す。アンタゴニスト化合物の存在下では用量反応曲線の右方向へのシフトが認められ、その結果、インドールに対してEC50が4倍増加する。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。この結果は、2−アセトナフトンがインドール受容体に結合して、この受容体の活性を阻害することを示している。
HEK293T細胞におけるイリンドール受容体Olfr743の活性の阻害
本明細書に概説した手順を使用して特定した後に、得られた悪臭受容体細胞株を使用して、その活性と可能性として考えられるヒトの知覚とを調節する化合物の化学ライブラリーをスクリーニングすることができる。この試験を、実施例4と同一の条件下に行った。Rhoタグ付きOlfr743(配列番号6)と共にトランスフェクトされた細胞を、300μMの2−アセトナフトンの存在下または不在下に、インドールの濃度増加に曝露した。2−アセトナフトンは、インドールに対するOlfr743(配列番号6)の活性を阻害する。結果を第4表および図7に示す。アンタゴニスト化合物の存在下では用量反応曲線の右方向へのシフトが認められ、その結果、インドールに対してEC50が4倍増加する。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。この結果は、2−アセトナフトンがインドール受容体に結合して、この受容体の活性を阻害することを示している。
本技術分野は、匂い物質および香り受容体、並びに匂い物質および/または香り化合物の特定に用いることができる、より具体的にはインドールまたはスカトールなどの悪臭化合物のインヒビターまたは抑制体の特定に用いることができるアッセイに関する。
背景技術
嗅覚は、ヒトの感覚系のうち、最も複雑でかつ十分な解明が進んでいないものの1つである。嗅覚受容体(OR)の活性化から知覚にかけては、なおもさらなる研究を要する多くのステップが存在する。個々の匂い物質および混合物に対するORコードがどのようにして知覚に変換されるかが解明されれば、この知見を様々な分野において顕著な利点をもたらすべく利用することができる。こうした分野には、匂いのモジュレーター、例えば不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または毒性化合物に代わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、並びに匂いの増強剤が含まれ、これらによって、天然源由来の供給源化合物に対する我々の依存性が制限されると考えられる。「嗅覚コード」の組み合わせの典型は、全ての単一のORは複数の匂い物質によって活性化されることができ、かつ逆にほとんどの匂い物質は複数のORを活性化しうるという所見に集約される。マウスゲノム中には、約1,200種の異なるORが存在する。一方で、ヒトは約400種のORを有する。どちらの場合にも、ORレパートリーは世界中の何千もの匂い物質によって活性化され、そしてこの組み合わせの複雑さによって、我々が知覚しうる嗅覚が広がる。しかし、2014年現在で従来の脱オーファン化法を用いて特定されているのは、わずか95種のマウスOR(約8%)および41種のヒトOR(約10%)に対する匂い物質またはリガンドのみである。さらに、主にインビトロで特定されたヒトORとの生理的関連性に関して試験が行われたリガンドは、ほとんどない。
嗅覚は、ヒトの感覚系のうち、最も複雑でかつ十分な解明が進んでいないものの1つである。嗅覚受容体(OR)の活性化から知覚にかけては、なおもさらなる研究を要する多くのステップが存在する。個々の匂い物質および混合物に対するORコードがどのようにして知覚に変換されるかが解明されれば、この知見を様々な分野において顕著な利点をもたらすべく利用することができる。こうした分野には、匂いのモジュレーター、例えば不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または毒性化合物に代わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、並びに匂いの増強剤が含まれ、これらによって、天然源由来の供給源化合物に対する我々の依存性が制限されると考えられる。「嗅覚コード」の組み合わせの典型は、全ての単一のORは複数の匂い物質によって活性化されることができ、かつ逆にほとんどの匂い物質は複数のORを活性化しうるという所見に集約される。マウスゲノム中には、約1,200種の異なるORが存在する。一方で、ヒトは約400種のORを有する。どちらの場合にも、ORレパートリーは世界中の何千もの匂い物質によって活性化され、そしてこの組み合わせの複雑さによって、我々が知覚しうる嗅覚が広がる。しかし、2014年現在で従来の脱オーファン化法を用いて特定されているのは、わずか95種のマウスOR(約8%)および41種のヒトOR(約10%)に対する匂い物質またはリガンドのみである。さらに、主にインビトロで特定されたヒトORとの生理的関連性に関して試験が行われたリガンドは、ほとんどない。
文献には様々なORの脱オーファン化法が記載されている[例えばTouhara (2007) Deorphanizing vertebrate olfactory receptors: Recent advances in odorant-response assays Neurochem Int 51, 132-139, Saito et al (2009) Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal 2, ra9, and Peterlin et al. (2014), The State of the Art of Odorant Receptor Deorphanization: a Report from the Orphanage, J Gen Physiol; 143(5): 527-42]。これらの方法の多くは、ORがハイスループットスクリーニングに適した非嗅細胞で発現される細胞ベースのアッセイに専ら依拠している。しかし、ORは多くの場合、そのような異種細胞の小胞体内に保持されている。従って、細胞表面へのトラフィックなしでは、ORは匂い物質と相互作用することができない。[Min et al. (2004) Endoplasmic reticulum degradation impedes olfactory G-protein coupled receptor functional expression. BMC Cell Biol 5, 34]。従って、数百ないし数千の様々な細胞株において各細胞株が匂い物質活性を評価できる特有のORタンパク質を有する体系的なアプローチは、匂い物質とORとの間の組み合わせの相互作用の包括的解読に適したアプローチではない。何故ならば、受容体の多くまたはほとんどはこのような細胞株において正常に機能しないためである。従って、生体内に存在するORの全レパートリーの中から、1種以上の匂い物質によって特異的に活性化または阻害される比較的小さなORのサブセットを迅速かつ確実に特定することができる新規の方法が求められている。さらに、嗅神経細胞自体からのORの特定を含む方法であって、その際、ORが完全に機能的であるものと推定され、従って非嗅細胞におけるORアッセイの周知の困難が回避される前記方法も求められている。
悪臭化合物、例えばインドール、スカトール(3−メチルインドール)およびp−クレゾールは、例えばトイレや糞便を含む他の「バスルーム」の源から生じる不快な匂いを発生させる。従って、例えばヒトの匂い化合物の知覚される強度を遮蔽若しくは低減させるかまたは知覚される質を変更する悪臭中和剤が望ましい。匂い物質受容体、より詳細には悪臭受容体を特定することが必要である。インドールまたはスカトールに結合する受容体は特定されつつあり、かつこうした受容体に結合する化合物が発見されつつあり、かつ悪臭の潜在的モジュレーターとして報告されつつある。しかし哺乳動物中には極めて多くのORが存在しているため、悪臭、特にインドールまたはスカトールに結合する受容体の完全なレパートリーの迅速な特定が継続的に望まれている。さらに、こうした受容体に結合する新規の有効な化合物を特定するための新たな悪臭受容体に依拠したアッセイが望まれている。
概要
本明細書においては、匂い物質および/または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の匂い物質または香り受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と匂い物質または香り化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質または香りにより誘発された神経細胞活性の変化を測定すること;
e)匂い物質または香り化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを、単離、または単離および増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、匂い物質受容体および香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
本明細書においては、匂い物質および/または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の匂い物質または香り受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と匂い物質または香り化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質または香りにより誘発された神経細胞活性の変化を測定すること;
e)匂い物質または香り化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを、単離、または単離および増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、匂い物質受容体および香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
さらに本明細書においては、悪臭化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること;
e)悪臭化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを、単離、または単離および増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを順次接触させること;
d)匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること;
e)悪臭化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを、単離、または単離および増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
さらに本明細書においては、以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有する、単離された核酸配列が提供される。
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有する、単離された核酸配列が提供される。
さらに本明細書においては、上記の通りの単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が提供される。
さらに本明細書においては、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
さらに、インドールおよび/またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書においては、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および/または増強する化合物を特定するための方法であって、以下:
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること;
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること;
を含み、ここで、前記受容体は上記のポリペプチドであるものとする前記方法が提供される。
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること;
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること;
を含み、ここで、前記受容体は上記のポリペプチドであるものとする前記方法が提供される。
一実施形態においては、前記化合物の活性は、インドールおよび/またはスカトールへのその結合の比較により決定される。他の実施形態においては、前記受容体と化合物とは、スカトールおよび/またはインドールの存在下に、スカトールおよび/またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触される。
本明細書において提供されるさらなる一実施形態においては、結合活性の測定に機能アッセイが用いられる場合には、本明細書において提供される受容体のシグナル伝達活性を測定するステップは、セカンドメッセンジャーのレベルの変化の検出を含むことができる。他の実施形態においては、シグナル伝達活性の測定が提供され、その際、前記シグナル伝達活性を測定するステップは、グアニンヌクレオチド結合/カップリングまたは交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、プロテインキナーゼA活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウムフラックス、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性の測定、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、FRET、BRETまたはレポーター遺伝子発現を含む。本明細書において提供される特定の一実施形態においては、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイの使用を含む。蛍光および発光アッセイは、Ca 2+ 感受性フルオロフォア、例えばFluo−3、Fluo−4またはFura色素(Molecular Probes);Calcium3アッセイキットファミリー(Molecular Devices)およびイクオリンの使用を含むことができる。
詳細な説明
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および/または」を意味する。同様に、「含む」および「包含する」は互換的であり、かつ限定を意図するものではない。さらに、様々な実施形態の説明において「含む」という用語が用いられる場合、幾つかの特定の事例において、実施形態を「主に〜からなる」または「からなる」という用語を用いても説明することができることは、当業者の当然とするところであるものと理解されたい。
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および/または」を意味する。同様に、「含む」および「包含する」は互換的であり、かつ限定を意図するものではない。さらに、様々な実施形態の説明において「含む」という用語が用いられる場合、幾つかの特定の事例において、実施形態を「主に〜からなる」または「からなる」という用語を用いても説明することができることは、当業者の当然とするところであるものと理解されたい。
定義
以下の用語は、別段の記載がない限り、それらに与えられた意味を有する。
以下の用語は、別段の記載がない限り、それらに与えられた意味を有する。
「OR」とは、嗅細胞において発現されるGタンパク質共役受容体のファミリーの1つ以上のメンバーを指す。嗅覚受容体細胞は、形態に基づいて、または嗅細胞において特異的に発現されるタンパク質の発現によっても特定されることができる。ORファミリーメンバーは、嗅覚伝達のための受容体として作用する能力を有しうる。
「インドール」および/または「スカトールOR」とは、嗅細胞中で発現されるGタンパク質共役受容体のファミリーのメンバーを指し、その受容体は、GPCRに結合しかつその活性の活性化、阻害または増強によりGPCRを調節するリガンドを特定するための結合または活性アッセイにおいて、インドールおよび/またはスカトールと結合しかつ/またはインドールおよび/またはスカトールにより活性化される。このようなアッセイについて、以下に記載する。本明細書におけるインドールおよび/またはスカトール受容体には、インドールおよび/またはスカトールに応答または結合する、断片、合成のおよび自然に存在する変異体、並びにキメラが含まれる。
「OR」核酸は、「Gタンパク質共役受容体活性」を有する7つの膜貫通領域を有するGPCRのファミリーをコードし、例えば、それらは細胞外刺激に応答してGタンパク質に結合し、かつセカンドメッセンジャー、例えばIP3、cAMP、cGMPおよびCa2+の産生を、酵素、例えばホスホリパーゼCおよびアデニル酸シクラーゼの刺激を介して促進することができる。
「OR」ポリペプチドは、約1kbの長さの単一エクソンによりコードされる7つの膜貫通ドメインを有するGタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属し、かつ特徴的な嗅覚受容体特異的なアミノ酸モチーフを示すと考えられる。これら7つの予測ドメインは「膜貫通」または「TM」ドメインTM I〜TM VIIと称され、これらは3つの予測「細胞内ループ」または「IC」ドメインIC I〜IC III、および3つの予測「細胞外ループ」または「EC」ドメインEC I〜EC IIIにより連結される。前記モチーフは、これらに限定されるものではないが、TM IIIおよびIC IIに重なるMAYDRYVAICモチーフ、IC IIIおよびTM VIに重なるFSTCSSHモチーフ、TM VIIにおけるPMLNPFIYモチーフ、並びにEC IIにおける3つの保存されたC残基、およびTM Iにおける高度に保存されたGN残基の存在と定義される。[Zhang and Firestein (2002), The Olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5(2):124-33; Malnic et al., The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584-9]。
「N末端ドメイン」領域は、N末端で始まり、かつ最初の予測膜貫通領域の始点に近い領域まで延びる。7つの予測「膜貫通領域」を含む「膜貫通ドメイン」とは、原形質膜内に存在するORポリペプチドのドメインを指し、これには対応する細胞質(細胞内)および細胞外ループも含まれうる。7つの膜貫通領域並びに細胞外および細胞質ループは、Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)またはStryerにおいて記載されているような標準的な方法を用いて特定することができる。膜貫通ドメインの一般的な二次および三次構造、特に嗅覚受容体のようなGタンパク質共役受容体の7つの膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている。従って、一次構造配列は、以下に詳細に説明するように、既知の膜貫通ドメイン配列に基づいて設計または予測されることができる。これらの膜貫通ドメインは、可溶性相および固相の双方でインビトロでのリガンド結合アッセイに有用である。
ORファミリーメンバーにより媒介される嗅覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における「機能アッセイ」という用語には、間接的または直接的に受容体の影響下にある任意のパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用の決定が含まれる。これには、リガンド結合、イオンフラックス、膜電位、電流、転写、Gタンパク質結合、GPCRリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達受容体−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度(例えばcAMP、cGMP IP3または細胞内Ca2+)の変化、インビトロ、インビボおよびエキソビボで行われるアッセイが含まれる。これにはさらに、他の生理学的作用、例えば神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少も含まれる。本明細書には、間接的または直接的にORファミリーメンバーの影響下にあるパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用を増加または減少させる化合物についての機能アッセイが含まれる。このような機能アッセイまたは作用は、当業者に知られている任意の手段によって測定されることができ、例えば分光学的特性(例えば蛍光、発光、吸光度、屈折率)、流体力学的特性(例えば形状)、クロマトグラフ特性または溶解特性の変化、パッチクランプ、電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカー、卵母細胞OR遺伝子発現;組織培養細胞OR発現;OR遺伝子の転写活性化;リガンド結合アッセイ;電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化;イオンフラックスアッセイ;細胞内セカンドメッセンジャー、例えばcAMP、cGMPおよびイノシトール三リン酸(IP3)の変化;細胞内カルシウムレベルの変化;神経伝達物質放出などによって測定されることができる。
OR遺伝子またはタンパク質の「インヒビター」、「ブロッカー」、「アクチベーター」、「抑制体」および「モジュレーター」は互換的に用いられ、嗅覚形質導入についてのエキソビボ、インビトロおよびインビボアッセイを用いて特定される阻害、活性化または調節分子を指し、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストおよびそれらのホモログおよび模倣物を指す。インヒビターおよびブロッカーとは、例えば、結合することによって刺激を部分的または完全に遮断し、活性化を減少、妨害、遅延させ、嗅覚伝達を不活化、脱感作または下方調節する化合物であり、例えばアンタゴニストである。アクチベーターとは、例えば、結合することによって活性化を刺激、増大、開放、活性化、促進、増強させ、嗅覚伝達を感作または上方調節する化合物であり、例えばアゴニストである。モジュレーターには、例えば受容体と以下のものとの相互作用を変更する化合物が含まれる:アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質(例えば、匂い物質結合タンパク質、リポカリン、および疎水性キャリアファミリーの他のメンバー);Gタンパク質;キナーゼ(例えば、受容体の不活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼのホモログ);およびアレスチン(これもまた、受容体を不活性化および脱感作する)。モジュレーターには、ORファミリーメンバーの遺伝的に改変されたバージョン、例えば活性が改変されたバージョン、並びに天然由来および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子などが含まれうる。インヒビターおよびアクチベーターについてのそのようなアッセイには、例えば、細胞または細胞膜におけるORファミリーメンバーの発現、フレーバーまたはフレグランス分子、例えば香料原料、香料配合物または悪臭の存在または不在下での推定モジュレーター化合物の適用、および次いで上記のような嗅覚伝達に対する機能作用の決定が含まれる。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを用いて処理されたORファミリーメンバーを含むサンプルまたはアッセイを、このインヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較することによって、調節の程度が調べられる。(モジュレーターで処理されない)対照サンプルは、100%の相対的OR活性値に設定される。対照に対するOR活性値が約80%、場合により50%、または25〜0%である場合には、ORの阻害が達成される。対照に対するOR活性値が110%、場合により150%、場合により200〜500%、または1000%〜3000%超である場合には、ORの活性化が達成される。
本明細書において用いられる場合に、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その自然状態で結合している他の非類似化合物を含まない状態を指す。従って、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象物は、所与のサンプルを少なくとも0.5質量%、1質量%、5質量%、10質量%または20質量%、最も好ましくは少なくとも50質量%または75質量%含む。好ましい一実施形態においては、これらの用語は、所与のサンプルを少なくとも95質量%含む本発明の化合物を指す。
本明細書で使用される場合に、「単離された」という用語は、核酸またはポリペプチドに関する場合には、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態を指す。(1)他の自然に生じる随伴構造体または化合物からの精製、または(2)体内では通常では随伴されることのない構造体または化合物の随伴を含む、体内で自然に生じるものよりも高い精製または濃縮のいかなる程度も、本明細書で使用される場合の「単離された」の意味に含まれる。本明細書に記載の複数の核酸または複数のタンパク質は、当業者に知られている様々な方法およびプロセスにより、単離されてもよいし、通常は自然にはこれらに随伴することのない構造体または化合物を伴っていてもよい。
本明細書において使用される場合に、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に説明するように、自然に発現された核酸の組換えの発生または検出に適した任意の増幅方法の使用を指す。例えば本発明は、本発明の自然に発現された(例えばゲノムまたはmRNA)または組換えの(例えばcDNA)核酸をインビボ、エクスビボまたはインビトロで(例えばポリメラーゼ連鎖反応、PCRにより)増幅するための方法および試薬(例えば特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマー対)を提供する。
「7回膜貫通型受容体」という用語は、原形質膜を7回貫通する7つのドメインを有する膜貫通型タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する(従って、これら7つのドメインは「膜貫通」または「TM」ドメインTM I〜TM VIIと称される)。嗅覚および特定の味覚受容体のファミリーのそれぞれが、このスーパーファミリーに属する。以下でさらに詳細に説明するように、7回膜貫通型受容体ポリペプチドは、類似しかつ特徴的な一次、二次および三次構造を有する。
「核酸」または「核酸配列」という用語は、1本鎖または2本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを指す。この用語には、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドが含まれる。またこの用語には、合成骨格を有する核酸様構造体も含まれる。別段の記載がない限り、個々の核酸配列には、その保存的に改変された改変体(例えば縮重コドン置換体または一塩基多型)および相補配列、ならびに明示された配列が暗に含まれる。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば1つ以上の選択されたコドンの第3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列の生成により達成されることができる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においては互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「異種」という用語は、核酸の部分に関して使用される場合には、当該核酸が、自然において互いに同一の関係では見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には組換えにより生成され、新たな機能的核酸を生成するために配置された無関係の遺伝子由来の2つ以上の配列を有し、例えばある供給源からのプロモーターおよび他の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が自然において互いに同一の関係では見出されない2つ以上の配列を含むこと(例えば、融合タンパク質)を示す。
本明細書で使用される場合に、「組換え」とは、合成されたかまたはさもなくばインビトロで操作されたポリヌクレオチド(例えば「組換えポリヌクレオチド」)、細胞または他の生物学的系における遺伝子産物の産生に組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド(「組換えタンパク質」)を指す。
「組換え」手段には、本発明のトランスロケーションドメインおよび本発明のプライマーを用いて増幅された核酸配列を含む融合タンパク質を発現させる、例えば誘導的または構成的に発現させるための発現カセットまたはベクターへの、異なる供給源からの様々なコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションも含まれる。
「発現ベクター」という用語は、本発明の核酸配列を、インビトロまたはインビボで、原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の細胞を含む任意の細胞において構成的または誘導的に発現させる目的での任意の組換え発現系を指す。この用語には、線状または環状の発現系が含まれる。この用語には、エピソームのままであるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現系(例えば安定発現)が含まれる。この発現系は自己複製能力を有することも有しないこともでき、すなわち、細胞内で一過性の発現を駆動することができる。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最低限の要素のみを含む組換え発現「カセット」が含まれる。
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現をサポートする細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞、例えばCHO、HeLa、HEK−293など、例えば培養細胞、外植片および生体内細胞であることができる。
一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13,配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する単離された核酸配列が提供される。
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13,配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有する単離された核酸配列が提供される。
一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸配列が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸配列が提供される。
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72および配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
この方法によって、当業者は、そのヒトの遺伝子のカウンターパートがヒトにおいて特定の匂い特性をコードするものと考えられる嗅覚受容体(OR)の比較的小さなサブセットを、齧歯類のゲノム中に存在する約1,200種のORの全集団の中から迅速に特定することが可能となる。図1は、この方法の概略図である。無傷マウスの嗅上皮(OE)組織を、機械的および酵素処理により単一細胞に解離する。生じる個々の嗅神経細胞(OSN)をガラスカバースリップ上に播種し、かつカルシウム指示色素(例えばFura−2)を負荷することにより細胞活性を検出する。このカバースリップを、次いで灌流チャンバー中に配置し、かつ生理食塩水に浸漬する。悪臭試験匂い物質を生理食塩水中で希釈し、かつ細胞に灌流する。その後、OSN活性を、Fura−2蛍光の変化および蛍光顕微鏡による細胞内カルシウムフラックスの変化のモニタリングにより検出する。重要なことには、いくつかの例では、可能性のある約1,200のOR遺伝子のうち1つまたは2つのみが、所与のOSNにおいて発現される。このことは、所与のOSNの活性が、細胞表面上で発現された単一種類または2種類のORタンパク質によってのみ駆動されることを意味する。細かく制御された匂い物質注入システムと可動ステージとを備えた半自動化カルシウムイメージングシステムでは、単一の実験で1,500超のOSNのモニタリングが可能である。マウスには約1,200種のOR遺伝子があるが、このスループットは全てのORレパートリーの代表的なサンプリングを保証する。1種以上の試験匂い物質に応答する1種以上のOSNをガラスマイクロピペットを用いて収集し、かつその後のRNAの抽出、増幅およびOSNのトランスクリプトームの次世代シーケンシング(NGS)のために、マイクロチューブへと移す。文献には、非常に少量(<100の細胞)の出発材料からのNGSベースのトランスクリプトームシーケンシングが報告されている。しかし本出願人の知る限り、これは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、特に嗅覚受容体の脱オーファン化という特定の目的ではまだ適用されていない。所望であれば、本明細書に記載の方法を用いて、複数のOSNを同一のマイクロチューブ内にプールすることができる。その後、生配列リードをリファレンスゲノムにマッピングし、適切なアライメントおよびアノテーションのために視覚的に検査し、かつ例えばゲノムの反復配列に基づく偽陽性マッピングについて解析する。その結果、マウスのOSNのスクリーニングに使用したのと同一の1種以上の悪臭試験匂い物質により活性化されると考えられる候補マウスORのリストが得られる。その後、この候補マウスORタンパク質配列を用いて公共マウスゲノムデータベースを検索し(例えばBLASTP)、それにより候補マウスOR配列の完全なリストを取得する。これらの候補は、もともとインドールおよび/またはスカトールによって活性化された神経細胞から特定されたNGS由来のOR配列に対する配列相同性によって関連している(すなわちパラロガスである)。その後、これらのマウスパラログ(NGSおよびBLASTP由来)の完全なリストを用いて公共ヒトゲノムデータベースを検索することによって、このマウスOR配列に関連する(すなわちオーソロガスな)候補ヒトOR配列のリストを取得する。その結果、試験匂い物質によって活性化されると考えられる候補のマウスおよびヒトのORの完全なリストが得られる。得られた候補OR遺伝子の活性を確認するために、これらの遺伝子のcDNAを利用可能な発現ベクターにクローニングし、かつハイスループットスクリーニングに適した培養細胞(例えばHEK293T)へトランスフェクトすることができる。その後、それぞれ組換えにより発現された候補OR cDNAを含む得られた細胞株を、カルシウムイメージングにおいて使用される試験匂い物質および他の構造的または官能的に関連する匂い物質を用いた細胞ベースの活性アッセイにおいてスクリーニングすることができる。
特定の一実施形態においては、例えばAraneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従って、非ヒト哺乳動物(例えばマウス)からのネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離し、かつ単一細胞に解離する。特定の一実施形態においては、各神経細胞は1度に1種または2種の受容体を発現する。一実施形態においては、嗅神経細胞の生成に使用される嗅覚組織は、受容体および関連する配列に関する公的に利用可能なデータを有する非ヒト哺乳動物に由来する。これには、マウス、ラットおよびハムスターの組織が含まれる。解離プロトコルは、記録可能な神経細胞の生存率が確実に高くなるように最適化されるべきである。特定の一実施形態においては、最低で約1,500の異なる感覚神経細胞を記録する。
さらなる実施形態においては、指示体を、蛍光カルシウム指示色素、カルシウム指示タンパク質、蛍光cAMP指示薬、cAMP応答配列(CRE)媒介性レポータータンパク質、生化学的cAMP HTRFアッセイ、β−アレスチンアッセイ、または電気生理学的記録から選択する。特に、嗅神経細胞の膜上で発現される嗅覚受容体の活性のモニタリングに使用可能なカルシウム指示色素を選択する(例えばFura−2 AM)。
特定の一実施形態においては、化合物を順次スクリーニングし、かつカルシウム色素蛍光の匂い物質依存性変化を、蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いて測定する。
例えば、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極またはFACS装置のいずれかを使用して1種以上の悪臭化合物をスクリーニングした後に、嗅神経細胞を単離する。より詳細には、少なくとも1つの神経細胞を単離する。マウス嗅神経細胞を、以前に記載された手順(Malnic et al.,1999; Areneda et al., 2004)に類似したCa2+イメージングによりスクリーニングする。特に、電動式可動顕微鏡ステージを使用することによって、スクリーニング可能な細胞数を1回の試験当たり少なくとも1,500に増加させる。マウスには約1,200種の異なる嗅覚受容体が存在し、かつ各嗅神経細胞は1,200種の嗅覚受容体遺伝子のうち1つまたは2つしか発現しないため、このスクリーニング能力は、事実上、全てのマウス嗅覚受容体レパートリーを網羅する。換言すれば、ハイスループットの嗅神経細胞スクリーニングのためのカルシウムイメージングの組み合わせによって、匂い物質の特定のプロファイルに応答する嗅覚受容体がほぼ全て特定される。特定の一態様においては、2つの一般的なトイレの悪臭化合物であるインドールおよびスカトールの双方に応答する匂い物質を単離することができる。
嗅神経細胞のカルシウムイメージングのために、主嗅上皮を、神経細胞の解離前にマウスから切開することができる。切開された嗅上皮を、その後、機械的および酵素的解離のために解離バッファーに移すことができる。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により数千の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種することができ、かつ、これらの細胞にカルシウム感受性色素(Fura−2 AM)を例えば31℃で約30分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移すことができる。解離された嗅神経細胞上に(生理食塩水中の)匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激する。例えば受容体を悪臭化合物50μmで刺激した後、Fura−2蛍光の変化により示される細胞内Ca2+フラックスをモニタリングすることによって、悪臭化合物に応答する希少な細胞を特定する。解析の後、応答細胞を、吸引マイクロピペットを用いてガラスカバースリップから取り出すことができる。その後、単離された細胞を、これに続いて応答細胞中のmRNAとして発現される嗅覚受容体遺伝子を特定するためにプールして1つのサンプルとする。
特定の一実施形態においては、嗅神経細胞のmRNAを、Marko, N. F., et al., (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi: 10.1186/1471-2164-6-27に包括的に記載されている方法(Eberwine法)によって精製および増幅する。トランスクリプトームの少なくとも一部(からトランスクリプトーム全体までを含む)を、次世代シーケンシング(NGS)を用いて配列決定するか、またはマイクロアレイ技術を用いて既知の遺伝子にハイブリダイズする。NGSは、Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11(1), 31-46; doi: 10.1038/nrg262において包括的に議論され、かつ説明されている。特定の一実施形態においては、同一の応答プロファイルを示す神経細胞を最低で5つプールし、かつ2回の連続するインビトロ転写(IVT)によりmRNAを増幅する。mRNAを、ピッキング後すぐに細胞溶解により放出する;DNアーゼなしで、かつ精製ステップを行わない。この増幅を、次のパラメーターを使用してMesageAmpII aRNA kit(Ambion, AMA1751)により行うことができる:連続する14時間にわたるIVTを2回。
さらなる一実施形態においては、NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体の群または遺伝子ファミリーを(例えば、ピッキングされた神経細胞の数と同数まで)特定する。特に、推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のNGSサンプル中でのmRNAの量が極めて多いか、または複数の独立した生物学的複製中に存在する。嗅覚コードの組み合わせの性質(1種の化合物が複数のORを活性化し、かつ1種ORが複数の化合物により活性化されうる)のために、所与の化合物によって活性化された複数の神経細胞をプールすることによって、単一のNGS試験においてこれらの分子を認識する役割を果たす受容体を事実上全て探索することが可能となる。従って、機能的に類似した神経細胞をプールすることによって、脱オーファン化のスループットおよび速度が大幅に改善される。
次に、標準的なバイオインフォマティクスツールを用いて、相同の受容体配列は類似の機能を保持するという仮定の下に、他の推定哺乳動物(非ヒト)の1種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連するヒトの1種以上の匂い物質受容体を特定する。ある研究によって、オーソロガスOR遺伝子対の約82%が共通のリガンドに応答したことが実証された。このことは、オーソロガス遺伝子対の約18%が異なるリガンドに応答しうることを示唆している;さらに、パラロガスOR遺伝子対の33%が共通のリガンドに応答したことが実証された。このことは、パラロガス対の少なくとも約67%が異なるリガンドに応答しうることを示唆している。[Adipietro et al. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8(7): e1002821. doi:10.1371/ journal.pgen.1002821]。BLASTPおよび/またはBLASTNアルゴリズムのデフォルトパラメーターを使用することができる。
ヒトまたは非ヒト哺乳動物の悪臭受容体を、悪臭化合物の活性を模倣、遮断、調節および/または増強する化合物の特定に用いることができる機能アッセイに適合させることができる。特にこのアッセイは細胞アッセイであってよく、かつ化合物を特定する方法はハイスループットスクリーニングアッセイであってよい。より詳細には、本明細書において提供されるのは、調節化合物(例えば、遮断、増強および遮蔽)を発見するための化合物ライブラリーを用いた受容体のハイスループットスクリーニングに適合可能な受容体ベースのアッセイである。
特定の一実施形態においては、悪臭受容体遺伝子配列を、インドールおよびスカトール感受性細胞から以下のように特定する:プールされた神経細胞を75℃に10分間加熱することにより細胞膜を破壊し、かつそのmRNAを増幅できるようにする。限られた量の出発材料、典型的には1〜15の細胞を用いてNGS技術を適用する場合には、この増幅ステップが重要である。Eberwine法による線形的増幅(IVT)によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。一晩(14時間)のインビトロ転写を連続して2回行うことにより、十分な量のcRNAを得る;次に、増幅されたcRNAを用いてIllumina HiSeq cDNA libraryを作成する。得られた典型的には75〜150の塩基対の短い配列(一般に「リード」と称される)をマウスのリファレンスゲノム(例えば、UCSCのバージョンmm9またはmm10)に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成する。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストが得られる。極めて高レベルの量のmRNAを示す(「リード」が極めて多い)かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子が、推定インドールおよびスカトール受容体と考えられる。
その後、予測マウスOR遺伝子を用いてマウスおよびヒトのゲノムデータベースの双方の最新版をマイニングすることによって、極めて密接に関連する(すなわち極めて高い配列類似性を示す)受容体を、マウスにおいて(パラロガス遺伝子)およびヒトにおいて(オーソロガス遺伝子)特定する。このプロセスは、配列類似性検索ツールであるBLAST検索アルゴリズム(NCBIのウェブサイトで公的に入手可能)を用いて行うことができ、その際、初期のトランスクリプトーム解析から予め得られた各推定遺伝子配列をクエリー配列として使用する。このデータマイニングプロセスから特定される新たに特定された遺伝子も、パラロガス遺伝子とオーソロガス遺伝子とが類似の活性を有する可能性が高いという仮定の下に、潜在的悪臭受容体と考えられる。
パラロガス遺伝子を、その後、マルチアライメントツールを用いてアライメントすることによって系統樹を作成する。インビトロでの機能データを、密接に関連してはいるが異なる受容体間のそのような系統学的関係に照らして解釈することができる。このステップは、例えば、インドールおよびスカトールといった試験化合物に程度の差はあれ応答する完全なOR遺伝子ファミリーの特定において不可欠である。
脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補OR遺伝子をさらに、嗅神経細胞の単離に使用された化合物および関心の持たれる他の構造的に関連する化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。一実施形態においては、脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補OR遺伝子をさらに、最初に前記嗅神経細胞の単離に使用された化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。インビトロで発現された同一の候補OR遺伝子を、さらに、関心の持たれる他の構造的に関連する化合物を用いてスクリーニングすることにより、例えば受容体のアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを特定する。
本明細書に記載のプロセスおよび方法を用いて、インドールおよびスカトール悪臭に応答する嗅神経細胞(マウスOR)のトランスクリプトームのシーケンシング(NGS)を行うことにより、以下の受容体を直接特定した。次いで、マウスORに対して極めて高いアミノ酸同一性の程度を有するヒトのインドールおよびスカトール受容体を、利用可能なゲノムデータベースの検索により特定した(第1表)。インドールおよびスカトールの双方への曝露後に応答する細胞を単離または「ピッキング」した後に、本明細書に記載のNGS法によって、マウス受容体Olfr740およびOlfr665を最初に特定した。対応するヒト相同受容体OR11G2およびOR52N2のそれぞれを、さらにアミノ酸配列の類似性の比較により特定した。実施例4および5に示すように、候補マウス受容体Olfr740およびOlfr665、並びにそれらのヒトのカウンターパートOR11G2およびOR52N2は、インドールによりおよびスカトールによりインビトロで活性化されたため、これらをインドールおよび/またはスカトール受容体と称する。同様に、候補マウス受容体Olfr746、Olfr745、Olfr207、Olfr211およびOlfr257によって、同一のステップに従って、それぞれヒト受容体OR11H4、OR11H6、OR5AC2、OR4C15およびOR8S1を特定した。これらのヒトOR遺伝子も、インビトロでインドールおよびスカトールの双方に応答した。総合すると、本明細書に記載の方法によって特定された7種の試験された推定ヒト受容体のうち7種が、インドールおよびスカトール受容体として確認され、これはさらに、ヒトのインドールおよびスカトール受容体を効率的に特定するための前記方法を支持するものである。
匂い物質受容体の脱オーファン化へのこのアプローチは、以前に確立された単一細胞RT−PCR法に対して幾つかの主要な利点を有する。第1に、匂いおよび/または香りに対して類似の結合特性を共有する複数の神経細胞をプールすることにより、独自のmRNAシーケンシング試験(NGS)で、標的悪臭化合物により活性化される受容体が事実上全て特定される。従って、スループットは以前に達成されたものよりも高い。第2に、複数の細胞をプールして1つのサンプルとするため、ある1つの特定の化合物に対する複数のORが単一の実験で明らかとなる。特定の一実施形態においては、試験間での複製サンプルの総合的な比較による遺伝子の選択が可能となる。第3に、NGSはORに特異的なPCRプライマーの使用を必要としない。NGSはまた、問題が多くかつ多くの場合非線形的または非特異的PCR増幅のために偽陽性をもたらす、ORに特異的な縮重プライマーの使用を必要としない。特に、ORコード配列は単一エクソン内にあることから、ゲノムDNAでのサンプル汚染がOR遺伝子配列の非特異的増幅を容易に導きうる。第4に、RT−PCR解析は、固有の偽陽性率のため、プールされたサンプルに対して行うことは困難である。単一細胞のmRNAのハイブリダイゼーション試験は、高密度DNAマイクロアレイチップを用いて行われている。しかし、このアプローチは一般的にNGSより感度が低く、かつさらには、対応するDNAプローブを合成する必要がある既知の遺伝子に制限されている。
従って、NGSの使用はORの迅速な特定にとって著しく有利であり、かつ最終的には、標準的な(例えばRT−PCRおよびマイクロアレイ)アプローチよりも正確な候補受容体の選択をもたらす。
さらなる一実施形態においては、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞から特定されたマウス受容体を、そのN末端で短ポリペプチド配列(例えばウシロドプシン受容体−RhoまたはFlag)で修飾し、一過的にHEK293T細胞中で発現させ、かつインドールおよびスカトールで別々に刺激し、それによって、それらが真のインドール/スカトール受容体であることを確認する。ヒトGαサブユニットGαolf(配列番号21)の共発現によってGs伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部cAMPが増加する。その結果によって、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)がインドール−スカトール受容体であることが裏付けられる。
他の態様においては、ヒト受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)を、マウスOlfr665(配列番号9および配列番号10)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR11G2(配列番号13および配列番号14)を、マウスOlfr740(配列番号1および配列番号2)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR5AC2(配列番号75および配列番号76)を、マウスOlfr207(配列番号77および配列番号78)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR4C15(配列番号79および配列番号80)を、マウスOlfr211(配列番号81および配列番号82)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。ヒト受容体OR8S1(配列番号83および配列番号84)を、マウスOlfr257(配列番号85および配列番号86)とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体と特定した(実施例6)。マウス受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した(実施例6)。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した(実施例6)。マウス受容体Olfr736(配列番号27および配列番号28)を、マウスOlfr740(配列番号1および配列番号2)とのその配列類似性ゆえにインドール/スカトール受容体と特定したが、これは嗅神経細胞から単離されたものであり、かつ恐らくは細胞表面発現の欠如のためにインドールにもスカトールに応答しない。マウス受容体Olfr747(配列番号39および配列番号40)およびOlfr748(配列番号41および配列番号42)も、マウスOlfr740(配列番号1および配列番号2)とのその配列類似性ゆえに特定されたが、例外的に、免疫染色アッセイによって評価された際には適切な細胞表面発現であるにもかかわらず、インドールにもスカトールに応答しない。このことは、高い類似性を示す配列が常に同一の応答プロファイルを共有するとは限らないという、嗅覚受容体の多様な性質を強調している。
受容体をRho配列で修飾し、かつHEK293T細胞中で安定的に発現させる。ヒトGαサブユニットGα15の共発現によってGq伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ca2+が増加する。
上記プロセスおよびここまでに得られた結果は、本プロセスが、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
さらに、インドールおよび/またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書において提供されるのは、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および/または増強する化合物を特定するための方法であって、以下:
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること、その際、前記受容体は上記ポリペプチドであるものとする、
を含む、前記方法である。
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、
b)前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること、その際、前記受容体は上記ポリペプチドであるものとする、
を含む、前記方法である。
一実施形態においては、前記化合物の活性を、インドールおよび/またはスカトールへのその結合の比較により決定する。他の実施形態においては、前記受容体またはそのキメラまたはその断片と前記化合物とを、スカトールおよび/またはインドールの存在下に、スカトールおよび/またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触させる。
さらなる一実施態様においては、化合物を、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される受容体またはそのキメラまたはその断片と接触させ、その際、前記受容体またはそのキメラまたはその断片を、ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞内で発現させる。
前記化合物の活性を、典型的には10,000種の化合物または化合物の混合物を含む大きな化合物ライブラリーのスクリーニングを許容するインビボ、エクスビボ、インビトロおよびシンセティックスクリーニングシステム用いて決定することができる。
他の実施形態においては、前記接触を、本明細書に記載のポリペプチドを含むリポソームまたはウイルス誘発出芽膜を用いて行う。
他の実施形態においては、スカトールおよび/またはインドールに結合する受容体に結合する化合物を特定するための方法を、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞からの膜画分上で実施されることができる。
以下の実施例は単なる例示であり、要約、発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載される本発明の範囲の限定を意図するものではない。
実施例
実施例1
インドールおよび/またはスカトールに結合する受容体を特定するためのマウス嗅神経細胞のスクリーニング、
マウス由来のネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離して単一細胞に解離した後、解離バッファーに移して穏やかに機械的および酵素的に解離した。解離プロトコルを最適化するために、新鮮な解離バッファーを作製するための一般的な手順を、Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従ったが、次の変更を加えた:DNアーゼIIに代えてDNアーゼIにし、Ca2+の濃度を5mMに高め、かつpHを32℃で7.35に調整した。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により2,500超の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種した。次いで、これらの細胞にカルシウム感受性色素(Fra−2 AM)を31℃で30分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移した。解離された嗅神経細胞を以前に記載された通りにスクリーニングしたが(Malnic et al., 1999; Areneda et al., 2004)、電動式可動顕微鏡ステージを用いることで、スクリーニング可能な細胞数を増加させた。次いで、解離された嗅神経細胞上に(生理食塩水中の)匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激した。
実施例1
インドールおよび/またはスカトールに結合する受容体を特定するためのマウス嗅神経細胞のスクリーニング、
マウス由来のネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離して単一細胞に解離した後、解離バッファーに移して穏やかに機械的および酵素的に解離した。解離プロトコルを最適化するために、新鮮な解離バッファーを作製するための一般的な手順を、Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従ったが、次の変更を加えた:DNアーゼIIに代えてDNアーゼIにし、Ca2+の濃度を5mMに高め、かつpHを32℃で7.35に調整した。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により2,500超の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種した。次いで、これらの細胞にカルシウム感受性色素(Fra−2 AM)を31℃で30分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移した。解離された嗅神経細胞を以前に記載された通りにスクリーニングしたが(Malnic et al., 1999; Areneda et al., 2004)、電動式可動顕微鏡ステージを用いることで、スクリーニング可能な細胞数を増加させた。次いで、解離された嗅神経細胞上に(生理食塩水中の)匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激した。
インドール50μmで、次いでスカトール50μmで受容体を刺激し、かつFura−2蛍光の変化により示される細胞内Ca2+フラックスをモニタリングすることによって、インドールおよびスカトールに応答する嗅神経細胞を特定した。図2に、インドールおよびスカトールの双方(各50μΜ)によって特異的に活性化された6つの独立した嗅神経細胞についてのCa2+イメージングトレースを示す。全ての細胞を、酵素アデニル酸シクラーゼACIIIの薬理学的活性化因子であるフォルスコリン(fork)20μΜでも刺激し、それにより細胞の生存能力および神経細胞の特定を確認した。x軸上の時間スケール単位は6秒のフレームである。平均蛍光強度は、レシオメトリックな340/380nmの記録の結果としての相対的な蛍光単位である。
実施例2
インドールおよびスカトール感受性細胞からのmRNAの単離および増幅による、インドールおよびスカトール感受性受容体に関する「悪臭受容体」遺伝子のcDNA配列の作成
実施例1の活性化された嗅神経細胞をガラス吸引マイクロピペットを用いて単離した後に、引き続き、応答細胞中のmRNAとして発現された匂い物質受容体遺伝子を特定するためにプールして1つのサンプルとした。悪臭受容体遺伝子配列を、次のようにインドールおよびスカトール感受性細胞から特定した:1種以上の悪臭化合物によって活性化される5種超の嗅神経細胞(各6、10、15および15の細胞)の4つの組を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極を用いて単離した。マイクロピペットはホウケイ酸ガラス(品目#B150−86−10、Sutter Instruments)から設計され、かつ次の条件下で微小電極プラー(P−1000型、Sutter Instruments)を用いて引かれたものである:熱、傾斜温度+20℃;Pull=0、Vel=120;圧力=500。引かれたピペットチップを手ではずし、かつカルシウムイメージングアッセイにおいて決定される際にインドールおよびスカトールにより活性化される嗅神経細胞を単離するためにNewportマイクロマニピュレーター(MW3R型)上に固定した。活性化されたOSNを、マイクロピペットの後端に適用される穏やかな吸引により単離した。
インドールおよびスカトール感受性細胞からのmRNAの単離および増幅による、インドールおよびスカトール感受性受容体に関する「悪臭受容体」遺伝子のcDNA配列の作成
実施例1の活性化された嗅神経細胞をガラス吸引マイクロピペットを用いて単離した後に、引き続き、応答細胞中のmRNAとして発現された匂い物質受容体遺伝子を特定するためにプールして1つのサンプルとした。悪臭受容体遺伝子配列を、次のようにインドールおよびスカトール感受性細胞から特定した:1種以上の悪臭化合物によって活性化される5種超の嗅神経細胞(各6、10、15および15の細胞)の4つの組を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極を用いて単離した。マイクロピペットはホウケイ酸ガラス(品目#B150−86−10、Sutter Instruments)から設計され、かつ次の条件下で微小電極プラー(P−1000型、Sutter Instruments)を用いて引かれたものである:熱、傾斜温度+20℃;Pull=0、Vel=120;圧力=500。引かれたピペットチップを手ではずし、かつカルシウムイメージングアッセイにおいて決定される際にインドールおよびスカトールにより活性化される嗅神経細胞を単離するためにNewportマイクロマニピュレーター(MW3R型)上に固定した。活性化されたOSNを、マイクロピペットの後端に適用される穏やかな吸引により単離した。
神経細胞のmRNAをEberwine法に従って精製および増幅した(MessageAmp II aRNA kit − Ambion, AM1751)。プールされた神経細胞を再懸濁バッファー中で10分間にわたって75℃に加熱し(Superscript III Cells Direct cDNA system, 46−6321−Invitrogen)、それによって細胞膜を破壊し、かつそのmRNAを増幅できるようにした。Eberwine法(インビトロ転写)による線形的増幅によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。第1鎖cDNAを、Ambionキットに従って42℃で2時間にわたるインキュベーションを行って得た。第2鎖cDNAの合成を、16℃で2時間にわたる第2のインキュベーション後に同一のキットを用いて行った。2本鎖cDNAを、対応するcRNAを生成するためのテンプレートとして使用し(37℃で14時間のインキュベーション)、その後これを精製した。このcRNA合成ステップを第2のIVTのために繰り返した。一晩(14時間)のインビトロ転写を連続して2回行うことにより、十分な量のcRNAを得た;次に、増幅されたcRNAを用いてIllumina HiSeq cDNA libraryを作成した。その後、全トランスクリプトームの配列を次世代シーケンシング(NGS)により得た。
NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭、特にインドールおよび/またはスカトールの嗅覚受容体を特定した。このために、得られたNGS由来の150の塩基対の短い配列(一般にリードと称される)をマウスのリファレンスゲノム(例えば、UCSCのバージョンmm9またはmm10など)に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成した。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストを得た。高レベルのmRNAを示す(リードが多い)かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子を候補インドールおよびスカトール受容体と考え、これを図3に示す。図3は、4つの独立したスカトール/インドール細胞ピッキング試験からの代表的なNGSの結果をまとめたものである。この棒グラフは、視覚的検査後に保持された極めて多いmRNAを有する候補インドール/スカトールOR遺伝子を表す。Y軸は、1サンプル当たりにピッキングされたOSNの数を考慮した、OMP mRNAのレベルに正規化されたmRNAの量レベルを表す。星印(*)は、受容体を複数の試験で特定したことを示す。OMP(嗅覚マーカータンパク質)は、成熟した嗅神経細胞のための特定のバイオマーカーである。上記の通りカルシウムイメージングおよびNGSを組み合わせることによって、以下の5種の受容体配列を、推定マウスインドールおよびスカトールORとして特定した:Olfr665(配列番号9および配列番号10)、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr741(配列番号3および配列番号4)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr745(配列番号7および配列番号8)。
実施例3
マウスおよびヒトの悪臭受容体の特定
カルシウムイメージングとNGSとの組み合わせによりマウスゲノムにおける約1,200種のORのうち5種のマウスインドールおよびスカトールORのサブセットを特定することによって(実施例1、2)、インシリコ法による付加的なマウスおよび新規のヒトインドールおよびスカトールORの迅速な特定が可能となる。類似する全体的なアミノ酸同一性を有するORは、類似の匂い物質応答プロファイルを示すものと考えられるため[Adipietro et al. (2012)]、候補インドールおよびスカトールORのリストを、カルシウムイメージングにより単離されたインドール/スカトール感受性嗅神経細胞のNGS解析に由来するマウスOR配列を用いた公共のマウスおよびヒトゲノムデータベースの検索により拡張した。NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭嗅覚受容体を特定した。推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のNGSサンプル中でmRNAが極めて高レベルの量であるか、または、複数の独立した生物学的複製において存在するが1種以上の悪臭に応答する嗅神経細胞を含まない対照サンプル中には存在しない。標準的なバイオインフォマティクスツールを使用して、相同配列受容体は類似の機能を保持するという仮定の下で(Adipietro et al. (2012))、推定哺乳動物(非ヒト)の1種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連する1種以上のヒト匂い物質受容体を特定した。BLASTPおよび/またはBLASTNアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いた。第1表に、特定されたマウス匂い物質受容体(OR)および予測ヒトオーソログを挙げる。
マウスおよびヒトの悪臭受容体の特定
カルシウムイメージングとNGSとの組み合わせによりマウスゲノムにおける約1,200種のORのうち5種のマウスインドールおよびスカトールORのサブセットを特定することによって(実施例1、2)、インシリコ法による付加的なマウスおよび新規のヒトインドールおよびスカトールORの迅速な特定が可能となる。類似する全体的なアミノ酸同一性を有するORは、類似の匂い物質応答プロファイルを示すものと考えられるため[Adipietro et al. (2012)]、候補インドールおよびスカトールORのリストを、カルシウムイメージングにより単離されたインドール/スカトール感受性嗅神経細胞のNGS解析に由来するマウスOR配列を用いた公共のマウスおよびヒトゲノムデータベースの検索により拡張した。NGSの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭嗅覚受容体を特定した。推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のNGSサンプル中でmRNAが極めて高レベルの量であるか、または、複数の独立した生物学的複製において存在するが1種以上の悪臭に応答する嗅神経細胞を含まない対照サンプル中には存在しない。標準的なバイオインフォマティクスツールを使用して、相同配列受容体は類似の機能を保持するという仮定の下で(Adipietro et al. (2012))、推定哺乳動物(非ヒト)の1種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連する1種以上のヒト匂い物質受容体を特定した。BLASTPおよび/またはBLASTNアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いた。第1表に、特定されたマウス匂い物質受容体(OR)および予測ヒトオーソログを挙げる。
関連するヒトタンパク質配列は、第1表に挙げたNGSで特定されたマウスOR配列に対して少なくとも60%の配列同一性の範囲内にある。同一性レベルは、BLASTPアルゴリズム後のアミノ酸配列のペアワイズ比較に関連して与えられる。26種の新規のヒトおよびマウスのORを、公共のゲノムデータベースのBLASTP検索(デフォルトパラメーター)によって特定した。16種が、NGS由来遺伝子Olfr740(配列番号1および配列番号2)、741(配列番号3および配列番号4)、743(配列番号5および配列番号6)、745(配列番号7および配列番号8)に密接に関連していた。これらは740ファミリーを構成する。10種が、NGS由来受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)に密接に関連していた。これらはOlfr665ファミリーを構成する。図4は、候補マウスインドールおよびスカトールOR遺伝子と、Olfr740(図4A)およびOlfr665(図4B)受容体ファミリーに属するそれらの予測ヒトオーソログとの系統学的関係を示す。この関係は、タンパク質配列に基づく近隣結合法による系統樹の再構成により得られたものである。対応するヒトオーソログを矢印で示す。偽遺伝子であるとの注釈が付されたヒトOR遺伝子名に「P」の印を付した。偽遺伝子は非機能性であるものと考えられる。OR11H7Pは、既知の機能対立遺伝子を有する分離偽遺伝子(SP)である。ダイヤ形(◇)は、NGSにより最初に特定された受容体を示す。追加候補のマウスおよびヒトのインドールおよびスカトールORに関するアミノ酸同一性を決定するために、完全長のタンパク質配列を、全ORレパートリーにわたって高度に保存されたアミノ酸モチーフに基づいて手動でアライメントした(Bioedit sequence alignment tool, version 7.0.5.3)。第2表に、マウスOlfr740ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。第3表に、マウスOlfr665ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。
実施例4
HEK293T細胞中でのマウスOR Olfr743、Olfr746およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
インドールおよびスカトールの双方の悪臭に対する、候補マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)の活性を、細胞ベースのcAMPアッセイで確認した。図5Aおよび5Bにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr743(配列番号6)およびOlfr740(配列番号2)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドール(左)またはスカトール(右)の濃度増加に曝露した。図5Cおよび5Dは、インドールおよびスカトールを用いた場合のOlfr740(配列番号2)の活性およびOlfr743(配列番号6)の活性が類似していることを示す反復試験である。図5Eにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr746(配列番号38)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドールまたはスカトールの濃度増加に曝露した。匂い物質誘発活性を、HTRFアプローチ(CisBioキット)を用いて、細胞質ゾル内cAMPレベルの測定により検出した。受容体活性の用量依存性増加を、双方の分子に対して3種全ての受容体に関して示す。Gαolf(配列番号21)単独(受容体なし)を用いたHEK細胞の共トランスフェクションを、非特異的活性についての対照として使用した(対照)。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。結果を図5に示す。3種全ての受容体は、悪臭化合物に対する特異的な用量依存的活性を示し、かつそれ自体で、こうした化合物に対する受容体を特定するための方法の正当性を実証している。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)およびOlfr743(配列番号5および配列番号6)を、インドールおよびスカトールの双方に応答した単離された嗅神経細胞から特定した。マウス受容体Olfr746(配列番号37および配列番号38)を、Olfr740(配列番号2)およびOlfr743(配列番号6)を検索配列として使用したデータベースマイニングによってインシリコで特定した。これらの受容体を、そのN末端でFLAGタグで修飾し、かつウシロドプシン受容体の最初の20のアミノ酸(配列番号18)を一過的にHEK293T細胞中で発現させ、かつ別々にインドールおよびスカトールで刺激することによって、それらが真のインドール/スカトール受容体であることを確認した。ヒトGαサブユニットGαolf(配列番号21)の共発現によってGs伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部cAMPが増加する。この結果は、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)がインドール−スカトール受容体であることを裏付けるものである。
HEK293T細胞中でのマウスOR Olfr743、Olfr746およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
インドールおよびスカトールの双方の悪臭に対する、候補マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)の活性を、細胞ベースのcAMPアッセイで確認した。図5Aおよび5Bにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr743(配列番号6)およびOlfr740(配列番号2)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドール(左)またはスカトール(右)の濃度増加に曝露した。図5Cおよび5Dは、インドールおよびスカトールを用いた場合のOlfr740(配列番号2)の活性およびOlfr743(配列番号6)の活性が類似していることを示す反復試験である。図5Eにおいて、タグ付きFLAG−Rho(配列番号18)、Olfr746(配列番号38)cDNA配列を、Gαolf(配列番号21)と共に共トランスフェクションし、かつインドールまたはスカトールの濃度増加に曝露した。匂い物質誘発活性を、HTRFアプローチ(CisBioキット)を用いて、細胞質ゾル内cAMPレベルの測定により検出した。受容体活性の用量依存性増加を、双方の分子に対して3種全ての受容体に関して示す。Gαolf(配列番号21)単独(受容体なし)を用いたHEK細胞の共トランスフェクションを、非特異的活性についての対照として使用した(対照)。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。結果を図5に示す。3種全ての受容体は、悪臭化合物に対する特異的な用量依存的活性を示し、かつそれ自体で、こうした化合物に対する受容体を特定するための方法の正当性を実証している。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)およびOlfr743(配列番号5および配列番号6)を、インドールおよびスカトールの双方に応答した単離された嗅神経細胞から特定した。マウス受容体Olfr746(配列番号37および配列番号38)を、Olfr740(配列番号2)およびOlfr743(配列番号6)を検索配列として使用したデータベースマイニングによってインシリコで特定した。これらの受容体を、そのN末端でFLAGタグで修飾し、かつウシロドプシン受容体の最初の20のアミノ酸(配列番号18)を一過的にHEK293T細胞中で発現させ、かつ別々にインドールおよびスカトールで刺激することによって、それらが真のインドール/スカトール受容体であることを確認した。ヒトGαサブユニットGαolf(配列番号21)の共発現によってGs伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部cAMPが増加する。この結果は、Olfr740(配列番号1および配列番号2)、Olfr743(配列番号5および配列番号6)およびOlfr746(配列番号37および配列番号38)がインドール−スカトール受容体であることを裏付けるものである。
実施例5
HEK293T細胞中でのヒトOR52N2、OR11G2、OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6およびOR11H4、並びにマウスOlfr665およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
候補ヒトインドールおよびスカトール悪臭受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)、OR11G2(配列番号13および配列番号14)、OR5AC2(配列番号75および配列番号76)、OR4C15(配列番号79および配列番号80)、OR8S1(配列番号83および配列番号84)、OR11H6(配列番号15および配列番号16)およびOR11H4(配列番号49および配列番号50)、並びに候補マウスインドールおよびスカトール悪臭受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)およびOlfr740(配列番号1および配列番号2)の活性を、細胞ベースのカルシウムフラックスアッセイにおいて確認した(図6)。細胞で安定的に共発現するRhoタグ付きヒトOR52N2(図6A、B)またはOR11G2(図6C)およびGαolf(配列番号25)を、スカトールまたはインドールの濃度増加に曝露した。図6Bは、インドールおよびスカトールを用いたOR52N2の類似の活性を示す反復試験である。匂い物質誘発OR52N2またはOR11G2活性を、匂い物質曝露後の最大のCalcium5色素(Molecular Devices)蛍光変化を測定することによって検出した。図6Aにおいては、活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位(RFU)に正規化されたベースライン補正RFU比と定義される。図6B〜Jにおいては、受容体活性の測定に相対的蛍光単位を用いる。受容体活性の用量依存的増加を記録し、かつ対応する用量反応曲線を双方の化合物について示す。受容体を欠く細胞株、例えばhOR52N2を、高濃度での非特異的活性についての対照として用いた(「インドール対照」および「スカトール対照」)。ヒト受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr665(配列番号10)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11G2(配列番号13および配列番号14)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr740(配列番号2)に対するその配列類似性ゆえに特定した。これらの受容体をRho配列で修飾し、かつHEK293T細胞中で安定的に発現させた。さらなる例として、ヒト受容体OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6、OR11H4、並びにマウス受容体Olfr665およびOlfr740に関するインドールおよびスカトールの用量反応曲線を示す(図6D−J)。ヒト受容体OR5AC2(配列番号75および配列番号76)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr207(配列番号78)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR4C15(配列番号79および配列番号80)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr1211(配列番号82)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR8S1(配列番号83および配列番号84)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr257(配列番号86)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H6(配列番号15および配列番号16)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr745(配列番号8)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H4(配列番号49および配列番号50)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるOlfr746(配列番号38)に対するその配列類似性ゆえに特定した。マウス受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。ヒトGαサブユニットGα15の共発現によってGq伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ca2+が増加する。この結果は、本明細書に開示された方法が、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
HEK293T細胞中でのヒトOR52N2、OR11G2、OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6およびOR11H4、並びにマウスOlfr665およびOlfr740のインドールおよびスカトール活性
候補ヒトインドールおよびスカトール悪臭受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)、OR11G2(配列番号13および配列番号14)、OR5AC2(配列番号75および配列番号76)、OR4C15(配列番号79および配列番号80)、OR8S1(配列番号83および配列番号84)、OR11H6(配列番号15および配列番号16)およびOR11H4(配列番号49および配列番号50)、並びに候補マウスインドールおよびスカトール悪臭受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)およびOlfr740(配列番号1および配列番号2)の活性を、細胞ベースのカルシウムフラックスアッセイにおいて確認した(図6)。細胞で安定的に共発現するRhoタグ付きヒトOR52N2(図6A、B)またはOR11G2(図6C)およびGαolf(配列番号25)を、スカトールまたはインドールの濃度増加に曝露した。図6Bは、インドールおよびスカトールを用いたOR52N2の類似の活性を示す反復試験である。匂い物質誘発OR52N2またはOR11G2活性を、匂い物質曝露後の最大のCalcium5色素(Molecular Devices)蛍光変化を測定することによって検出した。図6Aにおいては、活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位(RFU)に正規化されたベースライン補正RFU比と定義される。図6B〜Jにおいては、受容体活性の測定に相対的蛍光単位を用いる。受容体活性の用量依存的増加を記録し、かつ対応する用量反応曲線を双方の化合物について示す。受容体を欠く細胞株、例えばhOR52N2を、高濃度での非特異的活性についての対照として用いた(「インドール対照」および「スカトール対照」)。ヒト受容体OR52N2(配列番号11および配列番号12)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr665(配列番号10)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11G2(配列番号13および配列番号14)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール/スカトール受容体であるマウスOlfr740(配列番号2)に対するその配列類似性ゆえに特定した。これらの受容体をRho配列で修飾し、かつHEK293T細胞中で安定的に発現させた。さらなる例として、ヒト受容体OR5AC2、OR4C15、OR8S1、OR11H6、OR11H4、並びにマウス受容体Olfr665およびOlfr740に関するインドールおよびスカトールの用量反応曲線を示す(図6D−J)。ヒト受容体OR5AC2(配列番号75および配列番号76)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr207(配列番号78)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR4C15(配列番号79および配列番号80)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr1211(配列番号82)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR8S1(配列番号83および配列番号84)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr257(配列番号86)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H6(配列番号15および配列番号16)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスOlfr745(配列番号8)に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体OR11H4(配列番号49および配列番号50)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるOlfr746(配列番号38)に対するその配列類似性ゆえに特定した。マウス受容体Olfr665(配列番号9および配列番号10)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。マウス受容体Olfr740(配列番号1および配列番号2)を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのNGSデータから直接特定した。ヒトGαサブユニットGα15の共発現によってGq伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ca2+が増加する。この結果は、本明細書に開示された方法が、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
実施例6
HEK293T細胞におけるインドール受容体Olfr743の活性の阻害
本明細書に概説した手順を使用して特定した後に、得られた悪臭受容体細胞株を使用して、その活性と可能性として考えられるヒトの知覚とを調節する化合物の化学ライブラリーをスクリーニングすることができる。この試験を、実施例4と同一の条件下に行った。Rhoタグ付き(配列番号18)Olfr743(配列番号6)と共にトランスフェクトされた細胞を、300μMの2−アセトナフトンの存在下または不在下に、インドールの濃度増加に曝露した。2−アセトナフトンは、インドールに対するOlfr743(配列番号6)の活性を阻害する。結果を第4表および図7に示す。アンタゴニスト化合物の存在下では用量反応曲線の右方向へのシフトが認められ、その結果、インドールに対してEC50が4倍増加する。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。この結果は、2−アセトナフトンがインドール受容体に結合して、この受容体の活性を阻害することを示している。
HEK293T細胞におけるインドール受容体Olfr743の活性の阻害
本明細書に概説した手順を使用して特定した後に、得られた悪臭受容体細胞株を使用して、その活性と可能性として考えられるヒトの知覚とを調節する化合物の化学ライブラリーをスクリーニングすることができる。この試験を、実施例4と同一の条件下に行った。Rhoタグ付き(配列番号18)Olfr743(配列番号6)と共にトランスフェクトされた細胞を、300μMの2−アセトナフトンの存在下または不在下に、インドールの濃度増加に曝露した。2−アセトナフトンは、インドールに対するOlfr743(配列番号6)の活性を阻害する。結果を第4表および図7に示す。アンタゴニスト化合物の存在下では用量反応曲線の右方向へのシフトが認められ、その結果、インドールに対してEC50が4倍増加する。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正HTRF比と定義される。この結果は、2−アセトナフトンがインドール受容体に結合して、この受容体の活性を阻害することを示している。
Claims (40)
- 匂いおよび/または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下:
a)非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること;
b)前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること;
c)前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを接触させること;
d)匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること;
e)悪臭化合物によって活性化された1種以上の嗅神経細胞を単離すること;
f)前記単離された嗅覚受容体のmRNAを増幅すること;
g)次世代シーケンシングにより前記mRNAの全トランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること;および
h)前記トランスクリプトームの配列を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法。 - 請求項1に記載の方法であって、さらに、請求項1において特定された悪臭嗅覚受容体と極めて密接に関連するヒト受容体を特定することを含む、前記方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに、細胞株を改変することにより、請求項1において特定された少なくとも1種の悪臭嗅覚受容体を発現させることを含む、前記方法。
- 請求項2に記載の方法であって、さらに、細胞株を改変することにより、請求項2において特定された少なくとも1種のヒト受容体を発現させることを含む、前記方法。
- 請求項3に記載の方法であって、さらに、前記悪臭嗅覚受容体と試験化合物とを接触させることにより、該試験化合物が該悪臭嗅覚受容体に結合するかどうかを決定することを含む、前記方法。
- 請求項4に記載の方法であって、さらに、前記ヒト受容体と試験化合物とを接触させることにより、該試験化合物が該受容体に結合するかどうかを決定することを含む、前記方法。
- 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも65%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも75%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15,配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有する、単離された核酸。 - 以下:
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83および配列番号85
からなる群から選択される核酸配列を有する、単離された核酸。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも75%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 請求項7から16までのいずれか1項に記載の単離された核酸配列であって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。 - 以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片。 - 以下:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84および配列番号86
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片。 - 請求項27から37までのいずれか1項に記載のポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞。
- 請求項38に記載の細胞であって、HEK293、CHO、アフリカツメガエル卵母細胞、COS、酵母、細菌および嗅プラコード由来細胞からなる群から選択される、前記細胞。
- インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される匂い物質または香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および/または増強する化合物を特定するための方法であって、以下:
a)前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、ここで、前記受容体は請求項27から37までのいずれか1項に記載のポリペプチドであるものとする;
b)前記化合物が前記受容体の活性を遮断、阻害、調節または増強する程度を測定すること
を含む、前記方法。
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