BR112015032700B1 - Métodos de identificação, isolamento e uso de receptores de aroma e odorizante - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, ISOLAMENTO E USO DE RECEPTORES DE AROMA E ODORIZANTE A presente invenção se refere a novos métodos para identificar famílias específicas de receptores de odorizante de mamífero para odorizantes ou aroma, particularmente maus odores de escatol e indol e o uso dos mesmos em ensaios que podem ser usados para revelar compostos que modulam (ao bloquear, intensificar, mascarar ou imitar compostos) a atividade dos mesmos. Receptores de odorizante de camundongo órfão são identificados a partir de neurônios sensoriais olfativos que respondem a compostos-alvo. Os receptores resultantes assim como os correspondentes humanos dos mesmos podem ser submetidos à triagem em ensaios contra compostos de teste para confirmar a identidade dos mesmos como receptores de odorizante ou aroma, particularmente receptores de mau odor e subsequentemente revelar, por exemplo, moduladores que inibem a percepção do mau odor em seres humanos.

Description

CAMPO

[001] O campo da técnica é direcionado a receptores de aroma e odorizantes e ensaios que podem ser usados para identificar compostos de aroma e/ou odorizantes e, mais especificamente, inibidores ou neutralizadores de compostos de mau odor, tais como indol ou escatol.

ANTECEDENTES

[002] A olfação é um dos sistemas sensoriais humanos mais complexos e pouco compreendidos. Da ativação do receptor olfativo (OR) para percepção, existem muitas etapas que ainda necessitam de investigação. Se for possível entender como o código de OR para odorizantes individuais e misturas é traduzido em percepção, pode-se, então, explorar esse conhecimento para levar um benefício significativo para certas áreas. Essas áreas incluem moduladores de odor, como neutralizadores de mau odor que bloqueiam a percepção de odores desagradáveis, novos ingredientes de sabor e de fragrância que substituem compostos não biodegradáveis ou tóxicos, e intensificadores de odor que limitariam a dependência a compostos de origem difícil a partir de fontes naturais. O paradigma combinatório do código olfativo é centralizado na observação de que qualquer único OR pode ser ativado por múltiplos odorizantes e, de modo oposto a maior parte dos odorizantes tem capacidade para ativar certos ORs. No genoma de camundongo existem ~1.200 ORs distintos. Humanos, em contraste, têm ~400. Em ambos os casos, o repertório de ORs é ativado por muitos milhares de odorizantes no mundo, e é essa complexidade combinatória que permite a amplitude de sensações olfativas que se pode sentir. No entanto, odorizantes ou ligantes para apenas 95 ORs de camundongo (~8%) e 41 de humano (~10%) foram identificados até 2014 com o uso de métodos de desorfanização tradicionais. Além disso, a relevância fisiológica de maioria dos ligantes para os ORs de humano, essencialmente identificados in vitro, não foi testada.

[003] Diferentes métodos de desorfanização de OR foram descritos na literatura [por exemplo, Touhara (2007) Deorphanizing vertebrate olfactory receptors: Recent advances in odorant-response assays Neurochem Int 51, 132 a 139, Saito et al (2009) Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal 2, ra9 and Peterlin et al. (2014), The State of the Art of Odorant Receptor Deorphanization: a Report from the Orphanage, J Gen Physiol; 143(5): 527 a 42]. Muitos desses métodos dependem exclusivamente de ensaios baseados em célula em que o OR é expresso em células não olfativas que são adequadas para triagem com alto rendimento. No entanto, os ORs são frequentemente retidos no retículo endoplasmático de tais células heterólogas. Com a falha em transitar para a superfície celular, os ORs são, então, incapazes de interagir com o odorizante [Min et al. (2004) Endoplasmic reticulum degradation impedes olfactory G-protein coupled receptor functional expression. BMC Cell Biol 5, 34]. Portanto, uma abordagem sistemática em que centenas de milhares de diferentes linhagens celulares, em que cada linhagem celular possui uma única proteína de OR que pode ser avaliada para atividade odorizante, não é uma abordagem adequada para a decodificação compreensiva das interações combinatórias entre os odorizantes e os ORs visto que muitos ou a maior parte dos receptores não funciona adequadamente em tais linhagens celulares. Há, portanto, uma necessidade de novos métodos que possam identificar de maneira rápida e confiável o subconjunto relativamente pequeno de ORs, dentro de todo o repertório de ORs que existe em um organismo, que é especificamente ativado ou inibido por um ou mais odorizantes. Há uma necessidade adicional para um método envolver a identificação de ORs a partir dos neurônios olfativos em si, em que se presume que os ORs estejam completamente funcionais, evitando, assim, os desafios bem conhecidos de ensaios de OR nas células não olfativas.

[004] Os compostos de mau odor, tais como indol, escatol (3-metil indol) e p- cresol geram odores desagradáveis que se originam, por exemplo, a partir de latrinas e outras fontes de "banheiro" que contêm matéria fecal. Portanto, os neutralizadores de mau odor que mascaram ou reduzem a intensidade percebida ou modificam a qualidade percebida, por exemplo, do cheiro, em humanos, dos compostos são desejáveis. Os receptores odorizantes e, mais especificamente, receptores de mau odor precisam ser identificados. Os receptores que se ligam a indol e escatol também foram identificados e os compostos que se ligam a esses receptores foram revelados e relatados como moduladores em potencial do mau odor. No entanto, a rápida identificação do repertório completo de receptores que se ligam a maus odores, particularmente receptores de indol ou escatol, continua sendo desejada devido aos múltiplos ORs que existem em mamíferos. Os ensaios que dependem de novos receptores de mau odor para identificar novos compostos potentes que se ligam a esses receptores são adicionalmente desejados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] É fornecido no presente documento um método de identificação de receptores olfativos que são ativados por um composto odorizante ou de aroma que compreende:

[006] a) dissociar um epitélio olfativo isolado que contém neurônios olfativos nativos em células únicas de uma espécie mamífera não humana sendo que cada neurônio expressa um receptor olfativo;

[007] b) carregar as células olfativas com um corante indicador que permite a medição de atividade de ligação de receptor odorizante ou de aroma dos receptores olfativos;

[008] c) colocar os receptores olfativos em contato com compostos odorizantes ou de aroma sequencialmente;

[009] d) medir mudanças de atividade neural induzida por odorizante ou aroma;

[010] e) isolar um ou mais neurônios olfativos que foram ativados por um composto odorizante ou de aroma;

[011] f) isolar, ou isolar e amplificar o mRNA dos receptores olfativos isolados;

[012] g) sequenciar pelo menos uma porção do transcriptoma do mRNA por sequênciamento de nova geração; e

[013] h) determinar a identidade de um grupo de receptores olfativos selecionados a partir do grupo que consiste em receptores de aroma e odorizante comparando-se a sequência do transcriptoma a uma sequência de genoma de referência da mesma espécie e de outras espécies vertebradas.

[014] É fornecido adicionalmente um método de identificação de receptores olfativos que são ativados por um composto de mau odor que compreende:

[015] a) dissociar um epitélio olfativo isolado que contém neurônios olfativos nativos em células únicas de uma espécie mamífera não humana em que cada neurônio expressa um receptor olfativo;

[016] b) carregar as células olfativas com um corante indicador que permite a medição de atividade de ligação de receptor de mau odor dos receptores olfativos;

[017] c) colocar os receptores olfativos em contato com compostos de mau odor sequencialmente;

[018] d) medir mudanças de atividade neural induzida por odorizante;

[019] e) isolar um ou mais neurônios olfativos que foram ativados por um composto de mau odor;

[020] f) isolar, ou isolar e amplificar o mRNA dos receptores olfativos isolados;

[021] g) sequenciar pelo menos uma porção do transcriptoma do mRNA por sequênciamento de nova geração; e

[022] h) determinar a identidade de um grupo de receptores olfativos de mau odor comparando-se a sequência do transcriptoma a uma sequência de genoma de referência da mesma espécie e de outras espécies vertebradas.

[023] É fornecido adicionalmente do presente documento uma sequência de ácidos nucleicos isolada que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO: 85.

[024] Também é fornecida, no presente documento, uma sequência de ácidos nucleicos isolada, conforme descrito acima, que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 86.

[025] Também é fornecido, no presente documento, um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 86.

[026] Adicionalmente, é fornecida ainda uma célula que é modificada de maneira recombinante para expressar um polipeptídeo, descrito acima.

[027] São fornecidos adicionalmente ensaios para identificar compostos que se ligam a receptores odorizantes de indol e/ou escatol. Em particular, é fornecido no presente documento um método para identificar um composto que bloqueia, inibe, modula e/ou intensifica a atividade de um receptor olfativo que é ativado por um composto selecionado a partir do grupo que consiste em indol e escatol que compreende

[028] a) colocar o receptor, ou uma quimera ou fragmento em contato com um composto;

[029] b) analisar se o composto tem um efeito na atividade do receptor; em que o receptor é um polipeptídeo descrito acima.

[030] Em uma modalidade, a atividade do composto é determinada comparando-se sua ligação com aquela do indol e/ou escatol. Em outra modalidade, o receptor é colocado em contato com um composto na presença de escatol e/ou indol sob condições que permitem a ligação do composto, junto com escatol e/ou indol, ao receptor.

[031] Em uma modalidade adicional, fornecida no presente documento, quando um ensaio funcional é usado para medir a atividade de ligação, a etapa de medir uma atividade de sinalização dos receptores, fornecida no presente documento, pode compreender detectar uma mudança no nível de um segundo mensageiro. Em outra modalidade, a medição de uma atividade de sinalização é fornecida em que a etapa de medir uma atividade de sinalização compreende a medição de ligação/acoplamento ou troca de nucleotídeo de guanina, atividade de adenilato ciclase, cAMP, atividade de proteína quinase C, decomposição de fosfatidilinositol por atividade de proteína quinase A, diacilglicerol, inositol trifosfato, cálcio intracelular, fluxo de cálcio flux, ácido araquidônico, atividade de MAP quinase, atividade de tirosina quinase, ensaio de melanóforo, ensaio de inicialização de receptor, FRET, BRET ou expressão de gene repórter. Em uma modalidade particular fornecida no presente documento, a medição de atividade de sinalização compreende o uso de um ensaio de fluorescência ou de luminescência. Os ensaios de fluorescência e luminescência podem compreender o uso de fluoróforos sensíveis de Ca2+ que incluem corantes de Fluo-3, Fluo-4 ou Fura, (sondas moleculares); família de kit de ensaio de Cálcio 3 (dispositivo molecular) e aequorina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS

[032] A Figura 1 mostra uma visão geral esquemática do processo de desorfanização de receptor de mau odor

[033] A Figura 2 mostra traços de imageamento de Ca2+ que são mostrados para 6 neurônios sensoriais olfatórios independentes ativados especificamente tanto por indol quanto escatol (50 μM cada).

[034] A Figura 3 mostra genes de receptor de mau odor identificados com o uso de procedimentos esquematizados no presente documento.

[035] As Figuras 4A e 4B mostram receptores de mau odor de humano e de camundongos adicionais dentro das famílias Olfr740 (4A) e 01fr665 (4B) identificadas com o uso de procedimentos esquematizados no presente documento.

[036] As Figuras 5A a 5E mostram a atividade de indol e escatol de ORs de camundongos 01fr743, 01fr746 e Olfr740 em células HEK293T.

[037] As Figuras 6A a 6J mostram a atividade de indol e escatol de humanos OR52N2, OR11G2, OR5AC2, OR4C15, OR8S1, OR11H6 e OR11H4, e camundongos 01fr665 e Olfr740 em células HEK293T.

[038] A Figura 7 mostra a inibição da atividade de receptor de indol 01fr743 em células HEK293T por um composto de teste.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[039] Para as descrições no presente documento e as reivindicações em anexo, o uso de "ou" significa "e/ou" a menos que seja de outra maneira especificado. De maneira semelhante, "compreendem", "compreende", "que compreende" "incluem", "inclui" e "que inclui" são intercambiáveis e não se destinam a serem limitadores.

[040] Deve-se compreender adicionalmente que onde as descrições de várias modalidades usam o termo "que compreende", aqueles versados na técnica compreenderiam que, em instâncias específicas, uma modalidade pode ser descrita de maneira alternativa com o uso da linguagem "que consiste essencialmente em ou "que consiste em."

DEFINIÇÕES

[041] Os termos a seguir têm os significados atribuídos aos mesmos a menos que seja de outra maneira especificado.

[042] "OR" se refere a um ou mais membros de uma família de receptores acoplados à proteína G que são expressos em células olfativas. As células de receptor olfativo também podem ser identificadas com base na morfologia ou pela expressão de proteínas expressas especificamente em células olfativas. Os membros da família OR podem ter a habilidade de agir como receptores para transdução olfativa.

[043] "Indol" e/ou "OR de escatol" refere-se a um membro da família de receptores acoplados à proteína G que é expresso em uma célula olfativa, receptores os quais se ligam e /ou são ativados pelo indol e/ou escatol em um ensaio de atividade ou ligação para identificar ligantes que se ligam e modulam GPCRs ativando-se, inibindo-se ou intensificando-se sua atividade. Tais ensaios são descritos abaixo. Os receptores indol e/ou escatol no presente documento irão inclui fragmentos, variantes, que incluem aquelas que ocorrência sintética e natural, e quimeras que respondem ou se ligam a indol e/ou escatol.

[044] Os ácidos nucleicos de "OR" codificam uma família de GPCRs com sete regiões transmembranares que têm "atividade de receptor acoplado à proteína G", por exemplo, os mesmos podem se ligar a proteínas G em resposta a estímulos extracelulares e promover a produção de segundos mensageiros, tais como IP3, cAMP, cGMP e Ca2+ por meio de estímulo de enzimas, tais como fosfolipase C e adenilato ciclase.

[045] Polipeptídeos de "OR" são considerados como tais se os mesmos pertencem à superfamília de receptor acoplado à proteína G de domínio de 7 membranas codificada por um único éxon de ~1 kb de comprimento e exibem motivos de aminoácidos específicos de receptor olfativo característicos. Os sete domínios previstos são chamados domínios de "transmembrana" ou "TM", TM I a TM VII, conectados por três domínios de "alça celular interna" ou "IC previstos", IC I a IC III, e três domínios de "alça celular externa" ou "EC" previstos, EC I a EC III. Os motivos são definidos como, porém, não restritos, o motivo MAYDRYVAIC que sobrepõe TM III e IC II, o motivo FSTCSSH que sobrepões IC III e TM VI, o motivo PMLNPFIY em TM VII, assim como três resíduos C conservados em EC II, e a presente de resíduos GN altamente conservados em TM I [Zhang and Firestein (2002), The olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5 (2). 124 a 33; Malnic et al, The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584 a 9].

[046] A região de "domínio N terminal " se inicia no N-terminal e se estende para uma região próxima ao início da primeira região transmembranar prevista. O "domínio transmembranar", que compreende sete "regiões transmembranares" previstas, refere-se ao domínio de polipeptídeos de OR que se encontra dentro da membrana plasmática, e também pode incluir os laços citoplasmáticos (intracelular) e extracelular correspondentes. As sete regiões transmembranares e laços extracelulares e citoplasmáticos podem ser identificados com o uso de métodos- padrão, conforme descrito em Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol, 157: 105 a 32 (1982), ou em Stryer. A estrutura secundária e terciária de domínios transmembranares, em particular, os sete domínios transmembranares de receptores acoplados à proteína G, tais como receptores olfativos, são conhecidas na técnica. Portanto, a sequência de estrutura primária pode ser projetada ou prevista com base em sequências de domínios transmembranares conhecidas, conforme descrito em detalhe abaixo. Esses domínios transmembranares são úteis para ensaios de ligante-ligação in vitro, tanto na fase sólido quanto solúvel.

[047] A expressão "ensaio funcional" no contexto de ensaios para testar compostos que modulam a transdução olfativa mediada por membro da família OR inclui a determinação de qualquer parâmetro que esteja, indiretamente ou diretamente, sob a influência do receptor, por exemplo, efeitos funcionais, físicos e químicos. A mesma inclui ligação de ligante, mudanças em fluxo de íons, potencial de membrana, fluxo de corrente, transcrição, ligação de proteína G, fosforilação ou desfosforilação de GPCR, interações de receptor-ligante de transdução de sinal, concentrações de segundo mensageiro (por exemplo, cAMP, cGMP IP3 ou Ca2+ intracelular), ensaios realizados in vitro, in vivo e ex vivo. A mesma também inclui outros efeitos fisiológicos, tais como aumentos ou diminuições de liberação de hormônio ou neurotransmissor. Estão incluídos na presente invenção ensaios funcionais para um composto que aumenta ou diminui um parâmetro que está, indireta ou diretamente, sob a influência de um membro da família de OR, por exemplo, efeitos funcionais, físicos e químicos. Tais ensaios funcionais ou efeitos podem ser medidos por qualquer meio conhecido pelos versados na técnica, por exemplo, mudanças em características espectroscópicas (por exemplo, fluorescência, luminescência, absorbância, índice de refração), hidrodinâmicas (por exemplo, formato), cromatográficas, propriedades de solubilidade, fixação de membrana (patch clamping), corantes sensíveis à tensão, correntes de células inteiras, efluxo de radioisótopo, marcadores induzíveis, expressão de gene de OR oócito; expressão de OR de célula de cultura de tecido; ativação transcricional de genes de OR; ensaios de ligante-ligação; tensão, alterações em potencial e condutância de membrana; ensaios de fluxo de íons; alterações em segundos mensageiros intracelulares, tais como cAMP, cGMP e inositol trifosfato (IP3); alternações em níveis de cálcio intracelulares; liberação de neurotransmissor e semelhantes.

[048] Os "inibidores", "bloqueadores, "ativadores", "neutralizadores" e "moduladores" de genes ou proteínas de OR são usados de maneira intercambiável para se referir a inibição, ativação ou modulação de moléculas identificadas com o uso de ensaios ex vivo, in vitro e in vivo para transdução olfativa, por exemplo, ligantes, agonistas, antagonistas, agonistas inversos e seus homólogos e mímicos. Os inibidores e bloqueadores são compostos que, por exemplo, se ligam, bloqueiam parcial ou totalmente o estímulo, diminuem, previnem, atrasam a ativação, inativam, dessensibilizam ou regulam de maneira descendente a transdução olfativa, por exemplo, antagonistas. Os ativadores são compostos que, por exemplo, se ligam, estimulam, aumentam, abrem, ativam, facilitam, intensificam a ativação, sensibilizam ou regulam de maneira ascendente a transdução olfativa, por exemplo, agonistas. Os moduladores incluem compostos que, por exemplo, alteram a interação de um receptor com: proteínas extracelulares que ligam ativadores ou inibidores (por exemplo, proteínas que ligam odorizantes, lipocalina e outros membros da família de carreadores hidrofóbicos); proteínas G; quinases (por exemplo, homólogos de rodopsina quina e quinases do receptor adrenérgico beta que são envolvidas na desativação e dessensibilização de um receptor); e arrestinas, que também desativam e dessensibilizam receptores. Os moduladores podem incluir versões geneticamente modificadas de membros da família de OR, por exemplo, com atividade alterada, assim como ligantes, antagonistas, agonistas, pequenas moléculas químicas de ocorrência natural ou sintética e semelhantes. Tais ensaios para inibidores e ativadores incluem, por exemplo, expressar membros da família de OR em células ou membranas celulares, aplicar compostos de modulador putativos, na presença ou ausência de moléculas de sabor ou fragrância, por exemplo, materiais brutos de perfumaria, formulações de perfume ou maus odores e, então, determinar os efeitos funcionais em transdução olfativa, conforme descrito acima. Amostras ou ensaios de OR que compreendem membros da família de OR que são tratados com um ativador, inibidor ou modulador em potencial são comparados sem o inibidor, ativador ou modulador para examinar a extensão da modulação. Amostras de controle (não tratadas com moduladores) são atribuídas com um valor de atividade de OR relativo de 100%. A inibição de um OR é alcançada quando o valor de atividade de OR em relação ao controle é de cerca de 80%, opcionalmente 50% ou 25 a 0%. A ativação de um OR é alcançada quando o valor de atividade de OR em relação ao controle é de 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200 a 500% ou 1.000 a 3.000% mais alto.

[049] Os termos "purificado", "substancialmente purificado" e "isolado", conforme usado no presente documento, referem-se ao estado de se estar isento outros compostos dissimilares com os quais o composto da invenção é normalmente associado em seu estado natural, de modo que a matéria "purificada", "substancialmente purificada" e "isolada" compreende pelo menos 0,5%, 1%, 5%, 10% ou 20%> e, com máxima preferência, pelo menos 50%> ou 75% da massa, em peso, de uma determinada amostra. Em uma modalidade preferencial, esses termos se referem ao composto da invenção que compreende pelo menos 95% da massa, em peso, de uma determinada amostra.

[050] Conforme usado no presente documento, o termo "isolado", ao se referir a um ácido nucleico ou polipeptídeo, refere-se a um estado de purificação ou concentração diferente daquele que ocorre naturalmente no corpo de mamífero, especificamente de humano. Qualquer grau de purificação ou concentração maior do que aquele que ocorre naturalmente no corpo, incluindo (1) a purificação por outras estruturas ou compostos associados de ocorrência natural, ou (2) a associação com estruturas ou compostos aos quais o mesmo não é normalmente associado no corpo estão dentro do significado de "isolado", conforme usado no presente documento. Os ácidos nucleicos ou polipeptídeos descritos no presente documento podem ser isolados ou de outra maneira associados a estruturas ou compostos aos quais os mesmos não são normalmente associados na natureza, de acordo com uma variedade de métodos e processos conhecidos por indivíduos versados na técnica.

[051] Conforme usado no presente documento, os termos "que amplifica" e "amplificação" referem-se ao uso de qualquer metodologia de amplificação adequada para gerar ou detectar um recombinante de ácido nucleico expresso naturalmente, conforme descrito em detalhes abaixo. Por exemplo, a invenção fornece métodos e reagentes (por exemplo, pares de iniciador de oligonucleotídeo degenerado específicos) para amplificar (por exemplo, por reação em cadeia de polimerase, PCR) ácidos nucleicos expressos naturalmente (por exemplo, genômico ou mRNA) ou recombinantes (por exemplo, cDNA) da invenção in vivo, ex vivo ou in vitro.

[052] O termo "receptor transmembranas 7" significa um polipeptídeo que pertence a uma superfamília de proteínas transmembranares que tem sete domínios que abrange a membrana plasmática sete vezes (portanto, os sete domínios são chamados domínios de "transmembrana" ou "TM", TM I a TM VII). As famílias de receptores olfativos e de certos receptores de sabor pertencem, cada um, a essa superfamília. Os polipeptídeos de receptor de 7 transmembranas têm estruturas primária, secundária e terciária semelhantes e características, conforme discutido em mais detalhes abaixo.

[053] O termo "ácido nucleico" ou "sequência de ácidos nucleicos" refere-se a um desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo oligonucleotídeo ou em forma de fita simples ou de fita dupla. O termo abrange ácidos nucleicos, isto é, oligonucleotídeos, que contém análogos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas semelhantes à ácido nucleico com cadeias principais sintéticas. A menos que seja indicado de outra maneira, uma sequência de ácidos nucleicos específica também abrange implicitamente variantes modificados de maneira conservadora da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerados ou polimorfismos de nucleotídeo único) e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser alcançadas gerando-se, por exemplo, sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados são substituídas com resíduos de desoxinosina e/ou de base misturada.

[054] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de maneira intercambiável no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente de ocorrência natural, assim como de polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural. O termo "heterólogo", quando usado com referência a porções de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de maneira recombinante, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostas para produzir um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. De maneira semelhante, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

[055] Conforme usado no presente documento, "recombinante" refere-se a um polinucleotídeo sintetizado ou de outra maneira manipulado in vitro (por exemplo, "polinucleotídeo recombinante"), a métodos de uso de polinucleotídeos recombinantes para produzir produtos de gene em células ou outros sistemas biológicos, ou a um polipeptídeo ("proteína recombinante") codificada por um polinucleotídeo recombinante. "Meios Recombinantes" também abrangem a ligação de ácidos nucleicos que têm várias regiões de codificação ou domínios ou sequências de promotor de diferentes fontes em um cassete de expressão ou vetor para expressão de, por exemplo, expressão induzível ou constitutiva de uma proteína de fusão que compreende um domínio de translocação da invenção e uma sequência de ácido nucleico amplificada com o uso de um iniciador da invenção.

[056] O termo "vetor de expressão" se refere a qualquer sistema de expressão recombinante para o propósito de expressar uma sequência de ácido nucleico da invenção in vitro ou in vivo, de modo constitutivo ou induzível, em qualquer célula, incluindo procariótica, levedura, fúngica, planta, inseto ou célula de mamífero. O termo inclui sistemas de expressão lineares ou circulares. O termo inclui sistemas de expressão que permanecem episomais ou integrados no genoma de célula hospedeira (por exemplo, expressão estável). Os sistemas de expressão podem ter a capacidade de autorreplicar ou não, isto é, conduzir apenas expressão transiente em uma célula. O termo inclui “cassetes” de expressão recombinante que contêm apenas os elementos mínimos necessários para transcrição do ácido nucleico recombinante.

[057] Por "célula hospedeira" entende-se uma célula que contém um vetor de expressão e suporta a replicação ou expressão do vetor de expressão. As células hospedeiras podem ser células procarióticas tais como E. coli, ou células eucarióticas tais como levedura, inseto, anfíbio, ou células de mamífero tais como CHO, HeLa, HEK-293, e similares, por exemplo, células cultivadas, explantes e células in vivo.

[058] Em uma modalidade fornecida no presente documento há uma sequência de ácido nucleico isolada que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, e SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 , SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO: 85.

[059] Em uma modalidade fornecida no presente documento é uma sequência de ácido nucleico isolada conforme descrito acima que codifica um polipeptídio que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98%o identidade de sequência com um polipeptídio que tem uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 86.

[060] Em uma modalidade adicional fornecida no presente documento é um polipeptídio isolado que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% identidade de sequência com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 86, ou um fragmento biologicamente ativo de tal polipeptídio.

[061] Um método possibilita uma pessoa versada na técnica a identificar rapidamente o subconjunto relativamente pequeno de receptores de odorizante (ORs), dentro da população total de ~1.200 ORs que existem no genoma de roedor, cujos correspondentes genéticos humanos provavelmente codificam uma característica de odor específica em humanos. A Figura 1 é uma vista geral esquemática do método. O tecido de epitélio olfativo de camundongo intacto (OE) é dissociado por tratamento mecânico e enzimático em células únicas. Os neurônios sensoriais olfativos individuais (OSNs) resultantes são plaqueados sobre lamínulas de vidro e carregados com um corante indicador de cálcio (por exemplo, Fura-2) para detectar atividade celular. As lamínulas são colocadas, então, em uma câmara de perfusão e banhadas em uma solução de sal fisiológico. Os odorizantes de teste de maus odores são diluídos em solução salina fisiológica e respingados sobre as células. A atividade de OSN é, então, detectada monitorando-se as mudanças em fluxo de cálcio intracelular através de uma mudança em fluorescência de Fura-2 e um microscópio fluorescente. De modo importante, em alguns casos, apenas um ou dois dentre ~1.200 genes OR possíveis são expressos em um determinado OSN. Isso significa que a atividade de um determinado OSN é conduzida exclusivamente por um único tipo, ou dois tipos, de proteína(s) OR expressa na superfície de célula. Um sistema de imageamento de cálcio semiautomático com um sistema de injeção de odorizante finamente controlado e um estágio móvel permite monitoramento de >1.500 OSNs em um único experimento. Com ~1.200 genes OR em camundongo, esse rendimento garante uma amostragem representativa de todo o repertório de OR. Um ou mais OSNs que respondem a um ou mais odorizante de teste são coletados com o uso de uma micropipeta de vidro e deslocados em um microtubo para extração de RNA subsequente, amplificação, e Sequenciamento de Nova Geração (NGS) de transcriptomas de OSN. O sequenciamento de transcriptoma com base em NGS de quantidades muito pequenas de material inicial (<100 células) tem sido relatado na literatura. Entretanto, ainda não foi aplicado para o propósito específico de desorfanização de Receptor Acoplado a Proteína G (GPCR) ao melhor do presente documento; em particular, receptores olfativos. Com o uso dos métodos descritos no presente documento, múltiplos OSNs podem ser agrupados no mesmo microtubo se desejado. Leituras de sequência bruta são, então, mapeadas a um genoma de referência, visualmente inspecionado para alinhamento apropriado e anotação, e analisado para mapeamento positivo falso devido a, por exemplo, sequências de repetição de genoma. O resultado é uma lista de ORs de camundongo candidato que são provavelmente ativados pelo mesmo odorizante(s) de teste de maus odores usado para realizar triagem de OSNs de camundongo. As sequências de proteína OR de camundongo candidato são, então, usadas para consultar (por exemplo, BLASTP) bancos de dados de genoma de camundongo públicos para obter uma lista completa de sequências OR de camundongo candidato. Esses candidatos são relacionados por homologia de sequência (isto é, parálogo) às sequências de OR derivadas de NGS originalmente identificadas a partir dos neurônios que foram ativados por indol e/ou escatol. A lista completa de parálogo de camundongo (derivado de NGS e BLASTP) é, então, usada para consultar bancos de dados públicos de genoma humano para obter uma lista de sequências de OR de humano candidato que são relacionadas (isto é, ortólogo) às sequências de OR de camundongo. O resultado é uma lista completa de ORs de humano e camundongo candidato que são provavelmente ativados pelos odorizantes de teste. Para confirmar a atividade dos genes de ORs de candidato resultantes, cDNAs dos ditos genes podem ser clonados em vetores de expressão disponíveis e transfectados em células cultivadas que são triagem de rendimento receptiva a alta (por exemplo HEK293T). Pode-se, então, realizar triagem nas linhagens de célula resultantes, contendo, cada uma, um cDNA de OR de candidato expresso de modo recombinante, em um ensaio de atividade com base em célula com os odorizantes de teste usados em imageamento de cálcio e outros odorizantes relacionados de modo estrutural ou organolético.

[062] Em uma modalidade particular, epitélio olfativo contendo neurônios olfativos nativos de um mamífero não humano (por exemplo, camundongo) são isolados e dissociados em células únicas de acordo com, por exemplo, Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756. Em uma modalidade particular, cada neurônio expressa apenas um ou dois receptores de cada vez. O tecido olfativo usado para gerar neurônios olfativos é, em uma modalidade, de um mamífero não humano que tem dados publicamente disponíveis em relação aos receptores e sequências associadas. Isso inclui tecido de camundongo, rato e hamster. O protocolo de dissociação deve ser otimizado a fim de garantir alta taxa de neurônios graváveis sobreviventes. Em uma modalidade particular, um mínimo de aproximadamente 1.500 neurônios sensoriais distintos é registrado.

[063] Em uma modalidade adicional, o indicador é selecionado de um corante indicador de cálcio fluorescente, uma proteína indicadora de cálcio, um indicador de cAMP fluorescente, uma proteína repórter mediada por elemento de resposta de cAMP (CRE), um ensaio cAMP HTRF bioquímico, um ensaio de beta-arrestina, ou uma gravação eletrofisiológica. Particularmente, um corante indicador de cálcio é selecionado o qual pode ser usado para monitorar a atividade de receptores olfativos expressos na membrana dos neurônios olfativos (por exemplo, Fura-2 AM).

[064] Em uma modalidade particular, realiza-se triagem dos compostos sequencialmente e as mudanças dependentes de odorizante em fluorescência de corante de cálcio são medidas com o uso de um microscópio fluorescente ou classificador de célula ativado de modo fluorescente (FACS).

[065] Conforme um exemplo, os neurônios olfativos são isolados após triagem com um ou mais compostos de mau odor com o uso tanto de um microeletrodo de vidro anexado a um micromanipulador ou uma máquina de FACS. Mais particularmente, pelo menos 1 neurônio é isolado. Realiza-se triagem nos neurônios sensoriais olfativos de camundongo através de imageamento de Ca2+ de modo similar a procedimentos previamente descritos (Malnic et al.; 1999; Areneda et al., 2004). Particularmente, um estágio de microscópio móvel motorizado é usado para aumentar o número de células que podem passar por triagem para pelo menos 1.500 por experimento. Visto que há aproximadamente 1.200 receptores olfativos diferentes no camundongo e cada neurônio sensorial olfativo expressa apenas 1 ou 2 dentre 1.200 de genes receptores olfativos, essa capacidade de triagem irá abranger virtualmente todo o repertório de receptor de odorizante de camundongo. Em outras palavras, a combinação de imageamento de cálcio para triagem de neurônio sensorial olfativo de alto rendimento leva à identificação de quase todos os receptores de odorizante que respondem a um perfil particular de odorizantes. Em um aspecto particular, odorizantes que respondem tanto a indol como escatol, dois compostos de mau odor de latrina comuns podem ser isolados.

[066] Para imageamento de cálcio de neurônios olfativos, o principal epitélio olfativo pode ser dissecado de um camundongo antes de dissociação neuronal. O epitélio olfativo dissecado pode, então, ser transferido para um tampão de dissociação para dissociação mecânica e enzimática. Os neurônios dissociados podem, então, ser dispersos sobre uma lamínula que permite a triagem de milhares de células por microscopia de fluorescência e as células podem ser carregadas com um corante sensível ao cálcio (Fura-2 AM) por exemplo durante cerca de 30 minutos a 31 °C e transferidas sobre o microscópio pronto para triagem. As células são estimuladas respingando-se soluções diluídas de odorizantes (em solução salina fisiológica) sobre os neurônios olfativos dissociados. As células raras que respondem ao composto de mau odor são identificadas, por exemplo, estimulando- se os receptores com 50 μm dos compostos de mau odor e, então, monitorando-se o fluxo de Ca2+ intracelular indicado por mudanças em fluorescência de Fura-2. Após análise, células de resposta podem ser recuperadas de uma lamínula de vidro com uma micropipeta de sucção. As células isoladas são, então, agrupadas em uma amostra para identificação subsequente dos genes de receptor odorizantes expressos como mRNA nas células de resposta.

[067] Em uma modalidade particular, o mRNA de neurônios olfativos é purificado e amplificado de acordo com o método descrito, em geral, em Marko, N. F., et al., (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi: 10.1186/1471-2164-6-27 (método Eberwine). Pelo menos uma porção do transcriptoma (até e incluindo todo o transcriptoma) é sequenciada com o uso de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) ou hibridizado a genes conhecidos com o uso de tecnologias de Microarranjo. NGS é discutido e descrito, em geral, em Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11(1), 31 a 46; doi: 10.1038/nrg262. Em uma modalidade particular, um mínimo de 5 neurônios que apresentam o mesmo perfil de resposta é agrupado e o mRNA é amplificado por duas rodadas consecutivas de transcrição in vitro (IVT). O mRNA é liberado por lise celular imediatamente após coleta; etapas de DNAse e purificação não são realizadas. A amplificação pode ser realizada de acordo com MesageAmpII aRNA kit (Ambion, AMA1751) com os parâmetros a seguir: duas rodadas de IVT de 14 horas de duração consecutivas.

[068] Em uma modalidade adicional, a identidade de um grupo ou família de gene de receptores olfativos de mau odor é determinada (por exemplo, até tanto quanto o número de neurônios colhidos) comparando-se os resultados do NGS a uma sequência de genoma de referência das mesmas espécies. Particularmente, os receptores de mau odor putativos serão o mRNA mais altamente abundante na amostra de NGS derivada de neurônio olfativo ou presente em mais do que uma réplica biológica independente. Por causa da natureza combinatória do código olfativo (um composto ativa muitos ORs e um OR pode ser ativado por muitos compostos), agrupar diversos neurônios ativados por determinados compostos permite a recuperação de virtualmente todos os receptores responsáveis pela percepção dessas moléculas em um único experimento NGS. Agrupar neurônios funcionalmente similares aperfeiçoa bastante, desse modo, a velocidade e rendimento de desorfanização.

[069] Ferramentas de bioinformática padrão são, então, usadas para identificar receptor(es) odorizante humano mais estritamente relacionado a outro receptor(s) de mau odor de mamífero (não-humano) putativo sob a suposição de que sequências de receptor homólogas retêm função similar. Um estudo demonstrou que ~82% de pares de gene OR ortólogo responderam a um ligante comum, sugerindo que tanto quanto ~18% de pares de gene ortólogo podem responder a um ligante diferente; adicionalmente 33% de pares de gene de OR parálogo responderam a um ligante comum, sugerindo que pelo menos ~67% de pares parálogos podem responder a um ligante diferente [Adipietro et al. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8(7): e1002821. doi: 10.1371/ journal.pgen.1002821]. Parâmetros padrão de algoritmo BLASTP e/ou BLASTN podem ser usados.

[070] O receptor de mau odor de mamífero humano ou não humano pode ser adaptado a um ensaio funcional que pode ser usado para identificar compostos que minimizam, bloqueiam, modulam e/ou intensificam a atividade de um composto de mau odor. Em particular, o ensaio pode ser um ensaio de célula e o método para identificar compostos pode ser um ensaio de triagem de alto rendimento. Mais particularmente, são fornecidos no presente documento ensaios baseados em receptor adaptáveis para triagem de alto rendimento de receptores com bibliotecas de composto para a constatação de compostos de modulação (por exemplo, bloquear, intensificar e mascarar).

[071] Em uma modalidade particular, sequências de gene de receptor de mau odor são identificadas a partir de células sensíveis a indol e escatol conforme a seguir: Os neurônios agrupados são aquecidos a 75 °C durante 10 minutos para romper a membrana celular e tornar o mRNA dos mesmos disponível para amplificação. Essa etapa de amplificação é importante ao aplicar tecnologias NGS com quantidade limitada de material inicial, tipicamente entre 1 a 15 células. Uma amplificação linear, de acordo com o método Eberwine (IVT) garante a conservação dos níveis de transcrição relativos de genes expressos. Duas rodadas consecutivas ao longo da noite (14h) de transcrição in vitro são usadas para proporcionar quantidades suficientes de cRNA; cRNA amplificado é, então, usado para gerar uma biblioteca de Illumina HiSeq cDNA. As sequências curtas resultantes de tipicamente 75 a 150 de pares de base (comumente denominadas "leituras") são alinhadas contra o genoma de referência do camundongo (tal como versão UCSC mm 9 ou mm 10) a fim de construir o transcriptoma completo dessas células. A análise quantitativa dos dados de transcriptoma proporciona uma lista de genes de receptor de odorizante transcritos e os respectivos níveis de expressão dos mesmos. Os genes de receptor de odorizante que mostram os níveis mais abundantes de mRNA ("leituras" mais abundantes) ou estão presentes em mais do que um experimento de réplica são considerados receptores indol e escatol putativos.

[072] Os genes de OR de camundongo previstos são, então, usados para extrair as últimas versões dos bancos de dados tanto do camundongo como genoma humano a fim de identificar os receptores mais estritamente relacionados (isto é, maior similaridade de sequência) em camundongo (genes parálogos) e em humano (genes ortólogos). Esse processo pode ser realizado com o uso do algoritmo de busca BLAST (publicamente disponível no site da web NCBI), uma ferramenta de busca de similaridade de sequência, em que cada sequência de gene putativo previamente obtida a partir da análise de transcriptoma inicial é usada como uma sequência de consulta. Os genes recém-identificados, identificados a partir desse processo de extração de dados também são considerados como receptores de mau odor potenciais sob a suposição de que genes parálogos e ortólogos são altamente prováveis de ter atividades similares.

[073] Em uma modalidade particular, comparação em pares de homologia de sequência é realizada para identificar receptores estritamente relacionados em camundongo e humanos com o uso do esquema iterativo a seguir:

Parálogo = homólogo na mesma espécie Ortólogo = homólogo em outra espécie

[074] Os genes parálogos são, então, alinhados com o uso de uma ferramenta de alinhamento múltiplo a fim de gerar uma árvore filogenética. Dados in vitro funcionais podem ser interpretados à luz de tal relação filogenética entre receptores estritamente relacionados, mas distintos. Essa etapa é essencial na identificação de famílias de gene OR completas que respondem, a graus variáveis, aos compostos de teste, por exemplo, indol e escatol.

[075] Para completar o processo de desorfanização, os genes de OR candidatos são adicionalmente expressos in vitro para confirmação de atividade contra os compostos usados para isolar os neurônios sensoriais olfativos e outros compostos relacionados estruturalmente de interesse. Em uma modalidade, para completar o processo de desorfanização, os genes de OR candidatos são adicionalmente expressos in vitro para confirmação de atividade contra os compostos inicialmente usados para isolar os ditos neurônios sensoriais olfativos. Os mesmos genes de OR candidatos expressos in vitro são adicionalmente submetidos à triagem com outros compostos relacionados estruturalmente de interesse para identificar, por exemplo, ativadores, inibidores ou moduladores do receptor.

[076] Com o uso do processo e método descritos no presente documento, os receptores a seguir foram identificados diretamente sequenciando-se (NGS) o transcriptoma de neurônios olfativos que respondem a maus odores de indol e escatol (ORs de camundongo). Receptores de indol e escatol humanos com o maior grau de identidade de aminoácido para os ORs de camundongo foram identificados subsequentemente buscando-se bancos de dados de genoma disponíveis (Tabela 1). Receptor de Camundongo Olfr740 e 01fr665 foram inicialmente identificados através do método de NGS descrito no presente documento após isolar ou “coletar” células de resposta após exposição tanto a indol como escatol. Os receptores homólogos humanos correspondentes, OR11G2 e OR52N2 respectivamente, foram identificados adicionalmente por comparações de similaridade de sequência de aminoácido. Conforme demonstrado nos exemplos 4 e 5, os receptores de camundongo candidato Olfr740 e 01fr665 e os correspondentes humanos dos mesmos OR11G2 e OR52N2 foram ativados in vitro por indol e por escatol e são descritos, desse modo, como receptores de indol e/ou escatol. De modo similar, os receptores de camundongo candidato Olfr 746, 0lfr745, Olfr207, 01frl211 e 0lfr257 levaram à identificação dos receptores humanos OR11H4, OR11H6, OR5AC2, OR4C15 e OR8S1, respectivamente, seguindo as mesmas etapas. Esses genes de OR de humano também responderam a ambos indol e escatol in vitro. Juntos, sete de sete receptores humanos putativos testados identificados pelo método descrito no presente documento foram confirmados como receptores de indol e escatol que sustenta adicionalmente o método para identificação de receptor indol e escatol humano eficiente.

[077] Essa abordagem para desorfanização de receptor de odorizante tem diversas vantagens principais sobre métodos de RT-PCR de célula única previamente estabelecidos. Primeiro, agrupando-se múltiplos neurônios que compartilham propriedades de ligação similares a odores e/ou aromas, um experimento de sequenciamento de mRNA único (NGS) identifica virtualmente todos os receptores que são ativados pelos compostos de mau odor alvos. Portanto, o rendimento é maior do que o que foi previamente alcançado. Segundo, visto que múltiplas células são agrupadas em uma amostra, múltiplos ORs para um composto particular são constatados em um único experimento. Em uma modalidade particular, a seleção de genes através de uma comparação compreensiva de amostras de réplica através de experimentos. Terceiro, NGS não exige o uso de iniciadores de PCR específicos a um OR. NGS também não exige o uso de iniciadores de degeneração específicos a ORs, que são problemáticos e frequentemente levam a falsos positivos devido à amplificação de PCR não linear ou não específico. Em particular, visto que sequências de codificação de OR estão dentro de um único exão, contaminação de amostra com DNA genômico pode facilmente levar a uma amplificação específica de sequências de gene OR. Quarto, a análise de RT-PCR é difícil de realizar em amostras agrupadas por causa da taxa positiva falsa inerente. Experimentos de hibridização de mRNA de célula única têm sido realizados com o uso de chips de microarranjo de DNA de alta densidade. Entretanto, essa abordagem é geralmente menos sensível do que NGS e é adicionalmente restrita a genes conhecidos para os quais sondas de DNA correspondentes precisam ser sintetizadas. Portanto, o uso de NGS é significativamente vantajoso para identificar rapidamente OR e, por fim, resulta em uma seleção mais precisa de receptores de candidato quando comparado a abordagens padrão (por exemplo, RT-PCR e microarranjo).

[078] Em uma modalidade adicional, receptores de camundongo identificados de neurônios olfativos isolados que respondem tanto a indol e escatol são modificados na terminação N dos mesmos com uma sequência curta de polipeptídio (por exemplo, receptor de rodopsina bovino - Rho, ou Flag), expressa de modo transiente em células HEK 293T, e estimulados separadamente com indol e escatol para confirmar a identidade dos mesmos como receptores indol/escatol genuínos. Coexpressão da subunidade alfa G humana Ga0if (SEQ ID NO: 21) ativa a trajetória de transdução de Gs que leva a um aumento de cAMP interno mediante ligação ao ligante apropriado. Os resultados confirmam a identidade de Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), 01fr743 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6), e 01fr746 (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38) como receptores de indol-escatol.

[079] Em outro aspecto, receptor humano OR52N2 (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12) foi identificado por causa da similaridade de sequência do mesmo a 01fr665 de camundongo (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10), um receptor de indol/escatol isolado de neurônios olfativos que responde tanto a indol como escatol (Exemplo 6). O receptor humano OR11G2 (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14) foi identificado por causa da similaridade de sequência do mesmo a Olfr740 de camundongo (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), um receptor indol/escatol isolado de neurônios olfativos que responde tanto a indol e escatol (Exemplo 6). Receptor humano OR5AC2 (SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 76) foi identificado por causa da similaridade de sequência do mesmo a Olfr207 de camundongo (SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78), um receptor de indol/escatol isolado de neurônios olfativos que responde tanto a indol como escatol (Exemplo 6). Receptor humano OR4C15 (SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80) foi identificado por causa da similaridade de sequência do mesmo a 01frl211 de camundongo (SEQ ID NO: 81 e SEQ ID NO: 82), um receptor de indol/escatol isolado de neurônios olfativos que responde tanto a indol e escatol (Exemplo 6). Receptor humano OR8S1 (SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO: 84) foi identificado por causa da similaridade de sequência a 01fr257 de camundongo (SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 86), um receptor de indol/escatol isolado de neurônios olfativos que responde tanto a indol e escatol (Exemplo 6). Receptor de camundongo 01fr665 (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10) foi identificado diretamente de dados de NGS de neurônios olfativos isolado que responde tanto a indol como escatol (Exemplo 6). Receptor de camundongo Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) foi identificado diretamente de dados de NGS de neurônios olfativos isolado que responde tanto a indol e escatol (Exemplo 6). Receptor de camundongo 01fr736 (SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28) foi identificado por causa da similaridade de sequência do mesmo a Olfr740 de camundongo (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), um receptor de indol/escatol isolado de neurônios olfativos e que fracassou em responder a indol ou escatol provavelmente por causa de falta de expressão de superfície celular. Receptor de camundongo 01fr747 (SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40) e 01fr748 (SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42) também foram identificados por causa da similaridade de sequência dos mesmos a Olfr740 de camundongo (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) e fracassaram excepcionalmente em responder a indol ou escatol apesar de expressão de superfície celular apropriada conforme avaliado por ensaios de imunocoloração. Isso enfatiza a natureza diversificada dos receptores olfativos em que sequências altamente similares nem sempre compartilham o mesmo perfil de resposta.

[080] Os receptores são modificados com a sequência de Rho e expressos de modo estável em células HEK 293T. Coexpressão da subunidade alpha G humana Gα15 ativa a trajetória de transdução Gq que leva a um aumento de Ca2+ interno mediante ligação ao ligante apropriado.

[081] O processo acima e os resultados obtidos até então servem para validar o processo para identificação rápida e confiável de receptores odorizantes de mamífero para compostos de mau odor.

[082] Fornecida de modo ainda adicional é uma célula que é modificada de modo recombinante para expressar um polipeptídio descrito acima.

[083] Adicionalmente fornecidos são ensaios para identificar compostos que ligam a receptores de odorizante de indol e/ou escatol. Em particular, é fornecido no presente documento um método para identificar um composto que bloqueia, inibe, modula e/ou intensifica a atividade de um receptor olfativo que é ativado por um composto selecionado do grupo que consiste em indol e escatol que compreende

[084] a) colocar o receptor, ou uma quimera ou fragmento do mesmo em contato com um composto;

[085] b) ensaiar se o composto tem um efeito na atividade do receptor; em que o receptor é um polipeptídio descrito acima.

[086] Em uma modalidade, a atividade do composto é determinada comparando-se a ligação do mesmo com aquela de indol e/ou escatol. Em outra modalidade, o receptor ou uma quimera ou fragmento do mesmo entra em contato com um composto na presença de escatol e/ou indol sob condições que permitem a ligação do composto junto com escatol e/ou indol ao receptor.

[087] Em uma modalidade adicional, um composto entra em contato com um receptor, ou uma quimera ou fragmento do mesmo que é ativado por um composto selecionado a partir do grupo que consiste em indol e escatol em que o receptor, ou uma quimera ou fragmento do mesmo é expresso em uma célula que é modificada de modo recombinante para expressar o polipeptídio.

[088] A atividade do composto pode ser determinada com o uso de sistemas de triagem sintética, in vivo, ex vivo e in vitro que tipicamente permitem triagem de grandes bibliotecas de compostos contendo tanto quanto 10.000s de compostos ou misturas de compostos

[089] Em outra modalidade, o contato é realizado com membranas germinativas induzidas por vírus ou lipossomas contendo os polipeptídios descritos no presente documento.

[090] Em outra modalidade, os métodos para identificar compostos que ligam aos receptores que ligam a escatol e/ou indol, podem ser realizados em uma fração de membrana de células que expressa os polipeptídios descritos no presente documento.

[091] Os exemplos a seguir são ilustrativos apenas e não são destinados a limitar o escopo da invenção conforme estabelecido no Sumário, Descrição ou nas Reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 TRIAGEM DE NEURÔNIOS SENSORIAIS OLFATIVOS DE CAMUNDONGO PARA IDENTIFICAR RECEPTORES QUE LIGAM INDOL E/OU ESCATOL

[092] O epitélio olfativo contendo neurônios olfativos nativos de um camundongo foi isolado e dissociado em single células e, então, transferidos para um tampão de dissociação para uma dissociação mecânica e enzimática gentil. A fim de otimizar o protocolo de dissociação, o procedimento geral para realizar tampão de dissociação fresco buffer foi seguido conforme estabelecido em Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756 com as modificações a seguir: DNAse I em vez de DNAse II, concentração de Ca2+ elevada para 5 mM e pH ajustado para 7,35 a 32°. Os neurônios dissociados foram, então, espalhados em uma lamínula permitindo a triagem de >2.500 células por microscopia de fluorescência. As células foram, então, carregadas com um corante sensível a cálcio (Fura-2 AM) durante 30 minutos a 31 °C e transferidas sobre um microscópio pronto para triagem. Os neurônios olfativos dissociados foram submetidos à triagem conforme previamente descritos (Malnic et al; 1999; Araneda et al., 2004), mas com um estágio de microscópio móvel motorizado para aumentar o número de células que podem ser submetidas à triagem. As células foram, então, estimuladas respingando-se soluções diluídas de odorizantes (em solução salina fisiológica) sobre os neurônios olfativos dissociados.

[093] Neurônios olfativos que responderam a indol e escatol foram identificados estimulando-se receptores com 50 μm de indol seguido de 50 μm de escatol e monitorando o fluxo de Ca2+ intracelular indicado por mudanças em fluorescência de Fura-2. A Figura 2 exibe traços de imageamento de Ca2+ para 6 neurônios sensoriais olfativos independentes especificamente ativados tanto por indol como escatol (50 μM cada). Todas as células também foram estimuladas com 20 μM forskolin (garfo), um ativador farmacológico da enzima adenilato ciclase ACIII, para confirmar viabilidade e identidade neuronal das células. Unidades em escala de tempo no eixo geométrico X, 6 segundos de quadro. Intensidade de Fluorescência Média, unidade fluorescente relativa como resultado de gravações de 340/380 nm raciométrico.

EXEMPLO 2 ISOLAMENTO E AMPLIFICAÇÃO DE mRNA DE CÉLULAS SENSÍVEIS A INDOL E ESCATOL PARA GERAR SEQUÊNCIAS DE cDNA DO GENE DE "RECEPTOR DE MAU ODOR" PARA OS RECEPTORES SENSÍVEIS A INDOL E ESCATOL

[094] Os neurônios sensoriais olfativos ativados do Exemplo 1 foram isolados com o uso de uma micropipeta de sucção de vidro e, então, agrupados em uma amostra para identificação subsequente dos genes de receptor de odorizante expressos como mRNA nas células de resposta. As sequências de gene de receptor de mau odor foram identificadas a partir de células sensíveis a indol e escatol conforme a seguir: Quatro conjuntos de mais do que cinco (5) neurônios olfativos (6, 10, 15, e 15 células cada) ativados por um ou mais compostos de mau odor foram isolados com o uso de um micro eletrodo de vidro anexado a um micromanipulador. Micropipetas foram construídas de vidro de Borossilicato (Item # B 150-86-10, Sutter Instruments) e puxadas com o uso de um puxador de micro eletrodo (Model P-1000, Sutter Instruments) sob as condições a seguir: Calor, temp de elevação + 20 °C; Puxamento = 0; Vel = 120; Pressão = 500. As pontas de pipeta puxadas foram quebradas manualmente e presas sobre um micromanipulador Newport (modelo MW3R) para isolar neurônios sensoriais olfativos ativados por indol e escatol conforme determinado em um ensaio de imageamento de cálcio. OSNs ativados foram isolados por sucção gentil aplicada à extremidade posterior da micropipeta.

[095] O mRNA de neurônios foi purificado e amplificado de acordo com o método Eberwine (MessageAmp II aRNA kit - Ambion, AM1751). Os neurônios agrupados foram aquecidos a 75 °C durante 10 minutos em Tampão de Resuspensão (Superscript III Cells Direct cDNA system, 46-6321-Invitrogen) para romper a membrana celular e tornar o mRNA dos mesmos disponível para amplificação. Uma amplificação linear, de acordo com o método Eberwine, (transcrição in vitro) garante a conservação dos níveis de transcrição relativos de genes expressos. cDNA de primeiro filamento foi obtido de acordo com o kit Ambion com uma incubação durante 2 h a 42 °C. Síntese de cDNA de segundo filamento foi realizada com o uso do mesmo kit após uma segunda incubação durante 2h a 16 °C. cDNA de duplo filamento foi usado como um modelo para gerar o cRNA correspondente (14h de incubação a 37 °C), que é, então, purificado. Essas etapas de síntese de cRNA foram repetidas por um segundo IVT. As duas rodadas consecutivas ao longo da noite (14h) de transcrição in vitro proporcionaram quantidades suficientes de cRNA; cRNA amplificado foi, então, usado para gerar uma biblioteca de Illumina HiSeq cDNA. A sequência de todo o transcriptoma foi, então, obtida por Sequenciamento de Nova Geração (NGS).

[096] A identidade do mau odor de camundongo, especificamente receptores olfativos indol e/ou escatol, foi determinada comparando-se os resultados de NGS com uma sequência de genoma de referência da mesma espécie. Para isso, as sequências curtas resultantes de 150 pares de base (comumente denominadas leituras) derivadas de NGS foram alinhadas contra o genoma de referência do camundongo (versão UCSC mm 9 ou mm 10) a fim de construir o transcriptoma completo dessas células. Análise quantitativa dos dados de transcriptoma proporcionou uma lista de genes de receptor de odorizante transcritos e os respectivos níveis de expressão dos mesmos. Os genes de receptor de odorizante que mostraram níveis abundantes de mRNA (leituras abundantes) ou foram presentes em mais do que um experimento de réplica foram considerados receptores de indol e escatol de candidato e são estabelecidos na Figura 3, que resume resultados de NGS representativos de 4 experimentos de coleta de célula de escatol/indol independentes. As barras representam genes de OR de indol/escatol de candidato com os mRNAs mais abundantes que foram retidos após inspeção visual. O eixo geométrico Y representa os níveis de abundância de mRNA normalizados para o nível de OMP mRNA, em relação ao número de OSNs colhidos por amostra. Asterisco (*), receptores identificados em mais do que um experimento. OMP (Proteína de Marcador Olfativo) é um biomarcador específico para neurônios olfativos maduros. Acoplando-se imageamento de cálcio e NGS conforme descrito acima, as 5 sequências de receptor a seguir foram identificadas como ORs de indol e escatol de camundongo putativos: 01fr665 (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10), Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), 01fr741 (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4), 01fr743 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6), e 01fr745 (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

EXEMPLO 3 IDENTIFICAÇÃO DOS RECEPTORES DE MAU ODOR DE CAMUNDONGO E HUMANO

[097] A identificação de um subconjunto de 5 ORs de indol e escatol de camundongo entre ~1.200 ORs no genoma de camundongo acoplando-se imageamento de cálcio e NGS (Exemplos 1-2) possibilitou a rápida identificação de ORs de indol e escatol de humano novos e de camundongo adicionais por métodos em silico. Visto que ORs com identidade de aminoácido geral similar são prováveis de exibir perfis de resposta de odorizante similares [Adipietro et al. (2012)], uma lista de ORs de indol e escatol de candidatos foi expandida consultando-se bancos de dados públicos de genoma de camundongo e humano com as sequências de OR de camundongo derivadas de análise de NGS de neurônios sensoriais olfativos sensíveis a indol/escatol isolados por imageamento de cálcio. A identidade dos receptores olfativo de mau odor de camundongo foi determinada comparando-se os resultados do NGS com uma sequência de genoma de referência da mesma espécie. Os receptores de mau odor putativos serão o mRNA mais altamente abundante na amostra de NGS derivada de neurônio olfativo ou presente em mais do que uma réplica biológica independente, mas não em uma amostra de controle que carece neurônios olfativos que respondem ao mau odor(s). Ferramentas de bioinformática padrão foram usadas para identificar o receptor(s) odorizante humano mais estritamente relacionado ao receptor(s) de mau odor de mamífero (não humano) putativo sob a suposição de que receptores de sequência homóloga retêm função similar (Adipietro et al. (2012)). Parâmetros padrão de algoritmo BLASTP e/ou BLASTN foram usados. A Tabela 1 lista os receptores de odorizante de camundongo identificados (OR) e os ortólogos humanos previstos. TABELA 1

[001] As sequências de proteína humana relacionadas estão dentro de pelo menos 60% de identidade de sequência com as sequências de OR de camundongo identificadas por NGS listadas na Tabela 1. Os níveis de identidade são dados com relação à sequência de aminoácidos em comparação emparelhada após algoritmo BLASTP. Vinte e seis (26) novos ORs de humano e camundongo foram identificados através de pesquisas BLASTP de banco de dados de genoma públicos (parâmetros padrão). Dezesseis (16) estavam relacionados de modo próximo aos genes Olfr740 derivados de NGS (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), 741 (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4), 743 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6), 745 (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8) e definem a família 740. Dez (10) estavam relacionados de modo próximo ao receptor Olfr665 derivado de NGS (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10) e definem a família Olfr665. A Figura 4 representa as relações filogenéticas de genes de OR de indol e escatol do candidato camundongo e as previsões de ortólogos humanos dos mesmos que pertencem às famílias de receptor Olfr740 (Figura 4A) e Olfr665 (Figura 4B). As relações foram obtidas pela reconstrução de arvore filogenética por agrupamento de vizinhos com base em sequência de proteína. Ortólogos de humano correspondentes são indicados por setas. Nomes de gene de OR humano observados como pseudogenes são marcados com um 'P'. Pseudogenes são, provavelmente, não funcionais. OR11H7P é um pseudogene de segregação (SP) com alelos funcionais conhecidos. Diamantes (0) designam receptores inicialmente identificados por NGS. Para determinar as identidades de aminoácido para ORs de indol e escatol de candidato camundongo adicionais, as sequências de proteína completas foram manualmente alinhadas com base em motivos de aminoácido altamente conservados por todo o repertório de OR (Ferramenta de alinhamento de sequência Bioedit, versão 7.0.5.3). A Tabela 2 exibe as identidades de aminoácido em pares para a família Olfr740 de camundongo e os ortólogos humanos previstos das mesmas. A Tabela 3 exibe as identidades de aminoácido em pares para a família Olfr665 de camundongo e ortólogos humanos previstos das mesmas. TABELA 2 ORTÓLOGOS HUMANOS E FAMÍLIA 740 DE CAMUNDONGO

TABELA 3 ORTÓLOGOS HUMANOS E FAMÍLIA OLFR665 DE CAMUNDONGO

EXEMPLO 4 ATIVIDADE DE INDOL E ESCATOL DE ORS DE CAMUNDONGO OLFR743, OLFR746 E OLFR740 EM CÉLULAS HEK293T.

[002] A atividade dos receptores de candidato camundongo Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), Olfr743 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) e Olfr746 (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38) aos maus odores de escatol e indol foi confirmada em ensaios cAMP com base em célula. Na figura 5 A e 5B, sequências de cDNA (SEQ ID 18) Olfr743 (SEQ ID NO: 6) e Olfr740 (SEQ ID NO: 2) etiquetados com FLAG Rho foram cotransfectadas com Gaαolf (SEQ ID NO: 21) e expostas a concentrações crescentes de indol (esquerda) ou escatol (direita). As Figuras 5C e 5D são experimentos de repetição que mostram atividade similar de Olfr740 (SEQ ID NO: 2) com Olfr743 (SEQ ID NO: 6) com indol e escatol. Na figura 5E, a sequência de cDNA (SEQ ID 18) Olfr746 (SEQ ID NO: 38) etiquetada com FLAG Rho foi cotransfectada com Gaαolf (SEQ ID NO: 21) e exposta a concentrações crescentes de indol ou escatol. Atividade induzida por odorizante foi detectada ao medir níveis de cAMP no citosol pelo uso da abordagem HTRF (Kit CisBio). Um aumento dependente de dose de atividade de receptor é mostrado para todos os três receptores para ambas as moléculas. A cotransfecção das células HEK com Gaαolf (SEQ ID NO: 21) apenas (nenhum receptor) foi usada como controle para atividade não específica (controle). A atividade é definida como as razões de HTRF corrigidas na linha de base normalizadas para o sinal mais alto no experimento. Os resultados são exibidos na figura 5. Todos os três receptores mostram atividade dependente de dose específica para os compostos de mau odor e, desse modo, validam o processo para identificar receptores para esses compostos. Receptores de camundongo Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) e Olfr743 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) foram identificados a partir de neurônios olfativos isolados que responderam a indol e escatol. O receptor de camundongo Olfr746 (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38) foi identificado em silício através de extração de banco de dados pelo uso de Olfr740 (SEQ ID NO: 2) e Olfr743 (SEQ ID NO: 6) como sequências de pesquisa. Os receptores são modificados na terminação N dos mesmos com a etiqueta FLAG e os primeiros 20 aminoácidos do receptor de rodopsina bovina (SEQ ID 18), expressos de modo transitório em células HEK 293T e estimulados separadamente com indol e escatol para confirmar a identidade dos mesmos como receptores de indol/escatol confiáveis. A coexpressão do Gaαolf de subunidade alfa G humano (SEQ ID NO: 21) ativa a trajetória de transdução de Gs que conduz a um aumento de cAMP interno ligando-se ao ligante apropriado. Os resultados confirmam a identidade de Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), Olfr743 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) e Olfr746 (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38) como receptores de indol e escatol.

EXEMPLO 5 A ATIVIDADE DE INDOL E ESCATOL DE OR52N2, OR11G2, OR5AC2, OR4C15, OR8S1, OR11H6 E OR11H4 HUMANOS E OLFR665 E OLFR740 DE CAMUNDONGO EM CÉLULAS HEK293T.

[003] A atividade de receptores de maus odores de escatol e indol de candidato humano OR52N2 (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12), OR11G2 (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, OR5AC2 (SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 76), OR4C15 (SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80), OR8S1 (SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO: 84), OR11H6 (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16) e OR11H4 (SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50) e receptores de maus odores de escatol e indol de candidato camundongo Olfr665 (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO 10) e Olfr740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO 2) foi confirmada em ensaios de cálcio e fluxo com base em célula (Figura 6). As células que expressam de modo estável OR52N2 (Figura 6A, B) ou OR11G2 (Figura 6C) humanos etiquetados com Rho e Gα15 (SEQ ID NO: 25) foram expostas a concentrações crescentes de escatol ou indol. A Figura 6B é um experimento de repetição que mostra atividade similar de OR52N2 com indol e escatol. Atividade de OR52N2 ou OR11G2 induzida por odorizante foi detectada ao medir a mudança máxima de fluorescência (Dispositivos Moleculares) de corante 5 de Cálcio que segue à exposição ao odorizante. A atividade é definida como as razões de Unidades Fluorescentes Relativas (RFU) corrigidas na linha de base normalizadas para a RFU mais alta no experimento na Figura 6A. A Unidade Fluorescente Relativa é usada para medir a atividade de receptor nas Figuras 6B a J. Um aumento dependente de dose de atividade de receptor foi registrado, e uma curva de resposta à dose correspondente é mostrada para ambos os compostos. Uma linha de célula sem um receptor, por exemplo hOR52N2, foi usada como um controle para atividade não específica em concentrações altas (”controle de indol” e “controle de escatol”). O receptor humano OR52N2 (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12) foi identificado devido à similaridade de sequência do mesmo a do camundongo Olfr665 (SEQ ID NO: 10), um receptor de indol e escatol isolado dos neurônios olfativos que respondem a indol e escatol. O receptor humano OR11G2 (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14) foi identificado devido à similaridade de sequência do mesmo com a do camundongo Olfr740 (SEQ ID NO: 2), um receptor de indol e escatol isolado dos neurônios olfativos que respondem a indol e escatol. Os receptores foram modificados com a sequência de Rho e expressos de modo estável em células HEK 293T. Exemplos adicionais mostram curvas de resposta a dose de indol e escatol para receptores humanos OR5AC2, OR4C15, OR8S1, OR11H6, OR11H4 e receptores de camundongo 01&665 e Olfr740 (Figura 6D a J). O receptor humano OR5AC2 (SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 76) foi identificado devido à similaridade de sequência do mesmo com a do camundongo Olfr207 (SEQ ID NO: 78), um receptor isolado dos neurônios olfativos que responde a indol e escatol. O receptor humano OR4C15 (SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80) foi identificado devido à similaridade de sequência a do camundongo Olfrl211 (SEQ ID NO: 82), um receptor isolado dos neurônios olfativos que responde a indol e escatol. O receptor humano OR8S1 (SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO: 84) foi identificado devido à similaridade de sequência do mesmo com a do camundongo Olfr257 (SEQ ID NO: 86), um receptor isolado dos neurônios olfativos que responde a indol e escatol. O receptor humano OR11H6 (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16) foi identificado devido à similaridade de sequência do mesmo a do camundongo Olfr745 (SEQ ID NO: 8), um receptor isolado dos neurônios olfativos que responde a indol e escatol. O receptor humano OR11H4 (SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50) foi identificado devido à similaridade de sequência do mesmo a do camundongo Olfr746 (SEQ ID NO: 38), um receptor isolado dos neurônios olfativos que responde a indol e escatol. O receptor de camundongo 01&665 (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10) foi identificado diretamente a partir de dados do NGS dos neurônios olfativos isolados que respondem a indol e escatol. O receptor de camundongo O1&740 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) foi identificado diretamente a partir de dados do NGS dos neurônios olfativos isolados que respondem a indol e escatol. A coexpressão do Gα15 de subunidade alfa G humano ativa a trajetória de transdução de Gq que conduz a um aumento interno de Ca2+ ligando-se ao ligante apropriado. Esses resultados servem para validar que o processo resultado no presente documento é útil para a identificação rápida e confiável de receptores de odorizante de mamífero para compostos de mau odor.

EXEMPLO 6 INIBIÇÃO DE ATIVIDADE DE RECEPTOR DE INDOL OLFR743 EM CÉLULAS HEK293T.

[004] Uma vez identificadas pelo uso do procedimento descrito no presente documento, as linhas de célula de receptor de mau odor resultantes podem ser usadas para fazer a triagem de bibliotecas químicas por compostos que modulam a atividade das mesmas e possivelmente a percepção humana. Esse experimento foi realizado nas mesmas condições que no Exemplo 4. As células transfectadas com Olfr743 (SEQ ID NO: 18) etiquetado com Rho (SEQ ID NO: 6) foram expostas a concentrações crescentes de indol na presença ou ausência de 300 μM 2- actetonaftona. 2-acetonaftona inibe a atividade de Olfr743 (SEQ ID NO: 6) para indol. Os resultados são apresentados na Tabela 4 e na Figura 7. Na presença do composto antagonista, um deslocamento para a direita na curva de resposta à dose é observada e resulta em um crescimento de 4 vezes no EC50 para indol. A atividade é definida como as razões de HTRF corrigidas na linha de base normalizadas para o sinal mais alto no experimento. Esses resultados mostram que 2-acetonaftona liga e inibe a atividade do receptor de indol. TABELA 4

Claims (3)

1. Método para identificar um composto que bloqueia, inibe, modula e/ou intensifica a atividade de um receptor olfativo selecionado do grupo que consiste em receptores de odorizante ou aroma que é ativado por um composto selecionado do grupo que consiste em indol e escatol caracterizado por compreender: a) colocar o receptor em contato com um composto, em que o receptor é um polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2; b) medir a extensão na qual o composto bloqueia, inibe, modula ou intensifica a atividades do receptor; e c) identificar um compoto que bloqueia, inibe, modula ou intensifica a resposta do receptor olfativo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender utilizar uma célula que é modificada recombinantemente para expressar um polipeptídeo como definido acima.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita célula é selecionada do grupo consistindo de HEK293, CHO, oócitos de Xenopus, COS, levedura, bactérias e células derivadas do placódio olfativo.

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