BR112020003239A2 - método para identificar moduladores alostéricos positivos para receptores odorantes - Google Patents

Abstract

Os vários aspectos aqui apresentados referem-se à indústria de perfumaria. Mais particularmente, os vários aspectos aqui apresentados referem-se a ensaios e métodos para triagem e identificação de composições e / ou ingredientes que intensificam a percepção de um sujeito dos compostos odorantes alvo com base no uso de receptores olfativos específicos ativados pelo composto odorante alvo.

Description

“MÉTODO PARA IDENTIFICAR MODULADORES ALOSTÉRICOS POSITIVOS PARA RECEPTORES ODORANTES”

[001] O presente pedido reivindica a prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios nos U.S. 62/609.004 e 62/609.017, depositados em 21 de dezembro de 2017, Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/781.796, depositado em 19 de dezembro de 2018 e Pedidos de Patente Europeias n o 18157690.1, depositado em 20 de fevereiro de 2018 e no 18166887.2, depositado em 11 de abril de 2018, cujos conteúdos são incorporados em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] O campo técnico é dirigido aos receptores de odorante e aromas e ensaios que podem ser usados para identificar compostos odorantes e/ou aroma e, mais especificamente, moduladores positivos da atividade de receptor de odorante humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O olfato é um dos mais complexos e menos entendidos dos sistemas sensoriais humanos. Da ativação de receptor olfativo (OR) a percepção, há muitas etapas que ainda necessitam de investigação adicional. Se há a possibilidade de entender como o código de OR para odorantes individuais e misturas se traduzem em percepção, então, esse conhecimento pode ser explorado para trazer benefício significativo em diversas áreas. Essas áreas incluem moduladores de odores, tais como neutralizantes de mau odor, que bloqueiam a percepção de odores desagradáveis, novos ingredientes de sabores e fragrâncias que substituem compostos tóxicos ou não biodegradáveis e intensificadores de odores que limitariam nossa dependência de compostos difíceis de obter de fontes naturais ou que melhorariam a sensibilidade a certos ingredientes da fragrância. O paradigma combinatório de ‘código receptor olfativo’ é centralizado na observação de que qualquer OR único pode ser ativado por múltiplos odorantes, e de modo contrário, a maioria dos odorantes têm capacidade para ativar diversos ORs. No genoma do camundongo existem aproximadamente 1.200 ORs intactos distintos. Os seres humanos, por outro lado, têm aproximadamente 400. Em ambos os casos, o repertório de ORs é ativado por muitos milhares de odorantes no mundo, e é esta complexidade combinatória que permite a amplitude de sensações olfativas que podem ser percebidas. No entanto, odores ou ligantes para apenas 48 ORs humanas (aproximadamente 12%) foram identificados a partir de 2016 com o uso de métodos tradicionais de desorfanização [Teixeira CSS et al., Chemical Senses, 41 (2): 105 a 21 (2016)]. Além disso, a relevância fisiológica da maioria dos ligantes para os ORs humanos, essencialmente identificados in vitro, não foi testada.

[004] Um método que pode identificar rapidamente e confiavelmente um subconjunto relativamente pequeno de ORs, no repertório inteiro de ORs que existe em um organismo que é especificamente ativado ou inibido por um ou mais odorantes é descrito no documento nº WO2014/210585.

[005] Como os ORs são codificados pela maior família de genes dos vertebrados, ou seja, sete receptores acoplados à proteína G de Classe A transmembranares (GPCRs), é difícil a identificação de receptores que são elementares a uma dada percepção.

[006] Permanece a necessidade de identificar receptores de ORs que sejam ativados por determinados odorantes e/ou compostos de aroma. Uma vez que é identificado que um ou mais ORs são ativados por um odorante particular e/ou composto de aromas ou grupo de tais compostos, permanece uma necessidade de identificar receptores de odorante relevantes que possam ser usados em ensaios e métodos para identificar e caracterizar farmacologicamente moduladores voláteis de atividade de OR tais como moduladores alostéricos. Essa modulação alostérica de uma atividade do receptor de odorante era, na melhor das hipóteses, especulativa e iludia o campo da olfação.

[007] Assim, são desejados métodos para identificar receptores e compostos relevantes que possam ser usados em perfumaria ou outras aplicações para modular, melhorar ou intensificar (com o uso de moduladores alostéricos positivos) as fragrâncias ou aromas desejados, que podem levar a uma percepção mais sensível e mais intensa de perfumaria ou tonalidades de aromas ou inibir ou neutralizar (com o uso de moduladores alostéricos negativos ou antagonistas competitivos) cheiros ou compostos indesejados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Um aspecto apresentado no presente documento fornece um sistema de ensaio de alto rendimento para identificar um ou mais compostos de um grupo de compostos em que o um ou mais compostos modula positivamente a atividade de um receptor olfativo induzida por um composto odorante agonista, que compreende: a. uma ou mais células isoladas, sendo que cada célula expressa um receptor olfativo de mamífero, em que a uma ou mais células compreendem um receptor olfativo alvo que é ativado por um ou mais odorantes, b. um primeiro composto que se liga ao receptor olfativo e ativa o receptor olfativo, e c. pelo menos um segundo composto que se liga ao receptor de forma não competitiva em relação ao primeiro composto e que aumenta a atividade do receptor exposto ao primeiro composto quando comparado à atividade do receptor exposto ao primeiro composto na ausência de o segundo composto, em que o primeiro composto é um composto odorante agonista do receptor olfativo, em que o primeiro composto e o segundo composto são compostos diferentes, em que o segundo composto não é um agonista do receptor, e em que a atividade do receptor é intensificada sinergicamente pela combinação do primeiro composto e do segundo composto.

[009] Em um aspecto, o pelo menos um segundo composto é selecionado de um conjunto de compostos com base em análise de relação estrutura- atividade (SAR).

[0010] Em um aspecto, o segundo composto se liga a um sítio no receptor olfativo distinto do sítio em que o primeiro composto se liga.

[0011] Num aspecto, o segundo composto é um composto modulador alostérico positivo.

[0012] Em um aspecto do ensaio ou dos métodos descritos no presente documento, o receptor olfativo é selecionado do grupo que consiste em OR5AN1, Olfr1440, OR10J5 ou Olfr16.

[0013] Em um aspecto do ensaio ou dos métodos descritos no presente documento, pelo menos um dos receptores olfativos compreende um polipeptídeo d. compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8; e/ou e. é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

[0014] Em um aspecto, o pelo menos um dos receptores olfativos compreende um polipeptídeo f. compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8; e/ou g. é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

[0015] Em um aspecto do ensaio ou métodos, o primeiro composto é um composto de almíscar ou muguet floral.

[0016] Em um aspecto, o receptor olfativo de mamífero é um receptor olfativo de camundongo ou um receptor olfativo humano.

[0017] Em um aspecto, o primeiro composto compreende um composto de almíscar e o receptor olfativo é OR5AN1 ou Olfr1440; quimera e fragmentos funcionais da mesma; e em que o receptor olfativo compreende um polipeptídeo que h. compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 6; e/ou i. é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 5, ou o complemento inverso do mesmo. Em um aspecto, o composto de almíscar compreende uma cetona macrocíclica ou um composto nitro-almíscar.

[0018] Em um aspecto, o receptor é OR5AN1, o composto odorante agonista compreende uma cetona macrocíclica ou um composto nitro-almíscar; e o composto selecionado compreende pelo menos um modulador alostérico positivo que tem a estrutura: Fórmula (I) na forma de qualquer um de seus estereoisômeros ou uma mistura dos mesmos; em que R representa um grupo alquil C3-11 linear opcionalmente substituído por um grupo alquil C1-4 carboxiléster ou um grupo hidroxil, um grupo alquil C4-11 ramificado opcionalmente substituído por um grupo alcóxi C1-3 , um grupo alcenil ou alcadienil C6- 12 linear ou ramificado, um grupo fenil substituído por um ou dois grupos alquil C 1-3, um grupo alcenil C5-8 alicíclico ou um grupo benziloximetil , e em que o composto de Fórmula (I) é um modulador alostérico positivo de um receptor olfativo de almíscar.

[0019] Em outro aspecto, o composto de Fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em: (E,E)-2,4-decadienal, (E)-2-undecenal, (E,E)-2,4-nonadienal, (E)-2-tridecenal, (2E)-2-dodecenal, (2E,6Z)-2,6-nonadienal, (E,E)-2,6- nonadienal, (2E)-2,4-undecadienal, (2E)-2,4-dodecadienal, (E)-2-nonenal, (2E,4E,7Z)-decatrienal, (Z)-2-decenal, (E)-2-octenal, (E)-2-decenal, (Z)-4- (benziloxi)but-2-enal, (E)-4-(benziloxi)but-2-enal, (E)-4-ciclohexilidenebut-2- enal, (2E)-3-(4-metilfenil)-2-propenal, (2E,5E)-6,10-dimetil-2,5,9-undecatrienal, (2E)-7,8-dimetil-2,7-nonadienal, (5E)-7-oxo-5-heptenoato de metila, (2E)-7- metil-2,6-octadienal, (2E)-6,6-dimetil-2-heptenal, (+-)-(2E)-5,9-dimetil-2,8- decadienal, (E)-2-tetradecenal, (E)-8-metoxi-4,8-dimetilnon-2-enal e combinações dos mesmos.

[0020] Em outro aspecto, o primeiro composto compreende um composto muguet floral e o receptor olfativo é OR10J5 ou Olfr16; quimera e fragmentos funcionais da mesma; e em que o receptor olfativo compreende um polipeptídeo que j. compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 ou 8; e/ou k. é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

[0021] Em um aspecto, o composto muguet floral é 3-(4-hidroxi-4- metilpentil)ciclohex-3-eno-1-carbaldeído, 4-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclohex-3- eno-1-carbaldeído ou uma mistura dos mesmos.

[0022] Em um aspecto, o receptor é OR10J5, o composto odorante agonista compreende um composto muguet floral; e o composto selecionado compreende pelo menos um modulador alostérico positivo selecionado do grupo que consiste em octanal; (E)-dec-2-enal, 2-fenilpropanal; (E)-but-2-enal; 3-metilbenzaldeído; 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-2-metilpropanal; (+-)-3-(4-metil-3-penten-1-il)-3-ciclo- hexeno-1-carbaldeído, (+-)-4-(4-metil-3-penten-1-il)-3-ciclo-hexeno-1- carbaldeído, e misturas dos mesmos; heptanal, 4-Propan-2-ilbenzaldeído; (3R)- 3,7-dimetiloct-6-enal; (+)-(3S)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen-1-il]butanal, (+)- (3R)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen-1-il]butanal, e misturas dos mesmos; hexanal; 2,6-dimetil-hept-5-enal; benzaldeído; 2-metil-3-(4-metilfenil)propanal; 3,5,6- trimetil-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, 2,4,6-trimetil-3-ciclo-hexeno-1- carbaldeído, e misturas dos mesmos; 4-etilbenzaldeído; 6-metoxi-2,6-dimetil- heptanal; (E)-non-2-enal; e combinações dos mesmos.

[0023] Em um aspecto, a atividade modulada compreende l. modular a afinidade de ligação do primeiro composto ao sítio ortostérico, m. modular a eficácia da ativação de ligação do primeiro composto no sítio ortostérico e/ou n. modular o sítio de ligação à proteína G.

[0024] Um aspecto apresentado no presente documento fornece um método para identificar pelo menos um composto modulador alostérico positivo que intensifica a atividade de um receptor olfativo na presença de um agonista do receptor, que compreende o. fornecer uma ou mais células isoladas, sendo que cada célula expressa um receptor olfativo de mamífero, p. expor a uma ou mais células a um primeiro composto que ativa o receptor olfativo, q. expor a uma ou mais células a um ou mais compostos de teste, e r. selecionar pelo menos um segundo composto do um ou mais compostos de teste quando o pelo menos um segundo composto em combinação com o primeiro composto tiver um efeito sinérgico na atividade do receptor como um composto modulador alostérico positivo; em que o primeiro composto é um composto odorante agonista do receptor olfativo, em que o primeiro composto e o segundo composto são compostos diferentes, e em que o segundo composto não é um agonista do receptor.

[0025] Em um aspecto, a ativação do receptor olfativo para o primeiro composto é medida medindo-se a resposta do dito receptor olfativo na presença e na ausência do primeiro composto.

[0026] Em um aspecto, o pelo menos um segundo composto é selecionado dentre um ou mais compostos de teste de uma biblioteca de compostos quimicamente diversa.

[0027] Em um aspecto, o pelo menos um segundo composto é selecionado a partir de um ou mais compostos de teste com base em análise de relação estrutura-atividade (SAR) dos compostos identificados inicialmente.

[0028] O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o segundo composto se liga a um sítio no receptor olfativo distinto do sítio em que o primeiro composto se liga.

[0029] Em um aspecto, antes da etapa a) do sistema de ensaio ou do método fornecido no presente documento, as uma ou mais células são transformadas para expressar o receptor olfativo alvo.

[0030] Em um aspecto, o receptor olfativo é heterólogo para uma ou mais células.

[0031] Em um aspecto, a célula é selecionada do grupo que consiste em HEK293, CHO, oócitos Xenopus, COS, S2, Sf9, inseto, levedura e células derivadas do placode olfativo.

[0032] Um aspecto apresentado no presente documento fornece um método para identificar um composto que intensifica a atividade de um receptor olfativo induzida por um composto odorante agonista que compreende: (i) triar um ou mais compostos em um ensaio de ligação na presença do composto odorante agonista; (ii) selecionar um ou mais dos compostos triados que intensificam especificamente a ligação específica ou o efeito da ligação de um composto odorante agonista a um receptor olfativo de mamífero; e (iii) identificar compostos que potencialmente modulam a percepção do composto odorante agonista com base na sua intensificação da ligação específica ou no efeito da ligação do composto odorante agonista ao receptor olfativo.

[0033] Em um aspecto, a intensificação do efeito da ligação do composto odorante agonista ao receptor olfativo compreende aumentar a potência e/ou eficácia da atividade do receptor em comparação com a atividade do receptor na ausência do composto selecionado.

[0034] Em um aspecto, compostos selecionados que aumentam a potência e/ou eficácia da atividade do receptor em comparação com a atividade do receptor na ausência do composto selecionado podem se ligar covalentemente ao receptor alvo.

[0035] Em um aspecto, o receptor é OR5AN1, o composto odorante agonista compreende um composto de almíscar; e o composto selecionado é um modulador alostérico positivo que compreende um modulador alostérico positivo que tem a estrutura: Fórmula (I) na forma de qualquer um de seus estereoisômeros ou uma mistura dos mesmos; em que R representa um grupo alquil C3-11 linear opcionalmente substituído por um grupo alquil C1-4 carboxiléster ou um grupo hidroxil, um grupo alquil C4-11 ramificado opcionalmente substituído por um grupo alcóxi C1-3 , um grupo alcenil ou alcadienil C6- 12 linear ou ramificado, um grupo fenil substituído por um ou dois grupos alquil C 1-3, um grupo alcenil C5-8 alicíclico ou um grupo benziloximetil , e em que o composto de Fórmula (I) é um modulador alostérico positivo de um receptor olfativo de almíscar.

[0036] Em um aspecto, o composto de Fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em: (E,E)-2,4-decadienal, (E)-2-undecenal, (E,E)-2,4-nonadienal, (E)-2-tridecenal, (2E)-2-dodecenal, (2E,6Z)-2,6-nonadienal, (E,E)-2,6- nonadienal, (2E)-2,4-undecadienal, (2E)-2,4-dodecadienal, (E)-2-nonenal, (2E,4E,7Z)-decatrienal, (Z)-2-decenal, (E)-2-octenal, (E)-2-decenal, (Z)-4- (benziloxi)but-2-enal, (E)-4-(benziloxi)but-2-enal, (E)-4-ciclohexilidenebut-2- enal, (2E)-3-(4-metilfenil)-2-propenal, (2E,5E)-6,10-dimetil-2,5,9-undecatrienal, (2E)-7,8-dimetil-2,7-nonadienal, (5E)-7-oxo-5-heptenoato de metila, (2E)-7- metil-2,6-octadienal, (2E)-6,6-dimetil-2-heptenal, (+-)-(2E)-5,9-dimetil-2,8- decadienal, (E)-2-tetradecenal, (E)-8-metoxi-4,8-dimetilnon-2-enal.

[0037] Em um aspecto, o receptor é OR10J5, o composto odorante agonista compreende um composto muguet floral; e o composto selecionado compreende pelo menos um modulador alostérico positivo selecionado do grupo que consiste em octanal; (E)-dec-2-enal, 2-fenilpropanal; (E)-but-2-enal; 3-metilbenzaldeído; 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-2-metilpropanal; (+-)-3-(4-metil-3-penten-1-il)-3-ciclo- hexeno-1-carbaldeído, (+-)-4-(4-metil-3-penten-1-il)-3-ciclo-hexeno-1- carbaldeído, e misturas dos mesmos; heptanal, 4-Propan-2-ilbenzaldeído; (3R)- 3,7-dimetiloct-6-enal; (+)-(3S)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen-1-il]butanal, (+)- (3R)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen-1-il]butanal, e misturas dos mesmos; hexanal; 2,6-dimetil-hept-5-enal; benzaldeído; 2-metil-3-(4-metilfenil)propanal; 3,5,6- trimetil-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, 2,4,6-trimetil-3-ciclo-hexeno-1- carbaldeído, e misturas dos mesmos; 4-etilbenzaldeído; 6-metoxi-2,6-dimetil- heptanal; (E)-non-2-enal; e combinações dos mesmos.

[0038] Em um aspecto, o um ou mais compostos selecionados é selecionado com base em análise de relação estrutura-atividade (SAR) projetada especificamente para identificar os determinantes químicos de intensificação putativa.

[0039] Em um aspecto, a triagem compreende o cálculo de uma janela de ativação para confirmar a qualidade estatística dos dados e medir a intensificação do efeito sinérgico na EC05-50 e em outro aspecto na EC20.

[0040] Um aspecto apresentado no presente documento fornece um uso de um polipeptídeo que pode ser ativado por um agonista, sendo o polipeptídeo selecionado de um receptor olfativo humano que é ativado pelo agonista para uso em um ensaio de triagem para identificar um ou mais compostos moduladores alostéricos positivos do agonista.

[0041] Um aspecto apresentado no presente documento fornece um uso de um polipeptídeo que pode ser ativado por um almíscar, que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 6 para identificar um composto modulador alostérico positivo de almíscar.

[0042] Um aspecto apresentado no presente documento fornece um uso de um polipeptídeo que pode ser ativado por um composto muguet floral, que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 ou 8 para identificar um composto modulador alostérico positivo da atividade do receptor de muguet floral.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0043] A Figura 1 mostra a correlação entre os níveis in vitro induzidos por almíscar das gravações de ativação de OR5AN1 para uma série de almíscares distintos (a) e as sensibilidades humanas crescentes em geral, como mostrado pelas gravações de limiar de detecção de odor de muscone, MUSCENONE®, xilol de almíscar e cetona de almíscar ( b)

[0044] A Figura 2 mostra o resultado de uma mistura binária de ponto único de MUSCENONE® e triagem de matérias-primas para perfumaria para intensificação da atividade induzida por almíscares OR5AN1.

[0045] A Figura 3 mostra as curvas de resposta à dose de OR5AN1 para todos os quatro dentre o agonista muscone, MUSCENONE®, xilol de almíscar e almíscar cetona na presença e ausência de aldeído tridecilênico e uma resposta à dose para o aldeído tridecilênico isolado.

[0046] A Figura 4 fornece os valores de EC50 obtidos das curvas de resposta à dose obtidas na Figura 3 e resume o correspondente deslocamento de EC50.

[0047] A Figura 5 mostra uma série de curvas de resposta à dose de OR5AN1 para MUSCENONE® na presença de concentrações seriais de aldeído tridecilênico e também indica os valores de log calculados para o fator α de cooperatividade e a constante de equilíbrio KB.

[0048] A Figura 6 mostra uma classificação de 67 compostos voláteis de acordo com sua capacidade de intensificação de resposta ao almíscar de OR5AN1 com base no deslocamento de potência e aumento de eficácia.

[0049] A Figura 7 mostra os requisitos químicos identificados a partir das análises de SAR que são preferidos para suscitar a intensificação de resposta ao almíscar do OR5AN1.

[0050] A Figura 8 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos no OR5AN1 com a) decenal, b) decadienal e c) decanal, e a exigência da insaturação.

[0051] A Figura 9 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos no OR5AN1 com a) dodecenal e b) tangerinal e a importância da posição de insaturação.

[0052] A Figura 10 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos no OR5AN1 com a) aldeído nonilênico, b) nonenol e c) nordecenol e a ausência de intensificação com um grupo funcional de álcool.

[0053] A Figura 11 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos no OR5AN1 com a) decenal e b) decenona e a ausência de intensificação com um grupo funcional cetona.

[0054] A Figura 12 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos no OR5AN1 com a) ácido undecenal e b) undecenoico e a ausência de intensificação com um grupo ácido.

[0055] A Figura 13 mostra que os alelos OR5AN1 não são funcionalmente equivalentes quando ativados com o MUSCENONE®, mas a intensificação restaura a atividade de alelos hipofuncionais.

[0056] A Figura 14 mostra painelistas humanos mais sensíveis a

MUSCENONE® na presença de um intensificador em comparação com um composto não intensificador.

[0057] A Figura 15 mostra uma curva de resposta à dose de OR10J5 para o composto de muguet floral LYRAL®.

[0058] A Figura 16 mostra o resultado de uma mistura binária de ponto único do composto de muguet floral 3-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclo-hex-3-eno-1- carbaldeído, 4-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclo-hex 3-eno-1-carbaldeído ou uma mistura dos mesmos (vendido sob o nome comercial LYRAL®, doravante denominado "LYRAL®") e triagem de matérias-primas para perfumaria para intensificação da atividade induzida por LYRAL® de OR10J5.

[0059] A Figura 17 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos na ativação induzida pelo LYRAL® de OR10J5 com a) heliopropanal, b) 3-(4- metilciclohex-3-en-1-il) butanal, c) heliotropina e d) ciclometileno-citronelol e a ausência de intensificação para os dois últimos compostos.

[0060] A Figura 18 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos na ativação induzida pelo LYRAL® de Olfr16 com a) heliopropanal, b) 3-(4- metilciclohex-3-en-1-il) butanal, c) heliotropina e d) ciclometileno-citronelol e a ausência de intensificação para os dois últimos compostos.

[0061] A Figura 19 mostra uma série de curvas de resposta à dose de OR10J5 para LYRAL® na presença de concentrações seriais de a) heliopropanal, b) 3-(4-metilciclohex-3-en-1-il)butanal, c) melonal e d) heptanal e também indica os valores logarítmicos calculados correspondentes para o fator de cooperatividade α e a constante de equilíbrio KB.

[0062] A Figura 20 mostra os painelistas humanos mais sensíveis ao LYRAL® na presença de um intensificador em comparação com um composto não intensificador.

[0063] A Figura 21 mostra os painelistas humanos que aumentaram a detecção de LYRAL® como uma função de concentração de intensificador em comparação com o composto não intensificador.

[0064] A Figura 22 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos na ativação de OR10J5 induzida por (+ -)-2,5-dimetil-2-indanmetanol com a) heliopropanal e b) heliotropina e a ausência de intensificação para o último composto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0065] Para as descrições no presente documento e nas reivindicações anexas, o uso de “ou” significa “e/ou” a não ser que determinado de outro modo.

[0066] De modo similar, “compreender”, “compreende”, “que compreende”, “incluir”, “inclui” e “que inclui” são intercambiáveis, e não se destinam a ser limitantes.

[0067] Deve-se entender, ainda, que, nos casos em que as descrições de várias modalidades usam o termo “que compreende”, aqueles versados na técnica entenderiam que, em alguns exemplos específicos, uma modalidade pode ser descrita alternativamente com o uso de linguagem “que consiste essencialmente em” ou “que consiste em”.

[0068] Os termos a seguir têm os significados conferidos aos mesmos, a menos que especificado de outro modo.

[0069] Conforme usado no presente documento, o termo "OR" ou "receptor olfativo" ou "receptor de odorante" se refere a um ou mais membros de uma família de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que são expressos em células olfativas. As células receptoras olfativas também podem ser identificadas com base em morfologia ou pela expressão de proteínas especificamente expressas em células olfativas. Os membros da família de OR podem ter a capacidade para atuar como receptores para transdução de sinal olfativo.

[0070] Um receptor olfativo alvo se refere a um receptor olfativo que pode ser correlacionado com a percepção sensorial, seja in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0071] “OR de almíscar” se refere a um membro da família de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) que é expresso em uma célula olfativa, cujos receptores se ligam e/ou são ativados por um almíscar em um ensaio de ligação ou atividade para identificar ligantes que se ligam e/ou ativam GPCRs. Tais ensaios são descritos abaixo. Os receptores de almíscar incluirão no presente documento os fragmentos, variantes, incluindo ácidos nucleicos ou proteínas sintéticos e de ocorrência natural, e quimeras ou recombinantes que respondem a ou se ligam a um composto de almíscar. A mesma definição se aplica por analogia a outros ORs relevantes ou alvo que podem ser identificadas pelos métodos descritos no presente documento.

[0072] Um odorante se refere a qualquer tipo de odorante incluindo, porém, sem limitação, um perfume, um ingrediente de perfume, um aroma, um alimento, um sabor ou um ingrediente de sabor.

[0073] Um agonista de um OR ou um composto agonista se refere a um composto ou um ligante que se liga a um OR, ativa o OR e tem o potencial para induzir uma cascata de transdução de receptor.

[0074] Como considerado no presente documento, um composto que não é um agonista de um receptor olfativo se refere a um composto ou ligante que se liga a um OR de forma não competitiva em relação a um composto agonista e que intensifica ou inibe a atividade do receptor exposto ao composto agonista quando em comparação com a atividade do receptor exposto ao composto agonista na ausência do composto que não é um agonista. Em um aspecto, o composto que não é um agonista se liga a um sítio no receptor diferente do sítio em que o composto agonista se liga.

[0075] Em um aspecto, um composto que não é um agonista de um receptor olfativo tem uma potência e eficácia substancialmente inferior àquela de um agonista, por exemplo, quando o valor de EC50 é substancialmente superior àquele de um composto agonista e a eficácia é tipicamente menor de 20% da eficácia de uma resposta agonista completa na saturação.

[0076] Potência se refere à medida da atividade de um receptor induzida pela ligação de um agonista (odorante) em termos de quantidade necessária para produzir um dado nível de atividade. A mesma indica a sensibilidade do receptor a diferentes concentrações de agonista e geralmente é obtida calculando-se a EC50 (a concentração de agonista necessária para atingir a metade do máximo de atividade do receptor).

[0077] Eficácia se refere à medida da intensidade pela qual o receptor responde a um dado agonista e é obtida medindo-se o intervalo de ativação entre a atividade indutiva constitutiva (atividade de referência na ausência de um agonista) e induzida pelo agonista. A eficácia máxima é obtida na saturação do receptor.

[0078] Um sítio de ligação ortostática se refere a um sítio de ligação ao ligante ou composto odorante para um agonista ou um antagonista competitivo. Um evento de ligação ao sítio ortostérico geralmente leva à ativação pelo agonista ou à inibição pelo antagonista competitivo da atividade do receptor.

[0079] Um sítio de ligação alostérica se refere a um sítio de ligação que é distinto topograficamente do sítio de ligação ortostérica. A ligação alostérica na presença de agonista ortostérico não é impedida estericamente e, portanto, ocorre de maneira não competitiva. Certos ligantes alostéricos podem atuar como moduladores alostéricos positivos (PAMs) ou moduladores alostéricos negativos (NAMs), por exemplo, para potencializar ou inibir a ativação do receptor pelo agonista, respectivamente.

[0080] A competição de ligação ocorre quando duas moléculas competem para se ligar ao mesmo sítio de ligação. A probabilidade de ligação para cada ligante é dependente de sua respectiva afinidade com o receptor e sua concentração em comparação com o outro ligante. Competição ocorre tipicamente quando ambos os ligantes se ligam ao sítio ortostérico. Isso pode ser identificado através da realização de um ensaio de competição, tal como a análise de regressão de Schild; quando nenhuma competição é observada, ambos os ligantes podem se ligar ao receptor ao mesmo tempo em dois sítios de ligação distintos, definidos como os sítios de ligação ortostérica e alostérica, em que os sítios de ligação podem ser separados topograficamente no receptor ou podem ser adjacentes ou sobrepostos. Nesse caso, a ligação do ligante ortostérico não é linearmente dependente da concentração do ligante alostérico. A ligação alostérica pode modular várias propriedades do receptor, como afinidade agonista e eficiência de transdução de sinal.

[0081] Moduladores alostéricos positivos ou negativos ou compostos moduladores alostéricos positivos ou negativos se referem a compostos ou ligantes que aumentam ou inibem o efeito do composto agonista ortostérico ou ligação ao ligando, mas são amplamente inativos na ausência de um composto ou ligante agonista ortostérico. A inibição alostérica ou a intensificação da atividade de um receptor podem ocorrer modulando-se a conformação do receptor e modificando-se: 1) a afinidade do sítio ortostérico com seus agonistas,

2) o efeito da ativação da ligação ortostática (por exemplo, eficácia) ou 3) a ligação à proteína G no caso de GPCRs e diminuição ou aumento da eficiência da transdução de sinal, respectivamente.

[0082] Um fator de cooperatividade se refere à medida do grau de modulação de um efeito de ligação ao ligante ortostérico devido à presença de um ligante alostérico.

[0083] A capacidade dos compostos da presente revelação para inibir ou antagonizar um receptor olfativo pode ser determinada por qualquer método adequado prontamente selecionado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, tal como, por exemplo, por meio de um ensaio de neurônio de cultivado ex vivo ou por meio de um ensaio in vitro com o uso de uma linha celular que expressa um receptor olfativo relevante, por exemplo, um receptor olfativo de almíscar.

[0084] Tais ensaios para inibidores e ativadores incluem, por exemplo, expressar membros da família de OR em células ou membranas celulares, aplicar compostos moduladores putativos, na presença ou ausência de moléculas agonistas, por exemplo, almíscar e, em seguida, determinar os efeitos funcionais na transdução olfativa, conforme descrito nos Exemplos abaixo. As amostras ou ensaios que compreende membros da família de OR que são tratados com um inibidor potencial são comparados com amostras de controle sem o inibidor para examinar a extensão da inibição. As amostras de controle (não tratadas com inibidores, mas tratadas com o agonista) recebem um valor de atividade OR máximo relativo de 100%.

[0085] Os ensaios de atividade do receptor olfativo podem revelar os seguintes dados: (i) se um dado composto é ou não um ativador do receptor olfativo e a especificidade do composto para o receptor olfativo específico; (ii) a EC50 de um agonista para um receptor olfativo (isto é, a EC50 do agonista) e/ou (iii) a eficácia de um agonista para um receptor olfativo, determinado pela amplitude da resposta (isto é, o intervalo entre os níveis de atividade de referência e saturado).

[0086] Em alguns aspectos, a ativação intensificada de um OR é alcançada quando o valor normal da atividade do OR (100%) em relação ao controle agonista é maior que 100%, por exemplo, cerca de 110%, opcionalmente 120% ou 150% ou maior. Em um aspecto, a melhoria de um OR é alcançada se a potência de um agonista para o OR na presença do composto intensificador é aumentada. Em um aspecto, o aumento de potência é determinado por meio de uma mudança na EC50 para o agonista. Alternativamente, em outro aspecto, a melhoria de um OR é alcançada se o valor de EC50 do agonista na presença do composto intensificador for diminuído de 2 a 30 vezes. Em um aspecto, a melhoria de um OR é alcançada se o valor de EC50 do composto agonista for diminuído 2 vezes. Em outro aspecto, o aumento de um OR é alcançado se o valor de EC50 do agonista na presença do composto intensificador for diminuído 30 vezes

[0087] Em alguns aspectos, a intensificação de um OR é alcançada se a eficácia de um agonista da OR na presença do composto intensificador for aumentada em relação ao controle do agonista. Em um aspecto, a melhoria de um OR é alcançada se o valor de eficácia do agonista na presença do composto intensificador for aumentado entre 1,05 vez a 2 vezes ou mais. Em um aspecto, o aumento de um OR é alcançado se o valor de eficácia do agonista na presença do composto intensificador for aumentado em cerca de 1,05 vez. Em outro aspecto, o aumento de um OR é alcançado se o valor de eficácia do agonista na presença do composto intensificador for aumentado em cerca de 2 vezes.

[0088] Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada quando o valor normal da atividade do OR (100%) em relação ao controle agonista é inferior a 100%, por exemplo, cerca de 80%, opcionalmente 50% ou 25 a 0%. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se a potência de um agonista para o OR for diminuída. Em outro aspecto, a diminuição da potência é determinada por meio de uma alteração na EC50 para o agonista. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de EC50 do agonista na presença de um composto antagonista for aumentado entre cerca de 2 vezes a cerca de 30 vezes. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de EC 50 do agonista na presença do composto antagonista for aumentado 2 vezes. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de EC50 do agonista na presença do composto antagonista for aumentado 30 vezes.

[0089] Em alguns aspectos, a inibição de um OR é alcançada se a eficácia de um agonista do OR na presença do composto antagonista for diminuída. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de eficácia do agonista na presença do composto antagonista for diminuído de cerca de 1,25 vez a 4 vezes ou mais. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de eficácia do agonista na presença do composto antagonista for reduzido para 0. Em outro aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de eficácia do agonista na presença do composto antagonista for diminuído 1,25 vez. Em um aspecto, a inibição de um OR é alcançada se o valor de eficácia do agonista na presença do composto antagonista for diminuído 4 vezes.

[0090] Uma atividade intensificada sinergisticamente de um OR se refere à atividade do receptor que é aumentada pela exposição do receptor na presença de uma combinação de um composto agonista e um composto modulador alostérico positivo quando comparada à atividade do receptor exposto apenas ao agonista. Em um aspecto, a atividade intensificada sinergisticamente inclui um aumento de cerca de 2 a 30 vezes na potência e/ou um aumento de cerca de 1,05 a 1,5 vez ou mais na eficácia.

[0091] Os polipeptídeos "OR" ou "receptor de odorante" ou "receptor olfativo" são considerados como tal se pertencerem à superfamília de receptores acoplados à proteína G de domínio 7 transmembranar codificados por um único exon de ~1kb de comprimento e exibirem motivos de aminoácidos específicos do receptor olfativo característicos. Os sete domínios são chamados domínios "transmembranares" ou "TM” TM I a TM VII conectados por três domínios de “alça celular interna” ou “IC” IC I a IC III, e três domínios de “alça celular externa” ou “EC” EC I a EC III. Os motivos e as variantes dos mesmos são definidos como, porém, sem restrição, o motivo MAYDRYVAIC (SEQ ID NO: 15) que sobrepõe TM III e IC II, o motivo FSTCSSH (SEQ ID NO: 16) que sobrepõe IC III e TM VI, o motivo PMLNPFIY (SEQ ID NO: 17) em TM VII bem como três resíduos C conservados em EC II, e a presença de resíduos GN altamente conservados em TM I [Zhang, X. & Firestein, S. Nat. Neurosci. 5, 124 a 133 (2002); Malnic, B., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101, 2.584 a 2.589 (2004)].

[0092] Os ácidos nucleicos de "OR" codificam uma família de GPCRs com sete regiões transmembranares que têm "atividade de receptor acoplada à proteína G", por exemplo, os mesmos se ligam a proteínas G em resposta a estímulos extracelulares e promovem produção de segundos mensageiros intracelulares tais como IP3, cAMP, cGMP e Ca2+ por meio de estimulação de enzimas, tais como fosfolipase C e adenilato ciclase III.

[0093] Os genes OR “parálogos” ou “parálogos” são o resultado de duplicações de gene e se referem a genes homólogos proximamente relacionados dentro mesma espécie.

[0094] Genes OR “ortólogos” ou “ortólogos” são definidos como filogeneticamente ligados por um gene presente em um ancestral comum e se referem a genes homólogos proximamente relacionados em outras espécies.

[0095] A região de "domínio terminal N" começa no terminal N (terminal amino) de um peptídeo ou proteína e se estende para uma região próxima ao início da primeira região transmembranar.

[0096] “Regiões transmembranares" compreendem os sete "domínios transmembranares", o que se refere ao domínio de polipeptídeos OR que está situado dentro da membrana de plasma, e também podem incluir as alças citoplásmicas correspondentes (intracelulares) e extracelulares. As sete regiões transmembranares e alças extracelulares e citoplásmicas podem ser identificadas com o uso de métodos padrão, como perfis de hidrofobicidade, conforme descrito em Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105 a 132 (1982), ou em Stryer. A estrutura secundária e terciária geral de domínios transmembranares, em particular, os sete domínios transmembranares de receptores acoplados com proteína G, como receptores olfativos, é conhecida na técnica. Desse modo, a sequência de estrutura primária pode ser prevista com base em sequências de domínio transmembranares conhecidas, conforme descrito em detalhes abaixo. Estes domínios transmembranares são úteis para ensaios de ligação de ligante in vitro.

[0097] A expressão "efeitos funcionais" no contexto de ensaios para testar compostos que modulam transdução olfativa mediada por membro de família OR inclui a determinação de qualquer parâmetro que esteja indireta ou diretamente sob a influência do receptor, por exemplo, efeitos funcionais, físicos e químicos.

A mesma inclui união de ligante, mudanças em fluxo iônico, potencial de membrana, fluxo de corrente, transcrição, ligação de proteína G, fosforilação ou desfosforilação de GPCR, interações de ligante de receptor de transdução de sinal, concentrações de segundo mensageiro (por exemplo, cAMP, cGMP IP3, ou Ca2+ intracelular), in vitro, in vivo e ex vivo e também inclui outros efeitos fisiológicos, como aumentos ou diminuições de liberação de hormônio ou neurotransmissor.

[0098] Por "determinar o efeito funcional" ou "confirmar a atividade" no contexto de ensaios entende-se ensaios para um composto que aumenta ou diminui um parâmetro que está indireta ou diretamente sob a influência de um membro de família de OR, por exemplo, efeitos funcionais, físicos e químicos. Tais efeitos funcionais podem ser medidos por qualquer meio conhecido àqueles versados na técnica, por exemplo, mudanças em características espectroscópicas (por exemplo, fluorescência, absorbância, índice refrativo), propriedades hidrodinâmicas (por exemplo, formato), cromatográficas, ou solubilidade, fixação de emplastro, corantes sensíveis à tensão, correntes de célula inteira, efluxo de radioisótopo, marcadores induzíveis, expressão de gene OR de oócito; expressão OR de célula de cultura de tecido; ativação transcricional de genes OR ou genes de atividade induzida, como egr-1 ou c-fos; ensaios de união de ligante; tensão, mudanças de condutância e potencial de membrana; ensaios de fluxo de íon; mudanças em segundos mensageiros intracelulares tais como cAMP, cGMP e inositol trifosfato (IP3); mudanças em níveis de cálcio intracelulares; liberação de neurotransmissor e similares.

[0099] Os termos "purificado", "substancialmente purificado", e "isolado", conforme usados no presente documento, se referem ao estado de estar livre de outros compostos dissimilares com os quais o composto da invenção é normalmente associado em seu estado natural, de modo que a matéria "purificada", "substancialmente purificada" e "isolada" compreenda pelo menos 0,5%, 1%, 5%, 10% ou 20% ou pelo menos 50% ou 75%) da massa, em peso, de uma dada amostra. Em uma modalidade particular, esses termos se referem ao composto da invenção que compreende pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% da massa, em peso, de uma dada amostra. Conforme usado no presente documento, os termos "purificado", "substancialmente purificado" e "isolado", ao se referirem a um ácido nucleico ou proteína, de ácidos nucleicos ou proteínas, também se referem a um estado de purificação ou concentração diferente daquele que ocorre naturalmente no corpo de mamífero, especialmente ser humano. Qualquer grau de purificação ou concentração maior do que aquele que ocorre naturalmente no corpo de mamífero, especialmente ser humano, incluindo (1) a purificação de outras estruturas ou compostos associados ou (2) a associação a estruturas ou compostos aos quais o mesmo não é normalmente associado no corpo de mamífero, especialmente ser humano, está dentro do significado de "isolado". O ácido nucleico ou proteína ou classes de ácidos nucleicos ou proteínas, descritos no presente documento, podem ser isolados, ou associados de outro modo a estruturas ou compostos aos quais os mesmos não são normalmente associados na natureza, de acordo com uma variedade de métodos e processos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00100] Conforme usado no presente documento, os termos "amplificar" e "amplificação" se referem ao uso de qualquer metodologia de amplificação adequada para gerar ou detectar recombinante de ácido nucleico naturalmente expresso, conforme descrito em detalhes, abaixo. Por exemplo, a invenção fornece métodos e reagentes (por exemplo, pares de iniciador de oligonucleotídeo degenerado específicos, iniciador oligo dT) para amplificar (por exemplo, por reação em cadeia de polimerase, PCR) ácidos nucleicos naturalmente expressos (por exemplo, DNA ou mRNA genômico) ou recombinantes (por exemplo, cDNA) da invenção in vivo, ex vivo ou in vitro.

[00101] O termo "receptor de 7 transmembranar" significa um polipeptídeo que pertence a uma superfamília de proteínas transmembranares que têm sete domínios que abrange a membrana de plasma sete vezes (desse modo, os sete domínios são denominados domínios "transmembranares" ou "TM" TM I a TM VII). As famílias de receptores olfativos e determinados receptores de sabor pertencem, cada uma, a essa superfamília. Os polipeptídeos de receptor de 7 transmembranar têm estruturas primária, secundária e terciária similares e características, conforme discutido em detalhes adicionais abaixo.

[00102] O termo "ácido nucleico" ou "sequência de ácidos nucleicos" se refere a um desoxirribonucleotídeo ou oligonucleotídeo ribonucleotídeo em forma de filamento único ou filamento duplo. O termo abrange ácidos nucleicos, isto é, oligonucleotídeos, que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas similares a ácido nucleico com cadeias principais sintéticas. A menos que indicado de outra maneira, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente variantes modificadas de modo conservador da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser alcançadas gerando-se, por exemplo, sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados é substituída por resíduos de desoxi-inosina e/ou com base misturada.

[00103] Além das sequências gênicas mostradas nas sequências reveladas no presente documento, será evidente para o versado na técnica que variantes também incluem polimorfismos na sequência de DNA que podem existir dentro de uma dada população, o que pode levar a alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos revelados no presente documento. Tais polimorfismos genéticos podem existir em células de diferentes populações ou dentro de uma população devido à variação alélica natural. Variantes alélicas também podem incluir equivalentes funcionais.

[00104] Modalidades adicionais também se referem às moléculas derivadas por tais polimorfismos de sequência dos ácidos nucleicos revelados concretamente. Essas variações naturais provocam, em geral, uma variação de cerca de 1 a 5% na sequência de nucleotídeos de um gene ou na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos revelados no presente documento. Conforme mencionado acima, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de uma modalidade do presente documento é uma ferramenta útil para modificar células hospedeiras ou organismos hospedeiros não humanos destinados a serem usados nos métodos descritos no presente documento.

[00105] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido, que compreende aminoácidos ou polímeros de ocorrência natural e aminoácidos ou polímeros de ocorrência não natural. O termo "heterólogo", quando usado com referência a porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de modo recombinante, que tem duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos para produzir um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. De modo similar, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

[00106] Um "promotor" é definido como uma matriz de sequências de ácidos nucleicos que direcionam a transcrição de um ácido nucleico. Conforme usado no presente documento, um promotor inclui sequências de ácidos nucleicos necessárias próximas ao sítio de início de transcrição, tais como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos repressores ou intensificadores distais, que podem estar localizados tanto quanto diversos milhares de pares-base a partir do sítio de início de transcrição. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. O termo "ligado de modo operável" se refere a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, ou arranjo de sítios de ligação de fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controle de expressão direciona a transcrição do ácido nucleico que corresponde à segunda sequência.

[00107] Conforme usado no presente documento, "recombinante" se refere a um polinucleotídeo sintetizado ou manipulado de outro modo in vitro (por exemplo "polinucleotídeo recombinante"), a métodos para usar polinucleotídeos recombinantes para produzir produtos de gene em células ou outros sistemas biológicos, ou a um polipeptídeo ("proteína recombinante") codificado por um polinucleotídeo recombinante. “Recombinante" também significa a ligação de ácidos nucleicos que têm várias regiões de codificação ou domínios ou sequências de promotor a partir de diferentes fontes em um cassete de expressão ou vetor para expressão de, por exemplo, expressão induzível ou constitutiva de uma proteína de fusão que compreende um domínio de translocação da invenção e uma sequência de ácido nucleico potencialmente amplificada com o uso de um iniciador. “Recombinante" também significa modificações obtidas por técnicas de edição de genoma, tais como CRISPR/Cas9, de uma célula que leva à expressão estável ou transiente de genes endógenos tais como o gene receptor dito no presente documento.

[00108] O termo "vetor de expressão" se refere a qualquer sistema de expressão recombinante para o propósito de expressar uma sequência de ácidos nucleicos da invenção in vitro, ex vivo ou in vivo, de modo constitutivo ou induzível, em qualquer célula, incluindo célula procariótica, de levedura, fúngica, vegetal, de inseto ou de mamífero. O termo inclui quaisquer sistemas de expressão linear ou circular que incluem, porém, sem limitação, vetores virais, bacteriófagos e plasmídeos. O especialista tem capacidade para selecionar um vetor adequado de acordo com o sistema de expressão. O termo inclui sistemas de expressão que permanecem epissômicos ou se integram ao genoma de célula hospedeira. Os sistemas de expressão podem ter a capacidade de autorreplicar ou não, isto é, conduzir a expressão transiente em uma célula. O termo inclui “cassetes de expressão” recombinantes que pode conter os elementos mínimos necessários para transcrição do ácido nucleico recombinante. O termo também cobre cassetes ou vetores para expressão de genes endógenos através, por exemplo, de métodos de edição de genoma, como CRISPR/Cas9.

[00109] Por "um organismo não humano ou uma célula hospedeira" entende- se um organismo não humano ou uma célula que contém um ácido nucleico, conforme descrito no presente documento, ou um vetor de expressão e sustenta a replicação ou expressão do vetor de expressão. As células hospedeiras podem ser células procarióticas tais como E. coli, ou células eucarióticas tais como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero tais como CHO, HeLa, HEK-293 e similares, por exemplo células cultivadas, explantes e células in vivo.

[00110] Por “identificador” ou “combinação de identificador” entende-se uma sequência de polipeptídeo curta que pode ser adicionada à proteína receptora odorante. Tipicamente, o DNA que codifica um “identificador” ou uma “combinação de identificador” é adicionado ao DNA que codifica o receptor, que resulta eventualmente em uma proteína de fusão, em que o “identificador” ou uma “combinação de identificador” é fundido ao terminal N ou terminal C do receptor. Os identificadores Lucy, FLAG® e/ou Rho podem intensificar o tráfego de receptor para a membrana de célula, então, podem auxiliar na expressão de um receptor de odorante funcional para o ensaio com base em célula in vitro [Shepard, B. et al. PLoS One 8, e68758–e68758 (2013), e Zhuang, H. & Matsunami, H. J. Biol. Chem. 282, 15.284 a 15.293 (2007)].

MODALIDADES PARTICULARES

[00111] Os ensaios e métodos descritos no presente documento fazem uso de receptores olfativos humanos relevantes e/ou ortólogos de camundongo correspondentes em ensaios e métodos para a identificação de um ou mais compostos de um grupo de compostos em que um ou mais compostos modulam positivamente a atividade do receptor olfativo que é induzido por um composto odorante agonista, em que o agonista é de particular interesse para a perfumaria e em que a combinação do receptor alvo, seu agonista e o um ou mais compostos é usada nos ensaios ou métodos de triagem.

[00112] A presente revelação fornece a identificação de compostos que podem ser usados em aplicações de perfumaria para modular, isto é, intensificar fragrâncias desejadas ou agonistas alvo, como, por exemplo, um almíscar ou um composto floral, tal como muscone ou um composto de muguet floral, respectivamente. Em alguns aspectos, compostos voláteis que aumentam o agonista alvo são moduladores alostéricos positivos do receptor olfativo do agonista alvo. Sem pretender ser limitado por qualquer teoria particular, a interação sinérgica entre os ingredientes de perfumaria pode levar a uma percepção mais sensível e mais intensa das tonalidades de perfumaria. Tais compostos permitem assim novas rotas para otimizar as regras de perfumaria e criar formulações de perfumaria comercial com melhor desempenho.

[00113] Em uma modalidade, o receptor olfativo humano OR5AN1 e/ou seu ortólogo de camundongo correspondente Olfr1440 são usados como receptores ativados por vários compostos agonistas de almíscar para identificar compostos que modulam a atividade do receptor na presença do composto agonista de almíscar. O receptor olfativo humano OR5AN1 e o seu ortólogo de camundongo correspondente Olfr1440 têm aproximadamente 66% de identidade de sequência no nível de aminoácidos.

[00114] Em uma modalidade, em vista da correlação entre o resultado sensorial e a resposta do OR5AN1 a compostos de almíscares, o OR5AN1 é selecionado como um receptor alvo relevante ativado por almíscares específicos, isto é, cetonas e nitro-almíscares macrocíclicos, para uso em ensaios e métodos para triagem e seleção de moduladores alostéricos positivos desses compostos de almíscares.

[00115] Em outra modalidade, o receptor olfativo humano OR10J5 e/ou seu ortólogo de camundongo correspondente Olfr16 são usados como receptores para vários compostos agonistas de muguet floral para identificar compostos que modulam a atividade do receptor na presença de um composto agonista de muguet floral. O receptor olfativo humano OR10J5 e o seu ortólogo de camundongo correspondente Olfr16 têm aproximadamente 87 % de identidade de sequência no nível de aminoácidos.

[00116] OR10J5 e seu ortólogo de camundongo Olfr16 correlacionam atividade induzida por composto de muguet floral com o resultado sensorial de percepção de um floral, lírio do vale, nota de odor de hidroxicitronelal e um caráter olfativo geral que lembra fortemente aquele do ingrediente muito bem conhecido 3-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclo-hex-3-eno-1-carbaldeído, 4-(4-hidroxi- 4-metilpentil)ciclo-hex-3-eno-1-carbaldeído ou uma mistura dos mesmos (vendido sob a marca comercial LYRAL®, doravante denominado "LYRAL®").

[00117] Um composto de muguet floral refere-se a certos compostos que conferem uma nota semelhante a lírio do vale ou de muguet floral, incluindo, porém, sem limitação, um composto liral.

[00118] Exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, os compostos revelados nas Publicações de Pedido de Patente

Internacional nos WO2017/009175 A1, WO2010/091969 A1, WO2011/029743 A1, WO2018/134221 A1, WO2008/068310 A1, WO2014/198709 A1, WO2013/117433 A1, WO2014/180945 A1, WO2014/180952 A1, WO2016/074118 A1, WO2016/074697 A1, WO2016/074719 A1, WO2014/180952 A1, WO2001/090038 A1, WO2008/053148 A1 ou WO2017/066214 A1.

[00119] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, mas não estão limitados aos compostos revelados nas Publicações de Pedido de Patente nos US2013/0090390 A1, US2011/0117046 A1, US2011/0118170 A1, US2009/0036347 A1 ou US2011/0217257 A1.

[00120] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, compostos revelados nas patentes nos U.S. 5,527,769 A, 7,834,219 B1, 2,710,825 A ou 4,352,937 A.

[00121] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, mas não estão limitados aos compostos revelados nas Publicações de Pedido de Patente Europeia nos EP2594626 A1, EP0392258 A2, EP2322495 A1, EP1029845 A1, EP1054053 A2 ou EP1529770 A1.

[00122] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, mas não estão limitados aos compostos revelados nas Patentes Europeias n os EP2594626 B1, EP685444 B1 ou EP2594626 B1.

[00123] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, mas não estão limitados aos compostos revelados nas Publicações de Pedido de Patente do Reino Unido nos GB2528467 A, GB988502 A, GB1057360 A ou GB2529901 A.

[00124] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, os compostos revelados em Lamboley et al., Synthesis and Properties of Conformationally Constrained Analogues of Floral-Type Odorants, Helvetica Chimica Acta, vol. 84, páginas 1767 a 1793 (2004).

[00125] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, os compostos revelados em Schroeder et al., -Unsaturated Aldehydes as Potential Lilial Replacers, Chemistry & Biodiversity, vol. 11, páginas 1651 a 1673 (2014).

[00126] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, os compostos revelados em Skouroumounis et al., Synthesis of 1,3,4,5-Tetrahydro-2-benzoxepin Derivatives as Conformationally Restricted Analogues of Cyclamenaldehyde-Type Compounds and as Intermediates for Highly Odour-Active Homologues, Helvetica Chimica Acta, vol. 79, páginas 1095 a 1109 (1996).

[00127] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, os compostos revelados em Winter et al., Synthesis and Odor Properties of Substituted Indane-2-carboxaldehydes. Discovery of a New Floral (Muguet) Fragrance Alcohol, Helvetica Chimica Acta, vol. 88, páginas 3118 a 3127 (2005).

[00128] Outros exemplos de compostos de muguet floral incluem, porém, sem limitação, os compostos revelados em Coulomb, J, Beyond Mguet, Perfume and Flavorist, vol. 43 (2018).

[00129] Em algumas modalidades, o composto muguet floral é selecionado do grupo que consiste em: 3(4)-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclohex-3-eno-1- carbaldeído, 4(4)-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclohex-3-eno-1-carbaldeído ou uma mistura dos mesmos; (4Z)-9-hidroxi-5,9-dimetil-4-decenal (A) + (4E)-9-hidroxi- 5,9-dimetil-4-decenal; 3-[4-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metilfenil]propanal; 3-[4-(2- hidroxi-2-metilpropil)fenil]propanal; (+-)-3-[4-(2-hidroxi-2-metilpropil)fenil]-2- metilpropanal; (+-)-4-(4-hidroxi-4-metilpentil)-3,6-dihidro-2H-pyran-2- carbaldeído; (2,5-dimetil-2-indanyl)metil formate; (2,5-dimetil-1,3-di-hidroinden- 2-il)metanol; (2,5,6-trimetil-1,3-di-hidroinden-2-il)metanol; (2,4,6-trimetil-1,3-di- hidroinden-2-il)metanol; 4-metil-2-(2-metilpropil)oxan-4-ol; 7-hidroxi-3,7- dimetiloctanal; e misturas dos mesmos.

[00130] Em algumas modalidades, o composto de muguet floral pode compreender LYRAL® e/ou pode compreender um composto tal como 3(4)-(4- hidroxi-4-metilpentil)ciclohex-3-eno-1-carbaldeído, 4(4)-(4-hidroxi-4- metilpentil)ciclohex-3-eno-1-carbaldeído ou uma mistura dos mesmos, que podem ser vendidos sob os seguintes nomes comerciais: LYRAL®, KOVANOL®, MUGONAL®, e LANDOLAL®.

[00131] Esse método pode ser utilizado com outros receptores e agonistas alvo relevantes (por exemplo, agonista de particular importância para a perfumaria) para identificar potenciais moduladores alostéricos positivos dos principais agonistas desses receptores alvo.

[00132] Em uma modalidade fornecida no presente documento, uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

[00133] Em uma modalidade fornecida no presente documento, há uma sequência de ácido nucleico isolada conforme descrito acima que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8.

[00134] Em uma modalidade adicional fornecida no presente documento, há um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8.

[00135] Em uma modalidade, um organismo não humano ou uma célula hospedeira é transformada para expressar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8.

[00136] Em uma modalidade, um organismo não humano ou uma célula hospedeira é transformada para expressar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8.

[00137] É adicionalmente fornecido no presente documento um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8.

[00138] Também é fornecido no presente documento um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

[00139] Também é fornecido no presente documento um vetor de expressão que tem um ácido nucleico em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que é idêntica à SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

[00140] As ORs podem ser específicas para um único agonista ou podem ser ativadas por um painel de agonista estruturalmente diferente ou por um painel de agonistas com estrutura semelhante. O agonista também pode ativar especificamente um único OR ou ativar vários ORs. Como uma etapa inicial para a realização do ensaio ou métodos descritos no presente documento, um par receptor-agonista apropriado é identificado e selecionado. em um aspecto, esse agonista de receptor é preferencialmente de particular interesse para o desenho de composições de perfumaria.

[00141] Por exemplo, em referência à Figura 1 e Exemplo 1, o receptor olfativo OR5AN1 é um receptor olfativo humano cuja atividade induzida por almíscar in vitro se correlaciona com o resultado sensorial da percepção do almíscar. O receptor olfativo OR5AN1 foi ativado especificamente pelos compostos de almíscar muscone, MUSCENONE®, xilol de almíscar e cetona de almíscar, e os níveis de atividade observados, ou seja, potência e eficácia, se classificaram correlacionados com indivíduos no nível sensorial (Figura 1). Por conseguinte, um ensaio de rastreio in vitro de atividade de OR5AN1 tem um poder preditivo em relação ao resultado sensorial putativo do composto identificado e, portanto, OR5AN1 representa um bom alvo para a intensificação com base em receptor dirigido a almíscar.

[00142] As substâncias de teste a serem testadas nos métodos e ensaios descritos no presente documento não são particularmente limitadas. A substância de teste pode ser uma substância que ocorre naturalmente ou uma substância artificial sintetizada química ou biologicamente. A substância de teste pode ser um composto ou uma mistura de compostos.

[00143] Com referência à Figura 6, foi constatado sistematicamente que os aldeídos alifáticos dissubstituídos α-β-mono-insaturados exibem intensificação potente da atividade do receptor olfativo OR5AN1.

[00144] Por conseguinte, um aspecto apresentado no presente documento fornece um modulador alostérico positivo que tem a estrutura: Fórmula (I) na forma de qualquer um de seus estereoisômeros ou uma mistura dos mesmos; em que R representa um grupo alquil C3-11 linear opcionalmente substituído por um grupo alquil C1-4 carboxiléster ou um grupo hidroxil, um grupo alquil C4-11 ramificado opcionalmente substituído por um grupo alcóxi C1-3 , um grupo alcenil ou alcadienil C6- 12 linear ou ramificado, um grupo fenil substituído por um ou dois grupos alquil C 1-3, um grupo alcenil C5-8 alicíclico ou um grupo benziloximetil , e em que o composto de Fórmula (I) é um modulador alostérico positivo de um receptor olfativo de almíscar.

[00145] Por uma questão de clareza, a expressão "qualquer um de seus estereoisômeros", ou similar, é o significado normal entendido por uma pessoa versada na técnica, ou seja, que o composto da invenção pode ser um enantiômero puro (se quiral) ou diastereômero (por exemplo, a ligação dupla está em uma conformação E ou Z).

[00146] Em alguns aspectos, o composto de Fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em: (E,E)-2,4-decadienal, (E)-2-undecenal, (E,E)-2,4- nonadienal, (E)-2-tridecenal, (2E)-2-dodecenal, (2E,6Z)-2,6-nonadienal, (E,E)- 2,6-nonadienal, (2E)-2,4-undecadienal, (2E)-2,4-dodecadienal, (E)-2-nonenal, (2E,4E,7Z)-decatrienal, (Z)-2-decenal, (E)-2-octenal, (E)-2-decenal, (Z)-4- (benziloxi)but-2-enal, (E)-4-(benziloxi)but-2-enal, (E)-4-ciclohexilidenebut-2- enal, (2E)-3-(4-metilfenil)-2-propenal, (2E,5E)-6,10-dimetil-2,5,9-undecatrienal, (2E)-7,8-dimetil-2,7-nonadienal, (5E)-7-oxo-5-heptenoato de metila, (2E)-7- metil-2,6-octadienal, (2E)-6,6-dimetil-2-heptenal, (+-)-(2E)-5,9-dimetil-2,8- decadienal, (E)-2-tetradecenal, (E)-8-metoxi-4,8-dimetilnon-2-enal.

[00147] Em um aspecto, o receptor é OR10J5, o composto odorante agonista compreende um composto de muguet floral; e o composto selecionado compreende pelo menos um modulador alostérico positivo selecionado do grupo que consiste em octanal; (E)-dec-2-enal, 2-fenilpropanal; (E)-but-2-enal; 3- metilbenzaldeído; 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-2-metilpropanal; (+-)-3-(4-metil-3- penten-1-il)-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, (+-)-4-(4-metil-3-penten-1-il)-3-ciclo- hexeno-1-carbaldeído, e misturas dos mesmos; heptanal, 4-Propan-2- ilbenzaldeído; (3R)-3,7-dimetiloct-6-enal; (+)-(3S)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen- 1-il]butanal, (+)-(3R)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen-1-il]butanal, e misturas dos mesmos; hexanal; 2,6-dimetil-hept-5-enal; benzaldeído; 2-metil-3-(4- metilfenil)propanal; 3,5,6-trimetil-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, 2,4,6-trimetil-3- ciclo-hexeno-1-carbaldeído, e misturas dos mesmos; 4-etilbenzaldeído; 6- metoxi-2,6-dimetil-heptanal; (E)-non-2-enal; e combinações dos mesmos.

[00148] Em um aspecto, os moduladores alostéricos positivos intensificam especificamente a atividade do receptor particular, independentemente do agonista do receptor (composto de ativação).

MÉTODOS DE MONITORAMENTO DE ATIVIDADE DE OR

[00149] Desde que a função do OR não seja prejudicada, o mesmo pode ser utilizado sob qualquer forma em um método ou ensaio descrito no presente documento. Por exemplo, o OR pode ser usado como se segue: tecidos ou células que expressam intrinsecamente um OR, tais como neurônios sensoriais olfativos isolados de corpos vivos e produtos cultivados dos mesmos; membrana de célula olfativa portadora de OR; células recombinantes geneticamente modificadas para expressar o OR e produtos cultivados das mesmas; membrana das células recombinantes; e membrana bicamada lipídica artificial que porta o OR.

[00150] Em uma modalidade adicional, os indicadores para monitorar a atividade de receptores olfativos são selecionados de um corante indicador de cálcio fluorescente, uma proteína indicadora de cálcio (por exemplo, GcAMP, um indicador de cálcio codificado geneticamente), um indicador de cAMP fluorescente, um ensaio de mobilização de célula, um ensaio de redistribuição de massa dinâmica celular, um ensaio com base em célula livre de identificação,

uma proteína repórter mediada por elemento de resposta de cAMP (CRE), um ensaio de HTRF de cAMP bioquímico, um ensaio de beta-arrestina ou um registro eletrofisiológico. Particularmente, um corante indicador de cálcio é selecionado que pode ser usado para monitorar a atividade de receptores olfativos expressos na membrana dos neurônios olfativos (por exemplo, Fura-2 AM).

[00151] Em uma modalidade particular, os compostos são triados sequencialmente e as mudanças dependentes de odorante em fluorescência de corante de cálcio são medidas com o uso de um microscópio fluorescente ou separação de célula ativada por fluorescência (FACS).

[00152] Em uma modalidade adicional, a modelagem de receptor 3D molecular de receptores olfativos é usada para estimar o potencial de ligação in silico e para identificar compostos que podem ativar, imitar, bloquear, inibir, modular e/ou intensificar a atividade de um receptor olfativo.

[00153] Como exemplo, os neurônios olfativos ativados pelo agonista alvo, por exemplo, almíscar ou compostos florais, são isolados com o uso de um microeletrodo de vidro fixado a um micromanipulador ou a uma máquina FACS. Os neurônios sensoriais olfativos de camundongo são rastreados por imaginologia de Ca2 + semelhantes aos procedimentos descritos anteriormente [Malnic, B., et al. Cell 96, 713 a 723 (1999); Araneda, R. C. et al. J. Physiol. 555, 743 a 756 (2004); e documento nº WO2014/210585 incorporado em sua totalidade ao presente documento a título de referência]. Particularmente, um estágio de microscópio móvel motorizado é usado para aumentar o número de células que podem ser triadas para pelo menos 1.500 por experimento. Visto que há aproximadamente 1.200 receptores olfativos diferentes no camundongo e cada neurônio sensorial olfativo expressa apenas 1 de 1.200 genes receptores olfativos, essa capacidade de triagem abrangerá virtualmente todo o repertório de receptor de odorante de camundongo. Em outras palavras, a combinação de imaginologia de cálcio para triagem de neurônio sensorial olfativo de alta produtividade leva à identificação de quase todos os receptores de odorante que respondem a um perfil particular de odorantes. Em um aspecto particular, os receptores de odorante que respondem ao agonista alvo, por exemplo, almíscar ou compostos florais, podem ser isolados. Por exemplo, pelo menos um neurônio é isolado.

[00154] Para imaginologia de cálcio de neurônios olfativos, o principal epitélio olfativo pode ser dissecado de um camundongo antes de dissociação neuronal. O epitélio olfativo dissecado pode, então, ser transferido para um tampão de dissociação para dissociação mecânica e enzimática. Os neurônios dissociados podem, então, ser semeados sobre uma lamínula que permite a triagem de milhares de células por microscopia de fluorescência e as células podem ser carregadas com um corante sensível a cálcio (Fura-2 AM), por exemplo, por cerca de 30 minutos a 31 °C e transferidas para o microscópio pronto para triagem. As células são estimuladas espalhando-se soluções diluídas de odorantes (em solução salina fisiológica) sobre os neurônios olfativos dissociados. As células raras que respondem ao composto de mau odor são identificadas, por exemplo, estimulando-se os receptores com 50 μm dos compostos de mau odor e, então, monitorando-se o fluxo de Ca2+ intracelular indicado por mudanças em fluorescência Fura-2. Após análise, as células respondentes podem ser recuperadas de uma lamínula de vidro com uma micropipeta de sucção. As células isoladas são, então, agrupadas em uma amostra ou tratadas individualmente para identificação subsequente dos genes receptores de odorante expressos como mRNA nas células respondentes.

[00155] Em uma modalidade particular, os mRNAs de neurônios olfativos são purificados e amplificados de acordo com o método geralmente descrito em Marko, N. F., et al, (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi:10.1186/1471-2164-6-27 (método Eberwine). Pelo menos uma porção do transcriptoma (até incluir todo o transcriptoma) é sequenciada com o uso de tecnologias de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) ou hibridizada para genes conhecidos com o uso de tecnologias de Microarranjo. NGS é, em geral, discutido e descrito em Metzker, M. L. Nat. Rev. Genet. 11, 31 a 46 (2010). Em uma modalidade particular, um mínimo de 5 neurônios que apresentam o mesmo perfil de resposta é agrupado. Os mRNAs são liberados por lise celular imediatamente após coleta; nenhuma etapa de DNAse e purificação são realizadas. Os mRNAs são amplificados por duas rodadas consecutivas de transcrição in vitro (IVT). A amplificação pode ser feita de acordo com kit MesageAmpII aRNA (Ambion, AMA1751) com os seguintes parâmetros: duas rodadas de IVT de 14 horas de duração consecutivas.

[00156] Em uma modalidade adicional, o mRNA de um neurônio olfativo único é purificado e amplificado com métodos com base em LD-PCR (Reação em Cadeia de Polimerase de Longa Distância), como o descrito em kits prontos de NGS (por exemplo, Clontech/Takara, Kit SMARTer® Ultra® Low Input RNA para Sequenciamento - v3, cat. 634848) para sequenciamento de próxima geração (NGS). O mRNA de célula única é primeiro transcrito de modo reverso no cDNA correspondente, o qual é subsequentemente amplificado com 18 ciclos de PCR e serve como amostra de NGS para sequenciamento de transcriptoma.

[00157] Em ainda outra modalidade, a identidade de um grupo ou família de genes de receptores olfativos para o agonista alvo, por exemplo, almíscar ou compostos florais, é determinada (por exemplo, até o número de neurônios escolhidos) comparando-se os resultados das leituras de NGS obtidas dos neurônios sensoriais olfativos ativados isolados para uma sequência genômica de referência da mesma espécie. Particularmente, os receptores putativos para o agonista alvo, por exemplo, almíscar ou compostos florais, será o mRNA do receptor olfativo mais altamente abundante na amostra de NGS derivada de neurônio olfativo ou presente em mais de uma réplica biológica independente. Devido à natureza combinatória do código olfativo (um composto ativa muitos ORs e um OR pode ser ativado por muitos compostos), agrupar diversos neurônios ativados por dados compostos permite a recuperação de virtualmente todos os receptores responsáveis pela percepção dessas moléculas em um único experimento de NGS. Agrupar neurônios funcionalmente similares melhora muito, desse modo, a produtividade de e velocidade desorfanização.

[00158] Ferramentas de bioinformática padrão são então usadas para identificar o receptor (ou receptores) de odorante humanos mais intimamente relacionado a outro receptor (ou receptores) de mamíferos (não humanos) putativos para o agonista alvo, por exemplo, almíscar ou compostos florais, sob a suposição de que os receptores de sequência homóloga mantêm função semelhante. Diversos métodos identificam de modo bem-sucedido os pares de ligante OR com base nesta suposição [Armelin-Correa e Malnic (2017)] e até 80% de ortólogos de camundongo-humano parecem manter perfis de resposta funcionais similares [Adipietro, K. A, et al. PLoS Genet. 8, e1002821 a e1002821 (2012)]. Os parâmetros padrão de algoritmo BLASTP e/ou BLASTN, ou outros algoritmos de identificação de par de ortólogos, como InParanoid podem ser usados.

[00159] Os receptores mamíferos humanos ou não humanos para o agonista alvo, por exemplo, almíscar ou compostos florais, podem ser adaptados a um ensaio funcional que pode ser usado para identificar compostos que se ligam, suprimem, bloqueiam, inibem e/ou modulam a atividade dos receptores olfativos. Em particular, o ensaio pode ser um ensaio com base em célula ou um ensaio de ligação e o método para identificar compostos pode ser um ensaio de triagem de alta produtividade. Mais particularmente, no presente documento são fornecidos ensaios com base em receptor adaptáveis para triagem de alto rendimento de receptores com bibliotecas de compostos para a descoberta de compostos moduladores alostéricos positivos para o agonista de interesse particular.

[00160] Em uma modalidade, as sequências gênicas receptoras do agonista alvo (por exemplo, almíscar ou floral) são identificadas a partir das células sensíveis ao agonista alvo como se segue: Neurônios agrupados são aquecidos a 75 °C por 10 minutos para romper a membrana celular e tornar seu mRNA disponível para amplificação. Essa etapa de amplificação é importante durante a aplicação de tecnologias de NGS com quantidade limitada de material inicial, tipicamente entre 1 a 15 células. Uma amplificação linear de acordo com o método Eberwine (IVT) garante a conservação dos níveis de transcrição relativos de genes expressos. Duas rodadas consecutivas de um dia para o outro (14 h) de transcrição in vitro são usadas para proporcionar quantidades suficientes de cRNA; cRNA amplificado é, então, usado para gerar uma biblioteca de cDNA Illumina HiSeq. As sequências curtas resultantes de tipicamente 75 a 150 pares- base (comumente denominados "leituras") são alinhadas contra o genoma de referência do camundongo (tal como versão UCSC mm 9 ou mm 10) a fim de construir o transcriptoma inteiro dessas células. A análise quantitativa dos dados de transcriptoma proporciona uma lista de genes receptores odorantes transcritos e seus respectivos níveis de expressão. Os genes receptores de odorante que mostram os níveis mais abundantes de mRNA ("leituras" mais abundantes) ou estão presentes em mais do que um experimento de replicação são considerados receptores agonistas alvo putativos.

[00161] Os genes OR de camundongo previstos são, então, usados para extrair as últimas versões tanto dos bancos de dados de genoma de camundongo quanto humano a fim de identificar os receptores mais estritamente relacionados (isto é, similaridade de sequência mais alta) em camundongo (genes parálogos) e em humano (genes ortólogos). Esse processo pode ser realizado com o uso do algoritmo de pesquisa BLAST (publicamente disponível na página da web de NCBI), uma ferramenta de pesquisa de similaridade de sequência, em que cada sequência de gene putativo previamente obtida da análise de transcriptoma inicial é usada como uma sequência de consulta. Os genes recém-identificados desse processo de extração de dados são considerados como receptores de almíscar ou floral potenciais sob a suposição de que genes parálogos e ortólogos são altamente propensos de terem atividades similares. Em uma modalidade particular, comparação em par de homologias de sequência é realizada para identificar receptores estritamente relacionados em camundongo e humanos e os receptores são identificados conforme descrito no documento nº WO2014/210585. Outras abordagens também podem ser usadas, tais como abordagens RT-PCR e de microarray ou espectrometria de massa.

[00162] Em uma modalidade adicional, para completar o processo de desorfanização, os ou genes OR candidatos são expressos adicionalmente in vitro para confirmação de atividade contra os compostos usados para isolar os neurônios sensoriais olfativos e outros compostos de interesse estruturalmente relacionados. Os receptores de camundongo identificados de neurônios olfativos isolados que respondem ao agonista alvo (por exemplo, almíscar ou compostos florais) em seu terminal N com sequências curtas de polipeptídeos (por exemplo, FLAG® (SEQ ID NO: 10), Rho (SEQ ID NO: 12; 20 primeiros aminoácidos do receptor de rodopsina bovino), e/ou marcadores Lucy (SEQ ID NO: 14; (sequência de peptídeo sinal rico em leucina clivável)), transitoriamente expressos em células HEK 293T e estimulados separadamente com o agonista alvo (por exemplo, almíscar ou compostos florais) para confirmar sua identidade como receptores de boa-fé do agonista alvo específico. Em uma modalidade adicional, um gene RTP1 também pode ser expresso nas linhas celulares, seja através de ativação do gene endógeno RTP1, como descrito no documento WO 2016201153 A1, ou através de transformação ou transdução viral. A coexpressão da subunidade alfa G humana Gαolf nesse ensaio com base em célula ativa a via de transdução Gs que leva a um aumento de cAMP interno mediante ligação ao ligante apropriado. Alternativamente, a coexpressão da subunidade alfa G humana Gα15 no ensaio com base em célula ativa a via de transdução Gq que leva a um aumento de Ca2+ interno mediante ligação ao ligante apropriado. O processo acima e os resultados obtidos até agora servem para validar o processo para identificação rápida e confiável de receptores de odorante de mamíferos para o agonista alvo.

[00163] São fornecidos adicionalmente ensaios para identificar compostos que são moduladores alostéricos positivos do agonista alvo com base no uso do par agonista-receptor alvo particular. Em uma modalidade adicional é fornecido neste documento um composto modulador alostérico positivo que se liga a um sítio no receptor olfativo diferente do sítio em que o agonista se liga e melhora a atividade de pelo menos um receptor olfativo selecionado do grupo que consiste em OR5AN1, OR10J5, Olfr1440 ou Olfr16, e que é identificado pelos métodos descritos no presente documento, por exemplo, os compostos descritos no presente documento abaixo.

[00164] Em uma modalidade, a atividade do composto é determinada comparando-se a sua ligação em combinação com o agonista alvo com a do agonista alvo isolado e com a do composto isolado.

[00165] Em uma modalidade adicional, um composto é contatado a um receptor, ou uma quimera ou fragmento em combinação com o agonista alvo, em que o receptor, ou uma quimera ou fragmento do mesmo é expresso em uma célula que é modificada de forma recombinante para expressar o polipéptido receptor.

[00166] A atividade do composto pode ser determinada com o uso de sistemas de triagem in vivo, ex vivo, in vitro e sintéticos.

[00167] Em outra modalidade, o contato é realizado com lipossomos ou membranas germinativas induzidas por vírus que contêm os polipeptídeos descritos no presente documento.

[00168] Em outra modalidade, os métodos para identificar compostos que ligam, suprimem, bloqueiam, inibem e/ou modulam a atividade de um receptor olfativo específico para o agonista alvo podem ser realizados em células intactas ou em uma fração de membrana de células que expressam os polipeptídeos descritos no presente documento.

[00169] Em uma modalidade, as ORs descritas no presente documento estão envolvidas na percepção do agonista alvo particular, por exemplo, almíscar ou compostos de muguet floral, e constituem receptores candidatos valiosos para a identificação de compostos moduladores alostéricos positivos que intensificam a percepção do agonista alvo particular quando em combinação com o agonista alvo.

POLIPEPTÍDEOS APLICÁVEIS DE ACORDO COM A INVENÇÃO

[00170] A presente invenção se refere a "equivalentes funcionais" ou "análogos" ou "mutações funcionais" dos polipeptídeos especificamente descritos no presente documento.

[00171] Por exemplo, "equivalentes funcionais" se referem a polipeptídeos que, em um teste usado para atividade de OR, exibem pelo menos uma atividade de OR 1 a 10% ou pelo menos 20% ou pelo menos 50% ou pelo menos 75% ou pelo menos 90% maior ou menor, conforme definido no presente documento.

[00172] "Equivalentes funcionais", de acordo com a invenção, também abrangem mutantes específicos que, em pelo menos uma posição de sequência das sequências de aminoácidos indicadas no presente documento, têm um aminoácido que é diferente do indicado concretamente, mas, no entanto, possuem uma das atividades biológicas mencionadas acima. "Equivalentes funcionais" compreendem, portanto, os mutantes obteníveis por uma ou mais, como 1 a 20, 1 a 15 ou 5 a 10 adições, substituições, em particular substituições conservadoras, remoções e/ou inversões de aminoácidos, em que as alterações indicadas podem ocorrer em qualquer posição de sequência, desde que as mesmas levem a um mutante com o perfil de propriedades de acordo com a invenção. A equivalência funcional também é fornecida, em particular, se os padrões de atividade coincidirem qualitativamente entre o polipeptídeo mutante e o inalterado, ou seja, se, por exemplo, interação com o mesmo agonista ou antagonista, no entanto, em uma taxa diferente (ou seja, expressa por um valor de EC50 ou IC50 ou qualquer outro parâmetro adequado no presente campo técnico) for observada. Exemplos de substituições de aminoácidos adequadas (conservadoras) são mostrados na tabela a seguir: Resíduo original Exemplos de substituição Ala Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn; Gln Ile Leu; Val Leu Ile; Val Lys Arg; Gln; Glu Met Leu; Ile Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val Ile; Leu

[00173] "Equivalentes funcionais" no sentido acima também são "precursores" dos polipeptídeos descritos, bem como "derivados funcionais" e "sais" dos polipeptídeos.

[00174] "Precursores" são, nesse caso, precursores naturais ou sintéticos dos polipeptídeos com ou sem a atividade biológica desejada.

[00175] A expressão "sais" significa sais de grupos carboxila, bem como sais de adição ácida de grupos amino das moléculas de proteína, de acordo com a invenção. Os sais de grupos carboxila podem ser produzidos de uma maneira conhecida e compreendem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio,

amônio, ferro e zinco e sais com bases orgânicas, por exemplo aminas, tais como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina e similares. Sais de adição ácida, por exemplo, sais com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico e sais com ácidos orgânicos, tais como ácido acético e ácido oxálico, também são cobertos pela invenção.

[00176] "Derivados funcionais" de polipeptídeos, de acordo com a invenção, também podem ser produzidos em grupos laterais de aminoácidos funcionais ou em sua extremidade terminal N ou terminal C com o uso de técnicas conhecidas. Tais derivados compreendem, por exemplo, grupos de ésteres alifáticos de ácido carboxílico, grupos de amidas de ácido carboxílico, obtidos por reação com amônia ou com uma amina primária ou secundária; derivados N-acila de grupos amino livres, produzidos por reação com grupos acila; ou derivados O-acila de grupos hidroxila livres, produzidos por reação com grupos acila.

[00177] "Equivalentes funcionais" naturalmente também compreendem polipeptídeos que podem ser obtidos de outros organismos, bem como variantes que ocorrem naturalmente. Por exemplo, áreas de regiões de sequência homólogas podem ser estabelecidas por comparação de sequência e polipeptídeos equivalentes podem ser determinados com base nos parâmetros concretos da invenção.

[00178] "Equivalentes funcionais" também compreendem fragmentos, de preferência domínios individuais ou motivos de sequência, dos polipeptídeos, de acordo com a invenção, que, por exemplo, exibem a função biológica desejada.

[00179] "Equivalentes funcionais" são, além disso, proteínas de fusão, que têm uma das sequências polipeptídicas indicadas no presente documento ou equivalentes funcionais derivados das mesmas e pelo menos uma sequência heteróloga funcionalmente diferente, adicional na associação a terminal N ou terminal C funcional (ou seja, sem prejuízo funcional mútuo substancial das partes da proteína de fusão). Exemplos não limitantes dessas sequências heterólogas são, por exemplo, peptídeos sinalizadores, âncoras de histidina ou enzimas.

[00180] "Equivalentes funcionais", que também são compreendidos de acordo com a invenção, são homólogos dos polipeptídeos revelados especificamente.

Esses têm pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 75%, em particular pelo menos 80 ou 85%, tal como, por exemplo, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de homologia (ou identidade) com uma das sequências de aminoácidos reveladas especificamente, calculadas pelo algoritmo de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (EUA) 85(8), 1988, 2444 a 2448. Uma homologia ou identidade, expressa como uma porcentagem, de um polipeptídeo homólogo de acordo com a invenção significa em particular uma identidade, expressa como uma porcentagem, dos resíduos de aminoácido com base no comprimento total de uma das sequências de aminoácido descritas especificamente no presente documento.

[00181] Os dados de identidade, expressos em porcentagem, também podem ser determinados com o auxílio de alinhamentos BLAST, algoritmo blastp (proteína-proteína BLAST) ou aplicando-se as configurações de Clustal especificadas doravante.

[00182] No caso de uma possível glicosilação de proteína, "equivalentes funcionais" de acordo com a invenção compreendem polipeptídeos, como descrito no presente documento na forma desglicosilada ou glicosilada, bem como nas formas modificadas que podem ser obtidas alterando-se o padrão de glicosilação.

[00183] Tais equivalentes ou homólogos funcionais dos polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser produzidos por mutagênese, por exemplo, por mutação pontual, alongamento ou encurtamento da proteína ou como descrito em mais detalhes abaixo.

[00184] Tais equivalentes ou homólogos funcionais dos polipeptídeos, de acordo com a invenção, podem ser identificados por triagem de bancos de dados combinatórios de mutantes, por exemplo, encurtando mutantes. Por exemplo, um banco de dados variegado de variantes de proteínas pode ser produzido por mutagênese combinatória no nível de ácido nucleico, por exemplo, por ligação enzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos. Existem muitos métodos que podem ser utilizados para a produção de bancos de dados de homólogos potenciais a partir de uma sequência oligonucleotídica degenerada. A síntese química de uma sequência genética degenerada pode ser realizada em um sintetizador de DNA automático, e o gene sintético pode, então, ser ligado em um vetor de expressão adequado. O uso de um genoma degenerado torna possível fornecer todas as sequências em uma mistura, que codificam o conjunto desejado de sequências de proteínas possíveis. Métodos de síntese de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos por uma pessoa versada na técnica (por exemplo, Narang, SA (1983); Itakura et al. (1984) (a); Itakura et al., (1984) (b); Ike et al. (1983)). A geração de polipeptídeos com sequências de ácido nucleico otimizadas para códons, isto é, adaptadas à frequência de uso de códons da célula hospedeira, também são cobertas por este método.

[00185] Diversas técnicas são conhecidas para a triagem de produtos gênicos de bancos de dados combinatórios, que foram produzidos por mutações pontuais ou encurtamentos, e para a triagem de bibliotecas de cDNA para produtos gênicos com uma propriedade selecionada. Essas técnicas podem ser adaptadas para a triagem rápida dos bancos de genes que foram produzidos por mutagênese combinatória de homólogos, de acordo com a invenção. As técnicas usadas mais frequentemente para a triagem de grandes bancos de genes, que têm como base uma análise de alto rendimento, compreendem a clonagem do banco de genes em vetores de expressão que podem ser replicados, transformação das células adequadas com o banco de dados vetorial resultante e expressão dos genes combinatórios em condições nas quais a detecção da atividade desejada facilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese do Conjunto Recursivo (REM), uma técnica que aumenta a frequência de mutantes funcionais nos bancos de dados, pode ser usada em combinação com os testes de triagem, a fim de identificar homólogos (Arkin e Yourvan (1992); Delgrave et al. (1993)).

SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICADORAS APLICÁVEIS DE ACORDO COM A INVENÇÃO

[00186] A invenção também se refere a sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, como definido no presente documento.

[00187] A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos com um certo grau de "identidade" com as sequências reveladas especificamente no presente documento. "Identidade" entre dois ácidos nucleicos significa identidade dos nucleotídeos, em cada caso ao longo de todo o comprimento do ácido nucleico.

[00188] Por exemplo, a identidade pode ser calculada por meio do programa Vector NTI Suite 7.1 da empresa Informax (EUA) que emprega o Método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. (1989)) com as seguintes configurações: Parâmetro de alinhamento múltiplo: Penalidade de abertura de lacuna 10 Penalidade de extensão de lacuna 10 Faixa de penalidade de separação de 8 lacuna Penalidade de separação de lacuna desligado % de identidade para atraso de 40 alinhamento Lacunas específicas de resíduo desligado Lacuna de resíduo hidrofílico desligado Pesagem de transição 0 Parâmetro de alinhamento em pares: Algoritmo FAST ligado Tamanho da tupla K 1 Penalidade de lacuna 3 Tamanho da janela 5 Número de melhores diagonais 5

[00189] Alternativamente, a identidade pode ser determinada de acordo com Chenna, et al. (2003), a página da Web: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# e as seguintes configurações: Penalidade de Abertura de Lacuna de 15,0

DNA Penalidade de Extensão de Lacuna de 6,66

DNA Matriz de DNA Identidade Penalidade de Abertura de Lacuna de 10,0 Proteína Penalidade de Extensão de Lacuna de 0,2 Proteína

Matriz de proteínas Gonnet Proteína/DNA ENDGAP -1 Proteína/DNA GAPDIST 4

[00190] Todas as sequências de ácidos nucleicos mencionadas no presente documento (sequências de DNA e RNA de filamento simples e filamento duplo, por exemplo, cDNA e mRNA) podem ser produzidas de uma maneira conhecida por síntese química dos blocos de construção de nucleotídeos, por exemplo, por condensação de fragmento de blocos de construção de ácidos nucleicos complementares sobrepostos individuais da hélice dupla. A síntese química de oligonucleotídeos pode, por exemplo, ser realizada de uma maneira conhecida, pelo método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2ª edição, Wiley Press, Nova York, páginas 896 a 897). O acúmulo de oligonucleotídeos sintéticos e o preenchimento de lacunas por meio do fragmento Klenow da DNA polimerase e reações de ligação, bem como técnicas gerais de clonagem, são descritos em Sambrook et al. (1989), consultar abaixo.

[00191] A invenção também se refere a sequências de ácidos nucleicos (sequências de DNA e RNA de filamento simples e filamento duplo, por exemplo, cDNA e mRNA), que codificam um dos polipeptídeos acima e seus equivalentes funcionais, que podem ser obtidos, por exemplo, com o uso de análogos de nucleotídeos artificiais.

[00192] A invenção se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas, que codificam polipeptídeos de acordo com a invenção ou segmentos biologicamente ativos dos mesmos, e a fragmentos de ácido nucleico, que podem ser utilizados, por exemplo, como sondas ou iniciadores de hibridização para identificar ou amplificar ácidos nucleicos codificadores, de acordo com a invenção.

[00193] As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem, além disso, conter sequências não traduzidas da extremidade 3’ e/ou 5' da região genética codificadora.

[00194] A invenção se refere ainda às moléculas de ácido nucleico que são complementares às sequências de nucleotídeos descritas concretamente ou a um segmento das mesmas.

[00195] As sequências de nucleotídeos, de acordo com a invenção, tornam possível a produção de sondas e iniciadores que podem ser usados para a identificação e/ou clonagem de sequências homólogas em outros tipos e organismos celulares. Tais sondas ou iniciadores compreendem geralmente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições "rigorosas" (consultar abaixo) em pelo menos cerca de 12, preferencialmente pelo menos cerca de 25, por exemplo, cerca de 40, 50 ou 75 nucleotídeos sucessivos de um filamento senso de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção ou de um filamento antissenso correspondente.

[00196] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural do ácido nucleico e pode, além disso, estar substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura, se estiver sendo produzida por técnicas recombinantes, ou pode estar livre de precursores químicos ou outros produtos químicos, se estiver sendo sintetizada quimicamente.

[00197] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser isolada por meio de técnicas padrão de biologia molecular e da informação de sequência fornecida, de acordo com a invenção. Por exemplo, o cDNA pode ser isolado de uma biblioteca de cDNA adequada, com o uso de uma das sequências completas reveladas concretamente ou um segmento da mesma como sonda de hibridização e técnicas de hibridização padrão (como descrito, por exemplo, em Sambrook, (1989)). Além disso, uma molécula de ácido nucleico que compreende uma das sequências reveladas ou um segmento da mesma pode ser isolada pela reação em cadeia da polimerase, com o uso de os iniciadores oligonucleotídicos que foram construídos com base nessa sequência. O ácido nucleico amplificado dessa maneira pode ser clonado em um vetor adequado e pode ser caracterizado por sequenciamento de DNA. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção também podem ser produzidos por métodos padrão de síntese, por exemplo, com o uso de um sintetizador automático de DNA.

[00198] As sequências de ácido nucleico de acordo com a invenção ou seus derivados, homólogos ou partes dessas sequências, podem, por exemplo, ser isoladas por técnicas de hibridização usuais ou pela técnica de PCR de outras bactérias, por exemplo, através de bibliotecas genômicas ou de cDNA. Essas sequências de DNA hibridizam em condições padrão com as sequências de acordo com a invenção.

[00199] "Hibridizar" significa a capacidade de um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo de se ligar a uma sequência quase complementar em condições padrão, enquanto que a ligação não específica não ocorre entre parceiros não complementares nessas condições. Para isso, as sequências podem ser 90 a 100% complementares. A propriedade de sequências complementares de serem capazes de se ligar especificamente uma à outra é utilizada, por exemplo, em Northern Blotting ou Southern Blotting ou na ligação de iniciador em PCR ou RT-PCR.

[00200] Oligonucleotídeos curtos das regiões conservadas são utilizados vantajosamente para hibridização. No entanto, também é possível usar fragmentos mais longos dos ácidos nucleicos, de acordo com a invenção, ou as sequências completas para a hibridização. Essas condições padrão variam dependendo do ácido nucleico usado (oligonucleotídeo, fragmento mais longo ou sequência completa) ou dependendo de qual tipo de ácido nucleico - DNA ou RNA - é usado para hibridização. Por exemplo, as temperaturas de fusão para híbridos DNA:DNA são de aproximadamente 10 ºC inferiores às de híbridos DNA:RNA do mesmo comprimento.

[00201] Por exemplo, dependendo do ácido nucleico específico, condições padrão significam temperaturas entre 42 e 58 °C em uma solução tampão aquosa com uma concentração entre 0,1 e 5 x SSC (1 X SSC = NaCl 0,15 M, NaCl 0,15 M, citrato de sódio 15 mM, pH 7,2 ) ou adicionalmente na presença de formamida a 50%, por exemplo 42 °C em 5 x SSC, formamida a 50%. Vantajosamente, as condições de hibridização para híbridos DNA:DNA são 0,1 x SSC e temperaturas entre cerca de 20 °C e 45 °C, preferencialmente entre cerca de 30 °C e 45 °C. Para híbridos DNA:RNA, as condições de hibridização são vantajosamente 0,1 x SSC e temperaturas entre cerca de 30 °C e 55 °C, preferencialmente entre cerca de 45 °C e 55 °C. Essas temperaturas declaradas para hibridização são exemplos de valores calculados da temperatura de fusão para um ácido nucleico com um comprimento de aproximadamente 100 nucleotídeos e um conteúdo de G + C de 50% na ausência de formamida. As condições experimentais para hibridização de DNA são descritas em livros de genética relevantes, por exemplo, Sambrook et al., 1989, e podem ser calculadas com o uso de fórmulas conhecidas por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, dependendo do comprimento dos ácidos nucleicos, do tipo de híbridos ou do conteúdo de G + C. Uma pessoa versada na técnica pode obter mais informações sobre hibridização nos seguintes livros: Ausubel et al. (eds), (1985), Brown (ed) (1991).

[00202] A "hibridização" pode, em particular, ser realizada sob condições rigorosas. Tais condições de hibridização são, por exemplo, descritas em Sambrook (1989), ou em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1 a 6.3.6.

[00203] Como usado no presente documento, o termo hibridização ou hibridiza sob certas condições se destina a descrever condições para hibridização e lavagens sob as quais sequências de nucleotídeos que são significativamente idênticas ou homólogas umas às outras permanecem ligadas umas às outras. As condições podem ser tais que sequências, que são pelo menos cerca de 70%, como pelo menos cerca de 80% e como pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% idênticas, permaneçam ligadas uma à outra. Definições de condições de hibridização de baixo rigor, moderado e alto rigor são fornecidas no presente documento.

[00204] Condições de hibridização apropriadas podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica com experimentação mínima, como exemplificado em Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, seções 2, 4 e 6). Adicionalmente, condições de rigor são descritas em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, capítulos 7, 9 e 11).

[00205] Como usado no presente documento, condições definidas como de baixo rigor são como se segue. Filtros que contêm DNA são pré-tratados por 6 h a 40 ºC em uma solução que contém formamida a 35%, SSC 5x, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, EDTA 5 mM, PVP a 0,1%, Ficoll a 0,1%, BSA 1% e 500 µg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,2%, 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão, 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano, e sonda identificada com 5-20x106 32P é usada. Os filtros são incubados na mistura de hibridização por 18 a 20 h a 40 ºC e, em seguida, lavados por 1,5 h a 55 ºC. Em uma solução que contêm 2x SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, e SDS a 0,1%. A solução de lavagem é substituída por solução nova e incubada por mais 1,5 h a 60 ºC. Os filtros são secos com papel absorvente e expostos para autorradiografia.

[00206] Como usado no presente documento, condições definidas de moderado rigor são como se segue. Filtros que contêm DNA são pré-tratados por 7 h a 50 ºC em uma solução que contém formamida a 35%, SSC 5x, Tris- HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, EDTA 5 mM, PVP a 0,1%, Ficoll a 0,1%, BSA 1% e 500 µg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,2%, 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão, 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano, e sonda identificada com 5-20x106 32P é usada. Os filtros são incubados na mistura de hibridização por 18 a 20 h a 50 ºC e, em seguida, lavados por 1,5 h a 55 ºC. Em uma solução que contêm 2x SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, e SDS a 0,1%. A solução de lavagem é substituída por solução nova e incubada por mais 1,5 h a 60 ºC. Os filtros são secos com papel absorvente e expostos para autorradiografia.

[00207] Como usado no presente documento, condições definidas de alto rigor são como se segue. Pré-hibridização de filtros que contêm DNA é realizada por 8 h durante a noite a 65 ºC em composto tampão de 6x SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,02% e 500 µg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado Os filtros são hibridizados por 48 h a 65 ºC na mistura de pré-hibridização que contém 100 µg /ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonda identificada com 5-20x106 cpm de 32P. A lavagem de filtros é feita a 37 ºC por 1 h em uma solução que contêm 2x SSC, PVP a 0,01%, Ficoll a 0,01% e BSA a 0,01%. Isso é seguido por uma lavagem em 0,1x SSC a 50 ºC por 45 minutos.

[00208] Outras condições de rigor baixo, moderado e alto, bem conhecidas na técnica (por exemplo, como empregado para hibridizações entre espécies) podem ser usadas se as condições acima forem inadequadas (por exemplo, como empregado para hibridizações entre espécies).

[00209] A invenção também se refere a derivados das sequências de ácidos nucleicos concretamente reveladas ou deriváveis.

[00210] Assim, sequências de ácidos nucleicos adicionais, de acordo com a invenção, podem ser derivadas das sequências reveladas especificamente no presente documento e podem diferir da mesma por adição, substituição, inserção ou exclusão de nucleotídeos individuais ou de vários nucleotídeos e, além disso, codificar polipeptídeos com o perfil desejado de propriedades.

[00211] A invenção também abrange sequências de ácidos nucleicos que compreendem as chamadas mutações silenciosas ou que foram alteradas, em comparação com uma sequência indicada concretamente, de acordo com o uso de códon de um organismo especial original ou hospedeiro, bem como variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas do mesmo.

[00212] A mesma também se refere a sequências que podem ser obtidas por substituições de nucleotídeos conservadoras (isto é, o aminoácido em questão é substituído por um aminoácido da mesma carga, tamanho, polaridade e/ou solubilidade).

[00213] A invenção também se refere às moléculas derivadas dos ácidos nucleicos revelados concretamente por polimorfismos de sequência. Esses polimorfismos genéticos podem existir entre indivíduos dentro de uma população devido a variações naturais. Essas variações naturais geralmente produzem uma variação de 1 a 5% na sequência de nucleotídeos de um gene.

[00214] Derivados de sequências de ácidos nucleicos, de acordo com a invenção, significam, por exemplo, variantes alélicas, que possuem pelo menos 60% de homologia no nível do aminoácido derivado, preferencialmente pelo menos 80% de homologia, muito especialmente de preferência pelo menos 90% de homologia em toda a faixa de sequência (em relação à homologia no nível de aminoácidos, deve-se fazer referência aos detalhes dados acima para os polipeptídeos). Vantajosamente, as homologias podem ser maiores em regiões parciais das sequências.

[00215] Além disso, os derivados também devem ser entendidos como homólogos das sequências de ácidos nucleicos, de acordo com a invenção, por exemplo, homólogos de animais, plantas, fungos ou bactérias, sequências encurtadas, DNA ou RNA de filamento simples da sequência de DNA codificante e não codificante. Por exemplo, os homólogos têm, no nível de DNA, uma homologia de pelo menos 40%, de preferência de pelo menos 60%, especialmente de preferência de pelo menos 70%, muito especialmente de preferência de pelo menos 80% em toda a região de DNA dada em uma sequência especificamente revelada no presente documento.

[00216] Além disso, os derivados devem ser entendidos como sendo, por exemplo, fusões com promotores. Os promotores que são adicionados às sequências de nucleotídeos indicadas podem ser modificados por pelo menos uma troca de nucleotídeos, pelo menos uma inserção, inversão e/ou exclusão, embora sem prejudicar a funcionalidade ou eficácia dos promotores. Além disso, a eficácia dos promotores pode ser aumentada alterando-se sua sequência ou pode ser trocada completamente com promotores mais eficazes, mesmo de organismos de um gênero diferente.

GERAÇÃO DE MUTANTES POLIPEPTÍDICOS FUNCIONAIS

[00217] Além disso, uma pessoa versada na técnica está familiarizada com os métodos para gerar mutantes funcionais, isto é, sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86, %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID NO. 2, 4, 6, ou 8; e/ou codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.

[00218] Dependendo da técnica utilizada, uma pessoa versada na técnica pode introduzir mutações inteiramente aleatórias ou mais direcionadas nos genes ou em regiões de ácidos nucleicos não codificantes (que são, por exemplo, importantes para regular a expressão) e subsequentemente gerar bibliotecas genéticas. Os métodos de biologia molecular exigidos para esse fim são conhecidos do especialista e, por exemplo, descritos em Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press

2001.

[00219] Métodos para modificar genes e, portanto, para modificar o polipeptídeo codificado por os mesmos são conhecidos há muito tempo pelo especialista, tais como, por exemplo, - mutagênese de sítio específico, em que nucleotídeos individuais ou vários nucleotídeos de um gene são substituídos de maneira direcionada (Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), - mutagênese de saturação, na qual um códon para qualquer aminoácido pode ser trocado ou adicionado em qualquer ponto de um gene (Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcárel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1), - reação em cadeia de polimerase propensa a erros, em que as sequências de nucleotídeos são mutadas por polimerases de DNA propensas a erros (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739); - o método SeSaM (método de saturação de sequência), no qual as trocas preferenciais são impedidas pela polimerase. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277 a 279 - passagem de genes em cepas mutadoras, em que, por exemplo, devido a mecanismos defeituosos de reparo do DNA, há um aumento da taxa de mutação de sequências de nucleotídeos (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), ou - embaralhamento de DNA, em que um conjunto de genes intimamente relacionados é formado e digerido e os fragmentos são usados como modelos para uma reação em cadeia da polimerase, na qual, por repetidas separações e reassociações de filamentos, são gerados genes mosaicos completos (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci EUA 91:10747).

[00220] O uso da chamada evolução dirigida (descrita, entre outros, em Reetz MT e Jaeger KE (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial polypeptides by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology), um especialista pode produzir mutantes funcionais de maneira direcionada e em larga escala. Para esse fim, em uma primeira etapa, as bibliotecas de genes dos respectivos polipeptídeos são primeiramente produzidas, por exemplo, com o uso dos métodos apresentados acima. As bibliotecas de genes são expressas de uma maneira adequada, por exemplo, por bactérias ou por sistemas de exibição de fagos.

[00221] Os genes relevantes de organismos hospedeiros que expressam mutantes funcionais com propriedades que correspondem amplamente às propriedades desejadas podem ser submetidos a outro ciclo de mutação. As etapas da mutação e seleção ou triagem podem ser repetidas iterativamente até que os presentes mutantes funcionais tenham as propriedades desejadas em uma extensão suficiente. Com o uso desse procedimento iterativo, um número limitado de mutações, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5, pode ser realizado em estágios e avaliado e selecionado por sua influência na atividade em questão. O mutante selecionado pode então ser submetido a uma etapa de mutação adicional da mesma maneira. Dessa forma, o número de mutantes individuais a serem investigados pode ser reduzido significativamente.

[00222] Os resultados de acordo com a invenção também fornecem informações importantes relacionadas à estrutura e sequência dos polipeptídeos relevantes, que são necessárias para gerar, de uma maneira direcionada, outros polipeptídeos com propriedades modificadas desejadas. Em particular, é possível definir os chamados "lugares perfeitos", isto é, segmentos de sequência potencialmente adequados para modificar uma propriedade através da introdução de mutações direcionadas.

[00223] Também é possível deduzir informações sobre as posições de sequência de aminoácidos, na região em que podem ser efetuadas mutações que provavelmente devem ter pouco efeito sobre a atividade e podem ser designadas como potenciais “mutações silenciosas”.

CONSTRUTOS PARA A PREPARAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

[00224] A sequência de nucleotídeos como descrita acima pode ser parte de um cassete de expressão. Os termos cassete de expressão e construto de expressão são usados como sinônimos. O construto de expressão recombinante preferencial contém uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção e que está sob controle genético de sequências de ácidos nucleicos reguladoras.

[00225] Em um processo aplicado, de acordo com a invenção, o cassete de expressão pode ser parte de um vetor de expressão, em particular de um vetor de expressão recombinante.

[00226] Uma "unidade de expressão" é entendida como significando, de acordo com a invenção, um ácido nucleico com atividade de expressão que compreende um promotor como definido no presente documento e, após ligação funcional com um ácido nucleico a ser expresso ou um gene, regula a expressão, ou seja, a transcrição e a tradução do dito ácido nucleico ou do dito gene. Portanto, neste contexto, também é denominada como "sequência de ácidos nucleicos reguladora". Além do promotor, outros elementos reguladores, por exemplo, intensificadores, também podem estar presentes.

[00227] Um "cassete de expressão" ou "construto de expressão" é entendido como significando, de acordo com a invenção, uma unidade de expressão que está funcionalmente ligada ao ácido nucleico a ser expresso ou ao gene a ser expresso. Em contraste com uma unidade de expressão, um cassete de expressão compreende, portanto, não apenas sequências de ácidos nucleicos que regulam a transcrição e tradução, mas também as sequências de ácidos nucleicos que devem ser expressas como proteína como resultado da transcrição e tradução.

[00228] Os termos "expressão" ou "superexpressão" descrevem, no contexto da invenção, a produção ou aumento da atividade intracelular de um ou mais polipeptídeos em um micro-organismo, que são codificados pelo DNA correspondente. Para esse fim, é possível, por exemplo, introduzir um gene em um organismo, substituir um gene existente por outro, aumentar o número de cópias do gene (ou genes), usar um promotor forte ou usar um gene que codifique um polipeptídeo correspondente com alta atividade; opcionalmente, essas medidas podem ser combinadas.

[00229] De preferência, tais construtos, de acordo com a invenção, compreendem um promotor 5’ a montante da respectiva sequência de codificação e uma sequência terminadora 3' a jusante e, opcionalmente, outros elementos reguladores usuais, em cada caso em ligação operacional com a sequência de codificação.

[00230] Um "promotor", um "ácido nucleico com atividade promotora" ou uma "sequência promotora" é entendido como significando, de acordo com a invenção, um ácido nucleico que, quando ligado funcionalmente a um ácido nucleico a ser transcrito, regula a transcrição do dito ácido nucleico.

[00231] Nesse contexto, uma ligação "funcional" ou "operativa" é entendida como significando, por exemplo, o arranjo sequencial de um dos ácidos nucleicos com atividade promotora e de uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e, opcionalmente, outros elementos reguladores, por exemplo, sequências de ácidos nucleicos que asseguram a transcrição de ácidos nucleicos e, por exemplo, um terminador, de modo que cada um dos elementos reguladores possa desempenhar sua função após a transcrição da sequência de ácidos nucleicos. Isso não exige necessariamente uma ligação direta no sentido químico. Sequências de controle genético, por exemplo, sequências intensificadoras, podem até exercer sua função na sequência alvo de posições mais remotas ou mesmo de outras moléculas de DNA. Arranjos preferenciais são aqueles em que a sequência de ácidos nucleicos a ser transcrita é posicionada atrás (ou seja, na extremidade 3') da sequência promotora, de modo que as duas sequências sejam unidas de modo covalente. A distância entre a sequência promotora e a sequência de ácido nucleico a ser expressa de modo recombinante pode ser menor que 200 pares de bases, ou menor que 100 pares de bases ou menor que 50 pares de bases.

[00232] Além de promotores e terminadores, os seguintes podem ser mencionados como exemplos de outros elementos reguladores: sequências de direcionamento, intensificadores, sinais de poliadenilação, marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e similares.

Sequências reguladoras adequadas são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

[00233] Os construtos de ácido nucleico de acordo com a invenção compreendem, em particular, uma sequência que codifica um polipeptídeo, por exemplo, derivado da SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7, ou o complemento inverso do mesmo ou derivados e homólogos do mesmo, e as sequências de ácidos nucleicos que podem ser derivadas do mesmo e que foram ligadas operacional ou funcionalmente com um ou mais sinais reguladores, vantajosamente para controlar, por exemplo, aumento de expressão gênica.

[00234] Além dessas sequências reguladoras, a regulação natural dessas sequências ainda pode estar presente antes dos genes estruturais reais e, opcionalmente, pode ter sido geneticamente modificada para que a regulação natural tenha sido desativada e a expressão dos genes tenha sido intensificada. O construto de ácido nucleico também pode, no entanto, ser de construção mais simples, isto é, nenhum sinal regulador adicional ter sido inserido antes da sequência de codificação e o promotor natural, com sua regulação, não ter sido removido. Em vez disso, a sequência reguladora natural é mutada, de modo que a regulação não ocorra mais e a expressão gênica seja aumentada.

[00235] Um construto de ácido nucleico preferido também compreende vantajosamente uma ou mais das sequências "intensificadoras" já mencionadas em ligação funcional com o promotor, sequências estas que tornam possível uma expressão intensificada da sequência de ácidos nucleicos. Sequências vantajosas adicionais também podem ser inseridas na extremidade 3’ das sequências de DNA, tais como outros elementos reguladores ou terminadores. Uma ou mais cópias dos ácidos nucleicos, de acordo com a invenção, podem estar presentes em um construto. No construto, outros marcadores, tais como genes que complementam auxotrofismos ou resistências a antibióticos, também podem estar opcionalmente presentes, de modo a selecionar o construto.

[00236] Exemplos de sequências reguladoras adequadas estão presentes em promotores tais como cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD )SP6, lambda-PR ou no promotor lambda-PL, e estes são vantajosamente empregados em bactérias Gram-negativa Sequências reguladoras vantajosas adicionais estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivos amy e SPO2, nos promotores de leveduras ou fungos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Promotores artificiais também podem ser usados para regulação.

[00237] Para expressão em um organismo hospedeiro, o construto de ácido nucleico é inserido vantajosamente em um vetor tal como, por exemplo, um plasmídeo ou um fago, que possibilita a expressão ótima dos genes no hospedeiro. Os vetores também são entendidos como significando, além de plasmídeos e fagos, todos os outros vetores que são conhecidos pelo especialista, ou seja, por exemplo, vírus tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transposons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos e DNA linear ou circular. Esses vetores são capazes de se replicar de modo autônomo no organismo hospedeiro ou de modo cromossômico. Esses vetores são um desenvolvimento adicional da invenção.

[00238] Plasmídeos adequados estão, por exemplo, em E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 ou pBdCI, em Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, em Bacillus pUB110, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALS1, pIL2 ou pBB116, em leveduras 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 ou pEMBLYe23 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Os plasmídeos mencionados acima são uma pequena seleção dos plasmídeos que são possíveis. Plasmídeos adicionais são bem conhecidos do especialista e podem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdã-Nova York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

[00239] Em um desenvolvimento adicional do vetor, o vetor que compreende o construto de ácido nucleico, de acordo com a invenção, ou o ácido nucleico, de acordo com a invenção, também pode ser introduzido vantajosamente nos micro-organismos na forma de um DNA linear e integrado ao genoma do organismo hospedeiro por meio de recombinação heteróloga ou homóloga. Esse DNA linear pode consistir em um vector linearizado tal como um plasmídeo ou apenas o construto de ácido nucleico ou o ácido nucleico, de acordo com a invenção.

[00240] Para uma expressão ótima de genes heterólogos em organismos, é vantajoso modificar as sequências de ácidos nucleicos para corresponder ao “uso de códon” específico usado no organismo. O "uso de códon" pode ser determinado facilmente por avaliações de computador de outros genes conhecidos do organismo em questão.

[00241] Um cassete de expressão, de acordo com a invenção, é gerado fundindo-se um promotor adequado a uma sequência de nucleotídeos de codificação adequada e um sinal terminador ou de poliadenilação. As técnicas habituais de recombinação e clonagem são utilizadas para esse fim, conforme descrito, por exemplo, em T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e em T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987).

[00242] Para expressão em um organismo hospedeiro adequado, a construção de ácido nucleico recombinante ou construção de gene é vantajosamente inserida em um vetor específico do hospedeiro que possibilita a expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores são bem conhecidos do especialista e podem ser encontrados, por exemplo, em "vetores de clonagem" (Pouwels PH et al., Ed. Elsevier, Amsterdã-Nova York-Oxford, 1985).

[00243] As sequências de ácidos nucleicos e aminoácido identificadas e/ou usadas no presente documento são listadas abaixo: OR5AN1 Humano Homo sapiens_OR5AN1 Receptor de almíscar SEQ ID NO: 1 - DNA atgactgggggaggaaatattacagaaatcacctatttcatcctgctgggattctcagattttccc aggatcataaaagtgctcttcactatattcctggtgatctacattacatctctggcctggaacctctc cctcattgttttaataaggatggattcccacctccatacacccatgtatttcttcctcagtaacctgtc cttcatagatgtctgctatatcagctccacagtccccaagatgctctccaacctcttacaggaac agcaaactatcacttttgttggttgtattattcagtactttatcttttcaacgatgggactgagtgagtc ttgtctcatgacagccatggcttatgatcgttatgctgccatttgtaaccccctgctctattcatccat catgtcacccaccctctgtgtttggatggtactgggagcctacatgactggcctcactgcttctttat tccaaattggtgctttgcttcaactccacttctgtgggtctaatgtcatcagacatttcttctgtgacat gccccaactgttaatcttgtcctgtactgacactttctttgtacaggtcatgactgctatattaaccat gttctttgggatagcaagtgccctagttatcatgatatcctatggctatattggcatctccatcatga agatcacttcagctaaaggcaggtccaaggcattcaacacctgtgcttctcatctaacagctgttt ccctcttctatacatcaggaatctttgtctatttgagttccagctctggaggttcttcaagctttgaca gatttgcatctgttttctacactgtggtcattcccatgttaaatcccttgatttacagtttgaggaacaa agaaattaaagatgccttaaagaggttgcaaaagagaaagtgctgctgag SEQ ID NO: 2 - Proteína

MTGGGNITEITYFILLGFSDFPRIIKVLFTIFLVIYITSLAWNLSLIVLIRM DSHLHTPMYFFLSNLSFIDVCYISSTVPKMLSNLLQEQQTITFVGCII QYFIFSTMGLSESCLMTAMAYDRYAAICNPLLYSSIMSPTLCVWMV LGAYMTGLTASLFQIGALLQLHFCGSNVIRHFFCDMPQLLILSCTDT FFVQVMTAILTMFFGIASALVIMISYGYIGISIMKITSAKGRSKAFNTC ASHLTAVSLFYTSGIFVYLSSSSGGSSSFDRFASVFYTVVIPMLNPLI

YSLRNKEIKDALKRLQKRKCC OR10J5 Humano Homo sapiens_OR10J5 Receptor de muguet floral SEQ ID NO: 3 - DNA atgaagagaaagaacttcacagaagtgtcagaattcattttcttgggattttctagctttggaaag catcagataaccctctttgtggttttcctaactgtctacattttaactctggttgctaacatcatcattgt gactatcatctgcattgaccatcatctccacactcccatgtatttcttcctaagcatgctggctagtt cagagacggtgtacacactggtcattgtgccacgaatgcttttgagcctcatttttcataaccaac ctatctccttggcaggctgtgctacacaaatgttcttttttgttatcttggccactaataattgcttcctg cttactgcaatggggtatgaccgctatgtggccatctgcagacccctgagatacactgtcatcat gagcaagggactatgtgcccagctggtgtgtgggtcctttggcattggtctgactatggcagttct ccatgtgacagccatgttcaatttgccgttctgtggcacagtggtagaccacttcttttgtgacattt acccagtcatgaaactttcttgcattgataccactatcaatgagataataaattatggtgtaagttc atttgtgatttttgtgcccataggcctgatatttatctcctatgtccttgtcatctcttccatccttcaaatt gcctcagctgagggctggaagaagacctttgccacctgtgtctcccacctcactgtggttattgtc cactgtggctgtgcctccattgcctacctcaagccgaagtcagaaagttcaatagaaaaagac cttgttctctcagtgacgtacaccatcatcactcccttgctgaaccctgttgtttacagtctgagaaa caaggaggtaaaggatgccctatgcagagttgtgggcagaaatatttcttaa SEQ ID NO: 4 - Proteína

MKRKNFTEVSEFIFLGFSSFGKHQITLFVVFLTVYILTLVANIIIVTIICI DHHLHTPMYFFLSMLASSETVYTLVIVPRMLLSLIFHNQPISLAGCA TQMFFFVILATNNCFLLTAMGYDRYVAICRPLRYTVIMSKGLCAQLV CGSFGIGLTMAVLHVTAMFNLPFCGTVVDHFFCDIYPVMKLSCIDTT INEIINYGVSSFVIFVPIGLIFISYVLVISSILQIASAEGWKKTFATCVSH LTVVIVHCGCASIAYLKPKSESSIEKDLVLSVTYTIITPLLNPVVYSLR

NKEVKDALCRVVGRNIS Olfr1440 Camundongo Mus musculus_Olfr1440_ Receptor de almíscar SEQ ID NO: 5 - DNA atgcctggagggaggaatagcacagtcatcaccaagttcatccttgtgggattctcagattttcc aaagctcaagctggttctctttgttatcttcctgggaagttatctctccacagtggtgtggaacttgg gcctcatcatcttgattaggattgacccttacctacacacacctatgtacttcttcctcagcaatttgt catttttagatttctgttacatttcatctacaacccctaaaatgctctcgggattcttccagaagtcta aatctatctcctttgttgggtgcaccatgcagtacttcatcttctcaagcctgggtctgtccgaatgct gccttctggcagccatggcttatgaccggtatgctgccatttgtaatcctcttctctacacagccat catgtccccgtcactctgtgtgcacatggtggttggagcctatagtactggtctcttgggttcattga ttcaactgtgtgctatacttcagctccatttctgtgggccaaatattataaaccatttcttttgtgacct gcctcagctattagttctttcctgctctgaaacctttcccctgcaagtcttgaaatttgtaatagcagt gatttttggggtggcatctgtcattgttatcctgatatcctatggttatatcattggcacaatcctgaat atcagctcagtagaaggtaggtccaaggcattcaatacctgtgcctctcacctgacagcagtca ccctcttttttggatcaggactctttgtctatatgcgccccagctccaacagttcccagggttatgac aagatggcttccgtgttctatacagtggtgattcccatgttgaatcctctgatttatagtctcaggaa caaggaaataaaagatgctcttcagagatgtaaaaataagtgcttttctcagtgccactgttag SEQ ID NO: 6 - Proteína

MPGGRNSTVITKFILVGFSDFPKLKLVLFVIFLGSYLSTVVWNLGLIIL IRIDPYLHTPMYFFLSNLSFLDFCYISSTTPKMLSGFFQKSKSISFVG CTMQYFIFSSLGLSECCLLAAMAYDRYAAICNPLLYTAIMSPSLCVH MVVGAYSTGLLGSLIQLCAILQLHFCGPNIINHFFCDLPQLLVLSCSE TFPLQVLKFVIAVIFGVASVIVILISYGYIIGTILNISSVEGRSKAFNTCA SHLTAVTLFFGSGLFVYMRPSSNSSQGYDKMASVFYTVVIPMLNPL

IYSLRNKEIKDALQRCKNKCFSQCHC Olfr16 Camundongo Mus musculus_Olfr16_ Receptor de muguet floral SEQ ID NO: 7 - DNA Atgcagagaaataacttcactgaagtgatagagttcgtcttcctgggattctccagctttggaaa gcatcagataaccctctttgtggttttcctaaccatctacattttaactctggctggcaacatcattat agtgacaatcacacacatagaccaccaccttcacactcccatgtacttctttctgagcatgttgg caagctcagagactgtgtacacactggtcattgtcccacgaatgctttccagcctgattttttacaa ccttcccatatccttggcaggctgcgcaacccaaatgttcttttttgtcaccttggccaccaacaac tgctttctgctcacagcaatgggttatgatcgttatgtggctatttgtaatcctctgagatatacaatc atcatgagcaagggaatgtgtgccttgttggtttgtgggtctttaggcactggcctggttatggcag ttcttcatgtgccagccatgttccatttgcccttttgtggcacggtggtggagcactttttctgtgacat atacccagtaatgaagctttcttgtgttgataccactgtcaatgagataatcaattatggtgtaagtt catttgtaattcttgtgcccatagggctgatatttatctcctatgtgctcattgtctcttccatccttaaa attgtgtccactgaaggccagaagaaagcctttgccacctgtgcctctcatctcactgtggtcatt gtccactatggctgtgcctccattgcctacctcaaacccaaatcagaaagttcagtagaaaaag accttcttctctctgtgacctacactatcatcactcccttgctgaaccctgttgtctacagcctcagg aacaaagaagtcaaagatgctctatgcagagctgtgggcagaaacacttcttaa SEQ ID NO: 8 - Proteína

MQRNNFTEVIEFVFLGFSSFGKHQITLFVVFLTIYILTLAGNIIIVTITHI DHHLHTPMYFFLSMLASSETVYTLVIVPRMLSSLIFYNLPISLAGCAT QMFFFVTLATNNCFLLTAMGYDRYVAICNPLRYTIIMSKGMCALLVC GSLGTGLVMAVLHVPAMFHLPFCGTVVEHFFCDIYPVMKLSCVDTT VNEIINYGVSSFVILVPIGLIFISYVLIVSSILKIVSTEGQKKAFATCASH LTVVIVHYGCASIAYLKPKSESSVEKDLLLSVTYTIITPLLNPVVYSLR

NKEVKDALCRAVGRNTS Marcador FLAG® SEQ ID NO: 9 - DNA gattacaaggacgacgacgataag

SEQ ID NO: 10 - Proteína

DYKDDDDK Marcador Rho SEQ ID NO: 11 - DNA atgaacgggaccgagggcccaaacttctacgtgcctttctccaacaagacgggcgtggtg SEQ ID NO: 12 - Proteína

MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV Marcador Lucy SEQ ID NO: 13 - DNA atgagaccccagatcctgctgctcctggccctgctgaccctaggcctggct SEQ ID NO: 14 - Proteína

MRPQILLLLALLTLGLA Motivo SEQ ID NO: 15

MAYDRYVAIC Motivo SEQ ID NO: 16

FSTCSSH Motivo SEQ ID NO: 17

PMLNPFIY

[00244] Os exemplos a seguir são ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção conforme estabelecido no Sumário, Descrição ou nas Reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE RECEPTORES DE ODORANTE RELEVANTES PARA O RESULTADO SENSORIAL.

[00245] São escolhidos vários compostos-alvo (por exemplo, ingredientes almiscarados, florais ou amadeirados) de importância para a perfumaria. O método descrito em WO2014/210585 pode ser usado para identificar um subconjunto relativamente pequeno de ORs dentro do repertório inteiro de ORs que existem em um organismo que são ativados ou inibidos especificamente por um ou mais desses compostos. Análises transcriptômicas, tais como abordagens NGS, ou análises proteômicas, tais como espectrometria de massa, representam meios adicionais para identificar ORs ex vivo. Alternativamente, abordagens in vivo, tais como o método DREAM, permitem a desorfanização por OR após a entrega na fase gasosa de compostos voláteis [Von Der Weid B. et al., Nature neuroscience, 18 (10): 1455 a 63 (2015)].

[00246] Os receptores olfativos podem ser avaliados para determinar se o resultado psicofísico (sensorial) da percepção do composto alvo pode ser correlacionado com a atividade induzida pelo composto alvo in vitro. Tais receptores olfativos que aparentemente têm um poder preditivo em relação a resultados sensoriais putativos são escolhidos para triagem adicional para intensificação com base em receptor direcionado ao composto alvo. Alternativamente, são escolhidos receptores olfativos ativados por agonistas particulares de interesse para a perfumaria. O par receptor-agonista alvo particular é utilizado em ensaios ou métodos para rastrear e identificar compostos moduladores alostéricos positivos do agonista alvo. EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE UM RECEPTOR OLFATIVO DE ALMÍSCAR

[00247] Os compostos almíscar muscone, MUSCENONE®, xilol de almíscar e cetona de almíscar formaram um grupo altamente correlacionado em relação aos limiares médios de detecção de odor no nível sensorial. Para testar se a correlação sensorial observada entre os quatro compostos de almíscar estava ligada a uma atividade de receptor de odorante único, a resposta do receptor olfativo OR5AN1 aos compostos de almíscar foi avaliada. Os valores de especificidade e sensibilidade do receptor observados foram comparados com os dados do limiar de detecção de odor psicofísico (sensorial) humano (Figura 1).

[00248] O receptor olfativo OR5AN1 foi ativado especificamente por muscone, MUSCENONE®, xilol de almíscar e cetona de almíscar. No entanto, nenhum dos outros compostos de almíscar testados foi capaz de ativar o receptor olfativo OR5AN1. Consultar a Figura 1a.

[00249] As classificações de atividade observadas do receptor de almíscar (Figura 1a) e psicofísica (Figura 1b) foram as mesmas ao considerar a correlação de Pearson para os valores limiares de detecção de odor médios ou medianos (resultado sensorial) obtidos para os compostos de almíscar com a potência do ligante (valores de EC 50) ou eficácia (abrangência máxima) da atividade do receptor olfativo OR5AN1.

[00250] As medidas psicofísicas mostraram uma forte correlação direta com a CE 50 e uma correlação ainda mais forte com a eficácia (r = 0,87 e r = -0,91, respectivamente) com os limiares de detecção de odor medianos. Valores de correlação semelhantes foram obtidos com os limiares de detecção de odor médios. A sensibilidade tanto a mediana quanto média obtida no nível de grupo seguiram a potência e a classificação de eficácia obtidos in vitro (Tabela 1). TABELA 1. CLASSIFICAÇÃO DE ALMÍSCAR POR POTÊNCIA FARMACOLÓGICA EM OR5AN1 E LIMIAR DE DETECÇÃO PERCEPTIVO. Ordem Abrangência Limiar de Limiar de Odorant de EC50 a b detecção de odor detecção de odor e classifica Log(M) (Razão mediano médio Log(µmol/l Nome ção HTRF) Log(µmol/l ar) ar) Almíscar

1. 2,56e-8 4.312 6,41e-9 6,11e-9 cetona Almíscar

2. 3,57e-7 4.217 1,02e-8 2,20e-8 xilol Musceno

3. 2,01e-6 3.629 1,04e-7 1,26e-7 ne®

4. Muscone 3,29e-6 2.979 1,09e-6 1,21e-6 a: Correlação de Pearson EC50 com Mediana, r = 0,866177 e Média, r = 0,869362 b: Correlação de Pearson Abrangência com Mediana, r = -0,91012 e Média, r = -0,91267

[00251] Em outras palavras, o perfil de ativação do receptor recapitulou completamente os dados psicofísicos e foi suficiente para explicar a correlação sensorial observada entre os compostos de almíscar. Por conseguinte, OR5AN1 representa um bom alvo para a triagem de intensificação com base em receptor direcionado a almíscar. A identificação de receptores sensoriais alvo chave adicionais permite a triagem para intensificação de tonalidades de perfumaria adicionais (por exemplo, almiscarado, floral, amadeirado, marinho). EXEMPLO 3: IDENTIFICAÇÃO DE INTENSIFICADORES DE ATIVIDADE DE OR5AN1 PUTATIVOS.

[00252] Com o uso de um ensaio com base em células, OR5AN1 foi testado em uma linha celular HEK293T em que o gene RTP1 endógeno foi ativado e o receptor de odorante chaperona foi expresso (WO2016/201153 A1). O receptor identificado com Flag-Rho foi cotransfectado com a proteína G canônica olfativa Golf e foi exposto a uma mistura binária de uma concentração única de MUSCENONE® e um composto de teste.

[00253] Uma grande biblioteca de compostos voláteis foi usada para criar misturas binárias de cada composto com MUSCENONE® a ~EC10, uma concentração que suscita apenas ~10% do nível de atividade total do OR5AN1 por si só. Um ensaio com base em células de ativação foi usado para a identificação inicial de candidatos a intensificadores. A atividade de receptor induzida por mistura binária única foi detectada medindo-se o aumento de cAMP no citosol com o uso de um kit com base em HTRF (unidade de Fluorescência Homogênea Resolvida no Tempo) (CisBio, kit cAMP dynamic 2, 62AM4PEJ).

[00254] Foram criadas 481 misturas binárias misturando-se uma solução de reserva de MUSCENONE® com uma solução de reserva de cada composto de teste para uma concentração final de 10 e 500 µM, respectivamente. Soluções de reserva foram feitas de compostos dissolvidos em DMSO puro. Cada mistura foi apresentada a uma linha celular que expressa o receptor olfativo OR5AN1. Na Figura 2, as misturas são representadas por pontos (●), os poços vazios na placa 6 por triângulos (▲). A concentração final de DMSO em cada mistura binária foi de 0,17% e não teve efeito visível nas células.

[00255] A ativação resultante foi então medida e comparada ao MUSCENONE® isolado (definindo a referência do ensaio de intensificação). A qualidade do processo HTS foi determinada e a variabilidade da janela e a confiabilidade do sinal foram avaliadas calculando-se o valor de Z’ de cada placa Foram obtidos vinte acertos, cinco dos quais eram agonistas do receptor olfativo OR5AN1 de cetona e nitro-almíscar macrocíclicos (acertos n° 1, 2, 3, 5 e 9). Consultar a Figura 2 e a Tabela 2. Esses agonistas do receptor olfativo OR5AN1 confirmaram ainda que a faixa dinâmica da janela do ensaio era suficiente (uma vez que as respostas registradas foram bem acima da referência) e, portanto, provavelmente sensível o suficiente para detectar até mesmo níveis baixos de intensificação putativa.

[00256] Foram identificados 15 candidatos, marcados como “intensificação” na Tabela 2. Surpreendentemente, 80% desses intensificadores putativos (12/15) pertenciam à mesma classe de produtos químicos: aldeídos alifáticos insaturados.

Em seguida, foram realizados dois experimentos paralelos de resposta à dose para confirmar as propriedades de intensificação verdadeiras dos possíveis candidatos.

Primeiro, uma resposta à dose de cada candidato individual foi realizada para determinar se o mesmo era um agonista por si só.

Segundo, uma curva de resposta à dose de MUSCENONE® na presença e ausência de uma concentração de 250 µM do modulador putativo foi avaliada para deslocamentos de EC50. As moléculas que aumentaram a resposta do receptor olfativo OR5AN1 ao MUSCENONE®, mas não exibiram atividade agonista intrínseca mensurável, foram elas próprias consideradas intensificadores verdadeiros e foram selecionadas para estudos adicionais.

TABELA 2. Compostos selecionados da triagem de intensificação, numerados pela atividade de OR5AN1 decrescente (abrangência). Tipo de Tipo de Moléculas Moléculas Tipo de Acerto Moléculas Moléculas Tipo de Acerto Acerto Acerto

Agonist Intensificaçã 1 6 Aldeído Intensificação 11 16 Intensificação a 2-Decenal o Nonilênico Almíscar Amandolene Cetona Puro Puro

Agonist Intensificaçã

68/78 2 7 Agonista 12 17 Citral Intensificação a octenal, 2- N 302 o Dimetilacetal Dextro Muscenone

Agonist Intensificaçã 3 8 decadienal, E3, Intensificação 13 Aldeído 18 Intensificação Muscenone a o E4- Tridecilênico antranilato de delta metila n- metila

Intensifi Intensificaçã 4 9 Agonista 14 19 Neral & Intensificação cação o Nonadienal dea Geranial Pelargodienal Muscone Laevo

Agonist 1 Intensificaçã 5 Intensificação 15 20 Intensificação a 0 Dodecenal hexenal, 2- o Orto Musc X Aminoacetof

69/78 enona

[00257] A partir dessa análise, foi identificado o aldeído tridecilênico volátil (TDA), um aldeído alifático α-β mono-insaturado. Este composto não ativou o receptor olfativo OR5AN1 por si só, mas em combinação com o MUSCENONE® produziu um claro efeito de intensificação em comparação com o MUSCENONE® isolado. Consultar a Figura 3.

[00258] O aldeído tridecilênico pareceu ser um intensificador eficaz do receptor olfativo OR5AN1. A adição de TDA a 250 µM levou a uma redução drástica no EC 50 de MUSCENONE® (um desvio aproximado de 21 vezes) e a um nível de ativação máximo geral maior (aumento da abrangência) (Figura 3a). Quando testado por si só, o TDA não exibiu qualquer atividade significativa além de uma atividade de ligação muito menor acima de aproximadamente 100 µM. Nessa concentração, a ligação de TDA produziu uma ativação inferior a 8% da janela de ativação do MUSCENONE®. O aldeído tridecilênico não é, portanto, considerado um agonista verdadeiro de OR5AN1.

[00259] O efeito do TDA na ativação induzida por composto de almíscar do receptor olfativo OR5AN1 foi observado com muscone, xilol de almíscar e cetona de almíscar. Todos os agonistas exibiram deslocamentos da curva de resposta à dose à esquerda comparáveis na presença de uma concentração de 250 µM de TDA (Figura 3b a d). Isso indicou que a intensificação foi mediada através de um evento de ligação ao receptor e provavelmente não mediado por efeitos independentes de OR5AN1, tal como nas próprias células de ensaio. A diminuição em EC50 variou entre 13 e 28 vezes em experimentos repetidos (Figura 4). A aparente intensificação observada com misturas binárias de almíscar e TDA é inconsistente com uma ligação de natureza competitiva, principalmente devido ao TDA, que não é um agonista, também não atuar como um antagonista. Em vez disso, esse tipo de dados é indicativo de um sítio de ligação não competitivo para TDA.

[00260] As tabelas 3a e 3b abaixo relatam o efeito de compostos adicionais na CE 50 e na abrangência de MUSCENONE®.

TABELA 3A: EC50 (Deslocamento de Potência) Composto (Intensificador) Concentração de Intensificador (µM) 600 200 66,6 (2E)-7,8-dimetil-2,7- 1 3,99 9,03 1,52 nonadienal (5E)-7-oxo-5-heptenoato 2 4,29 2,16 1,18 de metila (2E)-7-metil-2,6- 3 29,14 5,60 1,36 octadienal (2E)-6,6-dimetil-2- 4 6,88 3,30 1,15 heptenal (+-)-(2E)-5,9-dimetil-2,8- 5 9,07 9,56 1,84 decadienal 7 (E)-2-tetradecenal 7,13 5,06 3,34 8 4-hidroxi-2-nonenal 4,99 n/a 1,30 Trans-2,6,7-dimetil-2,6- 9 n/a 4,47 1,18 octadienal

TABELA 3B: Abrangência (Deslocamento de Eficácia) Composto (Intensificador) Concentração de Intensificador (µM) 600 200 66,6 (2E)-7,8-dimetil-2,7- 1 1,24 1,31 1,07 nonadienal (5E)-7-oxo-5- 2 1,18 1,15 0,99 heptenoato de metila (2E)-7-metil-2,6- 3 1,18 1,20 1,06 octadienal (2E)-6,6-dimetil-2- 4 1,14 1,02 1,06 heptenal (+-)-(2E)-5,9-dimetil- 5 1,15 1,22 1,02 2,8-decadienal 7 (E)-2-tetradecenal 1,04 1,00 0,94 8 4-hidroxi-2-nonenal 1,09 1,32 1,00 Trans-2,6,7-dimetil-2,6- 9 1,03 1,13 1,05 octadienal

EXEMPLO 4: ALDEÍDO TRIDECILÊNICO ATUA COMO MODULADORES ALOSTÉRICOS POSITIVOS (PAM) PARA INTENSIFICAR A ATIVIDADE DO RECEPTOR OLFATIVO OR5AN1.

[00261] Experiências funcionais de resposta à dose foram realizadas para revelar a natureza alostérica da interação entre o aldeído tridecilênico (TDA) e o OR5AN1. O nível de intensificação da ativação do OR5AN1 foi avaliado em concentrações distintas do intensificador. Com o uso do mesmo ensaio com base em células descrito acima, foram realizadas curvas de resposta de dose de OR5AN1 a MUSCENONE® na presença de concentrações seriais de aldeído tridecilênico que variaram de 0 a 1 mM. As curvas foram obtidas aplicando-se a equação de efeito de deslocamento de EC50 alostérico simplificado (disponível em Prism5, v. 5.02), derivada do modelo de interação complexo ternário. Os níveis de intensificação registrados não foram dependentes linearmente da concentração do intensificador, e os seguintes valores de parâmetros chave para α (o fator de cooperatividade) e KB (a constante de dissociação de equilíbrio de TDA), obtidos a partir do modelo: α = 15,7 e K B = 259 µM. α> 1 é indicativo de modulação alostérica positiva. Seguindo esse método, o 2-decenal e o aldeído nonilênico, dois intensificadores potentes, exibiram propriedades de modulação alostérica semelhantes ao TDA com os seguintes parâmetros chave: 2-decenal, α = 37,3 e KB = 264 µM; Aldeído nonilênico, α = 28,8 e KB = 96 µM.

[00262] A caracterização farmacológica completa dos intensificadores fornece um meio para classificar os intensificadores com base em 1) o deslocamento de potência que os mesmos induzem quando em combinação com um ingrediente de perfumaria (por exemplo, ingredientes almiscarados, florais ou amadeirados), 2) o aumento de eficácia (o nível de atividade do receptor alvo) em comparação com a eficácia observada com o composto isolado, 3) a afinidade do composto intensificador com o receptor, 4) a concentração mínima necessária para a ocorrência de intensificação e/ou 5) a razão mais eficiente entre intensificador e composto de perfumaria que leva ao maior desempenho de intensificação.

[00263] Além disso, e como um controle, um experimento semelhante foi realizado no receptor de odorante responsivo a MUSCENONE® Olfr1440 de camundongo, o ortólogo de OR5AN1. O tridecilênico não intensificou a atividade do receptor Olfr1440. Em vez disso, o aldeído levou a uma leve inibição da ativação induzida por MUSCENONE® de Olfr1440 (Figura 5). Isto também apoia a visão de que a intensificação de OR5AN1 por aldeído tridecilênico é mediado pelo receptor e específico do receptor. EXEMPLO 5: A RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE DE MODULADORES ALOSTÉRICOS POSITIVOS DO RECEPTOR OLFATIVO OR5AN1.

[00264] Um conjunto quimicamente diversificado de 67 compostos voláteis relacionados estruturalmente aos aldeídos insaturados alifáticos encontrados inicialmente (consultar Exemplo 2 e Figura 1) foi gerado para análise de relação estrutura-atividade (SAR). As sessenta e sete moléculas foram testadas quanto às suas propriedades de intensificação no OR5AN1 para caracterizar os requisitos químicos necessários.

[00265] As curvas de resposta à dose para MUSCENONE® foram obtidas na presença de 250 µM de cada composto e comparadas a uma curva de resposta à dose de MUSCENONE® isolado. A intensificação resultante foi quantificado por meio de deslocamento de EC50 (aumento de potência) e a razão de abrangência de eficácia (aumento de eficácia).

[00266] O deslocamento de EC50 foi obtido dividindo-se a EC50 de MUSCENONE® + composto pela EC 50 MUSCENONE® de referência sozinho. A razão de abrangência foi obtida dividindo-se a abrangência de MUSCENONE® + composto pela abrangência de MUSCENONE® de referência sozinho. Especificamente, foram comparadas diversas moléculas α-β alifáticas mono ou poli-insaturadas.

[00267] Foi constatado sistematicamente que os aldeídos alifáticos dissubstituídos α-β-mono-insaturados exibiam a intensificação mais potente. A substituição do grupo funcional, modificação da saturação e substituições adicionais parecem reduzir ou eliminar o potencial daquele composto para intensificar o receptor (Figuras 6, 8 a 12). Modificações adicionais em torno dos aldeídos alifáticos α-β mono-insaturados, tais como substituição na posição α ou ciclização da cauda alifática, impediram a ocorrência de efeitos de intensificação.

[00268] Uma estrutura química genérica resultante que mostra as características químicas exigidas para a intensificação específica de OR5AN1 foi determinada (Figura 7). Comparações aos pares das curvas de resposta à dose obtidas com os aldeídos α-β-mono-insaturados e isômeros de saturação ou funcionais derivados exemplificam adicionalmente as características químicas necessárias para a intensificação de OR5AN1 (Figuras 8 a 12). A Figura 8 mostra os níveis distintos de intensificação obtidos com decenal, decadienal e decanal, e a exigência da insaturação. A Figura 9 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com dodecenal e tangerinal e a importância da posição de insaturação.

[00269] A Figura 10 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com aldeído nonilênico, nonenol e nordecenol, e a ausência de intensificação quando um grupo funcional álcool é usado em vez de um grupo aldeído. A Figura 11 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com decenal e decenona, e a ausência de intensificação quando um grupo funcional cetona é usado. E a Figura 12 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com ácido undecenal e undecenoico, e a ausência de intensificação quando um grupo funcional ácido é usado.

[00270] Uma análise de SAR foi conduzida para identificar os melhores intensificadores e determinar os requisitos químicos necessários para compostos que intensificaram um dado receptor. No caso do OR5AN1, foram identificados pelo menos 10 intensificadores potentes, todos os quais são compostos voláteis aplicáveis à criação/projeto de perfumaria. Sem pretender ser limitado por qualquer teoria particular, quando vários intensificadores estão à mão para criação, uma caracterização organoléptica subsequente de seu cheiro inerente permite ainda selecionar os compostos voláteis que melhor se ajustam às aplicações a jusante em relação à tonalidade geral da aplicação (ou seja, um perfume). Em outras palavras, um portfólio de ingredientes de intensificação que corresponde a cada molécula alvo, por exemplo, almíscar, é gerado e proporciona aos perfumistas mais ferramentas de criação. EXEMPLO 6: ALELOS OR HIPOFUNCIONAIS PODEM SER RESTAURADOS NA PRESENÇA DE UM INTENSIFICADOR.

[00271] Os receptores olfativos são frequentemente codificados por vários alelos para qualquer dado gene OR, de um único alelo a mais de quinze alelos.

Variações alélicas naturais podem variar de cerca de 1% a 5% na sequência nucleotídica de um gene ou na sequência de aminoácidos do polipeptídeo que o mesmo codifica.

[00272] São conhecidos cinco alelos de OR5AN1 que estão presentes em populações humanas. Esses alelos não são funcionalmente equivalentes e exibem níveis de atividade distintos que variam de totalmente funcional (alelo 1 e 2), hipofuncional (alelo 3 e 4) a perda de função (alelo 5) (Figura 13).

[00273] O teste do alelo de OR5AN1 hipofuncional 3 e 4 em um ensaio com base em células na presença e na ausência do intensificador identificado aldeído tridecilênico mostrou um aumento substancial no nível de atividade. O valor observado de EC50 para o alelo OR5AN1 3 exibiu um deslocamento de 6,0 vezes (de 9,0 µM para 1,5 µM na presença de 250 µM de aldeído tridecilênico) e uma razão de abrangência de atividade de 2,02 (com um aumento da atividade de

2.311 para 4.663 unidades de HTRF fluorescente relativo na presença de aldeído tridecilênico). O valor observado de EC50 para o alelo OR5AN1 4 exibiu um deslocamento de 6,25 vezes (de 10,1 µM para 1,6 µM na presença de 250 µM de aldeído tridecilênico) e uma razão de abrangência de atividade de 2,16 (com um aumento da atividade de 2.328 para 5.026 unidades de HTRF fluorescente relativo na presença de aldeído tridecilênico). Tanto a potência quanto a eficácia se deslocaram favoravelmente e levaram a um nível de atividade mais comparável à atividade presumivelmente mais forte suscitada pelo MUSCENONE® para pessoas portadoras do alelo 2. Esses dados sugerem que indivíduos portadores desses alelos podem ser mais sensíveis a uma aplicação de perfumaria que contém um almíscar ativador de OR5AN1 na presença de um ingrediente de perfumaria intensificado.

EXEMPLO 7: SENSIBILIDADE HUMANA A UM COMPOSTO DE ALMÍSCAR É AUMENTADA NA PRESENÇA DE UM INTENSIFICADOR.

[00274] A sensibilidade de indivíduos humanos ao MUSCENONE® foi avaliada através da realização de um teste de limiar de detecção de odor (ODT). O teste de ODT consistiu em identificar a concentração para a qual 50%, preferencialmente 66%, dos painelistas são capazes de determinar qual dos três recipientes contém o composto alvo MUSCENONE® em testes de triângulo de escolha forçada. Dois testes foram realizados para calcular o ODT em misturas contendo MUSCENONE® mais um odor de fundo perceptível de moléculas quimicamente semelhantes a) o aldeído tridecilênico intensificador e b) o composto volátil não intensificador, nonanal. Essas duas moléculas são quimicamente semelhantes, mas nonanal não exibe a α-β-insaturação necessária para que a intensificação ocorra, conforme identificado no Exemplo

5.

[00275] 28 painelistas receberam uma série de testes de triângulo com concentrações crescentes de MUSCENONE® na presença de aldeído tridecilênico em uma concentração de 0,1%. Dentro de cada teste de triângulo, as três amostras continham aldeído tridecilênico a 0,1% e uma amostra também continha MUSCENONE® 27 painelistas receberam uma série de testes de triângulo com concentração crescente de MUSCENONE® na presença de nonanal a uma concentração de 0,1%. Dentro de cada teste de triângulo, as três amostras continham nonanal a 0,1% e uma amostra também continha MUSCENONE®. Em cada teste do triângulo, os participantes do painel foram solicitados a identificar a amostra que era diferente das outras duas amostras. O ODT foi calculado ajustando-se um modelo de regressão não linear aos dados e calculando-se a concentração de MUSCENONE® na qual a proporção de respostas corretas era igual a 2/3 (66%, o ponto médio entre a taxa de probabilidade 1/3 e todas as respostas corretas 1) Houve um valor de ODT mais baixo quando o almíscar foi misturado com o intensificador do que com o composto neutro: 0,09% em comparação com 0,93%, respectivamente, indicando níveis de detecção distintos de almíscar em condições experimentalmente semelhantes (Figura 14).

EXEMPLO 8: IDENTIFICAÇÃO DE INTENSIFICADORES DE ATIVIDADE DE OR10J5 PUTATIVOS.

[00276] Seguindo o mesmo método de rastreio como descrito nos Exemplos 1 a 5, um receptor de odorante de muguet floral humano, OR10J5, é rastreado para identificar intensificadores putativos. O receptor marcado com Lucy-Flag- Rho é cotransfectado com a proteína G canônica olfativa Golf e exposto a uma mistura binária de uma única concentração de um composto de muguet floral e um composto de teste.

[00277] Uma curva de resposta à dose que mostra a ativação de OR10J5 em resposta ao composto de muguet floral 33- 4-hidroxi-4-metilpentil)ciclo-hex-3- eno-1-carbaldeído, 4-(4-hidroxi-4-metilpentil)ciclo-hex 3-eno-1-carbaldeído ou uma mistura dos mesmos (vendido sob o nome comercial LYRAL®, doravante denominado "LYRAL®") é mostrada na Figura 15. Com o uso de um ensaio com base em células, a atividade de OR10J5 foi testada em uma linha celular HEK293T em que o gene RTP1 endógeno da chaperona foi ativado e a chaperona do receptor odorante foi expressa de acordo com os métodos revelados na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO2016/201153 A1. O receptor marcado com Flag-Rho foi cotransfectado com a proteína G canônica olfativa Golf e foi exposto a uma mistura binária de uma única concentração de LYRAL® e um composto de teste.

[00278] Uma biblioteca de compostos voláteis foi usada para criar misturas binárias de cada composto com LYRAL® a aproximadamente EC 20, uma concentração que provoca apenas aproximadamente 20% do nível total de atividade de OR10J5 por si só. Um ensaio com base em células de ativação foi usado para a identificação inicial de candidatos a intensificadores. A atividade de receptor induzida por mistura binária única foi detectada medindo-se o aumento de cAMP no citosol com o uso de um kit com base em HTRF (unidade de Fluorescência Homogênea Resolvida no Tempo) (CisBio, kit cAMP dynamic 2, 62AM4PEJ).

[00279] Foram criadas 800 misturas binárias misturando-se uma solução de reserva de LYRAL® com uma solução de reserva de cada composto de teste para uma concentração final de 4,6 e 300 µM, respectivamente. Soluções de reserva foram feitas de compostos dissolvidos em DMSO puro. Cada mistura foi apresentada a uma linha celular que expressa o receptor olfativo OR10J5. A concentração final de DMSO em cada mistura binária foi de 0,17% e não teve efeito visível nas células (consultar a Figura 16).

[00280] A ativação resultante foi então medida e comparada ao LYRAL® isolado (definindo a referência do ensaio de intensificação). A qualidade do processo HTS foi determinada e a variabilidade da janela e a confiabilidade do sinal foram avaliadas calculando-se o valor de Z’ de cada placa Foram obtidos 45 acertos, oito dos quais eram agonistas do receptor olfativo OR10J5 (acertos nº 1, 2, 5, 6, 10, 15, 25 e 34), consultar a Tabela 4. Esses agonistas do receptor olfativo OR10J5 confirmaram ainda que a faixa dinâmica da janela do ensaio era suficiente (uma vez que as respostas registradas foram bem acima da referência) e, portanto, provavelmente sensível o suficiente para detectar até mesmo níveis baixos de intensificação putativa.

[00281] 37 candidatos, marcados como “intensificação” na Tabela 5, foram identificados e testados em dois experimentos paralelos de resposta à dose para confirmar as propriedades de intensificação verdadeiras dos candidatos potenciais. Primeiro, uma resposta à dose de cada candidato individual foi realizada para determinar se o mesmo era um agonista por si só. Segundo, a mesma curva de resposta à dose de candidato na presença da concentração de LYRAL® em EC20 (gerando 20% de atividade em OR10J5) foi avaliada quanto ao aumento do nível de atividade. Moléculas que aumentaram a resposta do receptor olfativo OR10J5 ao LYRAL® além de EC20, mas não exibiram atividade intrínseca mensurável foram consideradas como intensificadores verdadeiros e foram selecionadas para estudos posteriores. A partir dessa análise, foram identificadas 20 moléculas que mostraram propriedades de intensificação. Consultar a Tabela 4.

TABELA 4. COMPOSTOS CONFIRMADOS COMO INTENSIFICADORES VERDADEIROS DA ATIVAÇÃO de LYRAL de OR10J5.

1. Octanal 2. (E)-Dec-2-enal 3. 2-Fenilpropanal 4. (E)-But-2-enal

7. (+-)-3-(4-Metil-3- penten-1-il)-3-ciclo-

6. 3-(1,3- hexeno-1-carbaldeído

5. 3- Benzodioxol-5-il)- (A) + (+-)-4-(4-Metil-3- 8.Heptanal Metilbenzaldeído 2-metilpropanal penten-1-il)-3-ciclo- hexeno-1-carbaldeído (B)

11. (+)-(3S)-3-[(1R)-4- Metil-3-ciclo-hexen-1-

9. 4-Propan-2- 10. (3R)-3,7- il]butanal (A) + (+)-

12. Hexanal ilbenzaldeído Dimetiloct-6-enal (3R)-3-[(1R)-4-Metil-3- ciclo-hexen-1- il]butanal

16. 3,5,6-Trimetil-3- Cyclohexeno-1-

13. 2,6-Dimetil- 15. 2-Metil-3-(4- Carbaldeído (A) +

14. Benzaldeído hept-5-enal metilfenil)propanal 2,4,6-Trimetil-3- Cyclohexeno-1- Carbaldeído (B)

17. 2,4,6-

18. 4- 19. 6-Metoxi-2,6- Trimetilciclo-hex-3- 20. (E)-Non-2-enal Etilbenzaldeído dimetil-heptanal eno-1-carbaldeído

TABELA 5. Compostos selecionados da triagem de intensificação, numerados pela atividade de OR10J5 decrescente (abrangência). Tipo de Tipo de Tipo de Tipo de Moléculas Tipo de Acerto Moléculas Moléculas Moléculas Moléculas Acerto Acerto Acerto Acerto

Inten Agonist 1 Intensific 2 3 Intensifi 1 Agonista 10 sifica a 9 Metiloctilacetal ação 8 7 cação ção Lironol 50 Dipg deído Helotropina Florol Benzaldeído

Inten Intensifi 2 Intensific 2 3 Intensifi 2 Agonista 11 sifica cação 0 ação 9 Costenal 8 cação Lyral Heliopropanal ção Isociclocitral Liminal

80/78 Inten Intensificaçã Intensifi 2 Intensific 3 3 Intensifi 3 12 Neral & sifica Octanal o cação 1 ação 0 9 cação Zantryle 50 Geranial ção Acropal Dipg Vertonal

Inten Intensificaçã Intensifi 2 Intensific 3 4 Intensifi 4 13 XIVp-syringa sifica 2-Decenal o cação 2 ação 1 0 cação aldenyoe de Óleo de ção Óleo de capim- base Citronela Etil Maltol limão Java

Inten Sint P Fab Intensifi 2 Intensific 3 4 Intensifi 5 Agonista 14 decadienal, sifica Hidroxiotronela Fareral HR cação 3 ação 2 1 cação E2, E4- ção l Cis Noneral 10 Aldeído E Dpg

Inten Agonist 2 Intensific 3 4 Intensifi 6 Agonista 15 sifica a 4 Aldeído C 6 Fc ação 3 nonanal 2 cação ção Natactona 50 Lilyflore Amandolene Mip Puro

81/78 Intensificaçã Intensifi 2 3 Di- Agon 4 Intensifi 7 16 Agonista o Heptanal cação 5 Hidroxicitronela 4 hidromircenol ista 3 Metoximelonal cação Aldeído l iff Hidratrópico

Inten Intensificaçã Intensifi 2 Intensific 3 4 Intensifi 8 17 sifica Aldeído E-2-butenal o cação 6 ação 5 4 cação Preciclemone Delta ção Nonilênico Cuminaldeído B Undecalacton a

Inten Intensificaçã Intensifi 2 Intensific 3 4 Intensifi 9 18 sifica o cação 7 ação 6 5 Ciclemona A cação Citronelal cp Melonal satinaldeído ção m-Tolualdeído

82/78

EXEMPLO 9: CARACTERIZAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DE INTENSIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE OR10J5.

[00282] A especificidade de intensificação do LYRAL® foi testada em compostos que eram estruturalmente semelhantes aos intensificadores identificados. As curvas de resposta à dose para LYRAL® foram obtidas na presença de uma concentração constante de um composto de teste e comparadas com uma curva de resposta à dose do LYRAL® isoladamente. A intensificação resultante foi quantificado por meio de deslocamento de EC 50 (aumento de potência) e a razão de abrangência de eficácia (aumento de eficácia).

[00283] O deslocamento de EC50 foi obtido dividindo-se a EC50 de LYRAL® + composto pela EC 50 LYRAL® de referência sozinho. A razão de abrangência foi obtida dividindo-se a abrangência de LYRAL® + composto pela abrangência de LYRAL® de referência sozinho.

[00284] A Figura 17 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com a) heliopropanal e b) 3-(4-metilciclohex-3-en-1-il)butanal, e a ausência de intensificação com c) heliotropina e d) ciclometileno-citronelol para OR10J5. A ativação de OR10J5 pelo LYRAL® foi especificamente intensificada pelo heliopropanal e pelo 3-(4-metilciclo-hex-3-en-1-il)butanal, mas não por compostos relacionados estruturalmente, conforme indicado pelos deslocamentos correspondentes: um deslocamento de 9,2 e 6,7 vezes para o heliopropanal e 3-(4-metilciclohex-3-en-1-il)butanal, respectivamente, versus um deslocamento de 1,8 e 1,3 vezes para heliotropina e cilcometileno citronelol, respectivamente.

[00285] A Figura 18 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com heliopropanal e 3-(4-metilciclo-hex-3-en-1-il) butanal, e a ausência de intensificação com heliotropina e ciclometileno-citronelol para o ortólogo de camundongo OR10J5, Olfr16. A ativação de Olfr16 pelo LYRAL® foi intensificada especificamente pelo heliopropanal e 3-(4-metilciclohex-3-en-1-il) butanal, mas não por compostos estruturalmente relacionados, como indicado pelos deslocamentos correspondentes: um deslocamento de 5 vezes para o heliopropanal e 3-(4-metilciclo-hex-3-en-1-il)butanal, versus um desvio de 1,5 e

1,1 vezes para a heliotropina e o ciclometileno citronelol, respectivamente. Esses resultados indicam intensificação de outros receptores olfativos de mamíferos. EXEMPLO 10: INTENSIFICADORES DE COMPOSTOS DE MUGUET FLORAL ATUAM COMO MODULADORES ALOSTÉRICOS POSITIVOS (PAM) PARA INTENSIFICAR A ATIVIDADE DO RECEPTOR OLFATIVO OR10J5.

[00286] Experimentos funcionais de resposta à dose foram realizados para revelar a natureza alostérica da interação entre heliopropanal, 3-(4-metilciclo- hex-3-en-1-il)butanal, melonal e heptanal e OR10J5. O nível de intensificação da ativação do OR10J5 foi avaliado em concentrações distintas de cada intensificador. Com o uso do mesmo ensaio com base em células descrito anteriormente, foram realizadas curvas de resposta à dose de OR10J5 a LYRAL® na presença de concentrações seriais dos intensificadores que variam de 0 a 600 µM, consultar a Figura 19. As curvas foram obtidas aplicando-se a equação de efeito de deslocamento de EC50 alostérico simplificado (disponível em Prism7), derivada do modelo de interação complexo ternário. Os níveis de melhoria registrados não foram linearmente dependentes da concentração do intensificador, e os seguintes valores de parâmetros essenciais para α (o factor de cooperatividade) e KB (a constante de dissociação de equilíbrio do intensificador) foram obtidos a partir do modelo para cada intensificador: heliopropanal , α = 6,3 e KB = 10 µM; 3-(4-metilciclo-hex-3-en-1-il)butanal, α = 7,5 e KB = 15 µM; melonal, α = 4,1 e KB = 16 µM; e heptanal; α = 3,2 e KB = 51 µM. α> 1 é indicativo de modulação alostérica positiva. EXEMPLO 11: SENSIBILIDADE HUMANA AO LYRAL® É AUMENTADA NA PRESENÇA DE UM INTENSIFICADOR.

[00287] A sensibilidade de indivíduos humanos ao LYRAL® foi avaliada através da realização de um teste de limiar de detecção de odor (ODT). O teste de ODT consistiu em identificar a concentração para a qual 50%, preferencialmente 66%, dos painelistas são capazes de determinar qual dos três recipientes contém o composto alvo LYRAL® em uma série de testes de triângulo de escolha forçada. Dois testes foram realizados para calcular o ODT em misturas contendo LYRAL® mais um odor de fundo perceptível de moléculas semelhantes quimicamente a) o intensificador, 3-(4-metilciclo-hex-3-en-1-

il)butanal e b) o composto volátil não-intensificador, Ciclometileno citronelol. Essas duas moléculas são quimicamente semelhantes.

[00288] 28 painelistas receberam uma série de testes de triângulo com concentrações crescentes de LYRAL® na presença de 3-(4-metilciclo-hex-3-en- 1-il)butanal a uma concentração de 0,1%. Dentro de cada teste de triângulo, as três amostras continham 3-(4-metilciclohex-3-en-1-il)butanal a 0,1% e uma amostra também continha LYRAL®. 28 painelistas receberam uma série de testes de triângulo com concentração crescente de Lyral® na presença de ciclometileno citronelol a uma concentração de 7%. Dentro de cada teste de triângulo, as três amostras continham Ciclometileno citronelol a 7% e uma amostra também continha LYRAL®. Em cada teste do triângulo, os participantes do painel foram solicitados a identificar a amostra que era diferente das outras duas amostras. Os resultados correspondentes são mostrados na Figura 20.

[00289] A proporção de respostas corretas foi ajustada para levar em conta a probabilidade de adivinhação com o uso da fórmula de Abbott frequentemente usada no campo (Lawless, 2010). Uma regressão linear, com Material (Intensificador versus Composto neutro) e Nível de Concentração transformado em log como variáveis explicativas, e proporção de respostas corretas como uma variável de resposta produziram um efeito principal significativo do Material (p = 0,03) e uma interação marginalmente significativa (p = 0,052), indicando que, com o aumento da concentração, a proporção de respostas corretas aumentou a uma taxa mais alta quando o LYRAL® foi misturado com o intensificador (versus composto neutro. Consultar a Figura 21). EXEMPLO 12: INTENSIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DE OR10J5 É INDEPENDENTE DE AGONISTAS DE OR10J5.

[00290] A intensificação da atividade de OR10J5 foi testada com um agonista adicional e com um dos compostos e condições de teste descritos nos Exemplos acima. As curvas de resposta à dose para (+-)-2,5-dimetil-2-indanmetanol foram obtidas na presença de uma concentração constante do composto de teste e comparadas com uma curva de resposta à dose do agonista isolado. A intensificação resultante foi quantificada por meio de um deslocamento de CE50 (aumento de potência) e a razão de abrangência de eficácia (aumento de eficácia) como descrito acima.

[00291] A Figura 22 mostra os níveis de intensificação distintos obtidos com a) heliopropanal e a ausência de intensificação com b) heliotropina, a ativação de OR10J5 por (+-)-2,5-dimetil-2-indanmetanol foi especificamente intensificada pelo heliopropanal, mas não pelo composto relacionado estruturalmente, como indicado pelos deslocamentos correspondentes: um deslocamento de 8,6 e 2,0 vezes para heliopropanal e heliotropina, respectivamente.

[00292] Isso demonstra que o composto de teste está especificamente intensificando a atividade de OR10J5 independentemente da natureza do agonista (composto de ativação). Neste caso particular o (+-)-2,5-dimetil-2- indanmetanol, é um agonista parcial do OR10J5 e ainda foi intensificado pelo heliopropanal, o que levou a um aumento de eficácia de 1,7 vezes na faixa dinâmica da resposta à dose, além do aumento de potência (consultar a Figura 22a). Isso indicou adicionalmente que a intensificação foi mediada através de um evento de ligação ao receptor e provavelmente não mediado por efeitos independentes de receptor, tal como nas próprias células de ensaio.

[00293] Todas as publicações citadas ao longo deste documento são incorporadas a título de referência por meio deste em suas totalidades. Embora os vários aspectos da invenção tenham sido ilustrados acima em referência aos exemplos e modalidades preferidas, deve-se observar que o escopo a invenção é não é definido pela descrição anteriormente mencionada, mas pelas seguintes reivindicações adequadamente interpretadas sob os princípios de leis de patente.

Claims (40)

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de ensaio de alto rendimento para identificar um ou mais compostos de um grupo de compostos em que um ou mais compostos modulam positivamente a atividade de um receptor olfativo induzido por um composto odorante agonista, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma ou mais células isoladas, sendo que cada célula expressa um receptor olfativo de mamífero, em que a uma ou mais células compreendem um receptor olfativo alvo que é ativado por um ou mais odorantes, b) um primeiro composto que se liga ao receptor olfativo e ativa o receptor olfativo, e c) pelo menos um segundo composto que se liga ao receptor de forma não competitiva em relação ao primeiro composto e que aumenta a atividade do receptor exposto ao primeiro composto quando comparado à atividade do receptor exposto ao primeiro composto na ausência de o segundo composto, em que o primeiro composto é um composto odorante agonista do receptor olfativo, em que o primeiro composto e o segundo composto são compostos diferentes, em que o segundo composto não é um agonista do receptor, e em que a atividade do receptor é intensificada sinergicamente pela combinação do primeiro composto e do segundo composto.

2. Sistema de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segundo composto é selecionado a partir de um conjunto de compostos com base na análise de relação estrutura-atividade (SAR).

3. Sistema de ensaio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o segundo composto se liga a um sítio no receptor olfativo distinto do sítio em que o primeiro composto se liga.

4. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o segundo composto é um composto modulador alostérico positivo.

5. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que antes da etapa a) a uma ou mais células foram transformadas para expressar o receptor olfativo alvo.

6. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o receptor é selecionado do grupo que consiste em OR5AN1, Olfr1440, OR10J5 ou Olfr16.

7. Sistema de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos receptores olfativos compreende um polipeptídeo a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

8. Sistema de ensaio, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

9. Sistema de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor olfativo de mamífero é um receptor olfativo de camundongo ou um receptor olfativo humano.

10. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto é um composto de almíscar ou floral.

11. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto compreende um composto de almíscar e o receptor olfativo é OR5AN1 ou Olfr1440; quimera e fragmentos funcionais da mesma; e em que o receptor olfativo compreende um polipeptídeo que a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 6; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 5, ou o complemento inverso do mesmo.

12. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o composto de almíscar compreende uma cetona macrocíclica ou um composto nitro-almíscar.

13. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto compreende um composto muguet floral e o receptor olfativo é OR10J5 ou Olfr16; quimera e fragmentos funcionais da mesma; e em que o receptor olfativo compreende um polipeptídeo que a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 ou 8; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

14. Sistema de ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a atividade modulada compreende a) modular a afinidade de ligação do primeiro composto ao sítio ortostérico, b) modular a eficácia da ativação de ligação do primeiro composto no sítio ortostérico e/ou c) modular o sítio de ligação à proteína G.

15. Método para identificar pelo menos um composto modulador alostérico positivo que aumenta a atividade de um receptor olfativo na presença de um agonista do receptor, caracterizado pelo fato de que compreende a) fornecer uma ou mais células isoladas, sendo que cada célula expressa um receptor olfativo de mamífero, b) expor a uma ou mais células a um primeiro composto que ativa o receptor olfativo, c) expor a uma ou mais células a um ou mais compostos de teste, e d) selecionar pelo menos um segundo composto do um ou mais compostos de teste quando o pelo menos um segundo composto em combinação com o primeiro composto tiver um efeito sinérgico na atividade do receptor como um composto modulador alostérico positivo; em que o primeiro composto é um composto odorante agonista do receptor olfativo, em que o primeiro composto e o segundo composto são compostos diferentes, e em que o segundo composto não é um agonista do receptor.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a ativação do receptor olfativo para o primeiro composto é medida medindo-se a resposta do dito receptor olfativo na presença e na ausência do primeiro composto.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segundo composto é selecionado dentre um ou mais compostos de teste com base na análise de relação estrutura-atividade (SAR).

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o segundo composto se liga a um sítio no receptor olfativo distinto do sítio em que o primeiro composto se liga.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que antes da etapa a) a uma ou mais células são transformadas para expressar o receptor olfativo.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19,

caracterizado pelo fato de que o receptor olfativo é heterólogo para uma ou mais células.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consiste em HEK293, CHO, oócitos Xenopus, COS, inseto, levedura e células derivadas do placódio olfativo.

22. Método para identificar um composto que intensifica a atividade de um receptor olfativo induzido por um composto odorante agonista, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) triar um ou mais compostos em um ensaio de ligação na presença do composto odorante agonista; (ii) selecionar um ou mais dos compostos triados que intensificam especificamente a ligação específica ou o efeito da ligação de um composto odorante agonista a um receptor olfativo de mamífero; e (iii) identificar compostos que potencialmente modulam a percepção do composto odorante agonista com base na sua intensificação da ligação específica ou no efeito da ligação do composto odorante agonista ao receptor olfativo.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que o receptor olfativo de mamífero é um receptor olfativo de camundongo ou um receptor olfativo humano.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado pelo fato de que o receptor olfativo é OR5AN1, OR10J5, Olfr1440 ou Olfr16.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos receptores olfativos compreende um polipeptídeo que a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 26, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto é um composto de almíscar ou muguet floral.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto compreende um composto de almíscar e o receptor olfativo é OR5AN1 ou Olfr1440; quimera e fragmentos funcionais da mesma; e em que o receptor olfativo compreende um polipeptídeo que a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 6; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 5, ou o complemento inverso do mesmo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o composto almíscar compreende uma cetona macrocíclica ou um composto nitro-almíscar.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto compreende um composto de muguet floral e o receptor olfativo é OR10J5 ou Olfr16; quimera e fragmentos funcionais da mesma; e em que o receptor olfativo compreende um polipeptídeo que a) compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 ou 8; e/ou b) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou 7, ou o complemento inverso do mesmo.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 30, caracterizado pelo fato de que a atividade modulada compreende a) modular a afinidade de ligação do primeiro composto ao sítio ortostérico, b) modular a eficácia da ativação de ligação do primeiro composto no sítio ortostérico e/ou c) modular o sítio de ligação à proteína G.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 31, caracterizado pelo fato de que a intensificação do efeito da ligação do composto odorante agonista ao receptor olfativo compreende intensificar a potência e/ou eficácia da atividade do receptor em comparação com a atividade do receptor na ausência do composto selecionado.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o receptor é OR5AN1, o composto odorante agonista compreende uma cetona macrocíclica ou um composto nitro- almíscar; e o composto selecionado compreende pelo menos um modulador alostérico positivo que tem a estrutura: Fórmula (I) na forma de qualquer um de seus estereoisômeros ou uma mistura dos mesmos; em que R representa um grupo alquil C3-11 linear opcionalmente substituído por um grupo alquil C1-4 carboxiléster ou um grupo hidroxil, um grupo alquil C4-11 ramificado opcionalmente substituído por um grupo alcóxi C1-3 , um grupo alcenil ou alcadienil C6- 12 linear ou ramificado, um grupo fenil substituído por um ou dois grupos alquil C 1-3, um grupo alcenil C5-8 alicíclico ou um grupo benziloximetil , e em que o composto de Fórmula (I) é um modulador alostérico positivo de um receptor olfativo de almíscar.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o composto de Fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em: (E,E)-2,4-decadienal, (E)-2-undecenal, (E,E)-2,4-nonadienal, (E)-2-tridecenal, (2E)-2-dodecenal, (2E,6Z)-2,6-nonadienal, (E,E)-2,6-nonadienal, (2E)-2,4- undecadienal, (2E)-2,4-dodecadienal, (E)-2-nonenal, (2E,4E,7Z)-decatrienal, (Z)-2-decenal, (E)-2-octenal, (E)-2-decenal, (Z)-4-(benziloxi)but-2-enal, (E)-4- (benziloxi)but-2-enal, (E)-4-ciclohexilidenebut-2-enal, (2E)-3-(4-metilfenil)-2- propenal, (2E,5E)-6,10-dimetil-2,5,9-undecatrienal, (2E)-7,8-dimetil-2,7- nonadienal, (5E)-7-oxo-5-heptenoato de metila, (2E)-7-metil-2,6-octadienal, (2E)-6,6-dimetil-2-heptenal, (+-)-(2E)-5,9-dimetil-2,8-decadienal, (E)-2- tetradecenal, (E)-8-metoxi-4,8-dimetilnon-2-enal, e combinações dos mesmos.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 34, caracterizado pelo fato de que o um ou mais compostos selecionados são selecionados com base na análise de relação estrutura-atividade (SAR) projetada especificamente para identificar os determinantes químicos da intensificação putativa.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27 ou 30 a 32, caracterizado pelo fato de que o receptor é OR10J5, o composto odorante agonista compreende um composto muguet floral; e o composto selecionado compreende pelo menos um modulador alostérico positivo selecionado do grupo que consiste em octanal; (E)-dec-2-enal, 2-fenilpropanal; (E)-but-2-enal; 3-metilbenzaldeído; 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-2-metilpropanal; (+-)-3-(4-metil-3-penten-1-il)-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, (+-)-4-(4-metil-3- penten-1-il)-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, e misturas dos mesmos; heptanal, 4- Propan-2-ilbenzaldeído; (3R)-3,7-dimetiloct-6-enal; (+)-(3S)-3-[(1R)-4-metil-3- ciclo-hexen-1-il]butanal, (+)-(3R)-3-[(1R)-4-metil-3-ciclo-hexen-1-il]butanal, e misturas dos mesmos; hexanal; 2,6-dimetil-hept-5-enal; benzaldeído; 2-metil-3- (4-metilfenil)propanal; 3,5,6-trimetil-3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, 2,4,6-trimetil-

3-ciclo-hexeno-1-carbaldeído, e misturas dos mesmos; 4-etilbenzaldeído; 6- metoxi-2,6-dimetil-heptanal; (E)-non-2-enal; e combinações dos mesmos.

37. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a triagem compreende calcular uma janela de ativação para medir a intensificação de efeito sinérgico em EC05-50.

38. Uso de um polipeptídeo que pode ser ativado por um agonista, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo selecionado de um receptor olfativo humano que é ativado pelo agonista para uso em um ensaio de triagem ou método para identificar um ou mais compostos moduladores alostéricos positivos do agonista.

39. Uso de um polipeptídeo que pode ser ativado por uma cetona macrocíclica ou um nitro-almíscar, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 6 para uso em um ensaio de triagem ou método para identificar um composto modulador alostérico positivo da cetona macrocíclica ou nitro- almíscar.

40. Uso de um polipeptídeo que pode ser ativado por um composto de muguet floral caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 ou 8 para uso em um ensaio de triagem ou método para identificar um composto modulador alostérico positivo do composto de muguet floral.

Faixa receptiva OR5AN1 Almíscar Cetona Níveis de ODT variáveis pelos painelistas Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 102/123 Almíscar Xilol

ALMÍSCAR XILOL Razão HTRF

ALMÍSCAR CETONA 1/22 Almíscar DTI Concentração de fase gasosa (µmol / l ar) Log[Composto](M) FIGURA 1

Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Placa 6 Placa 7

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 103/123 2/22

Razão HTRF Compostos

FIGURA 2

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 104/123 Razão HTRF Log[composto](M) FIGURA 3A FIGURA 3B 3/22

Almíscar xilol - TDA Almíscar xilol + TDA Almíscar cetona - TDA Almíscar cetona + TDA

Razão HTRF Log[almíscar cetona](M) Log[almíscar xilol](M) FIGURA 3C FIGURA 3D

Nome de Odorante Deslocamento em vezes

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 105/123 Almíscar C Almíscar X 4/22

FIGURA 4

FIGURA 5B Razão HTRF FIGURA 5A

Razão HTRF

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 107/123 Aldeíldo Nonilênico

Razão de abrangência Aldeído melon

2-Decenona Deslocamento de EC-50 em vezes 6/22

Ácido trans-2-undecoico Ácido trans-2-dodecenoico

Ácido trans-2-tridecenoico

FIGURA 6

FIGURA 7 aldeído Grupo α-β ligação dupla dissubstituída

FIGURA 8B

FIGURA 8C Razão HTRF FIGURA 8A

Razão HTRF

Razão HTRF

FIGURA 9B Razão HTRF

FIGURA 9A

Razão HTRF

FIGURA 10B

FIGURA 10C Razão HTRF

Razão HTRF FIGURA 10A

Razão HTRF

FIGURA 11B FIGURA 11A

Razão HTRF

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 113/123 Muscenone + Ácido undecenoico 250uM 12/22

Razão HTRF

Razão de 665/620 FIGURA 12A FIGURA 12B

Alelos OR5AN1

Alelo 5 Alelo 4 Alelo 3 Alelo 2

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 114/123 Alelo 1

Razão HTRF FIGURA 13A 13/22

OR5AN1 - Alelo 3 OR5AN1 - Alelo 4

Sem intensificador Sem intensificador Com intensificador Com intensificador Razão HTRF

Razão HTRF FIGURA 13B FIGURA 13C

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 115/123 ODT de muscenone delta

Mistura de TDA Mistura de Nonanal Mistura de TDA (Ajuste do modelo) 14/22

Mistura de Nonanal (Ajuste do modelo)

Percentual de Respostas Corretas Concentração de Muscenone (w/w%)

FIGURA 14B

Abrangência

FIGURA 15

Razão HTRF

Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Placa 6 Placa 7 Placa 8 Placa 9 Placa 10

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 117/123 Razão HTRF 16/22

Compostos

FIGURA 16

Lyral - 3-(4- metilciclohex-3-en-1- il)butanal

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 118/123 Lyral + 3-(4- metilciclohex-3-en-1- il)butanal

Razão HTRF

Razão HTRF FIGURA 17A FIGURA 17B 17/22

Lyral - Ciclometileno Lyral - Heliotropina citronelol Lyral + Heliotropina Lyral + Ciclometileno Razão HTRF

Razão HTRF citronelol

FIGURA 17C FIGURA 17D

Lyral - 3-(4- metilciclohex-3-en-1- il)butanal

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 119/123 Lyral + 3-(4- metilciclohex-3-en-1- il)butanal

Razão HTRF Razão HTRF FIGURA 18B FIGURA 18A 18/22

Lyral - Ciclometileno Lyral - Heliotropina citronelol Lyral + Heliotropina Lyral +

Razão HTRF Razão HTRF Ciclometileno citronelol

FIGURA 18C FIGURA 18D

Concentrações de 3- Concentrações (4-metilciclohex-3- de heliopropanal: en-1-il)butanal:

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 120/123 Razão HTRF

Razão HTRF FIGURA 19A FIGURA 19B 19/22

Concentrações Concentrações de Melonal: de heptanal:

Razão HTRF Razão HTRF

FIGURA 19C FIGURA 19D

ODT de Lyral

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 121/123 Mistura de 3-(4-metilciclohex-3-en-1- il)butanal Mistura de Ciclometileno citronelol Mistura de 3-(4-metilciclohex-3-en-1- il)butanal (ajuste de modelo) Mistura de Ciclometileno citronelol 20/22

(ajuste de modelo)

Percentual de Respostas Corretas Lyral (Moralidade)

FIGURA 20

Efeito de Aumento de Concentração sobre Probabilidade de Detecção

Petição 870200046647, de 13/04/2020, pág. 122/123 21/22

3-(4-metilciclohex-3-en-1-il)butanal Ciclometileno citronelol

Probabilidade de Detecção Concentração de Ingrediente (log)

FIGURA 21

Razão HTRF

(+ -)-2,5-dimetil-2-indanmetanol- Heliopropanal (+-)-2,5-dimetil-2-indanmetanol + Heliopropanal

FIGURA 22A Razão HTRF

(+ -)-2,5-dimetil-2-indanmetanol - Heliotropina (+-)-2,5-dimetil-2-indanmetanol + Heliotropina

FIGURA 22B