CN111050856A

CN111050856A - 鉴定气味剂受体的正变构调节剂的方法

Info

Publication number: CN111050856A
Application number: CN201880054532.XA
Authority: CN
Inventors: P·菲斯特; M·罗杰斯; L·吴; C·马格特
Original assignee: Firmenich SA
Current assignee: Firmenich SA
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-04-21
Also published as: BR112020003239A2; EP3658236A1; US11921105B2; JP7343488B2; JP2021508030A; US20200408738A1; SG11202001226PA; WO2019122236A1; JP2023164913A

Abstract

本文提出的各个形态涉及香料工业。更具体而言，本文提出的各个形态涉及基于使用由目标气味剂化合物激活的特定嗅觉受体来筛选和鉴定能增强受试者对目标气味剂化合物的感知的组合物和/或成分的测定和方法。

Description

鉴定气味剂受体的正变构调节剂的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年12月21日提交的美国临时专利申请序列号62/609,004和62/609,017，于2018年12月19日提交的美国临时专利申请序列号62/781,796，以及于2018年2月20日提交的欧洲专利申请序列号18157690.1和于2018年4月11日提交的欧洲专利申请序列号18166887.2的优先权，其全部内容通过引用整体并入于此。

技术领域

本技术领域涉及气味剂和芳香受体，和可用于鉴定气味剂和/或芳香化合物，更具体而言人类气味剂受体活性的正(positive)调节剂的测定法。

背景技术

嗅觉是人类感官系统中最复杂、最难理解的一种。从嗅觉受体(OR)激活到感知，还有许多步骤仍需要进一步研究。如果我们能够理解单个气味剂和混合物的OR代码如何转化为感知，那么我们就可以利用这一知识在多个领域带来显著的益处。这些领域包括：气味调节剂，如恶臭拮抗剂，其可阻止令人不快的气味；新的调味料(食用香精)和香料(日化香精)成分，其替代不可生物降解或有毒的化合物；以及气味增强剂，其会限制我们对天然来源难以获取的源化合物的依赖，或将改善对某些香料成分的敏感性。“嗅觉受体代码”组合范例的核心是观察到任何单个OR可以被多种气味剂激活，相反，大多数气味剂能够激活几种OR。在小鼠基因组中，有大约1,200种不同的完整OR。相比之下，人类有大约400种。在这两种情况下、OR的所有组成部分都被世界上数以千计的气味剂激活，正是这种组合复杂性使我们能够感知到嗅觉的广泛性。然而，截至2016年，使用传统的脱孤法(deorphanization)[Teixeira C.S.S.et al.,Chemical Senses,41(2):105-21(2016)]已鉴定出仅48种人OR(约12％)的气味剂或配体。此外，尚未测试基本上在体外鉴定的大多数配体对人OR的生理相关性。

在WO2014/210585中描述了一种方法，该方法能够快速且可靠地鉴定存在于生物体中的全体OR中的相对一小部分的OR，所述OR由一种或多种气味剂特异性地激活或抑制。

因为OR是由脊椎动物中最大的基因家族，即七种跨膜A类G蛋白偶联受体(GPCR)编码的，所以难以鉴定对于给定感知而言是基本的受体。

仍然需要鉴定被特定的气味剂和/或芳香化合物激活的OR受体。一旦鉴定出被特定的气味剂和/或芳香化合物或一组这类化合物激活的一种或多种OR，就需要鉴定相关气味剂受体，其可使用在用于鉴定和药理学表征OR活性的挥发性调节剂，例如变构调节剂的测定和方法中。气味剂受体活性的这种变构调节充其量是推测性的，并且在嗅觉领域很难懂。

因此，需要用于鉴定相关受体和化合物的方法，这些受体和化合物可用于香料业或其他应用中以调节、改善或增强(使用正变构调节剂)所需的香气或芳香，其可导致对香料或芳香调性的更敏感和更强烈的感知，抑制或抵消(使用负变构调节剂或竞争性拮抗剂)不需要的气味或化合物。

发明内容

本文提出的一个形态提供了一种高通量测定系统，用于从一组化合物中鉴定出一种或多种化合物，其中该一种或多种化合物正性(positively)调节由激动剂气味剂化合物诱导的嗅觉受体的活性，包括：

a.一个或多个分离的细胞，每个细胞表达一种哺乳动物的嗅觉受体，其中该一个或多个细胞包含被一种或多种气味剂激活的目标嗅觉受体，

b.第一化合物，其与该嗅觉受体结合并激活该嗅觉受体，和

c.至少一种第二化合物，其相对于第一化合物非竞争性地与受体结合，并且与不存在第二化合物时暴露于第一化合物的受体的活性相比，增强了暴露于第一化合物的受体的活性，

其中第一化合物是该嗅觉受体的激动剂气味剂化合物，

其中第一化合物和第二化合物是不同的化合物，

其中第二化合物不是该受体的激动剂，并且

其中该受体的活性通过第一化合物和第二化合物的组合协同增强。

在一个形态中，该至少一种第二化合物是基于结构-活性关系(SAR)分析从一组化合物中选择的。

在一个形态中，第二化合物结合到该嗅觉受体上与第一化合物结合的位点不同的位点。

在一个形态中，第二化合物是正变构调节化合物。

在本文的测定或方法的一个形态中，该嗅觉受体是从由OR5AN1、Olfr1440、OR10J5或Olfr16构成的群组中选出的。

在本文的测定或方法的一个形态中，该至少一种嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a.包含与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b.由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

在一个形态中，该至少一种嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a.包含与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b.由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

在该测定或方法的一个形态中，该第一化合物是麝香或花香铃兰(muguet)化合物。

在一个形态中，该哺乳动物的嗅觉受体是小鼠嗅觉受体或人嗅觉受体。

在一个形态中，第一化合物包含麝香化合物，而嗅觉受体是OR5AN1或Olfr1440；其嵌合体和功能片段；并且其中嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a.包含与SEQ ID NO:2或6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b.由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1或5或其反向互补序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

在一个形态中，该麝香化合物包含大环酮或硝基麝香化合物。

在一个形态中，该受体是OR5AN1，该激动剂气味剂化合物包含大环酮或硝基麝香化合物；所选择的化合物包括至少一种具有以下结构的正变构调节剂：

该化合物为其任何一种立体异构体或这些立体异构体的混合物的形式，

其中R代表可选地取代有C_1-4烷基羧基酯基或羟基的C_3-11直链烷基，可选地取代有C_1-3烷氧基取代的C_4-11支链烷基，C_6-12直链或支链烯基或二烯基，取代有一个或两个C_1-3烷基的苯基，C_5-8脂环式烯基，或苄氧甲基，并且

其中式(I)化合物是麝香嗅觉受体的正变构调节剂。

在另一个形态中，式(I)化合物是从由如下构成的群组中选出的：(E,E)-2,4-癸二烯醛，(E)-2-十一烯醛，(E,E)-2,4-壬二烯醛，(E)-2-十三烯醛，(2E)-2-十二烯醛，(2E,6Z)-2,6-壬二烯醛，(E,E)-2,6-壬二烯醛，(2E)-2,4-十一碳二烯醛，(2E)-2,4-十二碳二烯醛，(E)-2-壬烯醛，(2E,4E,7Z)-癸三烯醛，(Z)-2-癸烯醛，(E)-2-辛烯醛，(E)-2-癸烯醛，(Z)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-环亚己基丁-2-烯醛，(2E)-3-(4-甲基苯基)-2-丙烯醛，(2E,5E)-6,10-二甲基-2,5,9-十一碳三烯醛，(2E)-7,8-二甲基-2,7-壬二烯环己基，(5E)-7-氧代-5-庚烯酸甲酯，(2E)-7-甲基-2,6-辛二烯醛，(2E)-6,6-二甲基-2-庚烯醛，(+-)-(2E)-5,9-二甲基-2,8-癸二烯醛，(E)-2-十四烯醛，和(E)-8-甲氧基-4,8-二甲基壬-2-烯醛，以及它们的组合。

在另一个形态中，第一化合物包含花香铃兰化合物，并且嗅觉受体是OR10J5或Olfr16；其嵌合体和功能片段；并且其中嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a.包含与SEQ ID NO:4或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b.由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:3或7或其反向互补序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

在一个形态中，该花香铃兰化合物为3-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛、4-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛或它们的混合物。

在一个形态中，该受体是OR10J5，该激动剂气味剂化合物包含花香铃兰化合物；而所选择的化合物包含从由如下构成的群组中选出的至少一种正变构调节剂：(E)-癸-2-烯醛，2-苯基丙醛；(E)-丁-2-烯醛；3-甲基苯甲醛；3-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-2-甲基丙醛；(+-)-3-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，(+-)-4-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；庚醛，4-丙-2-基苯甲醛；(3R)-3,7-二甲基辛-6-烯醛；(+)-(3S)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，(+)-(3R)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，以及它们的混合物；己醛；2,6-二甲基庚-5烯醛；苯甲醛；2-甲基-3-(4-甲基苯基)丙醛；3,5,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，2,4,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；4-乙基苯甲醛；6-甲氧基-2,6-二甲基庚醛；(E)-壬-2-烯醛；以及它们的组合。

在一个形态中，所调节的活性包括：

a.调节第一化合物对正构位点的结合亲和力，

b.调节第一化合物对正构位点的结合激活功效，和/或

c.调节G蛋白结合位点。

本文提出的一个形态提供了一种鉴定至少一种正变构调节化合物的方法，该化合物在嗅觉受体的激动剂存在下增强该嗅觉受体的活性，该方法包括：

a.提供一个或多个分离的细胞，每个细胞表达一种哺乳动物的嗅觉受体，

b.将一个或多个细胞暴露于能激活该嗅觉受体的第一化合物，

c.将一种或多种细胞暴露于一种或多种受试化合物，和

d.当至少一种第二化合物与第一化合物组合作为正变构调节化合物对受体活性具有协同作用时，从一种或多种受试化合物中选择该至少一种第二化合物；

其中第一化合物是该嗅觉受体的激动剂气味剂化合物，

其中第一化合物和第二化合物是不同的化合物，并且

其中第二化合物不是该受体的激动剂。

在一个形态中，通过在存在和不存在第一化合物的情况下测量该嗅觉受体的响应来测量该嗅觉受体对第一化合物的激活。

在一个形态中，至少一种第二化合物是从化学上多样化的化合物库中的一种或多种受试化合物中选择的。

在一个形态中，至少一种第二化合物是基于对最初鉴定的化合物的结构-活性关系(SAR)分析从一种或多种受试化合物选择的。

前述形态中任一项的方法，其中第二化合物结合到该嗅觉受体上与第一化合物结合的位点不同的位点。

在一个形态中，在本文提供的测定系统或方法的步骤a)之前，将该一个或多个细胞转化以表达靶嗅觉受体。

在一个形态中，该嗅觉受体对于该一个或多个细胞是异源的。

在一个形态中，该细胞是从由如下构成的群组中选出的：HEK293、CHO、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)、COS、昆虫、酵母和衍生自嗅觉基板的细胞。

本文提出的一个形态提供了一种鉴定化合物的方法，该化合物增强由激动剂气味剂化合物诱导的嗅觉受体的活性，该方法包括：

(i)在激动剂气味剂化合物存在下，在结合测试中筛选一种或多种化合物；

(ii)选择一种或多种经筛选的化合物，该化合物能特异性增强激动剂气味剂化合物与哺乳动物的嗅觉受体的特异性结合或结合效果；和

(iii)基于激动剂气味剂化合物对该嗅觉受体的特异性结合或结合效果的增强，鉴定出潜在地调节激动剂气味剂化合物的感知的化合物。

在一个形态中，该激动剂气味剂化合物与该嗅觉受体的结合作用的增强包括与不存在所选择的化合物时该受体的活性相比，增强该受体的活性的效力和/或功效。

在一个形态中，与不存在所选化合物时该受体的活性相比，增强该受体的活性的效力和/或功效的所选择的化合物能共价结合至靶受体。

在一个形态中，该受体是OR5AN1，该激动剂气味剂化合物包含麝香化合物；而所选择的化合物是一种正变构调节剂，其包含具有以下结构的正变构调节剂：

其中式(I)化合物是麝香嗅觉受体的正变构调节剂。

在一个形态中，式(I)化合物是从由如下构成的群组中选出的：(E,E)-2,4-癸二烯醛，(E)-2-十一烯醛，(E,E)-2,4-壬二烯醛，(E)-2-十三烯醛，(2E)-2-十二烯醛，(2E,6Z)-2,6-壬二烯醛，(E,E)-2,6-壬二烯醛，(2E)-2,4-十一碳二烯醛，(2E)-2,4-十二碳二烯醛，(E)-2-壬烯醛，(2E,4E,7Z)-癸三烯醛，(Z)-2-癸烯醛，(E)-2-辛烯醛，(E)-2-癸烯醛，(Z)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-环亚己基丁-2-烯醛，(2E)-3-(4-甲基苯基)-2-丙烯醛，(2E,5E)-6,10-二甲基-2,5,9-十一碳三烯醛，(2E)-7,8-二甲基-2,7-壬二烯环己基，(5E)-7-氧代-5-庚烯酸甲酯，(2E)-7-甲基-2,6-辛二烯醛，(2E)-6,6-二甲基-2-庚烯醛，(+-)-(2E)-5,9-二甲基-2,8-癸二烯醛，(E)-2-十四烯醛，和(E)-8-甲氧基-4,8-二甲基壬-2-烯醛。

在一个形态中，该受体是OR10J5，该激动剂气味剂化合物包含花香铃兰化合物；而所选择的化合物包含从由如下构成的群组中选出的至少一种正变构调节剂：辛醛；(E)-癸-2-烯醛，2-苯基丙醛；(E)-丁-2-烯醛；3-甲基苯甲醛；3-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-2-甲基丙醛；(+-)-3-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，(+-)-4-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；庚醛，4-丙-2-基苯甲醛；(3R)-3,7-二甲基辛-6-烯醛；(+)-(3S)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，(+)-(3R)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，以及它们的混合物；己醛；2,6-二甲基庚-5烯醛；苯甲醛；2-甲基-3-(4-甲基苯基)丙醛；3,5,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，2,4,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；4-乙基苯甲醛；6-甲氧基-2,6-二甲基庚醛；(E)-壬-2-烯醛；以及它们的组合。

在一个形态中，一种或多种所选择的化合物是基于结构-活性关系(SAR)分析来选择的，所述结构-活性关系是专门设计用于鉴定推定增强的化学决定因素的。

在一个形态中，筛选包括计算激活窗口以确认数据的统计质量并测量在EC_05-50处，而在另一个形态中在EC₂₀处的协同效应增强。

本文提出的一个形态提供了能被激动剂激活的多肽的用途，该多肽选自被该激动剂激活的人嗅觉受体，使用在用于鉴定该激动剂的一种或多种正变构调节化合物的筛选测定中。

本文提出的一个形态提供了能被麝香激活的多肽的用途，该多肽包含与SEQ IDNO:2或6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，用于鉴定麝香的正变构调节化合物。

本文提出的一个形态提供了能被花香铃兰化合物激活的多肽的用途，该多肽包含与SEQ ID NO:4或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，用于鉴定该花香铃兰受体活性的正变构调节化合物。

附图说明

图1显示了一系列不同麝香的由麝香诱导的体外OR5AN1激活水平记录数(a)与以气味检测阈值记录数显示的muscone(3-甲基-环十五酮)、

二甲苯麝香和麝香酮(musk ketone)的总体提高人灵敏度(b)之间的相关性。

图2显示了用于筛选OR5AN1麝香诱导的活性增强的

与香料原料的单点二元混合物的结果。

图3显示了在存在和不存在十三烯醛的情况下，OR5AN1对全部四种激动剂muscone、

二甲苯麝香和麝香酮的剂量响应曲线，以及对单独的十三烯醛的剂量响应。

图4给出了从图3中获得的剂量响应曲线获得的EC₅₀值，并总结了相应的EC 50倍数变动(fold shift)。

图5显示了在一系列浓度的十三烯醛存在下，OR5AN1对

的一系列剂量响应曲线，并且还指示了协同因子α和平衡常数K_B的计算对数值。

图6显示了67种挥发性化合物的排名，这是基于效力转变和功效增加，根据它们的OR5AN1麝香响应增强能力作出的。

图7描绘了从SAR分析中鉴定出的化学要求，其优选引起OR5AN1麝香响应增强。

图8显示了在OR5AN1上获得的不同的增强水平，分别使用a)癸烯醛，b)癸二烯醛和c)癸醛，以及对不饱和度的要求。

图9显示了在OR5AN1上获得的不同的增强水平，分别使用a)十二烯醛和b)tangerinal，以及不饱和位置的重要性。

图10显示了在OR5AN1上获得的不同的增强水平，分别使用a)壬烯醛，b)壬烯醇和c)去甲基癸烯醇(nordecenol)，以及不存在通过醇官能团的增强。

图11显示了在OR5AN1上获得的不同的增强水平，分别使用a)癸烯醛和b)癸烯酮，以及不存在通过酮官能团的增强。

图12显示了在OR5AN1上获得的不同的增强水平，分别使用a)十一烯醛和b)十一烯酸，以及不存在通过酸基团的增强。

图13显示了当用

激活时，OR5AN1等位基因在功能上不相等，但是增强恢复了功能不足的等位基因的活性。

图14显示了与非增强化合物相比，在增强剂存在下人类小组成员对

更敏感。

图15显示了OR10J5对花香铃兰化合物的剂量响应曲线。

图16显示了花香铃兰化合物3-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛、4-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛或它们的混合物(以商品名

出售(以下简称

)和用于筛选OR10J5诱导的活性增强的香料原料的单点二元混合物的结果。

图17显示了在OR10J5

诱导的激活下获得的不同的增强水平，分别使用a)新洋茉莉醛(Heliopropanal)、b)3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛、c)天芥菜精和d)环亚甲基香茅醇，并且不存在后两种化合物的增强。

图18显示了在Olfr16

诱导的激活下获得的不同的增强水平，分别使用a)新洋茉莉醛、b)3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛，c)天芥菜精和d)环亚甲基香茅醇，并且不存在后两种化合物的增强。

图19显示了在一系列浓度的a)新洋茉莉醛、b)3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛、c)甜瓜醛和d)庚醛的存在下，OR10J5对

的一系列剂量响应曲线，并且还指示了协同因子α和平衡常数K_B的相应的计算对数值。

图20显示了与非增强化合物相比，在增强剂存在下人类小组成员对

更加敏感。

图21显示了与非增强化合物相比，人类小组成员根据增强剂浓度增加的

检测量。

图22显示了在OR10J 5(+-)-2,5-二甲基-2-茚满甲醇诱导的激活下获得的不同的增强水平，分别使用a)新洋茉莉醛、和b)天芥菜精，并且不存在后者化合物的增强。

具体实施方式

定义

对于本文和所附权利要求的描述，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。

类似地，各种时态的“含”、“含有”、“包含”和“包括”是可互换的而不是限制性的。

应进一步理解，在各种实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用“基本上由……组成”或“由……组成”的语言来替代地描述实施方案。

除非另有说明，否则以下术语具有归属于它们的含义。

如本文所用，术语“OR”或“嗅觉受体”或“气味剂受体”是指在嗅觉细胞中表达的G蛋白偶联受体(GPCR)家族的一个或多个成员。嗅觉受体细胞也可以基于形态学或通过在嗅觉细胞中特异性表达的蛋白质的表达来鉴定。OR家族成员可以具有充当嗅觉信号转导的受体的能力。

目标嗅觉受体是指可以与体外、体内或离体的感觉感知相关的嗅觉受体。

“麝香OR”是指在嗅觉细胞中表达的G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，在用于鉴定结合和/或激活GPCR的配体的结合或活性测定中，该受体与麝香结合和/或被麝香激活。此类测定描述如下。本文的麝香受体将包括片段、变体，包括合成的和天然存在的，以及对麝香化合物有相应或结合的嵌合体或重组核酸或蛋白质。相同的定义类似地适用于可以通过本文所述的方法鉴定的其他相关或目标OR。

气味剂是指任何类型的气味剂，包括但不限于香料(日化香精)，香料成分，芳香剂，食品，调味料(食用香精)或调味料成分。

OR的激动剂或激动剂化合物是指这样一种化合物或配体，其与OR结合，激活OR并具有诱导受体转导级联的潜力。

如本文所考虑，不是嗅觉受体的激动剂的化合物是指这样一种化合物或配体，与在不存在不是激动剂的化合物的情况下暴露于激动剂化合物的受体的活性相比时，该化合物或配体相对于激动剂化合物非竞争性地结合至OR并且增强或抑制暴露于激动剂化合物的受体的活性。在一个形态中，不是激动剂的化合物与受体上与激动剂化合物结合的位点不同的位点结合。

在一个形态中，不是嗅觉受体激动剂的化合物的效力和功效显著低于激动剂的效力和功效，例如，当EC₅₀值显著高于激动剂化合物的功效和功效时，通常小于饱和时完全激动剂响应的功效的20％。

效力(potency)是指就产生给定活性水平所需的量而言，由激动剂(气味剂)的结合诱导的受体活性的量度。它表示受体对不同激动剂浓度的敏感性，通常是通过计算EC₅₀(达到半数最大受体活性所必需的激动剂浓度)获得。

功效(efficacy)是指受体对给定的激动剂作出响应的强度的量度，并且是通过测量组成型(在没有激动剂的情况下的基线活性)和激动剂诱导的活性之间的激活范围而获得的。在受体饱和时可获得最大功效。

正构结合位点是指激动剂或竞争性拮抗剂的配体或气味剂化合物结合位点。与正构位点的结合事件通常导致激动剂的激活或竞争性拮抗剂对受体活性的抑制。

变构结合位点是指在拓扑学上不同于正构结合位点的结合位点。在正构激动剂存在下的变构结合不受空间阻碍，因此以非竞争方式发生。某些变构配体可以用作正变构调节剂(PAM)或负变构调节剂(NAM)，例如以分别增强或抑制激动剂对受体的激活。

当两个分子竞争结合在相同的结合位点时发生结合竞争。每个配体的结合概率取决于其与受体的亲和力以及与其他配体相比的浓度。当两个配体都在正构位点结合时，通常会发生竞争。可以通过执行竞争测定(例如Schild回归分析)来鉴定。当未观察到竞争时，两个配体可同时在两个不同的结合位点(定义为正构和变构结合位点)上同时结合受体，其中结合位点可在受体上在拓扑上分离，或相邻或重叠。在这种情况下，正构配体的结合不线性依赖于变构配体的浓度。变构结合可以调节受体的一些特性，例如激动剂亲和力和信号转导效率。

正或负的变构调节剂或正或负的变构调节剂化合物是指这样的化合物或配体，其增强或抑制正构激动剂化合物或配体结合的作用但在不存在正构激动剂化合物或配体的情况下基本上无活性。受体活性的变构抑制或增强可通过调节受体的构象并对如下进行修饰来进行：1)对激动剂的正构位点亲和力；2)正构结合激活的作用(例如功效)；或3)在GPCR的情况下与G蛋白的结合，从而分别降低或提高信号转导效率。

协同因子是指由于变构配体的存在而对正构配体结合作用的调节程度的量度。

本公开的化合物抑制或拮抗嗅觉受体的能力可以通过本领域普通技术人员容易选择的任何合适方法来确定，例如，通过离体培养的神经元测定，或通过使用表达相关嗅觉受体(例如，麝香的嗅觉受体)的细胞系的体内测定。

抑制剂和活化剂的此类测定法包括，例如，在存在或不存在激动剂分子(例如麝香)的情况下，应用推定的调节剂化合物在细胞或细胞膜中表达OR家族成员，然后确定对嗅觉转导的功能作用，如以下实施例所述。将包含用潜在抑制剂处理过的OR家族成员的样品或测定与没有抑制剂的对照样品进行比较，以检查抑制程度。指定对照样品(未经抑制剂处理，但经激动剂处理)的相对最大OR活性值为100％。

嗅觉受体活性测定可以揭示以下数据：(i)给定化合物是否是嗅觉受体的激活剂，以及该化合物对特定嗅觉受体的特异性；(ii)嗅觉受体的激动剂的EC₅₀(即激动剂的EC₅₀)；和/或(iii)激动剂对嗅觉受体的功效，取决于响应的幅度(即基线和饱和活性水平之间的跨度)。

在一些形态中，当相对于激动剂对照的标准化OR活性值(100％)大于100％，例如约110％，可选地120％或150％或更大。在一个形态中，如果在增强剂化合物存在下激动剂对OR的效力增加，则实现OR的增强。在一个形态中，通过激动剂的EC₅₀的变动来确定效力的增加。或者，另一个形态中，如果在增强剂化合物存在下激动剂的EC₅₀值降低至二分之一至30分之一，则实现OR的增强。在一个形态中，如果激动剂化合物的EC₅₀值降低至二分之一，则实现OR的增强。在另一个形态中，如果在增强剂化合物存在下激动剂的EC₅₀值降低至30分之一，则实现OR的增强。

在一些形态中，如果相对于激动剂对照，在增强剂化合物存在下OR激动剂的功效增加，则可以实现OR的增强。在一个形态中，如果在增强剂化合物存在下激动剂的功效值增加到1.05倍至2倍或更大，则实现OR的增强。在一个形态中，如果在增强剂化合物存在下激动剂的功效值增加到约1.05倍，则实现OR的增强。在另一个形态中，如果在增强剂化合物存在下激动剂的功效值增加到约2倍，则实现OR的增强。

在一个形态中，当相对于激动剂对照的标准化OR活性值(100％)小于100％，例如，约80％，和选地50％或25～0％时，实现了对OR的抑制。在一个形态中，如果激动剂对OR的效力降低，则实现对OR的抑制。在另一个形态中，通过激动剂的EC₅₀的变动来确定效力的降低。在一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的EC₅₀值增加到约2倍至约30倍，则实现对OR的抑制。在一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的EC₅₀值增加到2倍，则实现对OR的抑制。在一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的EC₅₀值增加到30倍，则实现对OR的抑制。

在一些形态中，如果在拮抗剂化合物存在下OR激动剂的功效降低，则可以实现对OR的抑制。在一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的功效值降低至约1.25分之一至4分之一或更低，则实现对OR的抑制。在一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的功效值降低到0，则实现对OR的抑制。另一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的功效值降低至1.25分之一，则实现对OR的抑制。在一个形态中，如果在拮抗剂化合物存在下激动剂的功效值降低至4分之一，则实现对OR的抑制。

OR的协同增强的活性是指，与受体暴露于单独的激动剂时的活性相比，当激动剂化合物和正变构调节剂化合物的组合存在时，受体的活性通过受体暴露而增加。在一个形态中，协同增强的活性包括效力增加至约2倍至30倍和/或功效增加至约1.05倍至1.5倍或更多。

认为“OR”或“气味剂受体”或“嗅觉受体”多肽是这样的，它们属于由单个～1kb长外显子编码的7-跨膜结构域G蛋白偶联受体超家族并且表现出特征性嗅觉受体特异性氨基酸基序。这七个结构域被称为“跨膜”或称“TM”结构域TM I～TM VII，其通过三个“内部细胞环”或称“IC”结构域IC I～IC III，以及三个“外部细胞环”或称“EC”结构域EC I～EC III连接。基序及其变体定义为但不限于与TM III和IC II重叠的MAYDRYVAIC基序(SEQ ID NO:15)，与IC III和TM VI重叠的FSTCSSH基序(SEQ ID NO:16)，TM VII中的PMLNPFIY基序(SEQID NO:17)以及EC II中的三个保守C残基，以及TM I中高度保守的GN残基的存在[Zhang,X.&Firestein,S.Nat.Neurosci.5,124–133(2002)；Malnic,B.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,2584–2589(2004)]。

“OR”核酸编码具有七个具有“G蛋白偶联受体活性”的跨膜区的GPCR家族，例如，它们可响应细胞外刺激而结合G蛋白并通过刺激酶如磷脂酶C和腺苷酸环化酶而促进第二信使如IP₃、cAMP、cGMP和Ca²⁺的产生。

“旁系同源”OR基因或“旁系同源物”是基因重复的结果，是指同一物种内密切相关的同源基因。

“直系同源”OR基因或“直系同源物”定义为由共同祖先中存在的基因系统发育连接，并且指其他物种中密切相关的同源基因。

“N末端结构域”区域开始于肽或蛋白质的N末端(氨基末端)，并延伸至靠近第一跨膜区起点的区域。

“跨膜区”包含七个“跨膜结构域”，其是指位于质膜内的OR多肽的结构域，并且还可以包括相应的细胞质环(细胞内)和细胞外环。七个跨膜区、细胞外环和细胞质环可以使用标准方法鉴定，例如疏水性分布图，或如Kyte&Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105-32(1982)或在Stryer中所描述的。跨膜结构域的一般二级和三级结构，特别是G蛋白偶联受体的七个跨膜结构域，例如嗅觉受体是本领域已知的。因此，可以基于已知的跨膜结构域序列预测一级结构序列，如下文详细描述的。这些跨膜结构域可用于体外配体结合测定。

在测试调节OR家族成员介导的嗅觉转导的化合物的测定的语境中，短语“功能性效应”包括确定间接或直接受到受体影响的任何参数，例如功能性、物理性和化学性效应。它包括配体结合，离子通量、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如，cAMP、cGMP IP₃或细胞内Ca²⁺)的变化，体外、体内和离体，还包括其他生理作用，例如神经递质或激素释放的增加或减少。

在测定的语境中，“确定功能性效应”或“确认活性”是指化合物的测定，其增加或减少间接或直接受OR家族成员影响的参数，例如功能性、物理性和化学性效应。这些功能性效应可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量，例如，光谱特征(例如，荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如，形状)、色谱或溶解度性质、膜片钳、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素外排、诱导型标记、卵母细胞OR基因表达的变化；组织培养细胞OR表达；OR基因或活性诱导基因(如egr-1或c-fos)的转录激活；配体结合试验；电压、膜电位和电导变化；离子通量测定；细胞内第二信使如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3)的变化；细胞内钙水平的变化；神经递质释放等。

本文所用的术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”是指不含本发明化合物通常与其天然状态相关的其他不同化合物的状态，因此“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”物品占给定样品质量按重量计至少0.5％、1％、5％、10％或20％，或至少50％或75％。在一个特定的实施方案中，这些术语是指本发明的化合物占给定样品质量按重量计至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。如本文所用，当提及核酸或蛋白质时，核酸或蛋白质的术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”，也指不同于天然存在于哺乳动物，特别是人体中的该核酸或蛋白质的纯化或浓缩状态。任何纯化程度或浓度，只要大于天然存在于哺乳动物，特别是人体中的纯度或浓度，包括(1)从其他相关结构或化合物中的纯化，或(2)与在哺乳动物，特别是人体中通常不相关的结构或化合物的缔合，都在“分离的”的含义内。根据本领域技术人员已知的各种方法和过程，本文所述的核酸、蛋白质或核酸或蛋白质的类别可以是分离的，或如若不然与它们通常在性质上不相关的结构或化合物相缔合。

如本文所用，术语“进行扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”是指使用任何合适的扩增方法用于产生或检测天然表达的核酸的重组体，如下文详细描述的。例如，本发明提供用于扩增(例如，通过聚合酶链反应，PCR)天然表达的(例如，基因组DNA或mRNA)或本发明在体内、离体或体外的重组的核酸(例如cDNA)的方法和试剂(例如，特异性简并寡核苷酸引物对，寡聚dT引物)。

术语“7-跨膜受体”是指属于跨膜蛋白超家族的多肽，其具有跨越质膜七次的七个结构域(因此，这七个结构域被称为“跨膜”或称“TM”结构域TM I～TM VII)。嗅觉和某些味觉受体的家族都属于这个超级家庭。7-跨膜受体多肽具有相似和特征性的一级、二级和三级结构，如下面进一步详细讨论的。

术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语还包括具有合成骨架的核酸样结构。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列、以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生例如其中一个或多个选定密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。

除了本文公开的序列中显示的基因序列之外，变体还包括可能存在于给定群体内的DNA序列多态性，其可能导致本发明公开的多肽的氨基酸序列的变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。由于天然等位基因变异，这种遗传多态性可能存在于来自不同群体的细胞或来自一个群体内的细胞中。等位基因变体还可包括功能性等同物。

进一步的实施方案还涉及通过来自具体公开的核酸的此类序列多态性衍生的分子。这些天然变异通常在基因的核苷酸序列或本发明公开的多肽的氨基酸序列中产生约1～5％的变化。如上所述，编码本文实施方案的多肽的核酸是修饰旨在用于本文所述方法的非人宿主生物体或宿主细胞的有用工具。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，无论是否包含天然存在的氨基酸或聚合物和非天然存在的氨基酸或聚合物。当参考核酸的部分使用时，术语“异源的”表示核酸包含两个或更多个在自然界中彼此不存在相同关系的子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有来自无关基因的两个或更多个序列，其被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表明该蛋白质包含两个或更多个在自然界中彼此不存在相同关系的子序列(例如，融合蛋白)。

“启动子”定义为指导核酸转录的核酸序列阵列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列的TATA盒，例如，在聚合酶II型启动子的情况下。启动子还可选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点数千碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导核酸对应于第二序列的转录。

如本文所用，“重组”是指在体外合成或以其他方式操作的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)；是指使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统产生基因产物的方法；或是指重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组”还意指将具有来自不同来源的各种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接到表达盒或载体中，用于表达例如包含本发明的易位结构域的融合蛋白的诱导型或组成型表达和使用引物潜在扩增的核酸序列。“重组”还指通过基因组编辑技术(例如CRISPR/Cas9)获得的导致内源基因(例如本文提及的受体基因)稳定或瞬时表达的细胞的修饰。

术语“表达载体”是指用于在体外、离体或体内、组成型或诱导型地在任何细胞中，包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞内表达本发明核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括任何线性或环状表达系统，包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员能够根据表达系统选择合适的载体。该术语包括保持附加型或整合到宿主细胞基因组中的表达系统。该表达系统可以具有自我复制或非自我复制的能力，即驱动细胞中的瞬时表达。该术语包括重组“表达盒”，其可含有转录重组核酸所需的最小元素。该术语还涵盖用于通过例如基因组编辑方法(例如CRISPR/Cas9)表达内源基因的盒或载体。

“非人生物体或宿主细胞”是指含有本文所述核酸或表达载体并支持表达载体复制或表达的非人生物体或细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞，例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，例如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。

“标签”(tag)或“标签组合”是指可以添加到气味剂受体蛋白质中的短多肽序列。通常，将编码“标签”或“标签组合”的DNA添加到编码受体的DNA中，最终产生融合蛋白，其中“标签”或“标签组合”融合到受体的N-末端或C-末端。Lucy、

和/或Rho标签可以增强受体向细胞膜的运输，因此可以帮助表达功能性气味剂受体，用于体外基于细胞的测定[Shepard,B.et al.PLoS One 8,e68758–e68758(2013),以及Zhuang,H.&Matsunami,H.J.Biol.Chem.282,15284–15293(2007)]。

特定实施方案

本文所述的测定和方法在用于从一组化合物中鉴定一种或多种化合物的测定和方法中利用了相关的人嗅觉受体和/或相应的小鼠直系同源物，其中所述一种或多种化合物正性调节了嗅觉受体的活性，其由激动剂气味剂化合物诱导，其中该激动剂是香料业特别感兴趣的，并且在筛选测定或方法中使用目标受体、其激动剂和该一种或多种化合物的组合。

本公开提供了化合物的鉴定，该化合物可用于香料业应用，以分别调节即增强所需的香气或目标激动剂，例如麝香或花香化合物，例如muscone或花香铃兰化合物。在一些形态中，增强靶激动剂的挥发性化合物是靶激动剂嗅觉受体的正变构调节剂。不限于任何特定理论，香料成分之间的协同相互作用可以导致对香料调性的更敏感和更强烈的感知。这样的化合物因此能提供新的途径以优化香料规则并产生性能更好的商业香料配方。

在一个实施方案中，人嗅觉受体OR5AN1和/或其相应的小鼠直系同源物Olfr1440用作由各种麝香激动剂化合物激活的受体，以鉴定在麝香激动剂化合物存在下调节受体活性的化合物。人嗅觉受体OR5AN1及其相应的小鼠直系同源物Olfr1440在氨基酸水平上具有约66％的序列同一性。

在一个实施方案中，鉴于感觉结果与OR5AN1对麝香化合物的响应之间的相关性，选择OR5AN1作为由特定麝香即大环酮和硝基麝香激活的相关靶受体，使用在用于筛选和选择这些麝香化合物的正变构调节剂的测定和方法中。

在另一个实施方案中，人嗅觉受体OR10J5和/或其相应的小鼠直系同源物Olfr16用作各种花香铃兰激动剂化合物的受体，以鉴定在花香铃兰激动剂化合物存在下调节受体活性的化合物。人嗅觉受体OR10J5及其相应的小鼠直系同源物Olfr16在氨基酸水平上具有约87％的序列同一性。

OR10J5及其相应的小鼠直系同源物Olfr16花香铃兰化合物诱导的活性与花香、山谷百合、羟基香茅醛气味香调的感知的感觉结果以及总体嗅觉特征相关，所述总体嗅觉特征让人强烈地想起非常已知的成分3-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛、4-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛(以商品名

出售，以下简称

)的香调。

花香铃兰化合物是指赋予山谷百合(lily of the valley)样或铃兰(muguet)花香香调的某些化合物，包括但不限于lyral化合物。

花香铃兰化合物的例子包括但不限于国际专利申请公开号WO2017/009175 A1或WO2010/091969 A1或WO2011/029743 A1或WO2018/134221 A1或WO2008/068310 A1或WO2014/198709 A1或WO2013/117433 A1或WO2014/180945 A1或WO2014/180952 A1或WO2016/074118 A1或WO2016/074697 A1或WO2016/074719 A1或WO2014/180952 A1，或WO2001/090038 A1，或WO2008/053148 A1，或WO2017/066214 A1中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于美国专利申请公开号US2013/0090390A1或US2011/0117046 A1或US2011/0118170 A1或US2009/0036347 A1或US2011/0217257A1中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于美国专利号5,527,769 A或7,834,219B1或2,710,825 A或4,352,937 A中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于欧洲专利申请公开号EP2594626 A1或EP0392258 A2或EP2322495 A1或EP1029845 A1或EP1054053 A2或EP1529770 A1中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于欧洲专利号EP2594626 B1或EP685444B1或EP2594626 B1中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于英国专利申请公开号GB2528467A或GB988502A或GB1057360A或GB2529901A中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于Lamboley et al.,Synthesis andProperties of Conformationally Constrained Analogues of Floral-Type Odorants,Helvetica Chimica Acta,vol.84,pp1767-1793(2004)中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于Schroeder et al.,γ-UnsaturatedAldehydes as Potential Lilial Replacers,Chemistry&Biodiversity,vol.11,pp1651-1673(2014中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于Skouroumounis et al.,Synthesis of1,3,4,5-Tetrahydro-2-benzoxepin Derivatives as Conformationally RestrictedAnalogues of Cyclamenaldehyde-Type Compounds and as Intermediates for HighlyOdour-Active Homologues,Helvetica Chimica Acta,vol.79,pp1095-1109(1996)中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于Winter et al.,Synthesis and OdorProperties of Substituted Indane-2-carboxaldehydes.Discovery of a New Floral(Muguet)Fragrance Alcohol,Helvetica Chimica Acta,vol.88,pp3118-3127(2005)中公开的化合物。

花香铃兰化合物的其他例子包括但不限于Coulomb,J,Beyond Mguet,Perfumeand Flavorist,vol.43(2018)中公开的化合物。

在一些实施方案中，花香铃兰化合物从由如下构成的群组中选出：3(4)-(4-羟基-4-甲基戊基)环己基-3-烯-1-甲醛，4(4)-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛或它们的混合物；(4Z)-9-羟基-5,9-二甲基-4-癸烯醛(A)+(4E)-9-羟基-5,9-二甲基-4-癸烯醛；3-[4-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基苯基]丙醛；3-[4-(2-羟基-2-甲基丙基)苯基]丙醛；(+-)-3-[4-(2-羟基-2-甲基丙基)苯基]-2-甲基丙醛；(+-)-4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3,6-二氢-2H-吡喃-2-甲醛；甲酸(2,5-二甲基-2-茚满基)甲酯；(2,5-二甲基-1,3-二氢茚-2-基)甲醇；(2,5,6-三甲基-1,3-二氢茚-2-基)甲醇；(2,4,6-三甲基-1,3-二氢茚-2-基)甲醇；4-甲基-2-(2-甲基丙基)oxan-4-醇；7-羟基-3,7-二甲基辛醛；以及它们的混合物。

在一些实施方案中，花香铃兰化合物可以包含

和/或可以包含化合物，例如3(4)-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛，4(4)-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛或它们的混合物，其可以以下商标名出售：

和

该方法可以与其他相关的靶受体和激动剂(例如对香料业特别重要的激动剂)一起使用，以鉴定这些靶受体的关键激动剂的潜在正变构调节剂。

在一个实施方案中，本文提供了一种分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。

在一个实施方案中，本文提供了如上所述的分离的核酸序列，其编码多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本文提供了一种分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，非人生物体或宿主细胞经转化以表达多肽，该多肽包含与SEQID NO:2、4、6或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，非人生物体或宿主细胞经转化以表达包含与SEQ ID NO:2、4、6或8相同的氨基酸序列的多肽。

本文进一步提供了一种表达载体，其包含编码多肽的核酸，该多肽包含与SEQ IDNO:2、4、6或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

本文还提供了包含核酸的表达载体，该核酸包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。

本文还提供了具有核酸的表达载体，其中该核酸包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列相同的核苷酸序列。

OR可以对单一一种激动剂具有特异性，或者它们可以被一组结构上不同的激动剂或具有相似结构的一组激动剂激活。激动剂也可以特异性地激活一种OR，也可以激活多种OR。作为进行本文所述测定或方法的第一步，鉴定并选择合适的受体-激动剂对。在一个形态中，这种受体-激动剂优选特别用于设计香料组合物。

例如，参考图1和实施例1，嗅觉受体OR5AN1是一种人嗅觉受体，其麝香诱导的体外活性与麝香感官的感觉结果相关。OR5AN1嗅觉受体被麝香化合物muscone、

二甲苯麝香和麝香酮特异性地激活，并且观察到的活性水平(即效力和功效)与感官水平的个体相关(图1)。因此，OR5AN1活性的体外筛选测定对于所鉴定化合物的推定感觉结果具有预测能力，因此OR5AN1代表基于麝香定向受体的增强的良好靶标。

在本文所述的方法和测定中待测试的测试物质没有特别限制。测试物质可以是天然物质或化学或生物学合成的人工物质。测试物质可以是一种化合物，或多种化合物的混合物。

参照图6，系统地发现α-β-单不饱和二取代脂族醛显示出OR5AN1嗅觉受体活性的有效增强。

因此，本文提出的一个形态提供了一种具有以下结构的正变构调节剂：

其中式(I)化合物是麝香嗅觉受体的正变构调节剂。

为了清楚起见，通过表述“其任何一种立体异构体”或类似术语，表示本领域技术人员所理解的正常含义，即，本发明化合物可以是纯对映异构体(如果为手性)或非对映异构体(例如双键的构型为E或Z)。

在一些形态中，式(I)化合物是从由如下构成的群组中选出的：(E,E)-2,4-癸二烯醛，(E)-2-十一烯醛，(E,E)-2,4-壬二烯醛，(E)-2-十三烯醛，(2E)-2-十二烯醛，(2E,6Z)-2,6-壬二烯醛，(E,E)-2,6-壬二烯醛，(2E)-2,4-十一碳二烯醛，(2E)-2,4-十二碳二烯醛，(E)-2-壬烯醛，(2E,4E,7Z)-癸三烯醛，(Z)-2-癸烯醛，(E)-2-辛烯醛，(E)-2-癸烯醛，(Z)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-环亚己基丁-2-烯醛，(2E)-3-(4-甲基苯基)-2-丙烯醛，(2E,5E)-6,10-二甲基-2,5,9-十一碳三烯醛，(2E)-7,8-二甲基-2,7-壬二烯环己基，(5E)-7-氧代-5-庚烯酸甲酯，(2E)-7-甲基-2,6-辛二烯醛，(2E)-6,6-二甲基-2-庚烯醛，(+-)-(2E)-5,9-二甲基-2,8-癸二烯醛，(E)-2-十四烯醛，和(E)-8-甲氧基-4,8-二甲基壬-2-烯醛。

在一个形态中，该受体是OR10J5，该激动剂气味剂化合物包括花香铃兰化合物；而所选择的化合物包含从由如下构成的群组中选出的至少一种正变构调节剂：辛醛；(E)-癸-2-烯醛，2-苯基丙醛；(E)-丁-2-烯醛；3-甲基苯甲醛；3-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-2-甲基丙醛；(+-)-3-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，(+-)-4-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；庚醛，4-丙-2-基苯甲醛；(3R)-3,7-二甲基辛-6-烯醛；(+)-(3S)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，(+)-(3R)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，以及它们的混合物；己醛；2,6-二甲基庚-5烯醛；苯甲醛；2-甲基-3-(4-甲基苯基)丙醛；3,5,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，2,4,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；4-乙基苯甲醛；6-甲氧基-2,6-二甲基庚醛；(E)-壬-2-烯醛；以及它们的组合。

在一个形态中，正变构调节剂独立于受体激动剂(激活化合物)而特异性地增强特定受体的活性。

监测OR活性的方法

只要不损害OR的功能，就可以在本文所述的方法或测定中以任何形式使用它。例如，OR可以如下使用：固有表达OR的组织或细胞，例如从活体及其培养产物分离的嗅觉神经元；带有OR的嗅觉细胞膜；经基因修饰以表达OR及其培养产物的重组细胞；重组细胞的膜；和带有OR的人造脂质双层膜。

在另一个实施方案中，用于监测嗅觉受体活性的指示剂选自荧光钙指示剂染料、钙指示剂蛋白(例如GcaMP，一种遗传编码的钙指示剂)、荧光cAMP指示剂、细胞流动测定、细胞动态质量再分布测定、基于无标记的细胞测定、cAMP反应元件(CRE)介导的报告蛋白、生物化学cAMP HTRF测定、β-抑制蛋白测定或电生理学记录。特别地，选择钙指示剂染料，其可用于监测在嗅觉神经元(例如，Fura-2AM)的膜上表达的嗅觉受体的活性。

在一个具体的实施方案中，使用荧光显微镜或荧光激活细胞分选仪(FACS)依次筛选化合物，并测量钙染料荧光的气味依赖性变化。

在另一个实施方案中，嗅觉受体的分子3D受体模型用于评估计算机中的结合潜力，并鉴定可以激活、模拟、阻断、抑制、调节和/或增强嗅觉受体活性的化合物。

例如，使用连接到显微操纵器的玻璃微电极或FACS机器来分离由靶激动剂，例如麝香或花香化合物激活的嗅觉神经元。通过Ca2+成像筛选小鼠嗅觉感觉神经元，类似于先前描述的程序[Malnic,B.,et al.Cell 96,713–723(1999)；Araneda,R.C.etal.J.Physiol.555,743-756(2004)；和WO2014/210585，其全部内容通过引用并入本文。特别地，使用电动可移动显微镜台来增加每个实验可筛选的数量至至少1,500个细胞。由于小鼠中约有1,200种不同的嗅觉受体，并且每种嗅觉感觉神经元仅表达1,200种嗅觉受体基因中的1种，因此该筛选能力几乎涵盖整个小鼠气味剂受体库。换言之，用于高通量嗅觉感觉神经元筛选的钙成像的组合，可以鉴定出几乎所有对特定气味物质有反应的气味剂受体。在一个特定形态中，可以分离出响应于靶激动剂，例如麝香或花香化合物的气味剂受体。例如，分离出至少一个神经元。

对于嗅觉神经元的钙成像，可以在神经元解离之前从小鼠解剖主要的嗅觉上皮细胞。然后可以将解剖的嗅觉上皮细胞转移到解离缓冲液中进行机械和酶促解离。然后可以将解离的神经元接种到盖玻片上，允许通过荧光显微镜筛选数千个细胞，并且可以在31℃下使细胞加载钙敏感染料(Fura-2AM)例如约30分钟并转移到显微镜准备筛查。通过在解离的嗅觉神经元上灌注稀释的气味剂溶液(在生理盐水中)来刺激细胞。通过例如用50μm的恶臭化合物刺激受体，然后通过监测由Fura-2荧光的变化指示的细胞内Ca²⁺通量来鉴定响应恶臭化合物的稀有细胞。在分析之后，可以使用抽吸微量移液管从玻璃盖玻片取回响应细胞。然后将分离的细胞合并到一个样品中或单独处理以随后鉴定在响应细胞中表达为mRNA的气味剂受体基因。

在一个特定的实施方案中，根据Marko,N.F.,et al.,(2005)A robust methodfor the amplification of RNA in the sense orientation.BMC genomics,6,27；doi:10.1186/1471-2164-6-27(Eberwine方法)中通常描述的方法纯化和扩增嗅觉神经元的mRNA。使用下一代测序(NGS)技术对至少一部分转录组(直至包括整个转录组)进行测序或使用微阵列技术与已知基因杂交。NGS通常在Metzker,M.L.Nat.Rev.Genet.11,31–46(2010)中讨论和描述。在特定的实施方案中，汇集至少5个呈现相同响应谱的神经元。挑选后立即通过细胞裂解释放mRNA；没有DNA酶，也没有进行纯化步骤。通过连续两轮体外转录(IVT)来扩增mRNA。扩增可以根据MesageAmpII aRNA试剂盒(Ambion，AMA1751)进行，参数如下：两轮连续14小时长IVT。

在另一个实施方案中，使用基于LD-PCR(长距离聚合酶链式反应)的方法，例如在用于下一代测序(NGS)的NGS-ready试剂盒中描述的方法(例如，Clontech/Takara，

Low Input RNA Kit for Sequencing-v3，目录号634848)，纯化和扩增单个嗅觉神经元的mRNA。首先将单细胞mRNA逆转录成相应的cDNA，随后用18个PCR循环扩增，并用作转录组测序的NGS样品。

在又一个实施方案中，通过将从分离的激活的嗅觉感觉神经元获得的NGS读数的结果与相同物种的参考基因组序列进行比较，确定靶激动剂(例如麝香或花香化合物)嗅觉受体的组或基因家族的同一性(例如，多达所挑选的神经元的数量)。特别地，推定的靶激动剂(例如麝香或花香化合物)受体将是嗅觉神经元衍生的NGS样品中最高度丰富的嗅觉受体mRNA，或存在于多于一个的独立的生物复制品中。由于嗅觉代码的组合性质(一种化合物激活许多OR，而一种OR可被许多化合物激活)，汇集由给定化合物激活的几种神经元，允许在单个NGS实验中检索几乎所有负责感知这些分子的受体。因此，汇集功能相似的神经元极大地提高了脱孤法的通量和速度。

然后使用标准生物信息学工具在假设同源序列受体保留相似功能的情况下鉴定与其他推定的哺乳动物(非人)的靶激动剂(例如麝香或花香化合物)受体最密切相关的人类气味剂受体。几种方法基于该假设[Armelin-Correa and Malnic(2017)]成功鉴定人OR-配体对，并且高达80％的小鼠-人直系同源物似乎保持相似的功能反应谱[Adipietro,K.A,et al.PLoS Genet.8,e1002821–e1002821(2012)]。可以使用BLASTP和/或BLASTN算法的默认参数，或其他直系同源对识别算法，例如InParanoid。

人类或非人类哺乳动物的靶激动剂(例如麝香或花香化合物)受体可适用于功能测定，其可用于鉴定结合、抑制、阻断、抑制和/或调节嗅觉受体活性的化合物。特别地，该测定可以是基于细胞的测定或结合测定，而用于鉴定化合物的方法可以是高通量筛选测定。更具体地，本文提供了基于受体的测定，其适于用化合物文库高通量筛选受体，以发现针对特定的激动剂的正变构调节剂化合物。

在一个具体的实施方案中，靶激动剂(例如麝香或花香化合物)的受体基因序列从如下对靶激动剂敏感的细胞鉴定：将汇集的神经元加热至75℃10分钟以破坏细胞膜并使其mRNA可用于扩增。当在有限量的起始材料下(通常为1～15个细胞)应用NGS技术时，该扩增步骤是重要的。根据Eberwine方法(IVT)的线性扩增确保维持表达基因的相对转录水平。连续两轮过夜(14h)的体外转录用于产生足够量的cRNA；然后使用扩增的cRNA产生IlluminaHiSeq cDNA文库。得到的通常为75～150个碱基对的短序列(通常称为“读段”(reads))与小鼠的参考基因组(例如UCSC版本mm9或mm10)进行比对，以构建这些细胞的完整转录组。转录组数据的定量分析产生了转录的气味剂受体基因列表及其各自的表达水平。显示最丰富的mRNA水平(最丰富的“读段”)或存在于一次以上重复实验中的气味剂受体基因被认为是推定的靶激动剂受体。

然后使用预测的小鼠OR基因挖掘小鼠和人类基因组数据库的最新版本，以鉴定小鼠(旁系同源基因)和人类(直系同源基因)中最密切相关的受体(即最高序列相似性)。该过程可以使用BLAST搜索算法(在NCBI网站上公开获得)，一种序列相似性搜索工具，其中先前从初始转录组分析获得的每个推定的基因序列被用作查询序列。在认为旁系同源和直系同源基因极有可能具有相似活性的假设下，从该数据挖掘过程中鉴定的新鉴定的基因被认为是潜在的麝香或花香受体。在一个具体的实施方案中，进行序列同源性的成对比较以鉴定小鼠和人类中密切相关的受体，并如WO2014/210585中所述鉴定受体。也可以使用其他方法，例如RT-PCR和微阵列或质谱法。

在另一个实施方案中，为了完成脱孤法，进一步在体外表达候选OR基因，以确认针对用于分离嗅觉感觉神经元和其他结构相关的目标化合物的化合物的活性。从对靶激动剂(例如麝香或花香化合物)有响应的分离的嗅觉神经元中鉴定的小鼠受体在其N-末端用短多肽序列(例如，

(SEQ ID NO:10)、Rho(SEQ ID NO:12；牛视紫红质受体的头20个氨基酸)和/或Lucy(SEQ ID NO:14；可裂解的亮氨酸信号肽序列)标签)修饰，在HEK 293T细胞中瞬时表达，并用靶激动剂(例如麝香或花香化合物)分别刺激以证实它们作为真正的特定靶激动剂受体的身份。在另一个实施方案中，无论是通过内源RTP1基因的激活(如WO2016201153 A1中所述)还是通过转化或病毒转导，RTP1基因也可以在细胞系中表达。在该基于细胞的测定中，人类Gα亚基Gα_olf的共表达激活了Gs转导途径，其导致在与合适的配体结合后内部cAMP增加。或者，在基于细胞的测定中，人类Gα亚基Gα₁₅的共表达激活了Gq转导途径，其导致在与合适的配体结合后内部Ca²⁺增加。上述过程和迄今为止获得的结果用于验证快速和可靠地鉴定靶激动剂的哺乳动物气味剂受体的过程。

进一步提供了基于特定靶激动剂-受体对的使用来鉴定作为靶激动剂的正变构调节剂的化合物的测定法。在另一个实施方案中，本文提供了正变构调节剂化合物，其与嗅觉受体上与激动剂结合的位点不同的位点结合，并增强从OR5AN1、OR10J5、Olfr1440或Olfr16中选出的至少一种嗅觉受体的活性，并且通过本文所述的方法鉴定，例如下文所述的化合物。

在一个实施方案中，通过将化合物与靶激动剂的结合与单独的靶激动剂的结合以及与单独的化合物的结合进行比较来确定化合物的活性。

在另一个实施方案中，使化合物与受体(其与靶激动剂组合)、或其嵌合体或片段接触，其中该受体、或其嵌合体或片段在经重组修饰以表达该受体多肽的细胞中表达。

化合物的活性可以使用体内、离体、体外和合成筛选系统来确定。

在另一个实施方案中，用含有本文所述多肽的脂质体或病毒诱导的芽殖膜(budding membranes)进行接触。

在另一个实施方案中，用于鉴定结合、抑制、阻断、限制和/或调节对靶激动剂特异的嗅觉受体活性的化合物的方法可以在完整细胞或来自表达本文所述多肽的细胞的膜级分上进行。

在一个实施方案中，本文所述的OR参与对特定靶激动剂(例如麝香或花香铃兰化合物)的感知，并构成有价值的候选受体，用于鉴定正变构调节剂化合物，当与靶激动剂结合使用时，该化合物可增强对特定靶激动剂的感知。

根据本发明适用的多肽

本发明涉及本文具体描述的多肽的“功能等同物”或“类似物”或“功能突变”。

例如，“功能等同物”是指一种多肽，其在用于OR活性的测试中显示至少1％至10％、或至少20％、或至少50％、或至少75％或至少90％更高或更低如本文所定义的OR活性。

根据本发明，“功能等同物”还涵盖特定的突变体，其在本文所述的氨基酸序列的至少一个序列位置中具有与具体陈述的氨基酸不同的氨基酸，但是仍然具有上述生物活性之一。因此，“功能等同物”包括可通过一个或多个，例如1至20个、1至15个或5至10个氨基酸的添加、取代特别是保守取代、缺失和/或倒置而获得的突变体，其中所述变化可以在任何序列位置上出现，只要它们导致突变体具有本发明特性的概貌。还特别地提供功能等同性，如果活性模式与在突变体和未改变的多肽之间定性地重合，即，如果例如观察到与相同的激动剂或拮抗剂的相互作用，但是速率不同(即，通过EC₅₀或IC₅₀值或任何本技术领域合适的其他参数来表示)。下表显示了合适的(保守)氨基酸取代的例子：

上述意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”，以及所述多肽的“功能衍生物”和“盐”。

在该情况下，“前体”是具有或不具有所需生物活性的多肽的天然或合成前体。

表述“盐”是指根据本发明的蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成的盐。羧基的盐可以已知的方式生产，包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，以及与有机碱例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等形成的盐。酸加成的盐，例如与无机酸例如盐酸或硫酸形成的盐，以及与有机酸例如乙酸和草酸形成的盐，也被本发明所涵盖。

根据本发明的多肽的“功能衍生物”还可以使用已知技术在功能性氨基酸侧基或它们的N末端或C末端产生。这样的衍生物包括例如：羧酸基的脂族酯，羧酸基的酰胺，它们可通过与氨或与伯或仲胺反应获得；游离氨基的N-酰基衍生物，其通过与酰基反应生成；或游离羟基的O-酰基衍生物，其通过与酰基反应生成。

“功能等同物”自然也包括可以从其他生物体获得的多肽以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较来确定同源序列区域的面积，并且等同的多肽可以基于本发明的具体参数来确定。

“功能等同物”还包括根据本发明的多肽(其例如表现出所需的生物学功能)的片段，优选单个结构域或序列基序。

此外，“功能等同物”是融合蛋白，其具有本文所述的多肽序列之一或由其衍生的功能等同物，以及在功能性N-末端或C-末端缔合(即，没有融合蛋白部分的实质性相互功能受损)中具有至少一个另外的功能不同的异源序列。这些异源序列的非限制性例子是例如信号肽、组氨酸锚或酶。

根据本发明还包括的“功能等同物”是与具体公开的多肽的同源物。它们与具体公开的氨基酸序列具有至少60％，优选至少75％，特别是至少80或85％，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同源性(或同一性)，其通过Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法计算。根据本发明的同源多肽的以百分比表示的同源性或同一性尤其是指基于本文具体描述的氨基酸序列之一的总长度，以氨基酸残基的百分比表示的同一性。

以百分比表示的同一性数据也可以借助于BLAST比对，算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过应用本文下面详述的Clustal设置来确定。

在可能的蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的“功能等同物”包括本文所述的去糖基化或糖基化形式的多肽，以及可以通过改变糖基化模式获得的经修饰形式的多肽。

根据本发明的多肽的此类功能等同物或同源物可以通过诱变产生，例如通过点突变，延长或缩短蛋白质或如下文更详细描述。

根据本发明的多肽的此类功能等同物或同源物可以通过筛选突变体例如缩短的突变体的组合数据库来鉴定。例如，蛋白质变体的多样性数据库可以通过在核酸水平上的组合诱变，例如通过合成寡核苷酸混合物的酶促连接来产生。有许多方法可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物的数据库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可以将合成基因连接在合适的表达载体中。简并基因组的使用使得可以提供混合物中的所有序列，其编码所需的潜在蛋白质序列集合。简并寡核苷酸的合成方法是本领域技术人员已知的(例如Narang,S.A.(1983)；Itakura et al.(1984)(a)；Itakura etal.,(1984)(b)；Ike et al.(1983))。该方法还涵盖了多肽的产生，该多肽具有密码子优化的核酸序列，即适应宿主细胞的密码子使用频率。

在现有技术中，已知几种技术用于筛选通过点突变或缩短产生的组合数据库的基因产物，以及用于筛选具有选定性质的基因产物的cDNA文库。这些技术可以适用于快速筛选通过根据本发明的同源物的组合诱变产生的基因库。最常用于筛选大型基因库的基于高通量分析的技术包括在可复制的表达载体中克隆基因库，用所得载体数据库转化合适的细胞，以及在特定条件下表达组合基因，在所述条件下，所需活性的检测促进编码基因(其产物被检测)的载体的分离。递归整合诱变(REM)是一种提高数据库中功能突变体频率的技术，其可以与筛选测试结合使用，以鉴定同源物(Arkin and Yourvan(1992)；Delgrave etal.(1993))。

根据本发明适用的编码核酸序列

本发明还涉及编码本文定义的多肽的核酸序列。

本发明还涉及与本文具体公开的序列具有一定程度的“同一性”的核酸。两个核酸之间的“同一性”是指在每种情况下在核酸的整个长度上核苷酸的同一性。

例如，同一性可以通过Informax公司(美国)的Vector NTI Suite 7.1程序使用Clustal方法(Higgins DG,Sharp PM.((1989)))通过以下设置来计算：

多重比对参数：

成对比对参数：

或者，同一性可以根据Chenna et al.(2003)，网页：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#的方法和以下设置来确定：

本文提及的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以以已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生，例如通过双螺旋的各个重叠的互补核酸结构单元的片段缩合来实现。寡核苷酸的化学合成例如可以通过磷酰胺法(Voet,Voet,2ndedition,Wiley Press,New York,pages 896-897)以已知的方式进行。合成寡核苷酸的积累，和借助于DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应的空位的填补，以及一般的克隆技术描述于Sambrook et al.(1989)，请参阅下文。

本发明还涉及编码上述多肽之一及其功能等同物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其可以例如使用人工核苷酸类似物获得。

本发明涉及编码根据本发明的多肽或其生物活性区段的分离的核酸分子，并且涉及核酸片段，其可以例如用作杂交探针或引物，用于鉴定或扩增根据本发明的编码核酸。

根据本发明的核酸分子可以另外包含来自编码遗传区域的3'和/或5'末端的非翻译序列。

本发明进一步涉及与具体描述的核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。

根据本发明的核苷酸序列使得可以产生可用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物体中的同源序列的探针和引物。此类探针或引物通常包含在“严格”条件下(参见下文)与根据本发明的核酸序列的有义链或相应的反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。

“分离的”核酸分子与存在于核酸天然来源中的其他核酸分子分离，并且如果通过重组技术生产，则可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或者如果通过化学合成，则可以不含化学前体或其他化学物质。

可以借助于分子生物学的标准技术和根据本发明提供的序列信息来分离根据本发明的核酸分子。例如，可以使用具体公开的完整序列之一或其片段作为杂交探针和标准杂交技术(例如，描述于Sambrook,(1989))从合适的cDNA文库中分离cDNA。另外，包含所公开的序列之一或其片段的核酸分子可以使用基于该序列构建的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应来分离。以此方式扩增的核酸可以克隆到合适的载体中，并可以通过DNA测序来表征。根据本发明的寡核苷酸也可以通过标准的合成方法，例如使用自动DNA合成仪制备。

根据本发明的核酸序列或其衍生物，这些序列的同源物或部分可以例如通过常规的杂交技术或PCR技术从其他细菌中，例如通过基因组或cDNA文库分离出来。这些DNA序列在标准条件下与根据本发明的序列杂交。

“杂交”是指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下结合几乎互补的序列的能力，而在这些条件下非互补配对者之间不发生非特异性结合。为此，序列可以是90～100％互补的。能够彼此特异性结合的互补序列的性质被用于例如Northern印迹或Southern印迹或PCR或RT-PCR中的引物结合。

保守区的短寡核苷酸有利地用于杂交。然而，也可能使用更长的本发明核酸片段或完整序列进行杂交。这些标准条件取决于所使用的核酸(寡核苷酸，更长的片段或完整序列)或用于杂交的核酸类型(DNA或RNA)而有所不同。例如，DNA:DNA杂交种的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂交种低约10℃。

例如，根据特定核酸的不同，标准条件是指温度在42至58℃，在浓度为0.1至5xSSC(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)的缓冲水溶液中，或另外在50％甲酰胺(例如42℃，5x SSC，50％甲酰胺)的存在下。有利地，用于DNA:DNA杂交种的杂交条件是0.1×SSC，温度为约20℃至45℃，优选约30℃至45℃。对于DNA:RNA杂交种，杂交条件有利地为0.1×SSC，并且温度为约30℃至55℃，优选约45℃至55℃。这些所述的杂交温度是对于长度约100个核苷酸的核酸，以及在不存在甲酰胺的情况下G+C含量为50％的经计算的解链温度值的例子。DNA杂交的实验条件已在相关的遗传学教科书(例如Sambrook et al.,1989)中进行了描述，并且可以使用本领域技术人员已知的分子式来计算，例如取决于核酸的长度，杂交种的类型或G+C含量。本领域技术人员可以从以下教科书中获得有关杂交的更多信息：Ausubel et al.(eds),(1985),Brown(ed)(1991)。

“杂交”尤其可以在严格条件下进行。这样的杂交条件例如描述于Sambrook(1989)，或Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。

如本文所用，术语“杂交或在一定条件下杂交”旨在描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此显著相同或同源的核苷酸序列保持彼此结合。该条件可以使得至少约70％，例如至少约80％和例如至少约85％、90％或95％同一性的序列保持彼此结合。本文提供了低严格度、中等和高严格度杂交条件的定义。

本领域技术人员可以通过例如Ausubel等人(1995,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,sections 2,4,and 6)所举例说明的那样以最少的实验来选择合适的杂交条件。另外，严格条件在Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Press,chapters 7,9,and 11)中描述。

如本文所用，所限定的低严格度条件如下。含有DNA的滤膜在含有35％甲酰胺，5xSSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中于40℃预处理6小时。杂交在相同的溶液中进行，并进行以下修改：0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x10⁶ 32P标记的探针。将滤膜在杂交混合物中于40℃孵育18～20小时，然后于55℃洗涤1.5小时。在含有2x SSC，25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中。用新鲜溶液代替洗涤溶液，并在60℃下再孵育1.5小时。将滤膜吸干并进行放射自显影。

如本文所用，所限定的中等严格度条件如下。含有DNA的滤膜在含有35％甲酰胺，5x SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中于50℃预处理7小时。杂交在相同的溶液中进行，并进行以下修改：0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x10⁶ 32P标记的探针。将滤膜在杂交混合物中于50℃孵育30小时，然后于55℃洗涤1.5小时。在含有2x SSC，25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中。用新鲜溶液代替洗涤溶液，并在60℃下再孵育1.5小时。将滤膜吸干并进行放射自显影。

如本文所用，所限定的高严格度条件如下。含DNA的滤膜在由6x SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA组成的缓冲液中于65℃下预杂交8小时至过夜。在含有100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20x10⁶ cpm 32P标记探针的预杂交混合物中，将滤膜在65℃下杂交48小时。滤膜在含有2xSSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中于37℃洗涤1小时。然后在0.1x SSC中于50℃洗涤45分钟。

如果上述条件不合适(例如，如用于种间杂交)，则可以使用本领域众所周知的其他低、中等和高严格度条件(例如，用于种间杂交)。

本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。

因此，根据本发明的其他核酸序列可以衍生自本文具体公开的序列，并且可以通过添加、取代、插入或缺失单个或几个核苷酸而与之不同，并且还编码具有所需特性概貌的多肽。

本发明还涵盖这样的核酸序列，其包含所谓的沉默突变，或根据具体原始或宿主生物体的密码子使用，与具体所述的序列相比已经改变，以及其天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。

还涉及可通过保守核苷酸取代(即，所讨论的氨基酸被具有相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸取代)获得的序列。

本发明还涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。由于自然变异，这些遗传多态性可存在于种群中的个体之间。这些自然变异通常会在基因的核苷酸序列中产生1～5％的变异。

根据本发明的核酸序列的衍生物是指例如等位基因变体，在所衍生的氨基酸水平上，其具有至少60％的同源性，优选至少80％的同源性，非常特别优选在整个氨基酸范围至少90％的同源性(关于氨基酸水平的同源性，应参考以上对于多肽给出的详细信息)。有利地，同源性可以在序列的部分区域上更高。

此外，衍生物也应理解为根据本发明的核酸序列的同源物，例如动物、植物、真菌或细菌的同源物，缩短的序列，编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，在DNA水平上，同源物在本文具体公开的序列中给定的整个DNA区域中具有至少40％，优选至少60％，特别优选至少70％，非常特别优选至少80％的同源性。

此外，衍生物应理解为例如与启动子的融合体。尽管不损害启动子的功能或功效，添加至所述核苷酸序列的启动子可以通过至少一种核苷酸交换、至少一种插入、倒位和/或缺失来修饰。而且，启动子的功效可以通过改变它们的序列来增加，或者可以与更有效的启动子甚至是不同属的生物体的启动子完全交换。

功能性多肽突变体的产生

此外，本领域技术人员熟悉用于产生功能性突变体的方法，也就是说，编码多肽的核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO:2、4、6或8中的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；和/或由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1、3、5或7具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

取决于所使用的技术，本领域技术人员可以将完全随机的或更有针对性的突变引入到基因或非编码核酸区域(例如对于调节表达很重要)中，并随后产生遗传文库。为此目的所需的分子生物学方法是技术人员已知的，例如描述于Sambrook and Russell,Molecular Cloning.3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001。

修饰基因并由此修饰由其编码的多肽的方法是本领域技术人员长期已知的，举例而言例如：

-位点特异性诱变，其中基因的单个或多个核苷酸以定向方式被替换(Trower MK(Ed.)1996；In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey)，

-饱和诱变，其中任何氨基酸的密码子都可以在基因的任何位点交换或添加(Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res 22:1593；BarettinoD,Feigenbutz M,Valcárel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541；BarikS(1995)Mol Biotechnol 3:1)，

-易错聚合酶链反应，其中核苷酸序列被易错DNA聚合酶突变(Eckert KA,KunkelTA(1990)Nucleic Acids Res 18:3739)；

-SeSaM法(序列饱和法)，其中优选的交换被聚合酶阻止。Schenk et al.,Biospektrum,Vol.3,2006,277-279，

-突变株中的基因传代，其中例如由于DNA修复机制缺陷，核苷酸序列的突变率增加(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesistechnique using an E.coli mutator strain.In:Trower MK(Ed.)In vitromutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey)，或

-DNA改组，其中形成并消化一组密切相关的基因，并将这些片段用作聚合酶链反应的模板，其中通过重复的链分离和重新结合，最终生成了全长的镶嵌基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389；Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。

使用所谓的定向进化(尤其描述于Reetz MT and Jaeger K-E(1999),TopicsCurr Chem 200:31；Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods foroptimizing industrial polypeptides by directed evolution,In:Demain AL,DaviesJE(Ed.)Manual of industrial microbiology and biotechnology.American Societyfor Microbiology)，熟练的工人可以以定向的方式大规模生产功能性突变体。为此，在第一步中，首先，例如使用上文给出的方法，产生各个多肽的基因文库。基因文库以合适的方式表达，例如通过细菌或噬菌体展示系统来表达。

表达功能性突变体的宿主生物的相关基因(其功能在很大程度上与所需的特性相对应)可以提交给另一个突变周期。突变和选择或筛选的步骤可以迭代地重复，直到本发明的功能性突变体具有足够程度的所需特性。使用该迭代过程，可以分阶段进行有限数量的突变，例如1、2、3、4或5个突变，并评估和选择它们对所研究活性的影响。然后可以以相同的方式将所选择的突变体进行进一步的突变步骤。这样，可以显著减少待研究的单个突变体的数量。

根据本发明的结果还提供了与相关多肽的结构和序列有关的重要信息，这是以靶向方式产生具有所需修饰特性的其他多肽所必需的。特别地，可以定义所谓的“热点”，即潜在地适合于通过引入靶向突变来修饰特性的序列区段。

也可以推导出有关氨基酸序列位置的信息，在该区域中可以发生可能对活性几乎没有影响的突变，并且可以将其指定为潜在的“沉默突变”。

用于制备本发明多肽的构建体

如上所述的核苷酸序列可以是表达盒的一部分。术语表达盒和表达构建体同义使用。优选的重组表达构建体包含这样的核苷酸序列，其编码根据本发明的多肽并且在调节核酸序列的遗传控制之下。

在根据本发明应用的方法中，表达盒可以是表达载体，特别是重组表达载体的一部分。

根据本发明，“表达单位”应理解为是指具有表达活性的核酸，其包含如本文所定义的启动子，并且在与待表达的核酸或基因功能性连接后调节表达，即所述核酸或所述基因的转录和翻译。因此在这方面也被称为“调节核酸序列”。除启动子外，还可以存在其他调节元件，例如增强子。

根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”应理解为在功能上与要表达的核酸或要表达的基因连接的表达单元。因此，与表达单元相反，表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，而且还包含由于转录和翻译而作为蛋白质表达的核酸序列。

在本发明的语境中，术语“表达”或“过表达”描述了微生物中一种或多种由相应DNA编码的多肽的细胞内活性的产生或增加。为此，例如可以将基因导入到生物体中，用另一个基因替代现有基因，增加基因的拷贝数，使用强启动子或使用编码具有高活性的相应多肽的基因。可选地，这些措施可以组合。

优选地，根据本发明的此类构建体包含各自编码序列5'上游的启动子和3'下游的终止子序列，以及可选地其他常见的调控元件，在每种情况下均与编码序列可操作地连接。

根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”应理解为是指这样一种核酸，当与要转录的核酸功能性连接时，其调节所述核酸的转录。

在本文语境中，“功能性”或“可操作地”连接被理解为例如如下物质的顺序排列：具有启动子活性的核酸之一，和待转录的核酸序列以及可选的其他调控元件(例如确保核酸转录的核酸序列)和例如终止子，该顺序排列的方式为使得每个调控元件都能在核酸序列转录后执行其功能。这不一定需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列，例如增强子序列，甚至可以从更远的位置甚至从其他DNA分子上对目标序列发挥作用。优选的排列是这样的，其中待转录的核酸序列位于启动子序列的后面(即3'端)，从而使两个序列共价连接在一起。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离可以小于200个碱基对，或小于100个碱基对或小于50个碱基对。

除启动子和终止子外，还可以提及以下作为其他调控元件的例子：靶向序列，增强子，聚腺苷酸化信号，选择标记，扩增信号，复制起点等。合适的调节序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)。

根据本发明的核酸构建体特别地包含编码例如衍生自SEQ ID NO.1、3、5或7或其反向互补序列的多肽，或其衍生物和同源物，以及核酸序列，该核酸序列可由其衍生，并已与一个或多个调节信号可操作地或功能性连接，用于有利地控制例如增加基因表达。

除了这些调控序列之外，这些序列的天然调控可能仍存在于实际的结构基因之前，并且可选地可能已经进行了遗传修饰，因此天然调控已被关闭，基因的表达得到了增强。然而，核酸构建体也可以具有更简单的构建，即，在编码序列之前没有插入额外的调节信号，并且具有调节作用的天然启动子尚未去除。相反，天然调节序列被突变，使得不再发生调节并且基因表达增加。

优选的核酸构建体有利地还包含与启动子功能性连接的一个或多个已经提及的“增强子”序列，该序列使得增强核酸序列的表达成为可能。还可以在DNA序列的3'末端插入其他有利的序列，例如其他调控元件或终止子。根据本发明的核酸的一个或多个拷贝可以存在于构建体中。在该构建体中，还可以任选存在其他标计物，例如与营养缺陷性或抗生素抗性互补的基因，以便选择该构建体。

合适的调控序列的例子存在于启动子中，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaP_BAD)SP6、lambda-PR或lambda-PL启动子中，它们有利地用于革兰氏阴性细菌中。其他有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，酵母或真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人工启动子也可以用于调节。

为了在宿主生物体中表达，将核酸构建体有利地插入到载体，例如质粒或噬菌体中，这使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。除了质粒和噬菌体，载体还应理解为是本领域技术人员已知的所有其他载体，即例如病毒，例如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体能够在宿主生物体中自主复制或通过染色体复制。这些载体是本发明的进一步发展。

合适的质粒是例如在大肠杆菌pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI中，在链霉菌pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361中，在芽孢杆菌pUB110、pC194或pBD214中，在棒状杆菌pSA77或pAJ667中，在真菌pALS1、pIL2或pBB116中，在酵母2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23中，或在植物pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51中。上述质粒是可能的质粒的少量选择。其他质粒是技术人员众所周知的，并且可以在例如书籍Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.et al.Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中找到。

在载体的进一步开发中，包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体也可以有利地以线性DNA的形式引入到微生物中并通过异源或同源重组整合到宿主生物体的基因组中。该线性DNA可以由线性化的载体例如质粒组成，或者仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。

为了在生物体中异源基因的最佳表达，有利的是修饰核酸序列以匹配生物体中使用的特定“密码子使用”。“密码子使用”可以通过对所讨论的生物体的其他已知基因的计算机评估来容易地确定。

根据本发明的表达盒通过将合适的启动子融合到合适的编码核苷酸序列和终止子或聚腺苷酸化信号来产生。为此目的使用常规的重组和克隆技术，例如描述于T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)和T.J.Silhavy,M.L.Berman and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)和Ausubel,F.M.et al.,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)。

为了在合适的宿主生物体中表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入到宿主特异性载体中，这使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。载体是技术人员众所周知的，并且可以在例如"cloning vectors"(Pouwels P.H.et al.,Ed.,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。

本文鉴定和/或使用的核酸和氨基酸序列列于下：

Human OR5AN1

Homo sapiens_OR5AN1麝香受体

SEQ ID NO:1-DNA

atgactgggggaggaaatattacagaaatcacctatttcatcctgctgggattctcagattttcccaggatcataaaagtgctcttcactatattcctggtgatctacattacatctctggcctggaacctctccctcattgttttaataaggatggattcccacctccatacacccatgtatttcttcctcagtaacctgtccttcatagatgtctgctatatcagctccacagtccccaagatgctctccaacctcttacaggaacagcaaactatcacttttgttggttgtattattcagtactttatcttttcaacgatgggactgagtgagtcttgtctcatgacagccatggcttatgatcgttatgctgccatttgtaaccccctgctctattcatccatcatgtcacccaccctctgtgtttggatggtactgggagcctacatgactggcctcactgcttctttattccaaattggtgctttgcttcaactccacttctgtgggtctaatgtcatcagacatttcttctgtgacatgccccaactgttaatcttgtcctgtactgacactttctttgtacaggtcatgactgctatattaaccatgttctttgggatagcaagtgccctagttatcatgatatcctatggctatattggcatctccatcatgaagatcacttcagctaaaggcaggtccaaggcattcaacacctgtgcttctcatctaacagctgtttccctcttctatacatcaggaatctttgtctatttgagttccagctctggaggttcttcaagctttgacagatttgcatctgttttctacactgtggtcattcccatgttaaatcccttgatttacagtttgaggaacaaagaaattaaagatgccttaaagaggttgcaaaagagaaagtgctgctgag

SEQ ID NO:2-蛋白质

MTGGGNITEITYFILLGFSDFPRIIKVLFTIFLVIYITSLAWNLSLIVLIRMDSHLHTPMYFFLSNLSFIDVCYISSTVPKMLSNLLQEQQTITFVGCIIQYFIFSTMGLSESCLMTAMAYDRYAAICNPLLYSSIMSPTLCVWMVLGAYMTGLTASLFQIGALLQLHFCGSNVIRHFFCDMPQLLILSCTDTFFVQVMTAILTMFFGIASALVIMISYGYIGISIMKITSAKGRSKAFNTCASHLTAVSLFYTSGIFVYLSSSSGGSSSFDRFASVFYTVVIPMLNPLIYSLRNKEIKDALKRLQKRKCC

Human OR10J5

Homo sapiens_OR10J5花香铃兰受体

SEQ ID NO:3-DNA

atgaagagaaagaacttcacagaagtgtcagaattcattttcttgggattttctagctttggaaagcatcagataaccctctttgtggttttcctaactgtctacattttaactctggttgctaacatcatcattgtgactatcatctgcattgaccatcatctccacactcccatgtatttcttcctaagcatgctggctagttcagagacggtgtacacactggtcattgtgccacgaatgcttttgagcctcatttttcataaccaacctatctccttggcaggctgtgctacacaaatgttcttttttgttatcttggccactaataattgcttcctgcttactgcaatggggtatgaccgctatgtggccatctgcagacccctgagatacactgtcatcatgagcaagggactatgtgcccagctggtgtgtgggtcctttggcattggtctgactatggcagttctccatgtgacagccatgttcaatttgccgttctgtggcacagtggtagaccacttcttttgtgacatttacccagtcatgaaactttcttgcattgataccactatcaatgagataataaattatggtgtaagttcatttgtgatttttgtgcccataggcctgatatttatctcctatgtccttgtcatctcttccatccttcaaattgcctcagctgagggctggaagaagacctttgccacctgtgtctcccacctcactgtggttattgtccactgtggctgtgcctccattgcctacctcaagccgaagtcagaaagttcaatagaaaaagaccttgttctctcagtgacgtacaccatcatcactcccttgctgaaccctgttgtttacagtctgagaaacaaggaggtaaaggatgccctatgcagagttgtgggcagaaatatttcttaa

SEQ ID NO:4-蛋白质

MKRKNFTEVSEFIFLGFSSFGKHQITLFVVFLTVYILTLVANI I IVTI ICIDHHLHTPMYFFLSMLASSETVYTLVIVPRMLLSLIFHNQPISLAGCATQMFFFVILATNNCFLLTAMGYDRYVAICRPLRYTVIMSKGLCAQLVCGSFGIGLTMAVLHVTAMFNLPFCGTVVDHFFCDIYPVMKLSCIDTTINEIINYGVSSFVIFVPIGLIFISYVLVISSILQIASAEGWKKTFATCVSHLTVVIVHCGCASIAYLKPKSESSIEKDLVLSVTYTIITPLLNPVVYSLRNKEVKDALCRVVGRNIS

Mouse Olfr1440

Mus musculus_Olfr1440_麝香受体

SEQ ID NO:5-DNA

atgcctggagggaggaatagcacagtcatcaccaagttcatccttgtgggattctcagattttccaaagctcaagctggttctctttgttatcttcctgggaagttatctctccacagtggtgtggaacttgggcctcatcatcttgattaggattgacccttacctacacacacctatgtacttcttcctcagcaatttgtcatttttagatttctgttacatttcatctacaacccctaaaatgctctcgggattcttccagaagtctaaatctatctcctttgttgggtgcaccatgcagtacttcatcttctcaagcctgggtctgtccgaatgctgccttctggcagccatggcttatgaccggtatgctgccatttgtaatcctcttctctacacagccatcatgtccccgtcactctgtgtgcacatggtggttggagcctatagtactggtctcttgggttcattgattcaactgtgtgctatacttcagctccatttctgtgggccaaatattataaaccatttcttttgtgacctgcctcagctattagttctttcctgctctgaaacctttcccctgcaagtcttgaaatttgtaatagcagtgatttttggggtggcatctgtcattgttatcctgatatcctatggttatatcattggcacaatcctgaatatcagctcagtagaaggtaggtccaaggcattcaatacctgtgcctctcacctgacagcagtcaccctcttttttggatcaggactctttgtctatatgcgccccagctccaacagttcccagggttatgacaagatggcttccgtgttctatacagtggtgattcccatgttgaatcctctgatttatagtctcaggaacaaggaaataaaagatgctcttcagagatgtaaaaataagtgcttttctcagtgccactgttag

SEQ ID NO:6–蛋白质

MPGGRNSTVITKFILVGFSDFPKLKLVLFVIFLGSYLSTVVWNLGLIILIRIDPYLHTPMYFFLSNLSFLDFCYISSTTPKMLSGFFQKSKSISFVGCTMQYFIFSSLGLSECCLLAAMAYDRYAAICNPLLYTAIMSPSLCVHMVVGAYSTGLLGSLIQLCAILQLHFCGPNIINHFFCDLPQLLVLSCSETFPLQVLKFVIAVIFGVASVIVILISYGYIIGTILNISSVEGRSKAFNTCASHLTAVTLFFGSGLFVYMRPSSNSSQGYDKMASVFYTVVIPMLNPLIYSLRNKEIKDALQRCKNKCFSQCHC

Mouse Olfr16

Mus musculus_Olfr16_花香铃兰受体

SEQ ID NO:7-DNA

Atgcagagaaataacttcactgaagtgatagagttcgtcttcctgggattctccagctttggaaagcatcagataaccctctttgtggttttcctaaccatctacattttaactctggctggcaacatcattatagtgacaatcacacacatagaccaccaccttcacactcccatgtacttctttctgagcatgttggcaagctcagagactgtgtacacactggtcattgtcccacgaatgctttccagcctgattttttacaaccttcccatatccttggcaggctgcgcaacccaaatgttcttttttgtcaccttggccaccaacaactgctttctgctcacagcaatgggttatgatcgttatgtggctatttgtaatcctctgagatatacaatcatcatgagcaagggaatgtgtgccttgttggtttgtgggtctttaggcactggcctggttatggcagttcttcatgtgccagccatgttccatttgcccttttgtggcacggtggtggagcactttttctgtgacatatacccagtaatgaagctttcttgtgttgataccactgtcaatgagataatcaattatggtgtaagttcatttgtaattcttgtgcccatagggctgatatttatctcctatgtgctcattgtctcttccatccttaaaattgtgtccactgaaggccagaagaaagcctttgccacctgtgcctctcatctcactgtggtcattgtccactatggctgtgcctccattgcctacctcaaacccaaatcagaaagttcagtagaaaaagaccttcttctctctgtgacctacactatcatcactcccttgctgaaccctgttgtctacagcctcaggaacaaagaagtcaaagatgctctatgcagagctgtgggcagaaacacttcttaa

SEQ ID NO:8-蛋白质

MQRNNFTEVIEFVFLGFSSFGKHQITLFVVFLTIYILTLAGNIIIVTITHIDHHLHTPMYFFLSMLASSETVYTLVIVPRMLSSLIFYNLPISLAGCATQMFFFVTLATNNCFLLTAMGYDRYVAICNPLRYTIIMSKGMCALLVCGSLGTGLVMAVLHVPAMFHLPFCGTVVEHFFCDIYPVMKLSCVDTTVNEIINYGVSSFVILVPIGLIFISYVLIVSSILKIVSTEGQKKAFATCASHLTVVIVHYGCASIAYLKPKSESSVEKDLLLSVTYTIITPLLNPVVYSLRNKEVKDALCRAVGRNTS

标签

SEQ ID NO:9-DNA

gattacaaggacgacgacgataag

SEQ ID NO:10-蛋白质

DYKDDDDK

Rho标签

SEQ ID NO:11-DNA

atgaacgggaccgagggcccaaacttctacgtgcctttctccaacaagacgggcgtggtg

SEQ ID NO:12-蛋白质

MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV

Lucy标签

SEQ ID NO:13-DNA

atgagaccccagatcctgctgctcctggccctgctgaccctaggcctggct

SEQ ID NO:14-蛋白质

MRPQILLLLALLTLGLA

基序

SEQ ID NO:15

MAYDRYVAIC

基序

SEQ ID NO:16

FSTCSSH

基序

SEQ ID NO:17

PMLNPFIY

下列实施例仅是说明性的，并不意味着限制摘要、说明书或权利要求书中所述的发明范围。

实施例

实施例1：与感觉结果有关的气味剂受体的鉴定。

选择对香料业重要的各种目标化合物(例如麝香、花香或木香成分)。如WO2014/210585中所述的方法可用于鉴定存在于生物体中的全体OR中的相对一小部分的OR，所述OR由一种或多种这些化合物特异性地激活或抑制。转录组学分析(例如NGS方法)或蛋白质组学分析(例如质谱)代表了体外鉴定OR的其他方法。可替代地，体内方法(例如DREAM方法)允许在挥发性化合物的气相递送时进行OR脱孤[Von Der Weid B.et al.,Natureneuroscience,18(10):1455-63(2015)]。

可以评估嗅觉受体以确定目标化合物感知的心理(感官)结果是否可以与体外目标化合物诱导的活性相关。选择看起来对推定的感觉结果具有预测能力的此类嗅觉受体，以进一步筛选目标化合物导向的基于受体的增强作用。或者，选择由香料业感兴趣的特定激动剂激活的嗅觉受体。将特定的靶受体-激动剂对用在筛选和鉴定靶激动剂的正变构调节剂化合物的测定或方法中。

实施例2：麝香嗅觉受体的鉴定

就感觉水平上的平均气味检测阈值而言，麝香化合物muscone、

二甲苯麝香和麝香酮形成高度相关的群组。为了测试在四种麝香化合物之间观察到的感觉相关性是否与单个气味剂受体的活性有关，评估了OR5AN1嗅觉受体对麝香化合物的响应。将观察到的受体特异性和敏感性值与人类心理(感官)气味检测阈值数据进行比较(图1)。

OR5AN1嗅觉受体被muscone、

二甲苯麝香和麝香酮特异性激活。但是，所测试的其他麝香化合物均不能激活OR5AN1嗅觉受体。参见图1a。

当考虑对于麝香化合物获得的均值或中位气味检测阈值(感官结果)的皮尔逊相关性时，所观察到的麝香受体(图1a)和心理物理(图1b)活性排名相同，所述麝香化合物具有OR5AN1嗅觉受体活性的配体效力(EC₅₀值)或功效(最大跨度)。

心理物理测量显示出与EC₅₀的强直接相关性，以及与中位气味检测阈值的功效(分别为r＝0.87和r＝-0.91)甚至更强的相关性。用均值气味检测阈值获得相似的相关值。在群组水平上获得的中位灵敏度和平均灵敏度均遵循体外获得的效力和功效排名(表1)。

换句话说，受体激活概貌完全概括了心理物理数据，并且足以解释所观察到的麝香化合物之间的感觉相关性。因此，OR5AN1代表基于麝香定向受体的增强筛选的良好靶标。鉴定更多的感官关键靶受体使得能够对其他香料调性(例如麝香、花香、木香、海洋)的增强进行筛选。

实施例3：推定的OR5AN1活性增强剂的鉴定。

使用基于细胞的测定法，在已激活的内源RTP1基因并表达了气味剂受体伴侣的HEK293T细胞系中测试了OR5AN1(WO2016/201153A1)。将带有Flag-Rho标记的受体与嗅觉规范性G蛋白G_olf共转染，并暴露于单一浓度的

与受试化合物的二元混合物。

使用大的挥发性化合物库以约EC₁₀(该浓度仅引起OR5AN1本身完整活性水平的约10％)创建每种化合物与

的二元混合物。使用基于激活细胞的测定法用于初始增强剂候选物的鉴定。使用基于HTRF(均相时间分辨荧光单位)的试剂盒(CisBio，cAMP dynamic 2试剂盒，62AM4PEJ)，通过测量细胞溶质中cAMP的增加来检测由单一的二元混合物诱导的受体活性。

通过将

储备溶液与每种受试化合物的储备溶液混合至终浓度分别为10和500μM，创建了481种二元混合物。储备溶液由溶于纯DMSO的化合物制成。将每种混合物呈递至表达OR5AN1嗅觉受体的细胞系。在图2中，混合物用点(●)表示，板6中的空孔用三角形(▲)表示。每种二元混合物中DMSO的终浓度为0.17％、并且对细胞无可见影响。

然后测量所导致的激活并将其与单独的

(定义了增强测定的基线)比较。确定HTS工艺的质量，并通过计算每个板的Z'值来评估窗口变化性和信号可靠性。获得了20次命中(hit)，其中5次是大环酮和硝基麝香OR5AN1嗅觉受体激动剂(第1、2、3、5和9次命中)。参见图2和表2。这些OR5AN1嗅觉受体激动剂进一步证实了测定窗口的动态范围足够(因为所记录的响应远高于基线)，因此可能足够灵敏，甚至可以检测到低水平的推定增强。

鉴定了在表2中标记为“增强”的15个候选物。令人惊讶的是，这些推定的增强剂(12/15)中有80％属于同一类化学物质：不饱和脂族醛。接下来，进行了两个平行的剂量响应实验，以确认潜在候选物的真正增强特性。首先，对每个候选物进行剂量响应，以确定其本身是否是激动剂。其次，评估存在和不存在250μM浓度的假定调节剂时的

剂量-响应曲线的EC₅₀变动。增加OR5AN1嗅觉受体对

的响应但本身未表现出可测量的内在激动剂活性的分子被认为是真正的增强剂，并选择其进行进一步研究。

根据该分析，鉴定出挥发性的十三烯醛(TDA)，一种脂肪族α-β单不饱和醛。该化合物本身并不激活OR5AN1嗅觉受体，但与

组合时，与单独的

相比可产生明显的增强作用。参见图3。

十三烯醛似乎是OR5AN1嗅觉受体的有效增强剂。以250μM添加TDA导致

EC₅₀大幅降低(约21倍变动)，并导致总体上最大激活水平更高(跨度增加)(图3a)。当单独测试时，除了约100μM以上的极小结合活性外，TDA没有显示任何显著活性。在该浓度下，TDA的结合产生的激活少于

激活窗口的8％。因此，十三烯醛不被视为OR5AN1的真正激动剂。

用muscone、二甲苯麝香和麝香酮观察到TDA对麝香化合物诱导的OR5AN1嗅觉受体的激活的作用。在浓度为250μM的TDA存在下，所有激动剂均表现出类似的向左的剂量响应曲线变动(图3b-d)。这表明该增强是通过受体结合事件介导的，而不可能是由OR5AN1独立影响(如对测定细胞本身的影响)介导的。在重复实验中，EC₅₀的降低范围为13到28倍(图4)。用麝香与TDA的二元混合物观察到的明显增强与竞争性结合不一致，这主要是因为TDA不是激动剂，也不充当拮抗剂。相反，这种类型的数据指示TDA的非竞争性结合位点。

下表3a和3b报告了其他化合物对

的EC₅₀和跨度的影响。

表3a：

表3b：

实施例4：十三烯醛作为正变构调节剂(PAM)以增强OR5AN1嗅觉受体活性。

进行功能剂量响应实验以揭示十三烯醛(TDA)与OR5AN1之间相互作用的变构性质。用不同浓度的增强剂评估了OR5AN1激活的增强水平。使用与上述相同的基于细胞的分析，在跨度为0到1mM的连续浓度的十三烯醛的存在下，进行了OR5AN1对

的剂量响应曲线。通过应用简化的变构EC50变动效应方程(可得于Prism5，v.5.02)获得了这些曲线，该方程来自三元复杂相互作用模型。所记录的增强水平不线性依赖于增强剂的浓度，并且从模型中获得以下的α(协同因子)和K_B(TDA的平衡解离常数)的关键参数值：α＝15.7和K_B＝259μM。α>1表示正变构调节。按照这种方法，两种有效的增强剂2-癸烯醛和壬烯醛表现出与TDA相似的变构调节特性，具有以下关键参数：2-癸烯醛，α＝37.3，K_B＝264μM；壬烯醛，α＝28.8，K_B＝96μM。

增强剂的完整药理学特性提供了一种基于以下因素对增强剂进行排名的手段：1)当与香料成分(例如麝香、花香或木香成分)结合使用时，它们诱导的效力变动；2)与单独使用化合物所观察到的功效相比，功效(靶受体的活性水平)的提高；3)增强化合物对受体的亲和力；4)增强发生所必需的最小浓度；和/或5)可产生最大的增强性能的增强剂与香料化合物的最有效的比例。

此外并且作为对照，对小鼠

响应性气味剂受体Olfr1440(OR5AN1的直系同源物)进行了类似的实验。十三烯醛没有增强Olfr1440受体的活性。相反，该醛导致Olfr1440

诱导的激活受到轻微抑制(图5)。这进一步支持这样的观点，即十三烯醛对OR5AN1的增强是受体介导的和受体特异性的。

实施例5：OR5AN1嗅觉受体的正变构调节剂的结构-活性关系。

产生了结构上与最初发现的脂族不饱和醛结构相关的67种挥发性化合物的化学多样性集合，用于结构-活性-关系(SAR)分析。测试了这67种分子在OR5AN1上的增强特性，以表征必要的化学要求。

在每种化合物为250μM的存在下获得对

的剂量响应曲线，并将其与单独的

的剂量响应曲线进行比较。通过EC₅₀-倍数变动(效力增加)和功效跨度比(功效增加)来量化所得的增强。

通过将

+化合物的EC₅₀除以单独的

的参考EC₅₀获得EC₅₀倍数变动。通过将

+化合物的跨度除以单独的

的参考跨度获得跨度比。具体地，已经比较了各种脂族α-β单或多不饱和分子。

系统地发现α-β-单不饱和二取代脂族醛表现出最有效的增强。官能团取代、饱和修饰和其他取代似乎减少或消除了该化合物增强受体的潜力(图6、8～12)。α-β单不饱和脂族醛周围的其他修饰，例如在α位上的取代或脂族尾部的环化阻止了增强作用的发生。

已确定了显示出特定OR5AN1增强所需的化学特征的所得通用化学结构(图7)。用α-β-单不饱和醛与衍生的饱和或功能异构体获得的剂量响应曲线的成对比较进一步例证了OR5AN1增强所需的必要化学特征(图8～12)。图8显示了通过癸烯醛、癸二烯醛和癸醛获得的不同增强水平，以及对不饱和度的要求。图9显示了通过十二烯醛和tangerinal获得的不同增强水平，以及不饱和位置的重要性。

图10显示了用壬烯醛、壬烯醇和去甲基癸烯醇(nordecenol)获得的不同的增强水平，并且当使用醇官能团代替醛基时没有增强。图11显示了用癸烯醛和癸烯酮获得的不同的增强水平，并且当使用酮官能团时没有增强。并且图12显示了用十一烯醛和十一烯酸获得的不同的增强水平，并且当使用酸官能团时没有增强。

进行SAR分析以鉴定最佳增强剂并确定增强给定受体的化合物所需的化学要求。对于OR5AN1，已鉴定出至少10种有效的增强剂，所有这些都是适用于香料创造/设计的挥发性化合物。不打算受限于任何特定理论，当手边有几种增强剂用于创造时，其内在气味的随后感官表征进一步允许就应用(即香料)的整体调性而言选择最适合下游应用的挥发性化合物。换句话说，产生了与每种靶分子例如麝香相对应的增强成分的集，并为调香师提供了更多的创作工具。

实施例6：功能不足的等位基因可以在增强剂存在下恢复。

对于任何给定的OR基因，嗅觉受体通常由几个等位基因编码，从单个等位基因到超过十五个等位基因。基因的核苷酸序列或它编码的多肽的氨基酸序列中的天然等位基因变异可为约1％至5％。

已知在人群中存在五个OR5AN1等位基因。这些等位基因在功能上不相同，并且表现出不同的活性水平，范围从全功能(等位基因1和2)、功能不足(等位基因3和4)到功能丧失(等位基因5)(图13)。

在存在和不存在已鉴定的增强剂十三烯醛的情况下，在基于细胞的测定中测试功能不足的OR5AN1等位基因3和4显示出活性水平的显著提高。观察到的OR5AN1等位基因3的EC₅₀值表现出6.0倍的变动(在250μM的十三烯醛存在下，从9.0μM到1.5μM)和2.02的活性跨度比(在十三碳烯醛存在下，活性从2311增加到4663相对荧光HTRF单位)。观察到的OR5AN1等位基因4的EC₅₀值显示出6.25倍的变化(在250μM的十三烯醛存在下，从10.1μM到1.6μM)和2.16的活性跨度比(在十三烯醛存在下，活性从2328增加到5026相对荧光HTRF单位)。效力和功效均发生了良好的变化，并导致其活性水平与

对携带等位基因2的人的推测更强活性更可比。这些数据表明，在增强香料成分的存在下，携带这些等位基因的人可能对含有OR5AN1激活麝香的香料应用更为敏感。

实施例7：在增强剂的存在下，人对麝香化合物的敏感性增加。

通过进行气味检测阈值(ODT)测试评估了人类个体对

的敏感性。ODT测试包括鉴定浓度，对于该浓度，小组成员中的50％(优选66％)的浓度可以确定，强制选择三角测试中三个容器中的哪个包含目标化合物

进行了两项测试，以计算含有

加上可察觉的化学相似分子背景气味的混合物中的ODT，所述化学相似分子为a)增强剂十三烯醛和b)非增强型挥发性化合物壬醛。这两种分子在化学上是相似的，但壬醛没有表现出实施例5中鉴定的增强所必需的α-β-不饱和键。

28名小组成员进行了一系列三角测试，其中在浓度为0.1％的十三烯醛存在下，增加

的浓度。在每个三角测试中，三个样品都含有0.1％的十三烯醛，一个样品还含有

27名小组成员进行了一系列三角测试，其中在浓度为0.1％的壬醛存在下，增加

的浓度。在每个三角测试中，三个样品都含有0.1％的壬醛，一个样品还含有

在每个三角测试中，要求小组成员鉴定出一个与其他两个样品不同的样品。通过将非线性回归模型拟合到数据并计算

浓度来计算ODT，在该浓度下正确响应的比例等于2/3(66％，机会率1/3和所有正确应答1之间的中点)。当麝香与增强剂混合时，ODT值比中性化合物低：分别为0.09％和0.93％、表明在实验相似的条件下麝香的检出水平不同(图14)。

实施例8：推定的OR10J5活性增强剂的鉴定。

按照与实施例1至5中所述相同的筛选方法，筛选人花香铃兰气味剂受体OR10J5以鉴定推定的增强剂。将带有Lucy-Flag-Rho标记的受体与嗅觉规范性G蛋白G_olf共转染，并暴露于单一浓度的花香铃兰化合物与受试化合物的二元混合物。

剂量响应曲线显示OR10J5响应于花香铃兰化合物33-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛、4-(4-羟基-4-甲基戊基)环己-3-烯-1-甲醛或它们的混合物(以商品名

出售，以下简称

)的激活，其显示在图15中。使用基于细胞的分析方法，OR10J5活性在HEK293T细胞系中测试，在该细胞系中，根据国际专利申请公开号WO2016/201153A1中公开的方法，内源伴侣蛋白RTP1基因已被激活并且气味剂受体伴侣蛋白以被表达。将带有Flag-Rho标记的受体与嗅觉规范性G蛋白G_olf共同转染，并暴露于单一浓度的

与受试化合物的二元混合物中。

使用挥发性化合物库来产生每种化合物与

以约EC₂₀(该浓度仅引起OR10J5自身全部活性水平的大约20％)的二元混合物。使用基于激活细胞的测定法用于初始增强剂候选物的鉴定。使用基于HTRF(均相时间分辨荧光单位)的试剂盒(CisBio，cAMPdynamic 2试剂盒，62AM4PEJ)，通过测量细胞溶质中cAMP的增加来检测由单一的二元混合物诱导的受体活性。

通过将

储备溶液与每种受试化合物的储备溶液混合至终浓度分别为4.6和300μM，创建了800种二元混合物。储备溶液由溶于纯DMSO的化合物制成。将每种混合物呈递至表达OR10J5嗅觉受体的细胞系。每种二元混合物中DMSO的终浓度为0.1％、并且对细胞无可见影响(参见图16)。

然后测量所导致的激活并将其与单独的

(定义了增强测定的基线)比较。确定HTS工艺的质量，并通过计算每个板的Z'值来评估窗口变化性和信号可靠性。获得了45次命中，其中8次是OR10J5嗅觉受体激动剂(第1、2、5、6、10、15、25和34次命中)，参见表4。这些OR10J5嗅觉受体激动剂进一步证实了测定窗口的动态范围足够(因为所记录的响应远高于基线)，因此可能足够灵敏，甚至可以检测到低水平的推定增强。

鉴定了在表5中标记为“增强”的37个候选物，并在两个平行的剂量响应实验中对其进行了测试，以确认潜在候选物的真实增强特性。首先，对每个候选物进行剂量响应，以确定其本身是否是激动剂。其次，评估存在EC₂₀

浓度(在OR10J5上产生20％活性)时相同的候选剂量响应曲线，以评估活性水平的提高。增加OR10J5嗅觉受体对

的响应，超出了EC20，但本身未表现出可测量的内在活性的分子被认为是真正的增强剂，并选择其进行进一步研究。通过该分析，鉴定出显示增强特性的20种分子。参见表4。

实施例9：OR10J5活性增强特异性的表征。

与鉴定出的增强剂在结构上相似的化合物上测试了

增强特异性。在稳定浓度的受试化合物存在下获得对

的剂量响应曲线，并将其与单独的

通过将

+化合物的EC₅₀除以单独的参考EC₅₀获得EC₅₀倍数变动。通过将

+化合物的跨度除以单独的

的参考跨度获得跨度比。

图17显示了对OR10J5使用a)新洋茉莉醛和b)3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛获得的不同的增强水平，但使用c)天芥菜精和d)环亚甲基香茅醇不存在增强。通过

激活的OR10J5可以通过新洋茉莉醛和3-(4-甲基环己-3-烯-1-基)丁醛特异性地增强，但不能通过结构相关的化合物来增强，如相应的倍数变动所示：对于新洋茉莉醛和3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛的倍数变动分别为9.2和6.7，而对于天芥菜精和环亚甲基香茅醇的倍数变动分别为1.8和1.3。

图18显示对于OR10J5的小鼠直系同源物Olfr16，使用新洋茉莉醛和3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛获得的不同的增强水平，但使用天芥菜精和环亚甲基香茅醇不存在增强。通过

激活的Olfr16可以通过新洋茉莉醛和3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛特异性地增强活化，但不能通过结构相关的化合物来增强，如相应的倍数变动所示：对于新洋茉莉醛和3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛的倍数变动为5，而对于天芥菜精和环亚甲基香茅醇的倍数变动分别为1.5和1.1。这些结果表明其他哺乳动物嗅觉受体的增强。

实施例10：花香铃兰化合物增强剂作为正变构调节剂(PAM)以增强OR10J5嗅觉受体活性。

进行功能剂量反应实验以揭示新洋茉莉醛、3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛、甜瓜醛和庚醛与OR10J5之间相互作用的变构性质。用不同浓度的增强剂评估了OR10J5激活的增强水平。使用与上述相同的基于细胞的分析，在跨度为0至600μM的连续浓度的增强剂存在下，进行了OR10J5对

的剂量响应曲线，参见图19。通过应用简化的变构EC50变动效应方程(可得于Prism7)获得了这些曲线，该方程来自三元复杂相互作用模型。所记录的增强水平不线性依赖于增强剂的浓度，并且从每个增强剂的模型中获得以下α(协同因子)和K_B(增强剂的平衡解离常数)的关键参数值：新洋茉莉醛，α＝6.3，K_B＝10μM；3-(4-甲基环己-3-烯-1-基)丁醛，α＝7.5，K_B＝15μM；甜瓜醛，α＝4.1，K_B＝16μM；和庚醛，α＝3.2，K_B＝51μM。α>1表示正变构调节。

实施例11：在增强剂的存在下，人对

的敏感性增加。

通过进行气味检测阈值(ODT)测试评估了人类个体对

进行了两项测试,以计算含有

加上可察觉的化学相似分子背景气味的混合物中的ODT，所述化学相似分子为a)增强剂3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛和b)非增强型挥发性化合物环亚甲基香茅醇。这两种分子在化学上是相似的。

28名小组成员进行了一系列三角测试，其中在浓度为0.1％的3-(4-甲基环己基-3-烯-1-基)丁醛存在下，增加

浓度。在每个三角测试中，三个样品都含有0.1％的3-(4-甲基环己-3-烯-1-基)丁醛，一个样品还含有

28名小组成员进行了一系列三角测试，其中在浓度为7％的环亚甲基香茅醇存在下，增加

的浓度。在每个三角测试中，三个样品都含有7％的环亚甲基香茅醇，一个样品还含有

在每个三角测试中，要求小组成员鉴定出一个与其他两个样品不同的样品。相应结果如图20所示。

使用在该领域中经常使用的Abbott’s公式(Lawless，2010)，对正确响应的比例进行了调整，以考虑猜测的可能性。以材料(增强剂对中性化合物)和对数变换浓度水平作为解释变量，正确响应比例作为响应变量的线性回归产生了显著的材料主效应(p＝.03)和边际显著相互作用(p＝.052)，表明随着浓度的增加，当将

与增强剂混合时(相对于中性化合物，见图21)，正确响应的比例以较高的速率增加。

实施例12：OR10J5活性增强不依赖于OR10J5激动剂。

OR10J5活性增强使用另外的激动剂以及受试化合物之一和上述实施例中所述的条件进行了测试。在稳定浓度的受试化合物存在下获得对(+-)-2,5-二甲基-2-茚满甲醇的剂量响应曲线，并将其与单独的激动剂的剂量响应曲线进行比较。如上所述，通过EC₅₀倍数变动(效力增加)和功效跨度比(功效增加)来量化所得的增强。

图22显示了使用a)新洋茉莉醛获得的不同的增强水平，但使用b)天芥菜精不存在增强。通过(+-)-2,5-二甲基-2-茚满甲醇激活的OR10J5可以通过新洋茉莉醛特异性地增强，但不能通过结构相关的化合物来增强，如相应的倍数变动所示：对于新洋茉莉醛和天芥菜精的倍数变动分别为8.6和2.0。

这表明受试化合物与激动剂(激活化合物)的性质无关地特异性增强OR10J5的活性。在这种特殊情况下，(+-)-2,5-二甲基-2-茚满甲醇是OR10J5的部分激动剂，但被新洋茉莉醛增强，在剂量响应的动态范围内，除效力增加外，还导致1.7倍的功效增加(参见图22a)。这进一步表明，增强是通过受体结合事件介导的，而不可能是由受体非依赖性效应(如对测定细胞本身)介导的。

本文通篇所引用的出版物通过引用整体并入于此。尽管上面已经参考实施例和优选实施方案说明了本发明的各个形态，但是应当理解，本发明的范围并不由前述描述所限定，而是在专利法的原则下由适当解释的所附权利要求所限定。

序列表

<110> 弗门尼舍有限公司（Firmenich SA）

<120> 鉴定气味剂受体的正变构调节剂的方法

<130> 10590/WO

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 937

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

atgactgggg gaggaaatat tacagaaatc acctatttca tcctgctggg attctcagat 60

tttcccagga tcataaaagt gctcttcact atattcctgg tgatctacat tacatctctg 120

gcctggaacc tctccctcat tgttttaata aggatggatt cccacctcca tacacccatg 180

tatttcttcc tcagtaacct gtccttcata gatgtctgct atatcagctc cacagtcccc 240

aagatgctct ccaacctctt acaggaacag caaactatca cttttgttgg ttgtattatt 300

cagtacttta tcttttcaac gatgggactg agtgagtctt gtctcatgac agccatggct 360

tatgatcgtt atgctgccat ttgtaacccc ctgctctatt catccatcat gtcacccacc 420

ctctgtgttt ggatggtact gggagcctac atgactggcc tcactgcttc tttattccaa 480

attggtgctt tgcttcaact ccacttctgt gggtctaatg tcatcagaca tttcttctgt 540

gacatgcccc aactgttaat cttgtcctgt actgacactt tctttgtaca ggtcatgact 600

gctatattaa ccatgttctt tgggatagca agtgccctag ttatcatgat atcctatggc 660

tatattggca tctccatcat gaagatcact tcagctaaag gcaggtccaa ggcattcaac 720

acctgtgctt ctcatctaac agctgtttcc ctcttctata catcaggaat ctttgtctat 780

ttgagttcca gctctggagg ttcttcaagc tttgacagat ttgcatctgt tttctacact 840

gtggtcattc ccatgttaaa tcccttgatt tacagtttga ggaacaaaga aattaaagat 900

gccttaaaga ggttgcaaaa gagaaagtgc tgctgag 937

<210> 2

<211> 311

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Thr Gly Gly Gly Asn Ile Thr Glu Ile Thr Tyr Phe Ile Leu Leu

1 5 10 15

Gly Phe Ser Asp Phe Pro Arg Ile Ile Lys Val Leu Phe Thr Ile Phe

20 25 30

Leu Val Ile Tyr Ile Thr Ser Leu Ala Trp Asn Leu Ser Leu Ile Val

35 40 45

Leu Ile Arg Met Asp Ser His Leu His Thr Pro Met Tyr Phe Phe Leu

50 55 60

Ser Asn Leu Ser Phe Ile Asp Val Cys Tyr Ile Ser Ser Thr Val Pro

65 70 75 80

Lys Met Leu Ser Asn Leu Leu Gln Glu Gln Gln Thr Ile Thr Phe Val

85 90 95

Gly Cys Ile Ile Gln Tyr Phe Ile Phe Ser Thr Met Gly Leu Ser Glu

100 105 110

Ser Cys Leu Met Thr Ala Met Ala Tyr Asp Arg Tyr Ala Ala Ile Cys

115 120 125

Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Ser Ile Met Ser Pro Thr Leu Cys Val Trp

130 135 140

Met Val Leu Gly Ala Tyr Met Thr Gly Leu Thr Ala Ser Leu Phe Gln

145 150 155 160

Ile Gly Ala Leu Leu Gln Leu His Phe Cys Gly Ser Asn Val Ile Arg

165 170 175

His Phe Phe Cys Asp Met Pro Gln Leu Leu Ile Leu Ser Cys Thr Asp

180 185 190

Thr Phe Phe Val Gln Val Met Thr Ala Ile Leu Thr Met Phe Phe Gly

195 200 205

Ile Ala Ser Ala Leu Val Ile Met Ile Ser Tyr Gly Tyr Ile Gly Ile

210 215 220

Ser Ile Met Lys Ile Thr Ser Ala Lys Gly Arg Ser Lys Ala Phe Asn

225 230 235 240

Thr Cys Ala Ser His Leu Thr Ala Val Ser Leu Phe Tyr Thr Ser Gly

245 250 255

Ile Phe Val Tyr Leu Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Phe Asp

260 265 270

Arg Phe Ala Ser Val Phe Tyr Thr Val Val Ile Pro Met Leu Asn Pro

275 280 285

Leu Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Lys Glu Ile Lys Asp Ala Leu Lys Arg

290 295 300

Leu Gln Lys Arg Lys Cys Cys

305 310

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

atgaagagaa agaacttcac agaagtgtca gaattcattt tcttgggatt ttctagcttt 60

ggaaagcatc agataaccct ctttgtggtt ttcctaactg tctacatttt aactctggtt 120

gctaacatca tcattgtgac tatcatctgc attgaccatc atctccacac tcccatgtat 180

ttcttcctaa gcatgctggc tagttcagag acggtgtaca cactggtcat tgtgccacga 240

atgcttttga gcctcatttt tcataaccaa cctatctcct tggcaggctg tgctacacaa 300

atgttctttt ttgttatctt ggccactaat aattgcttcc tgcttactgc aatggggtat 360

gaccgctatg tggccatctg cagacccctg agatacactg tcatcatgag caagggacta 420

tgtgcccagc tggtgtgtgg gtcctttggc attggtctga ctatggcagt tctccatgtg 480

acagccatgt tcaatttgcc gttctgtggc acagtggtag accacttctt ttgtgacatt 540

tacccagtca tgaaactttc ttgcattgat accactatca atgagataat aaattatggt 600

gtaagttcat ttgtgatttt tgtgcccata ggcctgatat ttatctccta tgtccttgtc 660

atctcttcca tccttcaaat tgcctcagct gagggctgga agaagacctt tgccacctgt 720

gtctcccacc tcactgtggt tattgtccac tgtggctgtg cctccattgc ctacctcaag 780

ccgaagtcag aaagttcaat agaaaaagac cttgttctct cagtgacgta caccatcatc 840

actcccttgc tgaaccctgt tgtttacagt ctgagaaaca aggaggtaaa ggatgcccta 900

tgcagagttg tgggcagaaa tatttcttaa 930

<210> 4

<211> 309

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Lys Arg Lys Asn Phe Thr Glu Val Ser Glu Phe Ile Phe Leu Gly

1 5 10 15

Phe Ser Ser Phe Gly Lys His Gln Ile Thr Leu Phe Val Val Phe Leu

20 25 30

Thr Val Tyr Ile Leu Thr Leu Val Ala Asn Ile Ile Ile Val Thr Ile

35 40 45

Ile Cys Ile Asp His His Leu His Thr Pro Met Tyr Phe Phe Leu Ser

50 55 60

Met Leu Ala Ser Ser Glu Thr Val Tyr Thr Leu Val Ile Val Pro Arg

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Leu Ile Phe His Asn Gln Pro Ile Ser Leu Ala Gly

85 90 95

Cys Ala Thr Gln Met Phe Phe Phe Val Ile Leu Ala Thr Asn Asn Cys

100 105 110

Phe Leu Leu Thr Ala Met Gly Tyr Asp Arg Tyr Val Ala Ile Cys Arg

115 120 125

Pro Leu Arg Tyr Thr Val Ile Met Ser Lys Gly Leu Cys Ala Gln Leu

130 135 140

Val Cys Gly Ser Phe Gly Ile Gly Leu Thr Met Ala Val Leu His Val

145 150 155 160

Thr Ala Met Phe Asn Leu Pro Phe Cys Gly Thr Val Val Asp His Phe

165 170 175

Phe Cys Asp Ile Tyr Pro Val Met Lys Leu Ser Cys Ile Asp Thr Thr

180 185 190

Ile Asn Glu Ile Ile Asn Tyr Gly Val Ser Ser Phe Val Ile Phe Val

195 200 205

Pro Ile Gly Leu Ile Phe Ile Ser Tyr Val Leu Val Ile Ser Ser Ile

210 215 220

Leu Gln Ile Ala Ser Ala Glu Gly Trp Lys Lys Thr Phe Ala Thr Cys

225 230 235 240

Val Ser His Leu Thr Val Val Ile Val His Cys Gly Cys Ala Ser Ile

245 250 255

Ala Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Glu Ser Ser Ile Glu Lys Asp Leu Val

260 265 270

Leu Ser Val Thr Tyr Thr Ile Ile Thr Pro Leu Leu Asn Pro Val Val

275 280 285

Tyr Ser Leu Arg Asn Lys Glu Val Lys Asp Ala Leu Cys Arg Val Val

290 295 300

Gly Arg Asn Ile Ser

305

<210> 5

<211> 948

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

atgcctggag ggaggaatag cacagtcatc accaagttca tccttgtggg attctcagat 60

tttccaaagc tcaagctggt tctctttgtt atcttcctgg gaagttatct ctccacagtg 120

gtgtggaact tgggcctcat catcttgatt aggattgacc cttacctaca cacacctatg 180

tacttcttcc tcagcaattt gtcattttta gatttctgtt acatttcatc tacaacccct 240

aaaatgctct cgggattctt ccagaagtct aaatctatct cctttgttgg gtgcaccatg 300

cagtacttca tcttctcaag cctgggtctg tccgaatgct gccttctggc agccatggct 360

tatgaccggt atgctgccat ttgtaatcct cttctctaca cagccatcat gtccccgtca 420

ctctgtgtgc acatggtggt tggagcctat agtactggtc tcttgggttc attgattcaa 480

ctgtgtgcta tacttcagct ccatttctgt gggccaaata ttataaacca tttcttttgt 540

gacctgcctc agctattagt tctttcctgc tctgaaacct ttcccctgca agtcttgaaa 600

tttgtaatag cagtgatttt tggggtggca tctgtcattg ttatcctgat atcctatggt 660

tatatcattg gcacaatcct gaatatcagc tcagtagaag gtaggtccaa ggcattcaat 720

acctgtgcct ctcacctgac agcagtcacc ctcttttttg gatcaggact ctttgtctat 780

atgcgcccca gctccaacag ttcccagggt tatgacaaga tggcttccgt gttctataca 840

gtggtgattc ccatgttgaa tcctctgatt tatagtctca ggaacaagga aataaaagat 900

gctcttcaga gatgtaaaaa taagtgcttt tctcagtgcc actgttag 948

<210> 6

<211> 315

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

Met Pro Gly Gly Arg Asn Ser Thr Val Ile Thr Lys Phe Ile Leu Val

1 5 10 15

Gly Phe Ser Asp Phe Pro Lys Leu Lys Leu Val Leu Phe Val Ile Phe

20 25 30

Leu Gly Ser Tyr Leu Ser Thr Val Val Trp Asn Leu Gly Leu Ile Ile

35 40 45

Leu Ile Arg Ile Asp Pro Tyr Leu His Thr Pro Met Tyr Phe Phe Leu

50 55 60

Ser Asn Leu Ser Phe Leu Asp Phe Cys Tyr Ile Ser Ser Thr Thr Pro

65 70 75 80

Lys Met Leu Ser Gly Phe Phe Gln Lys Ser Lys Ser Ile Ser Phe Val

85 90 95

Gly Cys Thr Met Gln Tyr Phe Ile Phe Ser Ser Leu Gly Leu Ser Glu

100 105 110

Cys Cys Leu Leu Ala Ala Met Ala Tyr Asp Arg Tyr Ala Ala Ile Cys

115 120 125

Asn Pro Leu Leu Tyr Thr Ala Ile Met Ser Pro Ser Leu Cys Val His

130 135 140

Met Val Val Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Leu Leu Gly Ser Leu Ile Gln

145 150 155 160

Leu Cys Ala Ile Leu Gln Leu His Phe Cys Gly Pro Asn Ile Ile Asn

165 170 175

His Phe Phe Cys Asp Leu Pro Gln Leu Leu Val Leu Ser Cys Ser Glu

180 185 190

Thr Phe Pro Leu Gln Val Leu Lys Phe Val Ile Ala Val Ile Phe Gly

195 200 205

Val Ala Ser Val Ile Val Ile Leu Ile Ser Tyr Gly Tyr Ile Ile Gly

210 215 220

Thr Ile Leu Asn Ile Ser Ser Val Glu Gly Arg Ser Lys Ala Phe Asn

225 230 235 240

Thr Cys Ala Ser His Leu Thr Ala Val Thr Leu Phe Phe Gly Ser Gly

245 250 255

Leu Phe Val Tyr Met Arg Pro Ser Ser Asn Ser Ser Gln Gly Tyr Asp

260 265 270

Lys Met Ala Ser Val Phe Tyr Thr Val Val Ile Pro Met Leu Asn Pro

275 280 285

Leu Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Lys Glu Ile Lys Asp Ala Leu Gln Arg

290 295 300

Cys Lys Asn Lys Cys Phe Ser Gln Cys His Cys

305 310 315

<210> 7

<211> 930

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

atgcagagaa ataacttcac tgaagtgata gagttcgtct tcctgggatt ctccagcttt 60

ggaaagcatc agataaccct ctttgtggtt ttcctaacca tctacatttt aactctggct 120

ggcaacatca ttatagtgac aatcacacac atagaccacc accttcacac tcccatgtac 180

ttctttctga gcatgttggc aagctcagag actgtgtaca cactggtcat tgtcccacga 240

atgctttcca gcctgatttt ttacaacctt cccatatcct tggcaggctg cgcaacccaa 300

atgttctttt ttgtcacctt ggccaccaac aactgctttc tgctcacagc aatgggttat 360

gatcgttatg tggctatttg taatcctctg agatatacaa tcatcatgag caagggaatg 420

tgtgccttgt tggtttgtgg gtctttaggc actggcctgg ttatggcagt tcttcatgtg 480

ccagccatgt tccatttgcc cttttgtggc acggtggtgg agcacttttt ctgtgacata 540

tacccagtaa tgaagctttc ttgtgttgat accactgtca atgagataat caattatggt 600

gtaagttcat ttgtaattct tgtgcccata gggctgatat ttatctccta tgtgctcatt 660

gtctcttcca tccttaaaat tgtgtccact gaaggccaga agaaagcctt tgccacctgt 720

gcctctcatc tcactgtggt cattgtccac tatggctgtg cctccattgc ctacctcaaa 780

cccaaatcag aaagttcagt agaaaaagac cttcttctct ctgtgaccta cactatcatc 840

actcccttgc tgaaccctgt tgtctacagc ctcaggaaca aagaagtcaa agatgctcta 900

tgcagagctg tgggcagaaa cacttcttaa 930

<210> 8

<211> 309

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

Met Gln Arg Asn Asn Phe Thr Glu Val Ile Glu Phe Val Phe Leu Gly

1 5 10 15

Phe Ser Ser Phe Gly Lys His Gln Ile Thr Leu Phe Val Val Phe Leu

20 25 30

Thr Ile Tyr Ile Leu Thr Leu Ala Gly Asn Ile Ile Ile Val Thr Ile

35 40 45

Thr His Ile Asp His His Leu His Thr Pro Met Tyr Phe Phe Leu Ser

50 55 60

Met Leu Ala Ser Ser Glu Thr Val Tyr Thr Leu Val Ile Val Pro Arg

65 70 75 80

Met Leu Ser Ser Leu Ile Phe Tyr Asn Leu Pro Ile Ser Leu Ala Gly

85 90 95

Cys Ala Thr Gln Met Phe Phe Phe Val Thr Leu Ala Thr Asn Asn Cys

100 105 110

Phe Leu Leu Thr Ala Met Gly Tyr Asp Arg Tyr Val Ala Ile Cys Asn

115 120 125

Pro Leu Arg Tyr Thr Ile Ile Met Ser Lys Gly Met Cys Ala Leu Leu

130 135 140

Val Cys Gly Ser Leu Gly Thr Gly Leu Val Met Ala Val Leu His Val

145 150 155 160

Pro Ala Met Phe His Leu Pro Phe Cys Gly Thr Val Val Glu His Phe

165 170 175

Phe Cys Asp Ile Tyr Pro Val Met Lys Leu Ser Cys Val Asp Thr Thr

180 185 190

Val Asn Glu Ile Ile Asn Tyr Gly Val Ser Ser Phe Val Ile Leu Val

195 200 205

Pro Ile Gly Leu Ile Phe Ile Ser Tyr Val Leu Ile Val Ser Ser Ile

210 215 220

Leu Lys Ile Val Ser Thr Glu Gly Gln Lys Lys Ala Phe Ala Thr Cys

225 230 235 240

Ala Ser His Leu Thr Val Val Ile Val His Tyr Gly Cys Ala Ser Ile

245 250 255

Ala Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Glu Ser Ser Val Glu Lys Asp Leu Leu

260 265 270

Leu Ser Val Thr Tyr Thr Ile Ile Thr Pro Leu Leu Asn Pro Val Val

275 280 285

Tyr Ser Leu Arg Asn Lys Glu Val Lys Asp Ala Leu Cys Arg Ala Val

290 295 300

Gly Arg Asn Thr Ser

305

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FLAG 标签

<400> 9

gattacaagg acgacgacga taag 24

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FLAG 标签

<400> 10

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rho 标签

<400> 11

atgaacggga ccgagggccc aaacttctac gtgcctttct ccaacaagac gggcgtggtg 60

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rho 标签

<400> 12

Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Lys

1 5 10 15

Thr Gly Val Val

20

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lucy 标签

<400> 13

atgagacccc agatcctgct gctcctggcc ctgctgaccc taggcctggc t 51

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lucy 标签

<400> 14

Met Arg Pro Gln Ile Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Thr Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基序

<400> 15

Met Ala Tyr Asp Arg Tyr Val Ala Ile Cys

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基序

<400> 16

Phe Ser Thr Cys Ser Ser His

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基序

<400> 17

Pro Met Leu Asn Pro Phe Ile Tyr

1 5

Claims

1.一种高通量测定系统，用于从一组化合物中鉴定出一种或多种化合物，其中该一种或多种化合物正性调节由激动剂气味剂化合物诱导的嗅觉受体的活性，包括：

a)一个或多个分离的细胞，每个细胞表达一种哺乳动物的嗅觉受体，其中该一个或多个细胞包含被一种或多种气味剂激活的目标嗅觉受体，

b)第一化合物，其与该嗅觉受体结合并激活该嗅觉受体，和

c)至少一种第二化合物，其相对于第一化合物非竞争性地与受体结合，并且与不存在第二化合物时暴露于第一化合物的受体的活性相比，增强了暴露于第一化合物的受体的活性，

其中第一化合物是该嗅觉受体的激动剂气味剂化合物，

其中第一化合物和第二化合物是不同的化合物，

其中第二化合物不是该受体的激动剂，并且

2.权利要求1的测定系统，其中该至少一种第二化合物是基于结构-活性关系(SAR)分析从一组化合物中选择的。

3.权利要求1或2的测定系统，其中该第二化合物结合到该嗅觉受体上与该第一化合物结合的位点不同的位点。

4.权利要求1至3中任一项的测定系统，其中该第二化合物是正变构调节化合物。

5.权利要求1至4中任一项的测定系统，其中在步骤a)之前，将该一个或多个细胞转化以表达靶嗅觉受体。

6.权利要求1至5中任一项的测定系统，其中，该受体是从由OR5AN1、Olfr1440、OR10J5或Olfr16构成的群组中选出的。

7.权利要求1的测定系统，其中该至少一种嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a)包含与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b)由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

8.权利要求7的测定系统，其中该多肽：

a)包含与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b)由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1、3、5或7或其反向互补序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

9.权利要求1的测定系统，其中该哺乳动物的嗅觉受体是小鼠嗅觉受体或人嗅觉受体。

10.权利要求1至9中任一项的测定系统，其中该第一化合物是麝香或花香化合物。

11.权利要求1至10中任一项的测定系统，其中该第一化合物包含麝香化合物，而该嗅觉受体是OR5AN1或Olfr1440；其嵌合体和功能片段；并且其中该嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a)包含与SEQ ID NO:2或6具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b)由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1或5或其反向互补序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

12.权利要求10或11中任一项的测定系统，其中该麝香化合物包含大环酮或硝基麝香化合物。

13.权利要求1至10中任一项的测定系统，其中该第一化合物包含花香铃兰化合物，而该嗅觉受体是OR10J5或Olfr16；其嵌合体和功能片段；并且其中该嗅觉受体包含多肽，该多肽：

a)包含与SEQ ID NO:4或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或

b)由核酸分子编码，该核酸分子包含与SEQ ID NO:3或7或其反向互补序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。

14.权利要求1至13中任一项的测定系统，其中所调节的活性包括：

a)调节第一化合物对正构位点的结合亲和力，

b)调节第一化合物对正构位点的结合激活功效，和/或

c)调节G蛋白结合位点。

15.一种鉴定至少一种正变构调节化合物的方法，该化合物在嗅觉受体的激动剂存在下增强该嗅觉受体的活性，该方法包括：

a)提供一个或多个分离的细胞，每个细胞表达一种哺乳动物的嗅觉受体，

b)将一个或多个细胞暴露于能激活该嗅觉受体的第一化合物，

c)将一种或多种细胞暴露于一种或多种受试化合物，和

d)当至少一种第二化合物与第一化合物组合作为正变构调节化合物对受体活性具有协同作用时，从一种或多种受试化合物中选择该至少一种第二化合物；

其中第一化合物是该嗅觉受体的激动剂气味剂化合物，

其中第一化合物和第二化合物是不同的化合物，并且

其中第二化合物不是该受体的激动剂。

16.权利要求15的方法，其中通过在存在和不存在第一化合物的情况下测量该嗅觉受体的响应来测量该嗅觉受体对第一化合物的激活。

17.权利要求15或16的方法，其中该至少一种第二化合物是基于结构-活性关系(SAR)分析从一种或多种受试化合物中选择的。

18.权利要求15至17中任一项的方法，其中该第二化合物结合到该嗅觉受体上与该第一化合物结合的位点不同的位点。

19.权利要求15至18中任一项的方法，其中在步骤a)之前，将该一个或多个细胞转化以表达该嗅觉受体。

20.权利要求15至19中任一项的方法，其中该嗅觉受体对于该一个或多个细胞是异源的。

21.权利要求15至20中任一项的方法，其中该细胞是从由如下构成的群组中选出的：HEK293、CHO、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)、COS、昆虫、酵母和衍生自嗅觉基板的细胞。

22.一种鉴定化合物的方法，该化合物增强由激动剂气味剂化合物诱导的嗅觉受体的活性，该方法包括：

23.权利要求15至22中任一项的方法，其中该哺乳动物的嗅觉受体是小鼠嗅觉受体或人嗅觉受体。

24.权利要求15至23中任一项的方法，其中该嗅觉受体是OR5AN1、OR10J5、Olfr1440或Olfr16。

25.权利要求15至24中任一项的方法，其中该嗅觉受体中的至少一种包含多肽，该多肽：

26.权利要求15至25中任一项的方法，其中该多肽：

27.权利要求15至26中任一项的方法，其中该第一化合物是麝香或花香铃兰化合物。

28.权利要求15至27中任一项的方法，其中该第一化合物包含麝香化合物，而该嗅觉受体是OR5AN1或Olfr1440；其嵌合体和功能片段；并且其中该嗅觉受体包含多肽，该多肽：

29.权利要求27或28的方法，其中该麝香化合物包含大环酮或硝基麝香化合物。

30.权利要求15至27中任一项的方法，其中该第一化合物包含花香铃兰化合物，而该嗅觉受体是OR10J5或Olfr16；其嵌合体和功能片段；并且其中该嗅觉受体包含多肽，该多肽：

31.权利要求15至30中任一项的方法，其中所调节的活性包括：

a)调节第一化合物对正构位点的结合亲和力，

b)调节第一化合物对正构位点的结合激活功效，和/或

c)调节G蛋白结合位点。

32.权利要求15至31中任一项的方法，其中该激动剂气味剂化合物与该嗅觉受体的结合作用的增强包括与不存在所选择的化合物时该受体的活性相比，增强该受体的活性的效力和/或功效。

33.权利要求15至29、31或32中任一项的方法，其中该受体是OR5AN1，该激动剂气味剂化合物包含大环酮或硝基麝香化合物；而所选择的化合物包含至少一种具有以下结构的正变构调节剂：

其中式(I)化合物是麝香嗅觉受体的正变构调节剂。

34.权利要求33的方法，其中该式(I)化合物是从由如下构成的群组中选出的：(E,E)-2,4-癸二烯醛，(E)-2-十一烯醛，(E,E)-2,4-壬二烯醛，(E)-2-十三烯醛，(2E)-2-十二烯醛，(2E,6Z)-2,6-壬二烯醛，(E,E)-2,6-壬二烯醛，(2E)-2,4-十一碳二烯醛，(2E)-2,4-十二碳二烯醛，(E)-2-壬烯醛，(2E,4E,7Z)-癸三烯醛，(Z)-2-癸烯醛，(E)-2-辛烯醛，(E)-2-癸烯醛，(Z)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-(苄氧基)丁-2-烯醛，(E)-4-环亚己基丁-2-烯醛，(2E)-3-(4-甲基苯基)-2-丙烯醛，(2E,5E)-6,10-二甲基-2,5,9-十一碳三烯醛，(2E)-7,8-二甲基-2,7-壬二烯环己基，(5E)-7-氧代-5-庚烯酸甲酯，(2E)-7-甲基-2,6-辛二烯醛，(2E)-6,6-二甲基-2-庚烯醛，(+-)-(2E)-5,9-二甲基-2,8-癸二烯醛，(E)-2-十四烯醛，(E)-8-甲氧基-4,8-二甲基壬-2-烯醛，以及它们的组合。

35.权利要求15至34中任一项的方法，其中一种或多种所选择的化合物是基于结构-活性关系(SAR)分析来选择的，所述结构-活性关系是专门设计用于鉴定推定增强的化学决定因素的。

36.权利要求15至27或30至32中任一项的方法，其中该受体是OR10J5，该激动剂气味剂化合物包含花香铃兰化合物；而所选择的化合物包含从由如下构成的群组中选出的至少一种正变构调节剂：辛醛；(E)-癸-2-烯醛，2-苯基丙醛；(E)-丁-2-烯醛；3-甲基苯甲醛；3-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-2-甲基丙醛；(+-)-3-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，(+-)-4-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；庚醛，4-丙-2-基苯甲醛；(3R)-3,7-二甲基辛-6-烯醛；(+)-(3S)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，(+)-(3R)-3-[(1R)-4-甲基-3-环己烯-1-基]丁醛，以及它们的混合物；己醛；2,6-二甲基庚-5烯醛；苯甲醛；2-甲基-3-(4-甲基苯基)丙醛；3,5,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，2,4,6-三甲基-3-环己烯-1-甲醛，以及它们的混合物；4-乙基苯甲醛；6-甲氧基-2,6-二甲基庚醛；(E)-壬-2-烯醛；以及它们的组合。

37.权利要求22的方法，其中该筛选包括计算激活窗口以测量EC_05-50处的协同效应增强。

38.能被激动剂激活的多肽的用途，该多肽选自被该激动剂激活的人嗅觉受体，使用在用于鉴定该激动剂的一种或多种正变构调节化合物的筛选测定或方法中。

39.能被大环酮或硝基麝香激活的多肽的用途，该多肽包含与SEQ ID NO:2或6具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，使用在用于鉴定该大环酮或硝基麝香的正变构调节化合物的筛选测定或方法中。

40.能被花香铃兰化合物激活的多肽的用途，该多肽包含与SEQ ID NO:4或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，使用在用于鉴定该花香铃兰化合物的正变构调节化合物的筛选测定或方法中。