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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Natrium-Calcium-Austauscher (NCX)
und Verfahren zum Bestimmen ihrer Aktivität. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Fluoreszenz-basiertes Assay zum Erkennen
von Verbindungen zum Modulieren des NCX im „Vorwärtsmodus".
Sie betrifft ferner einen Teilesatz, welcher Zellen umfasst, die
NCX exprimieren, und die Verwendung des Teilesatzes.
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ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Eine
Grundvoraussetzung für das Leben ist die Kompartimentierung – wobei
biologische Membranen das Werkzeug der Natur sind, um dieses Prinzip
umzusetzen. Jedoch ist eine Lipiddoppelschicht – die Struktur, welche
der Zellmembran unterliegt – für die meisten Ionen
und Verbindungen undurchlässig, deren Transport essentiell
für das Beibehalten der Vitalfunktionen in Zellen und Organismen
ist. Die Antwort auf dieses Paradoxon liegt in der semipermeablen
Natur der Zellmembran – gelöste Stoffe, welche
die Membran durchqueren müssen, werden durch spezifische
Membranproteine transportiert. Diese Transporteure sind verantwortlich
für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Ionengradienten,
die Aufnahme von Nährstoffen, den Transport von Metaboliten,
die Wiederaufnahme von Signalgebungsmolekülen und die Entsorgung
von Gift- und Abfallverbindungen. Daher sind Transporteure potentielle
Arzneimittelziele, welche direkten Einfluss auf erkrankungsbezogene
Anomalitäten in diesem Kontext zulassen.
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Der
Natrium/Calcium-Austauscher ist ein wichtiger Mechanismus für
das Entfernen von Ca2+ aus diversen Zellen.
Im Herz extrudiert er Ca2+, welches durch
Ca2+-Kanäle zum Initiieren von
Kontraktion eingetreten ist, während Na+ in
die Herzzelle eintritt. Seine Relevanz bei kardiovaskulären
Erkrankungen ist z. B. veranschaulicht in Hobai, JA & O'Rourke, B (2004)
Expert Opin. Investig. Drugs, 13, 653–664. Daher
hat die pharmazeutische Industrie Verbindungen entwickelt, welche
den NCX hemmen, wie z. B. beschrieben in Iwamoto, T. et
al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 7544-7553. Der Na+/Ca2+-Austauscher
transportiert elektrogenisch drei bis vier Na+ für
jedes Ca2+, welches sich in die entgegengesetzte
Richtung bewegt, wie z. B. gezeigt durch elektrophysiologische Mittel
in Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453–461.
Der NCX ist in der Lage, die Zytoplasma-Ca2+-Konzentration
([Ca2+] ein) drei bis vier Größenordnungen
unter der extrazellulären Ca2+-Konzentration
([Ca2+] aus) aufrechtzuerhalten. Nichtsdestotrotz
ist die Richtung des Netto-Ca2+-Transports
abhängig vom elektrochemischen Gradienten des Na+. Simultane und konsekutive Transportmodelle
wurden für Na+- und Ca2+-Translokationen
vorgeschlagen, und eine Menge an Belegen spricht für Letztgenannte.
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Transporteure
sind eine aufstrebende Zielfamilie mit enormem Potential, die wissenschaftliche
und wirtschaftliche Möglichkeiten bieten. Andererseits
sind Transporteure eine schwierige Zielklasse im Hinblick auf Arzneimittel-Entdeckungstechnologien.
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Es
ist von erheblichem Interesse, Verbindungen zu identifizieren, welche
Kanalaktivität modulieren, zum Beispiel durch das Blockieren
des Calciumflusses und/oder das Hemmen der Aktivierung von Calciumkanälen.
Ein Standardverfahren, dies zu erreichen, ist die Verwendung von
Patch-Clamp-Experimenten. Bei diesen Experimenten müssen
Zellen einzeln und in Sequenz durch hochgeschulte Bediener bewertet
werden, durch Messung des Calciumstromes durch die Zellmembran hindurch
als Reaktion auf Veränderungen des Membranpotentials und/oder
die Anwendung von Testverbindungen. Die Wirkung von Sea0400, einem
neuen spezifischen Inhibitor von NCX, auf das Wirkpotential im Hunde-Ventrikelpapillarmuskel
wurde untersucht und offenbart durch K. Acsai während
des „ESC Congress 2004" in München auf Poster
Nr. 2886 (Titel: Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker
Sea0400 an the ventricular action potential and triggered activity in
dog ventricular muscle and Purkinje fiber) und durch C.
Lee et al. (The journal of pharmacology and experimental therapeutics;
Vol. 311: 748-757, 2004; Titel: Inhibitory Profile of SEA0400 [2-[4-[(2,5-Difluorophenyl)methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline]
assessed an the cardiac Na+/Ca2+ exchanger, NCX1.1).
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Unter
Verwendung einer Ionenselektiv-Elektrodentechnik zum Quantifizieren
von Ionenflüssen in Riesenpatches wurde gezeigt, dass der
kardiale Na+/Ca2 +-Austauscher mehrere Transportmodi aufweist
(Tong Mook Kang & Donald
W. Hilgemann; Nature; Vol. 427, 5. Februar 2004; Titel: Multiple
transport modes of the cardiac Na+/Ca2+ exchanger).
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Diese
Experimente sind, während sie gültig und informativ
sind, sehr zeitaufwändig und nicht für Assays
mit hohem Durchsatz für Verbindungen anpassbar, welche
die Calciumianenkanal-Aktivität modulieren.
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Es
wurden verschiedene Techniken als Alternativen zu Standardverfahren
der Elektrophysiologe entwickelt. Zum Beispiel wurden radioaktive
Fluss-Assays verwendet, bei denen Zellen mit einem radioaktiven Tracer
(z. B.
45Ca) versehen werden, und der Fluss
des radioaktiv markierten Ca wird überwacht. Zellen beladen
mit dem Tracer werden Verbindungen ausgesetzt, und diese Verbindungen,
welche den Ausfluss des Tracers entweder verstärken oder
verringern, werden als mögliche Aktivatoren oder Hemmer
von lonenkanälen in den Zellmembranen identifiziert. Ein
spezifisches Beispiel ist eingeschlossen in
T. Kuramochi
et al.; Bioorganic & Medical
Chemistry; 12 (2004) 5039-5056; Titel: Synthesis and structure-activity
relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of
the sodium-calcium exchanger.
EP 1 031 556 offenbart ein Verfahren,
bei dem die Na
+/Ca
2 +-Austauscheraktivität mit Hilfe
von Sarkolemmvesikeln gemessen wird, wobei die Konzentration der
Ca
2 +-Aufnahme in
den Sarkolemmvesikeln durch Messung der
45Ca-Radioaktivität
bestimmt wird.
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Viele
radioaktive Ionentransporteur-Assays weisen eingeschränkte
Empfindlichkeit und daher unzureichende Datenqualität auf.
Außerdem sind die Kosten und Sicherheitsfragen in Zusammenhang
mit der radioaktiven Screening-Technologie Hürden, welche
eine breitere Anwendung verhindern.
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Unter
den obengenannten Arzneimittel-Entdeckungstechnologien ist die Verwendung
von radioaktiven Fluss-Assays zum Identifizieren von Verbindungen,
welche die Aktivität von Ionenkanälen und Ionentransporteuren
modulieren, der nächste Stand der Technik zur vorliegenden
Erfindung, da es sich hierbei um eine Technik handelt, bei der eine
Testverbindung durch Überwachung des Flusses von Ca2+ aus den Zellen als möglicher
Aktivator oder Hemmer identifiziert werden kann. Das Hauptproblem
für die radioaktiven Assays basiert auf der Schwierigkeit
der Erkennung des eingeschränkten Umsatzes von Ionentransporteuren
von etwa 1 bis 1.000 Molekülen pro Sekunde – etwa
104 Mal weniger als die meisten Ionenkanäle.
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Das
Problem, welches sich aus dem Stand der Technik ergibt, ist daher
das Identifizieren eines robusten Assays mit einer sehr guten Empfindlichkeit
und Brauchbarkeit für das Screening mit hohem Durchsatz
und das Profiling von NCX-Modulatoren. Die Lösung dieses
Problems wird durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Assay für
das Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein, wobei:
- a) Zellen, welche NCX exprimieren, bereitgestellt
werden;
- b) eine farbige Substanz zum Bestimmen des intrazellulären
Calciums bereitgestellt wird;
- c) Zellen mit einem NCX-Aktivitätsaktivator in Kontakt
gebracht werden; und
- d) die durch Calcium vermittelte Veränderung in dem
Lumineszenzsignal von der farbigen Substanz verglichen wird mit
einem Lumineszenzsignal erzeugt bei einem Kontrollexperiment.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Assay
für das Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein
als Reaktion auf die Zugabe einer Verbindung, wobei:
- a) Zellen, welche NCX exprimieren, bereitgestellt werden;
- b) eine farbige Substanz zum Bestimmen des intrazellulären
Calciums bereitgestellt wird;
- c) Zellen mit einer Verbindung in Kontakt gebracht werden, wobei
die Zellen vor der Behandlung mit der Verbindung mit einem NCX-Aktivitätsaktivator
behandelt wurden; und
- d) die durch Calcium vermittelte Veränderung in dem
Lumineszenzsignal von der farbigen Substanz verglichen wird mit
einem Lumineszenzsignal erzeugt bei einem Kontrollexperiment.
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Im
Allgemeinen stammte das verwendete NCX-Protein von einem Säugetier,
und insbesondere von einem Menschen. Das NCX-Protein ist ausgewählt
aus NCX1, NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6 und/oder NCX7, insbesondere
NCX1, NCX2 und/oder NCX3.
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Im
Allgemeinen können die bei dem Assay der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zellen von jedem eukaryotischen Organismus abgeleitet
sein.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen Säugetierzellen.
Bei einer bevorzugteren Ausführungsform sind die Zellen
CHO (CCL-61), HEK (CCL-1573), COS7 (CRL-1651) und/oder JURKAT (CRL-1990) – Zellen.
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Insbesondere
ist der beim Assay der vorliegenden Erfindung verwendete NCX-Aktivitätsaktivator
Ionomycin.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform wird die farbige Substanz
als ein Farbstoffvorläufer zu den Zellen zugegeben, welcher
in der Lage ist, in die Zellen einzutreten und zu einem Farbstoff
hydrolysiert zu werden, wodurch der Farbstoff in den Zellen einen
Komplex mit Calcium bildet und ein Lumineszenzsignal bereitstellt.
Ferner kann der Farbstoffvorläufer bevorzugt ein Acetoxymethylester-Derivat
sein und der Farbstoff kann bevorzugt der Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoff
Fluo-4 sein. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform ist
das Lumineszenzsignal Fluoreszenz und der Überwachungsschritt
c) verwendet ein FLIPR-Gerät.
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Assays wie zuvor
erwähnt zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität
als ein Agonist oder Antagonist von NCX. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines
Assays wie zuvor erwähnt für die Diagnose einer
Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten Expression.
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Die
Erfindung betrifft ferner einen Teilesatz, welcher Folgendes umfasst:
- a) lyophilisierte Zellen, welche NCX-Protein
exprimieren;
- b) eine farbige Substanz;
- c) einen Verbindungspuffer; und
- d) einen farbigen Substanzpuffer.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform des Teilesatzes der vorliegenden
Erfindung ist die farbige Substanz der Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoff
Fluo-4. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
stammte das verwendete NCX-Protein von einem Säugetier,
und insbesondere von einem Menschen. Das NCX-Protein ist ausgewählt
aus NCX1, NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6 und/oder NCX7, insbesondere NCX1,
NCX2 und/oder NCX3.
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Teilesatzes wie zuvor
erwähnt zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität
als ein Agonist oder Antagonist von NCX. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines
Teilesatzes wie zuvor erwähnt für die Diagnose
einer Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten
Expression.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Der
Begriff „Assay" betrifft ein Verfahren, bei dem eine Eigenschaft
eines Systems oder Objektes gemessen wird. Assay ist eine Abkürzung üblicherweise
verwendet für biologisches Assay und ist eine Art in vitro Experiment.
Assays werden normalerweise zum Messen der Auswirkungen einer Substanz
auf einen lebenden Organismus durchgeführt. Assays können
qualitativ oder quantitativ sein und sie sind essentiell bei der Entwicklung
neuer Arzneimittel.
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Das
gegenständliche Assay stellt einen breiten dynamischen
Bereich bereit, so dass die Aktivität eines NCX-Proteins
bestimmt werden kann. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung
ein schnelles, effektives Assay für das Screening und Profiling
pharmazeutisch wirksamer Verbindungen bereit, welche spezifisch
mit der Aktivität eines NCX-Proteins interagieren und diese
modulieren.
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Der
Begriff „NCX-Protein" oder „NCX" soll im Kontext
der vorliegenden Erfindung für eines aus der Liste der
folgenden Na+/Ca2+-Austauscherproteine
entweder allein oder in Kombination miteinander stehen: NCX1, NCX2,
NCX3, NCX4, NCX5, NCX6, NCX7.
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Besonders
bevorzugt sind NCX1, NCX2 und/oder NCX3, deren Aminosäuresequenzen
jeweils SEQ. ID. NR. 1, SEQ. ID. NR. 2 und SEQ. ID. NR. 3 entsprechen.
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Ein
solches NCX-Protein könnte abgeleitet sein von irgendeinem
Wirbeltier und insbesondere Säugetierspezies (z. B. Hund,
Pferd, Rind, Maus, Ratte, Huhn, Anthropoid, Mensch oder andere).
Der NCX könnte aus Gewebeproben solcher Wirbeltierorganismen
isoliert sein oder mit Hilfe von rekombinantem biologischem Material
hergestellt werden, welches in der Lage ist, das NCX-Protein zu
exprimieren.
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Der
Begriff „NCX-Protein" betrifft Polypeptide, polymorphe
Varianten, Mutanten und Interspezies-Homologa, welche eine Aminosäuresequenz
aufweisen, welche eine Aminosäuresequenzidentität,
die größer ist als etwa 80%, 85%, 90%, bevorzugt
eine Aminosäuresequenzidentität von 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder höher, bevorzugt über
eine Region von mindestens etwa 25, 50, 100, 200 oder 500 oder mehr
Aminosäuren zu einer Aminosäuresequenz codiert
durch die Nukleinsäuresequenz enthalten in SEQ. ID. NR.
1, SEQ, ID. NR. 2 und SEQ. ID. NR. 3 aufweist.
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Der
Begriff „biologisches Material" steht für jedes
Material, welches genetische Informationen enthält und
in der Lage ist, sich selbst zu reproduzieren oder in einem biologischen
System reproduziert zu werden. Rekombinantes biologisches Material
ist jedes biologische Material, das mit Hilfe rekombinanter Techniken,
die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt, verändert
oder modifiziert wurde.
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Die
folgenden Referenzen sind Beispiele des Klonens bestimmter NCX-Proteine.
Der Hunde-Na+/Ca2+-Austauscher
NCX1 wurde durch Nicoll, DA. et al. (Science, 250 (4980):
562–5, 1990; Titel: Molecular cloning and functional expression
of the cardiac sarcolemmal Na(+)-Ca2+ exchanger) geklont.
Der menschliche Na+/Ca2+-Austauscher
NCX1 wurde durch Komuro, I., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89 (10), 4769–4773, 1992; Titel: Molecular cloning
and characterization of the human cardiac Na+/Ca2+ exchanger cDNA) und
durch Kofuji, P. et al. (Am. J. Physiol. 263 (Cell Physiol.
32): C1241–C1249, 1992; Titel: Expression of the Na-Ca
exchanger in diverse tissues: a study using the cloned human cardiac
Na-Ca exchanger) geklont. Der menschliche Na+/Ca2+-Austauscher NCX2 wurde durch Li,
Z. et al. (J. Biol. Chem. 269(26): 17434-9, 1994; Titel: Cloning
of the NCX2 isoform of the plasma membrane (Na(+)-Ca2+ exchanger) geklont.
Der Ratten-Na+/Ca2+-Austauscher
NCX3 wurde durch Nicoll, DA. et al. (J. Biol. Chem. 271(40):
24914-21, 1996; Titel: Cloning of a third mammalian Na+/Ca2+ exchanger,
NCX3) geklont. Der menschliche Na+/Ca2+-Austauscher NCX3 wurde durch Gabellini,
N. et al. (Gene, 298: 1–7, 2002; Titel: The human SLC8A3
gene and the tissue-specific Na+/Ca2+ exchanger 3 isoforms) geklont.
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Die
Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein"
werden hierin austauschbar verwendet zur Bezugnahme auf ein Polymer
von Aminosäureresten.
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Die
Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, in denen
ein oder mehr Aminosäurereste ein künstlicher chemischer
Nachahmer einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure
ist, sowie für natürlich vorkommende Aminosäurepolymere
und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere.
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Der
Begriff „Aktivität von NCX-Protein" betrifft den
Mechanismus des Entfernens von intrazellulärem Ca2+ aus einer Zelle. Im Herz extrudiert er
Ca2+, welches durch Ca2+-Kanäle
zum Initiieren von Kontraktion eingetreten ist, während
Na+ in die Herzzelle eintritt. Seine Relevanz
bei kardiovaskulären Erkrankungen ist z. B. veranschaulicht
in Hobai, JA & O'Rourke,
B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs, 13, 653–664.
Daher hat die pharmazeutische Industrie Verbindungen entwickelt,
welche den NCX hemmen, wie z. B. beschrieben in Iwamoto,
T. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 7544–7553.
Der Na+/Ca2+-Austauscher
transportiert elektrogenisch drei bis vier Na+ für
jedes Ca2+, welches sich in die entgegengesetzte
Richtung bewegt, wie z. B. gezeigt durch elektrophysiologische Mittel
in Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453–461.
Der NCX ist in der Lage, die Zytoplasma-Ca2+-Konzentration
([Ca2+] ein) drei bis vier Größenordnungen
unter der extrazellulären Ca2 +-Konzentration ([Ca2 +] aus) aufrechtzuerhalten. Nichtsdestotrotz
ist die Richtung des Netto-Ca2 +-Transports
abhängig vom elektrochemischen Gradienten des Na+. Simultane und konsekutive Transportmodelle
wurden für Na+- und Ca2 +-Translokationen vorgeschlagen, und eine
Menge an Belegen spricht für Letztgenannte. Die Aktivität von
NCX-Protein wird bestimmt durch die Messung der verstärkten
Lumineszenz, welche aus einer geeigneten farbigen Substanz, die
mit Calcium einen Komplex bildet, resultiert.
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Der
Begriff „Zellen, welche NCX exprimieren" betrifft Zellen,
welche den Austauscher von Interesse endogen exprimieren oder rekombinante
Zellen. Der Begriff „rekombinant", wenn er unter Bezugnahme
z. B. auf eine Zelle oder Nukleinsäure, ein Protein oder
einen Vektor verwendet wird, gibt an, dass die Zelle, Nukleinsäure,
das Protein oder der Vektor durch das Einführen einer/s
heterologen Nukleinsäure oder Proteins oder die Veränderung
einer/s nativen Nukleinsäure oder Proteins modifiziert
wurde, oder dass die Zelle abgeleitet ist von einer so modifizierten
Zelle. So exprimieren rekombinante Zellen zum Beispiel Gene, welche
sich nicht in der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle finden,
oder sie exprimieren native Gene, welche sonst anomal exprimiert,
unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden.
In der vorliegenden Erfindung betrifft dies normalerweise Zellen,
welche mit Nukleinsäuresequenzen transfiziert wurden, die
NCX-Proteine codieren.
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Das
Assay wird einfach durch das Züchten der Zellen in einem
geeigneten Behälter mit einem geeigneten Kulturmedium durchgeführt.
Die Zelle kann eine natürlich vorkommende Zelle, eine native
Zelle, eine etablierte Zelllinie, eine handelsübliche Zelle,
eine genetisch modifizierte Zelle usw. sein, solange die Zelle in der
Lage ist, während des Assays aufrechterhalten zu werden
und in einem Kulturmedium wünschenswert zu wachsen.
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Zu
geeigneten Zellen für das Erzeugen des gegenständlichen
Assays zählen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische
Zellen, besonders Säugetierzellen. Zu Prokaryoten zählen
Gram-negative und Gram-positive Organismen. Die Zellen sind normalerweise
Säugetierzellen, wie menschliche Zellen, Mauszellen, Rattenzellen,
chinesische Hamsterzellen usw. Zu Zellen, welche sich als geeignet
erwiesen haben, zählen CHO-, COS7-, JURKAT-, HeLa-, HEKs-,
MDCK- und HEK293-Zellen.
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Zellen
lassen sich mit den bekannten Verfahren herstellen (Current
protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059)
oder können erworben werden (Invitrogen Corp., Sigma-Aldrich
Corp., Stratagene).
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Der
Begriff „farbige Substanz" betrifft insbesondere einen
Calcium-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff. Der Farbstoffvorläufer
ist dadurch gekennzeichnet, dass er unter den Bedingungen des Assays
nicht lumineszent ist; jedoch handelt es sich um einen Ester, der
in der Lage ist, in die Zellen einzutreten und der intrazellulär
zu der lumineszenten Oxyverbindung hydrolysiert, wodurch bei der
Komplexbildung mit Calcium verstärkte Lumineszenz bereitgestellt
wird. Die Ester werden so ausgewählt, dass sie empfänglich
für die Hydrolyse durch intrazelluläre Hydrolasen
sind.
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Der
Begriff „in der Lage, in die Zellen einzutreten" steht
dafür, dass die Vorläufer in der Lage sind, die zelluläre
Membran zu durchqueren und in den Zellen hydrolysiert zu werden;
der Farbstoffvorläufer tritt unter spezifischen Bedingungen
des pH, der Temperatur usw. in die Zelle ein, tritt mit unterschiedlichen
Geschwindigkeiten in die Zelle ein oder tritt unter spezifischen
Bedingungen nicht in die Zelle ein.
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Die
farbige Substanz wird mittels der bekannten Protokolle (Current protocols
in cell biology, John Wiley & Sons
Inc., ISBN: 0471241059) zu den Zellen zugegeben.
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Die
Verwendung einer farbigen Substanz ist konventionell, und es können
handelsübliche Reagenzien (Invitrogen Corp.) sowie im Labor
synthetisierte Reagenzien verwendet werden.
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Eine
Reihe handelsüblicher Farbstoffe, welche die obigen Anforderungen
erfüllen, sind bekannt. Fluoreszenzfarbstoffe für
die Überwachung des Ca2+ sind bekannt
und in Abschnitt 20.1–20.4 des Katalogs Molecular Probes,
9. Edition detailliert beschrieben. Sie weisen üblicherweise
zwei Bis-carboxymethylaminogruppen angehaftet an einem fluoreszenten
Nukleus wie Fluorescin, Rhodamin, Coumarin, Aminophenylindol und andere
auf. Größtenteils sind die Verbindungen 3,6-Dioxy-substituierte
Xanthene, wobei im Vorläufer die Oxygruppen substituiert
sind und im lumineszenten Farbstoff sind sie unsubstituiert. Üblicherweise
sind Acetoxymethylgruppen vorhanden, welche die Phenole und Säuren
schützen. Siehe zum Beispiel Fluo3/4, Fura2/3, Calceingrün
usw. Die Hydrolyse der Acetylgruppen resultiert in dem lumineszenten
Produkt. Die Vorläufer sind in der Lage, die zelluläre
Membran zu durchqueren und in der Zelle hydrolysiert zu werden.
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Der
Begriff „Lumineszenz" betrifft ein „kaltes Licht",
Licht aus anderen Energiequellen, was bei normalen und niedrigeren
Temperaturen stattfinden kann. Bei der Lumineszenz verdrängt
eine Energiequelle ein Elektron eines Atoms von seinem „Grund"
(Niedrigstenergie)-Status in einen „angeregten" (Höherenergie)
Status; dann gibt das Elektron die Energie in Form von Licht zurück,
so dass in seinen „Grund"-Zustand zurückkehren
kann. Es gibt mehrere Varietäten von Lumineszenz, jede
jeweils danach benannt, was die Energiequelle ist oder was der Auslöser
für die Lumineszenz ist.
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Der
Begriff „Fluoreszenz" betrifft eine Lumineszenz, welche
sich hauptsächlich als ein optisches Phänomen
bei kalten Körpern findet, bei denen die molekulare Absorption
eines Photons die Emission eines anderen Photons mit einer längeren
Wellenlänge auslöst. Der Energieunterschied zwischen
dem absorbierten und emittierten Photon endet als Molekülschwingungen
oder Wärme. Üblicherweise liegt das absorbierte
Photon im ultravioletten Bereich und das emittierte Licht liegt
im sichtbaren Bereich, dies ist jedoch abhängig von der
Absorbanzkurve und der Stokes-Verschiebung des bestimmten Fluorophors.
Fluoreszenz ist benannt nach dem Mineral Fluorit, zusammengesetzt
aus Calciumfluorid, welches häufig dieses Phänomen
zeigt.
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Fluoreszenz
von den Indikatorfarbstoffen kann mit einem Luminometer oder einem
Fluoreszenz-Imager gemessen werden. Ein bevorzugtes Erkennungsinstrument
ist der Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) (Molecular Devices,
Sunnyvale, Calif.). Der FLIPR ist gut geeignet für das
Screening mit hohem Durchsatz unter Verwendung der Verfahren der
vorliegenden Erfindung, da er integriertes Flüssigkeitshandling,
welches in der Lage ist, gleichzeitig in 96 oder 384 Wells einer
Mikrotiterplatte zu pipettieren, und die schnelle kinetische Erkennung
unter Verwendung eines Argon-Lasers gekoppelt an eine ladungsgekoppelte Schaltungs-Imagingkamera
einschließt.
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Eine
Alternative zur Verwendung von Calciumindikatorfarbstoffen ist die
Verwendung des Aequorinsystems. Das Aequorinsystem verwendet das
Protein Apoaequorin, welches an den lipophilen Chromophor Coelenterazin
bindet, wodurch eine Kombination aus Apoaequorin und Coelenterazin
gebildet wird, die als Aequorin bekannt ist. Apoaequorin weist drei
Calciumbindungsstellen auf, und bei der Calciumbindung ändert
der Apoaequorinanteil des Aequorins seine Konformation. Diese Veränderung
in der Konformation veranlasst, dass das Coelenterazin zu Coelenteramid,
CO2 und einem Photon von blauem Licht (466 nm) oxidiert. Dieses Photon
kann mit geeigneter Instrumentierung erkannt werden.
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Für
eine Revision der Verwendung von Aequorin, siehe
Créton
et al., 1999, Microscopy Research and Technique 46: 390–397;
Brini
et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 9896–9903;
Knight & Knight, 1995,
Meth. Cell. Biol. 49: 201–216. Außerdem
von Interesse kann
US-Patentschrift
Nr. 5,714,666 sein, welches Verfahren der Messung intrazellulären
Calciums in Säugetierzellen durch die Zugabe von Coelenterazin-Co-Faktoren
zu Säugetierzellen, die Apoaequorin exprimieren, beschreibt.
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„Hemmer", „Aktivatoren"
und „Modulatoren" von NCX-Polynukleotid- und -Polypeptidsequenzen
werden verwendet, um auf die aktivierenden, hemmenden oder modulierenden
Moleküle Bezug zu nehmen, welche mit Hilfe der zellbasierten
Assays von NCX-Polynukleotid- und -Polypeptidsequenzen identifiziert
werden.
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„Hemmer"
sind Verbindungen, welche z. B. an NCX-Proteine, z. B. Antagonisten,
binden, deren Aktivität teilweise oder komplett blockieren,
ihre Aktivierung verringern, verhindern oder verzögern
oder deren Aktivität oder Expression deaktivieren, desensibilisieren
oder nach unten regulieren.
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„Aktivatoren"
sind Verbindungen, welche die Aktivierung der NCX-Protein aktivität
erhöhen, öffnen, aktivieren, vereinfachen oder
verstärken und die NCX-Proteinaktivität sensibilisieren,
agonisieren oder nach oben regulieren. Ein bevorzugter NCX-Aktivator
ist Ionomycin, ein Ionophor, der von Streptomyces conglobatus stammt.
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Zu
Hemmern, Aktivatoren oder Modulatoren zählen auch genetisch
modifizierte Versionen von NCX-Proteinen, z. B. Versionen mit veränderter
Aktivität sowie natürlich vorkommende und synthetische
Liganden, Antagonisten, Agonisten, Peptide, cyclische Peptide, Nukleinsäuren,
Antikörper, Antisense-Moleküle, Ribozyme, kleine
organische Moleküle und ähnliche.
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Der
Begriff „Verbindung" oder „Testverbindung" oder „Testkandidat"
oder grammatische Äquivalente davon beschreibt jedes Molekül,
entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, z. B. Protein,
Oligopeptid, kleines organisches Molekül, Polysaccharid,
Lipid, Fettsäure, Polynukleotid, Oligonukleotid usw. zum
Testen auf die Kapazität zum Modulieren der NCX-Aktivität
(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN:
0471250961). Die Testverbindung kann in Form einer Bibliothek
von Testverbindungen vorliegen, wie eine kombinatorische oder randomisierte
Bibliothek, welche einen ausreichenden Diversitätsbereich
bereitstellt (Current protocols in molecular biology, John
Wiley & Sons
Inc., ISBN: 0471250937). Testverbindungen sind wahlweise
verbunden mit einem Fusionspartner, z. B. Targeting-Verbindungen,
Rettungsverbindungen, Dimerisationsverbindungen, Stabilisierungsverbindungen,
adressierbare Verbindungen und weitere funktionale Komponenten.
Herkömmlich werden neue chemische Einheiten mit nützlichen
Eigenschaften durch Identifikation einer Testverbindung (eine „Führungsverbindung"
genannt) mit einer wünschenswerten Eigenschaft oder Aktivität
erzeugt, z. B. Verstärkung der Aktivität, Erzeugung
von Varianten der Führungsverbindung und Auswertung der
Eigenschaft und Aktivität dieser Variantenverbindungen.
Bevorzugt werden Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz (HTS) für
solche Analysen eingesetzt.
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Die
Hemmer-, Aktivator- und Testverbindung kann durch Injektion in das
Kulturmedium zu den Zellen zugegeben werden, nachdem die Zellen
gewachsen sind, oder sie können vor dem Zellwachstum in
dem Kulturmedium vorliegen (Current protocols in cell biology,
John Wiley & Sons
Inc., ISBN: 0471241059).
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Die
Zellen können auf der Hemmer-, Aktivator und/oder Testverbindung
auf eine geeignete Zahl gezüchtet werden, oder sie können
darauf aufgebracht und ohne weiteres Wachstum verwendet werden.
Die Zellen können an die Hemmer-, Aktivator- und/oder Testverbindung
angehaftet werden, oder, bei den Ausführungsformen, bei
denen die Zellen in Wells positioniert oder gezüchtet werden,
können die Zellen Suspensionszellen sein, welche in dem
Fluid in den Wells suspendiert sind.
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Der
Begriff „Kontrollexperiment" betrifft unterschiedliche
Arten von Experimenten, die zusammen durchgeführt werden
sollten. Der Fachmann wird erkennen, dass es im Allgemeinen von
Vorteil ist, Kontrollen zusammen mit den hierin beschriebenen Verfahren
durchzuführen.
-
Zum
Beispiel ist es üblicherweise hilfreich, eine Kontrolle
für das Assay für die Bestimmung der Aktivität
von NCX-Protein zu haben, bei der die Zellen bevorzugt im Wesentlichen
identisch mit den Zellen sind, die in dem Assay verwendet werden,
außer dass diese Zellen das NCX-Protein von Interesse nicht
exprimieren würden. Außerdem ist es üblicherweise
hilfreich, eine Kontrolle für das Assay für die
Bestimmung der Aktivität von NCX-Protein als Reaktion auf
die Zugabe einer Verbindung zu haben, bei der die Verbindungen in
dem Assay der Erfindung gegen Zellen getestet werden, die bevorzugt
im Wesentlichen identisch mit den Zellen sind, die in dem Assay
verwendet werden, außer dass diese Zellen das NCX-Protein
von Interesse nicht exprimieren würden. Auf diese Art und
Weise kann bestimmt werden, dass Verbindungen, welche durch das
Assay identifiziert werden, ihre Wirkungen wirklich durch das NCX-Protein
von Interesse ausüben, anstatt durch einen unerwarteten
nichtspezifischen Mechanismus. Eine Möglichkeit für
solche Kontrollzellen wäre die Verwendung nicht-rekombinanter
Elternzellen, wobei die Zellen des tatsächlichen Experimentes
das NCX-Protein von Interesse exprimieren.
-
Weitere
Kontrollen für das Assay zum Bestimmen der Aktivität
von NCX-Protein als Reaktion auf die Zugabe einer Verbindung wären
das Durchführen des Assays ohne die Zugabe der Testverbindung
(niedrige Kontrolle) und das Durchführen des Assays mit
einer hohen Konzentration der Testverbindung (hohe Kontrolle). Weitere
Arten von Kontrollen beinhalten das Hernehmen von Verbindungen,
welche durch das Assay der vorliegenden Erfindung als Agonisten
oder Antagonisten von NCX-Proteinen von Interesse identifiziert
werden und das Testen dieser Verbindungen mit den Verfahren des
Standes der Technik zur Bestätigung dessen, dass diese
Verbindungen auch Agonisten oder Antagonisten sind, wenn sie mit
diesen Verfahren des Standes der Technik getestet werden.
-
Außerdem
dürfte ein Fachmann auf dem Gebiet wissen, dass es auch
wünschenswert wäre, statistische Analysen durchzuführen,
indem Assay Werte mit Standardwerten verglichen werden.
-
Die
Begriffe „Agonist" und „Antagonist" betreffen
Rezeptor-Effektor-Moleküle, welche die Signaltransduktion über
einen Rezeptor modulieren. Rezeptor-Effektor-Moleküle sind
in der Lage an den Rezeptor zu binden, jedoch nicht notwendigerweise
an der Bindungsstelle des natürlichen Liganden. Rezeptor-Effektoren
können die Signaltransduktion modulieren, wenn sie allein
verwendet werden, d. h. sie können Ersatzliganden sein,
oder sie können die Signaltransduktion in Gegenwart des
natürlichen Liganden verändern, entweder zum Verstärkern
oder Hemmen der Signalgebung durch den natürlichen Liganden.
Zum Beispiel sind „Antagonisten" Moleküle, welche
die Signaltransduktionsaktivität des Rezeptors blockieren
oder verringern, z. B. können sie konkurrierend, nichtkonkurrierend
und/oder allosterisch die Signaltransduktion von dem Rezeptor hemmen,
wohingegen „Agonisten" die Signaltransduktionsaktivität
eines Rezeptors potenzieren, induzieren oder anderweitig verstärken.
-
Der
Begriff „Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten
Expression" betrifft dilatierte Kardiomyopathie, Koronarherzerkrankung,
Arrhythmie, Herzversagen usw.
-
Der
Verbraucherfreundlichkeit halber können die farbige Substanz
und andere Komponenten des Assays in Sätzen bereitgestellt
sein, wobei die farbige Substanz als ein rekonstituierbares Pulver
oder als eine gekühlte Lösung auf Eis, in einem
Puffer vorliegen kann. Der Satz kann auch den Puffer, Aktivator,
Hemmer, die Testverbindung, Zellen, welche NCX-Protein exprimieren,
usw. enthalten. Zellen können als lyophilisierte Zellen
vorliegen. Der Teilesatz kann als ein diagnostischer Satz für
das Diagnostizieren von dilatierter Kardiomyopathie, Koronarherzerkrankung,
Arrhythmie, Herzversagen usw. verwendet werden.
-
Die
folgenden Figuren und Beispiele beschreiben die Erfindung detaillierter
durch die Beschreibung der typischen Resultate des Fluoreszenz-basierten
zellulären NCX-Assays, ohne dabei den Schutzumfang einzuschränken.
-
BEISPIELE
-
1. Assay-Verfahren
-
1.1 Assay-Reagenzien
-
Die
folgenden chemischen Zusammensetzungen werden als Reagenzien für
das Assay verwendet:
Reagenz | Chemikalien | Bemerkungen |
Assay-Puffer | 3,5
mM CaCl2
133,8 mM NaCl
4,7 mM
KCl
1,25 mM MgCl2
0,01% Pluronic
F-127
10 mM Hepes/NaOH pH 7,5
5 mM Glucose
2,5 mM
Probenecid | Probenecid
wird zugegeben am Tag der Verwendung aus einer frisch hergestellten
1 M Lösung in 1 N NaOH. |
Farbstoffauftragspuffer | Assay-Puffer
enthaltend
2 μM Fluo-4/AM
0,1% BSA | Fluo-4/AM
wird zugegeben aus einer 1 mM Stammlösung in DMSO |
Verbindungspuffer | Assay-Puffer
Verschiedene Verbindungskonzentrationen | Verbindungen
werden zugegeben aus einer 10 mM Stammlösung in DMSO |
Ionophor-Lösung | Assay-Puffer
enthaltend
0,3% BSA
6 μM Ionomycin | Ionomycin
wird zugegeben aus einer 10 mM Stammlösung in DMSO |
Positive
Kontrollpuffer | Niedrig)
Ionophor-Lösung | A000135933 wird zugegeben aus einer 10 mM
Stammlösung in DMSO |
Hoch)
Assay-Puffer 15–45 μM A0001135933 |
-
1.2 Assay-Verfahren
-
- 1] 20 bis 24 Stunden vor dem Experiment werden
Zellen in Wachstumsmedium suspendiert (Nutrient Mixture F12 (HAM)
Invitrogen, Karlsruhe, 5% FCS, Biochrom, Berlin), ohne Antibiotika,
und in schwarzen 96-Well-Klarbodenplatten (25.000 Zellen/Well in
100 μl) kultiviert.
- 2] Das Medium wird entsorgt und anschließend werden
100 μl Farbstoffauftragspuffer zugegeben, und die Platten
werden im Dunkeln für 75 Min. bei RT inkubiert.
- 3] Der Farbstoffauftragspuffer wird durch dreimaliges Waschen
mit 100 μl Assay-Puffer entfernt. Der Puffer wird entsorgt.
- 4] 80 μl aus den Verbindungsplatten werden zugegeben
und die Platten für 30 Min. bei 16°C aufbewahrt.
- 5] Die Platten werden in den FLIPR übertragen und unter
Verwendung des folgenden Protokolls (einschließlich 40 μl
Zugabe aus der Ionophor-Platte) untersucht:
-
1.1 FLIPR-Experiment-Setup-Parameter |
Aussetzung |
0,5
Sek. (bei 1,2 W) |
F-Stopp |
F/2 |
Filter |
1 |
1.1.1 Diagramm-Setup |
Subtrahieren
der Vorspannung basierend auf der Probe: aus |
Räumliche
Uniformitätskorrektur: aus |
Negative
Kontrollkorrektur: aus |
1.1.2 Erste
Sequenz |
Anfangszeitraum |
2
Sek. |
Anfangszählung |
100
Frames |
Zugabe
nach Frame |
5 |
Zugabehöhe |
70 μl |
Zugabegeschwindigkeit |
40 μl/Sek. |
Zugabevolumen |
40 μl |
Mischung |
1 × 40 μl |
Statistik |
Statistik
1 |
Summe
25–45 (Vorspannung aus) |
-
1.3 Datenanalyse
-
Inhibitorische
Aktivität der Testverbindungen in NCX-Zellen:
-
Berechnung der Hemmung:
-
Die
Berechnungen basieren auf dem Statistikexport. Rohdaten werden für
die Hemmung gemäß folgender Gleichung umgewandelt:
-
Das
Mittel der hohen Kontrolle ist abgeleitet aus der durchschnittlichen
Differenz von acht gepaarten Proben von 10 oder 30 μM A000135933
mit Ionomycin. Das Mittel der unteren Kontrolle ist abgeleitet aus
den Ionomycin-Kontrollen. Verbindungen, welche die basale Fluoreszenz
mehr als 1,3fach erhöhen, werden entsorgt.
-
2. Assay-Beispiele
-
2.1 Reaktion der hohen und niedrigen Kontrollen
-
Die
typische Fluoreszenzreaktion der hohen und niedrigen Kontrollen
nach Zugabe von 2 μM Ionomycin ist in 2 gezeigt
und ist Folgende: Wenn der NCX1 aktiv ist (niedrige Kontrolle),
wird Calcium, welches nach der Ionomycin-Zugabe in die Zelle eintritt,
aus der Zelle heraustransportiert. Nach ein paar Sekunden ist die
Anfangscalciumbeladung der Zellen wiederhergestellt. Die Hemmung
von NCX1 führt zu einer Fluoreszenzerhöhung nach
der Ionomycin-Zugabe aufgrund einer Erhöhung des cytosolischen
Calciums (hohe Kontrolle, 30 μM A000135933).
-
2.2 Werkzeugsubstanz: A000135933
-
Der
neue NCX1-Hemmer A000135933 fand sich im ersten HTS-Screen. 3, 4 und 5 zeigen
eine typische dosisabhängige Reaktion auf unterschiedliche
Konzentrationen von A000135933. A000135933 war ein guter NCX1-Hemmer
mit einem mittleren IC50 von 5,9 μM
und seit dieser Zeit wird er als eine Werkzeugsubstanz bei den Assays
verwendet. Ein IC50 dieser Verbindung wird
auf jeder Platte als Kontrolle zugegeben. Das S/B-Verhältnis
und der z'-Wert für dieses Beispiel waren sehr gut. Zusammen
mit dem IC50 von A000135933 wurden diese
Parameter verwendet, um eine gute Assay-Leistung für jede
Platte anzuzeigen:
- 1. S/B größer
als zwei.
- 2. z'-Wert zwischen 0,5 und 0,7.
- 3. IC50 der Werkzeugverbindung A000135933
muss um das Mittel von 5,9 μM liegen.
-
2.3 Werkzeugsubstanz: Assay-Beispiel
-
Ein
Assay wurde mit vier Verbindungen in doppelter Ausführung
durchgeführt (6). Die vier Verbindungen sind
aus der gleichen Verbindungsklasse. Eine Verbindung war ein guter
NCX1-Hemmer (A000135933), zwei Verbindungen zeigen moderate Hemmung
(A000136648, A000104243) und eine war nicht aktiv im Konzentrationsbereich
(A000103746). Dieses Beispiel zeigt, dass das Assay geeignet ist, NCX1-Hemmer
zu screenen und Strukturaktivitätsbeziehungen zu etablieren.
-
2.4 Korrelation mit Elektrophysiologie
-
Der
Vergleich der Daten abgeleitet aus dem Fluoreszenz-basierten Assay
mit einem direkten Elektrophysiologieverfahren (longate's SURFE2R-Technologie) ist die beste Möglichkeit
zum Einschätzen der Leistung dieses Assays. Die Korrelation
dieser beiden sehr unterschiedlichen Techniken ist recht gut (7).
-
Die
mit SURFE2R gemessene Hemmung war höher
(im Mittel 14%), außer bei einer Verbindung, als die Hemmung
abgeleitet aus dem indirekten FLIPR-Assay.
-
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
-
1: 1a zeigt
die Polynukleotidsequenz von NCX1 dargestellt durch SEQ. ID. NR.
1. 1b zeigt die Polynukleotidsequenz von NCX2 dargestellt
durch SEQ. ID. NR. 2. 1c zeigt die Polynukleotidsequenz
von NCX3 dargestellt durch SEQ. ID. NR. 3.
-
2:
Fluoreszenzsignal der CHO-NCX1-Zellen nach Ionomycin-Zugabe. Hemmung
von NCX1 (hohe Kontrolle, 30 μM A000135933, rot) führt
zu einer Fluoreszenzerhöhung aufgrund einer Erhöhung
des cytosolischen Calciums. Aktives NCX1 stellt die Anfangscalciumbeladung
nach wenigen Sekunden wieder her (niedrige Kontrolle, schwarz).
-
3:
Rohdaten: Die Kinetik der Fluoreszenz ändert sich nach
Ionomycin-Zugabe für unterschiedliche Konzentrationen von
A000135933. Die Summe der Fluoreszenzwerte von 50 bis 90 Sek. wurde
verwendet, um die prozentualen Fluoreszenzänderungen im
Vergleich zu den Kontrollen zu berechnen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
-
4:
Assay-Statistik für eine 96-Well-Platte mit hohen und niedrigen
Kontrollen und unterschiedlichen Konzentrationen von A000135933.
Das berechnete Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis (S/B),
z' und die Erhöhung der Fluoreszenz zwischen 50 und 90
Sekunden verschiedener Konzentrationen von A000135933 sind aufgelistet
(siehe auch 2). Bei diesem Beispiel betrug
der berechnete IC50 von A000135933 7,16 μM
(mittlerer IC50: 5,9 μM).
-
5:
Veranschaulichung der prozentualen Fluoreszenzerhöhung
im Vergleich zur Verbindungskonzentration von A000135933 und die
entsprechende Passkurve. Bei diesem Beispiel betrug der berechnete
IC50 von A000135933 7,16 μM (mittlerer
IC50: 5,9 μM).
-
6:
zeigt den Rohdatenausdruck aus dem FLIPR.
-
7:
Korrelation zwischen dem NCX1-Fluoreszenz-basierten FLIPR-Assay
mit der Elektrophysiologie-basierten SURFE2R-Technologie
einer Verbindungsklasse. Die Hemmung von NCX1 wurde in beiden Fällen
mit 10 μM gemessen.
-
-
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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