DE10202482B4 - Molekularer Sensorkomplex, Messsondenanordnung und Verfahren zur pharmakologischen Wirkstoff- und/oder Wirkorttestung - Google Patents

Abstract

Molekularer Sensorkomplex,
welcher zur Fluoreszenz anregbar ist, mit:
– mindestens einer Membranproteineinheit (12) und
– mindestens einer an die Membranproteineinheit (12) gebundenen Fluoreszenzeinheit (13),
– wobei die Membranproteineinheit (13) mindestens eine Na⁺/K⁺-ATPase als eine P-Typ-ATPasen-Einheit (12) aufweist oder von einer solchen gebildet wird,
– wobei die Fluoreszenzeinheit (13) jeweils an eine durch Funktionen und/oder Konformationsänderungen der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) beeinflussbare Reporterposition der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) gebunden ist,
– wobei die Fluoreszenzeinheit (13) in der Nähe einer Kationenbindungsstelle gebunden ist,
– wobei die Reporterposition über zielgerichtete Mutagenese der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) ausgebildet ist und
– wobei bei der zielgerichteten Mutagenese der Fest N790C in der α1-Untereinheit der Na⁺/K⁺-ATPase verwendet wird.

Description

• Die Erfindung betrifft einen molekularen Sensorkomplex, eine Messsondenanordnung sowie ein Verfahren zur pharmakologischen Wirkstoff- und/oder Wirkorttestung.
• Es sind verschiedene Techniken bekannt, bei denen bestimmte funktionale Eigenschaften und Zusammenhänge von Membranproteinen oder Membranproteineinheiten ausgenutzt werden, um pharmakologisch relevante Wirkstoffe und/oder Wirkorte zu testen oder einem sogenannten Screening zuzuführen.
• Zum einen ist bekannt, die Membranproteineinheiten, also zum Beispiel die Wirkorte selbst, oder jeweils eingesetzten Wirkstoffe über eine Fluoreszenzmessung oder Fluoreszenzänderungsmessung zu charakterisieren. Dabei werden zum Beispiel die entsprechenden Membranproteineinheiten in nativer Form oder quasinativer Form in Membranen eingefügt und aktiviert. Die sich nach Aktivierung aufbauenden Ionengradienten oder deren Änderungen beeinflussen dann ebenfalls im Bereich der vorgesehenen Membran ausgebildete Fluoreszenzeinheiten, zum Beispiel entsprechende Farbstoffmoleküle, in ihrem Fluoreszenzverhalten. Dieser Mechanismus setzt aber zum Beispiel eine strikte Elektrogenität der Membranproteineinheiten voraus, weil die entsprechenden Fluoreszenzeinheiten ladungsabhängig oder potenzialabhängig fungieren, so dass damit elektroneutral arbeitende Membranproteineinheiten nicht vermessen werden können.
• Au "Labelling the (Ca²⁺ – Mg²⁺)-ATPase of sarcoplasmatic reticulum at Glu-439 with 5-(bromomethyl)fluorescein (Stefanova et al., 1993) ist bekannt, dass Fluoreszenzmarkierungen an bestimmten Ami nosäureresten der Kalzium-/Magnesium-ATPase verwendet werden kann, um Konformationsänderungen aufzuspüren. Dabei werden bestimmte Lysinreste entsprechend modifiziert.
• Aus "Structure-function study of gastric proton pump" (Asano, 1997) ist bekannt, den Strukturfunktionszusammenhang bei der Protonenpumpe aus der Magenschleimhaut durch Anwendung funktionaler Antikörper, spezifischer Inhibitoren, Fluoreszenzreagentien und auch zielgerichteter Mutagenese aufzudecken.
• In der Arbeit "Localization of side-specific probes on the Ca-ATPase of sarcoplasmatic rediculum using fluorescence energy transfer (Squier, 1987) wird geschrieben, wie mittels Fluoreszenzsonden, die an bestimmten Stellen der Kalzium-ATPase ausgebildet wird, um aufgrund der Fluoreszenzanalyse auch hier Strukturfunktionszusammenhänge aufzudecken.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen molekularen Sensorkomplex, eine Messsondenanordnung sowie ein Messverfahren anzugeben, bei welchem auf besonders einfache Art und Weise über eine Fluoreszenzmessung oder Fluoreszenzänderungsmessung eine pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung durchgeführt werden kann.
• Die Aufgabe wird durch einen molekularen Sensorkomplex mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 3 gelost. Ferner wird die Aufgabe durch eine Messsondenanordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 7 gelöst. Darüber hinaus wird die Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Anspruch 9 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind jeweils Gegenstand der jeweiligen abhängigen Unteransprüche.
• Der erfindungsgemäße molekulare Sensorkomplex ist zur Fluoreszenz anregbar und weist mindestens eine Membranproteineinheit und mindestens eine an die Membranproteineinheit gebundene Fluoreszenzeinheit auf. Die Membranproteineinheit weist ihrerseits mindestens eine Na⁺/K⁺-ATPase als eine P-Typ-ATPasen-Einheit auf oder wird von einer solchen gebildet. Die Fluoreszenzeinheit ist jeweils an eine durch Funktion und/oder Konformationsänderungen der P-Typ-ATPasen-Einheit beeinflussbare Reporterposition der P-Typ-ATPasen-Einheit gebunden. Ferner ist es erfindungsgemäß vorgesehen, dass die Fluoreszenzeinheit in der Nähe einer Kationenbindungsstelle gebunden ist. Des Weiteren ist es erfindungsgemäß vorgesehen, dass die Reporterposition über zielgerichtete Mutagenese der P-Typ-ATPasen-Einheit ausgebildet ist. Dabei wird erfindungsgemäß der Rest N790C der α1-Untereinheit der Na⁺/K⁺-ATPase verwendet.
• Es ist somit eine Kernidee der vorliegenden Erfindung, bei einem molekularen Sensorkomplex auf der Grundlage eines Fluoreszenzeffekts eine Fluoreszenzeinheit in der P-Typ-ATPasen-Einheit an einer bestimmten Stelle, nämlich einer sogenannten Reporterposition derart gebunden vorzusehen, dass die Beeinflussung der Reporterposition über Funktionen und/oder Konformationsänderungen der P-Typ-ATPasen-Einheit auch die Eigenschaften der Fluoreszenzeinheit, nämlich die Fluoreszenzintensität beeinflussbar ist.
• Bei einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen molekularen Sensorkomplexes ist es vorgesehen, dass die Fluoreszenzeinheit im Wesentlichen kovalent gebunden ist.
• Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen molekularen Sensorkomplexes ist es vorgesehen, dass die Fluoreszenzeinheit im Wesentlichen an oder über eine Cysteingruppe oder eine Mehrzahl davon gebunden ist. Dabei wird ausgenutzt, dass bei P-Typ-ATPasen-Einheiten gerade die Cysteingruppen an im Hinblick auf die Funktion der P-Typ-ATPasen-Einheiten charakteristischen Positionen ausgebildet sind, seien diese endogen, das heißt natürlich, oder künstlich eingefügt. Grundsätzlich ist jede Aminosäure denkbar, solange eine dafür selektive Chemie zur Ankopplung bereit steht. Diese können auch vorab bereits mit der Fluoreszenzeinheit verbunden sein.
• Ferner ist es vorgesehen, dass die Fluoreszenzeinheit im Wesentlichen im Bereich des Übergangs zwischen aufeinanderfolgenden Transmembransegmenten, insbesondere zwischen dem fünften Transmembransegment M5 und dem sechsten Transmembransegment M6 vorgesehen ist, insbesondere in der sogenannten M5-M6-Schleife.
• Vorteilhafterweise weist die Fluoreszenzeinheit ein Farbstoffmolekül auf oder ist aus einem solchen gebildet, insbesondere durch ein Rhodaminfarbstoffmolekül.
• Wegen der zielgerichteten Matagenes kann also insbesondere daran gedacht werden, die im Hinblick auf die Funktionen und/oder Konformationsänderung wichtigen Positionen zur Beeinflussung der Fluoreszenz mit entsprechenden Cysteinresten oder -gruppen mittels Mutagenese als Ziel einer kovalenten Anbindung der Fluoreszenzeinheit auszubilden.
• Die erfindungsgemäße Messsondenanordnung zur insbesondere pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung mittels Fluoreszenz weist eine Primärträgersuspension, -emulsion und/oder dergleichen in einem im Wesentlichen fluiden Messmedium auf. Ferner können die Primärträger der Primärträgersuspension mittels einer Membran mit einem Innenmedium gegenüber dem Messmedium abgeschlossen ausgebildet sein. Dies ist jedoch nicht zwingend notwendig. Des Weiteren sind in dem Memb ran der Primärträger die erfindungsgemäß ausgebildeten molekularen Sensorkomplexe vorgesehen.
• Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messsondenanordnung sind die Primärträger als Vesikel, Liposomen, Zellen, Oozyten, Organellen und/oder dergleichen ausgebildet. Gerade im Bereich der Oozyten ergibt sich auf einfache Art und Weise die Expression der molekularen Sensorkomplexe in entsprechender Konzentration der Membran, gegebenenfalls mit entsprechender zielgerichteter Mutagenese zur Ankopplung des Fluoreszenzfarbstoffes. Denkbar sind auch Membranfragmente als Primärträger.
• Das erfindungsgemäße Verfahren zur pharmakologischen Wirkstoff- und/oder Wirkorttestung ist dadurch gekennzeichnet, dass die erfindungsgemäße Messsondenanordnung bzw. der erfindungsgemäße molekulare Sensorkomplex verwendet werden.
• Die vorangehend genannten und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich auch aus den nachfolgend aufgeführten Bemerkungen:
  Die Erfindung betrifft insbesondere auch einen fluoreszenzbasierten Aktivitätstest für oder bei P-Typ-ATPasen und inbesondere für oder bei heterolog exprimierten P-Typ-ATPasen.
• P-Typ-ATPasen stellen eine bedeutende Klasse von Membranproteinen dar, die für den primär-aktiven Transport spezifischer Ionensorten durch Membranen von Zellen, Organellen, Bakterien oder dergleichen, kurz, durch die Zellmembran verantwortlich sind, also für den Transport z.B. von Ionen durch Membranen von Zellen, Bakterien und dergleichen. Während die Na⁺/K⁺-ATPase, welche 3 Na⁺-Ionen aus der Zelle hinaus und 2 K⁺- Ionen hinein transportiert (unter Verbrauch eines Moleküls Adenosintriphosphat, ATP) beispielsweise für das Überleben jeder tierischen Zelle notwendig ist, weil sie für die Aufrechterhaltung der über die Zellmembran hinweg bestehenden Konzentrationsgradienten von Na⁺- und K⁺-Ionen sorgt, erfüllen andere P-Typ-ATPasen, wie die H⁺/K⁺-ATPase des Magens, (Transport von zwei Protonen H⁺ aus der Zelle und zwei K⁺-Ionen hinein, Säuresekretion), stark gewebsspezifische Aufgaben mit nicht minder wichtiger Bedeutung für den gesamten Organismus. Aus der bedeutenden physiologischen Relevanz dieser Transportproteine erklärt sich die hier zugrunde liegende Zielsetzung, Aufschlüsse über Funktion und Mechanismus dieser molekularen Maschinen zu liefern.
• Physiologisch verwertbare Aktivitätstests für P-Typ-ATPasen sind alles andere als zahlreich und z.T. mit immensen Schwierigkeiten und Nachteilen verknüpft.
• Ein bekanntes Verfahren bedient sich der zeitlich aufwändigen und schwierigen Aufreinigung des funktionellen Proteins aus nativem Gewebe. Für jeden Proteintyp oder auch das jeweilige Ausgangsgewebe müssen spezielle Protokolle erarbeitet werden, die die Gewinnung funktionell aktiven Proteins ermöglichen.
• Eine Alternative zur Gewinnung aus nativem Gewebe stellt die Expression in Laborzelllinien dar, zum Beispiel in E. coli, Hefe, Insektenzellen, wie Sf9, Säugerzelllinien. Allerdings gestatten nur wenige Zelllinien die Gewinnung gerade dieser Proteinklasse mit ausreichender Ausbeute. Die sich an die Aufreinigung anschließenden Aktivitätstests selbst sind eben falls technisch schwierig und langwierig, zum Beispiel bekannte ATP-Hydrolysemessungen bzw. Phosphorylierungsstudien.
• Prinzipiell besteht nämlich die Gefahr, dass es bei der Aufreinigung zu irreversiblem Funktionsverlust oder zu Veränderungen der Eigenschaften des Proteins kommen kann. Zudem befinden sich die Proteinmoleküle bei den nachfolgenden Messungen in der Regel nicht mehr in ihrer natürlichen Membranumgebung, so dass physiologische Aussagen nur schwer zu treffen sind. Technisch noch aufwändiger sind elektrophysiologische Techniken, bei denen direkt die Eigenschaft der Proteine als Ladungstransporter in Zellmembranen beobachtet werden kann. In diesem Fall bleibt zwar die natürliche Membranumgebung erhalten, dafür erfordert diese Methode wissenschaftlich geschultes Personal und ist nicht dazu in der Lage, hohe Probendurchsätze zu bewältigen. Ungünstigerweise bewirken zudem nicht alle P-Typ-ATPasen einen Nettotransport von elektrischer Ladung, zum Beispiel die H⁺/K⁺-ATPase, so dass ihr Transportzyklus elektroneutral ist und eine elektrische Aktivität nicht nachgewiesen werden kann.
• Das erfindungsgemäße Vorgehen und insbesondere der erfindungsgemäße Aktivitätstest gehen auf die Methode der zielgerichteten Fluoreszenzmarkierung zurück, die zum Beispiel an einem spannungsgesteuerten Kaliumkanal, Shaker H4 oder Shaker B aus Drosophila melanogaster, entwickelt wurde, der in der wissenschaftlichen Literatur als Paradigma für spannungsgesteuerte Kationenkanäle geführt wird. Ziel war es dabei, Konformationsänderungen zu verfolgen, die mit einer Bewegung des Spannungssensors des Kanals einhergehen. Dazu seien genannt:
• 1. Manuzzu, M. et al. (1996). Direct Physical Measure of Conformational Rearrangements Underlying Potassium Channel Gating. Science 271: 213–216
• 2. Cha, A. and F. Bezanilla (1997). Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K⁺-channel with Fluorescence. Neuron 19:1127–1140
• Der Spannungssensor spannungsgesteuerter Kationenkanäle besteht im Wesentlichen aus einem einzigen Transmembransegment „S4", das eine große Zahl, zum Beispiel 4–8, positiv geladener Aminosäurereste trägt. Bei der Aktivierung eines solchen Kanals durch einen Spannungspuls greift das elektrische Feld an diesen Ladungen an und verschiebt so das S4-Segment relativ zur Membran, so dass es zu einem kurzzeitigen Strom von elektrischer Ladung kommt („Schaltstrom", gating current), welcher der eigentlichen Öffnung der Kanalpore vorausgeht. Zum Nachweis der spannungsinduzierten Bewegung des S4-Segments bringt man in der extrazellulären Schleife der Polypeptidsequenz zwischen dem S3- und dem S4-Segment durch zielgerichtete Mutagenese Cystein-Reste ein, nachdem zuvor zunächst alle übrigen im nativen Protein nach außen orientierten Cysteine entfernt wurden, was für den Erfolg der Methode allerdings nicht notwendig ist. Diese Kanalkonstrukte werden sodann in Xenopus-Oozyten, also Eizellen des Krallenfroschs Xenopus laevis exprimiert. Mit Hilfe sulfhydrylspezifischer Reagenzien kann sodann ein Fluoreszenzfarbstoff an diese Cystein-Reste gekoppelt werden. Eine bekannte Substanz mit diesen Eigenschaften ist z.B. Tetramethylrhodamin-6-maleimid.
• Untersucht man nun die fluoreszenzmarkierten Oozyten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme, so kann man für einige der untersuchten Cystein-Mutanten eine deutliche Veränderung der Fluoreszenz infolge eines aktivierenden Spannungspulses messen. Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzsignale ist im Wesentlichen identisch mit dem Zeitverlauf der bei einem Spannungspuls verschobenen Schaltladung.
• Obwohl diese Methode im Prinzip zur Untersuchung beliebiger Membranproteine geeignet ist, beschränkt sich die Zahl der damit untersuchten Moleküle bislang auf 1.) spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, 2.) spannungsgesteuerte Natriumkanäle, 3.) Natrium-Glukose-Austauscher (SGLT1) und 4.) GABA-Transporter (GAT1). Dies hat mehrere Gründe.
• Die größte Schwierigkeit besteht darin, in der Primärsequenz eines Membranproteins eine Aminosäure zu finden, die sich hinsichtlich ihrer Lage im Proteinmolekül als Reporterposition eignet. Die zur Verfügung stehenden Informationen zur Eingrenzung einer solchen Posititon sind zum großen Teil sehr mangelhaft, in der Regel ist die Transmembrantopologie eines Membranproteins nur bruchstückhaft bekannt. Noch spärlicher sind Daten über die Beteiligung extrazellulärer Aminosäurereste an funktionellen Prozessen oder gar Konformationsänderungen. Falls hierzu keine Anhaltspunkte bestehen ist es zur Etablierung der Technik notwendig, quasi nach dem Zufallsprinzip eine Vielzahl von Cystein-Mutanten des betreffenden Proteins zu generieren, um nach irgendeinem Effekt zu suchen, der dann möglicherweise mit der zentralen Funktion des Proteins gar nichts zu tun hat.
• Im Fall der P-Typ-ATPasen ist die Ausgangslage wesentlich günstiger, weil die dreidimensionale Struktur eines Vertreters dieser Proteinfamilie, nämlich der Ca²⁺-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, SERCA, und eine Vielzahl Strukturfunktionsbeziehungen bekannt sind.
• Alle P-Typ-ATPasen weisen in funktionell bedeutsamen Regionen ein hohes Maß an Homologie auf, was dafür spricht, dass wesentliche Funktionselemente stark konserviert sind. Außer an den katalytischen Zentren, zum Beispiel der ATP-Bindungsstelle, der Phosphorylierungsstelle, der Ionenkoordinationsregion usw., sind die Übereinstimmungen im Bereich des sogenannten M5-Segments, also des fünften Transmembransegments der Ca²⁺-ATPase besonders ausgeprägt. Die Numerierung kann je nach Gesamtzahl der Transmembransegmente einer P-Typ ATPase variieren. Dieses spezifische Segment, also zum Beispiel das M5-Segment verbindet wie eine starre Achse die Region der ATP-Hydrolyse, wo die primäre Energie für den aktiven Transport zur Verfügung gestellt wird, mit der Region der Kationenbindungsstellen und ist vermutlich maßgeblich am Energietransduktionsprozess beteiligt, der den aktiven Ionentransport ermöglicht. Die Vermutung liegt nahe, dass das M5-Segment direkt an den Konformationsänderungen teilnimmt, die die freiwerdende Energie der ATP-Hydrolyse zum Transport der Ionen überträgt.
• Entsprechend werden erfindungsgemäß Cystein-Reste in die extrazellulär orientierte Schleife zwischen dem M5- und dem M6-Segment zum Beispiel der Na⁺/K⁺-ATPase als P-Typ-ATPase-Einheit ausgenutzt oder gar eingeführt. Nach der oben be schriebenen Methode werden die verschiedenen Konstrukte nach Ankopplung einer Fluoreszenzeinheit, zum Beispiel des Rhodamin-Farbstoffs via sulfhydrylspezifisches Reagenz, zum Beispiel mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme zum Beispiel an Xenopus laevis Oozyten verwendet.
• Insbesondere zeigt sich eine Aminosäure als besondere Reporterposition geeignet, alle übrigen Cystein-Substitutionen innerhalb der M5-M6-Schleife sind entweder nicht für eine Markierung zugänglich oder zeigen keine funktionell korrelierbaren Fluoreszenzsignale. Dies ist bei dem Organismus Schaf ovis aries in der α1-Untereinheit der Na⁺/K⁺-ATPase zum Beispiel die Position N790C.
• Unter bestimmten Ionenbedingungen zeigen Spannungssprungexperimente, dass das Protein ein hohes Maß an Flexibilität hat, was sich in Form charakteristischer Stromsignale zeigt. Die Fluoreszenzsignale entsprechen in ihrem Zeitverlauf exakt dem dieser typischen Stromsignale des Proteins.
• In Gegenwart eines spezifischen Inhibitors, im Fall der Na⁺/K⁺-ATPase zum Beispiel Ouabain, der die Aktivität und damit die charakteristischen Stromsignale absolut blockiert, sind auch keine auf eine Konformationsänderung hindeutenden Fluoreszenzsignale mehr messbar. Damit ergibt sich, dass die fluorophortragende Reportergruppe im Bereich der M5-M6-Schleife in der Lage ist, direkt die funktionelle Aktivität des Proteins anzuzeigen. Die Amplitude der Fluoreszenzänderungen erreicht 5-10 % der Hintergrundfluoreszenz, so dass eine einfache Photodiode zur Detektion des Signals ausreicht.
• Funktionsbedingte Konformationsänderungen der Na⁺/K⁺-ATPase lassen sich nicht nur durch Spannungssprungexperimente induzieren. Setzt man die in den Oozyten exprimierte Na⁺/K⁺-ATPase extrazellulären Lösungsbedingungen aus, die ihre Aktivität beeinflussen, zum Beispiel durch Zugabe bzw. Wegnahme von extrazellulärem Kalium, das als Substrat ja von außen nach innen transportiert wird, so lassen sich auch absolute Fluoreszenzänderungen hervorrufen, die in Gegenwart eines Inhibitors nicht mehr auftreten.
• Durch dieses erfindungsgemäße Vorgehen wird der Aktivitätstest wesentlich vereinfacht. Man muss die Zellen, einzelne im Fall von Xenopus-Oozyten oder einen Zellrasen bei transfizierten Kulturzellen, unter Messung der Fluoreszenz lediglich mit verschiedenen Puffermedien umspülen, welche die funktionellen Parameter des Proteins verändern. Eine sich ändernde Fluoreszenzintensität zeigt dann die Funktionalität des Proteins an, was man dann durch Zugabe einer Blockersubstanz nachprüfen kann.
• Die hohe Spezifität der identifizierten Aminosäureposition, die zur Einfügung eines funktionell relevanten Fluoreszenzlabels geeignet ist, wird erfindungsgemäß auch durch Einfügung eines Cysteins in die entsprechende homologe Position bei der H⁺/K⁺-ATPase erreicht. Obwohl die H⁺/K⁺-ATPase keinen Nettotransport von Ladung vermittelt, elektrische Ströme zum Aktivitätstest also nicht gemessen werden können, reagiert die erzeugte Cystein-Mutante der H⁺/K⁺-ATPase in derselben Weise auf Änderungen der Membranspannung, wie bei der Na⁺/K⁺-ATPase. Auch in diesem Fall sind die Fluoreszenzsignale durch spezifische Inhibitoren der H⁺/K⁺-ATPase, zum Beispiel Omeprazol, absolut blockierbar.
• Es ist ein Kernaspekt der Erfindung, die identifizierte Aminosäureposition oder unmittelbar benachbarte davon durch die hohe Homologie aller P-Typ-ATPasen in dieser Region universell als Reporterposition einzusetzen und damit einen universellen Aktivitätstest für P-Typ-ATPasen, demonstriert durch die Wirkung hochspezifischer Inhibitoren, zu schaffen.
• Der Funktionstest kann mit einer Vielzahl gebräuchlicher Expressionszellinien oder Präparationsverfahren durchgeführt werden. Notwendig ist nur eine fluorimetrische Einheit, in die die Zellen – einzeln im Fall von Xenopus Oozyten, Kulturschalen oder Objektträger im Falle von kleinen, anhaftenden Kulturzellen, wie HEK 293, COS oder CHO – eingebracht werden können und die Möglichkeit einen Austausch des Mediums in der Meßkammer vorzunehmen.
• Prinzipiell sind auch Zellen geeignet, die nur in Suspension kultiviert werden können, ohne an Gefäßwänden anzuhaften, zum Beispiel E. coli, Hefezellen oder Insektenzellen, wie Sf9. Hierfür bietet sich zum Beispiel eine fluorimetrische Technik an, die auf einem sog. stopped-flow-Verfahren beruht. Dabei wird eine Zellsuspension unter fluorimetrischer Beobachtung mit einer Lösung gemischt, die einen bestimmten, für die Funktion des exprimierten Proteins wichtigen Effektor enthält, zum Beispiel Kalium im Fall der Na⁺/K⁺-ATPase. In Gegenwart eines Inhibitors sollte die ansonsten unter identischen Bedingungen beobachtete Fluoreszenzänderung unterbleiben.
• Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens liegen zum einen in der einfachen Durchführung und Handhabbarkeit, weil zeitlich und technisch aufwändige proteinbiochemische Reinigungsverfahren zur Gewinnung des Enzyms aus nativem Gewebe entfallen, der Test selbst sehr sensitiv ist. (10 % Fluoreszenzänderung ist ein robustes Signal) und keine radioaktiven oder ansonsten für den Benutzer schädlichen Substanzen verwendet werden müssen, wie es z.B. bei Phosphorylierungsstudien erforderlich ist (dort arbeitet man mit radioaktiv markiertem Phosphor).
• Der andere große Vorteil besteht darin, dass die Enzymmoleküle in einer natürlichen Membranumgebung unter physiologischen Bedingungen untersucht werden und somit die größtmögliche Nähe zu natürlichen Bedingungen gewährleistet ist. Auch entfällt die Notwendigkeit für technisch aufwändige und zeitintensive elektrophysiologische Messverfahren, die zudem nur an ausgewählten Mitgliedern dieser Proteinklasse, die einen Nettotransport von Ladung bewerkstelligen, möglich ist (z.B. Na⁺/K⁺-ATPase: ja, H⁺/K⁺-ATPase: nein).
• Die erfinderische Relevanz des vorgestellten Verfahrens besteht zum einen in der Etablierung der Fluoreszenz basierten Untersuchungsmethode für diese Proteinklasse, die in hohem Maße universell anwendbar ist. Zum zweiten ergibt sie sich aus der Identifikation der funktionell bedeutsamen Aminosäureposition bzw. -region, die für ein spezifisches Ankoppeln einer fluoreszenten Reportergruppe geeignet ist, welche an einem integralen Funktionsschritt des enzymatischen Reaktionsmechanismus teilnimmt.
• Zum Beispiel wird die Na⁺/K⁺-ATPase mit einem Reportercystein in der extrazellulären Schleife zwischen den Transmembransegmenten M5 und M6 in Xenopus laevis Oozyten exprimiert, mit Tetramethylrhodamin-6-Maleimid spezifisch markiert und mit Hilfe der 2-Elektroden-Spannungsklemme die Aktivität (Pumpströme) gemessen. In Abwesenheit von Kalium kann man durch Spannungssprünge kurzzeitige Stromsignale hervorrufen, von denen bekannt ist, dass sie durch eine Neueinstellung des Konformationsgleichgewichts des phosphorylierten Enzyms hinsichtlich der Orientierung der Ionenbindungsstellen nach außen oder zum Innern der Zelle hervorgerufen werden. In diesem sogenannten Na⁺/Na⁺-Austauschmodus besitzt das Enzym eine hohe Flexibilität und kann mit einem Spannungspuls zwischen zwei Konformationszuständen hin- und hergeschaltet werden. Die simultan aufgezeichneten Fluoreszenzsignale entsprechen in ihrem zeitlichen Verlauf den beobachteten Stromsignalen, woraus wir schließen, dass damit direkt die Konformationsänderung angezeigt wird.
• Nachfolgend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen aufgrund der beigefügten schematischen Zeichnungen näher erläutert.
• 1 zeigt in schematischer Seitenansicht einen Messaufbau, wie er bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann.
• 2A–C zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht Primärträger mit darin inkorporierten erfindungsgemäßen molekularen Sensorkomplexen.
• 3 zeigt in Form von Graphen den Transportstrom bzw. die Fluoreszenzänderung als Funktion der Zeit bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 4 zeigt in Form von Graphen den Transportstrom sowie die Fluoreszenzänderung als Funktion der Zeit bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 5A–C zeigen in Form von Graphen die Fluoreszenzänderung als Funktion der Zeit bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
• 1 zeigt in einer schematischen Seitenansicht einen Messaufbau, wie er bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann.
• In einem Messbereich 40 ist die zu vermessende Primärträgersuspension 100 vorgesehen. Diese besteht aus Vesikeln 10 als Primärträger 10, welche in einem im Wesentlichen wässrigen Messmedium 30 suspendiert sind.
• In dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel wird davon ausgegangen, dass in den Vesikeln 10 als Primärträger 10 ein erfindungsgemäßer molekularer Sensorkomplex 11 oder eine Mehrzahl davon vorgesehen ist. Das heißt, dass in der Membran 10c der Vesikel 10 jeweils P-Typ-ATPasen-Einheiten 12 mit daran gebundenen Fluoreszenzeinheiten 13 vorgesehen sind.
• Zur Aktivierung des vorgesehenen Fluoreszenzfarbstoffes 13 ist eine Lichtquelle 53 vorgesehen, über welche Anregungslicht 52 mit einer Anregungswellenlänge λ_exc in die Primärträgersuspension 100 im Messbereich 40 eingestrahlt wird. Unter der Anregung mit dem Anregungslicht 52 senden die mit dem Fluoreszenzfarbstoff über die P-Typ-ATPasen-Einheiten verbun denen Primärträger 10 Fluoreszenzlicht oder Beobachtungslicht 54 der Beobachtungswellenlänge λ_obs aus, welches über einen entsprechenden Detektor 55 gemessen und auf eine Anzeige 56 in Form entsprechender Spuren oder Kurven 57 und 58 dargestellt werden kann.
• Die Spur 57 deutet zum Beispiel ein Fluoreszenzänderungssignal an, welches von der Proteinaktivität der P-Typ-ATPasen-Einheiten erzeugt wird. Die Spur 58 zeigt ein im Vergleich zur Spur 57 reduziertes Fluoreszenzänderungsniveau, welches durch Zugabe eines Wirkstoffes, zum Beispiel eines Inhibitors, welcher die Aktivität der P-Typ-ATPasen-Einheiten reduziert, erreicht wird.
• Die 2A bis 2C zeigen in geschnittener Seitenansicht, wie die erfindungsgemäßen molekularen Sensorkomplexe 11 in einem Primärträger 10 in Form eines Vesikels, Liposoms oder Oozyten eingebracht sind.
• Das Vesikel 10 weist eine Membran 10c, zum Beispiel in Form einer Lipiddoppelschicht, auf. Die Membran besitzt eine intravesikuläre Seite 10b und extravesikuläre Seite 10a. Das Vesikel 10 ist ein über die Membran 10c in sich geschlossenes Gebilde, welches in seinem Inneren ein Innenmedium 15 besitzt, vorzugsweise in wässriger Form. In die Membran 10c des Vesikels 10 ist die Membran durchspannend ein ATPase-Molekül 12 als P-Typ-ATPasen-Einheit 12 membrandurchspannend eingebracht.
• Bei der Ausführungsform der 2A bis 2C weist die P-Typ-ATPasen-Einheit 12 acht Transmembransegmente oder membrandurchspannende Helizes M1 bis M8 auf, welche miteinander über sogenannten Schleifen oder Loops verbunden sind. Im Übergang zwischen dem fünften Transmembransegment M5 und dem sechsten Transmembransegment M6 ist in der diese Membranseg mente verbindenden Schleife kovalent eine Fluoreszenzeinheit 13 in Form eines Fluoreszenzfarbstoffes angekoppelt. Die Kombination der P-Typ-ATPasen-Einheit 12 mit der Fluoreszenzeinheit 13 ergibt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen molekularen Sensorkomplexes 11.
• Gemäß 2B wird nun im erfindungsgemäßen Verfahren zur pharmakologischen Wirkstoff- und/oder Wirkorttestung zur Aktivierung der Fluoreszenzeinheit 13 von extern Anregungslicht 52 mit der Anregungswellenlänge λ_exc eingestrahlt. In Folge sendet die Fluoreszenzeinheit 13 in Abhängigkeit vom Aktivitätszustand des molekularen Sensorkomplexes 11 und insbesondere vom Aktivitätszustand der P-Typ-ATPasen-Einheit 12 Fluoreszenzlicht oder Beobachtungslicht 54 mit einer Wellenlänge λ_obs mit unterschiedlicher Intensität aus.
• Gemäß 2C kann nun ein Wirkstoff I, zum Beispiel ein Inhibitor I, in das das Vesikel 10 umgebende Messmedium 30 eingebracht und so an die P-Typ-ATPasen-Einheit 12 angekoppelt werden. Dies ist hier durch eine kovalente Bindung des Inhibitormoleküls I in der Schleife oder dem Loop zwischen dem siebten und dem achten Transmembransegment M7 bzw. M8 angedeutet. Aufgrund des Einflusses des Wirkstoffes I oder des Inhibitors I ist die Aktion, das heißt die Aktivität und insbesondere die Konformationsänderung, der P-Typ-ATPasen-Einheit 12 vermindert oder blockiert. Entsprechend erfolgt beim Einstrahlen des Anregungslichtes 52 auch nach Zuführen einer aktivierenden Substanz keine Aktion durch den molekularen Sensorkomplex 11 bzw. durch die P-Typ-ATPasen-Einheit 12, so dass auch keine Fluoreszenzänderung im Beobachtungslicht 54 messbar ist. Bei der Ausführungsform der 2C wird davon ausgegangen, dass durch die Blockade der Proteinaktivität im Hinblick auf die P-Typ-ATPasen-Einheit 12 gar keine Fluoreszenz messbar ist.
• Die 3 zeigt zwei Graphen, welche den Transportstrom, welcher durch induzierten Ionentransport über die Membran 10c des Vesikels 10 aus den 2A bis 2C erzeugt wird, als Funktion der Zeit in der unteren Spur S1 bzw. die zeitliche Abhängigkeit der mit der Proteinaktivität korrespondierenden Fluoreszenzänderung in der Spur S2 veranschaulichen.
• Zu einem ersten Zeitpunkt t1 wird in das die Vesikel 10 umgebende Messmedium 30 Kalium K⁺ in das vorher kaliumfreie Messmedium 30 hinzugegeben. Infolgedessen wird die P-Typ ATPasen-Einheit 12 des molekularen Sensorkomplexes 11, welche hier durch eine Na⁺/K⁺-ATPase gebildet wird, aktiviert. Die Aktivität der P-Typ-ATPasen-Einheit 12 schlägt sich in der Spur S1 als messbarer positiver Transportstrom nieder. In der Spur S2 ist simultan eine Fluoreszenzänderung messbar.
• Zum Zeitpunkt t2 wird in das kaliumfreie Messmedium 30 zurückgeschaltet, und infolgedessen sinken sowohl der Transportstrom gemäß Spur S1 als auch die Fluoreszenzänderung gemäß S2.
• Zum Zeitpunkt t3 wird dieses Experiment durch erneute Kaliumzufuhr wiederholt. Dann wird jedoch zu einem nachfolgenden Zeitpunkt t4 unter weiterer Kaliumgabe als zusätzlicher Wirkstoff Ouabain zugeführt. Ouabain ist als für die Na⁺/K⁺-ATPase spezifischer Inhibitor bekannt. Dies wird dadurch deutlich, dass mit dem Zeitpunkt t4 der Zugabe von Ouabain die Aktivität der P-Typ-ATPasen-Einheit 12 absinkt, was durch einen sinkenden Transportstrom gemäß Spur S1 erkennbar ist. Simultan sinkt auch die Fluoreszenzänderung ab, die aber in diesem Fall keine Potenzialabhängigkeit repräsentiert, son dern über die kovalente Ankopplung der Fluoreszenzeinheit bzw. des Fluoreszenzfarbstoffes direkt an die Na⁺/K⁺-ATPase unmittelbar die verminderte Aktivität zeigt.
• Die Na⁺/K⁺-ATPase mit einem Reportercystein in der extrazellulären Schleife zwischen den Transmembransegmenten M5 und M6 wurde in Xenopus laevis Oozyten exprimiert, mit Tetramethylrhodamin-6-Maleimid spezifisch markiert und mit Hilfe der 2-Elektroden-Spannungsklemme die Aktivität (Pumpströme) gemessen. Führt man einen Lösungswechsel zwischen einer kaliumfreien und kaliumhaltigen Pufferlösung durch, so zeigt sich die Aktivität des Proteins in Form eines spezifischen Pumpstroms. Dieser Pumpstrom ist durch Zugabe des spezifischen Inhibitors Ouabain absolut blockierbar (untere Messkurve). Die obere Messkurve gibt die Intensität des gleichzeitig aufgezeichneten Fluoreszenzsignals in ihrem zeitlichen Verlauf wieder. Die Fluoreszenz erhöht sich durch Zugabe von Kalium und geht bei gleichzeitiger Gabe von Kalium und Ouabain auf ihr Ausgangsniveau zurück.
• Neben der Aktivierung der P-Typ-ATPasen-Einheit 12 durch Änderungen in der Zusammensetzung des Messmediums 30 und/oder des Innenmediums 15 kann eine derartige Aktivierung oder Deaktivierung auch durch das Anlegen eines Transmembran-Potenzials, also durch das Anlegen einer elektrischen Spannung über die Membran 10c erreicht werden.
• Die 4 zeigt Messergebnisse zu derartigen Spannungssprung-Experimenten mittels einer 2-Elektroden-Spannungsklemmentechnik. Bei diesen Messungen wurden Spannungssprünge durchgeführt jeweils beginnend bei einer Spannung 0V auf Spannungsendwerte von –160mV, –60mV und +60mV. Im unteren Graphen der 4, d.h. mittels der Spuren S3, S4, S5 sind die entsprechenden aus den Spannungssprüngen resultierenden Fluoreszenzänderungen als Funktion der Zeit dargestellt. Entsprechendes gilt für die Änderungen im Transportstrom gemäß den Spuren S6, S7, S8 im oberen Graphen der 4.
• Auch hier wurde wieder eine Na⁺/K⁺-ATPase als P-Typ-ATPasen-Einheit 12 für den molekularen Sensorkomplex 11 vorgesehen.
• Die Na⁺/K⁺-ATPase mit einem Reportercystein in der extrazellulären Schleife zwischen den Transmembransegmenten M5 und M6 wurde in Xenopus laevis Oozyten exprimiert, mit Tetramethylrhodamin-6-Maleimid spezifisch markiert und mit Hilfe der 2-Elektroden-Spannungsklemme die Aktivität (Pumpströme) gemessen. In Abwesenheit von Kalium kann man durch Spannungssprünge kurzzeitige Stromsignale hervorrufen (oberer Teil der Abbildung), von denen bekannt ist, dass sie durch eine Neueinstellung des Konformationsgleichgewichts des phosphorylierten Enzyms hinsichtlich der Orientierung der Ionenbindungsstellen nach außen oder zum Innern der Zelle hervorgerufen werden. In diesem sogenannten Na⁺/Na⁺-Austauschmodus besitzt das Enzym eine hohe Flexibilität und kann mit einem Spannungspuls zwischen zwei Konformationszuständen hin- und hergeschaltet werden. Die simultan aufgezeichneten Fluoreszenzsignale entsprechen in ihrem zeitlichen Verlauf den beobachteten Stromsignalen, woraus geschlossen werden kann, dass damit direkt die Konformationsänderung angezeigt wird.
• Zur weiteren Erläuterung der in der 4 dargestellten Vorgehensweise wird auf die 5A bis 5C verwiesen.
• 5C zeigt bei Spannungsexperimenten verwendbares Spannungsprotokoll, wobei ausgehend von einem Normalspannungsniveau von –80mV für 200ms Spannungssprünge in rechteckpulsform zwischen –160mV und +60mV an die Vesikel 10 oder Oozyten 10 mit darin ausgebildeten molekularen Sensorkomplexen 11 unter Verwendung einer Na⁺/K⁺-ATPase als P-Typ-ATPasen-Einheit 12 vorgesehen sind.
• Die 5A und 5B zeigen die aus den Spannungssprungexperimenten der 5C resultierenden Fluoreszenzänderungen in Abwesenheit von Ouabain, also unter normaler Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase bzw. unter Anwesenheit von Ouabain, also unter Wirkung des spezifischen Inhibitors. Als Ergebnis ergibt sich, dass die Verwendung von Ouabain das Fluoreszenzänderungssignal vollständig inhibiert, was auf die Inhibition der Proteinaktivität in direkter Weise hindeutet.
• Durch die 5A und 5B wird verdeutlicht, dass das in 2 beschriebene spannungssprunginduzierte Fluoreszenzsignal durch Zugabe eines spezifischen Inhibitors, zum Beispiel Ouabain, absolut blockiert werden kann. Der Inhibitor blockiert das Enzym in einem bestimmten Konformationszustand; durch Spannungssprünge ist das Molekül nicht mehr in einen anderen Konformationszustand überführbar. Damit wird der Wirkmechanismus des Inhibitors direkt anschaulich.
• Entsprechend können unter Bezugnahme auf normale Proteinaktivitäten mit entsprechenden normalen Fluoreszenzänderungssignalen bei Aktivierung die Wirkungen verschiedenster Wirkstof fe getestet werden, z.B. im Rahmen eines Screening-Verfahrens.

Claims (9)

1. Molekularer Sensorkomplex, welcher zur Fluoreszenz anregbar ist, mit: – mindestens einer Membranproteineinheit (12) und – mindestens einer an die Membranproteineinheit (12) gebundenen Fluoreszenzeinheit (13), – wobei die Membranproteineinheit (13) mindestens eine Na⁺/K⁺-ATPase als eine P-Typ-ATPasen-Einheit (12) aufweist oder von einer solchen gebildet wird, – wobei die Fluoreszenzeinheit (13) jeweils an eine durch Funktionen und/oder Konformationsänderungen der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) beeinflussbare Reporterposition der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) gebunden ist, – wobei die Fluoreszenzeinheit (13) in der Nähe einer Kationenbindungsstelle gebunden ist, – wobei die Reporterposition über zielgerichtete Mutagenese der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) ausgebildet ist und – wobei bei der zielgerichteten Mutagenese der Fest N790C in der α1-Untereinheit der Na⁺/K⁺-ATPase verwendet wird.
2. Molekularer Sensorkomplex nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzeinheit (13) im Bereich des Übergangsbereichs zwischen aufeinanderfolgenden Transmembransegmenten, insbesondere zwischen dem fünften Transmembransegment M5 und dem sechsten Transmembransegment M6 gebunden ist, insbesondere in der M5-M6-Schleife.
3. Molekularer Sensorkomplex, welcher zur Fluoreszenz anregbar ist, mit: – mindestens einer Membranproteineinheit (12) und – mindestens einer an die Membranproteineinheit (12) gebundenen Fluoreszenzeinheit (13), – wobei die Membranproteineinheit (13) mindestens eine P-Typ-ATPasen-Einheit (12) aufweist oder von einer solchen gebildet wird, – wobei die Fluoreszenzeinheit (13) jeweils an eine durch Funktionen und/oder Konformationsänderungen der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) beeinflussbare Reporterposition der P-Typ-ATPasen-Einheit (12) gebunden ist und – wobei die Fluoreszenzeinheit (13) im Bereich des Übergangsbereichs zwischen aufeinanderfolgenden Transmembransegmenten zwischen dem fünften Transmembransegment M5 und dem sechsten Transmembransegment M6 oder in der M5-M6-Schleife gebunden ist.
4. Molekularer Sensorkomplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzeinheit (13) kovalent gebunden ist.
5. Molekularer Sensorkomplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzeinheit (13) an oder über eine Cysteingruppe oder eine Mehrzahl davon gebunden ist.
6. Molekularer Sensorkomplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzeinheit (13) ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül ist, insbesondere ein Rhodaminfarbstoffmolekül.
7. Messsondenanordnung zur pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung mittels Fluoreszenz, – bei welcher eine Primärträgersuspension (100) oder eine Primärträgeremulsion in einem fluiden Messmedium (30) vorhanden ist, – bei welcher die Primärträger (10) eine Membran (10c) aufweisen und insbesondere mittels dieser mit einem Innenmedi um (15) gegenüber dem Messmedium (30) abgeschlossen ausgebildet sind und – bei welcher in der Membran (10c) der Primärträger (10) molekulare Sensorkomplexe (11) nach einem der Ansprüche 1 bis 6 vorhanden sind.
8. Messsondenanordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Primärträger (10) als Vesikel, Liposomen, Zellen, Oozyten, Organellen oder Membranfragmente ausgebildet sind.
9. Verfahren zur pharmakologischen Wirkstoff- und/oder Wirkorttestung, mittels Fluoreszenzmessung, bei welchem eine Messsondenanordnung nach einem der Ansprüche 7 oder 8 verwendet wird.