DE102015115640B4

DE102015115640B4 - Verfahren zum Nachweis von Liganden vermittels Biosensoren

Info

Publication number: DE102015115640B4
Application number: DE102015115640.7A
Authority: DE
Inventors: Dagmar Wachten; U. Benjamin Kaupp; Reinhard Seifert; Vera Jansen; Shatanik Mukherjee
Original assignee: Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2017-06-29
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: DE102015115640A1; WO2017045970A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis von Liganden (10) vermittels Biosensoren (6), die auf dem Förster Resonanz Energie Transfer Prinzip basieren, wobei ein Biosensor (6) ein Protein ist, das drei Abschnitte umfasst, wobei der erste Abschnitt die Funktion eines Donors (7) hat, wobei der zweite Abschnitt die Funktion eines Akzeptors (8) hat und wobei der dritte Abschnitt den ersten Abschnitt und den zweiten Abschnitt verbindet, wobei der dritte Abschnitt einen Bereich zur Wechselwirkung mit dem nachzuweisenden Liganden (10) aufweist und wobei die Wechselwirkungsreaktion eine Änderung der geometrischen Struktur des dritten Abschnitts bewirkt, wobei der dritte Abschnitt ein zur Bindung von zyklischen Nukleotiden geeignetes Protein (1) prokaryotischer Natur ist, dadurch gekennzeichnet, dass das den dritten Abschnitt bildende Protein (1) die Bindestelle mICNBD des bakteriellen Ionen-Kanals mICNG ist.

Description

Verfahren zum Nachweis von Liganden vermittels Biosensoren, die auf dem Förster Resonanz Energie Transfer Prinzip basieren, wobei ein Biosensor ein Protein ist, das drei Abschnitte umfasst, wobei ein erster Abschnitt die Funktion eines Donors aufweist, wobei ein zweiter Abschnitt die Funktion eines Akzeptors aufweist und wobei ein dritter Abschnitt den ersten Abschnitt und den zweiten Abschnitt verbindet, wobei der dritte Abschnitt einen Bereich zur Wechselwirkung mit dem nachzuweisenden Liganden aufweist und wobei die Wechselwirkungsreaktion eine Änderung der geometrischen Struktur des dritten Abschnitts des Proteins bewirkt.
Verfahren zum Nachweis von Liganden, die sich der Nutzung biologischer Moleküle bedienen, die als Biosensoren fungieren und die den Nachweis auf der Basis einer Fluoreszenzreaktion bewirken, sind bekannt. Dabei sind Biosensoren allgemein als integrierte Messsysteme definiert, bei denen der zu untersuchende Ligand mit einer auf diesen ausgerichteten Erkennungsstruktur biologischer Natur in Wechselwirkung gebracht wird und bei denen die spezifische Interaktion der Wechselwirkungspartner vermittels chemischer oder physikalischer Transducer in ein messtechnisch zugängliches Signal gewandelt wird.
Die DE 601 25 145 T2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung und zur Anwendung solch makromolekularerer Biosensoren. Der Nachweis des Liganden wird dort vermittels einer Immunfluoreszenzreaktion, mithin eines Licht-basierten Signals erbracht. Ferner sind Verfahren bekannt, bei denen die Biosensoren respektive die Fluoreszenzreaktion speziell auf dem Prinzip der Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) aufbauen. Dabei bewirkt die den Liganden erkennende Reaktion einen Energietransfer zwischen zwei Flurophoren – dem Donor-Akzeptor-Paar – der dann vermittels eines Fluoreszenzsignals nachgewiesen wird.
In Zaccolo et al., IUBMB Life, 49, 5, 375, (2000) erfolgt auf dieser Basis der Nachweis des zyklischen Nukleotids cyclic adenosine-monophosphate (cAMP). cAMP ist eine im Rahmen der zielgerichteten Ausbreitung informationstragender Signale innerhalb einer biologischen Zelle („cell signaling”) wesentliche Substanz. Insbesondere betrifft dies die Wechselwirkung der Zelle mit ihrer Umgebung. In Nikolaev et al., J. Biol. Chem., 279, 36, 37215 (2004) wird der Nachweis von cAMP ebenfalls vermittels FRET-basierter Biosensoren erzielt. Als Donor-Akzeptor-Paar des FRET-Verfahrens werden dort die Substanzen cyan fluoreszierendes Protein (CFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) genutzt. Die den Biosensor vervollständigende Donor und Akzeptor verbindende Struktur ist eine gegenüber cAMP spezifisch bindende Proteindomäne, die als cyclic nucleotide-binding domain (CNBD) bezeichnet ist und welche die Bindungsstelle für zyklische Nukleotide der Proteine Epac1 und Epac2 („exchange protein directly activated by cAMP”) darstellt. Durch die vermittels der spezifischen Bindung des Liganden an CNBD bewirkte Konformationsänderung, also die Änderung des Faltungszustandes des Proteins, kommt es dort zu einer Verkürzung der räumlichen Distanz zwischen Donor und Akzeptor, wodurch die gewünschte Austauschreaktion zwischen CFP und YFP initiiert wird. Das aus dem Austausch resultierende und das Bindungsereignis anzeigende Lichtsignal wird schließlich vermittels optischer Methoden nachgewiesen und anschließend ausgewertet.
Verfahren, die für den Nachweis von zyklischem Adenosinmonophospaht (cAMP) auf dem FRET-Prinzip aufbauende Biosensoren nutzen, beruhen häufig auf der Verwendung des Enzyms Protein Kinase A (PKA). Dabei bildet das Enzym die gegenüber cAMP sensitive Einheit. Für das FRET-Verfahren werden die katalytischen und regulatorischen Untereinheiten der PKA genutzt, an welche das Donor-Akzeptor-Paar gekoppelt wird. Zwar weist der Ansatz eine hohe Spezifität gegenüber cAMP auf, er erfordert aber auch ein Gleichgewicht in der Expression beider Untereinheiten, was insbesondere in lebenden Zellen schwer zu realisieren ist. Zudem kommt es aufgrund der katalytisch aktiven Untereinheiten des PKA zu störenden Veränderungen in der intrazellularen Signalübermittlung.
Verfahren, die für den Nachweis von cAMP Biosensoren einsetzen, welche die Bindungsstelle für zyklische Nukleotide der Faktoren Epac1 oder Epac2 nutzen, überwinden die Erfordernis stöchiometrischer Expressionsraten. Sie zeichnen sich zudem durch eine hohe Spezifität aus und beeinträchtigen auch nicht das cell signaling durch störende katalytische Aktivitäten. Allerdings weisen solche Biosensoren eine nur geringe Affinität gegenüber dem nachzuweisenden Liganden auf. Dies ist der verwendeten CNBD geschuldet und folglich der Substanz inhärent. Typische Werte für die solche geringe Affinitäten quantifizierenden Dissoziationskonstanten, liegen im mikromolaren Bereich. Damit ist die Sensitivität dieser Art von Biosensoren entsprechend eingeschränkt. Die Tatsache, dass FRET-basierte Biosensoren, die dem Nachweis und der Analyse von cAMP zugedacht sind, in der Regel eukaryotische Bindestellen nutzen, führt zudem zu einer deutlichen Erschwernis bei der Extraktion und Reinigung der Biosensoren bei Expression in einem bakteriellen System.
Aus der US 2008/0213811 A1 sind Biosensoren mit Liganden bindenden Molekülen mit Donor-Akzeptoren-Paare bekannt, bei denen sich die Liganden mittels FRED nachweisen lassen.
Aus der WO 2006/054167 A2 sind Biosensoren mit drei Abschnitten bekannt, wobei der erste Abschnitt ein Epac Polypeptid mit einer cAMP Bindestelle, der zweite Abschnitt ein erstes fluoreszierendes Polypeptid und der dritte Abschnitt ein zweites fluoreszierendes Polypeptid aufweist, wobei die Bildung eines cAMP einen FRET Übergang zwischen den fluoreszierenden Polypeptiden auslöst.
Aus dem DE 60 2004 013 361 T2 ist ein Verfahren zur in-vitro Bestimmung von cAMP in einer Probe bekannt, bei dem der Probe ein chimäres Pepid hinzugefügt wird und die cAMP-Konzentration in der Probe durch Messen des FRET und durch Vergleichen der Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve, die mit definierten Konzentrationen von cAMP erhalten wurde, bestimmt wird.
Aufgabe der Erfindung ist nun eine Weiterbildung des Verfahrens zum Nachweis von Liganden, insbesondere von cAMP, vermittels molekularer Biosensoren, mit der die Nachteile des vorstehenden Standes der Technik überwunden werden.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen genannt.
Anspruchsgemäß ist der dritte Abschnitt des Biosensors ein Protein, das zur Bindung von zyklischen Nukleotiden geeignet und prokaryotischer Natur ist. Der Kern der Erfindung liegt darin, dass für die spezifische Wechselwirkung mit dem Liganden ein Protein genutzt wird, das eine besonders hohe Affinität gegenüber dem zyklischen Nukleotid Adenosinmonophospaht cAMP aufweist. Erfindungsgemäß ist dies die Bindestelle für zyklische Nukleotide mICNBD des bakteriellen Ionenkanals mICNG. Die Affinität dieses Proteins ist durch Werte für die korrespondierende Dissoziationskonstante gekennzeichnet, die im nanomolaren Bereich, insbesondere im Bereich von 70 bis 110 nM, liegen
Das Verfahren erzielt insbesondere wegen der Verwendung des Proteins mICNBD eine besonders hohe Sensitivität gegenüber cAMP. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Konzentrationswerte von cAMP in Lösung mit einer Genauigkeit bestimmt werden, wie dies mit bislang bekannten FRET-basierten Verfahren nicht möglich war. Ein großer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorgehensweise ist, dass es die Analyse von cAMP-Dynamiken in lebenden Zellen ermöglicht. Das Verfahren leistet dies mit einer zeitlichen und räumlichen Auflösung, die bislang unerreicht ist. Mit dem Verfahren, lassen sich überdies Biosensoren erzeugen, die gut in bakteriellen Expressionssystemen herstellbar sind. Schließlich stellen Zelllinien, welche dem erfindungsgemäßen Verfahren zu Grunde liegende Biosensoren umfassen, auch in Aussicht, neue, auf cAMP-abhängige Signalwege einflussnehmende Wirkstoffe, im Hochdurchsatzverfahren zu screenen.
Der besondere Vorteil liegt somit darin, dass genetisch codierte, FRET-basierte Biosensoren erzeugt werden können, die für die Bestimmung von cAMP-Konzentration sowohl in Lösung als auch in lebenden Zellen nutzbar sind. Das Verfahren überwindet das Erfordernis stöchiometrischer Expressionsraten ebenso, wie das Auftreten unerwünschter Wechselwirkungen der Biosensoren mit der intrazellularen Umgebung. Die erfindungsgemäßen Biosensoren sind leicht zu reinigen und weisen eine hohe Spezifität sowie Sensitivität gegenüber dem Liganden auf.
In einer vorteilhaften Ausführungsvariante des Verfahrens wird das FRET-Paar je eines erfindungsgemäßen Biosensors durch zwei Fluorophore gebildet, die vorzugsweise die Substanzen Cerulean und Citrin sind. Dabei wirkt Cerulean als Donor und Citrin als Akzeptor. Ähnlich dem Licht des gelb fluoreszierenden Proteins YFP, emittiert Citrin Licht, das dem gelb-grünen Spektralbereich entstammt, während Cerulean Licht emittiert, das vergleichbar dem des cyan fluoreszierenden Proteins CFP dem blau-grünen Spektralbereich entstammt.
In einer weiteren Variante dient das Verfahren dem Nachweis von zyklischem Adenosinmonophosphat cAMP und/oder cAMP umfassenden Liganden. Dabei erfolgt der Nachweis je eines Liganden vorzugsweise durch eine Bindung zwischen dem betreffenden Liganden und der Bindestelle für zyklische Nukleotide CNBD des bakteriellen Ionenkanals mICNG. Vorzugsweise erfolgt dabei die Bindung als spezifische Bindung.
In einer Ausführungsvariante führt die Wechselwirkung von je einem Liganden und je einem Biosensor zu einer Änderung der geometrischen Struktur der Bindestelle für zyklische Nukleotide CNBD des betreffenden Biosensors. Vorzugsweise führt die Wechselwirkung zu einer Konformationsänderung, also einer Änderung des Faltungszustandes des Proteins CNBD. Der Faltungszustand des betreffenden Proteins CNBD ändert sich dabei dergestalt, dass in Folge der Bindung des betreffenden Liganden an die Bindestelle Donor und Akzeptor des betreffenden Biosensors eine Änderung ihrer räumlichen Distanz zueinander erfahren, insbesondere eine Zunahme ihrer Distanz.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsvariante sind die Biosensoren, umfassend die Bindungsstellen für die Liganden, die Donoren und die Akzeptoren, genetisch codiert, wobei vermittels der genetischen Codierung die Biosensoren als Fusionsproteine vermittels lebender Zellen exprimiert werden.
Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens sieht vor, dass die erfindungsgemäßen Biosensoren von einem bakteriellen Zellsystem exprimiert werden, insbesondere von E.coli-Bakterien. Dabei weisen die Biosensoren für die Extraktion aus dem Zellsystem, insbesondere für die Reinigung, molekulare Hilfsstrukturen, sogenannte Tags, vorzugsweise Histidin-Tags, auf. Vorteilhafterweise ist je ein Biosensor mit je einem Histidin-Tag versehen, wobei der betreffende Histidin-Tag an dem Donor des betreffenden Biosensors, insbesondere am Ende des Proteins Cerulean, angebracht ist. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise vermittels des sogenannten cobalt-basierten immobilized-metal affinity chromatography Verfahrens, IMAC. Die auf solche Weise gewonnenen Biosensoren werden vorzugsweise für den Nachweis und die Analyse von cAMP in Lösung angewandt.
Schließlich werden in einer besonders vorteilhaften Ausführungsvariante die erfindungsgemäßen Biosensoren von den zu untersuchenden Zellen selbst exprimiert, insbesondere von eukaryotischen Zellen. Dabei ist vermittels solchermaßen erzeugter Biosensoren der Nachweis, die Lokalisation und die Analyse der Dynamik von Liganden, insbesondere von cAMP, innerhalb lebender Zellen durchführbar.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der 1–6 näher erläutert. Hierin zeigen:
1 Die Bindestelle mICNBD für zyklischen Nukleotide des bakteriellen Ionenkanals mICNG,
2 die Primärstruktur des mICNBD,
3 einen Biosensor des Verfahrens, in schematischer Darstellung,
4a die Darstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors vor der Bindung des Liganden,
4b die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors mit gebundenem Liganden,
5 eine Mikroskopie einer lebenden Zelle umfassend mICNBD-basierte FRET-Biosensoren und
6 den zeitlichen Verlauf des Messsignal in Reaktion auf eine Erhöhung der cAMP-Konzentration.
1 zeigt in der Bändermodell-Darstellung den bindungsaktiven Kern eines erfindungsgemäßen Biosensors 6, nämlich das Protein 1 mICNBD, welches die Bindestelle für zyklische Nukleotide des bakteriellen Ionenkanals mICNG bildet und welches die erfindungsgemäßen Biosensoren 6 für die spezifische Bindung von cAMP nutzen. Die 1 zeigt die Sekundär- und Tertiärstruktur des Proteins 1 sowie speziell den Bereich, an den cAMP spezifisch bindet, die Phosphate Bindecassette 2 (PBC).
Die Aminosäuresequenz, welche die Primärstruktur des Proteins 1 mICNBD bildet, ist in schematischer Darstellung in 2 gezeigt. Hervorgehoben sind einige wesentliche strukturelle Merkmale der Sequenz. Diese sind die die Konformationsänderung vorrangig aufweisenden alpha-Helices 3 und die beta-Faltblätter 4 des Proteins 1, die Phosphate Bindecassette 2 PBC sowie die für die Bindung von cAMP bedeutsame Aminosäure Arginin 5.
Einen vollständigen erfindungsgemäßen Biosensor 6 zeigt die 3. Abgebildet sind in schematischer Darstellung die beiden Flurophore – der Donor 7, hier Cerulean, und der Akzeptor 8, hier Citrin – das das Donor-Akzeptor-Paar verbindende Protein 1 mICNBD, sowie der der Extraktion und Reinigung dienende Histidin-Tag 9.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Funktionsweise des Verfahrens geht aus den schematischen Darstellungen der 4a und 4b hervor. Dargestellt ist die Funktion anhand eines einzelnen erfindungsgemäßen Biosensors 6. Dabei zeigt 4a einen Biosensor 6 vor der Bindung eines Liganden 10 cAMP an das Protein 1 mICNBD. Der 4a ist zu entnehmen, dass im Zustand vor der Ligandenbindung der Donor 7 Cerulean und der Akzeptor 8 Citrin dergestalt in räumlicher Nähe zueinander befindlich sind, dass das vermittels Fluoreszenz bewirkte Lichtsignal durch den Akzeptor 8 Citrin dominiert ist. Hat sich demgegenüber eine Bindungswechselwirkung zwischen dem Liganden 10 cAMP und der Bindestelle mICNBD ereignet, so wird eine Änderung der Konformation des Proteins 1 mICNBD bewirkt, die in der Folge zu einer Streckung des betreffenden Biosensors 6 führt (4b). Die Distanz zwischen beiden Flurophoren wird so vergrößert. Als Resultat der Abstandszunahme zwischen Donor 7 und Akzeptor 8 wird der Einfluss der Fluoreszenz des Cerulean auf das Lichtsignal erhöht. Gleichzeitig wird der Einfluss des Citrin reduziert. Im Ergebnis kommt es so zu einer Verschiebung des durch das Lichtsignal vermittelten Farbeindruckes.
In 5 ist eine mikroskopische Aufnahme lebender Zellen 11 gezeigt – hier intakter HEK 293-Zellen – die die erfindungsgemäßen mICNBD-basierte FRET-Biosensoren heterolog exprimiert haben. Innerhalb der Zellen 11 sind dabei die Biosensoren 6 als Strukturen erhöhter Helligkeit 12 zu erkennen. Wird nun an dergestalt vorbereiteten HEK 293-Zellen eine Erhöhung der cAMP-Konzentration herbeigeführt, wie dies beispielsweise vermittels der Zugabe geeigneter Konzentrationen von NKH 477 und IBMX bewirkt wird, so führt dies zu einer Änderung des durch das Lichtsignal vermittelten Farbeindruckes und mithin des Messsignals 13.
Ein solches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermitteltes Messsignal 13 im Zeitverlauf, wie es an HEK 293-Zellen auftritt, die eine, die cAMP-Konzentration, wie beschrieben erhöhende Behandlung erfahren haben, zeigt schließlich 6.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Liganden (10) vermittels Biosensoren (6), die auf dem Förster Resonanz Energie Transfer Prinzip basieren, wobei ein Biosensor (6) ein Protein ist, das drei Abschnitte umfasst, wobei der erste Abschnitt die Funktion eines Donors (7) hat, wobei der zweite Abschnitt die Funktion eines Akzeptors (8) hat und wobei der dritte Abschnitt den ersten Abschnitt und den zweiten Abschnitt verbindet, wobei der dritte Abschnitt einen Bereich zur Wechselwirkung mit dem nachzuweisenden Liganden (10) aufweist und wobei die Wechselwirkungsreaktion eine Änderung der geometrischen Struktur des dritten Abschnitts bewirkt, wobei der dritte Abschnitt ein zur Bindung von zyklischen Nukleotiden geeignetes Protein (1) prokaryotischer Natur ist, dadurch gekennzeichnet, dass das den dritten Abschnitt bildende Protein (1) die Bindestelle mICNBD des bakteriellen Ionen-Kanals mICNG ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Donor (7) die Substanz Cerulean ist und/oder dass der Akzeptor (8) die Substanz Citrin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand (10) ein zyklisches Nukleotid ist und/oder umfasst, insbesondere zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP).
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung mit dem Liganden (10) eine spezifische Bindung ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der geometrischen Struktur des Proteins (1), das die Bindungsstelle für den Liganden (10) bildet, eine Konformationsänderung ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die die Affinität der Bindungswechselwirkung quantifizierende Dissoziationskonstante einen Wert im nanomolaren Bereich aufweist, insbesondere einen Wert im Bereich von 70 bis 110 nM.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis von Liganden (10) in Lösung und/oder innerhalb lebender Zellen (11) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biosensoren (6) umfassend die Proteine (1), welche die Bindungsstellen für die Liganden (10) bilden, die Donoren (7) und die Akzeptoren (8) genetisch codiert sind, dass die Biosensoren (6) als Fusionsproteine exprimiert werden und dass die Biosensoren (6) vermittels lebender Zellen (11) exprimiert werden, insbesondere vermittels bakterieller Zellen und/oder der zu untersuchenden Zellen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass je ein Biosensor (6) je einen Tag (9) aufweist, insbesondere je einen Histidin-Tag, und dass der Tag (9) dem Zwecke der Reinigung dient.