DE69923581T2

DE69923581T2 - Test für auf Phosphatase zielende Toxine

Info

Publication number: DE69923581T2
Application number: DE69923581T
Authority: DE
Inventors: Ove Stein DOSKELAND; Hauge Margrethe SERRES; Espolin Kari FLADMARK
Original assignee: Biosense Laboratories AS
Current assignee: Biosense Laboratories AS
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-11
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2019-11-12
Also published as: ID30236A; HK1040546A1; BR9915299A; ES2237953T3; HUP0104194A2; CZ20011673A3; NO20012304L; DE69923581D1; JP4460779B2; IL143047A0; EP1129352B1; KR100674517B1; JP2002529738A; AU769203B2; KR20010092728A; WO2000028325A1; NO328021B1; EP1129352A1; DK1129352T3; PL198749B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Testmethode für die Detektion von auf Phosphatase zielenden Toxinen, die typischerweise von Mikroalgen, wie beispielsweise Cyanobakterien und Dinoflagellaten, produziert werden.
Dinoflagellaten sind typischerweise einzellige, photosynthetische Algen mit zwei Flagellen. Einige der marinen Dinoflagellaten (z.B. Prorocentrum sp. und Dinophysis sp.) produzieren auf Phosphatase zielende Toxine, wie beispielsweise Okadainsäure und Dinophysis-Toxin, die bei Aufnahme durch den Menschen gastrointestinale Probleme hervorrufen. Solche Algen können somit problematisch sein, wenn sie die Habitate von Schalentieren kontaminieren, die für den Verzehr gedacht sind.
Cyanobakterien, die oft auch als Blaugrünalgen bezeichnet werden, sind ebenfalls photosynthetische Organismen, die vorwiegend aquatisch sind und Küstengewässer, die offene See und Ozeane, Flüsse, Seen und Grundwasser bewohnen, aber auch terrestrisch sein können und in Blattstreu und im Boden vorkommen.
Viele Arten und Stämme der Cyanobakterien, insbesondere Microcystis sp., Aphanizomenon sp., Anabena sp., Nodularia sp. und Oscillatoria sp. produzieren Toxine, die Krankheiten hervorrufen können, wenn sie von Menschen oder anderen Säugetieren, Vögeln und sogar Fischen aufgenommen werden. Die Aufnahme solcher Toxine erfolgt über zwei Hauptrouten, entweder über das Trinken von kontaminiertem Wasser oder das Essen kontaminierter Meeresfrüchte.
Zwei besondere Arten von Toxinen werden von Cyanobakterien und Dinoflagellaten produziert. Neurotoxine, beispielsweise Anatoxine und Saxitoxine, verursachen bei dem Opfer eine Lähmung und daher einen Zustand, der oft als lähmende Schalentiervergiftung bezeichnet wird. Die Vergiftung durch solche Neurotoxine kommt selten vor, kann aber tödlich ausgehen.
Die andere Form von Toxinen inaktiviert Proteinphosphatase-Enzyme in den Zellen des Körpers, indem sie an die Enzyme bindet und deren Fähigkeit zur Dephosphorylierung von Proteinsubstraten beeinflusst. Diese Toxine sind relativ verbreitet, und einige (beispielsweise die Dinoflagellaten-Toxine Okadainsäure und Dinophysis-Toxin) können Übelkeit, Erbrechen und Diarrhöe hervorrufen und somit einen Krankheitszustand verursachen, der oft als Diarrhöe erzeugende Schalentiervergiftung bezeichnet wird. Einige auf Proteinphosphatase zielende Toxine sind Tumorpromotoren, und eine Exposition gegenüber diesen Toxinen kann zu Krebs führen. Andere, beispielsweise die cyanobakteriellen Toxine Microcystin und Nodularin sind hepatotoxisch und verursachen Leberschäden. Die verbreitetsten der auf Phosphatase zielenden Toxine sind Microcystin, Nodularin und Okadainsäure.
Die häufigsten Quellen für Vergiftung mit Dinoflagellaten-Toxin sind Schalentiere und Fischleber, und die häufigste Ursache für Vergiftung mit cyanobakteriellem Toxin ist kontaminiertes Trink- und/oder Badewasser. Sowohl die cyanobakteriellen als auch die Dinoflagellaten-Toxine können jedoch in Schalentieren und in Wasser vorkommen. Eine besonders häufige Quelle für Algentoxinvergiftung sind Miesmuscheln, da sie die Toxine anreichern, wenn sie sich von Toxin produzierenden Algen ernähren. Andere Schalentiere, beispielsweise Austern, Venusmuscheln und Kammmuscheln können auch betroffen sein.
Darüber hinaus können Hauswasserversorgungen, insbesondere wenn sie auf Grundwasser basieren, mit Cyanobakterien kontaminiert werden und somit eine direkte Route für die Toxinaufnahme bereitstellen.
Es gibt einige Bedenken hinsichtlich des Verzehrs von Algen und Cyanobakterien als Reformkost mit hohem Proteingehalt und als Diäthilfe. Es gibt keine offiziellen Richtlinien für die Überwachung geernteter Algen und Cyanobakterien auf Kontaminierung mit Toxin produzierenden Stämmen, und die Vermarktung von Gattungen wie Anabena und Aphanizomenon ist besonders Besorgnis erregend, da innerhalb dieser Gattungen eine Reihe Toxin produzierender Stämme zu finden sind.
Zusätzlich zu den kurzzeitigen Beschwerden, den medizinischen Kosten, den kommerziellen Kosten für die Schalentierindustrie, dem Verlust von Arbeitsstunden usw., die entstehen, wenn man Algentoxinen ausgesetzt ist, erwiesen sich, wie oben erwähnt, die auf Phosphatase zielenden Toxine Microcystin und Nodularin als Tumorpromotoren, und man nimmt an, dass wiederholte Exposition gegenüber solchen Toxinen in klinischen oder subklinischen Konzentrationen, insbesondere in Kombination mit einer hohen Alkoholaufnahme oder Rauchen, zu Krebs, insbesondere Leberkrebs führen kann.
Gegenwärtig gibt es eine Reihe unterschiedlicher Methoden für die Detektion und die Quantifizierung von auf Phosphatase zielenden Toxinen aus Algen und Cyanobakterien. Eine Standardmethode umfasst das Mahlen von Miesmuscheln und anderen potenziellen Quellen der auf Phosphatase zielenden Toxine und die Injektion eines Extrakts des gemahlenen Miesmuschelgewebes in Mäuse. Das Vorliegen und der Grad der Kontamination mit auf Phosphatase zielenden Toxinen wird dann in Abhängigkeit vom Überleben der Mäuse bestimmt (Stabell et al. (1992), Food. Chem. Toxicol. 30(2): 139-44). Dies stellt eindeutig eine Zeit raubende, grobe und teure Methode der Bestimmung von Lebensmittelsicherheit und der Qualitätskontrolle dar.
Eine weitere Methode zur Bestimmung von Diarrhöe erzeugenden Schalentiergiften (DSP) (EP-A-554458 der latron Laboratories Inc) umfasst die Verwendung eines ersten und zweiten Antikörpers gegen das Toxin in einem herkömmlichen Sandwich-Test.
Eine weitere Methode umfasst die Messung der Verringerung der enzymatischen Aktivität exogen zugegebener Phosphatasen, wodurch das Vorliegen von auf Phosphatase zielenden Toxinen in dem Schalentier nachgewiesen wird. Dieses Verfahren umfasst wiederum das Mahlen der Miesmuscheln oder anderer Schalentiergewebe, wodurch endogene Phosphatasen freigesetzt werden, welche auf die zugegebenen Phosphatasen störend einwirken, wodurch die Sensitivität und Genauigkeit des Tests beeinträchtigt wird (Sim und Mudge (1994) in Detecion Methods for Cyanobacterial Toxins, Hrsg. Codd, Jeffries, Keevil und Potter, Royal Society of Chemistry, und US-A-5180665 an Charles Holmes).
Es besteht somit ein großer Bedarf an einem schnellen, sensitiven und billigen Test oder einer Methode, welcher/welche die qualitative und/oder quantitative Bestimmung des Vorliegens von auf Phosphatase zielenden Toxinen, insbesondere von auf Phosphatase zielenden Toxinen von Algen und Cyanobakterien, in Wasser, in Schalentieren und/oder verzehrbaren Produkten von Algen oder Cyanobakterien ermöglicht. Es besteht insbesondere ein Bedarf an einer Testmethode, die einfach genug ist, um vor Ort von relativ ungelerntem oder ungelerntem Personal, beispielsweise Fischhändlern oder Personal im Bereich der Wasserhygiene, durchgeführt zu werden und keine Laborausrüstung oder spezielle Einrichtungen für deren Durchführung erfordert.
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt dementsprechend eine Testmethode bereit für die Bestimmung von auf Phosphatase zielenden Toxinen, die Proteinphosphatasen inhibieren, wobei man einen festen Träger, der einen daran immobilisierten Liganden aufweist, in Kontakt bringt mit:

(i) einer Probe, von der man annimmt, dass sie mit Toxin kontaminiert ist und
(ii) einem nicht-immobilisierten Liganden,

In einer Ausführungsform kann die Toxinbestimmung somit die Bestimmung des nicht-immobilisierten Liganden beinhalten, der nicht direkt oder indirekt an den immobilisierten Liganden gebunden hat. Wenn der nicht-immobilisierte Ligand mit dem Toxin um die Bindung an den immobilisierten Liganden konkurriert, ist eine hohe Konzentration an nicht-gebundenem Liganden ein Anzeichen für eine hohe Toxinkonzentration. Wenn der nicht-immobilisierte Ligand an den immobilisierten Liganden gebundenes Toxin komplexieren kann, dann ist eine hohe Konzentration an nicht-gebundenem Liganden ein Anzeichen für eine niedrige Toxinkonzentration.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Toxinbestimmung die Bestimmung des nicht-immobilisierten Liganden, der direkt oder indirekt an den immobilisierten Liganden gebunden hat. Wenn das Toxin und der nicht-immobilisierte Ligand um die Bindung an den immobilisierten Liganden konkurrieren, dann ist eine hohe Konzentration an gebundenem Liganden ein Anzeichen für eine niedrige Toxinkonzentration. Wenn der nicht-immobilisierte Ligand an den immobilisierten Liganden gebundenes Toxin komplexieren kann, dann ist eine hohe Konzentration an gebundenem Liganden ein Anzeichen für eine hohe Toxinkonzentration.
Die erfindungsgemäße Methode beinhaltet jedoch vorzugsweise einen kompetitiven Bindungstest für die Detektion von auf Phosphatase zielenden Toxinen, insbesondere Algen- und cyanobakteriellen Toxinen, wobei in der Probe vorliegende Toxinmoleküle mit dem nicht-immobilisierten Liganden um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen des immobilisierten Liganden konkurrieren und jedes beliebige Toxin, das in der Probe vorliegt, relativ zum Grad des nicht immobilisierten Liganden, der an die Bindungsstellen des immobilisierten Liganden gebunden ist oder nicht gebunden ist, bestimmt wird.
Die Begriffe „detektieren", „bestimmen" oder „beurteilen" umfassen sowohl die Quantifizierung in dem Sinn, dass ein absoluter Wert für die Menge oder die Konzentration der auf Phosphatase zielenden Toxine, die in der Probe vorliegen, erhalten wird, als auch eine semi-quantitative und qualitative Beurteilung oder Bestimmung. Ein Index, ein Verhältnis, eine Prozentangabe oder eine molare Angabe der Konzentration oder der Menge des vorliegenden Toxins kann bestimmt werden oder alternativ ein einfaches Anzeigen des Vorliegens oder Fehlens solcher Toxine in der Probe erhalten werden. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein einfaches Anzeigen des Vorliegens oder Fehlens von Toxin oder eine semi-quantitative Bestimmung des Vorliegens von Toxin erreicht. In diesem Zusammenhang kann „Fehlen" von Toxin bedeuten, dass die Toxinkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze des Tests oder unterhalb der für sicher oder tolerierbar gehaltenen Konzentration liegt.
Die in der erfindungsgemäßen Testmethode verwendeten Proben können jede beliebige Probe sein, von der man annimmt, dass sie auf Phosphatase zielenden Toxinen ausgesetzt wurde, eventuell durch Exposition gegenüber Mikroorganismen, die auf Phosphatase zielende Toxine produzieren, beispielsweise durch Wasser, das Meerwasser, Süßwasser, Grundwasser, aus Seen, Flüssen, Quellen, Strömen, Reservoiren, Hauswasserversorgungen entnommenes Wasser sein kann, oder Flüssigkeit, die aus Schalentieren, beispielsweise durch einfaches Abtropfenlassen oder durch Extraktion unter Verwendung einer Pipette entnommen wurde, oder Wasser, in dem man Schalentiere wässern ließ, oder kann ein Nahrungsmittel, ein Nahrungszusatz, eine Nahrungsergänzung, ein alternatives Heilmittel oder ein ähnliches Produkt sein, das durch oder von Algen oder Cyanobakterien produziert wird. Wenn das Schalentier freies Wasser enthält (z. B. wie in Austern), kann der Test das Eintauchen eines absorbierenden Substrats (des festen Trägers) in das Wasser beinhalten. Alternativ kann er einfach das Drücken eines adsorbierenden Substrats gegen das feuchte Fleisch des Schalentiers beinhalten, z.B. nach Aufbrechen und Öffnen der Schale.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die untersuchte Probe eine Oberfläche oder freie Flüssigkeit eines Schalentiers.
Alle Arten von Schalentieren, beispielsweise Kammmuscheln, Garnelen, Miesmuscheln und Austern sind der erfindungsgemäßen Testmethode zugänglich, aber gemäß einem bevorzugten Aspekt sind die Schalentiere Miesmuscheln. Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt ist die untersuchte Probe Wasser, das aus dem Habitat entnommen wurde, in dem solche Schalentiere leben, und gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt ist die Probe Wasser, das aus Hauswasserversorgungen entnommen wurde.
Die für die Analyse verwendete Probe kann im Wesentlichen unbehandelt verwendet werden, gegebenenfalls aber über jede beliebige bekannte Methode filtriert oder durch Zugabe von Wasser, Puffer oder jedes beliebigen anderen wässrigen Mediums vor der Analyse verdünnt werden, und kann beispielsweise durch Kühlen oder Einfrieren vor der Analyse gelagert oder konserviert werden.
Bei der erfindungsgemäßen Methode kann jeder beliebige Toxin-bindende Ligand als der immobilisierte oder nicht-immobilisierte Ligand verwendet werden, beispielsweise Antikörper, die polyklonal oder monoklonal sein können oder Anti körperfragmente, beispielsweise F(ab)-, F(ab')₂- oder F(v)-Fragmente. Solche Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalent oder divalent sein und über Hybridomtechnologie hergestellt oder synthetischen Ursprungs sein, entweder als Produkte rekombinanter DNA-Technologie oder chemischer Synthese. Beispielsweise könnten Einzelketten-Antikörper oder andere Antikörperderivate oder Antikörper nachahmende Moleküle verwendet werden. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können in geeigneter Weise gegen jedes beliebige Epitop, jede beliebige Komponente oder Struktur der auf Phosphatase zielenden Toxine gerichtet sein oder gegen diese erzeugt werden. Alternativ können Verbindungen mit Affinität für das Toxin, beispielsweise ein kleines organisches Molekül oder ein Peptid, z.B. ein Oligopeptid oder Polypeptid, die zur spezifischen Bindung an das Toxin befähigt sind, beispielsweise ein spezifischer Binder, der aus einer kombinatorischen chemischen oder Phagen-Display-Bibliothek selektiert wurde, oder eine spezifisch bindende Sequenz aus DNA oder RNA verwendet werden.
Der Toxin-bindende Ligand der vorliegenden Erfindung ist jedoch vorzugsweise ein Proteinphosphatase-Enzym, und noch bevorzugter wird der bindende Ligand Proteinphosphatase 2A (pp2A) in der Testmethode verwendet.
Der in der erfindungsgemäßen Methode verwendete zweite Ligand kann gleichermaßen jeder beliebige Ligand sein, der an das Toxin entweder in kompetitiver oder nicht-kompetitiver Weise hinsichtlich des ersten Liganden bindet. Alternativ kann der zweite Ligand jeder beliebige Ligand sein, der mit dem Toxin um die Bindung an den ersten Liganden konkurriert. Der erste Ligand ist vorzugsweise ein Toxin-bindender Ligand, noch mehr bevorzugt ein Proteinphosphatase-Enzym. Einer der beiden Liganden muss immobilisiert und der andere muss nicht-immobilisiert sein, und einer der Liganden muss direkt oder indirekt detektierbar sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte der nicht-immobilisierte Ligand die funktionellen Bedingungen erfüllen, dass er kompetitiv die Bindung des Toxins an den immobilisierten Liganden inhibiert und direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal erzeugen kann, z. B. kann er ein Molekül sein, das markiert werden kann unter Verwendung eines Restes jeder beliebigen bekannten Form, der ein direktes oder indirektes Signal bildet. Solche Liganden können gleichermaßen Antikörper sein, die polyklonal oder monoklonal sein können, oder Antikörperfragmente, beispielsweise F(ab)-, F(ab')₂- oder F(b)-Fragmente. Solche Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalent oder divalent sein, und können über Hybridomtechnologie hergestellt werden oder synthetischen Ursprungs sein, entweder durch rekombinante DNA-Technologie oder chemische Synthese. Beispielsweise könnten Einzelketten-Antikörper oder andere Antikörperderivate oder Antikörper nachahmende Moleküle und kleine organische Moleküle, Peptide, Oligopeptide und Polypeptide, die aus kombinatorischen oder Phagen-Display-Bibliotheken selektiert wurden, verwendet werden. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können in geeigneter Weise gegen jedes beliebige Epitop, jede beliebige Komponente oder Struktur des auf Phosphatase zielenden Toxinmoleküls oder des Liganden, der das auf Phosphatase zielende Molekül bindet, gerichtet sein oder dagegen erzeugt werden. Alternativ können Verbindungen mit Affinität für das Toxin oder den Liganden, der das Toxin bindet, beispielsweise ein kleines organisches Molekül oder Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, die das Toxin oder den das Toxin bindenden Liganden binden, beispielsweise ein spezifischer Binder, der aus einer kombinatorischen chemischen oder Phagen-Display-Bibliothek selektiert wurde, oder eine spezifisch bindende Sequenz aus DNA oder RNA verwendet werden.
Der Reporter-Rest, den einer der Liganden im Allgemeinen trägt, kann eine Bindungsstelle für einen direkt detektierbaren Rest sein, z. B. ein Metallsol (z. B. Goldsol), ein Chromophor oder Fluorophor (z. B. ein Cyanin, Phthalocyanin, Merocyanin, Triphenylmethyl, Equinance, usw., siehe Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing Chromophores, herausgegeben von M. Matsuoka, Plenum Press, New York, NY, 1990, Topics in Applied Chemistry, The Chemistry und Application of Dyes, Waring et al., Plenum Press, New York, NY, 1990, und Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Molecular Probes Inc. 1996, eine Radiomarkierung, ein Enzym, ein magnetisches Partikel, ein Trübung erzeugendes Mittel, usw., oder kann bereits einen solchen direkt detektierbaren Rest tragen. Wenn der Reporter-Rest auf dem immobilisierten Liganden vorliegt, handelt es sich im Allgemeinen um eine Bindungsstelle für einen direkt detektierbaren Rest, wobei die Bindungsstelle entweder aktiviert oder im Allgemeinen deaktiviert ist, wenn der Ligand komplexiert ist.
Vorzugsweise trägt der nicht-immobilisierte Ligand den Reporter-Rest.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der nicht-immobilisierte Ligand ein markiertes, z. B. enzym- oder chromophor- oder fluorophor-markiertes Peptid Hepatotoxin, z. B. ein unter Nodularin, Microcystin LR oder Microcystin YR ausgewähltes Hepatotoxin oder alternativ Okadainsäure.
Da der Test in erster Linie zur Verwendung durch Nicht-Fachleute vor Ort vorgesehen ist, werden vorzugsweise Reporter-Reste verwendet, die ein sichtbares Signal erzeugen, z. B. Chromophore, Fluorophore, phosphoreszierende Reste, Trübung induzierende Mittel, Gaserzeugung induzierende Mittel, etc., obwohl eine Markierung mit Radiomarkierungen möglich ist.
Wenn der signalbildende Rest ein Material ist, das an eine Bindungsstelle an einem der Liganden bindet, wird er praktischerweise nach Abtrennung der gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen in geeigneter Weise mit der gebundenen oder nicht-gebundenen Fraktion in Kontakt gebracht.
Wenn das Signal von der gebundenen Fraktion erhalten werden soll, wird das Substrat im Allgemeinen vorzugsweise gespült, z. B. mit Wasser, um die nicht-gebundene Fraktion wegzuspülen, bevor der Ligand detektiert oder erzeugt und detektiert wird.
Die vorliegende Erfindung kann auf jede Art oder jeden Stamm von Algen oder Cyanobakterien angewendet werden, die/der auf Phosphatase zielende Toxine produziert, ist jedoch insbesondere anwendbar auf Toxin-produzierende Stämme von Cyanobakterien, beispielsweise Microcystis aeroginosa, Anabena-Arten, Nodularia spuragena und Anabena flus-aquae oder Algen. Beispielsweise werden die Toxine Microcystin-LR und Microcystin-YR dementsprechend von Microcystis sp. produziert, das Toxin Nodularin von Nodularia sp. und das Toxin Okadainsäure von Prorocentrum sp.
Die Toxine, die durch die erfindungsgemäße Methode bestimmt werden, können gleichermaßen jedes beliebige auf Phosphatase zielende Toxin sein, das von Algen oder Cyanobakterien produziert wird, aber gemäß bevorzugten Aspekten sind die Peptidtoxine Hepatotoxine (von denen Microcystin und Nodularin die am weitesten verbreiteten sind) oder Okadainsäure.
In ihrer allgemeinsten Form beinhaltet die erfindungsgemäße Methode dementsprechend das Inkontaktbringen einer Probe, von der man annimmt, dass eine Kontamination mit auf Phosphatase zielenden Toxinen vorliegt, mit einem Toxin-bindenden Liganden und einem Reporter-Molekül, das befähigt ist, mit dem Toxin um die Bindungsstellen der Liganden zu konkurrieren, entweder gleichzeitig, nacheinander oder getrennt in einer von beiden Reihenfolgen, wobei das Reporter-Molekül gegebenenfalls an den bindenden Liganden gebunden wird, bevor es der untersuchten Probe ausgesetzt wird, und die Bestimmung des Reporter-Moleküls, das entweder an die feste Phase gebunden ist oder frei in Lösung vorliegt.
Die gebundene Fraktion kann vor der Beurteilung des Reporters von der nicht-gebundenen Fraktion durch jedes geeignete Mittel, beispielsweise Fällung, Zentrifugation, Filtration, chromatographische Mittel, Kapillarwirkung oder einfach durch Abgießen getrennt werden. Die feste Phase kann beispielsweise in Form eines Messstäbchens oder einer festen Matrix jeder beliebigen bekannten Form vorliegen, beispielsweise als Polymer- oder Magnetkügelchen, beispielsweise Dynabeads^® (erhältlich von Dynal AS). Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung liegt die feste Phase, an die Toxin-bindende Liganden mobilisiert sind, in Form von Dynabeads^® vor.
Das Reporter-Molekül kann entweder in der gebundenen oder in der nicht-gebundenen Fraktion in Abhängigkeit von der spezifischen Ausführungsform der Erfindung bestimmt werden, wird aber vorzugsweise in der gebundenen Fraktion bestimmt.
Der immobilisierte Ligand kann über jedes bekannte Mittel immobilisiert werden, beispielsweise durch Bindung oder Kopplung des Liganden an jeden beliebigen der allgemein bekannten festen Träger oder Matrizes, die gegenwärtig für die Abtrennung oder Immobilisierung umfassend benutzt oder vorgeschlagen werden, beispielsweise können feste Phasen die Form von Partikeln, Blättern, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern oder Kapillaren oder Mikrotiterstreifen, Röhrchen oder Platten mit Wells usw. annehmen, und praktischerweise aus Glas, Kieselerde, Latex, einem polymeren Material oder Magnetkügelchen bestehen. Techniken für die Bindung des Liganden an den festen Träger sind dem Fachmann allgemein bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung liegt die feste Phase, an welche die Liganden immobilisiert sind, die das auf Phosphatase zielende Toxin binden, in Form von Dynabeads^® vor.
Die erfindungsgemäße Testmethode ist vorteilhaft, da sie für die Durchführung keine komplexe Laborausstattung erfordert, und von relativ fachunkundigen oder fachunkundigen Personen durchgeführt werden kann. Die Testmethode ist somit geeignet für die Verwendung zuhause, in Geschäften oder im Außeneinsatz und kann schnell und einfach durchgeführt werden, ohne intensive Arbeit oder gefährliche Chemikalien zu erfordern.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Tests ist der sehr hohe Grad an Sensitivität, der von kritischer Bedeutung ist, wenn Proben analysiert werden, bei denen das Toxin in sehr niedrigen Konzentrationen vorliegt, beispielsweise beim Testen von Trinkwasser oder der Beurteilung einer möglichen Verschmutzung mit auf Phosphatase zielenden Toxinen. Der Test vermag typischerweise Toxine in picomolaren Konzentrationen zu detektieren, z. B. bis hinunter zu 10 pM. Der Assay kann praktischerweise zur Detektion von Toxinen im Bereich von 15 bis 560 pM verwendet werden.
Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Tests im Vergleich mit anderen vorhandenen Techniken besteht darin, dass er nicht durch die Anwesenheit endogener Phosphatasen beeinflusst wird, die in den untersuchten Proben vorliegen können, insbesondere wenn die Proben beispielsweise von Schalentieren entnommen werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Proteinphosphatase auf einem festen Träger immobilisiert, die immobilisierte Phosphatase wird mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht und jedes auf Phosphatase zielende Toxin, das in der Probe vorliegt, bindet an die immobilisierte Phosphatase. Eine Quelle für Reporter-Moleküle, die mit dem Toxin um Phosphatase-Bindungsstellen konkurrieren, wird zugegeben. Die Reporter-Moleküle verdrängen Toxin-Moleküle in einem Ausmaß von den Bindungsstellen, das von der relativen Konzentration von Toxin-Molekülen und Reporter-Molekülen abhängt. Das Ausmaß der Bindung von Reporter-Molekülen erleichtert die Bestimmung des in der zu untersuchenden Probe vorliegenden Toxins. Bevorzugte Reporter/Markierungen umfassen Radiomarkierungen, Chromophore (einschließlich Fluorophore) und Enzyme, die chromogene oder fluorogene Produkte erzeugen. Szintillations-„Proximity"-Markierungen und Markierungen, die eine messbare Änderung der Lichtstreuung hervorrufen, sind auch umfasst.
In einer alternativen Ausführungsform werden auf einem festen Träger immobilisierte Reporter-blockierte Phosphatase-Moleküle mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht und alle auf Phosphatase zielenden Toxine, die in der Probe vorliegen, konkurrieren mit den Phosphatase-gebundenen Reporter- Molekülen, wobei sie diese aus der festen Phase in die wässrige Phase in einem Ausmaß verdrängen, das proportional zur Menge an Toxin ist, die in der Probe vorliegt. Die Menge an Reporter-Molekülen, die an die feste Phase gebunden bleiben, wird dann bestimmt, um die Bestimmung des in der zu untersuchenden Probe vorliegenden Toxins zu erleichtern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt einen Kit für die Detektion von auf Phosphatase zielenden Toxinen von Cyanobakterien oder Algen bereit, wobei der Kit erfindungsgemäß umfasst.
eine feste Phase, auf welcher ein Ligand immobilisiert ist;
einen nicht-immobilisierten Liganden, vorzugsweise in wässriger Lösung oder komplexiert mit dem immobilisierten Liganden; wobei weder der immobilisierte noch der nicht-immobilisierte Ligand einen direkt oder indirekt detektierbaren Rest enthält, einen Reporter-Rest, der zur Bindung an einen der immobilisierten und nicht-immobilisierten Liganden und zur Erzeugung eines detektierbaren Signals befähigt ist, wobei vorzugsweise der detektierbare Rest oder das detektierbare Signal direkt ohne Laborausrüstung ablesbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Kit:
eine feste Phase, auf der Liganden immobilisiert sind, die auf Phosphatase zielendes Toxin binden
ein Reporter-Molekül, das befähigt ist, die Bindung von auf Phosphatase zielenden Toxinen an den Toxin-bindenden Liganden kompetitiv zu inhibieren und ein Signal zu erzeugen, das ohne Laborausrüstung ablesbar ist.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst magnetisch entfernbare polymere Mikrokügelchen mit einer darauf immobilisierten Proteinphosphatase;
Goldsol-markierte Peptidhepatotoxin-Moleküle, welche zur kompetitiven Inhibierung der Bindung von cyanobakteriellen Toxinen an die Proteinphosphatase befähigt sind.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst magnetisch entfernbare polymere Mikrokügelchen, auf denen eine Proteinphosphatase immobilisiert ist;
Goldsol-markierte Okadainsäuremoleküle, welche zur kompetitiven Inhibierung der Bindung von Algen-Toxinen an die Proteinphosphatase befähigt sind.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt umfasst die Verwendung des Kits das Eintauchen eines porösen, celluloseartigen Substrats, auf dem ein Toxin-bindender Ligand immobilisiert ist, und das mit einem kompetitiv bindenden, chromophor- (oder fluorophor- usw.) -markiertem Liganden imprägniert ist, in eine Probe von Wasser oder Schalentierflüssigkeit, die Inkubation des gesättigten Substrats für eine vorbestimmte Zeitdauer (entweder aus der Probe entnommen oder in einem vorbestimmten Volumen der Probe), das Entfernen des nicht-gebundenen markierten Liganden, z.B. durch Spülen des Substrats mit Toxin-freiem Wasser oder durch Wässern des Substrats für eine vorbestimmte Zeitdauer in einem vorbestimmten Volumen von Toxin-freiem Wasser, und Überprüfen der Farbe des Substrats oder des für das Wässern verwendeten Wassers. Das Substrat ist wünschenswerterweise auf einem Träger aufgebracht, vorzugsweise einem Träger, der mit Kalibrierungsfarben markiert ist, um den Vergleich der Farbe des Substrats oder des Wassers für die Wässerung zur Bestimmung der Toxinkonzentration zu erleichtern, oder um anzuzeigen, ob die Toxinkonzentration über oder unter einem oder mehreren Schwellenwerten liegt.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulicht:
Materialien
Microcystin YR, Microcystin-LR, Okadainsäure, Nodularin, Calyculin A und Tautomycin werden von Calbiochem (San Diego CA) bezogen. Träger-freies Na¹²⁵I und [γ-³²P]ATP wird von Amersham (Little Calfont, UK) bezogen. Albumin (RIA-Grad), Ammoniumacetat, Chloramin T, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dithioerythritol (DTE), EDTA, EGTA, Glycerin, Hepes, Histon II-AS, Natriummetabisulfit und Trypsin-Inhibitor (Sojabohne) werden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Acetonitril und Trifluoressigsäure (TFA) werden von Rathburn (Walkerburn, Scotland) bezogen. Teilweise aufgereinigte Proteinphosphatase 2A wird entweder von Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) bezogen oder nach Resink et al. (Eur. J. Biochem. 133: 455-461 (1983)) aufgereinigt.
Jodierung von Mycrocystin-YR
Microcystin YR (10 μg) wird 1 mCi Träger-freiem Na¹²⁵I (37 MBq) unter Verwendung von Chloramin T wie von Ciechanover et al., (PNAS 77: 1365-1368 (1980)) beschrieben jodiert. Nach der Jodierungsreaktion wird Jodid von [¹²⁵I]-Microcystin-YR unter Verwendung von Sep-Pak^® Plus-Kartuschen (Waters, Milford, MA) nach der Methode von Runnegar et al. (Toxicon 24: 506-509(1986)) abgetrennt. Das [¹²⁵I]-Microcystin-YR wird auf eine 3 × 250 mm Inertsil ODS-2 HPLC-Säule von Chrompack (Raritan, NJ) aufgetragen und mit einem Acetonitril-Gradienten eluiert.
Kompetitiver Bindungstest
Der kompetitive Bindungstest wird in einem Volumen von 0,5 ml durchgeführt, das mit 50 mM Hepes (pH 7,2), 1 mM EDTA, 0,3 mM EGTA, 1 mM DTE, 5 mM MnCl₂, 0,5 mg ml^–1 BSA und 0,2 mg ml^–1 Trypsin-Inhibitor gepuffert ist. In 100 % DMSO verdünnte Algen-Toxine werden mit 0-100 nM in einer Endkonzentration von 10 % DMSO zu dem Test gegeben. [¹²⁵I]-Microcystin-YR (1 Ci/13 ng) wird auf 35 pM zugegeben. Zuletzt wird Proteinphosphatase 2A (30 pM) zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht auf Eis inkubiert. [¹²⁵I]-Microcystin-YR, das an Proteinphosphatase 2A gebunden ist, wird von freiem [¹²⁵I]-Microcystin-YR über Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex^® G-50 Fein von Pharmacia (Uppsala, Schweden) in 0,7 × 15 cm-Säulen von Bio-Rad (Hercules, CA) abgetrennt. Ein 50 mM Hepes-Puffer (pH 7,2) mit 1 mM EDTA und 0,3 mM EGTA wird bei der Abtrennung verwendet, die bei 4 °C durchgeführt wird. Die [¹²⁵I]-Microcystin-YR enthaltende Fraktion, die an Proteinphosphatase 2A bindet, wird gesammelt und die Radioaktivität durch Szintillationszählung quantifiziert. Nicht-spezifische Bindung von [¹²⁵I]-Microcystin-YR wird in einer Kontrollreaktion detektiert, in der Microcystin-LR im Überschuss (1 μM) zugegeben wird.
Beispiel 1
Proteinphosphatase 2A wird an Magnetkügelchen gebunden (direkt an die Kügelchen oder über Biotinylierung der Phosphatase). Die immobilisierte Proteinphosphatase wird dann mit der Probe und radiomarkiertem Toxin (z.B. [¹²⁵I]-Microcystin-YR) gemischt. Die immobilisierte Proteinphosphatase wird von dem Reaktionsgemisch durch ein Magnetfeld abgetrennt. Mit der Proteinphosphatase (Magnetkügelchen) assoziierte Radioaktivität wird durch Szintillationszählung detektiert. Die Menge der mit der Proteinphosphatase assoziierten Radiomarkierung nimmt als Funktion von Phosphatase-bindendem Toxin in der Probe ab.
Beispiel 2
Proteinphosphatase 2A wird an Magnetkügelchen gebunden (direkt an die Kügelchen oder über Biotinylierung der Phosphatase). Die immobilisierte Proteinphosphatase wird dann mit Probe und an farbige Kügelchen gebundenes Toxin gemischt. Die immobilisierte Proteinphosphatase wird vom Reaktionsgemisch durch ein Magnetfeld getrennt. Mit der Proteinphosphatase (Magnetkügelchen) assoziierte farbige Kügelchen werden mit bloßem Auge oder in einem Mikroskop bei geringer Vergrößerung (z.B. Nikon TMS) abgeschätzt. Die Menge an farbigen Kügelchen, die mit der Proteinphosphatase (Magnetkügelchen) assoziiert ist, nimmt als Funktion des Phosphatase-bindenden Toxins in der Probe ab.
Beispiel 3
Proteinphosphatase 2A wird an Magnetkügelchen gebunden (direkt an die Kügelchen oder über Biotinylierung der Phosphatase). Immobilisierte Proteinphosphatase wird dann mit Probe und Toxin, das auf immobilisiertes Enzym tragenden Beads immobilisiert ist, gemischt. Das Enzym vermag nach geeigneter Inkubation mit einem chromogenen oder fluorogenen Substrat ein detektierbares Produkt (farbig oder fluoreszent) zu erzeugen. Die immobilisierte Proteinphosphatase wird von dem Reaktionsgemisch durch ein Magnetfeld abgetrennt. Die mit der Proteinphosphatase (Magnetkügelchen) assoziierte Farbe oder Fluoreszenz wird über Spektroskopie bzw. Fluorometrie gemessen. Die Menge der mit den Magnetkügelchen assoziierten Farbe/Fluoreszenz nimmt als Funktion des Phosphatase-bindenden Toxins in der Probe ab.
Beispiel 4
Szintillations-„Proximity"-Test:
Proteinphosphatase wird biotinyliert und auf Wells immobilisiert, die mit Streptavidin und einem Szintillationsmittel (z.B. FlashPlate PLUS Streptavidin SMP103, bezogen von NEN) vorbeschichtet sind. Die Probe und [¹²⁵I]-Microcystin-YR werden in die Wells gegeben. Die Menge an [¹²⁵I]-Microcystin-YR, das an die immobilisierte Proteinphosphatase gebunden ist, wird durch Szintillationszählung detektiert.
Beispiel 5
Inhibierung der Bindung von [¹²⁵I]-Microcystin-YR an Proteinphosphatase 2A in Gegenwart verschiedener Toxine
Beispiel 6
Effekt exogener Verbindungen auf den kompetitiven Bindungstest im Vergleich mit dem Proteinphosphatasetest
Beispiel 8
Okadainsäure-Äquivalente in Schalentierextrakten bei Bestimmung durch HPLC-Analyse und durch den Proteinphosphatase-Bindungstest
Beispiel 9
Beigefügte Diagramme
1 des beigefügten Diagramms ist ein schematisches Diagramm des kompetitiven Bindungstests zum Nachweis der Proteinphosphatase-bindenden Toxine.
Proteinphosphatase 2A wird mit [¹²⁵I]-Microcystin-YR und einem weiteren, gegen Proteinphosphatase 2A gerichteten Toxin inkubiert. Das Toxin konkurriert mit [¹²⁵I]-Microcystin-YR um die Bindung an die Phosphatase. Die Zugabe einer großen Menge von Toxin führt zu einer verringerten Bindung von [¹²⁵I]-Microcystin-YR an die Phosphatase und umgekehrt. Nachdem sich ein Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, wird das an Proteinphosphatase 2A gebundene [¹²⁵I]-Microcystin-YR von freiem [¹²⁵I]-Microcystin-YR durch Gelfiltrationschromatographie abgetrennt. Die Fraktion, die an die Phosphatase gebundenes [¹²⁵I]-Microcystin-YR enthält, wird gesammelt und die Menge an Radioaktivität durch Szintillationszählung bestimmt.
2 des beigefügten Diagramms zeigt den Effekt steigender Mengen verschiedener Algen-Toxine auf die Bindung von [¹²⁵I]-Microcystin-YR an Proteinphosphatase 2A.
Proteinphosphatase 2A (30 pM) wurde in Gegenwart von 35 pM [¹²⁵I]-Microcystin-YR (1 Ci/13 ng) und 0-100 nM verschiedener, in der Figur angegebener Algentoxine inkubiert. Das an Proteinphosphatase 2A gebundene [¹²⁵I]-Microcystin-YR wurde über Gelfiltrationschromatographie isoliert und die Radioaktivität durch Szintillationszählung bestimmt. Jede Kurve stellt den Durchschnitt von wenigstens drei getrennten Experimenten dar.
3 der beigefügten Diagramme zeigt den IC₅₀ für die Microcystin-LR-Bindung in dem kompetitiven Bindungstest.
Die Bindung von [¹²⁵I]-Microcystin-YR an Proteinphosphatase 2A wurde als das Verhältnis zwischen nicht-gebundenem [¹²⁵I]-Microcystin-YR (Co-Cx) und gebundenem [¹²⁵I]-Microcystin-YR (Cx) gegen die Konzentration von Microcystin-LR gezeichnet. Co repräsentiert die Menge an gebundenem [¹²⁵I]-Microcystin-YR bei Fehlen von Microcystin-YR, und Cx repräsentiert die Menge an gebundenem [¹²⁵I]-Microcystin-YR in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Microcystin-LR.
4 der beigefügten Diagramme zeigt die Stabilität des an Proteinphosphatase 2A gebundenen [¹²⁵I]-Microcystin-YR in Gegenwart von überschüssigem Microcystin-LR.
Proteinphosphatase 2A (1 nM) wurde in Gegenwart von [¹²⁵I]-Microcystin-YR (100 pM) 1 Stunde inkubiert. Microcystin-LR (2 μM) wurde zum Zeitpunkt 0 dem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Menge von [¹²⁵I]-Microcystin-YR, das an Proteinphosphatase 2A gebunden war, wurde für die angegebenen Zeitpunkte durch Gelfiltration und Szintillationszählung wie beschrieben bestimmt. Die Kurve repräsentiert einen Durchschnitt von vier getrennten Experimenten.

Claims

Testmethode zur Bestimmung von auf Phosphatase zielenden Toxinen, welche Proteinphosphatasen inhibieren, wobei man einen festen Träger, der einen daran immobilisierten Liganden aufweist, in Kontakt bringt mit: (i) einer Probe von der man annimmt, dass sie mit Toxin kontaminiert ist und (ii) einem nicht-immobilisierten Liganden, wobei der immobilisierte Ligand befähigt ist zur Bindung an wenigstens eines der Toxine, an den nicht-immobilisierten Liganden oder an Komplexe des Toxins und des nicht-immobilisierten Liganden, und wobei der nicht-immobilisierte Ligand befähigt ist zur Bindung an wenigstens einen der immobilisierten Liganden, an das Toxin oder an Komplexe aus dem Toxin und dem immobilisierten Liganden, wobei der Anteil des immobilisierten Liganden, gebunden von dem Toxin, von dem nicht-immobilisierten Liganden oder Komplexen des Toxins und des nicht-immobilisierten Liganden abhängig ist von Toxingehalt der Probe und worin der immobilisierten Liganden und/oder nicht-immobilisierte Toxin-bindende Ligand ein Proteinphosphatase-Enzym ist und worin der immobilisierte Ligand befähigt ist, ein direkt oder indirekt nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn er nicht komplexiert ist, wenn er mit dem Toxin komplexiert ist, wenn er mit einem Komplex aus dem Toxin und dem nicht-immobilisierten Liganden komplexiert ist, oder wenn er mit dem nicht-immobilisierten Liganden komplexiert ist; oder der nicht-immobilisierte Ligand befähigt ist, ein direkt oder indirekt nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn er unkomplexiert oder komplexiert vorliegt; eine gebundene Fraktion von einer nicht-gebundenen Fraktion trennt; und direkt oder indirekt den nicht-immobilisierten Liganden, gebunden an den immobilisierten Liganden (die gebundene Fraktion) oder in nicht-komplexierter Form in wässriger Lösung (die nicht-gebundene Fraktion) bestimmt; wobei die Anwendung von (i) und (ii) auf den festen Träger voneinander getrennt, nacheinander oder gleichzeitig und bei getrennter oder sequenzieller Anwendung, in beliebiger Reihenfolge durchführbar ist.
Testmethode nach Anspruch 1, worin das auf Phosphatase zielende Toxin von Algen oder Cyanobakterien produziert wird.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin das zu bestimmende Toxin ein Hepatotoxin oder Okadainsäure ist.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die in der Probe vorliegenden Toxinmoleküle mit dem nicht-immobilisierten Liganden um eine limitierte Anzahl von Bindungsstellen auf dem immobilisierten Liganden kompetitieren und jegliches in der Probe vorliegende Toxin relativ zu dem Maß an nicht-immobilisierten Liganden bestimmt wird, der an die Bindungsstellen des immobilisierten Liganden gebunden oder nicht gebunden ist.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Vorliegen oder das Fehlen eines auf Phosphatase zielenden Toxins bestimmt wird.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die untersuchte Probe die Oberfläche oder die freie Flüssigkeit eines Schalentiers, oder Wasser aus dem Habitat, in welchem ein solches Schalentier lebt, oder Wasser aus der Hauswasserversorgung ist.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der immobilisierte oder nicht-immobilisierte Ligand ein Antikörper oder Antikörperfragment ist.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Protein Phosphatase-Enzym der Proteinphosphatase 2A-Bindungsligand ist.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin entweder der immobilisierte oder der nicht-immobilisierte Ligand einen Reporter-Rest trägt.
Testmethode nach Anspruch 9, worin der nicht-immobilisierte Ligand einen Reporter-Rest trägt.
Testmethode nach Anspruch 10, worin der nicht-immobilisierte Ligand ein markiertes Peptid Heptatoxin oder markierte Okadainsäure ist.
Testmethode nach Anspruch 11, worin das Hepatotoxin ausgewählt ist unter Nodularin, Microcystin LR oder Microcystin YR.
Testmethode nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der feste Träger ein Messstäbchen oder eine feste Matrix ist.
Testmethode nach Anspruch 13, worin als feste Matrix Polymerkügelchen oder Magnetkügelchen verwendet werden.
Kit zur Detektion von auf Phosphatase zielenden Toxinen, welche Proteinphosphatasen inhibieren, wobei der Kit umfasst: eine feste Phase, auf welcher ein Ligand immobilisiert ist; einen nicht-immobilisierten Liganden, vorzugsweise in wässriger Lösung oder komplexiert mit dem immobilisierten Liganden; und worin der immobilisierte und/oder nicht-immobilisierte Ligand ein Proteinphosphatase-Enzym ist; wobei weder der immobilisierte noch der nicht-immobilisierte Ligand einen direkt oder indirekt detektierbaren Rest enthält; oder einen Reporter-Rest, der zur Bindung an einen der immobilisierten und nicht-immobilisierten Liganden und zur Erzeugung eines detektierbaren Signals befähigt ist, wobei vorzugsweise der detektierbare Rest oder das detektierbare Signal ohne Laborausrüstung ablesbar ist.
Kit nach Anspruch 15, wobei das auf Phosphatase zielende Toxin von Algen oder Cyanobakterien produziert wird.
Kit zum Nachweis eines auf Phosphatase zielenden Toxins, welches Proteinphosphatasen inhibiert, wobei der Kit umfasst: einen festen Träger, auf welchen ein Proteinphosphatase-Enzym als Toxin-bindender Ligand immobilisiert ist; und ein Reporter-Molekül, welches zur kompetitiven Inhibition des Bindung von auf Phosphatase zielenden Toxinen an den Toxin-bindenden Liganden und zur Erzeugung eines ohne Laborausrüstung ablesbaren Signals befähigt ist.
Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Kit magnetisch entfernbare polymere Mikrokügelchen umfasst, worauf eine Proteinphosphatase immobilisiert ist; und Goldsol-markierte Peptidhepatotoxin-Moleküle, welche zur kompetitiven Inhibierung der Bindung von cyanobakteriellen Toxinen an die Proteinphosphatase befähigt sind.
Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Kit magnetisch entfernbare polymere Mikrokügelchen umfasst, auf denen eine Proteinphosphatase immobilisiert ist; und Goldsol-markierte Okadainsäuremoleküle, welche zur kompetitiven Inhibierung der Bindung von Algentoxinen an die Proteinphosphatase befähigt sind.
Kit zur Detektion von auf Phosphatase zielenden Toxinen, welche Proteinphosphatasen inhibieren, wobei der Kit umfasst: eine feste Phase, auf welcher ein Ligand immobilisiert ist; einen nicht-immobilisierten Liganden, vorzugsweise in wässriger Lösung oder komplexiert mit dem immobilisierten Liganden; und worin der immobilisierte und/oder nicht-immobilisierte Ligand ein Proteinphosphatase-Enzym ist; wobei einer der immobilisierten und nicht-immobilisierten Liganden einen Reporter-Rest trägt, der zur Erzeugung eines detektierbaren Signals befähigt ist, wobei vorzugsweise das detektierbare Signal ohne Laborausrüstung ablesbar ist.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 15 bis 20 zur Bestimmung von auf Phosphatase zielenden Toxinen.