본 발명의 목적은 TRPV2에 특이적으로 활성을 나타내는 활성제인 프로베네시드를 이용하여 TRPV2 활성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로베네시드(Probenecid)를 포함하는 TRPV2(transient receptor potential vanilloid 2) 활성제를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 뉴런을 배양한 후 프로베네시드를 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 뉴런의 TRPV2 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 측정치를 프로베네시드가 비처리된 뉴런의 TRPV2 활성 측정치와 비교하여 TRPV2 양성 반응을 나타낸 뉴런을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 양성 뉴런의 분리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 뉴런을 배양한 후 프로베네시드 및 TRPV2 비특이적 활성제를 순차적으로 또는 역순으로 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 측정치를 프로베네시드 및 TRPV2 비특이적 활성제가 비처리된 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성 측정치와 비교하여 TRPV2 비특이적 활성제에는 양성 반응을 나타내지만 프로베네시드에는 음성 반응을 나타내는 뉴런을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 음성 뉴런의 분리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) TRPV2 양성 뉴런에 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리하는 단계;
2) TRPV2 음성 뉴런에 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리하는 단계;
3) 단계 1) 및 단계 2)의 처리된 TRPV2 양성 뉴런 및 TRPV2 음성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 각각의 측정치를 프로베네시드만 처리된 TRPV2 양성 뉴런의 활성 측정치와 비교하여 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리한 TRPV2 양성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성을 억제하고 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리한 TRPV2 음성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성에 영향을 주지 않는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) TRPV2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드가 숙주세포에 형질도입된 형질전환체를 제조하는 단계;
2) 상기 형질전환체에 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리 하는 단계;
3) TRPV2 음성 뉴런에 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리하는 단계;
4) 단계 2) 및 단계 3)의 처리된 형질전환체 및 TRPV2 음성 뉴런의 TRPV2 칼슘 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 각각의 측정치를 프로베네시드만 처리된 형질전환체의 TRPV2 활성 측정치와 비교하여 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리한 형질전환체의 칼슘 이온 채널 활성을 억제하고 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리한 TRPV2 음성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성에 영향을 주지 않는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검체에 프로베네시드와 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 투여하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 피검체의 침해성 행동 유발을 측정하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 측정치를 프로베네시드만 처리된 피검체의 침해성 행동 유발 측정치와 비교하여 후보물질의 침해성 행동을 유발하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 활성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 프로베네시드(Probenecid)를 포함하는 TRPV2(transient receptor potential vanilloid 2) 활성제를 제공한다.
상기 프로베네시드는 TRPV2의 활성을 촉진하는 역할을 수행한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 프로베네시드 및 TRPV2 활성제로 알려진 2-APB(2-aminoethoxydiphenyl borate)가 TRPV2에 미치는 영향을 팻취클램프 기법의 일종인 전세포 전압 클램프 실험 및 세포내 칼슘 농도 변화 측정 기술의 일종인 칼슘 이미지화로 확인한 결과 상기 두 물질이 TRPV2의 활성을 촉진하는 것으로 나타났고(도 1a 참조), 상기 활성은 일반적인 TRP 통로 활성 억제제(pore blocker)인 루테늄 레드(ruthenium red)에 의해 억제되었다(도 1b 참조). 즉, 프로베네시드에 반응한 모든 세포들은 2-APB에 대해서도 반응하였다. 또한, 프로베네시드 및 2-APB에 반응한 상기 전류들은 TRPV2-관련 전류의 전형적인 특성을 나타내는 외향 정류 현상(outward rectifying)을 나타내었다.
또한 상기 프로베네시드는 TRPV2를 특이적으로 활성화하는 역할을 수행한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 삼차 신경절 감각 뉴런에서 발현되는 것으로 알려진 TRP 중에서 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1), TRPV1, TRPV3, TRPV4 및 TRPM8(Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 8)를 발현하는 형질전환 세포주에서 프로베네시드에 의한 활성을 측정한 결과, 활성이 나타나지 않았다(도 1d 참조). 즉, 프로베네시드는 TRPV2에 대해서만 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 삼차 신경절 뉴런에서 발생한 프로베 네시드-유발 칼슘 유입의 대부분은 2-APB(도 2a 및 도 2c 참조; 60개의 뉴런 중 59개의 뉴런이 반응함)에 대한 반응이었고, 나머지 화학물질에 대해서는 프로베네시드-유도성 세포내 칼슘 증가를 나타내지 않았다. 즉, 삼차 신경절 뉴런은 2-APB에 대해 넓은 감수성을 나타내었다(전체 뉴런의 46.8%). 또한 캡사이신(capsaicin)에 대해 반응성을 나타내는 뉴런 중에서 프로베네시드에 대한 감수성을 나타내는 작은 그룹이 발견되었다(n = 111 개중 5개). 2-APB-감수성군 중에서 40.2%는 캡사이신(TRPV1 발현자로 추정)에도 반응을 나타내었다. 즉, 2-APB 처리에 의해 상승된 칼슘량을 나타내는 많은 뉴런은 알려지지 않은 2-APB 감수성 성분 또는 TRPV3을 가질 가능성을 나타낸다. 복합적인 감각기관 화학물질로 처리된 삼차 신경절 뉴런의 전체적인 반응 양상은 특정 소규모 뉴런이 프로베네시드 반응자를 구성하는 것을 시사한다. 또한, 2-APB-감수성 삼차 신경절 뉴런에서의 프로베네시드-유발 전류가 외향 정류현상을 나타내었고, 전세포 전압 클램프 실험에서 루테늄 레드에 의해 차단되었다(도 2b 참조).
프로베네시드는 TRPV2에만 특이적인 활성을 나타내므로, 감각 신경세포 중에 TRPV2 양성 세포만을 분리하는 데에 유용하게 사용될 수 있어서, 상기 감각 신경세포의 통각 감지 성격(예: 열, 화학적 및 기계적 자극에 대한 감수성)의 파악 및 특히 취약한 질환(예: 염증성, 신경병증성 및 약물부작용의 통증)의 판별이 가능할 수 있다. 또한, 상기 프로베네시드를 동물에 투여하여 통증행동반응 강도를 측정함으로써 상기 TRPV2 활성이 실제 행동반응으로 외삽되는 지를 확인할 수 있고, 또한 이를 통해 여러 통증 중 TRPV2의 관련 통증을 판별할 수 있을 것이다. 아울러, TRPV2 활성 억제제 개발에도 유용하게 사용될 것이다. 즉, TRPV2 활성제 개발의 경우, TRPV2 활성 후보물질의 표준 물질로 사용될 수 있을 것이다. 또한, TRPV2 활성 억제제 개발의 경우, TRPV2 활성 억제제 후보물질이 프로베네시드에 의한 TRPV2 활성화를 차단하는지 여부를 확인하는 데에 이용될 수 있을 것이다. 아울러, 상기 프로베네시드는 현재까지 알려진 유일한 TRPV2 특이적 활성제이므로 이의 화학적 가공을 통해 더욱 높은 강도의 활성제 또는 활성 억제제로 변화시킬 수 있도록 활용할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 뉴런을 배양한 후 프로베네시드를 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 뉴런의 TRPV2 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 측정치를 프로베네시드가 비처리된 뉴런의 TRPV2 활성 측정치와 비교하여 TRPV2 양성 반응을 나타낸 뉴런을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 양성 뉴런의 분리 방법을 제공한다.
상기 피검체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 더욱 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다. 상기 프로베네시드는 10 내지 1000 μM의 농도로 처리하는 것이 바람직하다. 또한, 단계 1)의 TRPV2 비특이적 활성제는 2-APB(2-aminoethoxydiphenyl borate), 캡사이신(capsaicin), 계피알데히드(cinnamaldehyde) 및 멘톨(menthol) 등이 TRPV2를 포함하는 thermoTRP 군(temperature-sensitive transient receptor potential ion channels)의 활성 활성제로 알려진 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 단계 3)의 TRPV2 활성의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 세포막 전류를 증폭하여 그 변화를 측정할 수 있는 전세포 전압 클램프 기술 및 TRPV2가 칼슘 이온 등의 양이온을 이동시키는 데에서 착안한 세포내 칼슘 농도 변화 측정 기술인 칼슘 이미지화에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 약리학적 결과 및 전류-전압 프로파일링 방법을 이용하여 삼차 신경절 뉴런에서 프로베네시드에 의해 반응성이 특이적으로 나타난 것을 확인하였다(도 2a-2c 참조). 또한, 프로베네시드 감수성 뉴런(도 2d의 2 참조)의 70% 이상은 넓은 직경의 뉴런에서 발견되었는데(> 25 ㎛의 세포체 직경), 이는 이전에 보고된 결과와 동일하다. 그러므로, 상기 삼차 신경절 뉴런의 크기분석, 약리학적 결과 및 전류-전압 프로파일링을 결과를 통합적으로 분석함으로써, TRPV2 활성 억제제 및 활성제의 선별이 가능할 뿐만 아니라, 신규 TRPV2 활성제인 프로베네시드를 사용하여 TRPV2-양성 뉴런을 약리학적으로 분리될 수 있음을 시사하였다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 뉴런을 배양한 후 프로베네시드 및 TRPV2 비특이적 활성제를 순차적으로 또는 역순으로 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 측정치를 프로베네시드 및 TRPV2 비특이적 활성제가 비처리된 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성 측정치와 비교하여 TRPV2 비특이적 활성제에는 양성 반응을 나타내지만 프로베네시드에는 음성 반응을 나타내는 뉴런을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 음성 뉴런의 분리 방법을 제공한다.
또한, 단계 3)의 TRPV2 칼슘 이온 채널 활성의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 전세포 전압 클램프 기술 및 세포내 칼슘 농도 변화 측정 기술인 칼슘 이미지화에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) TRPV2 양성 뉴런에 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리하는 단계;
2) TRPV2 음성 뉴런에 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리하는 단계;
3) 단계 1) 및 단계 2)의 처리된 TRPV2 양성 뉴런 및 TRPV2 음성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 각각의 측정치를 프로베네시드만 처리된 TRPV2 양성 뉴런의 활성 측정치와 비교하여 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리한 TRPV2 양성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성을 억제하고 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리한 TRPV2 음성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성 에 영향을 주지 않는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 TRPV2 양성 뉴런 및 TRPV2 음성 뉴런은 본 발명의 방법에 의해 분리되는 것을 특징으로 한다. 단계 1)의 후보물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
1) TRPV2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드가 숙주세포에 형질도입된 형질전환체를 제조하는 단계;
2) 상기 형질전환체에 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리하는 단계;
3) TRPV2 음성 뉴런에 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리하는 단계;
4) 단계 2) 및 단계 3)의 처리된 형질전환체 및 TRPV2 음성 뉴런의 TRPV2 칼슘 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 각각의 측정치를 프로베네시드만 처리된 형질전환체의 TRPV2 활성 측정치와 비교하여 프로베네시드 및 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 처리한 형질전환체의 칼슘 이온 채널 활성을 억제하고 상기 TRPV2 활성 억제제 후보물질 및 TRPV2 비특이적 활성제를 처리한 TRPV2 음성 뉴런의 칼슘 이온 채널 활성에 영향을 주지 않는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, HEK 세포주, CHO 세포주, HeLa 세포주, RBL-2H3 세포주 등의 칼슘 채널 활성 연구 및 고효율 억제제 검색에 이용할 수 있는 세포주가 바람직하다. 단계 2)의 프로베네시드는 TRPV2만을 특이적으로 활성화하는 작용을 수행한다. 이미 THC(Delta9-tetrahydrocannabinol) 및 2-APB가 TRPV2를 활성 시키는 것으로 알려져 있으나, TRPV2만을 특이적으로 활성화하지는 못한다. 즉, THC는 TRPA1도 활성시키고 2-APB는 TRPV1 및 TRPV3도 활성화한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 감각 뉴런에서 발현되는 것으로 알려진 TRP 중에서 TRPV2를 발현하는 형질전환 세포주에서만 프로베네시드에 의한 활성을 나타냈다(도 1d 참조). 상기 프로베네시드는 10 내지 1000 μM의 농도로 처리하는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 프로베네시드의 TRPV2에 대한 EC50(effective concentration 50%: 50% 효과 농도)은 31.9 μM이었고, 최대 유효량은 대략 1 mM이었다. 이것은 프로베네시드가 마이크로몰라 농도의 범위에서 TRPV2에 활성 효과를 나타내는 것을 시사한다(도 1c 참조).
아울러, 본 발명은
1) 피검체에 프로베네시드와 TRPV2 활성 억제제 후보물질을 투여하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 피검체의 침해성 행동 유발을 측정하는 단계; 및,
3) 단계 2)의 측정치를 프로베네시드만 처리된 피검체의 침해성 행동 유발 측정치와 비교하여 후보물질의 침해성 행동을 유발하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV2 활성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 피검체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 더욱 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물이며, 그 보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다. 또한 단계 2)의 프로베네시드는 10 내지 100 mM의 농도로 투여하는 것이 바람직하다. 단계 2)의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여 방법이 바람직하고, 피내 투여가 가장 바람직하다. 단계 3)의 침해성 행동 유발의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 염증성 감작 유발에 의한 뒷발 핥기/튀기기 행동 분석에 의해 수행될 수 있다. 상기 염증성 감작은 상기 프로베네시드 주사 전에 카라기난(carrageenan) 또는 CFA(complete Freund's adjuvant)를 주사하여 유발할 수 있다.
TRPV2는 가는 유수성 침해 수용체(thinly myelinated nociceptors)에서 발현되는 통각 기관(pain sensor)에서 필요하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 프로베네시드 처리에 의해 침해성(nocifensive) 행동을 실제로 유발할 수 있는지를 시험하였다. 우선, 구두 기피 행동 검사를 통해 상기 프로베네시드 투여 시 물 또는 사료 섭취에 영향을 나타낼 수 있는 구두 기피가 발생하지 않을 것을 확인한 후(도 3a 참조), 뒷발에 카라기난 또는 CFA에 의해 염증을 일으킨 쥐에서 프로베네시드 투여한 결과, 프로베네시드를 포함하지 않는 부형액만 투여한 군에서는 행동성 반응이 유발되지 않았으나, 프로베네시드를 투여한 군에서는 행동 소요 시간의 현저한 증가를 나타내었다(도 3b 내지 3f 참조).
본 발명의 프로베네시드는 TRPV2에만 특이적으로 작용하여, TRPV2를 발현하는 감각 신경세포만을 분리할 수 있게 할 수 있게 함으로 TRPV2 작용 기작 연구 및 TRPV2 작용 진통제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
TRPV
형질전환 세포주 시료
HEK293T 세포주(ATCC CRL-11268)를 rTRPV1(서열번호 1), rTRPV2(서열번호 2), mTRPV3(서열번호 3), rTRPV4(서열번호 4), mTRPM8(서열번호 5) 및 mTRPA1(서열번호 6) 플라스미드 DNA를 이용하여 일시적(transiently) 형질전환하였다.
구체적으로, HEK293T 세포주를 각각 35 ㎜ 디쉬 당 3 ㎍의 rTRPV1, rTRPV2, mTRPV3, rTRPV4, mTRPM8 및 mTRPA1 플라스미드 DNA 및 600 ng/웰의 pCDNA3(Invitrogen Corp., USA; 녹색 형광 단백질 cDNA 포함)로 Fugene6(Roche DiagnosticsCorp., 미국)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 형질전환하였다. 상기 형질전환된 세포를 24 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양한 후, 폴리-L-라이신 코팅된 유리 커버 슬립에 도말한 후, 10 내지 24 시간 동안 추가 배양하였다.
<
실시예
2> 삼차 신경절 뉴런 시료
차가운 PBS에서 성체 ICR계 마우스(한림실험동물연구소, 한국)의 삼차 신경절(trigeminal ganglia)을 분리하여 세절한 후, 1.5 ㎎/㎖ 콜라지나아제/디스파아제(collagenase/dispase; Roche Diagnostics Corp., USA)를 37℃에서 45분 동안 처리 및 0.25% 트립신(Invitrogen Corp., USA)를 15분 동안 처리하였다. 상기 방법으로 제조한 삼차 신경절 뉴런을 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 5 ng/㎖ 2.5S NGF(Invitrogen Corp., USA)를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 폴리-L-라이신 코팅된 유리 커버 슬립에 도말한 후, 48 내지 72시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
<
실험예
1>
TRPV2
의
프로베네시드(probenecid)와
2-APB(2-
aminoethoxydiphenyl
borate)에 대한 반응 조사
<1-1>
프로베네시드와
2-
APB
처리
실시예 1의 방법으로 제조한 TRPV2 형질전환 세포주에 100 μM 프로베네시 드(Probenecid; Sigma-Aldrich, USA)와 300 μM 2-APB(2-aminoethoxydiphenyl borate; Cayman Chemical, USA)를 처리하였다. 상기 화학물질들의 저장 용액은 물, DMSO 또는 에탄올을 이용하여 제조하였고, 사용하기 직전에 검사용액으로 희석하여 사용하였다.
<1-2> 전세포 전압 클램프 실험
상기 실험예 1-1의 방법으로 처리된 형질전환 세포에 팻취클램프 기법의 일종인 전세포 전압 클램프(Whole-cell voltage clamp) 기록을 Bandell M 외(Neuron 41:849-857, 2004)의 방법에 따라 수행하였다.
구체적으로, 세포외 용액(extracellular solution, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES를 포함하고 NaOH를 이용하여 pH 7.4로 적정)과 파이펫 용액(pipette solution; 140 mM CsCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2.0 mM MgATP, 0.2 mM NaGTP를 포함하고 CsOH를 이용하여 pH 7.2로 적정)을 이용하였다. 또한 250 ㎳ 동안 -60 ㎷, -80 ㎷에서 + 80 ㎷로 325초 동안 전압경사, 250 ㎳ 동안 -60 ㎷로 되돌리는 조건을 지속적으로 반복하여 인터스윕(intersweep) 구간이 없이 실험을 수행하였다. 상기 실험은 5회 반복수행하였다.
그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이 프로베네시드를 처리하자마자 전류의 현저한 증가가 생성되었고, 상기 세포는 또한 TRPV2 활성제로 알려진 2-APB 처리에 의해서도 이에 버금가는 반응을 나타내었다(도 1a). 즉, 프로베네시드에 반응한 모든 세포들은 2-APB에 대해서도 반응하였다. 프로베네시드 및 2-APB에 반응한 상 기 전류들은 TRPV2-관련 전류의 전형적인 특성을 나타내는 외향 정류현상(outward rectifying)을 나타내었다.
<
실험예
2> 루테늄
레드에
의한
TRPV2
의
프로베네시드와
2-
APB
에 대한 반응의 억제 조사
실시예 1의 방법으로 제조한 TRPV2 형질전환 세포주에 100 μM 프로베네시드, 100 μM 프로베네시드 + 20 μM 루테늄 레드(ruthenium red; Sigma-Aldrish, USA) 및 300 μM 2-APB를 각각 처리하였다. 상기 화학물질들의 저장 용액은 물, DMSO 또는 에탄올을 이용하여 만들었고, 사용하기 직전에 검사용액으로 희석하여 사용하였다. 이후 실시예 1-2의 방법과 동일한 방법으로 상기 실험예 2-1의 방법으로 처리된 형질전환 세포에 전세포 전압 클램프 기록을 수행하였다.
그 결과, 도 1b에 나타나 바와 같이 일반적인 TRP 통로 활성 억제제(pore blocker)인 루테늄 레드에 의해 도 1a에서 나타낸 프로베네시드에 의한 반응이 억제되었다.
<
실험예
3>
TRPV2
의
프로베네시드
특이적 및 농도 의존적 반응 조사
<3-1>
프로베네시드와
2-
APB
처리
실시예 1의 방법으로 제조한 TRPV2 형질전환 세포주에 100 μM 프로베네시드와 300 μM 2-APB를 처리하였다.
<3-2>
프로베네시드의
농도별 처리
실시예 1의 방법으로 제조한 TRPV2 형질전환 세포주에 0.1에서 1,000 μM까지 농도를 점진적으로 증가시키며 프로베네시드를 처리하였다.
<3-3> 칼슘 이미지화를 이용한
세포내
칼슘수준변화 측정
상기 실험예 3-1의 방법으로 처리된 형질전환 세포에 칼슘 이미지화를 수행하였다.
구체적으로, 0.02% 풀루로닉산(pluronic acid; Invitrogen Corp., USA)을 포함하는 배스 용액(bath solution, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES를 포함하고 NaOH를 이용하여 pH 7.4로 적정)에서 상기 실험예 3-1의 방법으로 처리된 형질전환 세포에 Fluo-3AM(5 μM; Sigma aldrich, USA)을 37℃에서 1시간 동안 주입하였다. 이후, LSM5 Pascal 공초점 현미경(Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 칼슘 이미지화(Calcium imaging)를 수행하였고, Carl Zeiss ratio tool software(Carl Zeiss, 독일)를 이용하여 저속촬영이미지(time-lapse image; 488 ㎚ 여기/514 ㎚ 방출)를 매 3초마다 저장하였다. 힐 플랏(Hill plot; Kd 값: 31.9 μM, n 값: 2.8)에 의해 칼슘 유입 반응의 평균 수치(각 실험값 당 n=12-62) 곡선을 작성하였다.
그 결과, Fluo-3 칼슘 이미지화 실험(n = 59)에서도 도 1a에서와 마찬가지로 TRPV2-특이 반응 결과를 나타내었다.
또한, 도 1c에서 나타난 바와 같이 프로베네시드의 TRPV2에 대한 EC50(effective concentration 50%: 50% 효과 농도)은 31.9 μM이었고, 최대 유효량 은 대략 1 mM이었다. 이것은 프로베네시드가 마이크로몰라 농도의 범위에서 TRPV2에 활성 효과를 나타내는 것을 시사한다.
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실험예
4>
TRP
형질전환 세포주별
프로베네시드에
대한 반응 조사
실시예 1의 방법으로 제조한 TRPA1, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 및 TRPM8 형질전환 세포주 및 형질전환되지 않은 HEK 세포주(대조군)에 100 μM 프로베네시드를 처리하였다. 이후 실시예 3-2의 방법과 동일한 방법으로 상기 방법으로 처리된 형질전환 세포에 칼슘 이미지화를 수행하였다.
그 결과, 도 1d에서 나타낸 바와 같이 삼차 신경절 뉴런에서 발현되는 것으로 알려진 상기 5개의 TRP 중에서 TRPV2만이 프로베네시드에 의해 활성을 나타내었다.
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실험예
5> 삼차 신경절 뉴런에서
프로베네시드에
대한 반응 조사
실시예 2의 방법으로 처리된 삼차 신경절 뉴런에 프로베네시드 100 μM 및 상기 네 개의 TRP 활성제: TRPM8에 대한 활성제 멘톨 400 μM, TRPA1에 대한 활성제 계피알데히드(Cinnamaldehyde; MP Biomedicals, USA) 300 μM, TRPV1에 대한 활성제 캡사이신(capsaicin: Sigma-aldrich, USA) 2 μM 및 TRPV1-3에 대한 활성제 2-APB 300 μM를 처리한 후, 실험예 3-3과 동일한 방법으로 칼슘 이미지화를 수행하였다.
그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이 프로베네시드에 반응하여 칼슘유입되 는 뉴런 그룹을 발견하였다. 즉, 2-APB 반응성 뉴런은 프로베네시드에 반응하였다(도 2a의 3, 4) 그러나 TRPV1/TRPA1 공동-발현자(co-expressors)로 여겨지는 캡사이신-감수성 뉴런의 주요 그룹(도 2a의 1) 및 캡사이신/계피알데히드-감수성 뉴런의 모든 그룹(도 2a의 2)은 프로베네시드-유도성 세포내 칼슘 증가를 나타내지 않았고, TRPM8-양성 뉴런인 멘톨-반응자는 프로베네시드의 첨가에 반응을 나타내지 않았다(도 2a의 5).
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실험예
6> 루테늄
레드에
의한 삼차 신경절 뉴런에서
프로베네시드와
2-
APB
에 대한 반응의 억제 조사
실시예 2의 방법으로 처리된 삼차 신경절 뉴런에 100 μM 프로베네시드, 100 μM 프로베네시드 + 20 μM 루테늄 레드 및 300 μM 2-APB를 각각 처리하였다. 이후 실시예 1-2의 방법과 동일한 방법으로 전세포 전압 클램프 기록을 수행하였다.
그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이 2-APB-감수성 삼차 신경절 뉴런에서의 프로베네시드-유발 전류가 외향 정류현상을 나타내었고, 전세포 전압 클램프 실험에서 루테늄 레드에 의해 차단되었다.
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실험예
7> 삼차 신경절 뉴런에서
프로베네시드와
2-
APB
에 대한 반응 조사
실시예 2의 방법으로 처리된 삼차 신경절 뉴런에 프로베네시드 및 상기 네 개의 TRP 활성제를 복합 처리하였다. 즉, 2-APB 300 μM + 프로베네시드 100 μM 투여군, 2-APB 300 μM + 캡사이신 2 μM 투여군, 2-APB 300 μM + 계피알데히드 300 μM + 캡사이신 2 μM 투여군, 2-APB 300 μM + 캡사이신 2 μM + 프로베네시드 100 μM 투여군, 2-APB 300 μM + 멘톨 400 μM 투여군 및 2-APB 300 μM 단독 투여군으로 나누어 처리한 후, 실험예 3-3과 동일한 방법으로 칼슘 이미지화를 수행하였다.
그 결과, 도 2c에서 나타난 바와 같이 뉴런에서 발생한 프로베네시드-유발 칼슘 유입의 대부분은 2-APB(60개의 뉴런 중 59개의 뉴런이 반응함)에 대한 반응이었다. 즉, 삼차 신경절 뉴런은 2-APB에 대해 넓은 감수성을 나타내었다(전체 뉴런의 46.8%). 또한 캡사이신에 대해 반응성을 나타내는 뉴런 중에서 프로베네시드에 대한 감수성을 나타내는 작은 그룹이 발견되었다(n = 111 개중 5개). 2-APB-감수성군 중에서 40.2%는 캡사이신(TRPV1 발현자로 추정)에도 반응을 나타내었다. 즉, 2-APB 처리에 의해 상승된 칼슘량을 나타내는 많은 뉴런은 알려지지 않은 2-APB 감수성 성분 또는 TRPV3을 가질 가능성을 나타낸다. 프로베네시드-감수성의 7.7%가 캡사이신 반응을 나타내었고, 캡사이신-감수성의 3.5%가 프로베네시드 반응성을 나타내었다. 복합적인 감각기관 화학물질로 처리된 삼차 신경절 뉴런의 전체적인 반응 양상은 특정 소규모 뉴런이 프로베네시드 반응자를 구성하는 것을 시사한다. 모든 뉴런들은 중간 크기였고, n=5이다.
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실험예
8>
프로베네시드
-감수성 뉴런의 크기 측정
프로베네시드-감수성 뉴런의 세포체 크기를 현미경 축적과 눈금자를 이용하여 측정한 후, 크기 분류에 따라 반응한 뉴런 개수 대 전체 뉴런 개수의 비율을 측 정하였다.
그 결과, 도 2d에서 나타난 바와 같이 프로베네시드 감수성 뉴런(도 2d의 2)의 70% 이상은 넓은 직경의 뉴런에서 발견되었다(> 25 ㎛의 세포체 직경). 반대로 캡사이신-감수성 뉴런(도 2d의 1)은 작은 크기에서 중간 크기의 뉴런(10-25 ㎛)에서 발견되었다. TRPV2 발현 뉴런은 주로 중간 크기에서 넓은 직경의 뉴런에서 발견되는 것으로 알려져 있고, 동일한 결과가 본 발명에서도 수득되었다.
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실험예
9> 구두 기피 행동 검사
구두 기피 행동(oral aversion) 검사는 Caterina MJ 외(Science 288:306-313, 2000) 및 Kwan KY 외(Neuron 50: 277-289, 2006)의 방법에 따라 수행하였다.
구체적으로, 임의로 사육된 성체 ICR 마우스에 0.125% 사카린(Sigma aldrich, USA)을 포함한 물을 하루에 오직 3시간 동안만 마시게 하였다. 유체병에 매일 물과 사료 소비량을 측정하여 4일 동안 지속적으로 주입하였다. 4일째에 20 mM 프로베네시드를 포함하는 물을 3시간 동안 공급하였다. 통계적 자료는 양측 꼬리(two-tailed), 쌍을 이루지 않은(unpaired) 스튜던트 검정(Student's t-test)을 이용하여 분석하였고, 평균±S.E.M.의 형태로 나타내었다.
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 프로베네시드 비투여군(n=5)과 비교하여 유의있는 차이도 없고 프로베네시드 처리 3일 전의 보통의 물 섭취율 및 사료 섭취율과 프로베네시드-포함 물(20 mM)을 공급한 쥐에게서 차이점이 없었다. 상기 결과는 프로베네시드로 처리되었을 때 물 또는 사료 섭취에 영향을 나타낼 수 있는 구두 기피가 발생하지 않을 것을 시사한다.
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실험예
10> 뒷발 핥기/튀기기 행동
<10-1> 염증성
감작
유발
프로베네시드에 의한 염증성 감작(inflammatory sensitization) 반응을 관찰하기 위하여, 오른쪽 뒷발의 발바닥에 상기 프로베네시드 주사 3 시간 전에 50 ㎕의 1% 카라기난(carrageenan; Sigma aldrich, USA)을 주사하거나, 또는 상기 프로베네시드 주사 24 시간 전에 50 ㎕의 CFA(complete Freund's adjuvant; Sigma aldrich, USA)를 주사하였다. 또한, 실험에 앞서 쥐를 1 시간 동안 실험환경에 적응하도록 순화시켰으며, 부형액(3% DMSO 및 0.5% Tween 80을 포함하는 식염수) 및 프로베네시드(20 mM)를 포함하는 부형액 각각 25 ㎖를 쥐의 오른쪽 뒷발에 피내 주사하였다.
<10-2> 급성 핥기/튀기기 행동 분석
뒷발 핥기/튀기기 행동(hindpaw licking/flicking behavior)에 걸린 시간을 Bandell M 외(Neuron 41:849-857, 2004) 및 Moqrich A 외(Science 307:1468-1472, 2005)의 방법에 따라 10분 동안 측정하였다. 통계적 자료는 양측 꼬리(two-tailed), 쌍을 이루지 않은(unpaired) 스튜던트 검정(Student's t-test)을 이용하여 분석하였고, 평균±S.E.M.의 형태로 나타내었다(***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05 and ND, p > 0.05).
그 결과, 프로베네시드를 뒷발의 피내에 주사한 결과, 정상 쥐에서는 행동의 현저한 변화가 발견되지 않았으나, 카라기난으로 3시간 동안 또는 CFA로 1일 동안 국부적으로 염증을 일으킨 쥐에서는 시간이 지남에 따라 행동에 변화가 나타났고(도 3b, 도 3c 및 도 3e), 부형액만 투여한 쥐에서는 효과가 나타나지 않았다(도 3b, 도 3d 및 도 3f). 즉, 상기 결과들은 프로베네시드가 특히 염증성 조건하에서 고통을 유도할 수 있음을 지시한다.
도 1은 프로베네시드의 TRPV2 특이적 활성을 나타낸 도이다(PRO:프로베네시드, RR:루테늄 레드, A1:TRPA1, V1:TRPV1, V2:TRPV2, V3:TRPV3, V4:TRPV4, M8:TRPM8):
a: 100 μM 프로베네시드 처리에 의한 TRPV2-형질전환 HEK293T 세포에서 +60 ㎷ 및 -60 ㎷에서 전세포 전류의 빠른 증가(n=5);
b: 100 μM 프로베네시드, 100 μM 프로베네시드 + 20 μM 루테늄 레드 및 100 μM 프로베네시드 + 300 μM 2-APB 처리에 반응하는 TRPV2의 전류-전압 관련성;
c: Fluo-3 칼슘 이미지화 실험에 의해 결정된 프로베네시드에 대한 반응에 의한 TRPV2 활성의 양적 관계; 및,
d: 프로베네시드 처리에 대한 여러 TRP 형질전환된 세포주의 반응.
도 2 는 TRPV2 활성제 처리에 의한 배양된 마우스 삼차 신경절 뉴런의 반응을 나타낸 도이다(MET: 멘톨, CA: 계피알데히드, CAP: 캡사이신):
a: 뉴런의 약리학적 반응의 대표도(N은 각 뉴런의 개수);
1: 캡사이신-반응성 뉴런은 프로베네시드에 반응하지 않았음;
2: 캡사이신/계피알데히드 반응성 뉴런은 프로베네시드에 반응하지 않았음;
3: 2-APB 반응성 뉴런은 프로베네시드에 반응함;
4: 2-APB 반응성 뉴런은 프로베네시드에 반응함; 및,
5: 멘톨 반응성뉴런은 프로베네시드에 반응하지 않았음;
b: 100 μM 프로베네시드, 100 μM 프로베네시드 + 20 μM 루테늄 레드 및 100 μM 프로베네시드 + 300 μM 2-APB 처리에 반응하는 삼차 신경절 뉴런의 전류-전압 관련성;
c: 2-APB 반응성 뉴런에서 드럭-감수성 뉴런의 조성; 및,
d: 전류 반응이 캡사이신 또는 프로베네시드 처리에 의해 유발된 삼차 신경절 뉴런의 세포체 직경의 분포:
1: 캡사이신-감수성군; 및,
2: 프로베네시드-감수성군.
도 3은 염증성 조건에서 프로베네시드가 고통을 유발하는 것을 나타낸 도이다(VEH:부형액(vehicle), ND:차이없음(no difference), CAR:카라기난(carrageenan), CFA:complete Freund's adjuvant):
[도 3의 선명한 Tif. 또는 jpg 파일을 당소로 송부하여 주시기 바랍니다.]
a: 20 mM 프로베네시드 투여에 의한 매일의 물과 사료 소비량(삼각형: 물 소비, 원형: 사료 소비, 빈 도형; 프로베네시드 투여군);
b: 프로베네시드 처리 전 10분 동안의 쥐의 핥기/튀기기 행동(licking/flicking behavior); 및,
c-f: 여러 염증 유도 물질 처리에 의한 10분 동안의 핥기/튀기기 행 동(licking/flicking behavior)의 소요 시간:
c: 카라기난 + 25 ㎖ 부형액;
d: 카라기난 + 25 ㎖ 부형액 + 20 mM 프로베네시드;
e: CFA + 25 ㎖ 부형액; 및,
f: CFA + 25 ㎖ 부형액 + 20 mM 프로베네시드.