KR20210150011A

KR20210150011A - 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20210150011A
Application number: KR1020200066862A
Authority: KR
Inventors: 오주형; 오승예; 최병일; 잭 루빈스틴
Original assignee: 주식회사 삼오파마켐
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-12-10
Also published as: WO2021246779A1

Abstract

본 발명은 프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체, 이를 포함하는 심부전 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법{AN AMIDE DERIVATIVES OF PROBENECID AND ARGININE, A PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND A PREPARATION METHOD OF THEREOF}

본 발명은 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체, 이를 포함하는 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

이온 채널은 모든 세포의 세포 막을 통한 이온의 흐름을 조절하는 세포 단백질로서, 상이한 이온들(칼슘, 칼륨, 염소 이온 등)에 대한 자체의 선택적 투과성에 따라 분류된다. 칼슘 이온의 흐름을 조절하는 칼슘 채널 수용체는 동물의 다양한 장기에서 발견되는 여러 양이온 채널 중 하나이다. 여러 양이온 채널 중, TRPV2(Transient receptor potential vanilloid 2)는 심혈관 구조 및 기능 조절에 주요한 영향을 미치며, TRPV2가 결핍된 심장은 그 기능이 손상된 것으로 보여졌다. 이에, TRPV2가 심근세포에 존재하며 활성을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.

종래에 심근 수축 항진제로 사용되고 있는 Digoxin은 실질적으로 유일한 심부전 치료제로 알려져 있으나, 독성 문제와 심근 수축 기능의 저하 문제 등의 이유로 사용에 제한이 많은 상황이다. 또한 Digoxin 외에 Dobutamine 이나 Milrinone 등이 대안으로 사용되고 있으나, 이들 제제는 정맥 주사용 제제로 경구 투여용 제제가 없어 사용에 제한이 따르며, 심장 박동 항진의 부작용으로 인해 사용에 제한이 많은 상황이다.

이와 관련하여, Jack Rubinstein 연구팀 등의 최근 연구 결과를 참조하면, 분리된 심근세포(isolated myocytes) 내에서의 TRPV2 심근 수축(inotropy) 및 심근 이완(lusitropy) 메커니즘을 규명하였으며, TRPV2가 칼슘 이온의 일과성 부하 및 근소포체 칼슘 이온 부하를 조절한다는 것과, 이에 따라, TRPV2의 활성이 정상적인 심장 기능에 필수적이며, 프로베네시드(probenecid)에 의한 TRPV2의 아고니즘(agonism)에 따라 심근수축력(contractility)이 증가된다는 것을 확인하였다.

또한 대한민국 등록특허 제10-0951656호에서는 프로베네시드를 유효성분으로 사용하여 TRPV2 활성제 또는 활성 억제제를 스크리닝하기 위한 조성물을 개시하고 있으나, 상기 조성물의 심부전 예방, 개선 또는 치료 효과가 미미하다는 문제를 해결하고 있지 못한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0951656호

본 발명은, 심근세포 내 칼슘 이온의 농도 조절 문제로 인해 발생되는 심부전증에 대해 치료 효과를 나타내는 신규한 유도체, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체를 포함하는 심부전 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로베네시드와 염소화제(Chlorinating agents) 또는 브롬화제(Brominating agents)를 반응시켜, 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드를 합성하는 단계; 상기 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드와 아르기닌 메틸에스테르(Arg-OMe, Arginine methylester)를 반응시켜, 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 합성하는 단계; 및 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 가수분해시켜, 프로베네시드-아르기닌 유도체를 합성하는 단계;를 포함하는 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법을 제공한다.

본 발명의 심부전 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 신규한 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체를 포함하며, 이는 심근세포 내 양이온의 농도를 조절하는 TRPV2에 작용하여 심근세포 내 칼슘 이온의 농도가 적절한 수준으로 조절되게 함으로써 심부전증을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실험 예 1에 따른 심근수축력(contractility) 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험 예 2에 따른 심근 세포의 근절 길이 변화(구획 단축률) 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험 예 2에 따른 심근 세포의 수축 속도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험 예 2에 따른 심근 세포의 이완 속도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 신규한 프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체, 이를 포함하는 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체를 이용한, 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 치료, 예방, 개선, 진단 용도 및 치료, 예방, 개선, 진단 방법을 포함한다.

< 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체 >

상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 프로베네시드와 아르기닌을 반응물로 하여 합성된 생성물로, 구체적으로는, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

상기 아르기닌은 L-아르기닌, D-아르기닌 및 DL-아르기닌을 포함할 수 있으며, 이에 따라, 상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 이의 L-입체이성체, D-입체이성체 및 DL-입체이성체를 포함할 수 있고, DL-입체이성체인 것이 가장 바람직하다.

< 심부전 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물 >

상기 심부전 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체를 포함하며, 상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 이의 L-입체이성체, D-입체이성체, DL-입체이성체 및 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있고, DL-입체이성체를 포함하는 것이 가장 바람직하다.

상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 브롬화수소산염, 질산염, 과염소산염, 인산염, 황산염, 포름산염, 아세트산염, 아코나이트, 아스코르브산염, 벤젠 술폰산염, 벤조산염, 신남산염, 시트르산염, 엠보네이트, 에난트산염, 푸마르산염, 글루탐산염, 글리콜산염, 젖산염, 말레산염, 말론산염, 만델산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염 유래, 프탈산염, 살리실산염, 소르브산염, 스테아르산염, 숙신산염, 주석산염, 톨루엔-p-술폰산염 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 다른 염의 형태도 포함할 수 있다.

상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 심근세포 내 양이온의 농도를 조절하는 TRPV2(Transient receptor potential cation channel subfamily V member 2)에 작용하여, 심근세포 내 칼슘 이온(Ca²⁺)의 농도를 적절한 수준으로 조절하고, 이에 따라, 심근수축력을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, TRPV2는 양이온, 특히 칼슘 이온의 유입(influx)에 의해 변화되는 세포 내 칼슘 이온 농도의 조절에 따라 세포의 수축과 이완을 조절하는데, 활성제(agonist)는 수축 기능 항진, 저해제(inhibitor)는 이완 기능 항진에 영향을 미칠 수 있다. 상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 심근수축력(contractility)을 약 7 내지 12%까지 증가시킬 수 있으며, 심근 세포의 근절 길이 변화를 약 6 내지 11%까지 증가시킬 수 있다.

이에 따라, 상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 심근수축력을 향상시키는 활성제(agonist)로 작용하여 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료에 효과를 가짐을 알 수 있다.

본 발명에서, 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병은, 심부전증, 근육 이완증, 근육통, 통풍, 발기부전, 및 폐동맥고혈압 중 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 심부전증일 수 있다.

본 발명에 따른 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양"으로 투여될 수 있다. "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양"이란, 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여경로, 제거 속도, 치료 지속 기간, 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 이러한 "유효량" 또는 "약제학적으로 유효한 양" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 혈관주사, 복강주사, 피하주사 및 경구 투여 중 하나 이상을 위한 것일 수 있으며, 투여 방법에 따라 적합한 임의의 형태로 제공될 수 있고, 예를 들어, 프리드러그(predrug) 또는 프로드러그(prodrug) 형태를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 사람에게 투여되어, 심부전증에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 대상체의 질병과 체중에 따라 적절하게 투여할 수 있으며, 바람직하게는, 사람의 심부전증 치료를 위해, 상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체를 포함하는 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 경구로 투여하는 경우, 1회 투여량은 100 mg 내지 3000 mg 정도일 수 있으며, 하루에 4회까지 분할 투여 할 수 있다.

본 발명에 따른 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 더 포함할 수 있으며, 구체적인 예로서 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

< 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법 >

본 발명의 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법은, 1) 프로베네시드와 염소화제(Chlorinating agents) 또는 브롬화제(Brominating agents)를 반응시켜, 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드를 합성하는 단계; 2) 상기 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드와 아르기닌 메틸에스테르(Arg-OMe, Arginine methylester)를 반응시켜, 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르(를 합성하는 단계; 및 3) 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르(를 가수분해시켜, 프로베네시드-아르기닌 유도체를 합성하는 단계;를 포함한다.

1) 상기 프로베네시드와 염소화제(Chlorinating agents) 또는 브롬화제(Brominating agents)를 반응시켜, 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드를 합성하는 단계에서, 상기 프로베네시드와 염소화제를 반응시켜, 염화프로베네시드를 합성하는 경우, 하기 반응식 1로 나타낼 수 있고, 상기 프로베네시드와 브롬화제를 반응시켜, 염화프로베네시드를 합성하는 경우, 하기 반응식 2로 나타낼 수 있다.

[반응식 1]

[반응식 2]

상기 염소화제는 프로베네시드를 염소화할 수 있는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 염화티오닐(Thionyl chloride, SOCl₂), 염화술포닐(Sulfuryl chloride, SO₂Cl₂), 염화포스포릴(Phosphoryl chloride, POCl₃) 또는 오염화인(Phosphorus pentachloride, PCl₅)을 사용할 수 있고, 상기 DMF는 촉매로 작용할 수 있다.

상기 브롬화제는 삼브롬화인(Phosphorus tribromide, PBr₃)을 사용할 수 있고, 상기 DMAc는 촉매로 작용할 수 있다.

구체적으로, 프로베네시드(4-(N,N-dipropylsufamoyl)benzoic acid), 과량의 염소화제 또는 브롬화제와 DMF(Dimethylformamide) 또는 DMAc(Dimethylacetamide)를 실온에서 혼합한 뒤, 6 내지 12시간 동안 환류하며 반응시켜, 염화프로베네시드(4-(N,N-dipropylsufamoyl)benzoyl chloride) 또는 브롬화프로베네시드(4-(N,N-dipropylsulfamoyl)benzoyl bromide)를 합성할 수 있다. 상기 염화프로베네시드 또는 상기 브롬화프로베네시드는 감압 하에 용매를 증발시킨 뒤, 톨루엔을 이용하여 공비 증류(azeotrope distillation)시키면 회백색(off white)의 고체상으로 수득될 수 있다.

2) 상기 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드와 아르기닌 메틸에스테르(Arg-OMe, Arginine methylester)를 반응시켜, 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 합성하는 단계는 하기 반응식 3 또는 4로 나타낼 수 있다.

[반응식 3]

[반응식 4]

구체적으로, DMF에 아르기닌 메틸에스테르 염산염(Arg-OMe.2HCl, Arginine methyl ester hydrochloride)을 첨가하고, 약 0℃cold temperature)까지 냉각하여, 4 내지 12 당량(equivalents), 바람직하게는 4 내지 6 당량의 트리에틸아민(triethylamine)을 첨가한 뒤, 이를 교반하면서 상기 염화프로베네시드 또는 상기 브롬화프로베네시드를 첨가하고, 12 내지 24시간 동안 실온에서 격렬하게 교반하여, 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르(methyl 2-(4-(N,N-dipropylsufamoyl)benzamido)-5-guanidinopentanoate)를 합성할 수 있다. 미정제된 상태의 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르에서 불용성 고체를 여과한 뒤, 용매를 증발시키고, 메탄올-디클로로메탄(methanol-dichloromethane) 시스템을 이용하여 가압(flash) 하에 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 수득할 수 있다.

상기 아르기닌 메틸에스테르에서 아르기닌은 L-아르기닌, D-아르기닌 및 DL-아르기닌 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

3) 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 가수분해시켜, 프로베네시드-아르기닌 유도체를 합성하는 단계는 하기 반응식 5로 나타낼 수 있다.

[반응식 5]

상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르에 염기성 화합물을 첨가하여 가수분해시키면, 상기 프로베네시드-아르기닌 유도체가 합성될 수 있다. 일 실시예를 들어, 상기 염기성 화합물은 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 가수분해시킬 수 있는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 수산화리튬(lithium hydroxide), 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 또는 수산화칼륨(Potassium hydroxide)을 사용할 수 있다.

구체적으로, 2 내지 6시간에 걸쳐 약 0℃cold temperature)에서 실온까지 승온시키는 온도 조건에서 교반하며, 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 테트라하이드로퓨란-메탄올-물(tetrahydrofuran-methanol-H₂O, THF-MeOH-H₂O)에 용해시킨 후, 수산화리튬, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 이용하여 염기 가수분해(base hydrolysis)시키고, 이후 감압 하에 휘발성 물질을 증발시키고, 2N HCl을 첨가하여 pH를 3 내지 4로 조절한 뒤, 용매를 증발시키고, 아세토니트릴-물-아세트산(Acetonitrile-H₂O-acetic acid)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 정제하고, 용매를 증발시킨 뒤, 아세트산염과 프로베네시드-아르기닌 유도체(2-(4-(N,N-dipropylsufamoyl)benzamido)-5-guanidinopentanoic acid)를 수득할 수 있다.

상기 프로베네시드-아르기닌 유도체는 약 60% 이상의 수율로 수득될 수 있다.

상기 프로베네시드-아르기닌 유도체는 아미드(amide) 결합을 포함하며, 상기 아르기닌의 이성체 구조에 따라 L-입체이성체, D-입체이성체 및 DL-입체이성체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 형태로 수득될 수 있다.

<심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 치료, 예방, 개선, 진단 용도 및 치료, 예방, 개선, 진단 방법>

본 발명의 프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체를 이용한, 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 치료, 예방, 개선, 진단 용도 및 치료, 예방, 개선, 진단 방법은, 상술한 프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체에 대한 내용이 동일하게 적용되며, 그 외 질병 치료, 예방, 개선, 진단 등을 위한 공지의 방법이 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예 및 실험 예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시 예 및 실험 예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

합성예 1: 프로베네시드-L-아르기닌 유도체의 합성

프로베네시드(9.0 g, 31.5mmol), SOCl₂(23mL, 10 당량) 및 DMF(0.5mL)를 혼합한 뒤, 6시간 동안 환류하며 반응시켜 염화프로베네시드를 합성하였다. 감압 하에서 용매를 증발시키고, 톨루엔을 이용하여 공비 증류시켜, 회백색의 미정제 염화프로베네시드(9.5g)를 수득하였다.

L-아르기닌 메틸에스테르 염산염(L-Arg-OMe.2HCl, 6.2g, 23.7mmol)을 DMF(50mL)에 첨가한 뒤, 0℃로 냉각시키고, 트리에틸아민(17.5mL, 126mmol)을 적가(dropwise)하였다. 이를 교반하면서, DMF(50mL)에 용해된 상기 염화프로베네시드(9.5g)를 첨가하고, 24시간 동안 실온에서 격렬하게 교반하여, 프로베네시드-L-아르기닌 메틸에스테르를 합성하였다. 미정제된 상태의 상기 프로베네시드-L-아르기닌 메틸에스테르에서 불용성 고체를 여과한 뒤, 필터 케이크(filter cake)를 아세트산에틸로 세정(rinse)하고, 감압 하에 용매를 증발시킨 후, 실리카 겔(30g)에 흡착시켰다가, 메탄올(5~20%)-디클로로메탄을 이용하여 실리카 겔(300g) 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 용매를 증발시켜 무색의 생성물인 프로베네시드-L-아르기닌 메틸에스테르(7.0g, 수율 65%)를 수득하였다.

상기 프로베네시드-L-아르기닌 메틸에스테르(7.0g, 15.3mmol)를 THF-H₂O-MeOH(3:1:1, 70mL)에 용해시킨 후, 0℃로 냉각시키고, 교반하면서 LiOH-H₂O(1.92g, 46mmol)를 첨가하고, 0℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, 실온에서 4시간 동안 반응시키고, 휘발성 물질을 증발시켰다. 이 후, 2N HCl을 첨가하여 pH를 3 내지 4로 조절하고, 디캔테이션(decantation)을 통해 잔사를 분리해 내고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 MeOH(60mL) 및 CH₂Cl₂(30mL)의 혼합 용매에 용해시킨 뒤, 분리된 염을 여과하고, 실리카 겔(70g)에 흡착시켰다가, 아세토니트릴-H₂O-아세트산(16:1:1)을 이용하여 실리카 겔(250g) 컬럼 크로마토그래피 정제하였고, 용매를 증발시킨 뒤, 아세트산염과 무색의 생성물인 프로베네시드-L-아르기닌 유도체(5.0g, 수율 65%)를 수득하였다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ9.11 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H), 7.78 (dd, 2H), 7.68 (dd, 2H), 7.44(br s, 3H), 4.31 (m, 1H), 3.37-3.0 (m, 6H), 1.90-1.75 (m, 2H), 1.59-1.45(m, 6H), 0.80 (t, 6H).

합성예 2: 프로베네시드-D-아르기닌 유도체의 합성

합성예 1과 동일한 방법으로, L-아르기닌 메틸에스테르 염산염(L-Arg-OMe.2HCl) 대신 D-아르기닌 메틸에스테르 염산염(D-Arg-OMe.2HCl)을 사용하여 프로베네시드-D-아르기닌 유도체(5.5g, 수율 71%)를 수득하였다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ(br s, 1H), 8.68 (br s, 1H), 8.05 (dd, 2H), 7.75 (dd, 2H), 7.48 (br s, 3H), 4.40 (m, 1H), 3.27-3.09 (m, 6H), 2.01-1.91 (m, 2H), 1.75-1.50(m, 6H), 0.91 (t, 6H).

합성예 3: 프로베네시드-DL-아르기닌 유도체의 합성

합성예 1과 동일한 방법으로, L-아르기닌 메틸에스테르 염산염(L-Arg-OMe.2HCl) 대신 DL-아르기닌 메틸에스테르 염산염(DL-Arg-OMe.2HCl)을 사용하여 프로베네시드-DL-아르기닌 유도체(5.7g, 수율 75%)를 수득하였다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ9.14 (br s, 1H), 8.72 (br s, 1H), 7.97 (dd, 2H), 7.68 (dd, 2H), 7.40(br s, 3H), 4.25 (m, 1H), 3.20-2.95 (m, 6H), 1.95-1.75 (m, 2H), 1.65-1.40(m, 6H), 0.85 (t, 6H).

약제학적 조성물의 제조

실시예 1: 합성예 1의 프로베네시드-L-아르기닌 유도체 10mg을 DMSO 100μl에 용해시킨 뒤, 물 900μl를 첨가하고, 37 ℃로 가열하여 실시예 1에 따른 약제학적 조성물(Prob-L)을 제조하였다.

실시예 2: 합성예 2의 프로베네시드-D-아르기닌 유도체 10mg을 DMSO 100μl에 용해시킨 뒤, 물 900μl를 첨가하고, 37 ℃로 가열하여 실시예 2에 따른 약제학적 조성물(Prob-D)을 제조하였다.

실시예 3: 합성예 3의 프로베네시드-DL-아르기닌 유도체 10mg을 DMSO 100μl에 용해시킨 뒤, 물 900μl를 첨가하고, 37 ℃로 가열하여 실시예 3에 따른 약제학적 조성물(Prob-DL)을 제조하였다.

비교예 1: 수용성 프로베네시드(ThermoFisher) 10mg을 물 900μl에 용해시킨 뒤, DMSO 100μl를 첨가하여, 비교예 1에 따른 약제학적 조성물(Prob-Reg)을 제조하였다.

물 900μl에 DMSO 100μl를 첨가하여, 상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에 따른 심부전 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물에 대한 대조군(control)으로서 사용하였다.

시험예 1: 심장초음파 측정

심장초음파 측정을 위하여, 각각의 마우스의 체중을 측정하였고, 이 마우스들을 2.5% 이소플루란으로 마취시킨 다음, Vevo 2100 스테이지에 고정한 채, 가슴 털을 제모하였다. 기준 PSLAX B-모드 및 M-모드 영상을 30 MHz 프로브로 촬영하였다. 실시예 1 내지 3, 비교예 1 및 대조군을 100mg/kg의 농도로 IP 주사(injection peritoneal, 복강 주사)하되, 이때 마우스를 움직이지 못하게 만들어 정확한 비교 영상을 확보하였다. IP 주사 직후 및 1분 후에 M-모드 영상을 촬영하였다. 주사 후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 및 30분 경과 시 추가 영상을 촬영하였다. 그 다음, 마우스를 Vevo 스테이지에서 꺼낸 후 저절로 깨어나게 놔두었다. 실시예 1 내지 3, 비교예 1 및 대조군에 대해 맹검 상태인 연구자가 Vevo 소프트웨어를 사용하여 심장초음파 영상을 분석하였으며, 주사 후 30분 경과 시 의 심근수축력(contractility)을 대조군을 기준으로 하여 변화된 박출률(ejection fraction, EF)로서 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 비교예 1의 투여 후 30분 경과 시, 심근수축력(contractility)을 3.8%까지 증가시킨 반면, 실시예 1 내지 3의 투여 후 30분 경과 시, 심근수축력을 각각 9.1%, 11.2% 및 7.8%까지 증가시켰음을 확인할 수 있다.

심장의 주 역할은 체내의 모든 기관에 충분한 혈액을 공급하는 것이며, 이는 심근의 수축과 이완을 통해 이루어진다. 심근은 충분히 이완하여 돌아오는 혈액을 모은 후 충분히 수축하여 혈액을 내보낸 후, 이를 다시 돌아오게 해야 한다. 만약 심근의 수축력이 저하될 경우 혈액을 내보내는 힘이 줄어들 뿐만 아니라 돌아오는 혈액의 양도 줄어들게 되며, 이러한 상태를 심부전이라고 판단한다. 따라서 심근수축력의 향상을 심부전 치료의 주된 작용기전으로 볼 수 있으며, 이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 프로베네시드-아르기닌 유도체를 포함하는 경우, 심부전 치료에 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시험예 2: 심근 세포의 근절 길이 변화 측정

시험예 1의 마우스들에 대하여, 헤파린과 혼합한 유타졸을 과량으로 IP 주사하여, 안락사시켰다. 가슴을 절제하여 여전히 뛰고 있는 심장을 꺼낸 다음, 여기에 캐뉼러를 꽂고 나서, 바로 관류 완충액으로 관류하여 혈액을 제거하였다. 심장을 Langendorff 장치에 걸어 놓고 나서, 관류 완충액으로 약 5분 동안 관류한 후, Liberase 분해하여 ECM을 제거하였다. 심장을 꺼내고, 분해 완충액 2.5ml중에서 분쇄하여 심근 세포를 분산시킨 다음, 50ml Falcon 튜브에서 나일론 메쉬를 통해 여과하여 덩어리를 제거하였다. 제1 종결 완충액 2.5ml를 심근 세포에 첨가한 다음, 이 심근 세포가 펠릿이 되도록 허용하였다. 상층액(supernatant)을 제2 종결 완충액 4ml로 대체한 다음, 심근 세포에 칼슘을 재도입하였다. 일단 심근 세포가 펠릿화되면, 상층액을 제거하고, 그 대신 Tyrodes 완충액 3ml를 넣었다. 그 다음, 심근 세포를 500ul 튜브 5개에 나누어 넣었다. 각 심근 세포 분액들을 조영 조(imaging bath)에 넣어 Ionoptix 세포 단축 분석(cellular shortening analysis)을 수행하였는데, 이 때 각각의 화합물의 최종 농도는 1μM로 하였다. 심근 세포에 전기장 자극을 주고(10V, 펄스 폭 10ms, 주파수 1Hz), Ionoptix SarcLen 소프트웨어를 사용하여 심근 세포의 근절 길이 변화(구획 단축률, fractional shortening, FS)를 추적하여, 그 결과를 도 2 내지 4에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 대조군의 FS를 기준으로 비교예 1은 FS를 8.6% 증가시킨 반면, 실시예 1 내지 3은 각각 FS를 6.7%, 6.2% 및 10.6%까지 증가시켰다. 도 3 및 4를 참조하면, 심근 세포의 수축 및 이완 속도 또한 FS와 동일한 경향성을 가지며 증가하는 것을 확인할 수 있다.

심근 세포의 수축과 이완은 서로 상관관계가 있으며, 심근 세포의 수축이 잘 되어야 심근 세포 이완도 증가하고, 심근 세포의 이완이 충분히 이루어져야 심장으로 들어오는 혈류량이 증가하여, 심근 세포의 수축으로 인한 심장박동 시의 혈류량 증가를 기대할 수 있다.

그러나 심근수축력 향상이 곧 치료 효과 증대로 이어진다고 볼 수는 없으며, 심근수축력이 지나치게 향상될 경우, 부정맥의 위험이 높아지는 문제가 생길 수 있다.

따라서 심근 세포의 수축 기능이 저하되고 심실이 커진 상태에서는, 심장에서의 심실박출량(Stroke volume)을 증가(실험예 1에서, 도 1의 박출률(EF) 참조)시켜 전체적 혈액순환을 도와줌으로써 심부전 치료 효과를 얻을 수 있으며, 다시 말하면, 심근 이완기를 상대적으로 더 늘리는 것이 심장 생리학(physiology) 및 에너지학(energetics) 측면에서 유리한 것으로 볼 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 프로베네시드-아르기닌 유도체를 포함하는 경우, 심부전 치료에 효과를 나타냄을 알 수 있다.

Claims

프로베네시드(probenecid) 및 아르기닌(arginine)의 아미드(amide) 유도체.
청구항 1에 있어서,
상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는, 이의 L-입체이성체, D-입체이성체 및 DL-입체이성체를 포함하는 것인, 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체.
프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체를 포함하는, 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는, 이의 L-입체이성체, D-입체이성체, DL-입체이성체 및 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나 이상을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체는 TRPV2(Transient receptor potential cation channel subfamily V member 2)에 작용하여 심근수축력(contractility)을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 심근 세포 수축 기능이 저하됨에 따라 유발되는 질병은, 심부전증, 근육 이완증, 근육통, 통풍, 발기부전, 및 폐동맥고혈압 중 하나 이상인, 약제학적 조성물.
1) 프로베네시드와 염소화제(Chlorinating agents) 또는 브롬화제(Brominating agents)를 반응시켜, 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드를 합성하는 단계;
2) 상기 염화프로베네시드 또는 브롬화프로베네시드와 아르기닌 메틸에스테르(Arg-OMe, Arginine methylester)를 반응시켜, 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 합성하는 단계; 및
3) 상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 가수분해시켜, 프로베네시드-아르기닌 유도체를 합성하는 단계;를 포함하는 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 염소화제는 염화티오닐(Thionyl chloride, SOCl₂), 염화술포닐(Sulfuryl chloride, SO₂Cl₂), 염화포스포릴(Phosphoryl chloride, POCl₃) 또는 오염화인(Phosphorus pentachloride, PCl₅)인 것을 특징으로 하는 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 브롬화제는 삼브롬화인(Phosphorus tribromide, PBr₃)인 것을 특징으로 하는 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 아르기닌 메틸에스테르에서 아르기닌은 L-아르기닌, D-아르기닌 및 DL-아르기닌으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 프로베네시드-아르기닌 메틸에스테르를 가수분해시켜, 프로베네시드-아르기닌 유도체를 합성하는 단계에서,
상기 가수분해는 수산화리튬(lithium hydroxide), 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 또는 수산화칼륨(Potassium hydroxide)을 사용하는 것인, 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 프로베네시드-아르기닌 유도체는, 이의 L-입체이성체, D-입체이성체 및 DL-입체이성체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 프로베네시드 및 아르기닌의 아미드 유도체의 합성 방법.