NO328021B1

NO328021B1 - Analysemetode for fosfatase-malsokende toksiner, samt sett og anvendelse derav

Info

Publication number: NO328021B1
Application number: NO20012304A
Authority: NO
Inventors: Stein Ove Doskeland; Margrethe Hauge Serres; Kari Espolid Fladmark
Original assignee: Biosense Lab As
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2009-11-09
Also published as: ZA200103796B; EA002710B1; ID30236A; DK1129352T3; EA200100452A1; DE69923581T2; JP2002529738A; EP1129352A1; KR20010092728A; NO20012304D0; CA2349942A1; ES2237953T3; PL198749B1; ATE288588T1; NO20012304L; CZ20011673A3; DE69923581D1; IL143047A0; EP1129352B1; CN1338051A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analysemetode for påvisning av fosfatase-målsøkende toksiner som typisk produseres av mikroalger, som for eksempel cyanobakterier og dinoflagellater, samt sett og anvendelse derav.

Dinoflagellater er i alminnelighet encellede, fotosyntetiske biflagellære alger. Noen av de marine dinoflagellatene (f.eks. Prorocentrum sp., og Dinophysis sp.) produserer fosfatase-målsøkende toksiner, så som okadainsyre og dinofysis-toksin som forårsaker gastrointestinale problemer dersom de inntas av mennesker. Slike alger kan således være problematiske dersom de kontaminerer tilholdsstedet for skalldyr for konsum.

Cyanobakterier som ofte omtales som blågrønnalger, er også fotosyntetiske organismer som hovedsakelig er aquatiske og lever i kystfarvann, åpen sjø og hav, elver, innsjøer og grunnvann, men kan også være terrestriske og forekomme i bladavfall og jord.

Mange arter og stammer av cyanobakterier, særlig Microcystis sp. Aphanizomen sp., Anabena sp., Nodularia sp. og Oscillatoria sp., produserer toksiner som kan føre til sykdom dersom de inntas av mennesker eller andre patte-dyr, fulger og endog fisk. Inntak av slike toksiner skjer via to hovedveier, enten ved å drikke kontaminert vann eller ved å spise forurenset sjømat.

To spesielle typer toksiner produseres av cyanobakterier og dinoflagellater. Neurotoksiner, for eksempel anatoksiner og saxitoksiner, forårsaker paralyse av offeret, og tilstanden omtales derfor ofte som paralytisk skalldyrforgiftning. Forgiftning med slike neurotoksiner er sjelden, men kan vise seg å være dødelig.

Den andre form av toksiner inaktiverer proteinfosfataseenzymer i cellene i kroppen ved å binde til enzymene og påvirke deres evne til å defosforylere protein-substrater. Disse toksinene er relativt vanlige, og enkelte (så som dinoflagellat-toksinene okadainsyre og dinofysis -toksin) kan forårsake kvalme, brekninger og diaré, og tilstanden omtales derfor ofte som skalldyrforgiftningsdiaré. Noen proteinfosfatase-målsøkende toksiner er tumorpromotere, og eksponering for disse toksinene kan føre til kreft. Andre, så som cyanobakterie-toksinene mikrocystin og nodularin, er hepatotoksiske og forårsaker leverskade. Den mest fremtredende av fosfatase-målsøkende toksiner er mikrocystin, nodularin og okadainsyre.

Den vanligste kilde til dinoflagellat-toksinforgiftning er skalldyr og fiskelever, og den vanligste årsak til cyanobakteriell toksinforgiftning er kontaminert drikke- og/eller badevann. Både cyanobakterie- og dinoflagellat-toksiner kan imidlertid holde til i skalldyr og i vann. En særlig vanlig kilde til algetoksinforgiftning er muslinger, siden de akkumulerer toksinene etter å ha levd på toksinproduserende alger. Andre skalldyr, for eksempel østers, blåskjell og kamskjell, kan også være rammet.

Dessuten kan drikkevannskilder, særlig hvis de skriver seg fra grunnvann, bli kontaminert med cyanobakterier og derved utgjøre en direkte vei til toksininntak.

Det eksisterer en viss bekymring med hensyn til konsumet av alger og cyanobakterier som høyprotein helsekost og diettbestanddel. Det finnes ingen offisielle retningslinjer for overvåkning av innsamlede alger eller cyanobakterier med henblikk på kontaminering med toksinproduserende stammer, og markedsføringen av slekter som Anabena og Aphanizomenon er særlig bekymringsfull, siden det blant disse forekommer en rekke toksinproduserende stammer.

I tillegg til det kortvarige ubehag, medisinske omkostninger, kommersielle omkostninger for skalldyrindustrien, tap av arbeidstimer, etc, som kan være resultat av eksponering for algetoksiner, har som nevnt ovenfor, de fosfatase-målsøkende toksinene mikrocystin og nodularin, vist seg å være tumorpromotere, og det antas at gjentatt eksponering for slike toksiner på det kliniske eller subkliniske nivå, særlig i kombinasjon med et høyt inntak av alkohol eller med røking, kan resultere i kreft, særlig i leveren.

For tiden eksisterer en rekke forskjellige metoder for påvisning og kvantifisering av fosfatase-målsøkende toksiner fra alger og cyanobakterier. En standardmetode innebærer oppmaling av muslinger eller andre potensielle kilder av de fosfatase-målsøkende toksinene, og injisering av et ekstrakt av det oppmalte muslingvev i mus. Forekomsten og nivået av fosfatase-målsøkende toksin-kontaminering bestemmes deretter ut fra overlevelse hos mus (Stabell et al., (1992), Food. Chem. Toxicol. 30(2): 139-44). Dette er klart en tidkrevende, grov og kostbar metode for vurdering av matsikkerhet og kvalitetskontroll.

En annen metode for bestemmelse av DSP (diarrheal shellfish poisons)

(EP-A-554458 til latron Laboratories Inc.) involverer anvendelse av et første og et andre antistoff mot toksinet i en konvensjonell sandwich-test.

En annen metode involverer måling av reduksjonen i enzymaktivitet av eksogent tilsatt fosfatase, hvorved forekomsten av fosfatase-målsøkende toksiner i skalldyr påvises. Igjen innebærer dette oppmaling av muslinger eller annet skalldyr-vev, frigjøring av endogene fosfataser som interfererer med den tilsatte fosfatase og svekker følsomheten og nøyaktigheten av testen (Sim & Mudge (1994) i Detection Methods for Cyanobacterial Toxins, red. Codd, Jeffries, Keevil & Potter, Royal Society of Chemistry, og US-A-5180665 til Charles Holmes.

US5180665 beskriver en metode som involverer måling av reduksjonen av enzymatisk aktivitet til eksogent tilsatt fosfatase for derved å detektere tilstedeværelsen av fosfatasemålsøkende toksiner i skalldyr.

EP05554458 beskriver en metode for bestemmelse av "diarrheal shellfish poisons" (DSP) som involverer anvendelse av et første og andre antistoff mot toksinet i en konvensjonell sandwich analyse.

Det eksisterer derfor et stort behov for en hurtig, følsom og billig analyse eller metode for å muliggjøre den kvalitative og/eller kvantitative bestemmelse av forekomsten av fosfatase-målsøkende toksiner, særlig alge- og cyanobakterie-fosfatase-målsøkende toksiner, i vann, skalldyr og/eller spiselige produkter fra alger eller cyanobakterier. Særlig er det behov for en analysemetode som er tilstrekkelig enkel til utførelse lokalt av relativt uøvde, eller uøvde personer, for eksempel fiskehandlere eller personell ved vannrenseanlegg, og som ikke fordrer noe laboratorieutstyr eller spesialinnretninger for å utføres.

I henhold til et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse således en analysemetode for bestemmelse av fosfatase-målsøkende toksiner som inhiberer proteinfosfataser,

kjennetegnet ved at analysemetoden omfatter:

(A) kontakting av en fast bærer som har en første ligand immobilisert derpå med: (i) en prøve mistenkt for å være kontaminert med toksin og; (ii) en andre ligand, som ikke er immobilisert på en fast bærer, hvor enten: (a) nevnte første ligand er proteinfosfataseenzym og er i stand til å binde, på konkurrerende måte, nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte andre ligand, eller (b) nevnte andre ligand er et proteinfosfataseenzym og er i stand til å binde, på en konkurrerende måte, nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte første ligand, eller (c) minst en av nevnte første ligand og nevnte andre ligand omfatter et proteinfosfataseenzym, og nevnte første ligand og nevnte andre ligand er i stand til samtidig binding av nevnte fosfatase-målsøkende toksin, eller (d) minst en av nevnte første ligand og nevnte andre ligand omfatter et proteinfosfataseenzym, og nevnte første ligand er i stand til å binde til nevnte fosfatase-målsøkende toksin, nevnte andre ligand er i stand til å binde til et kompleks av nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte første ligand, eller (e) minst en av nevnte første ligand og nevnte andre ligand omfatter et proteinfosfataseenzym, og nevnte andre ligand er i stand til å binde til nevnte fosfatase-målsøkende toksin, og nevnte første ligand er i stand til å binde til et kompleks av den nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte andre ligand; hvor andelen av nevnte første ligand bundet av nevnte toksin, nevnte andre ligand eller komplekser av nevnte toksin og nevnte andre ligand er avhengig av toksininnholdet i nevnte prøve, og hvor enten: (f) nevnte første ligand er i stand til å danne et direkte eller indirekte detekterbart signal når det ikke er kompleksert, når kompleksert med nevnte toksin, når kompleksert med et kompleks av nevnte toksin og nevnte andre ligand eller når kompleksert med nevnte andre ligand; eller (g) nevnte andre ligand er i stand til å danne et direkte eller indirekte detekterbart signal når ikke-kompleksert eller når kompleksert,

(B) separering av en bundet fraksjon fra en ikke-bundet fraksjon; og

(C) direkte eller indirekte bestemmelse av den andre ligand bundet til den

første ligand (bundet fraksjon) eller den andre ligand ikke-kompleksert i vandig

løsning (ikke-bundet fraksjon);

hvor tilsetning av (i) og (ii) til den faste bæreren kan bli utført separat, suksessivt eller samtidig og, om separat eller suksessivt i en hvilken som helst rekkefølge.

I henhold til én utførelsesform kan toksinbestemmelse således innebære bestemmelse av den ikke-immobiliserte ligand som ikke har kunnet binde direkte eller indirekte til den immobiliserte ligand. Når den ikke-immobiliserte ligand konkurrerer om binding til den immobiliserte ligand med toksinet, utgjør et høyt nivå ubundet ligand en indikasjon på en høy toksinkonsentrasjon. Når den ikke-immobiliserte ligand kan kompleksere toksin bundet til den immobiliserte ligand, utgjør et høyt nivå ubundet ligand en indikasjon på en lav toksinkonsentrasjon.

I henhold til en annen utførelsesform innebærer toksinbestemmelse, bestemmelse av den ikke-immobiliserte ligand som har bundet seg direkte eller indirekte til den immobiliserte ligand. Når toksin og ikke-immobilisert ligand konkurrerer om binding til den immobiliserte ligand, utgjør et høyt nivå av bundet ligand en indikasjon på en lav toksinkonsentrasjon. Når den ikke-immobiliserte ligand kan kompleksere toksin bundet til den immobiliserte ligand, utgjør et høyt nivå bundet ligand en indikasjon på en høy toksinkonsentrasjon.

Fortrinnsvis innebærer imidlertid fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en kompetitiv bindingsbestemmelse for påvisningen av fosfatase-målsøkende toksiner, særlig alge- og cyanobakterietoksiner, hvor toksinmolekyler som er tilstede i en prøve, konkurrerer med den ikke-immobiliserte ligand om et begrenset antall bindingsseter på den immobiliserte ligand, og eventuelt forekommende toksin i nevnte prøve bestemmes i forhold til graden av ikke-immobilisert ligand bundet til, eller ikke bundet til, bindingssetene på den immobiliserte ligand.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, kjennetegnet ved at i opsjonene (a) og (b) konkurrerer toksinmolekylene forekommende i prøven med nevnte andre ligand om et begrenset antall bindingsseter på den nevnte første ligand, og eventuelt forekommende toksin i nevnte prøve bestemmes i forhold til graden av andre ligand bundet til, eller ikke bundet til, bindingssetene på den første ligand.

I denne sammenheng innbefatter betegnelsene «påvisning», «bestemmelse» eller «måling» både kvantifisering i den forstand at det oppnås en absolutt verdi for den mengde eller konsentrasjon av fosfatase-målsøkende toksiner som er tilstede i prøven, og også halv-kvantitativ og kvalitativ måling eller bestemmelse. En indeks, et forhold, prosentandel eller molar angivelse av nivået eller mengden av forekommende toksin, kan bestemmes, eller alternativt, kan det oppnås en enkel indikasjon på forekomst eller fravær av slike toksiner i prøven. I denne sammenheng kan «fravær» av toksin bety at toksinkonsentrasjonen er under påvisningsgrensen for analysen eller under et nivå som ansees å være sikkert eller tolererbart.

Prøvene benyttet i analysemetoden ifølge oppfinnelsen kan være en hvilken som helst prøve som er mistenkt for eksponering overfor fosfatase-målsøkende toksiner, muligens ved eksponering for fosfatase-målsøkende toksinproduserende mikroorganismer, for eksempel vann, som kan være sjøvann, ferskvann, grunnvann, vann tatt fra innsjøer, elver, brønner, bekker, reservoarer eller vannverk, eller kan være fuktighet ekstrahert fra skalldyr, for eksempel ved enkel avrenning eller uttak ved å benytte en pipette, eller vann hvor skalldyr har fått gjennombløtes, eller kan være et næringsmiddel, næringsmiddeltilsetning, næringstilskudd, alternativt middel eller lignende produkt som produseres av, eller fra, alger eller cyanobakterier. Når skalldyr inneholder fritt vann (f.eks. som i østers), kan analysen involvere dypping av et absorberende substrat (den faste bærer) inn i vannet. Alternativt kan det ganske enkelt innebære pressing av et absorberende substrat mot det fuktige skalldyrkjøttet, f.eks. etter knusing eller åpning av skallet.

I henhold til et foretrukket aspekt ved oppfinnelsen er prøven som undersøkes overflate- eller fri fuktighet fra skalldyr.

Alle typer skalldyr, for eksempel kamskjell, reker, muslinger og østers, er egnet for analysemetoden ifølge oppfinnelsen, men i henhold til et foretrukket aspekt er skalldyret muslinger. I henhold til et annet foretrukket aspekt er prøven som undersøkes, vann tatt fra det miljø hvor slike skalldyr lever, og i henhold til et ytterligere foretrukket aspekt, er prøven vann tatt fra lokale vannverk.

Prøven benyttet for analyse kan benyttes på tilnærmet ubehandlet måte, men kan eventuelt filtreres etter en hvilken som helst kjent metode, eller fortynnes ved tilsetning av vann, buffer eller et hvilket som helst annet vandig medium før analyse, og kan oppbevares eller konserveres, for eksempel ved avkjøling eller frysing før analyse.

En hvilken som helst toksin-bindende ligand kan benyttes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som den immobiliserte eller ikke-immobiliserte ligand, for eksempel antistoffer, som kan være polyklonale eller monoklonale, eller antistoff-fragmenter, for eksempel F(ab)-, F(ab')2- eller F(v)-fragmenter. Slike antistoffer eller antistoff-fragmenter kan være monovalente eller divalente og kan produseres ved hjelp av hybridomteknologi eller være av syntetisk opprinnelse, enten som produkter av rekombinant DNA-teknologi eller kjemisk syntese. Enkeltkjede-antistoff eller andre antistoff-derivater eller mimetika, kan for eksempel benyttes. Antistoffene eller antistoff-fragmentene kan alt etter hva som er relevant, være rettet eller utviklet mot en hvilken som helst epitop, komponent eller struktur av de fosfatase-målsøkende toksiner. Alternativt vil forbindelser med en affinitet for toksinet, for eksempel et lite organisk molekyl eller peptid, f.eks. et oligopeptid eller polypeptid som spesifikt kan binde toksinet, for eksempel et spesifikt bindemiddel valgt fra et kombinatorisk kjemi-eller fag-display-bibliotek eller en spesifikk bindende sekvens av DNA eller RNA, kunne benyttes.

Fortrinnsvis er imidlertid den toksin-bindende ligand ifølge foreliggende oppfinnelse et proteinfosfataseenzym, og enda mer foretrukket benyttes bindings-ligandproteinfosfatase2A (pp2A) i analysemetoden.

Likeledes kan den andre ligand benyttet i metoden ifølge oppfinnelsen være en hvilken som helst ligand som binder til toksinet, enten kompetitivt eller ikke-kompetitivt med den første ligand. Alternativt kan den andre ligand være en hvilken som helst ligand som konkurrerer med toksinet om binding til den første ligand. Fortrinnsvis er den første ligand en toksin-bindende ligand, mer foretrukket et proteinfosfataseenzym. Den ene av de to ligandene må være immobilisert og den andre må være ikke-immobilisert, og den ene av ligandene må være direkte eller indirekte påvisbar. I henhold til en foretrukket utførelsesform bør den ikke-immobiliserte ligand oppfylle de funksjonelle krav at den kompetitivt inhiberer toksin-binding til den immobiliserte ligand og direkte eller indirekte kan produsere et påvisbart signal, f.eks. kan det være et molekyl som kan merkes ved å benytte en direkte eller indirekte signaldannende del av en hvilken som helst kjent form. Slike ligander kan likeledes ha form av antistoffer, som kan være polyklonale eller monoklonale, eller antistoff-fragmenter, for eksempel F(ab)-, F(ab')2- eller F(b)-fragmenter. Slike antistoffer eller antistoff-fragmenter kan være monovalente eller divalente og kan produseres ved hjelp av hybridomteknologi eller være av syntetisk opprinnelse, enten som produkter av rekombinant DNA-teknologi eller kjemisk syntese. Enkeltkjede-antistoff eller andre antistoff-derivater eller mimetika og små organiske molekyler, peptider, oligopeptider og polypeptider valgt fra kombinatoriske-eller fag-display-bibliotek vil for eksempel kunne benyttes. Antistoffene eller antistoff-fragmentene kan alt etter hva som er relevant, være rettet eller utviklet mot en hvilken som helst epitop, komponent eller struktur av det fosfatase-målsøkende toksinmolekyl eller liganden som binder det fosfatase-målsøkende molekyl. Alternativt vil forbindelser med en affinitet for toksinet eller for liganden som binder toksinet, for eksempel et lite organisk molekyl eller peptid, et oligopeptid eller polypeptid som spesifikt kan binde toksinet eller liganden som binder toksinet, for eksempel et spesifikt bindemiddel valgt fra et kombinatorisk kjemi- eller fag-display-bibliotek eller en spesifikk bindende sekvens av DNA eller RNA, kunne benyttes.

Den rapportørdel som én av ligandene i alminnelighet vil ha, kan være et bindingssete for en direkte påvisbar del, f.eks. et metall-sol (f.eks. gull-sol), en kromofor eller fluorofor (f.eks. et cyanin, ftalocyanin, merocyanin, trifenylmetyl, equinance, etc, se Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing Chromophores, redigert av M. Matsuoka, Plenum Press, New York, NY. 1990, Topics in Applied Chemistry, The Chemistry and Application of Dyes, Waring et al., Plenum Press, New York, NY, 1990, og Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Molecular Probes Inc., 1996, en radioaktiv merking, et enzym, en magnetisk partikkel, et turbiditets-induserende middel, etc, eller det kan allerede være bærer av en slik direkte påvisbar del. Når rapportørdelen bæres av den immobiliserte ligand, vil den i alminnelighet være et bindingssete for en direkte påvisbar del, hvis bindingssete enten aktiveres, eller mer generelt, deaktiveres når liganden komplekseres.

Fortrinnsvis bæres rapportørdelen av den ikke-immobiliserte ligand.

Den ikke-immobiliserte ligand et fortrinnsvis merket, f.eks. enzym- eller kromofor- eller fluorofor-merket peptid hepatotoksin, f.eks. et hepatotoksin valgt fra nodularin, mikrocystin LR eller mikrocystin YR eller alternativt okadainsyre.

Selv om radioaktiv merking er mulig, er det å foretrekke siden analysen primært er ment for legfolk anvendt på angjeldende sted, å benytte rapportørdeler som gir et synlig signal, f.eks. kromoforer, fluoroforer, fosforescerende deler, turbiditets-induserende midler, gass-utviklings induserende midler, etc.

Når den signal-dannende del er et materiale som binder til et bindingssete på én av ligandene, vil det lett kontaktes med den bundne eller ubundne fraksjon, alt etter forholdende, etter separasjon av de bundne og ubundne fraksjoner.

Når signalet skal tas fra den bundne fraksjon, vil det i alminnelighet være fordelaktig å rense substratet, f.eks. med vann, for å spyle bort den ubundne fraksjon før liganden påvises eller frembringes og påvises.

Enhver art eller stamme av alger eller cyanobakterier som produserer fosfatase-målsøkende toksiner kan være gjenstand for foreliggende oppfinnelse, men den er særlig anvendelig for toksin-produserende stammer av cyanobakterier som for eksempel Microcystis aeroginosa, Anabena arter, Nodularia spuragena og Anabena flus- aquae eller alger. For eksempel produseres toksinene mikrocystin-LR og mikrocystin-YR av Microcystis sp., toksinet nodularin produseres av Nodularia sp., og toksinet okadainsyre produseres av Prorocentrum sp.

De toksiner som er gjenstand for bestemmelse etter foreliggende metode kan likeledes være et hvilket som helst fosfatase-målsøkende toksin som produseres av alger eller cyanobakterier, men i henhold til foretrukne aspekter er peptid-toksinene hepatotoksiner (hvorav mikrocystin og nodularin er den mest utbredte) eller okadainsyre.

I dens mest generelle forstand involverer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen derfor en enkel kontakting av en prøve som mistenkes å være kontaminert med fosfatase-målsøkende toksiner, med en toksin-bindende ligand og et rapportør-molekyl som kan konkurrere med nevnte toksin om bindingsseter på liganden, enten samtidig, suksessivt eller separat i en hvilken som helst rekkefølge, hvor rapportør-molekylet eventuelt er bundet til bindingsliganden før eksponering for den aktuelle prøve, og bestemmelse av det rapportørmolekyl som enten er bundet til den faste fase eller er fritt i løsning.

Den bundne fraksjon kan separeres fra den ubundne fraksjon før rapportør-bestemmelsen på en hvilken som helst passende måte, for eksempel ved presipitasjon, sentrifugering, filtrering, kromatografiske anordninger, kapillærvirkning eller ganske enkelt ved gjennomsiving. Den faste fasen kan for eksempel ha form av en teststrimmel eller en fast matriks av en hvilken som helst kjent form, for eksempel polymere eller magnetiske kuler som for eksempel Dynabeads® (tilgjengelig fra Dynal AS). I henhold til foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse har den faste fase som de toksin-bindende ligandene er immobilisert på, form av Dynabeads®.

Rapportørmolekylet kan bestemmes enten i den bundne eller den ikke-bundne fraksjon avhengig av angjeldende utførelsesform av oppfinnelsen, men bestemmes fortrinnsvis i den bundne fraksjon.

Den immobiliserte ligand kan immobiliseres på en hvilken som helst kjent måte, for eksempel ved binding eller kobling av liganden til hvilken som helst av de velkjente faste bærerne eller matrikser som for tiden er utstrakt anvendt eller foreslått for separasjon eller immobilisering, hvor for eksempel faste faser kan ha form av partikler, ark, gel, filtere, membraner, fibere eller kapillærer eller mikrotiterstrimler, rør eller brønnplater, etc, og kan hensiktsmessig være fremstillet av glass, silika, lateks, et polymermateriale eller magnetiske kuler. Teknikker for binding av liganden til den faste bærer er velkjent på området og omfattende beskrevet i litteraturen. I henhold til foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse har den faste fase som bindingsliganden av det fosfatase-målsøkende toksin er immobilisert på, form av Dynabeads®.

Analysemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse er fordelaktig ved at den kan foretas uten behov for komplekst laboratoriesutstyr og kan utføres av relativt ufaglært eller en ufaglært person. Analysemetoden er således egnet for bruk i hjemmet, i forretninger eller utendørs, og den kan utføres hurtig og lett uten behov for omfattende arbeid eller farlige kjemikalier.

Av særlig fordel for bestemmelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er den meget høye følsomhet som er av avgjørende betydning ved analyse av prøver hvor toksinet forekommer i meget lave nivåer, for eksempel ved testing av drikkevann eller bestemmelse av mulig forurensning med fosfatase-målsøkende toksiner. Analysen er typisk i stand til å påvise toksiner i pikomolare konsentrasjoner, f.eks. så lavt som 10 pM. Analysemetoden kan hensiktsmessig benyttes for å påvise toksiner i 15 til 560 pM området.

En ytterligere fordel ved foreliggende analyse i forhold til eksisterende teknikker er at den foreliggende analyse ikke påvirkes av nærværet av endogene fosfataser som kan være tilstede i de aktuelle analyser, for eksempel dersom prøvene tas fra skalldyr.

I én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse immobiliseres en protein-fosfatase på en fast bærer, den immobiliserte fosfatase kontaktes med prøven som skal undersøkes, og et eventuelt fosfatase-målsøkende toksin i prøven binder seg til den immobiliserte fosfatase. En rapportør-molekylkilde som konkurrerer med toksinet om fosfatase-bindingsseter tilsettes. Rapportør-molekylene fortrenger toksin-molekylet fra bindingssetet i en grad som avhenger av den relative konsentrasjon av toksinmolekyler og rapportørmolekyler. Graden av rapportørmolekyl-binding letter bestemmelse av toksin som forekommer i den aktuelle prøve. Foretrukne rapportører/merkinger omfatter radioaktive merkinger, kromoforer (inklusivt fluoroforer) og enzymer som fører til kromogene eller fluorogene produkter. Scintillasjons-proksimitets-merkinger og merkinger som fører til en målbar endring i lysspredning kan også være aktuelle.

I henhold til en alternativ utførelsesform kontaktes rapportør-blokkerte

fosfatasemolekyler immobilisert på en fast bærer, med prøven som skal undersøkes, og eventuelle fosfatase-målsøkende toksiner i prøven konkurrerer med de fosfatase-bundne rapportørmolekylene og fortrenger dem fra den faste fase over i den vandige fase i en grad som er proporsjonal med mengden av toksin forekommende i prøven.

Den mengde rapportørmolekyl som forblir bundet til den faste fase, bestemmes deretter for å lette bestemmelsen av toksinnærvær i prøven som undersøkes.

I henhold til et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et sett for påvisning av fosfatase-målsøkende toksiner som inhiberer proteinfosfataser, kjennetegnet ved at det omfatter: en fast fase på hvilken det er immobilisert en første ligand;

en andre ligand, fortrinnsvis i vandig løsning eller kompleksert til den første ligand;

og hvor den første og/eller andre ligand er et proteinfosfataseenzym;

hvor verken den nevnte immobiliserte eller andre ligand omfatter en direkte eller indirekte påvisbar del, en rapportørdel som er i stand til binding til én av nevnte første og andre ligander og frembringelse av et påvisbart signal, hvor nevnte påvisbare del eller signal fortrinnsvis er direkte avlesbart uten laboratoriesutstyr.

I henhold til en foretrukket utførelsesform omfatter settet ifølge foreliggende oppfinnelse produseres nevnte fosfatase-målsøkende toksin av alger eller cyanobakterier.

En spesielt foretrukket utførelsesform av settet ifølge oppfinnelsen omfatter en fast fase på hvilken det er immobilisert et proteinfosfatase-enzym som en toksin-bindende ligand;

et rapportørmolekyl som er i stand til kompetitivt å inhibere binding av fosfatase-målsøkende toksiner til nevnte toksin-bindende ligand og frembringelse av et signal som er avlesbart uten laboratorieutstyr.

En ytterligere spesielt foretrukket utførelsesform av settet ifølge oppfinnelsen omfatter magnetisk fortrengbare polymere mikrokuler, hvor det på disse er immobilisert en proteinfosfatase;

gull-sol-merkede peptid-heptatoksinmolekyler som er i stand til kompetitivt å inhibere binding av cyanobakterietoksiner til nevnte proteinfosfatase.

I henhold til et annet foretrukket aspekt omfatter settet magnetisk fortrengbare polymere mikrokuler som på disse har immobilisert en proteinfosfatase;

gull-sol-merkede okadainsyremolekyler som er i stand til kompetitivt å inhibere binding av algetoksiner til nevnte proteinfosfatase.

I henhold til et annet foretrukket aspekt omfatter settet en fast fase på hvilken det er immobilisert en første ligand;

og hvor den første og/eller andre ligand er et proteinfosfataseenzym;

hvor enten nevnte første eller andre ligander bærer en rapportørdel som er i stand til å danne et detekterbart signal, idet nevnte detekterbare signal fortrinnsvis er direkte avlesbart uten laboratorieutstyr.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av et sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 19 for bestemmelse av fosfatase-målsøkende toksiner.

Oppfinnelsen vil nedenfor bli illustrert gjennom de etterfølgende eksempler.

Materialer

Mikrocystin-YR, Mikrocystin-LR, okadainsyre, nodularin, calyculin A og tautomycin anskaffes fra Calbiochem (San Diego, CA). Bærer-fritt Na<125>l og [y-<32>P]ATP anskaffes fra Amersham (Little Chalfont, UK). Albumin (RIA-kvalitet), ammoniumacetat, kloramin T, dimetylsulfoksyd (DMSO), ditioerytritol (DTE), EDTA, EGTA, glycerol, Hepes, histon ll-AS, natrium-metabisulfitt og trypsininhibitor (soyabønne) anskaffes fra Sigma (St. Louis, MO). Acetonitril og trifluoreddiksyre (TFA) anskaffes fra Rathburn (Walkerburn, Skottland). Delvis renset protein-fosfatase 2A anskaffes enten fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) eller renses i henhold til Resink et al., (Eur. J. Biochem. 133:455-461 (1983)).

Jodering av microcystin-YR

Mikrocystin YR (10 ug) joderes med 1 mCi bærer-fritt Na<125>l (37 <M>Bq) ved å benytte kloramin T som beskrevet av Ciechanover et al., (PNAS 77:1365-1368

(1980)). Etter joderingsreaksjonen separeres jodid fra [1<25>l] mikrocystin-YR ved å benytte Sep-Pak® Plus patroner (Waters, Milford, MA) i henhold til metoden til Runnegar et al., (Toxicon 24:506-509 (1986)). [<125>l]mikrocystin-YR påføres en 3x250 mm Inertsil ODS-2 HPLC-kolonne fra Chrompack (Raritan, NJ) og elueres med en acetonitrilgradient.

Kompetitiv bindingsbestemmelse

Den kompetitive bindingsbestemmelse foretas i et volum på 0,5 ml_ buffret med 50 mM Hepes (pH 7,2), 1 mM EDTA, 0,3 mM EGTA, 1 mM DTE, 5 mM MnCI2, 0,5 mg ml_"1 BSA og 0,2 mg ml_"1 trypsin-inhibitor. Algetoksiner fortynnet i 100% DMSO tilsettes i en mengde på 0-100 nM i en sluttkonsentrasjon på 10% DMSO.

[<125>l]mikrocystin-YR (1 Ci/13 ng) tilsettes som 35 pM. Proteinfosfatase 2A (30 pM) tilsettes tilslutt, hvorpå reaksjonsblandingen inkuberes på is over natten. [<125>l]mikrocystin-YR bundet til proteinfosfatase 2A separeres fra fritt [<125>l]mikrocystin-YR ved gelfiltrering under bruk av Sephadex® G-50 fine fra Pharmacia (Uppsala Sverige) i 0,7 x 15 cm kolonner fra Bio-Rad (Hercules, CA). En 50 mM Hepes buffer (pH 7,2) med 1 mM EDTA og 0,3 mM EGTA benyttes ved separasjonen som foretas ved 4°C. Fraksjonen som inneholder [<125>l]mikrocystin-YR som binder til proteinfosfatase 2A, oppsamles, og radioaktiviteten kvantifiseres ved scintillasjonstelling. Uspesifikk binding av [<125>l]mikrocystin-YR påvises i en kontrollreaksjon, hvor mikrocystin-LR tilsettes i et overskudd (1 u.M).

Eksempel 1

Proteinfosfatase 2A kobles til magnetiske kuler (direkte til kulene eller via biotinylering av fosfatasen). Immobilisert proteinfosfatase blandes deretter med prøve og radioaktivt merket toksin (f.eks. [<125>l]-mikrocystin-YR). Den immobiliserte proteinfosfatasen separeres fra reaksjonsblandingen med magnetkraft. Radioaktivitet assosiert med proteinfosfatasen (magnetiske kuler) påvises ved scintillasjonstelling. Den mengde radioaktiv merking som er assosiert med proteinfosfatasen avtar som funksjon av fosfatase-bindende toksin i prøven.

Eksempel 2

Proteinfosfatase 2A kobles til magnetiske kuler (direkte til kulene eller via biotinylering av fosfatasen). Immobilisert proteinfosfatase blandes deretter med prøve og toksin koblet til farvede kuler. Den immobiliserte proteinfosfatasen separeres fra reaksjonsblandingen med magnetkraft. Farvede kuler assosiert med proteinfosfatasen (magnetiske kuler) vurderes visuelt eller med et mikroskop med liten forstørrelse (f.eks. Nikon TMS). Den mengde farvede kuler som er assosiert med proteinfosfatasen (magnetiske kuler) avtar som en funksjon av fosfatase-bindende toksin i prøven.

Eksempel 3

Proteinfosfatase 2A kobles til magnetiske kuler (direkte til kulene eller via biotinylering av fosfatasen). Immobilisert proteinfosfatase blandes deretter med prøve og toksin immobilisert på kuler som bærer et immobilisert enzym. Enzymet er i stand til å produsere et påvisbart produkt (farvet eller fluorescerende) etter passende inkubering med et kromogent eller fluorogent substrat. Den immobiliserte protein-fosfatase separeres fra reaksjonsblandingen med magnetkraft. Farve eller fluorescens assosiert med proteinfosfatasen (magnetiske kuler) måles ved henholds-vis spektroskopi eller fluorimetri. Mengden farve/fluorescens assosiert med de magnetiske kulene avtar som funksjon av fosfatase-bindende toksin i prøven.

Eksempel 4

Scintillasjons-proksimitets-test

Proteinfosfatase biotinyleres og immobiliseres til brønner som på forhånd er dekket med streptavidin og et scintillasjonsmiddel (f.eks. FlashPlate PLUS Streptavidin SMP103 fra NEN). Prøven og [<125>l]mikrocystin-YR tilsettes til brønnene. Mengden [<125>l]mikrocystin-YR bundet til den immobiliserte proteinfosfatase påvises ved scintillasjonstelling.

Eksempel 5

Inhibering av binding av [<125>l]-mikrocystin-YR til proteinfosfatase 2A i nærvær av forskjellige toksiner

Eksempel 6

Effekt av eksogene forbindelser på den kompetitive bindingstest sammenlignet med proteinfosfatasebestemmelsen

Eksempel 8

Okadainsyre ekvivalenter i skalldyrekstrakter bestemt ved HPLC-analyse og ved proteinfosfatase-bindingstesten

Eksempel 9

Vedlagte diagrammer

Fig. 1 i det vedlagte diagram er et skjematisk diagram over den kompetitive bindingstest for påvisningen av proteinfosfatase-bindende toksiner.

Proteinfosfatase 2A inkuberes med [<125>l]-mikrocystin-YR og et annet toksin rettet mot proteinfosfatase 2A. Toksinet konkurrerer med [<125>l]-mikrocystin-YR om binding til fosfatasen. Tilsetning av en større mengde toksiner resulterer i redusert binding av [<125>l]-mikrocystin-YR til fosfatasen, og vice versa. Etter at bindingslikevekt er oppnådd, separeres [<125>l]-mikrocystin-YR bundet til proteinfosfatase 2A, fra fritt [<125>l]-mikrocystin-YR ved gelfiltreringskromatografi. Fraksjonen som inneholder [125l]-mikrocystin-YR bundet til fosfatasen, oppsamles, og mengden radioaktivitet bestemmes ved scintillasjonstelling.

Fig. 2 av de vedlagte diagrammer viser effekten av økende mengder av forskjellige algetoksiner på binding av [<125>l]-mikrocystin-YR til proteinfosfatase 2A.

Proteinfosfatase 2A (30 pM) ble inkubert i nærvær av 35 pM [125l]-mikrocystin-YR (1 Ci/13 ng) og 0-100 nM av forskjellige algetoksiner angitt på figuren. [<125>l]-mikrocystin-YR bundet til proteinfosfatase 2A, ble isolert ved gelfiltreringskromatografi og radioaktiviteten bestemt ved scintillasjonstelling. Hver kurve representerer gjennomsnittet av minst tre separate forsøk.

Fig. 3 av de vedlagte diagrammer viser IC5o for mikrocystin-LR-binding ved den kompetitive bindingstest.

Binding av [<125>l]-mikrocystin-YR til proteinfosfatase 2A, ble plottet inn som forholdet mellom ubundet [125l]-mikrocystin-YR (Co-Cx) og bundet [125l]-mikrocystin-YR (Cx) mot konsentrasjonen av mikrocystin-LR. Co representerer mengden bundet [<125>l]-mikrocystin-YR i fravær av mikrocystin-YR, og Cx representerer mengden bundet [<125>l]-mikrocystin-YR i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av mikrocystin-LR.

Fig. 4 av de vedlagte diagrammer illustrerer stabiliteten av [<125>l]-mikrocystin-YR bundet til proteinfosfatase 2A, i nærvær av overskudd av mikrocystin-LR.

Proteinfosfatase 2A (1 nM) ble inkubert i nærvær av [12<5>l]-mikrocystin-YR (100 pM) i 1 time. Mikrocystin-LR (2 \ iM) ble tilsatt til reaksjonsblandingen på tidspunktet 0. Mengden [<125>l]-mikrocystin-YR bundet til proteinfosfatase 2A, ble bestemt til de angitte tidspunkter ved gelfiltrering og scintillasjonstelling som beskrevet. Kurven representerer et gjennomsnitt av 4 separate forsøk.

Claims

1. Analysemetode for bestemmelse av fosfatase-målsøkende toksiner som inhiberer proteinfosfataser, karakterisert ved at analysemetoden omfatter: (A) kontakting av en fast bærer som har en første ligand immobilisert derpå med: (i) en prøve mistenkt for å være kontaminert med toksin og; (ii) en andre ligand, som ikke er immobilisert på en fast bærer, hvor enten: (a) nevnte første ligand er proteinfosfataseenzym og er i stand til å binde, på konkurrerende måte, nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte andre ligand, eller (b) nevnte andre ligand er et proteinfosfataseenzym og er i stand til å binde, på en konkurrerende måte, nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte første ligand, eller (c) minst en av nevnte første ligand og nevnte andre ligand omfatter et proteinfosfataseenzym, og nevnte første ligand og nevnte andre ligand er i stand til samtidig binding av nevnte fosfatase-målsøkende toksin, eller (d) minst en av nevnte første ligand og nevnte andre ligand omfatter et proteinfosfataseenzym, og nevnte første ligand er i stand til å binde til nevnte fosfatase-målsøkende toksin, nevnte andre ligand er i stand til å binde til et kompleks av nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte første ligand, eller (e) minst en av nevnte første ligand og nevnte andre ligand omfatter et proteinfosfataseenzym, og nevnte andre ligand er i stand til å binde til nevnte fosfatase-målsøkende toksin, og nevnte første ligand er i stand til å binde til et kompleks av den nevnte fosfatase-målsøkende toksin og nevnte andre ligand; hvor andelen av nevnte første ligand bundet av nevnte toksin, nevnte andre ligand eller komplekser av nevnte toksin og nevnte andre ligand er avhengig av toksininnholdet i nevnte prøve, og hvor enten: (f) nevnte første ligand er i stand til å danne et direkte eller indirekte detekterbart signal når det ikke er kompleksert, når kompleksert med nevnte toksin, når kompleksert med et kompleks av nevnte toksin og nevnte andre ligand eller når kompleksert med nevnte andre ligand; eller (g) nevnte andre ligand er i stand til å danne et direkte eller indirekte detekterbart signal når ikke-kompleksert eller når kompleksert, (B) separering av en bundet fraksjon fra en ikke-bundet fraksjon; og (Cc) direkte eller indirekte bestemmelse av den andre ligand bundet til den første ligand (bundet fraksjon) eller den andre ligand ikke-kompleksert i vandig løsning (ikke-bundet fraksjon); hvor tilsetning av (i) og (ii) til den faste bæreren kan bli utført separat, suksessivt eller samtidig og, om separat eller suksessivt i en hvilken som helst rekkefølge.

2. Analysemetode ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte fosfatase-målsøkende toksin produseres av alger eller cyanobakterier.

3. Analysemetode ifølge ett av kravene 1 og 2, karakterisert ved at nevnte fosfatase-målsøkende toksin er et hepatotoksin eller okadainsyre.

4. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved ati opsjonene (a) og (b) konkurrerer toksinmolekylene forekommende i prøven med nevnte andre ligand om et begrenset antall bindingsseter på den nevnte første ligand, og eventuelt forekommende toksin i nevnte prøve bestemmes i forhold til graden av andre ligand bundet til, eller ikke bundet til, bindingssetene på den første ligand.

5. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at nærværet eller fraværet av et fosfatase-målsøkende toksin bestemmes.

6. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at prøven som undersøkes er overflate- eller fri fuktighet fra skalldyr, eller vann tatt fra det miljø hvor slike skalldyr lever, eller vann tatt fra lokale vannverk.

7. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at når den først liganden er en proteinfosfatase er den andre liganden et antistoff eller antistoff-fragment, og når den andre liganden er en proteinfosfatase er den første liganden et antistoff eller antistoff-fragment.

8. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at proteinfosfatasen er protein-fosfatase 2A.

9. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at enten den første eller andre liganden bærer en rapportørdel.

10. Analysemetode ifølge krav 9, karakterisert ved at den andre ligand bærer en rapportørdel.

11. Analysemetode ifølge krav 10, karakterisert ved at den første ligand er et proteinfosfataseenzym, den andre ligand er et merket peptid-hepatotoksin eller merket okadainsyre.

12. Analysemetode ifølge krav 11, karakterisert ved at hepatotoksinet er valgt fra nodularin, mikrocystin LR eller mikrocystin YR.

13. Analysemetode ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at den faste bærer er en teststrimmel eller fast matriks.

14. Analysemetode ifølge krav 13, karakterisert ved at den faste matriks er polymere eller magnetiske kuler.

15. Sett for påvisning av fosfatase-målsøkende toksiner som inhiberer proteinfosfataser, karakterisert ved at det omfatter: en fast fase på hvilken det er immobilisert en første ligand; en andre ligand, fortrinnsvis i vandig løsning eller kompleksert til den første ligand; og hvor den første og/eller andre ligand er et proteinfosfataseenzym; hvor verken den nevnte immobiliserte eller andre ligand omfatter en direkte eller indirekte påvisbar del, en rapportørdel som er i stand til binding til én av nevnte første og andre ligander og frembringelse av et påvisbart signal, hvor nevnte påvisbare del eller signal fortrinnsvis er direkte avlesbart uten laboratoriesutstyr.

16. Sett ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte fosfatase-målsøkende toksin produseres av alger eller cyanobakterier.

17. Sett for deteksjon av fosfatase-målsøkende toksiner som inhiberer proteinfosfatasen ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at settet omfatter: en fast fase på hvilken det er immobilisert et proteinfosfatase-enzym som en toksin-bindende ligand; et rapportørmolekyl som er i stand til kompetitivt å inhibere binding av fosfatase-målsøkende toksiner til nevnte toksin-bindende ligand og frembringelse av et signal som er avlesbart uten laboratorieutstyr.

18. Sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 17, karakterisert ved at nevnte sett omfatter magnetisk fortrengbare polymere mikrokuler, hvor det på disse er immobilisert en proteinfosfatase; gull-sol-merkede peptid-heptatoksinmolekyler som er i stand til kompetitivt å inhibere binding av cyanobakterietoksiner til nevnte proteinfosfatase.

19. Sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 17, karakterisert ved at nevnte sett omfatter magnetisk fortrengbare polymere mikrokuler som på disse har immobilisert en proteinfosfatase; gull-sol-merkede okadainsyremolekyler som er i stand til kompetitivt å inhibere binding av algetoksiner til nevnte proteinfosfatase.

20. Sett for deteksjon av fosfatase-målsøkende toksiner, karakterisert ved at nevnte sett omfatter: en fast fase på hvilken det er immobilisert en første ligand; en andre ligand, fortrinnsvis i vandig løsning eller kompleksert til den første ligand; og hvor den første og/eller andre ligand er et proteinfosfataseenzym; hvor enten nevnte første eller andre ligander bærer en rapportørdel som er i stand til å danne et detekterbart signal, idet nevnte detekterbare signal fortrinnsvis er direkte avlesbart uten laboratorieutstyr.

21. Anvendelse av et sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 19 for bestemmelse av fosfatase-målsøkende toksiner.