ES2237953T3

ES2237953T3 - Determinacion de toxinas dirigidas a fosfatasa.

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Publication number: ES2237953T3
Application number: ES99954218T
Authority: ES
Inventors: Stein Ove University of Bergen DOSKELAND; Margrethe Hauge University of Bergen SERRES; Kari Espolin University of Bergen FLADMARK
Original assignee: Biosense Laboratories AS
Current assignee: Biosense Laboratories AS
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-11
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2019-11-11
Also published as: PL198749B1; JP2002529738A; KR100674517B1; CN1249435C; NZ511757A; IL143047A; NO20012304L; EA002710B1; AU769203B2; IL143047A0; HK1040546A1; NO328021B1; CA2349942A1; BR9915299A; ID30236A; DE69923581T2; ZA200103796B; NO20012304D0; CZ20011673A3; EP1129352A1

Abstract

Un método de análisis para la determinación de las toxinas dirigidas a fosfatasa que inhiben las proteínas fosfatasas que comprende poner en contacto un soporte sólido que tiene un ligando inmovilizado sobre él con: (i) una muestra sospechosa de estar contaminada con toxinas y (ii) un ligando no inmovilizado, en el que dicho ligando inmovilizado es capaz de unirse al menos a una de dichas toxinas, a dicho ligando no inmovilizado o a los complejos de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es capaz de unirse al menos a uno de dichos ligandos inmovilizados, a dicha toxina o a los complejos de dicha toxina y dicho ligando inmovilizado, por lo que la proporción de dicho ligando inmovilizado unido a dicha toxina, dicho ligando no inmovilizado o los complejos de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado dependen del contenido en toxina de dicha muestra y en el que dicho ligando que se une a la toxina inmovilizado y/o no inmovilizado es una enzima y en el que dicho ligando inmovilizado es capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable cuando no está acomplejado, cuando está acomplejado con dicha toxina, cuando está acomplejado por un complejo de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado o cuando está acomplejado por dicho ligando no inmovilizado o dicho ligando no inmovilizado es capaz de generar una señal directa o indirectamente detectable cuando no está acomplejado o cuando está acomplejado, separar una fracción unida de una fracción no unida; y determinar directa o indirectamente el ligando no inmovilizado unido al ligando inmovilizado (fracción unida) o no acomplejado en solución acuosa (fracción no unida); en el que la aplicación de (i) y (ii) al soporte sólido se puede realizar por separado, sucesiva o simultáneamente y si es por separado o sucesivamente, se puede realizar en cualquier orden.

Description

Determinación de toxinas dirigidas a fosfatasa.

La presente invención se refiere a un método de análisis para la detección de toxinas dirigidas a fosfatasa producidas normalmente por microalgas tales como, por ejemplo, cianobacterias y dinoflagelados.

Los dinoflagelados normalmente son algas biflageladas unicelulares y fotosintéticas. Algunos de los dinoflagelados marinos (p. ej. Prorocentrum sp. y Dinophysis sp.) producen toxinas dirigidas a fosfatasa tales como el ácido ocadaico y la toxina dinofisis, que producen problemas gastrointestinales si son ingeridos por el hombre. Dichas algas pueden ser por lo tanto problemáticas si contaminan los hábitats de los mariscos para el consumo.

Las cianobacterias, que con frecuencia se denominan algas verde-azuladas, son también organismos fotosintéticos que son principalmente acuáticos y habitan las aguas costeras, el mar abierto y los océanos, ríos, lagos y aguas subterráneas pero también pueden ser terrestres y encontrarse en lechos de hojas y en el suelo.

Muchas especies y cepas de cianobacterias, en particular Microcystis sp., Aphanizomenon sp., Anabena sp., Nodularia sp. y Oscillatoria sp., producen toxinas que si son ingeridas por el hombre u otros mamíferos, aves e incluso peces, pueden producir enfermedades. La ingestión de dichas toxinas tiene lugar por dos vías principales, ya sea bebiendo agua contaminada o comiendo alimentos marinos contaminados.

Dos tipos particulares de toxinas son producidos por las cianobacterias y los dinoflagelados. Las neurotoxinas, por ejemplo anatoxinas y saxitoxinas, producen parálisis en la víctima y por consiguiente la enfermedad con frecuencia se denomina envenenamiento con crustáceo con parálisis. El envenenamiento por dichas neurotoxinas es raro pero puede demostrarse que es mortal.

La otra forma de toxinas inactiva la proteína de las enzimas fosfatasa en las células del cuerpo uniéndose a las enzimas y afectando su capacidad para desfosforilar los sustratos de la proteína. Estas toxinas son relativamente frecuentes, y algunas (tales como las toxinas de dinoflagelados ácido ocadaico y toxina dinofisis) pueden producir náuseas, vómitos y diarrea y por consiguiente la enfermedad se denomina con frecuencia envenenamiento diarreico con crustáceos. Algunas toxinas dirigidas a la proteína fosfatasa son activadores tumorales y la exposición a estas toxinas puede conducir al cáncer. Otras, tales como las toxinas cianobacterianas microcistina y nodularina son hepatotóxicas y producen daños en el hígado. Las más extendidas de estas toxinas dirigidas a fosfatasa son microcistina, nodularina y ácido ocadaico.

Las fuentes más frecuentes de envenenamiento por toxina de dinoflagelado son los crustáceos y el hígado de los peces y la causa más frecuente de envenenamiento por toxinas de cianobacterias es el agua potable y/o de baño contaminadas. Ambas toxinas cianobacterianas y de dinoflagelados sin embargo pueden albergarse en crustáceos y en el agua. Una fuente particularmente frecuente de envenenamiento por toxina de algas son los mejillones ya que ellos acumulan las toxinas durante la alimentación en las algas productoras de toxina. Otros crustáceos, por ejemplo las ostras, las almejas y las veneras pueden también estar afectados.

Además, los suministros de agua potable, particularmente si proceden de agua subterránea, pueden contaminarse con cianobacterias y de este modo proporcionar una vía directa para la ingestión de toxinas.

Existe algún interés con respecto al consumo de algas y cianobacterias como alimentos saludables con alto contenido en proteínas y auxiliares de la dieta. No existen directrices oficiales para controlar la contaminación de las algas o cianobacterias recogidas por las cepas productoras de toxinas y la comercialización de géneros tales como Anabena y Aphanizomenon es particularmente inquietante ya que dentro de ellas pueden encontrarse numerosas cepas productoras de toxinas.

Además de la incomodidad a corto plazo, los costes sanitarios, los costes comerciales para la industria marisquera, la pérdida de horas de trabajo, etc. que provienen de la exposición a las toxinas de las algas, como se mencionó anteriormente se ha encontrado que las toxinas microcistina y nodularina dirigidas a fosfatasa son activadores tumorales y se cree que la exposición repetida a dichas toxinas en el nivel clínico o subclínico, particularmente en combinación con un elevado consumo de alcohol o de tabaco puede producir cáncer, especialmente de hígado.

Actualmente, existen numerosos métodos diferentes para la detección y cuantificación de las toxinas dirigidas a fosfatasa, en algas y cianobacterias. Un método normalizado implica la molienda de mejillones u otras fuentes potenciales de toxinas dirigidas a fosfatasa y la inyección de un extracto del tejido de mejillón molido en ratones. Se determina a continuación la presencia y nivel de contaminación de la toxina dirigida a fosfatasa en relación con la supervivencia del ratón (Stabell et al. (1992), Food. Chem. Toxicol. 30(2):139-44). Desde luego, este es un método largo, tosco y costoso de evaluación de la seguridad y control de calidad de los alimentos.

Otro método para la determinación de venenos diarreicos en crustáceos (DSP) (documento EP-A-554458 de Iatron Laboratories Inc.) implica la utilización de un primer y segundo anticuerpo contra la toxina en un análisis convencional en sandwich.

Otro método implica la medición de la reducción de la actividad enzimática de fosfatasa añadida exógenamente detectando de este modo la presencia de toxinas dirigidas a fosfatasa en el crustáceo. De nuevo esto implica la molienda de los mejillones o de otros tejidos de crustáceos, liberando las fosfatasas endógenas que interfieren con la fosfatasa añadida, alterando la sensibilidad y precisión de la prueba (Sim y Mudge (1994) en Detection Methods for Cyanobacterial Toxins Eds. Codd, Jeffries, Keevil y Potter, Royal Society of Chemistry, y el documento US-A-5180665 de Charles Holmes.

Existe por consiguiente mucha necesidad de un análisis o método rápido, sensible y económico que permita la determinación cualitativa y/o cuantitativa de la presencia de toxinas dirigidas a fosfatasa, en particular toxinas dirigidas a fosfatasa de algas y de cianobacterias, en agua, crustáceos y/o productos comestibles de algas o cianobacterias. En particular, existe necesidad de un método de análisis que sea bastante sencillo para ser realizado in situ por personal relativamente no experto o no experto, por ejemplo pescaderos o personal de saneamiento del agua y que no requiera equipo de laboratorio o instalaciones especiales para su realización.

Por lo tanto, según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de análisis para la determinación de las toxinas dirigidas a fosfatasa que inhiben las proteínas fosfatasas que comprende poner en contacto un soporte sólido que tiene un ligando inmovilizado sobre él con:

(i) una muestra sospechosa de estar contaminada con toxinas y

(ii) un ligando no inmovilizado,

en el que dicho ligando inmovilizado es capaz de unirse al menos a una de dichas toxinas, a dicho ligando no inmovilizado o a los complejos de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es capaz de unirse al menos a uno de dichos ligandos inmovilizados, a dicha toxina o a los complejos de dicha toxina y dicho ligando inmovilizado, por lo que la proporción de dicho ligando inmovilizado unido a dicha toxina, dicho ligando no inmovilizado o los complejos de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado dependen del contenido en toxina de dicha muestra y

en el que dicho ligando inmovilizado es capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable cuando no está acomplejado, cuando está acomplejado con dicha toxina, cuando está acomplejado por un complejo de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado o cuando está acomplejado por dicho ligando no inmovilizado o dicho ligando no inmovilizado es capaz de generar una señal directa o indirectamente detectable cuando no está acomplejado o cuando está acomplejado,

separar una fracción unida de una fracción no unida; y

determinar directa o indirectamente el ligando no inmovilizado unido al ligando inmovilizado (fracción unida) o no acomplejado en solución acuosa (fracción no unida);

en el que la aplicación de (i) y (ii) al soporte sólido se puede realizar por separado, sucesiva o simultáneamente y si es por separado o sucesivamente, se puede realizar en cualquier orden.

Por lo tanto, en una realización la determinación de la toxina puede implicar la determinación del ligando no inmovilizado que no ha podido unirse directa o indirectamente al ligando inmovilizado. Cuando el ligando no inmovilizado compite para unirse al ligando inmovilizado con la toxina, una concentración alta de ligando no unido es indicio de una concentración elevada de toxina. Cuando el ligando no inmovilizado puede acomplejar la toxina unida al ligando inmovilizado, entonces una gran concentración de ligando no unido es indicio de un bajo nivel de concentración de toxina.

En otra realización, la determinación de la toxina implica la determinación del ligando no inmovilizado que se ha unido directa o indirectamente al ligando inmovilizado. Cuando la toxina y el ligando no inmovilizado compiten para unirse al ligando inmovilizado, entonces una concentración elevada de ligando unido es indicio de un bajo nivel de concentración de toxina. Cuando el ligando no inmovilizado puede acomplejar la toxina unida al ligando inmovilizado, entonces una gran concentración de ligando unido es indicio de un elevado nivel de concentración de toxina.

Preferentemente, sin embargo el método de la invención implica un análisis de enlace competitivo para la detección de toxinas dirigidas a fosfatasa, en particular toxinas de algas y de cianobacterias, en las que las moléculas de toxina presentes en una muestra compiten con el ligando no inmovilizado para un número limitado de puntos de enlace del ligando inmovilizado y cualquier toxina presente en dicha muestra se determina en comparación con la extensión del ligando no inmovilizado unido o no unido a los puntos de enlace del ligando inmovilizado.

Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "detección", "determinación" o "evaluación" incluyen tanto la cuantificación en el sentido de la obtención de un valor absoluto para la cantidad o concentración de toxinas dirigidas a fosfatas, presentes en la muestra como también la evaluación o determinación semicuantitativa y cualitativa. Se puede determinar un índice, proporción, porcentaje o indicación molar de la concentración o de la cantidad de toxina presente o como alternativa se puede obtener una indicación simple de la presencia o ausencia de tales toxinas en la muestra. En un aspecto preferido de la invención se consigue una simple presencia o ausencia o la determinación semicuantitativa de la presencia de la toxina. A este respecto "ausencia" de toxina puede significar que la concentración de toxina es inferior al límite de detección del análisis o es inferior a un nivel que se considera que es seguro o tolerable.

Las muestras utilizadas en el método de análisis de la invención pueden ser cualquier muestra sospechosa de exposición a toxinas dirigidas a fosfatasa, quizás por la exposición a microorganismos productores de la toxina dirigida a fosfatasa, por ejemplo agua, que puede ser agua de mar, agua corriente, agua subterránea, agua tomada de lagos, ríos, pozos, corrientes, depósitos, suministros de agua doméstica o puede ser humedad extraída de crustáceos, por ejemplo, mediante simple purgado o extracción utilizando una pipeta o agua en la que se ha dejado remojar el crustáceo o puede ser un artículo alimenticio, aditivo alimenticio, complemento nutritivo, remedio alternativo o producto similar que sea producido por las algas o cianobacterias o en ellas. Cuando el crustáceo contiene agua libre (p. ej., como en las ostras), el análisis puede implicar mojar un sustrato absorbente (soporte sólido) en esta agua. Como alternativa puede implicar simplemente presionar un sustrato absorbente contra la carne mojada del crustáceo, p. ej., tras romper o abrir el caparazón.

En un aspecto preferido de la invención la muestra bajo investigación es la humedad en superficie o libre del crustáceo.

Todos los tipos de crustáceos, por ejemplo veneras, gambas, mejillones y ostras son sensibles al método de análisis de la invención pero en un aspecto preferido, los crustáceos son los mejillones. En otro aspecto preferido, la muestra bajo investigación es agua extraída del hábitat en el que vive dicho crustáceo y en otro aspecto preferido, la muestra es agua extraída de suministros de agua doméstica.

La muestra utilizada para análisis puede utilizarse de una manera esencialmente no tratada, pero opcionalmente puede filtrarse por cualquier método conocido o diluirse añadiendo agua, tampón o cualquier medio acuoso antes del análisis y almacenarse o conservarse, por ejemplo, por enfriamiento o congelación antes del análisis.

En el método de la invención se puede utilizar cualquier ligando que se una a la toxina como ligando inmovilizado o no inmovilizado, por ejemplo anticuerpos, que pueden ser policlonales o monoclonales o fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, los fragmentos F(ab), F(ab')_{2} o F(v). Dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser monovalentes o divalentes y pueden ser producidos por tecnología de hibridoma o ser de origen sintético, ya sea como productos de tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Se podrían utilizar por ejemplo anticuerpos de una sola cadena u otros derivados o simulados de anticuerpos. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden dirigirse o producirse contra cualquier epítopo, componente o estructura de las toxinas dirigidas a fosfatasa como resulte apropiado. Como alternativa, se podrían utilizar los compuestos con afinidad para la toxina, por ejemplo, una pequeña molécula orgánica o péptido, p. ej., un oligopéptido o polipéptido capaz de unirse de forma específica a la toxina, por ejemplo, un aglutinante específico seleccionado de una química combinatoria o banco de exposición del fago o una secuencia de enlace específico de ADN o ARN.

Preferentemente sin embargo, el ligando de unión a la toxina de la presente invención es una proteína de la enzima fosfatasa, y aún más preferentemente en este método de análisis se utiliza la proteína fosfatasa 2A (pp2A) del ligando de unión.

Asimismo, el segundo ligando utilizado en el método de la invención puede ser cualquier ligando que se una a la toxina ya sea competitiva o no competitivamente con el primer ligando. Como alternativa, el segundo ligando puede ser cualquier ligando que compita con la toxina para unirse al primer ligando. Preferentemente el primer ligando es un ligando que se une a la toxina, más preferentemente a una proteína de la enzima fosfatasa. Uno de los dos ligandos puede estar inmovilizado y el otro puede estar no inmovilizado y uno de los ligandos puede ser directa o indirectamente detectable. En una realización preferida el ligando no inmovilizado debería reunir los requisitos funcionales que inhiben competitivamente la unión de la toxina al ligando inmovilizado y pueden producir directa o indirectamente una señal detectable, p. ej. puede ser una molécula que se puede marcar utilizando un grupo formador de señal directa o indirecta de cualquier forma conocida. Dichos ligandos así mismo pueden tomar la forma de anticuerpo, que pueden ser policlonales o monoclonales o fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, los fragmentos F(ab), F(ab')_{2} o F(b). Dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser monovalentes o divalentes y pueden ser producidos por tecnología de hibridoma o ser de origen sintético, ya sea como productos de tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Se podrían utilizar, por ejemplo, anticuerpos de una sola cadena u otros derivados o simulados de anticuerpos y pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, oligipéptidos y polipéptidos seleccionados de los bancos combinatorios o de exposición del fago. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden dirigirse o producirse contra cualquier epítopo, componente o estructura de la molécula de toxina dirigida a fosfatasa o al ligando que se une a la molécula dirigida a fosfatasa como resulte apropiado. Como alternativa, se podrían utilizar los compuestos con afinidad para la toxina o para el ligando que se unen a la toxina, por ejemplo, una pequeña molécula orgánica o péptido, oligopéptido o polipéptido capaz de unirse de forma específica a la toxina, por ejemplo, un aglutinante específico seleccionado de una química combinatoria o de un banco de exposición del fago o una secuencia de enlace específica de ADN o ARN.

El grupo indicador que llevará generalmente uno de los ligandos puede ser un punto de enlace para un grupo directamente detectable, p. ej., un sol metálico (p. ej., sol de oro), un cromóforo o un fluoróforo (p. ej., una cianina, ftalocianina, merocianina, trifenilmetilo, equinance, etc.) véase Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing Chromophores, editado por M. Matsuoka, Plenum Press, Nueva York, NY, 1990, Topics in Applied Chemistry, The Chemistry and Application of Dyes, Waring et al., Plenum Press, Nueva York, NY, 1990, y Handbook of Fluorescent Probes Inc. 1996, un radiomarcador, una enzima, una partícula magnética, un agente inductor de turbidez, etc., o puede llevar ya dicho grupo directamente detectable. Cuando el grupo indicador lo lleva el ligando inmovilizado generalmente será un punto de enlace para un grupo directamente detectable cuyo punto de enlace está activado, o más generalmente desactivado, cuando el ligando está acomplejado.

Preferentemente el grupo indicador lo lleva el ligando no inmovilizado.

En una realización preferida de la invención, el ligando no inmovilizado es p. ej., una enzima o cromóforo marcado o el péptido hepatotoxina marcado con fluoróforo, p. ej., una hepatotoxina seleccionada de nobularina, microcistina LR o microcistina YR o como alternativa ácido ocadaico.

Si bien es posible el marcado con radiomarcadores, ya que el análisis está destinado principalmente a su utilización in situ por usuarios no expertos, es preferible utilizar grupos indicadores que dan una señal visible, p. ej., grupos cromóforos, fluoróforos, fosforescentes, agentes inductores de turbidez, agentes inductores de producción de gas, etc.

Cuando el grupo formador de la señal es un material que se une a un punto de enlace en uno de los ligandos, se pondrá en contacto de forma conveniente con la fracción unida o no unida, apropiada, tras la separación de las fracciones unida y no unida.

En general, cuando la señal procede de la fracción unida, será preferible enjuagar el sustrato, p. ej., con agua, arrastrar la fracción no unida antes de detectar el ligando o de que se genere y detecte.

Cualquier especie o cepa de algas o cianobacterias que produzca toxinas dirigidas a fosfatasa puede ser objeto de la presente invención, pero es particularmente aplicable a cepas de cianobacterias productoras de toxinas, por ejemplo, Microcystis aeroginosa, especies de Anabena, Nodularia spuragena y Anabena flus-aquae o algas. Por lo tanto, por ejemplo, las toxinas microcistina-LR y microcistina-YR son producidas por Microcystis sp., la toxina nodularina es producida por Nodularia sp. y la toxina ácido ocadaico es producida por Prorocentrum sp.

Las toxinas objeto de determinación por el presente método pueden ser asimismo cualquier toxina dirigida a fosfatasa producida por algas o cianobacterias, pero en aspectos preferidos las toxinas de péptido son hepatotoxinas (de las cuales la microcistina y la nodularina son las más frecuentes) o el ácido ocadaico.

Por lo tanto, en su sentido más general, el método de la invención implica poner en contacto simplemente una muestra sospechosa de contaminación con toxinas dirigidas a fosfatasa, con un ligando que se une a la toxina y una molécula indicadora capaz de competir con dicha toxina en los puntos de enlace de los ligandos ya sea de forma simultánea, secuencial o por separado en cualquier orden, estando unida opcionalmente la molécula indicadora al ligando de enlace antes de la exposición a la muestra bajo investigación, y determinando la molécula indicadora que está unida a la fase sólida o libre en solución.

La fracción unida se puede separar de la fracción no unida antes de la evaluación del indicador por cualquier medio adecuado, por ejemplo, precipitación, centrifugación, filtración, medios cromatográficos, acción capilar o simplemente por purgado. La fase sólida puede estar, por ejemplo, en forma de una varilla o de una matriz sólida en cualquier forma conocida, por ejemplo, granos poliméricos o magnéticos, por ejemplo, Dynabeads® (disponible en Dynal AS). En las realizaciones preferidas de la presente invención, la fase sólida en la que se inmovilizan los ligandos que se unen a la toxina está en forma de Dynabeads®.

La molécula indicadora se puede evaluar ya sea en la fracción unida o en la no unida dependiendo de la realización específica de la invención pero preferentemente se evalúa en la fracción unida.

El ligando inmovilizado se puede inmovilizar por cualquier medio conocido, por ejemplo uniendo o acoplando el ligando a cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos que se utilizan actualmente ampliamente o se proponen para la separación o inmovilización, por ejemplo, fases sólidas pueden tomar la forma de partículas, hojas, geles, filtros, membranas, fibras o capilares o tiras de microvaloración, tubos o placas de pocillos, etc. y en la práctica se pueden construir de vidrio, sílice, látex, un material polimérico o bolas magnéticas. Las técnicas para unir el ligando al soporte sólido son bien conocidas en la materia y se describen ampliamente en la bibliografía. En las realizaciones preferidas de la presente invención, la fase sólida en la que se inmovilizan los ligandos que se unen a la toxina dirigida a fosfatasa está en forma de Dynabeads®.

El método de análisis de la presente invención presenta la ventaja de que se puede realizar sin necesidad de equipo complejo de laboratorio y se puede realizar por una persona relativamente no experta o no experta. Por consiguiente el método de análisis es adecuado para su utilización en casa, en comercios o en el campo y se puede realizar rápida y fácilmente sin necesidad de un trabajo intenso o productos químicos peligrosos.

Es de particular ventaja en el análisis de la presente invención el grado de sensibilidad muy elevado que es de crítica importancia cuando se analizan muestras en las que la toxina está presente a concentraciones muy bajas, por ejemplo, en el análisis de agua potable o en la evaluación de la posible polución con toxina dirigida a fosfatasa. Normalmente el análisis es capaz de detectar toxinas en concentraciones picomolares, p. ej. tan bajas como 10 pM. Prácticamente, el análisis se puede utilizar para detectar toxinas en el intervalo de 15 a 560 pM.

Una ventaja más del presente análisis en relación con las técnicas existentes es que el presente análisis no está afectado por la presencia de fosfatasas endógenas que pueden estar presentes en las muestras bajo análisis, particularmente, por ejemplo, si las muestras se toman en crustáceos.

En una realización de la presente invención, se inmoviliza una proteína fosfatasa sobre un soporte sólido, la fosfatasa inmovilizada se pone en contacto con la muestra bajo investigación y cualquier toxina dirigida a fosfatasa presente en la muestra se une a la fosfatasa inmovilizada. Se añade una fuente de moléculas indicadoras que compiten con la toxina por los puntos de enlace a la fosfatasa. Las moléculas del indicador desplazan las moléculas de toxinas de los puntos de enlace hasta un grado que depende de la concentración relativa de las moléculas de toxina y de las moléculas del indicador. El grado de enlace de la molécula de indicador facilita la determinación de la toxina presente en la muestra bajo investigación. Los indicadores/marcadores preferidos incluyen radiomarcadores, cromóforos (incluyendo fluoróforos) y enzimas que dan lugar a productos cromógenos o fluorógenos. Los marcadores de centelleo por proximidad y los marcadores que dan lugar a un cambio de dispersión de la luz que se puede medir, también deben ser considerados.

En una realización alternativa, las moléculas de fosfatasa bloqueadas por el indicador inmovilizado en el soporte se ponen en contacto con la muestra bajo investigación y cualquiera de las toxinas dirigidas a fosfatasa presentes en la muestra compiten con las moléculas de indicador unidas a la fosfatasa desplazándolas de la fase sólida a la fase acuosa en un grado proporcional a la cantidad de toxina presente en la muestra. Se evalúa a continuación la cantidad de molécula de indicador que permanece unida a la fase sólida para facilitar la determinación de la presencia de toxina en la muestra bajo investigación.

Vista desde otro aspecto, la invención proporciona un kit para la detección de toxinas dirigidas a fosfatasa de cianobacterias o algas, según la invención, comprendiendo dicho kit:

una fase sólida en la que se inmoviliza un ligando;

un ligando no inmovilizado, preferentemente en solución acuosa o acomplejado con el ligando inmovilizado; en el que ninguno de dichos ligandos inmovilizado y no inmovilizado incluye un grupo directa o indirectamente detectable, un grupo indicador capaz de unirse a uno de dichos ligandos inmovilizados y no inmovilizados y generar una señal detectable, siendo legible preferentemente dicho grupo o señal detectable directamente sin equipo de laboratorio.

En una realización preferida, el kit de presente invención comprende:

una fase sólida en la que están inmovilizados los ligandos que se unen a la toxina dirigida a fosfatasa;

una molécula de indicador capaz de inhibir de forma competitiva la unión de las toxinas dirigidas a fosfatasa a dicho ligando de unión a la toxina y generar una señal legible sin equipo de laboratorio.

Una realización especialmente preferida del kit de la invención comprende microesferas de polímero magnéticamente desplazables que tienen inmovilizada en ellas una proteína fosfatasa;

moléculas de péptido hepatotoxina marcadas con sol de oro capaces de inhibir de forma competitiva las toxinas cianobacterianas que se unen a dicha proteína fosfatasa.

Una realización adicional especialmente preferida del kit de la invención comprende microesferas de polímero magnéticamente desplazables que tienen inmovilizada en ellas una proteína fosfatasa;

moléculas de ácido ocadaico marcadas con sol de oro capaces de inhibir de forma competitiva las toxinas de algas que se unen a dicha proteína fosfatasa.

En otro aspecto preferido, la utilización del kit implica mojar un sustrato celulósico poroso en el que está inmovilizado el ligando que se une a la toxina y que está impregnado con un ligando marcado por cromóforo (o fluoróforo, etc.) que se une competitivamente a una muestra de agua o fluido de crustáceo, permitiendo incubar el sustrato saturado durante un periodo prefijado (ya sea extraído de la muestra o en un volumen prefijado de la muestra), eliminando el ligando marcado no unido, p. ej., arrastrando el sustrato con agua libre de toxina o dejando empapar el sustrato durante un periodo prefijado en un volumen prefijado de agua exenta de toxina e inspeccionando el color del sustrato o del agua empapada. El sustrato se monta, convenientemente, en un soporte, preferentemente uno marcado con colores de calibración para facilitar la comparación del sustrato o remojando el color en agua para determinar la concentración de toxina o para indicar si la concentración de toxina está por encima o por debajo de uno o más de los valores umbral.

A continuación se ilustra la invención mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

Materiales

Microcistina YR, microcistina-LR, ácido ocadaico, nodularina, caliculina A y tautomicina se adquirieron en Calbiochem (San Diego, CA). Na^{125}I exento de portador y [\gamma-^{32}P]ATP se adquirieron en Amersham (Little Chalfont, UK). Albúmina (calidad RIA), acetato de amonio, cloramina T, sulfóxido de dimetilo (DMSO), ditioeritritol (DTE), EDTA, EGTA, glicerol, Hepes, histona II-AS, metabisulfito de sodio e inhibidor de tripsina (soja) se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO). Acetonitrilo y ácido trifluoroacético (TFA) se adquirieron en Rathburn (Walkerburn, Escocia). La proteína fosfatasa 2A parcialmente purificada se adquirió en Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) o se purificó según Resink et al. (Eur. J. Biochem. 133:455-461 (1983)).

Yodación de microcistina-YR

La microcistina YR (10 \mug) se yoda con 1 mCi de Na^{125}I exenta de portador (37 MBq) utilizando cloramina T tal como describe Ciechanover et al., (PNAS 77: 1365-1368 (1980)).

Tras la reacción de yodación, se separa el yoduro de [^{125}I]microcistina-YR utilizando cartuchos Sep-Pak® Plus (Waters, Milford, MA) según el método de Runnegar et al. (Toxicon 24: 506-509 (1986)). La [^{125}I]microcistina-YR se aplica a una columna de HPLC Inertsil ODS-2 de 3\times250 mm de Chrompack (Raritan, NJ) y se eluye con un gradiente de acetonitrilo.

Análisis de enlace competitivo

El análisis de enlace competitivo se realiza en un volumen de 0,5 ml tamponado con Hepes 50 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM, EGTA 0,3 mM, DTE 1 mM, MnCl_{2} 5 mM, 0,5 mg ml^{-1} de BSA y 0,2 mg ml^{-1} de inhibidor de tripsina. Se añaden toxinas de algas diluidas en DMSO al 100% al análisis a 0-100 nM en una concentración final de DMSO al 10%. Se añade [^{125}I]microcistina-YR (1 Ci/13 ng) a 35 pM. Se añade por último proteína fosfatasa 2A (30 pM) y se incuba la mezcla de reacción en hielo durante la noche. Se separa la [^{125}I]microcistina-YR unida a la proteína fosfatasa 2A de la [^{125}I]microcistina-YR por filtración en gel utilizando Sephadex® G-50 fino de Pharmacia (Uppsala, Suecia) en columnas de 0,7 \times 15 cm de Bio-Rad (Hercules, CA). En la separación que se realiza a 4ºC se utiliza un tampón Hepes 50 mM (pH 7,2) con EDTA 1 mM y EGTA 0,3 mM. Se recoge la fracción que contiene [^{125}I]microcistina-YR que se une a la proteína fosfatasa 2A y se cuantifica la radioactividad mediante recuento por centelleo. Se detecta el enlace no específico de [^{125}I]microcistina-YR en una reacción de referencia en la que se añade microcistina-LR en exceso (1 \muM).

Ejemplo 1

La proteína fosfatasa 2A se acopla a bolitas magnéticas (directamente a las bolitas o mediante biotinilación de la fosfatasa). La proteína fosfatasa inmovilizada se mezcla a continuación con la muestra y la toxina radiomarcada (p. ej. [^{125}I]-microcistina-YR). La proteína fosfatasa inmovilizada se separa de la mezcla de reacción mediante fuerzas magnéticas. La radioactividad asociada a la proteína fosfatasa (bolita magnética) se detecta mediante recuento por centelleo. La cantidad de radiomarcador asociado a la proteína fosfatasa disminuye en función de la toxina que se une a la fosfatasa en la muestra.

Ejemplo 2

La proteína fosfatasa 2A se acopla a bolitas magnéticas (directamente a las bolitas o mediante biotinilación de la fosfatasa). La proteína fosfatasa inmovilizada se mezcla a continuación con la muestra y la toxina acoplada a las bolitas coloreadas. La proteína fosfatasa inmovilizada se separa de la mezcla de reacción mediante fuerzas magnéticas. Las bolas coloreadas asociadas a la proteína fosfatasa (bolitas magnéticas) se evalúan a simple vista o mediante un microscopio de baja ampliación (p. ej. Nikon TMS). La cantidad de bolas coloreadas asociadas a la proteína fosfatasa (bolas magnéticas) disminuye en función de la toxina que se une a la fosfatasa en la muestra.

Ejemplo 3

La proteína fosfatasa 2A se acopla a bolitas magnéticas (directamente a las bolitas o mediante biotinilación de la fosfatasa). La proteína fosfatasa inmovilizada se mezcla a continuación con la muestra y la toxina inmovilizada en las bolitas que llevan una enzima inmovilizada. La enzima es capaz de producir un producto detectable (coloreado o fluorescente) durante la incubación apropiada con un sustrato cromógeno o fluorógeno. La proteína fosfatasa inmovilizada se separa de la mezcla de reacción mediante fuerzas magnéticas. El color o la fluorescencia asociada a la proteína fosfatasa (bolitas magnéticas) se mide por espectroscopía o fluorimetría, respectivamente. La cantidad de color/fluorescencia asociada a las bolas magnéticas disminuye en función de la toxina que se une a la fosfatasa en la muestra.

Ejemplo 4 Análisis de centelleo por proximidad

La proteína fosfatasa se biotinila y se inmoviliza en pocillos recubiertos previamente con estreptavidina y un centelleante (p. ej. FlashPlate PLUS estreptavidina SMP103 suministrado por NEN). Se añaden la muestra y [^{125}I]microcistina-YR a los pocillos. La cantidad de [^{125}I]microcistina-YR unida a la proteína fosfatasa inmovilizada se detecta mediante recuento por centelleo.

Ejemplo 5 Inhibición del enlace de [^{125}I]microcistina-YR a la proteína fosfatasa 2A en presencia de varias toxinas

	Compuesto analizado^{1}	IC _{50}^{2}(pM)
	nodularina	15
	microcistina-LR	17
	microcistina-YR	75
	ácidoocadaico	100
	caliculina A	251
	tautomicina	562
^{1} \begin{minipage}[t]{157mm} Los compuestos analizados se incubaron con [^{125}I]microcistina-YR y proteína fosfatasa 2A como se describió anteriormente.\end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{157mm} El índice IC_{50} representa la concentración necesaria para obtener una inhibición del 50% de [^{125}I]microcistina-YR que se une a la proteína fosfatasa 2A. Estos valores se determinaron según la Fig. 3. Los datos representan una media de al menos 3 experimentos independientes.\end{minipage}

Ejemplo 6 Efecto de los compuestos exógenos en el análisis del enlace competitivo en comparación con el análisis de la proteína fosfatasa

2

\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{160mm} La proteína fosfatasa 2A se
preincubó con los compuestos disueltos en Hepes 50 mM (pH 7,2) o con
tampón solo (referencia) durante 30 minutos en hielo.
\end{minipage} \cr   \hskip0.1cm 
 \begin{minipage}[t]{160mm}  Se midió la actividad de la
fosfatasa por desfosforilación de la fosfohistona como se describe.
El % de actividad corresponde a la reacción de referencia.
\end{minipage} \cr   ^{2}   \begin{minipage}[t]{160mm} La
actividad en el análisis de enlace competitivo representa la
capacidad de la proteína fosfatasa 2A para unirse a
[ ^{125}I]  microcistina-YR en presencia del
compuesto exógeno disuelto en tampón en comparación con el tampón
solo. Los datos representan un promedio de al menos tres
experimentos independientes  \pm  SEM.
\end{minipage} \cr}

Ejemplo 7 Sensibilidad del análisis de enlace para nodularina y microcistina-LR

4

^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Se disolvieron nodularina y microcistina-LR en agua MilliQ, potable o de mar en la concentración mostrada. Se analizó la capacidad de alícuotas de 300 \mu l de estas soluciones para competir con [^{125}I]microcistina-YR para el enlace de la proteína fosfatasa 2A como se describió anteriormente. \end{minipage}

^{2} Agua de mar diluída 1/10 en agua MilliQ.

Los datos se presentan como promedio \pm SEM.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Equivalentes de ácido ocadaico en extracto de crustáceo determinados por análisis de HPLC y por el análisis de enlace a la proteína fosfatasa

5

^{1} Los extractos se prepararon a partir de hepatopáncreas de mejillones recogidos a lo largo de la costa noruega.

^{2} Se analizaron los equivalentes de ácido ocadaico de los extractos por HPLC.

^{3} \begin{minipage}[t]{155mm} Se diluyeron los extractos en DMSO al 100% y se analizó su capacidad para competir con [^{125}I]microcistina-YR para unirse a la proteína fosfatasa 2A utilizando el análisis de enlace descrito anteriormente. Se determinó la concentración de equivalentes de ácido ocadaico comparando los datos con las curvas patrón de ácido ocadaico disuelto en DMSO al 100% .\end{minipage}

\newpage

Ejemplo 9 Diagramas adjuntos

La Fig. 1 del diagrama adjunto es un diagrama esquemático del análisis de enlace competitivo para la detección de las toxinas que se unen a la proteína fosfatasa.

Se incuba proteína fosfatasa 2A con [^{125}I]microcistina-YR y otra toxina dirigida hacia la proteína fosfatasa 2A. La toxina compite con la [^{125}I]microcistina-YR para el enlace a la fosfatasa. La adición de una gran cantidad de toxina produce una reducción del enlace de [^{125}I]microcistina-YR con la fosfatasa y viceversa. Tras alcanzarse el equilibrio del enlace, se separa la [^{125}I]microcistina-YR unida a la proteína fosfatasa 2A de la [^{125}I]microcistina-YR libre por cromatografía de filtración en gel. Se recoge la fracción que contiene [^{125}I]microcistina-YR unida a la fosfatasa y se determina la cantidad de radioactividad mediante recuento por centelleo.

La Fig. 2 de los diagramas adjuntos presenta el efecto de las cantidades crecientes de diferentes toxinas de algas sobre el enlace de [^{125}I]microcistina-YR a la proteína fosfatasa 2A.

Se incubó proteína fosfatasa 2A (30 pM) en presencia de 35 pM de [^{125}I]microcistina-YR (1 Ci/13 ng) y 0-100 nM de diferentes toxinas de algas indicadas en la figura. La [^{125}I]microcistina-YR unida a la proteína fosfatasa 2A se aisló por cromatografía de filtración en gel y se determinó la radioactividad mediante recuento por centelleo. Cada curva representa el promedio de por lo menos 3 experimentos independientes.

La Fig. 3 de los diagramas adjuntos presenta el IC_{50} para microcistina-LR que se une en el análisis de enlace competitivo.

El enlace de [^{125}I]microcistina-YR a la proteína fosfatasa 2A se representó como la proporción entre [^{125}I]microcistina-YR no unida (Co-Cx) y [^{125}I]microcistina-YR unida (Cx) frente a la concentración de microcistina-LR. Co representa la cantidad de [^{125}I]microcistina-YR unida en ausencia de microcistina-YR y Cx representa la cantidad de [^{125}I]microcistina-YR unida en presencia de varias concentraciones de microcistina-LR.

La Fig. 4 de los diagramas adjuntos ilustra la estabilidad de la [^{125}I]microcistina-YR unida a la proteína fosfatasa 2A en presencia de microcistina-LR en exceso.

Se incubó proteína fosfatasa 2A (1 nM) en presencia de [^{125}I]microcistina-YR (100 pM) durante 1 hora. Se añadió microcistina-LP (2 \muM) en la mezcla de reacción en el tiempo 0. Se determinó la cantidad de [^{125}I]microcistina-YR unida a la proteína fosfatasa 2A en los puntos de tiempo indicados por filtración en gel y recuento por centelleo como se describe. La curva representa un promedio de 4 experimentos por separado.

Claims

1. Un método de análisis para la determinación de las toxinas dirigidas a fosfatasa que inhiben las proteínas fosfatasas que comprende poner en contacto un soporte sólido que tiene un ligando inmovilizado sobre él con:

(i) una muestra sospechosa de estar contaminada con toxinas y

(ii) un ligando no inmovilizado,

en el que dicho ligando inmovilizado es capaz de unirse al menos a una de dichas toxinas, a dicho ligando no inmovilizado o a los complejos de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado, y dicho ligando no inmovilizado es capaz de unirse al menos a uno de dichos ligandos inmovilizados, a dicha toxina o a los complejos de dicha toxina y dicho ligando inmovilizado, por lo que la proporción de dicho ligando inmovilizado unido a dicha toxina, dicho ligando no inmovilizado o los complejos de dicha toxina y dicho ligando no inmovilizado dependen del contenido en toxina de dicha muestra y en el que dicho ligando que se une a la toxina inmovilizado y/o no inmovilizado es una enzima y

separar una fracción unida de una fracción no unida; y

2. Un método de análisis según la reivindicación 1, en el que dicha toxina dirigida a fosfatasa es producida por algas o por cianobacterias.

3. Un método de análisis según una de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la toxina que se debe determinar es una hepatoxina o ácido ocadaico.

4. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moléculas de toxina presentes en la muestra compiten con el ligando no inmovilizado para un número limitado de puntos de enlace del ligando inmovilizado y cualquier toxina presente en dicha muestra se determina en comparación con la extensión del ligando no inmovilizado unido o no unido a los puntos de enlace del ligando inmovilizado.

5. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se determina la presencia o ausencia de una toxina dirigida a fosfatasa.

6. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra bajo investigación es la humedad en superficie o libre del crustáceo, o agua extraída del hábitat en el que vive dicho crustáceo o agua extraída de suministros de agua doméstica.

7. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ligando inmovilizado o no inmovilizado es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

8. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína de la enzima fosfatasa es la proteína fosfatasa 2A con ligando de enlace.

9. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que uno de los ligandos inmovilizado o no inmovilizado lleva un grupo indicador.

10. Un método de análisis según la reivindicación 9, en el que el ligando no inmovilzado lleva un grupo indicador.

11. Un método de análisis según la reivindicación 10, en el que el ligando no inmovilzado es un péptido hepatotoxina marcado o ácido ocadoico marcado.

12. Un método de análisis según la reivindicación 11, en el que la hepatotoxina se selecciona de nodularina, microcistina LR o microcistina YR.

\newpage

13. Un método de análisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el soporte sólido es una varilla o una matriz sólida.

14. Un método de análisis según la reivindicación 13, en el que la matriz sólida son bolitas de polímero o magnéticas.

15. Un kit para la detección de toxinas dirigidas a fosfatasa que inhiben las proteínas fosfatasas, comprendiendo dicho kit:

una fase sólida en la que se inmoviliza un ligando;

un ligando no inmovilizado, preferentemente en solución acuosa o acomplejado con el ligando inmovilizado;

y en el que el ligando inmovilizado y/o no inmovilizado es una proteína de la enzima fosfatasa;

donde ninguno de dichos ligandos inmovilizados o no inmovilizados incluye un grupo directa o indirectamente detectable, un grupo indicador capaz de unirse a uno de dichos ligandos inmovilizados y no inmovilizados y generar una señal detectable, siendo legible preferentemente dicho grupo o señal detectable directamente sin equipo de laboratorio.

16. Un kit según la reivindicación 15, en el que dicha toxina dirigida a fosfatasa es producida por algas o por cianobacterias.

17. Un kit para la detección de toxinas dirigidas a fosfatasa que inhiben las proteínas fosfatasas, en el que dicho kit comprende:

una fase sólida en la que se inmoviliza una proteína de la enzima fosfatasa como ligando de enlace a la toxina;

una molécula de indicador capaz de inhibir de forma competitiva el enlace de las toxinas dirigidas a fosfatasa a dicho ligando de unión a la toxina y generar una señal legible sin equipo de laboratorio.

18. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que dicho kit comprende microesferas de polímero magnéticamente desplazables que tienen inmovilizada en ellas una proteína fosfatasa;

19. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que dicho kit comprende microesferas de polímero magnéticamente desplazables que tienen inmovilizada en ellas una proteína fosfatasa;

20. Un kit para la detección de toxinas dirigidas a fosfatasa que inhiben las proteínas fosfatasas, comprendiendo dicho kit:

una fase sólida en la que se inmoviliza un ligando;

donde uno de dichos ligandos inmovilizados y no inmovilizados lleva un grupo indicador capaz de generar una señal detectable, siendo legible preferentemente dicha señal detectable directamente sin equipo de laboratorio.

21. Utilización del kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 para la determinación de toxinas dirigidas a fosfatasa.