KR100381718B1 - 프로테인 포스파테이스를 이용한 마이크로시스틴의비색정량법 - Google Patents
프로테인 포스파테이스를 이용한 마이크로시스틴의비색정량법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프로테인 포스파테이스(protein phosphatase)를 이용한 마이크로시스틴(microcystin)의 비색정량법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마이크로시스틴이 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하고, 프로테인 포스파테이스에 의해 포스포릴레이스 a로부터 무기인(PO4 3-)이 유리되는 특성을 이용한 발명으로, 마이크로시스틴이 포함된 시료에 프로테인 포스파테이스와 기질로서 포스포릴레이스 a를 가하여 포스포릴레이스 a로부터 유리되는 무기인의 함량을 발색시약을 사용한 흡광도 측정에 의하여 마이크로시스틴의 함량을 정량하는 방법에 관한 것이다.
종래 마이크로시스틴의 정량법이 방사성 동위원소32P를 사용하고, 복잡하고 고도의 숙련된 기술이 요구되는 분석장치를 이용하는데 반하여, 본 발명에 따른 정량법은 누구나 간편하게 사용할 수 있는 발색시약을 사용하여 시료중에 포함된 인체에 무해한 무기인의 양을 정량하는 방법을 통하여 경제적이고 간편하며 전혀 위험하지도 않으면서 미량의 검출도 가능한 개선된 마이크로시스틴의 비색정량법이다.
Description
본 발명은 프로테인 포스파테이스(protein phosphatase)를 이용한 마이크로시스틴(microcystin)의 비색정량법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마이크로시스틴이 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하고, 프로테인 포스파테이스에 의해 포스포릴레이스 a로부터 무기인(PO4 3-)이 유리되는 특성을 이용한 발명으로, 마이크로시스틴이 포함된 시료에 프로테인 포스파테이스와 기질로서 포스포릴레이스 a를 가하여 포스포릴레이스 a로부터 유리되는 무기인(PO4 3-)의 함량을 발색시약을 사용한 흡광도 측정에 의하여 마이크로시스틴의 함량을 정량하는 방법에 관한 것이다.종래 마이크로시스틴의 정량법이 방사성 동위원소32P를 사용하고, 복잡하고 고도의 숙련된 기술이 요구되는 분석장치를 이용하는데 반하여, 본 발명에 따른 정량법은 누구나 간편하게 사용할 수 있는 발색시약을 사용하여 시료중에 포함된 인체에 무해한 무기인(PO4 3-)의 양을 정량하는 방법을 통하여 경제적이고 간편하며 전혀 위험하지도 않으면서 미량의 검출도 가능한 개선된 마이크로시스틴의 비색정량법이다.
마이크로시스틴은 남조류에 속하는 마이크로시스티스 속(Microcystissp.), 아나배나 속(Anabaenasp.), 오실라토리아 속(Osillatoriasp.) 등이 생산하는 사이클로펩타이드(cyclopeptide)형 독성물질로서, 현재 50여종 이상의 구조유사체들이 밝혀져 있다[Oh et al.,Applied and Environmental Microbiology, 66:176∼179, 2000]. 마이크로시스틴은 인간을 포함한 포유동물에게 간독성(hepatotoxic effect)을 유발하여 치사에 도달하게 만들며, 마우스(mouse)를 이용한 독성시험결과에서 반수치사약량(LD50)이 50 ∼ 200 mg/kg 정도로서 독성이 강한 물질이다[Honkanen et al.,Journal of Phycology, 31:478∼486, 1995]. 이러한, 마이크로시스틴은 온혈동물 뿐만 아니라 물고기, 다프니아(Daphnia) 및 수생식물(aquatic plants) 등 수중생태계(aquatic environment) 전반에 걸쳐 영향을 끼친다. 국내에서는 아직까지 마이크로시스틴에 의한 인간 및 가축의 피해현상이 알려진 바 없으나, 중국 및 브라질에서는 마이크로시스틴으로 인하여 수 천명이 사망하였으며, 가축의 피해는 호주, 유럽, 아시아 등 세계 각지에서 빈번하게 발생하고 있다[Ueno et al.,Carcinogenesis, 17:1317∼1321, 1996]. 그러나, 우리 나라에서도 산업의 발달 및 경제활동의 다양성에 기인한 부영양화 현상으로 인하여 매년 여름 주요 강 및 대형호수에서 남조류 수화현상(cyanobacterial bloom) 및 마이크로시스틴의 발생이 보고되고 있다.
일반적으로 수중 마이크로시스틴의 농도는 매우 낮고, 남조류의 수화현상이 발생한 경우에도 약 10 ∼ 20 ㎍/ℓ이하 수준이다. 아직까지 수중 마이크로시스틴의 잔류농도에 관하여 제한하는 국가는 많지 않으나 호주의 경우 1 ㎍/ℓ 이하로 규제하고 있으며 이러한 규제는 전세계적으로 점차 확대되어가고 있는 실정이다. 따라서 마이크로시스틴의 정량방법은 경제적이면서도 간편하여야할 뿐만 아니라 1 ㎍/ℓ 이하의 마이크로시스틴을 정량적으로 검출할 수 있는 방법이어야 한다.
마이크로시스틴의 분석방법으로는 크게 기기 분석방법과 생물학적 분석방법으로 나누어 볼 수 있다.
먼저, 기기분석 방법은 HPLC(High-performance liquid chromatograph)를 이용하여 분석하므로 정확하며, 여러 가지 종류의 마이크로시스틴을 분리하여 정량할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, HPLC가 고가의 장비를 필요로 하고, 숙련된 분석기술을 요하며, 특히 분석하는데 시간이 많이 소요되는 단점을 지니고 있다[Harada et al.,Journal of Chromatography, 438:93∼99, 1988].
또 다른 방법으로 사용되는 생물학적 분석방법은 주로 마이크로시스틴이 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하는 작용을 이용하는 방법이다. 즉, 방사성동위원소인32P를 포스포릴레이스 a(posphorylase a)에 흡착시켜32P-포스포릴레이스 a를 만든 다음에, 프로테인 포스파테이스와 마이크로시스틴을 첨가하여 반응시킴으로써, 마이크로시스틴이 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하는 정도에 따라32P-포스포릴레이스 a에서 유리(release)되어 나오는32P의 양이 달라지게 되므로 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정하는 방법이다. 상기한 생물학적 분석방법의 경우, 고감도이며 분석시간이 짧은 장점이 있으나, 방사능물질인32P를 사용해야 한다는 치명적인 단점과 방사능물질 취급인가증을 가진 소수의 사람들만이 사용할 수 있다는 단점을 지니고 있다[Lambert et al.,Environmental Science and Technology, 28:753∼755, 1994].
따라서 고도의 숙련된 기술을 가지고 있지 않은 사람들이 경제적인 방법으로서 많은 시료를 동시에 취급할 수 있는 새로운 분석방법이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 HPLC를 이용하는 기기분석법이 고가의 장비를 필요로 하고, 숙련된 분석기술을 요구하며, 분석하는데 시간이 많이 소요되는 단점을 지니고 있으며, 또한 생물학적 분석방법은 방사능물질인32P를 사용해야 한다는 단점과 방사능물질 취급인가증을 가진 소수의 사람들만이 사용할 수 있는 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 분석방법 중 생물학적 분석방법이 가지고 있는 장점을 충분히 활용하면서 방사능물질인32P를 사용하지 않고서도 마이크로시스틴의 함량을 측정하는 방법을 알게되어, 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 마이크로시스틴이 가지는 독성으로 인하여 프로테인 포스파테이스의 활성이 저해되면 포스포릴레이스 a에서 유리되는 무기인(PO4 3-)의 양이 감소하는 바 포스포릴레이스 a에서 유리된 무기인의 양은 발색시약(color reagent)을 사용하여 흡광도로서 측정할 수 있다는 점과, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하면 수 십개의 시료를 동시에 분석할 수 있다는 사실을 착안하여 포스포릴레이스 a의 농도, 프로테인 포스파테이스의 농도, pH 등에 관한 시험을 수행하였다.
따라서, 본 발명은 고도의 숙련기술을 요하지 않으면서, 방사능 물질32P의 사용 없이도 경제적으로 남조류 유래 독성물질은 마이크로시스틴을 정량하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 마이크로시스틴의 검량선을 나타낸 것이다.
본 발명은 마이크로시스틴이 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하는 작용을 이용하는 마이크로시스틴의 비색정량법에 있어서, 마이크로시스틴 함유 시료에 프로테인 포스파테이스 효소와 기질로서 포스포릴레이스 a를 첨가하고, 상기 기질로 첨가된 포스포릴레이스 a로부터 유리되는 무기인(PO4 3-)의 양을 정량하는 것을특징으로 하는 마이크로시스틴의 비색정량법를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명은 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 남조류 유래 독성물질인 마이크로시스틴(microcystin)이 프로테인 포스파테이스(protein phosphatase)의 활성을 저해하는 작용을 이용하는 비색정량법에 있어서, 기질로 첨가된 포스포릴레이스 a(phosphorylase a)로부터 유리되는 무기인(PO4 3-)을 발색시약을 사용하여 흡광도를 측정하므로써 마이크로시스틴의 함량을 정량하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 비색정량 과정에서 마이크로플레이트 리더를 사용하는 경우, 다량의 시료를 동시에 분석할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 비색정량법을 수행함에 있어, 포스포릴레이스 a와 프로테인 포스파테이스를 각각 50 ㎕로 첨가하고 pH 8 조건하에서 수행하게 되면 마이크로시스틴의 함량을 0.05 ㎍/ℓ정도까지 측정할 수 있는 바, 호주 및 일본에서 수중 마이크로시스틴의 규제치로 적용하고 있는 1 ㎍/ℓ이하의 마이크로시스틴 함량도 검출이 가능하다. 다음의 실시예 1과 같은 과정을 거쳐 시료중 마이크로시스틴의 함량 0.01 ∼ 100.0 ㎍/ℓ범위에서 프로테인 포스파테이스의 저해 정도를 비색법(885 nm)으로 측정하여 r2=0.9787이라는 상관계수를 유지한다는 결과를 얻게 된다.
다음의 실시예는 본 발명이 프로테인 포스파테이스를 이용한 마이크로시스틴의 정량방법을 구체화하여 설명한 것으로, 다음의 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 마이크로시스틴의 프로테인 포스파테이스 활성저해
비색정량법을 이용한 마이크로시스틴의 검출방법은 다음과 같이 수행하였다.
물시료 100 ㎖을 Sep-Pak C18 카트리지(cartridge)[Waters, USA]에 통과시켜 수중의 용존 무기인을 제거하고 Sep-Pak C18 카트리지에 흡착된 마이크로시스틴을 메탄올 10 ㎖로 용출한 후 1 ㎖로 농축시켰다. 시료 농축액 50 ㎕을 마이크로플레이트(microplate)에 넣고 프로테인 포스파테이스 50 ㎕와 기질로서 포스포릴레이스 a 50 ㎕를 첨가하여 30℃의 항온기에서 2시간동안 반응시켰다. 얼음상에서 20% TCA(Trichloroacetic acid) 용액(v/v) 250 ㎕를 첨가하여 반응을 종료시켰고, 발색시약 500 ㎕를 넣어 상온에서 10분간 발색반응시킨 후 흡광도를 측정(885 nm)하였다.
상기에 사용한 마이크로시스틴은 우리 나라에서 가장 많이 검출되는 형태인 마이크로시스틴-RR(microcystin-RR)을 사용하였고, 프로테인 포스파테이스는 시그마사(sigma co., USA)의 프로테인 포스파테이스 1(protein phosphatase 1)을 사용하였고, 기질로서는 시그마사(sigma co., USA)의 포스포릴레이스 a(phosphorylase a)를 사용하였다.
상기 발색시약으로는 무기인의 정량에 사용되는 혼합발색시약으로서 그 조성은 암모늄 몰리브데이트(Ammonium molybdate) 0.8%, 황산(Sulfuric acid) 4%, 포타시움 안티모닐 타르타레이트(Potassium antimonyl tartrate) 0.34%, 아스코빅에시드(Ascorbic acid) 0.35%로 구성되어 있다.
상기 과정을 거쳐 시료의 흡광도를 측정하여 마이크로시스틴의 함량변화에 따라서 프로테인 포스파테이스의 활성이 변화하는 정도를 발색시약을 사용하여 885 nm에서 흡광도의 차이로서 나타낸 결과를 다음 표 1에 나타내었다.
실시예 2 : 마이크로시스틴의 검량선
상기 표 1의 결과를 기초로 하여 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하는 마이크로시스틴의 농도를 직선회귀방정식을 이용하여 검량선을 작성하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서와 같이, 마이크로시스틴의 농도 0.01에서부터 100 ㎍/ℓ까지 대수적으로 증가함에 따라 프로테인 포스파테이스의 활성이 일차함수적으로 감소하였다. 본 발명은 비색정량법을 이용한 마이크로시스틴 검출방법의 검출한계가 0.05 ㎍/ℓ 정도로서, 호주 및 일본에서 수중 마이크로시스틴의 규제치로 적용하고 있는 1 ㎍/ℓ 이하의 마이크로시스틴 함량도 검출할 수 있는 방법이다.
실시예 3 : 기질종류에 따른 마이크로시스틴의 검출한계
기질의 종류에 따라서 프로테인 포스파테이스의 친화도(affinity)가 다르며, 따라서 유리되는 무기인의 양이 달라지게 되어 마이크로시스틴의 검출한계도 달라지게 된다. 본 발명에서는 기질로서 포스포릴레이스 a와p-니트로페놀 포스페이트(p-nitrophenol phosphate)를 사용하여 검출한계를 비교한 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
그 결과 기질로서는p-니트로페놀 포스페이트보다 포스포릴레이스 a를 사용하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.
실시예 4 : 포스포릴레이스 a의 함량변화에 따른 마이크로시스틴의 검출한계
포스포릴레이스 a의 함량에 따라 유리되는 무기인의 양도 달라지게 되므로포스포릴레이스 a의 함량변화에 따른 마이크로시스틴의 검출한계를 조사하여 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다.
상기 표 3에서 보면, 포스포릴레이스 a의 함량이 50 ㎍/ℓ까지는 검출한계가 증가하다가 그 이상에서는 증가하지 않는 것으로 판명되었다.
실시예 5:프로테인 포스파테이스의 함량변화에 따른 마이크로시스틴의 검출한계
프로테인 포스파테이스 함량에 따라 유리되는 무기인의 양도 달라지게 되므로 프로테인 포스파테이스의 함량변화에 따른 마이크로시스틴의 검출한계를 조사하였고, 그 결과를 다음 표 4에 나타내었다.
그 결과 프로테인 포스파테이스의 함량이 50 ㎍/ℓ까지는 검출한계가 증가하다가 그 이상에서는 증가하지 않는 것으로 판명되었다.
실시예 6: pH 변화에 따른 마이크로시스틴의 검출한계
프로테인 포스파테이스의 활성은 pH에 따라 활성이 달라지게 되며 유리되는 무기인의 양도 달라지게 되므로 pH 변화에 따른 마이크로시스틴의 검출한계를 조사하였고 그 결과는 다음 표 5에 나타내었다.
그 결과 프로테인 포스파테이스는 pH 8인 조건에서 활성이 최대인 것으로 조사되었다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명에 의한 마이크로시스틴의 비색정량법은 매우 간편하며, 경제적이고, 다량의 시료를 동시에 취급할 수 있으며, 초보자도 쉽게 시험할 수 있을 뿐만 아니라, 미량도 측정가능한 방법이다.
Claims (4)
- 마이크로시스틴이 프로테인 포스파테이스의 활성을 저해하는 작용을 이용하는 마이크로시스틴의 정량법에 있어서,마이크로시스틴 함유 시료에 프로테인 포스파테이스 효소와 기질로서 포스포릴레이스 a를 첨가하여 반응시키고, 상기 반응액을 발색시약으로 발색시켜 흡광도를 측정하여 포스포릴레이스 a로부터 유리되는 무기인(PO4 3-)을 정량하며, 그리고 무기인(PO4 3-)의 흡광도 표준곡선으로부터 마이크로시스틴을 정량하는 것을 특징으로 하는 마이크로시스틴의 비색정량법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 발색시약은 암모늄 몰리브데이트(Ammonium molybdate), 황산(Sulfuric acid), 포타시움 안티모닐 타르타레이트(Potassium antimonyl tartrate) 및 아스코빅에시드(Ascorbic acid)가 함유된 것을 특징으로 하는 마이크로시스틴의 비색정량법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 흡광도 측정은 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하는 것을 특징으로 하는 마이크로시스틴의 비색정량법.
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