ES2244051T3 - Deteccion de parasitos transmitidos por el agua utilizando electroquimioluminiscencia. - Google Patents
Deteccion de parasitos transmitidos por el agua utilizando electroquimioluminiscencia.Info
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Abstract
Método para la detección o cuantificación de Cryptosporidia en una muestra, que comprende: (a) extraer la muestra con un medio de extracción; (b) solubilizar, en dicho medio de extracción, un antígeno de los oocistos y/o esporozoitos de Cryptosporidia; (c) formar una mezcla de ensayo que comprende, (i) dicho antígeno solubilizado y (ii) un anticuerpo específico para dicho antígeno; (d) incubar dicha mezcla de ensayo en condiciones suficientes para permitir la unión de dicho anticuerpo y dicho antígeno, formándose así un complejo antígeno-anticuerpo; y y (e) determinar la presencia de dicho complejo antígeno-anticuerpo, detectando o cuantificando así Cryptosporidia en la muestra.
Description
Detección de parásitos transmitidos por el agua
utilizando electroquimioluminiscencia.
Cryptosporidium es un género de parásitos
protozoarios que se encuentran comúnmente en el tracto
gastrointestinal de los vertebrados. Hay ocho especies nombradas de
Cryptosporidium. C. parvum es infecciosa para 79
especies de mamíferos, incluyendo los seres humanos, produciendo
gastroenteritis aguda. A diferencia de la mayor parte de los
parásitos, C. parvum carece de especificidad de huésped entre
los mamíferos y puede producir infección cruzada en múltiples
especies de huésped.
Cryptosporidiosium se transmite como un
oocisto a través de la vía fecal-oral. El agua
contaminada, el contacto directo entre seres humanos y el contacto
con los excrementos de ganado, animales del zoológico o animales
domésticos infectados pueden conducir a la transmisión del parásito.
Cuando está fuera de un huésped, la fase exógena, Cryptosporidium
existe como un oocisto esporulado. El oocisto consiste en cuatro
esporozoitos dentro de una resistente pared de dos capas. La pared
del oocisto tiene capas interna y externa definidas y una sutura en
un extremo. Durante la exquistación, la sutura se disuelve
proporcionando un orificio a través del cual los esporozoitos
abandonan el oocisto. Cuando se ingieren por un huésped adecuado los
esporozoitos exquistados, la materia viva parásita las células del
tracto gastrointestinal o respiratorio. Tras la reproducción, se
produce una nueva esporulación en los oocistos. Los oocistos en el
tracto gastrointestinal se excretan con la materia fecal, mientras
que aquellos que están en el tracto respiratorio salen del organismo
en las secreciones respiratorias y nasales.
Se encuentran comúnmente casos de infección por
Cryptosporidium tanto en países desarrollados como
subdesarrollados. La prevalencia ligeramente superior de
criptosporidiosis en los países menos desarrollados puede
atribuirse a unas malas condiciones de salubridad, desnutrición,
agua potable contaminada y contacto directo con personas y animales
infectados.
El signo clínico más común asociado con la
criptosporidiosis es la diarrea, que puede ser grave y dar
como resultado la pérdida de peso y la deshidratación. Otros
síntomas clínicos comunes incluyen calambres abdominales, fiebre,
náuseas, vómitos, dolor de cabeza, fatiga, mialgia e inapetencia.
Las infecciones por Cryptosporidium son generalmente en el
intestino delgado, pero también se han producido en los pulmones, el
esófago, el estómago y otros órganos. Los síntomas clínicos
asociados con la infección parasitaria dependen del órgano
afectado.
La gama de síntomas y la gravedad de la
enfermedad pueden variar enormemente de un individuo a otro y pueden
llegar a ser potencialmente mortales. Los síntomas de la enteritis
aguda duran generalmente de una a dos semanas en los individuos que
por lo demás son inmunológicamente sanos. La criptosporidiosis
representa una amenaza mayor en los pacientes con SIDA, personas
desnutridas, individuos con inmunodeficiencias hereditarias y
personas que reciben fármacos inmunosupresores.
Todas las infecciones por Cryptosporidium
se inician mediante la ingestión o la inhalación del oocisto. Debido
a que el parásito se transmite en la forma de un oocisto, los
oocistos han evolucionado para sobrevivir en condiciones ambientales
duras y son inusitadamente resistentes a tensiones naturales y los
desinfectantes químicos. Además, la presencia de un oocisto exógeno
que encapsula el parásito protozoario hace al parásito mucho más
resistente a los procesos de tratamiento de aguas convencionales.
Las medidas para prevenir o limitar la propagación de la infección
se concentran en eliminar o reducir los oocistos infecciosos del
medioambiente. Para los seres humanos, los procedimientos de
desinfección buscan minimizar la transmisión de una persona a otra y
tratar eficazmente la contaminación de los suministros de agua.
La aparición bastante reciente de grandes brotes
transmitidos por el agua ha centrado la atención en la importancia
de entender su transmisión a través del ambiente. Las aguas
superficiales pueden contaminarse de manera natural por los
excrementos de animales infectados. Muchas prácticas de eliminación
de residuos pueden conducir a cursos y corrientes de aguas
contaminadas. La contaminación fecal de las vías fluviales a
conducido recientemente a grandes brotes de infección por C.
parvum. El agua contaminada por estas prácticas puede conducir
entonces a la contaminación de los suministros de agua potable o de
los cultivos de plantas comestibles durante la
irriga-
ción.
ción.
La composición de proteínas, hidratos de carbono
y lípidos de C. parvum es diversa y compleja. Muchos de los
componentes son antigénicos y, por tanto, funcionan como dianas de
la respuesta inmunitaria. Se han identificado glucoproteínas que
oscilan desde < 14 hasta 7200 kDa a partir de oocistos rotos,
cubiertas de oocisto purificadas y esporozoitos purificados mediante
electroforesis en gel SDS-PAGE. Muchas de estas
proteínas derivadas del oocisto están glucosiladas. Se han
identificado restos de hidratos de carbono específicos. Se ha
determinado que las glucoproteínas del esporozoito con residuos
terminales de
N-acetil-D-glucosamina
pueden funcionar en la unión del parásito o ayudar de alguna manera
en la invasión. Estos hidratos de carbono se expresan en la
superficie del oocisto y son útiles en los métodos de detección
inmunológicos. Los esporozoitos de Cryptosporidium puede
exquistarse espontáneamente a través de una sutura en un polo del
oocisto, cuando se calienta hasta aproximadamente 37ºC durante
aproximadamente 90 minutos. Esto hace innecesario llevar a cabo
métodos mecánicos para la rotura de la pared del oocisto.
El pretratamiento de los oocistos de C.
parvum con hipoclorito de sodio (una "lejía") da como
resultado la separación de las paredes interna y externa del
oocisto. Es decir, aunque no es necesario pretratar los oocistos en
un agente reductor cuando se exquistan de C. parvum, se
produce un ligero aumento de la rapidez de la exquistación cuando se
incuban oocistos tratados con lejía en PBS que contiene cisteína HCl
0,01 M durante el proceso de exquistación. Los oocistos que no se
han pretratado con lejía se exquistan algo cuando se calientan hasta
aproximadamente 37ºC. El uso de tripsina y sales biliares, o sales
biliares solas, puede aumentar o acelerar la exquistación de los
oocistos no tratados con lejía.
Se han utilizado técnicas inmunológicas para
detectar C. parvum en muestras ambientales. La disponibilidad
de anticuerpos monoclonales para antígenos específicos de
Cryptosporidium facilitó el desarrollo de estos métodos.
Los ensayos de inmunofluorescencia (IFA) son los
ensayos más comunes utilizados para detectar oocistos de
Cryptosporidium en muestras y para detectar la presencia de
un anticuerpo específico. Estos métodos emplean colorantes
fluorescentes que se combinan con anticuerpos para hacer que den
fluorescencia cuando se expongan a la luz ultravioleta. En un ensayo
IFA habitual, se filtra agua a través de un filtro de cartucho de
polipropileno o un filtro de membrana plano. Ambos filtros
proporcionan filtrados que se someten entonces a purificación antes
del análisis por microscopía. El filtrado se retira del filtro y
luego se centrifuga. Se eliminan los restos superfluos mediante
flotación sobre una disolución de sacarosa. El sobrenadante se marca
con un anticuerpo conjugado con fluoresceína contra
Cryptosporidium y se examina mediante microscopía de
epifluorescencia.
Algunos ensayos y reactivos de
inmunofluorescencia comerciales utilizados para detectar oocistos
criptosporidiales incluyen: (1) HydroFluor Combo, un sistema de
ensayo de inmunofluorescencia basado en un anticuerpo monoclonal
específico para los oocistos (IgM, OW3), (2) Detect IF
Cryptosporidium, un sistema de ensayo de inmunofluorescencia
basado en un anticuerpo monoclonal específico para los oocistos
(IgM, C1), (3) kit Crypto IF, un sistema de ensayo de
inmunofluorescencia basado en un anticuerpo monoclonal específico
para los oocistos.
Las desventajas de los ensayos de
inmunofluorescencia incluyen su baja eficacia de recuperación,
tiempos de procesamiento prolongados, la necesidad de analistas
altamente cualificados, alto coste, la incapacidad para discriminar
las cepas viables o virulentas y la reactividad cruzada de las
sondas con algas de tamaño y forma similares. Además, la detección
con IFA a menudo supone la etapa intensiva desde el punto de vista
de la habilidad y que lleva mucho tiempo de examinar un lodo
procedente del agua para determinar oocistos que se han marcado con
un anticuerpo fluorescente. También a menudo es difícil distinguir
los oocistos de los residuos unidos de manera no específica por los
anticuerpos. El procedimiento es caro y suele llevar días
completarlo.
Los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas
(ELISA) que utilizan anticuerpo monoclonales reactivos con oocistos
también se utilizan para detectar Cryptosporidium en muestras
de agua contaminada. Se han utilizados dos pruebas de ELISA básicas
en el pasado para la detección de un antígeno de
Cryptosporidium en las muestras: (1) la técnica de sándwich
de doble anticuerpo para la detección de antígenos, y (2) el ensayo
de inmunoabsorción indirecta ligado a enzima para la detección de
anticuerpos.
En el método de sándwich de doble anticuerpo, se
adsorbe antisuero a un pocillo. Se añade el antígeno de prueba y, si
es complementario, se une al anticuerpo. Un anticuerpo ligado a
enzima específico para el antígeno de prueba se une entonces al
antígeno, formando un sándwich. Se añade luego el sustrato de la
enzima y la reacción produce un visible cambio de color. En el
ensayo de inmunoabsorción indirecta, se adsorbe un antígeno a un
pocillo. Se añade luego el antisuero de prueba, uniéndose el
anticuerpo complementario al antígeno. Se añade después la
gamma-globulina anti-humana ligada a
enzima. Se une al anticuerpo unido. Se añade luego, el sustrato de
la enzima, produciéndose un visible cambio de color. Una dificultad
encontrada en los ensayos basados en enzimas es la desactivación de
la enzima por componentes de la mezcla de ensayo. Una dificultad
adicional se encuentra en la etapa de lavado en la que poderosas
fuerzas dominan la interacción antígeno-anticuerpo.
Esto conduce a una pérdida de precisión del ensayo.
También se han utilizado los ensayos de detección
basados en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para
detectar oocistos en muestras clínicas o ambientales. Se han
secuenciado varias regiones de ADN y ARN de C. parvum y se ha
notificado que son dianas de ensayos para la detección de
parásitos.
La citometría de flujo es otro método utilizado
para detectar la contaminación parasitaria de muestras de agua. Las
técnicas de citometría de flujo pueden cuantificar oocistos
completos pero suponen mucha preparación y tiempo, y requieren
equipo extremadamente caro.
Se asocian numerosos problemas con los métodos de
la técnica anterior de detección de Cryptosporidium en
muestras de agua y ambientales. Además de los mencionados y de la
carencia general de ensayos precisos, reproducibles, las técnicas de
la técnica anterior generalmente requieren que las muestras se
transfieran a un laboratorio u a otra ubicación alejada, para la
realización del ensayo. Las técnicas de la técnica anterior carecen
de la fiabilidad, velocidad y sensibilidad requeridas para detectar
con precisión Cryptosporidium en muestras de agua
contaminada.
La detección de los oocistos de C. parvum
infecciosos en agua y otras muestras ambientales es esencial para
detectar y tratar los suministros de agua contaminados. Por tanto,
es crucial que se desarrollen ensayos específicos, rápidos y
sumamente sensibles para detectar la presencia del parásito con
precisión y de manera fiable. Los métodos conocidos de inmunoensayos
enzimáticos e inmunofluorescencia no cumplen estos requisitos. El
origen, viabilidad y patogenicidad de los oocistos que se encuentran
en agua u otras muestras ambientales no puede determinarse de manera
fiable utilizando los métodos de la técnica anterior. Existe la
necesidad de una vigilancia epidemiológica y una monitorización
medioambiental rutinarias que puedan realizarse in situ para
proporcionar la detección temprana del parásito.
Robertson et al., Parasitology, enero de
1993, Vol. 106, 1, páginas 13-19 describen
protocolos pata la exquistación in vitro de oocistos de
Cryptosporidium parvum, utilizando diferentes etapa de
preincubación química.
Johnson et al., FASEB Journal Abstracts,
9-13 marzo de 1995, Vol. 9, nº 3, parte 1, página
A229, Abstract nº 1328, XP002911135 describen un ensayo cuantitativo
para oocistos de Cryptosporidium en agua potable.
El documento
WO-A-9005302 describe una
composición adecuada para su uso en un ensayo de ECL
(electroquimioluminiscencia), en el que se detecta la radiación
electromagnética emitida por dicha composición.
El documento
WO-A-9214138 describe un método y un
aparato para un ensayo de luminiscencia basado en un material
microparticulado magnético que incluye una pluralidad de imanes.
Un objeto principal de esta invención es
proporcionar un ensayo rápido, sensible y preciso para la detección
o cuantificación de oocistos de Cryptosporidium en muestras
ambientales.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
procedimiento de ensayo rápido, sensible y preciso para la detección
o cuantificación de esporozoitos de Cryptosporidium en una
muestra ambiental.
Un objeto adicional de esta invención es
proporcionar un procedimiento de ensayo rápido, sensible y preciso
para la detección y cuantificación contemporáneas de oocistos y
esporozoitos de Cryptosporidium en una muestra ambiental.
Todavía un objeto adicional de la invención es
proporcionar ensayos cuantitativos rápidos para C. parva en
entornos descentralizados, es decir plantas de tratamiento de aguas,
que no lleven mucho tiempo y que empleen instrumentos de ensayo
fiables.
La presente invención proporciona así un método
para la detección o cuantificación de Cryptosporidia en una
muestra, que comprende:
(a) extraer la muestra con un medio de
extracción;
(b) solubilizar, en dicho medio de extracción, un
antígeno de los oocistos y/o esporozoitos de
Cryptosporidia;
(c) formar una mezcla de ensayo que
comprende,
- (i)
- dicho antígeno solubilizado y
- (ii)
- un anticuerpo específico para dicho antígeno;
(d) incubar dicha mezcla de ensayo en condiciones
suficientes para permitir la unión de dicho anticuerpo y dicho
antígeno, formándose así un complejo
antígeno-anticuerpo; y
(e) determinar la presencia de dicho complejo
antígeno-anticuerpo, detectando o cuantificando así
Cryptosporidia en la muestra.
El problema inherente en los ensayos de la
técnica anterior se soluciona en los ensayos basados en la
electroquimioluminiscencia (ECL) de la invención. Estos ensayos
pueden detectar Cryptosporidium en fuentes de agua. Estos
ensayos de ECL son ensayos rápidos para la detección o
cuantificación de C. parva en entornos descentralizados, es
decir, el agua se somete a ensayo en la planta de tratamiento. Los
ensayos cuantitativos sencillos son una mejora sobre los métodos de
la técnica anterior. Son precisos y sensibles y se realizan en unas
cuantas horas sin un trabajo extenso.
Los ensayos pueden detectar o cuantificar
oocistos completos o fragmentos de oocistos utilizando un método que
es fiable, preciso y barato, y puede realizarse rápidamente
utilizando un equipo sencillo.
Esta invención está ampliamente en un método para
la detección o cuantificación de Cryptosporidium en agua
mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia que comprende las
etapas de:
a) filtrar agua para obtener un lodo que contiene
oocistos de Cryptosporidia;
b) extraer una muestra del lodo con un medio de
extracción para formar al menos un derivado antigénico de los
oocistos;
c) formar una mezcla de ensayo que comprende una
muestra del lodo extraído y un anticuerpo específico para el
derivado antigénico;
d) incubar la mezcla de ensayo para permitir la
unión del anticuerpo y el derivado antigénico; y
e) llevar a cabo un ensayo de
electroquimioluminiscencia para el complejo unido de anticuerpo y
derivado antigénico, detectando o cuantificando así los
Cryptosporidia en el agua filtrada.
La mezcla de ensayo contiene una muestra del lodo
extraído, partículas magnéticas marcadas con un primer anticuerpo
específico para un primer epítopo del fragmento antigénico, una
sonda marcada que comprende un segundo anticuerpo específico para un
segundo epítopo del derivado antigénico y un reactivo de ensayo para
ECL. El segundo epítopo puede ser el mismo o diferente al primer
epítopo.
El método de la invención también puede
utilizarse para la detección o cuantificación de antígenos de
esporozoitos de Cryptosporidia y para ensayos en los que se
someten a ensayo de manera contemporánea la pared externa de los
oocistos de Cryptosporidia y los esporozoitos contenidos en
los oocistos.
La invención también se refiere a un kit para
llevar a cabo el ensayo de electroquimioluminiscencia para
Cryptosporidia en agua, que incluye un medio de extracción
para la extracción de derivaciones antigénicas en paredes de oocisto
y/o esporozoitos procedentes de un lodo orgánico obtenido a partir
de la filtración de agua y un anticuerpo específico para un derivado
antigénico en el lodo extraído. Los kits para la realización de un
ensayo de electroquimioluminiscencia para Cryptosporidium en
agua también pueden incluir componentes de un ensayo de
electroquimioluminiscencia, incluyendo partículas magnéticas
marcadas con un anticuerpo específico para un epítopo de un derivado
antigénico de oocistos de Cryptosporidia extraídos, sondas de
marcado para ECL que comprenden un anticuerpo específico para un
epítopo del derivado antigénico y reactivos de ensayo.
Los métodos y ensayos para detectar
Cryptosporidium en muestras ambientales ofrecen marcadas
ventajas sobre los métodos de detección de la técnica anterior. El
ensayo puede llevarse a cabo con el lodo no estabilizado, en el
lugar de la filtración, es decir, en un entorno descentralizado, de
modo que no hay necesidad de transportar las muestras hasta otra
ubicación para su análisis. Los resultados obtenidos utilizando esta
invención son precisos, exactos, rápidos y superan los problemas
inherentes a los procedimientos de la técnica anterior.
La invención es un ensayo de
electroquimioluminiscencia para la detección de
Cryptosporidia en un lodo obtenido a partir de un filtro de
agua no tratada. Puede determinarse la presencia y cantidad de
oocistos y/o esporozoitos en estos ensayos. Por tanto, el ensayo
puede detectar si el agua está contaminada actualmente con parásitos
vivos o si sólo quedan oocistos vacíos en la muestra de agua. Se
trata directamente el lodo recogido de un filtrado o agua no tratada
para liberar antígenos en forma soluble procedentes de los parásitos
para su detección.
Los parásitos vivos y muertos pueden detectarse a
partir de la muestra de filtrado. Por tanto, el ensayo proporciona
información cualitativa o cuantitativa referente a la contaminación
previa del agua (parásitos no viables) así como relacionada con la
contaminación actual (parásitos que contienen esporozoitos,
infecciosos).
El método comprende generalmente las etapas
de:
a) filtrar agua para obtener un lodo que contiene
oocistos de Cryptosporidia;
b) extraer una muestra del lodo con un medio de
extracción para formar derivados de los oocistos que contienen al
menos un derivado antigénico de los oocistos;
c) formar una mezcla de ensayo que comprende una
muestra del lodo extraído y un anticuerpo específico para el
derivado antigénico;
d) incubar la mezcla de ensayo para permitir la
unión del anticuerpo y el derivado antigénico; y
e) llevar a cabo un ensayo de
electroquimioluminiscencia para el complejo unido de anticuerpo y
derivado antigénico, detectando o cuantificando así los
Cryptosporidia.
Las proteínas glucosiladas en las paredes de los
oocistos y los esporozoitos sirven como derivados antigénicos para
estos ensayos. La composición de proteínas, hidratos de carbono y
lípidos de C. parvum es diversa y compleja. Muchos de los
componentes son antigénicos y, por tanto, funcionan como dianas de
la respuesta inmunitaria. La identificación y caracterización de
C. parvum ha sido facilitada por protocolos para purificar
oocistos y esporozoitos. Se han
identificado muchas moléculas de proteína / glucoproteína a partir de oocistos rotos, cubiertas de oocisto purificadas y esporozoitos purificados, que oscilan desde < 14 hasta 7200 kDa, en electroforesis en geles de poliacrilamida - dodecilsulfato de sodio con tinción de proteínas (SDS-PAGE). Pueden utilizarse los anticuerpos monoclonales específicos para estas proteínas glucosiladas en la pared del oocisto y el esporozoito en estos inmunoensayos.
identificado muchas moléculas de proteína / glucoproteína a partir de oocistos rotos, cubiertas de oocisto purificadas y esporozoitos purificados, que oscilan desde < 14 hasta 7200 kDa, en electroforesis en geles de poliacrilamida - dodecilsulfato de sodio con tinción de proteínas (SDS-PAGE). Pueden utilizarse los anticuerpos monoclonales específicos para estas proteínas glucosiladas en la pared del oocisto y el esporozoito en estos inmunoensayos.
El mAc OW3 identifica el ADNc de los esporozoitos
de C. parvum que codifica para una supuesta secuencia de 670
aminoácidos con importante homología tanto con hsp70 como con una
proteína de regulación de la glucosa de 78 kDa. Este mAc reconoce un
antígeno de la pared de los oocistos de C. parvum de > 200
kD en inmunotransferencias. Aunque esta molécula puede ser un
componente de la pared de los oocistos, la repetición
Gly-Gly-Met-Pro de
hsp70 de C. parvum debe ser sumamente inmunogénico y puede
tener simplemente una característica antigénica en común con
COWP-190. El mAc OW-IGO,
desarrollado para detectar restos antigénicos dentro de la pared
externa de los oocistos de C. parvum, también marca el
material fibrilar en las vacuolas parasitóforas de macrogametos en
desarrollo, microgametocitos y oocistos en esporulación. En las
inmunotransferencias, el anticuerpo reconoce las bandas principales
a 250 y 40 kDa y bandas más pequeñas adicionales. La mayor parte de
la actividad de la inmunotransferencia se suprime mediante
tratamiento con peryodato, lo que sugiere de nuevo hidratos de
carbono en la pared externa.
Se trata el lodo recogido de un filtrado de agua
no tratada para liberar los antígenos procedentes de los parásitos
de modo que puedan detectarse mediante inmunoensayos. La extracción
y solubilización de los antígenos requiere un tratamiento con ácido
de los parásitos en presencia de sales biliares a aproximadamente
40ºC. Este tratamiento activa enzimas proteasas que ayudan a
degradar las paredes de los oocistos. Entonces, se trata la muestra
con una base tal como Tris para proporcionar un pH de entre 5,5 y 8.
La muestra se trata luego con agentes perturbadores tales como
detergentes iónicos o no iónicos y/o urea o formamida, incubada a
temperaturas elevadas en disoluciones tamponadas. La muestra puede
tratarse después con agentes reductores tales como
mercapto-etanol o ditiotreitol. Los reactivos de
detergente o sales biliares en exceso pueden eliminarse o
secuestrarse añadiendo diferentes detergentes no iónicos o BSA u
otra albúmina de suero animal o inmunoglobulina al extracto, dejando
los antígenos diana en disolución y en un estado listo para unirse
con anticuerpos complementarios específicos. Los agentes caotrópicos
en exceso pueden eliminarse mediante diálisis o medios enzimáticos o
cromatografía, o sus efectos mediante dilución. Los agentes
reductores en exceso pueden eliminarse mediante tratamiento con:
tampón saturado de oxígeno (o aire), diamida, disolución de yodo
(0,05 N en agua), hidroperóxido de terc-butilo,
ferricianuro, peróxido de hidrógeno, yodoacetamida,
N-metil-maleimida,
2-(2-piridil-ditio)etanol.
Los ensayos de la invención emplean
procedimientos para tratar los oocistos de los parásitos con sales
biliares a temperaturas elevadas, in vitro, para inducir la
exquistación y para liberar los antígenos procedentes tanto de los
oocistos como de los esporozoitos. Estos antígenos pueden detectarse
y cuantificarse entonces en un inmunoensayo.
Los antígenos en disolución en la suspensión de
lodo tratada, que consisten en los antígenos liberados desde las
membranas de los oocistos y los esporozoitos, si los hubiera, se
incuban con anticuerpos específicos para los derivados antigénicos,
por ejemplo, el anticuerpo OW3 que es específico para un antígeno de
la pared de los oocistos de > 200 kD. El anticuerpo OW3 reconoce
epítopos repetitivos lineales caracterizados a partir de
experimentos de inmunotransferencia. Los epítopos lineales no se
destruyen tras el tratamiento con detergente y, por tanto, siguen
siendo activos con los anticuerpos tras la solubilización del lodo.
Una vez que los antígenos están en disolución, puede llevarse a cabo
el inmunoensayo de ECL.
Las técnicas de ensayo mediante ECL proporcionan
una medición sensible y precisa de la presencia y la concentración
de un analito de interés. En tales técnicas, se provoca la
electroquimioluminiscencia mediante una tensión imprimida sobre el
electrodo de trabajo de una celda de electroluminiscencia, en un
momento particular y de una manera particular. La luminiscencia
producida por el marcador de ECL se mide e indica la presencia o
cantidad del analito.
Los ensayos de electroquimioluminiscencia pueden
llevarse a cabo con o sin la necesidad de una etapa de separación
durante el procedimiento de ensayo y con modulaciones de señal
máximas para diferentes concentraciones de analito, de modo que
pueden realizarse mediciones precisas y sensibles en un amplio
intervalo de concentración de analito. Los ensayos sin separación
incluyen aquellos que emplean materia microparticulada suspendida en
la muestra de ensayo para unir uno o más de los componentes de unión
del ensayo.
Para una descripción con más detalle de las
técnicas de ECL; se hace referencia a la solicitud publicada PCT US
85/01253 (WO86/02734), solicitud publicada PCT número US 87/00987 y
solicitud publicada PCT US 88/03947. Estas publicaciones y aquellas
a las que se hizo referencia anteriormente se incorporan como
referencia. Aunque se había esperado en la técnica que la
luminiscencia procedente de restos electroquimioluminiscentes sería
absorbida, dispersada o si no sufriría interferencia de la materia
microparticulada, la solicitud de patente de los EE.UU. de número de
serie 539.389 (solicitud publicada PCT US 89/04919) enseña métodos
de ensayo de unión sensibles y específicos, basados en un fenómeno
luminiscente en el que se une específicamente materia
microparticulada a uno de los reactivos de unión del sistema de
ensayo. Los ensayos de esa solicitud pueden llevarse a cabo en un
formato de ensayo heterogéneo (una o más etapas de separación) y
pueden utilizarse de la forma más ventajosa en formato de ensayo
homogéneo (sin separación).
La señal procedente de las especies marcadas
puede aumentarse concentrándolas antes de someterlas a una etapa de
medición. La solicitud de patente de los EE.UU. número de serie
08/255.824, solicitud publicada PCT US 92/00982 se refiere a un
método de medición de electroquimioluminiscencia basado en
partículas, en el que las partículas se ponen en contacto directo
con el electrodo utilizando un imán para imponer un campo magnético
que reúna las partículas en el electrodo.
Partículas útiles en los ensayos de
electroquimioluminiscencia tienen ventajosamente un diámetro de 0,01
a 200 \mum y un componente superficial que puede unirse, directa o
directamente, al analito. Las partículas se suspenden en el sistema
de ECL y responden ventajosamente de forma magnética.
El ensayo requiere un electrolito. Generalmente,
el electrolito está en la fase líquida, por ejemplo, como una
disolución de una sal en agua. El electrolito es, en ciertas
realizaciones de la invención, un sistema tamponado tal como una
disolución acuosa de fosfato de sodio / cloruro de sodio o
disolución acuosa de fosfato de sodio / fluoruro de sodio.
Tal como se describe en la solicitud publicada
PCT US 89/04859, es deseable incluir un reductor, normalmente una
amina o resto de amina (o de una molécula mayor) que puede oxidarse
y descomponerse espontáneamente para convertirlo en una especie
altamente reductora, que a su vez facilita el fenómeno de
electroquimioluminiscencia. Puede utilizarse una amplia gama de
aminas y los correspondientes restos de amina en la práctica de la
presente invención. Las aminas (y correspondientes restos de amina
derivados de las mismas) que se utilizan ventajosamente en la
presente invención, incluyendo aminas alifáticas, tales como
alquilaminas primarias, secundarias y terciarias, teniendo los
grupos alquilo de cada una desde uno hasta tres átomos de carbono,
así como aminas alifáticas sustituidas. Se prefiere especialmente la
tripropilamina.
Tal como se describe en la solicitud publicada
PCT US 89/04915, los ensayos de la invención se llevan a cabo
preferiblemente en presencia de un potenciador utilizado en una
cantidad suficiente, de modo que en su presencia se produzca el
aumento deseado en la emisión de radiación electromagnética,
normalmente un compuesto de la fórmula
en la que R es hidrógeno o
C_{n}H_{2n+1}, R' es C_{n}H_{2n}, X es de 0 a 70 y n es
desde 1 hasta
20.
El aparato para llevar a cabo los ensayos de la
invención incluye un electrodo de trabajo u otra superficie de
activación para aplicar un potencial eléctrico que provoque las
reacciones que hacen que el resto de ECL unido a partículas dé
electroquimioluminiscencia e imanes que pueden reunir el resto de
ECL unido a partículas en el electrodo. Se dan a conocer detalles
adicionales del aparato para llevar a cabo los ensayos de ECL en las
solicitudes publicadas PCT US 89/04854 y US 90/01370.
Los ensayos de la invención pueden realizarse en
cualquiera de los formatos convencionales, es decir, formatos
directos, indirectos, hacia delante, inversos o competitivos. Se
prefieren los inmunoensayos de tipo sándwich, que se conocen bien en
el campo del diagnóstico en general y en la detección mediante ECL
específicamente. Tales ensayos suponen un analito (antígeno) que
está unido por dos anticuerpos: un anticuerpo "primario" o de
captura que está unido a una superficie sólida, por ejemplo,
marcándose con biotina, y un anticuerpo "secundario" o de
marcado que está marcado con una especie electroluminiscente tal
como Ru(bpy)_{3}^{2}+. Por tanto, en tal ensayo,
un soporte sólido recubierto con estreptavidina se une a un
anticuerpo primario biotinilado. El anticuerpo primario se une al
analito (el antígeno, si está presente), antígeno que está unido al
anticuerpo secundario marcado con
Ru(bpy)_{3}^{2}+.
En la invención, se conjuga con biotina un
anticuerpo monoclonal específico para un primer epítopo de un
antígeno de interés, OW3 en el caso de un ensayo para determinar
antígenos de oocistos, E3E en el caso de un ensayo para determinar
antígenos de esporozoitos. Se conjuga un anticuerpo monoclonal
específico para un segundo epítopo del antígeno de interés (que
puede ser el mismo que el del primer epítopo) a un marcador de ECL
("TAG"). Se combinan el lodo extraído y una disolución del
anticuerpo primario biotinilado y se incuban. El anticuerpo marcado
con TAG se añade entonces y se incuba para permitir la unión del
anticuerpo marcado con TAG y el analito. Tras esta incubación, se
añade una disolución de perlas recubiertas de estreptavidina para
combinarse con la biotina en el anticuerpo primario.
El complejo inmunitario del antígeno de los
oocistos se detecta utilizando un analizador tal como el analizador
ORIGEN®. Los reactivos y analizadores ORIGEN® están disponibles de
Igen, Inc., Gaithesburg, MD. El complejo inmunitario que se
cuantifica en este procedimiento consiste en las perlas
paramagnéticas recubiertas de estreptavidina unidas por biotina al
complejo del anticuerpo, OW3, que se une al antígeno específico para
OW3, que a su vez se une a otro anticuerpo OW3, conjugado con el
resto electroquimioluminiscente que produce la luz en el analizador.
Las perlas magnéticas y el sándwich unido se llevan a la superficie
del electrodo mediante un imán asociado con la celda de flujo. Se
aplica una tensión al electrodo. Se detecta la luz producida por el
resto de ECL y se cuantifica mediante un fotomultiplicador.
El material solubilizado generado en el
tratamiento del lodo recogido del filtro de agua incluye todos los
derivados antigénicos de C. parvum en el agua filtrada. Por
tanto, puede utilizarse una única preparación de material
solubilizado para someter a ensayo tanto los oocistos como los
esporozoitos de Cryptosporidium que contiene. Es importante
cuantificar tanto el número de esporozoitos viables en el agua,
porque constituyen la forma infecciosa en seres humanos del
parásito, así como los oocistos de los que se han liberado. La
última medición puede representar una concentración actual de
oocistos viables o una concentración de oocistos inviables,
revelando la historia de la contaminación.
El anticuerpo monoclonal, 3E3, es específico para
el antígeno de superficie de los esporozoitos de 27 kD, altamente
inmunogénico (p27). El anticuerpo monoclonal E3E se conjuga con
biotina y se purifica de la mezcla de reacción. Se conjuga un
antisuero policlonal preparado contra el mismo antígeno de
superficie de los esporozoitos de 27 kD, altamente inmunogénico
(p27) con un TAG y luego se purifica de la mezcla de reacción. Se
añade una disolución del anticuerpo biotinilado (en un diluyente de
ensayo) al lodo tratado y se incuba durante aproximadamente 1 hora a
aproximadamente 37ºC. La disolución del antisuero marcado con TAG
(en un diluyente de ensayo) se añade entonces a la mezcla y se
incuba en las mismas condiciones. Después de esta incubación, se
añade una disolución de perlas recubiertas de estreptavidina y se
incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se
detecta el complejo inmunitario de antígeno de los esporozoitos
utilizando un analizador (tal como el analizador ORIGEN) tal como se
describió anteriormente.
Los ensayos de detección o cuantificación para
uno o ambos de los antígenos de los oocistos o los esporozoitos
pueden realizarse de manera esencialmente contemporánea, es decir,
uno después del otro. Una ventaja importante sobre los métodos de la
técnica anterior es que puede determinarse si la muestra de agua
está en realidad infectada con esporozoitos vivos o si simplemente
están presentes oocistos vacíos no infecciosos. Además, el lodo
recogido sobre el filtro de agua puede analizarse directamente sin
un pretratamiento extenso.
El método y el ensayo de la invención se
describen adicionalmente con referencia a los siguientes
ejemplos.
Se filtran de 100 a 1000 litros de agua potable /
limpia a través de un filtro de tipo Cuno. La membrana del filtro
junto con el filtrado de lodo se corta para liberarlo y retirarlo
del portafiltro. La lámina de la membrana se coloca en un recipiente
de plástico y se añade 1 litro de una disolución detergente de Tween
80 al 0,1% al recipiente. El filtro se agita durante 20 minutos y se
decanta la suspensión de lodo en una botella para centrífuga. Se
añade un segundo litro de disolución detergente al recipiente y se
agita el filtro de nuevo durante 20 minutos. Después, se decanta el
segundo litro en una botella para centrífuga y se centrifugan los 2
litros de suspensión de filtrado de lodo a 7.280 g durante 12
minutos. Las botellas se sacan de la centrífuga y se extraen
cuidadosamente por aspiración el líquido sobrenadante para dejar un
sedimento en aproximadamente de 20 a 30 ml de líquido en las
botellas. El líquido restante se agita vigorosamente para
resuspender el sedimento y transferirlo a un tubo para centrífuga de
50 ml. La botella se enjuaga con una disolución de Tween 80 al 0,1%
y se añade a un tubo para centrífuga de 50 ml utilizando \approx 5
ml de agua destilada, si fuese necesario, para equilibrar los tubos
para centrífuga. Los tubos de 50 ml se centrifugan a 2190 g durante
10 minutos y se decanta el líquido sobrenadante. Se reúnen los 2
sedimentos y se resuspenden. El volumen final del concentrado se
mide en microlitros con una pipeta Pipetman.
Se pipetea el 50% del volumen del concentrado
resuspendido derivado en el ejemplo 1 en un tubo para centrífuga de
50 ml limpio. Se ajusta una disolución madre concentrada 10x de
solución salina básica de Hank (HBSS) a pH 2,5 con HCl. Se añaden
una cantidad predeterminada del concentrado 10x de HBSS de pH bajo y
una cantidad predeterminada de una disolución madre al 5% de sales
biliares bovinas a la suspensión de lodo para dar concentraciones
finales del 0,5% de sales biliares y 1x HBSS. La suspensión de lodo
se incuba entonces a 40ºC durante 2 horas. Después de la incubación,
la disolución se ajusta a pH 7 con base Tris y se añade una
disolución madre al 3% de dodecilsulfato de sodio para dar una
concentración final del 0,3%. Se añade una cantidad predeterminada
de mercapto-etanol 200 mM o ditiotreitol 100 mM para
dar una concentración final de mercapto-etanol 20 mM
o ditiotreitol 10 mM. La suspensión se mezcla y se incuba a 40ºC
durante 1 hora. Se añade N-metilmaleimida hasta una
concentración final de 20 mM. Se añade una disolución madre al 5% de
Triton X-100 para dar una concentración final del
0,5% y luego se añade albúmina de suero bovino a la mezcla de
incubación hasta una concentración final del 2% para secuestrar el
detergente en exceso y mejorar así la inmunorreactividad en
presencia de los detergentes. La disolución se mezcla y se mide el
volumen final de la mezcla de extracción en microlitros con una
pipeta Pipetman.
Este extracto es equivalente al 50% del volumen
que ha pasado a través del filtro. El volumen del extracto que va a
analizarse puede calcularse tal como sigue: Se divide el volumen del
extracto en microlitros entre la mitad del número de litros de agua
que se tomó como muestra. Esto proporcionará una razón volumétrica
de microlitros de extracto por litro de la muestra de agua. El
equivalente de muestra de agua que va a analizarse debe ser de al
menos el 10% del volumen de agua que ha pasado sobre el filtro. Por
tanto, debe analizarse el 20% del extracto. El volumen del
inmunoensayo que debe analizarse debe estar entre 20 y 50
microlitros.
Se disuelven 0,5 mg de proteína OW3 en 500 \mul
de PBS, pH 7,8, en un vial de polipropileno. Se utilizan
dispositivos de concentración por ultrafiltración para conseguir el
intercambio de tampón y la concentración de la proteína. Se prepara
una disolución madre de éster de NHS-TAG de ORIGEN
añadiendo 50 \mul de DMSO al vial de 75 \mug de éster de
NH3-TAG (Igen). El vial se hace girar suavemente
para humedecer las partes del fondo e inferiores del vial con el
DMSO. Este volumen de DMSO disuelve los 75 pg de éster de
NHS-TAG de ORIGEN, dando como resultado una
disolución madre 1,5 \mug/\mul.
Se añade una razón molar de 25:1 de éster de
NHS-TAG de ORIGEN a la disolución de OW3 anterior a
1 mg/ml. Basándose en los pesos moleculares de 1057 y 750.000,
respectivamente, se añaden 35 \mug/\mul del éster de
NHS-TAG de ORIGEN a la disolución de la proteína. El
éster de NHS-TAG de ORIGEN restante se desecha. El
contenido del vial se agita con vórtex y se incuba en la oscuridad a
temperatura ambiente durante 60 minutos. La reacción se detiene
añadiendo 20 \mul de glicina 2 M e incubando en la oscuridad a
temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales.
Se elimina el marcador TAG de ORIGEN no acoplado
cargando la mezcla en una columna PD-10 (una columna
Sephadex G-25 preempaquetada, fabricada por
Pharmacia) equilibrada previamente con PBS que contiene azida de
sodio o timerosol. Debido al largo tiempo de separación de la
columna, se cubre con lámina de aluminio para proteger el conjugado
de la luz. Se formaron dos bandas amarillas según avanzaba la
separación del TAG de ORIGEN libre del unido. La proteína marcada
eluyó en primer lugar, seguida por una segunda banda correspondiente
a TAG de ORIGEN no conjugado. Se recogen ocho fracciones de 0,5 ml
después de que el volumen de la muestra entrase en el lecho de
resina.
La concentración de proteína en moles por litro
se determinó utilizando un ensayo de proteínas habitual (por
ejemplo, Bradford, Lowry o un kit de ensayo de BCA Protein de
Pierce). Se evita una lectura de la absorbancia a una DO de 280 nm
ya que TAG altera la absorbancia a esta longitud de onda. Se recogen
las fracciones que contienen proteína y se reúnen para determinar la
concentración y la molaridad finales de la proteína reunida. La
proteína en porcentaje recuperada osciló desde el 70 - 90%,
dependiendo de la técnica de separación empleada.
La absorbancia de la TAG-OW3 a
455 nm se mide utilizando una cubeta de 1 cm de paso. El valor de
absorbancia se divide entre 13.700 para obtener la concentración de
TAG de ORIGEN en moles por litro. Se calcula la razón de TAG de
ORIGEN:OW3 dividiendo el valor obtenido previamente para la
concentración de TAG de ORIGEN entre el valor obtenido previamente
para la concentración de proteína.
Se preparó el antígeno de los esporozoitos (p27)
mediante inmunopurificación sobre una fase sólida, utilizando el
anticuerpo 3E3 procedente de extractos preparados tal como se
describe en el ejemplo 2, excepto porque se obtuvo
Cryptosporidium en forma altamente concentrada a partir de
terneros infectados. Se inmunizaron conejos siguiendo métodos
convencionales. Se prepararon los anticuerpos utilizando técnicas
habituales. Estos anticuerpos se marcaron siguiendo el protocolo
descrito en el ejemplo 3.
El procedimiento seguido es tal como se describió
anteriormente para OW3, excepto porque se añaden 17,6 \mug (11,7
\mul de una disolución de 1,5 \mug/\mul preparada a partir de
los 75 pg de producto TAG) del éster de NHS-TAG de
ORIGEN a la disolución de proteína.
Se disuelven 1,5 mg del anticuerpo OW3 en 1,5 ml
de tampón fosfato de potasio 150 mM, pH 7,8, que contiene cloruro
de sodio 150 mM y se divide en alícuotas, en fracciones de 0,5
ml.
Se disuelve 1 mg de éster de
sulfo-NHS-LC-biotina
de ORIGEN en 0,5 ml de agua destilada, estéril inmediatamente antes
de su uso, dando como resultado una disolución de 2 mg/ml. Para
conseguir una razón molar de 10:1, 20:1 0 40:1 de éster de
sulfo-NHS-LC-biotina
de ORIGEN con respecto a 0,5 mg de anticuerpo en 0,5 ml de tampón,
se añaden, respectivamente, 9,3, 18,5 ó 37 \mul del reactivo de
biotinilación a las alícuotas de anticuerpo. La disolución se incuba
durante 60 minutos a temperatura ambiente, y se extingue mediante la
adición de 20 \mul de glicina 2 M.
El éster de
sulfo-NHS-LC-biotina
de ORIGEN sin reaccionar se elimina dializando la disolución de
anticuerpo frente al tampón final deseado de PBS que contiene
NaN_{3} al 0,02%. También pueden emplearse la filtración en gel en
una columna de desalinización de tamaño apropiado (tal como una
columna desechable PD-10 de Pharmacia) o una columna
de centrifugación o el uso de un microconcentrador tal como un
Centricon-30 (Amicon) para eliminar el éster de
sulfo-NHS-LC-biotina
de ORIGEN sin reaccionar. En anticuerpo biotinilado se almacena a
4ºC hasta que esté listo para su uso.
Este procedimiento es tal como se describió
anteriormente para el anticuerpo OW3.
Se pipetea una muestra de 30 microlitros de lodo
tratado (ejemplo 2) en un tubo de ensayo de 12 x 70 mm. Se añaden al
tubo, 0,25 microlitros de una disolución de 2 mg/ml del anticuerpo
OW3 biotinilado (ejemplo 4) en diluyente de ensayo de ORIGEN
(disponible de IGEN), seguido por la adición de 25 microlitros de
una disolución de 2 mg/ml del anticuerpo OW3 marcado con TAG en el
diluyente de ensayo de ORIGEN (ejemplo 3). La mezcla se incuba a
37ºC durante 2 horas, mezclando periódicamente. Después de la
incubación, se añaden 25 microlitros de una suspensión de 1 mg/ml de
perlas recubiertas de estreptavidina de 2,8 micras Dynal
(equivalente a 25 microgramos) en diluyente de ensayo de ORIGEN. La
mezcla se incuba de nuevo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
La mezcla de incubación del inmunoensayo se diluye luego hasta 300
microlitros con tampón de ensayo de ORIGEN.
El tubo se coloca en el carrusel del analizador
ORIGEN y se inicia el ciclo de prueba. Utilizando una bomba
peristáltica, el instrumento extrae una alícuota de la muestra del
tubo en el carrusel y la transporta a la celda electroquímica de
flujo. Las perlas paramagnéticas se reúnen en el electrodo mediante
un imán asociado a la celda de flujo. Posteriormente, se aplica una
tensión al electrodo. La luz producida por TAG se detecta o
cuantifica mediante un fotomultiplicador.
El inmunoensayo se calibra sometiendo a ensayo
cantidades conocidas de oocistos de Cryptosporidium contados
mediante procedimientos aceptados generalmente utilizando un
citómetro de flujo. La disolución de calibración se prepara a partir
de oocistos recién aislados de las heces de pacientes
infectados.
El procedimiento de ensayo del antígeno de los
esporozoitos es tal como se describió anteriormente para el ensayo
del antígeno de los oocistos excepto porque utiliza el anticuerpo
E3E.
El inmunoensayo se calibra sometiendo a ensayo
cantidades conocidas de oocistos de Cryptosporidium que
contienen esporozoitos vivos. La disolución de calibración se
prepara a partir de oocistos recién aislados de las heces de
pacientes infectados y contados mediante procedimientos aceptados
generalmente utilizando un citómetro de flujo.
Los inmunoensayos de ECL de los ejemplo 7 y 8
pueden realizarse de manera contemporánea (o bien de manera
simultánea o bien en rápida sucesión). El concentrado derivado en el
ejemplo 1 se solubiliza como se describió en el ejemplo 2. El
producto solubilizado se divide en dos partes iguales. Las partes se
someten a ensayo entonces utilizando los métodos descritos en los
ejemplos 3 a 5.
Claims (27)
1. Método para la detección o cuantificación de
Cryptosporidia en una muestra, que comprende:
(a) extraer la muestra con un medio de
extracción;
(b) solubilizar, en dicho medio de extracción, un
antígeno de los oocistos y/o esporozoitos de
Cryptosporidia;
(c) formar una mezcla de ensayo que
comprende,
- (i)
- dicho antígeno solubilizado y
- (ii)
- un anticuerpo específico para dicho antígeno;
(d) incubar dicha mezcla de ensayo en condiciones
suficientes para permitir la unión de dicho anticuerpo y dicho
antígeno, formándose así un complejo
antígeno-anticuerpo; y
(e) determinar la presencia de dicho complejo
antígeno-anticuerpo, detectando o cuantificando así
Cryptosporidia en la muestra.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra es una muestra de agua y en el que dicha etapa a) del
método según la reivindicación 1 comprende filtrar dicha muestra de
agua para obtener un lodo que comprende oocistos y/o esporozoitos de
Cryptosporidia presentes en la muestra de agua, y extraer una
muestra de dicho lodo con un medio de extracción.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo está ligado a un
marcador.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
dicho marcador es biotina.
5. Método según la reivindicación 3, en el que
dicho marcador es un resto electroquimioluminiscente y dicho
complejo antígeno-anticuerpo se determina mediante
una medición de electroquimioluminiscencia.
6. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que dicho medio de extracción comprende una sal
biliar o un detergente iónico.
7. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que dicho medio de extracción es ácido.
8. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que dicha solubilización se lleva a cabo a
temperatura elevada.
9. Método según la reivindicación 6, en el que
dicho medio de extracción comprende además una proteína en una
cantidad suficiente para secuestrar dicho detergente.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra es un lodo formado filtrando un volumen de agua.
11. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho antígeno es un antígeno de la
pared celular externa de un oocisto.
12. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo está ligado a un
marcador, dicha mezcla de ensayo comprende además un segundo
anticuerpo específico para dicho antígeno y un soporte sólido ligado
a o que puede capturar dicho segundo anticuerpo y dicho complejo
antígeno-anticuerpo comprende además dicho segundo
anticuerpo y dicho soporte sólido.
13. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende:
(a) solubilizar, en dicho medio de extracción,
antígenos de oocistos de dichos Cryptosporidia, que incluyen
al menos un primer antígeno procedente de la pared externa de dichos
oocistos y al menos un segundo antígeno de un esporozoito contenido
dentro de dicho oocisto;
(b) formar una primera mezcla de ensayo que
comprende,
- (i)
- una primera parte de dichos antígenos solubilizados, y
- (ii)
- un primer anticuerpo específico para dicho primer antígeno;
(c) formar una segunda mezcla de ensayo que
comprende,
- (i)
- una segunda parte de dichos antígenos solubilizados, y
- (ii)
- un segundo anticuerpo específico para dicho segundo antígeno;
(d) incubar dicha primera mezcla de ensayo en
condiciones suficientes para permitir la unión de dicho primer
anticuerpo y dicho primer antígeno, formándose así un primer
complejo antígeno-anticuerpo;
(e) incubar dicha segunda mezcla de ensayo en
condiciones suficientes para permitir la unión de dicho segundo
anticuerpo y dicho segundo antígeno, formándose así un segundo
complejo antígeno-anticuerpo;
(f) determinar la presencia de dicho primer
complejo antígeno-anticuerpo; y
(g) determinar la presencia de dicho segundo
complejo antígeno-anticuerpo, detectando o
cuantificando así tanto los oocistos como los esporozoitos en la
muestra.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dicha primera mezcla de ensayo comprende:
(i) una primera parte de dichos antígenos
solubilizados,
(ii) un primer anticuerpo de captura específico
para dicho primer antígeno,
(iii) una primera sonda de marcado que comprende
un primer anticuerpo de marcado específico para dicho primer
antígeno y un primer resto electroquimioluminiscente, y
(iv) una primera partícula magnética ligada a o
que puede capturar dicho primer anticuerpo de captura;
y en el que dicha segunda mezcla de ensayo
comprende:
(i) una segunda parte de dichos antígenos
solubilizados,
(ii) un segundo anticuerpo de captura específico
para dicho segundo antígeno,
(iii) una segunda sonda de marcado que comprende
un segundo anticuerpo de marcado específico para dicho segundo
antígeno y un segundo resto electroquimioluminiscente, y
(iv) una segunda partícula magnética ligada a o
que puede capturar dicho segundo anticuerpo de captura;
y en el que la etapa (d) del método comprende
incubar dicha primera mezcla de ensayo en condiciones suficientes
para formar un primer complejo que comprende dicha primera partícula
magnética, dicho primer anticuerpo de captura, dicho primer antígeno
y dicha primera sonda de marcado;
y en el que la etapa (e) del método comprende
incubar dicha segunda mezcla de ensayo en condiciones suficientes
para formar un segundo complejo que comprende dicha segunda
partícula magnética, dicho segundo anticuerpo de captura, dicho
segundo antígeno y dicha segunda sonda de marcado.
15. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende:
(a) formar una primera mezcla de ensayo que
comprende,
- (i)
- dicho antígeno solubilizado,
- (ii)
- un anticuerpo de captura específico para dicho antígeno,
- (iii)
- una sonda de marcado que comprende un anticuerpo de marcado específico para dicho antígeno y un resto electroquimioluminiscente, y
- (iv)
- una partícula magnética ligada a o que puede capturar dicho anticuerpo de captura;
(b) incubar dicha primera mezcla de ensayo en
condiciones suficientes para formar un primer complejo que comprende
dicha partícula magnética, dicho anticuerpo de captura, dicho
antígeno y dicha sonda de marcado; y
(c) llevar a cabo un ensayo de
electroquimioluminiscencia para dicho primer complejo, detectándose
o cuantificándose así Cryptosporidia en dicha muestra.
16. Composición de materia que comprende:
(a) un lodo formado filtrando una muestra de
agua;
(b) un medio de extracción que comprende al menos
un tensioactivo en una cantidad eficaz para solubilizar al menos un
antígeno de oocistos de Cryptosporidia; y
(c) un complejo que comprende dicho antígeno y un
anticuerpo específico para dicho antígeno.
17. Composición según la reivindicación 16, en la
que dicho tensioactivo es una sal biliar o un detergente iónico.
18. Composición según la reivindicación 16, en la
que dicho antígeno es un antígeno de la pared celular externa de un
oocisto.
19. Composición según la reivindicación 16, en la
que el pH de dicha composición está en el intervalo de
aproximadamente 4 - 8.
20. Kit para cuantificar Cryptosporidia en
una muestra, que comprende en uno o más recipientes:
(a) un medio de extracción que comprende al menos
una sal biliar o un detergente iónico en una cantidad eficaz para
solubilizar al menos un antígeno de pared celular procedente de
oocistos de Cryptosporidia, y
(b) un anticuerpo específico para dicho
antígeno.
21. Kit según la reivindicación 20, en el que
dicho anticuerpo se marca con biotina.
22. Kit según la reivindicación 20, en el que
dicho anticuerpo se marca con un resto
electroquimioluminiscente.
23. Kit según la reivindicación 20, que
comprende
(a) un anticuerpo de captura específico para
dicho antígeno;
(b) un anticuerpo de marcado específico para
dicho antígeno; y
(c) un soporte sólido ligado a o que puede
capturar dicho anticuerpo de captura.
24. Kit según la reivindicación 23, en el que
dicho anticuerpo se marca con biotina, dicho anticuerpo de marcado
se marca con un marcador electroluminiscente y dicho soporte sólido
es una perla magnética recubierta de estreptavidina.
25. Kit según la reivindicación 20 ó 23, que
comprende además un diluyente de ensayo tamponado que contiene
proteínas.
26. Extracto de oocistos de Cryptosporidia
que comprende:
(a) un medio de extracción que comprende una
sustancia que puede tamponar dicho medio a un pH bajo y un
tensioactivo, y
(b) derivados de dichos oocistos, incluyendo al
menos un derivado antigénico que puede complejarse con un anticuerpo
para formar un complejo antígeno-anticuerpo que
puede detectarse mediante un inmunoensayo.
27. Extracto de oocistos según la reivindicación
26, que comprende al menos un derivado antigénico procedente de la
pared externa de los oocistos y al menos un derivado antigénico de
los esporozoitos en dichos oocistos, en el que al menos uno de
dichos derivados puede complejarse con un anticuerpo para formar un
complejo antígeno-anticuerpo que puede detectarse
mediante un inmunoensayo.
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