DE4408700C1

DE4408700C1 - Selektiver Nachweis lebender, infektionsfähiger Cryptosporidien-Oozysten mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Info

Publication number: DE4408700C1
Application number: DE4408700A
Authority: DE
Inventors: Albrecht Dr Med Wiedenmann; Renata Dipl Biol Filkorn
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-03-15
Filing date: 1994-03-15
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2014-03-16
Also published as: US5556774A

Description

Technisches Gebiet

Mikrobiologisches Nachweisverfahren im Bereich der Umwelt- und Lebensmittelhygiene.

Stand der Technik

Zum Nachweis von Cryptosporidien können spezifische Abschnitte der Cryptosporidien-DNA mit Hilfe der PCR amplifiziert werden. Die amplifizierbaren DNA-Sequenzen können für die PCR verfügbar gemacht werden, indem die Cryptosporidien-Oozysten und die darin enthaltenen Sporozoiten mit verschiedenen chemischen, biochemischen oder physikalischen Methoden (z. B. Natrium-hypochlorit, Proteinase K, Frieren und Tauen etc.) zerstört werden, so daß die DNA freigesetzt wird (Johnson et al., 1993 und Laxer et al., 1990).

Mängel der bisher bekannten Ausführungen

Die bisher beschriebenen Methoden haben den Nachteil, daß auf diese Weise auch DNA-Sequenzen toter oder inaktivierter Cryptosporidien-Oozysten bzw. auch freie DNA aus bereits vorher zerfallenen Erregern nachgewiesen wird.

Ein positives PCR-Ergebnis läßt in diesem Fall keine Aussage darüber zu, ob das überprüfte Probenmaterial infektiös und damit seuchenhygienisch relevant ist oder nicht (Filkorn et al., 1994). Bei der mikrobiologischen Beurteilung von Lebensmitteln, insbesondere von desinfiziertem oder anderweitig aufbereitetem Trinkwasser ist diese Frage aber von essentieller Bedeutung.

Technisches Problem

Das Problem besteht darin, das Nachweisverfahren so zu modifizieren, daß ein positives PCR-Resultat nur dann aufritt, wenn tatsächlich lebende, infektiöse Erreger im Probenmaterial vorhanden sind.

Lösung des Problems

Die Lösung des Problems besteht in einer bisher noch nicht beschriebenen Kombination der PCR mit anderen bekannten Verfahren.

Dem Probenmaterial bzw. den daraus isolierten Oozysten werden Substanzen zugegeben, die das physiologische Milieu im Verdauungstrakt von Mensch oder Tier simulieren, z. B. Salzsäure, menschliche oder tierische Gallensäuren und deren Salze oder Bestandteile des Pankreassafts. Dies bewirkt, daß die lebenden, infektionsfähigen Erreger (Cryptosporidien-Sporozoiten) die Oozystenwand aktiv durchdringen. Es findet also in vitro eine aktive Exzystierung statt, wie sie sich bei einer natürlichen Infektion im Verdauungstrakt abspielen würde (Wagner und Kimmig, 1992).

Die freien Sporozoiten können jetzt, z. B. durch immunomagnetische Verfahren, vom Oozystenmaterial separiert und anschließend der PCR zugeführt werden, oder sie werden durch ein Verfahren lysiert, das die verbleibenden, inaktiven oder toten Oozysten intakt läßt und nur die DNA der aktiv geschlüpften Sporozoiten für den anschließenden PCR-Nachweis freisetzt, z. B. Erhitzen, Anwendung proteolytischer Enzyme u. a. m.

Wenn die Möglichkeit besteht, daß im zu untersuchenden Probenmaterial oder einem die Oozysten enthaltenden Extrakt daraus schon vor der Exzystierung Cryptosporidien-DNA außerhalb von Oozysten vorhanden ist, wird diese durch geeignete Verfahren vor der Exzystierung zerstört oder entfernt, z. B. durch Zugabe einer DNAse (Davis et al., 1986).

Ausführungsbeispiel

Ausgangspunkt für das Nachweisverfahren ist das Cryptosporidien-Oozysten enthaltende Probenmaterial oder eine Präparation daraus, im Folgenden als Cryptosporidien-Suspension bezeichnet.

Beispiel für die Entfernung außerhalb von Oozysten vorliegender amplifizierbarer DNA aus einer Cryptosporidien-Suspension

Pro 10 µl der Cryptosporidien-Suspension werden 1 µl DNase I (z. B. von Pharmacia) und 1 µl 10x-Enzym-Puffer zugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei 37°C inkubiert.

Beispiel für eine In-vitro-Exzystierung

Die Cryptosporidien-Suspension wird im Verhältnis 1 : 1 mit einer Lösung aus 1,5% Tauroglycolat, Natriumsalz (Merck) in physiologischer Kochsalzlösung vermischt und vier Stunden lang bei 37°C inkubiert.

Beispiel für einen Sporozoiten-Aufschluß, bei dem äußerlich intakte Oozysten nicht zerstört werden

Die Cryptosporidien-Suspension wird in ein "Safe-Lock-Cup" (Eppendorf) gegeben und 15 Minuten lang in einem Thermoblock bei 95°C gekocht.

Beispiel für eine PCR

Es können z. B. die von LAXER et al. (1990) beschriebenen Primer verwendet werden:
P1 (+) 5′-CCG AGT TTG ATC CAA AAA GTT ACG AA-3′
und
P2(-) 5′-TAG CTC CTC ATA TGC CTT ATT GAG TA-3′
(z. B. von Pharmacia synthetisiert).

Der PCR-Mix kann z. B. wie folgt zusammengesetzt sein:
10 µl 10x-PCR-Puffer (100 mM Tris · Cl, pH 8,3; 500 mM KCl; 15 mM MgCl₂; 0,01% Gelatine); 16 µl dNTP-mix (jeweils 1,25 mM für dATP, dGTP, dCTP und dTTP); 1 µl Primer 1 (100 pmol); 1 µl Primer 2 (100 pmol); 2 µl DMSO (z. B. von Sigma); 0,5 µl Taq-Polymerase (z. B. von Perkin Elmer) und 59,5 µl H₂O pro 10 µl Cryptosporidien-Suspension.

Der PCR-Mix wird vor Verdunstung geschützt, indem er mit 50 µl Mineralöl überschichtet wird. Um Kreuz-Kontaminationen zu vermeiden, sollte die Herstellung des PCR-Mix und die Detektion des Amplifikationsprodukts räumlich getrennt voneinander stattfinden.

Die PCR-Zyklen können z. B. folgendermaßen aussehen:

Teil 1:
Denaturierung (3 Minuten bei 94°C)
Primer annealing (5 Minuten bei 45°C)
Prolongation (1 Minute bei 72°C)
Teil 1 wird einmal durchlaufen.

Teil 2:
Denaturierung (1 Minute bei 94°C)
Primer annealing (2 Minuten bei 57°c)
Prolongation (1 Minute bei 72°C)
Teil 2 wird 30 Mal durchlaufen.

Der letzte Prolongations-Schritt wird auf 5 Minuten verlängert.

Nach Ablauf von Teil 2 werden dem Ansatz 10 µl entnommen und damit die PCR in gleicher Weise ein zweites Mal durchgeführt.

Detektion der PCR-Produkte

Die PCR-Produkte können z. B. durch Gel-Elektrophorese in einem Gel mit 3% Agarose und einer Ethidiumbromid-Konzentration von 5 µg/ml nachgewiesen werden. Als Marker kann ein pGEM-DNA-Marker (z. B. von Promega) verwendet werden.

Die amplifizierte Gensequenz hat bei Verwendung, der zuvor genannten Primer eine Länge von 452 bp.

Vorteile der Erfindung

Durch die Kombination mit den beiden zuvor beschriebenen Verfahren, nämlich der in-vito-Exzystierung und der vor der Exzystierung durchgeführten Zerstörung oder Entfernung von außerhalb von Oozysten vorhandener DNA im Probenmaterial, läßt das Ergebnis einer PCR für Cryptosporidien einen Rückschluß auf die Infektiosität des Ausgangsmaterials zu, der ohne diese Kombination ansonsten nicht möglich wäre.

Die erheblichen Vorteile der PCR (hohe Sensitivität und Spezifität, Objektivierbarkeit, Möglichkeit zur zeitsparenden parallelen Untersuchung mehrerer Proben) werden dadurch auch für verschiedene Anwendungen im Bereich der Umwelt- und Lebensmittelhygiene nutzbar, bei denen die Frage der Infektiosität des Ausgangsmaterials von entscheidender Bedeutung ist.

Fundstellen

Davis, L. G., M. D. Dibner, J. F. Battey:
Basic Methods in Molecular Biology.
Elsevier, New York (1986).
Filkom, R.; A. Wiedenmann und K. Botzenhart:
Selective Detection of Viable Cryptosporidium Oocysts by PCR.
Zur Veröffentlichung eingereicht beim Zentralblatt für Hygiene und Umweltmedizin, Gustav Fischer Verlag Stuttgart.
Johnson, D. W.; N. J. Pieniazek und J. B. Rose:
DNA Probe Hybridization and PCR Detection of Cryptosporidium compared to Immunofluorescence Assay.
Wat. Sci. Tech. Vol. 27, No. 3-4, (1993) 77-84.
Laxer, M. A.; B. K. Timblin und R. J. Patel:
DNA sequences for the specific detection of Cryptosporidium parvum by the polymerase chain reaction.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 42 (1990) 688-694.
Wagner, C. und P. Kimmig:
Vitalitätstest für Cryptosporidium parvum. Methode und praktische Anwendung.
ln: Bericht des 4. Hohenheimer Seminars: "Aktuelle Zoonosen", Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, Gießen (1992) 189-203.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Cryptosporidien mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR), dadurch gekennzeichnet, daß den aus einem Probenmaterial isolierten Oozysten Substanzen zugegeben werden, die das physiologische menschliche oder tierische Darmmilieu simulieren und den Schlüsselreiz dafür liefern, daß eine aktive Exzystierung lebender, infektionsfähiger Sporozoiten erfolgt und die PCR nur mit der DNA dieser Sporozoiten durchgeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cryptosporidien-DNA, die außerhalb von Oozysten vorhanden ist, vor der Exzystierung zerstört oder entfernt wird.