JP2002529738A - ホスファターゼ標的毒素のアッセイ - Google Patents
ホスファターゼ標的毒素のアッセイInfo
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Abstract
Description
ような微小藻類によって典型的に産生されるホスファターゼを標的とする毒素(
ホスファターゼ標的毒素)の検出のためのアッセイ方法に関するものである。
例 Prorocentrum sp. およびDinophysis sp. )には、ヒトに摂取されると胃腸
の問題を引き起こす、オカダ酸(okadaic acid)およびdinophysis毒といった、
ホスファターゼ標的毒素を産生するものがある。したがって、もしこのような藻
類が消費用の貝の生息地を汚染すれば、このような藻類が問題となる可能性があ
る。
また光合成微生物であり、これらは、主に水生であり、沿岸の水域、外海および
外洋、河川、湖沼ならびに地下水に生息しているが、陸生生物でもあり、落ち葉
層および土壌中にも見られる。 シアノバクテリアの多くの種および株、特にMicrocystis sp.、Aphanizomenon
sp.、Anabena sp.、Nodularia sp.およびOscillatoria sp.は、毒素を産生し、
もし、ヒトまたは他の動物、鳥および魚にでさえ摂取されれば、病気を起こし得
る。このような毒素の摂取は、2つの主要なルート、すなわち、汚染された水を
飲むかあるいは汚染された海産物を食べることのいずれかによって起こる。
。たとえば、アナトキシン(anatoxins)およびサキシトキシン(saxitoxins)
といった神経毒は、罹病者に麻痺を引き起こし、このため、この状態をしばしば
麻痺性貝中毒などのように呼んでいる。このような神経毒による中毒は珍しいが
、致命的であることが判明しているといってよい。
に結合し、タンパク質基質を脱リン酸化する能力に影響を及ぼすことによって不
活性化する。これらの毒素は、比較的共通しており、あるもの(たとえば、渦鞭
藻類の毒素である、オカダ酸およびdinophysis毒といったもの)は、吐き気、嘔
吐および下痢を引き起こしうるので、この状態を、しばしば下痢性貝中毒などの
ように呼んでいる。タンパク質ホスファターゼ標的毒素の中には、腫瘍プロモー
ターがあり、これらの毒素にさらされると癌になる可能性がある。他のもの、シ
アノバクテリア毒素であるミクロシスチン(microcysitin)およびノジュラリン
(nodularin)は肝細胞毒性で、肝臓障害を引き起こす。最も大勢を占めるホス
ファターゼ標的毒素は、ミクロシスチン、ノジュラリンおよびオカダ酸である。
、シアノバクテリアの毒素中毒の最もありふれた原因は、汚染された飲料水およ
び/または浴用水である。しかしながら、シアノバクテリアおよび渦鞭藻類の毒
素の両方とも、貝および水中に潜んでいる。藻類の毒素中毒に特に共通する出所
は、斧足類(mussels)であり、なぜなら、それらは、毒素産生藻類を餌とする
と同時に毒素を蓄積するからである。たとえば、カキ、クラムおよびイタヤガイ
(scallops)といった他の貝もまた影響を及ぼされ得る。
、シアノバクテリアで汚染される可能性があり、したがって、毒素摂取の直接の
ルートを提供する。 高タンパク質の健康食品および食養生の補助としての藻類およびシアノバクテ
リアの消費に関し、ある関心がもたれている。毒素産生株による汚染に対し回収
された藻類またはシアノバクテリアを監視することに関する公式のガイドライン
はなく、AnabenaおよびAphanizomenonのような属の市場への出荷は、多数の毒素
産生株がそれらの中に発見され得るので、特に厄介である。
商業的コスト、仕事時間の空費などに加え、上述したように、ホスファターゼ標
的毒素であるミクロシスチンおよびノジュラリンは、腫瘍プロモーターであるこ
とがわかっており、このような毒素に臨床的または亜臨床的レベルで、特にアル
コールまたは喫煙の高摂取と組み合わせて繰り返しさらされることにより、癌、
特に肝臓癌になる可能性がある。
び定量に関する多くの異なる方法が存在する。一つの標準的な方法は、斧足類ま
たは他のホスファターゼ標的毒素の可能性のある供給源をつぶし、つぶした斧足
類組織の抽出物をマウスに注射することを含む。さらに、ホスファターゼ標的毒
素の汚染の存在およびそのレベルが、マウスの生存率に関して決定される(Stab
ell et al. (1992), Food. Chem. Toxicol. 30 (2) : 139-44)。これは、明ら
かに、多くの時間を要し、大雑把で高価な、食物の安全性および品質コントロー
ルを評価する方法である。
定することで、貝中のホスファターゼ標的毒素の存在を検出することを含む。さ
らに、この方法は、斧足類または他の貝組織をつぶし、外から加えたホスファタ
ーゼを害する内因性のホスファターゼを放出することを含むが、試験の感度およ
び正確さを妥協している(シアノバクテリアの毒素の検出方法(Detection Meth
ods for Cyanobacterial Toxins) Codd, Jeffries, Keevil および Potter編,
王立化学会(Royal Society of Chemistry)においてSim and Mudge (1994))
。
またはシアノバクテリアの食用産物中の、藻類およびシアノバクテリアのホスフ
ァターゼ標的毒素の存在についての定性的および/または定量的な測定を可能と
する、迅速で、感度が良く、かつ安価なアッセイまたは方法に対する多大なニー
ズが存在する。特に、比較的に未熟なまたは未熟な人員、具体的には、魚屋ある
いは水関係の公衆衛生員によって、現場で行えるほど簡単で、かつ、その実施に
関し、実験器具または特殊な設備を必要としないアッセイ方法に対するニーズが
ある。
害するホスファターゼ標的毒素を測定するためのアッセイ方法を提供するもので
あり、下記の段階からなる: 表面に固定化されたリガンドを有する固体支持体を、 (i) 毒素で汚染されていると推測されるサンプル、および、 (ii) 非固定化リガンド と接触させる段階、 ここで、前記固定化リガンドは、前記毒素のうちの少なくとも一つ、前記非固
定化リガンド、または該毒素および該非固定化リガンドの複合体に結合すること
ができ、また、該非固定化リガンドが、該固定化リガンドのうちの少なくとも一
つ、該毒素、または該毒素および該固定化リガンドの複合体に結合することがで
き、それによって、該毒素と結合した該固定化リガンド、該非固定化リガンドま
たは該毒素と該非固定化リガンドの複合体の割合は、前記サンプルの毒素の量に
依存しており、 前記固定化リガンドは、複合体が形成されていないとき、前記毒素により複合
体が形成されているとき、前記毒素と前記非固定化リガンドとの複合体によって
複合体が形成されているとき、または前記非固定化リガンドによって複合体が形
成されているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生すること
ができ、あるいは、前記非固定化リガンドは、複合体が形成されていないときま
たは複合体が形成されているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナル
を発生することができる; 非結合フラクションと結合フラクションを分離する段階;および 直接的または間接的に、固定化リガンドに結合した非固定化リガンド(結合フ
ラクション)、または水溶液中で非複合化した非固定化リガンド(非結合フラク
ション)を検出する段階 ここで、(i)および(ii)の固体支持体への適用は、別々に、連続的に、または
同時に行ってもよく、もし、別々にまたは連続的に行う場合は、それらはどちら
の順序で行うこともできる。
接的に結合できなかった非固定化リガンドの定量を含んでもよい。非固定化リガ
ンドが、毒素と、固定化リガンドへの結合を巡って競争する場合には、非結合リ
ガンドが高レベルであることは、毒素濃度が高いことの指標となる。さらにまた
、非固定化リガンドが固定化リガンドに結合した毒素と複合体を形成し得る場合
には、非結合リガンドが高レベルであることは、毒素濃度が低レベルであること
の指標となる。
に結合した非固定化リガンドの定量を含んでいる。さらに、毒素および非固定化
リガンドが固定化リガンドへの結合を巡って競争する場合には、結合したリガン
ドが高レベルであることは、毒素濃度が低レベルであることの指標となる。そし
て、非固定化リガンドが、固定化リガンドに結合した毒素と複合体を形成するこ
とができる場合には、結合リガンドが高レベルであることは、毒素濃度が高レベ
ルであることの指標となる。
アノバクテリアの毒素の検出のための競合的結合アッセイを含むことが好ましく
、当該方法は、サンプル中に存在する毒素分子が、非固定化リガンドと、固定化
リガンドの限られた数の結合部位を巡って競争し、該サンプル中に存在する任意
の毒素が、固定化リガンドの結合部位に結合した、あるいは結合していない非固
定化リガンドの程度に対応して測定されることを特徴としている。
」という用語は、サンプル中に存在するホスファターゼ標的毒素の量または濃度
の絶対値を得るという意味において定量的であり、また半定量的でもあり、さら
に定性的である評価または定量を含む。毒素の存在のレベルまたは量の指標、割
合、パーセンテージまたはモル示度(molar indication)も測定されてもよく、
あるいは代わりに、サンプル中のこのような毒素の存在または不存在の単純な表
示が得られてもよい。本発明の好ましい観点においては、毒素の存在の単純な有
無(存在または不存在)の、あるいは半定量的な測定が達成される。この点に関
し、毒素の「不存在」とは、毒素濃度がアッセイの検出限界を下まわるか、ある
いは安全または許容できると考えられるレベルより下であることを意味してもよ
い。
らされると推測されるいずれのサンプルであってもよく、あるいはホスファター
ゼ標的毒素を産生する微生物にさらされることによるもの、たとえば、水であっ
てもよく、この水は、海水、淡水、地下水の他に、湖沼、河川、井戸、小川、貯
水池、家庭用給水源から得られる水であってもよく、また、たとえば簡単な水切
りまたはピペットを用いた抽出により貝から採取される水分または貝を浸してい
た水であってもよく、あるいは、藻類またはシアノバクテリアによって作られる
、または藻類またはシアノバクテリアから作られる食料品、食品添加物、栄養補
給物、代替治療剤または類似の製品であってもよい。貝が遊離水を含む場合(例
えば、カキの中のように)には、該アッセイは、吸収性の基質(固体支持体)を
その水に浸すことを含んでもよい。また、代わりに、単に、たとえば殻を開くと
同時に分離した後に、吸湿性の基質を、湿った貝の身に対して押しつけることを
含んでもよい。
表面のまたは遊離の水分である。 すべての種類の貝、具体的には、イタヤガイ、エビ(prawns)、斧足類および
カキが、本発明のアッセイ方法に対して感度がよいが、好ましい面においては、
貝は斧足類である。別の好ましい面では、調査を受けるサンプルは、このような
貝が生息している生息地から得られる水であるが、さらに好ましい面においては
、サンプルは、家庭用給水源から得られた水である。
、必要に応じて任意の既知の方法によってろ過されてもよく、あるいは分析前に
、水、バッファーまたは他の任意の水性媒体を加えることによって希釈してもよ
く、また、分析に先立ち、たとえば冷却するかまたは冷凍することによって貯蔵
または保存してもよい。
具体的には、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい)とし
てまたは、たとえばF(ab)、F(ab')2、F(v)フラグメントのような抗体断片として
、本発明の方法で使用してもよい。このような抗体または抗体断片は、一価また
は二価であってもよく、また、ハイブリドーマ技術によって製造されてもよく、
あるいは、組換DNA技術または化学合成のいずれかによる産物といった、合成起
源のものであってもよい。たとえば、一本鎖抗体あるいは他の抗体の誘導体また
は擬似体を使用することができるだろう。抗体または抗体断片は、ホスファター
ゼ標的毒素の任意のエピトープ、成分または構造に対して、おあつらえ向きとな
るよう、導入されまたは向けられてもよい。代わりに、たとえば小さな有機分子
あるいはペプチド(例 オリゴペプチドまたはポリペプチド)のような毒素に対
し親和性を有する化合物で、毒素と特異的に結合し得るもの、たとえばコンビナ
トリアルケミストリー(conbinatorial chemistry)またはファージディスプレイ
ライブラリーから選ばれる特異的なバインダー、あるいはDNAまたはRNAの特異的
な結合配列を使用し得るだろう。
ゼ酵素であることが好ましく、また、本アッセイ方法では、結合リガンドタンパ
ク質ホスファターゼ2A(pp2A)を使用することがさらに好ましい。 同様に、本発明の方法で使用される第二のリガンドは、第一のリガンドととも
に、競合的にまたは非競合的に毒素に結合するリガンドのいずれであってもよい
。あるいは、第二のリガンドは、第一のリガンドに結合することを巡って、毒素
と競合するいずれのリガンドであってもよい。好ましくは第一のリガンドは毒素
結合リガンドであり、タンパク質ホスファターゼ酵素であることがより望ましい
。2つのリガンドのうちの一方は、固定化されてなければならず、他方は、非固
定化されてなければならない。また、リガンドの一方は直接的または間接的に検
出可能でなければならない。好ましい態様では、非固定化リガンドは、固定化リ
ガンドに結合する毒素を競合的に阻害し、直接的または間接的に検出可能なシグ
ナルを発生し得るといった機能的要請を満たすべきであり、具体的には、該リガ
ンドは、直接的または間接的なシグナルを形成する既知の任意形式の一部を用い
てラベル化し得る分子であってもよい。このようなリガンドは、同様に、抗体(
ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい)、またはたとえばF(
ab)、F(ab')2またはF(b)フラグメントのような抗体断片の形をとっていてもよい
。このような抗体または抗体断片は、一価または二価であってもよく、また、ハ
イブリドーマ技術によって製造されてもよく、あるいは、組換DNA技術または化
学合成のいずれかの合成起源のものであってもよい。一本鎖抗体あるいは他の抗
体誘導体または擬似体およびコンビナトリアルまたはファージディスプレイライ
ブラリーから選ばれる小さな有機分子、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペ
プチドを、たとえば使用することが可能であろう。抗体または抗体断片は、ホス
ファターゼ標的分子に結合するホスファターゼ標的毒素分子またはリガンドの任
意のエピトープ、成分または構造に対して、おあつらえ向きとなるように、導入
されまたは向けられてもよい。代わりに、たとえば小さな有機分子またはペプチ
ド、毒素または毒素に結合するリガンドと特異的に結合し得るオリゴペプチドま
たはポリペプチドといった、毒素に対しまたは毒素に結合するリガンドに対し親
和性を有する化合物、具体的にはコンビナトリアルケミストリーまたはファージ
ディスプレイライブラリーから選ばれる特異的なバインダー、あるいはDNAまた
はRNAの特異的に結合する配列を使用し得るだろう。
検出可能な部分、たとえば金属ゾル(例 金ゾル)、発色団または蛍光物質(例
シアニン、フタロシアニン、メロシアニン(merocyanint)、トリフェニルメ
チル、equinanceなど。(Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing C
hromophores, M. Matsuoka編, Plenum Press, New York, NY, 1990, Topics in
Applied Chemistry, The Chemistry and Application of Dyes, Waring 等, Ple
num Press, New York, NY, 1990およびHandbook of Fluorescent Probes and Re
search Chemicals, Haugland, Molecular Probes Inc. 1996参照)、放射性ラベ
ル、酵素、磁性粒子、混濁誘発剤(turbidity inducing agent)などのための結
合部位であってもよく、あるいは、このような直接的に検出可能な部分をすでに
保有していてもよい。レポーター部分が固定化リガンドに保有されている場合、
一般に、レポーター部分が直接的に検出可能な部分のための結合部位となり、リ
ガンドが複合体を形成しているときには、該結合部位が活性化またはより一般的
には不活性化される。
酵素、あるいは発色団または蛍光物質でラベル化されたペプチド肝細胞毒素、具
体的には、ノジュラリン、ミクロシスチンLCまたはミクロシスチンYR、あるいは
代わりにオカダ酸から選ばれる肝細胞毒素である。
者による現場での使用を主に意図しているため、視覚可能なシグナル、例えば発
色団、蛍光発色団、リン光部分、混濁誘発剤、ガス発生誘発剤などを与えるレポ
ーター部分を使用することが好ましい。 このシグナル形成部分が、リガンドの一つにある結合部位に結合する物質であ
る場合、その形成部分は結合および未結合フラクションの分離後に、結合のまた
は未結合フラクションとおあつらえ向きに接触させることが都合良いだろう。
ンドを検出するかまたは生成して検出する前に基質を、例えば水で洗い落として
、未結合のフラクションを流し去ることが好ましい。 ホスファターゼ標的毒素を生成する藻類またはシアノバクテリアのいかなる種
または株も、本発明に供することができるが、それは特に毒素を生成するシアノ
バクテリアの株、例えばMicrocystis aeroginosa、Anabena種、Nodularia spura
genaおよびAnabena flus-aquaeまたは藻類に適用される。これにより、例えば毒
素microcystin-LRおよびmicrocystin-YRはMicrocystis sp.により生成され、毒
素nodularinはNodularia sp.により生成され、および毒素オカダ酸はProrocentr
um sp.により生成される。
より産生されるホスファターゼ標的毒素であってもよいが、好ましい観点におい
ては、ペプチド毒素は(その中でmicrocystinおよびnodularinが最も効果的であ
る)肝細胞毒素またはオカダ酸である。 これにより、その最も一般的な意味において、本発明の方法は、ホスファター
ゼ標的毒素で汚染されたと推測されるサンプルを、毒素結合リガンド、およびレ
ポーター分子と単純に接触させること、および固相に結合するかまたは溶液中で
遊離のリポーター分子を測定することを包含する。このレポーター分子は、同時
と、連続に、または別個の何れかで任意の順に、前記毒素と当該リガンドの結合
部位を巡って競合することができ、必要に応じて調査するサンプルにさらす前に
前記結合リガンドに結合させてもよい。
心分離、濾過、クロマトグラフィー手段、毛細管作用により、または単に液を排
出することにより、未結合フラクションから分離することができる。この固相は
、例えばディップスティック(dipstick)の形態、または公知の形態、例えばポ
リマー形態または磁性ビーズ形態、例えばDynabeadsTM(Dynal ASから入手可能
)における固体マトリックスであってもよい。本発明の好ましい態様において、
前記毒素結合リガンドが固定化された固相はDynabeadsTMの形態にある。
ョンのいずれにおいて評価してもよいが、結合フラクションにおいて評価するこ
とが好ましい。 固定化リガンドは、公知の手段により、例えばリガンドを公知の固体支持体、
または現在において分離または固定化に広く用いられまたは提案される材料のい
ずれかに結合またはカップリングさせることにより固定化してもよい。例えば、
固相は、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、繊維または毛細管、または微量滴
定ストリップ(microtitre strips)、井戸状の管または板などの形態をとって
もよく、ガラス、シリカ、ラテックス、ポリマー材料または磁性ビーズから作ら
れることが都合よい。リガンドを固体支持体に結合させるための技術は公知であ
り、文献に広く記載されている。本発明の好ましい態様では、ホスファターゼ標
的毒素結合リガンドを固定化した固相は、DynabeadsTMの形態である。
とにおいて利点があり、比較的未熟な、または未熟な者によって行うことができ
る。したがって、このアッセイ方法は、家庭、店または現場での使用に好適であ
り、集約的な労力または危険な化学薬品の必要性なしで迅速にかつ容易に行うこ
とができる。
が非常に低レベルで存在するサンプルを分析する際、またはホスファターゼ標的
毒素による汚染可能性を評価する際に、決定的に重要となる非常に高い程度の感
度である。典型的には、このアッセイは、ピコモル濃度、例えば10pM程度に
おける毒素の検出が可能である。このアッセイは、15〜560pMの範囲にお
ける毒素を検出するのに用いることができることが都合良い。
セイが、特に例えば、サンプルが貝類から採取される場合に、分析中のサンプル
に存在するかもしれない内因的なホスファターゼの存在によっては影響を受けな
いことである。 本発明の一つの態様において、タンパク質ホスファターゼを固体支持体上に固
定化させ、固定化されたホスファターゼを調査するサンプルと接触させ、サンプ
ル中に存在するホスファターゼ標的毒素はすべて固定化ホスファターゼに結合す
る。毒素とホスファターゼ結合部位を巡って競合するリポーター分子源を添加す
る。このリポーター分子は、該結合部位から、毒素分子およびリポーター分子の
相対濃度に依存した程度において毒素分子を排除する。リポーター分子の結合の
程度は、調査するサンプルに存在する毒素の測定を容易にする。好ましいリポー
ター/標識(ラベル)としては、放射性標識、発色団(蛍光発色団を含む)およ
び色素原または蛍光原となる生成物を生じさせる酵素が挙げられる。シンチレー
ション近接標識および光散乱において測定可能な変化を生じさせる標識をも考慮
に入れるべきである。
ァターゼ分子を調査するサンプルと接触させて、該サンプル中に存在するホスフ
ァターゼ標的毒素を、いずれもホスファターゼ結合リポーター分子と競合させて
、該サンプルに存在する毒素の量に比例した程度において、それらを固相から水
相に移し変える。固相に結合したまま残っているリポーター分子の量を評価して
、調査するサンプルに存在する毒素の測定を容易にする。
スファターゼ標的毒素を検出するためのキットを提供し、該キットは、 リガンドを固定化させた固相と、 非固定化リガンド、好ましくは水溶液中にあるか固定化リガンドに複合化され
たもの(ここで、前記固定化リガンドおよび非固定化リガンドのいずれも直接的
または間接的に検出可能な部分、および前記固定化リガンドおよび非固定化リガ
ンドの一方と結合し、かつ検出可能なシグナルを発生させることができるリポー
ター部分(好ましくは、前記検出可能な部分またはシグナルが実験装置なしで直
接読み出し可能である)を含まない)を含む。
して、実験装置なしに読み出し可能なシグナルを発生させることができるリポー
ター分子とを含む。
ァターゼを有する磁気的に移動可能なポリマー微小球体と、 前記タンパク質ホスファターゼへのシアノバクテリア毒素の結合を競合的に阻
害可能な、金ゾル標識したペプチド肝細胞毒分子を含む。 さらに、本発明のキットの特に好ましい態様は、固定化したタンパク質ホスフ
ァターゼを表面に有し、磁気作用によって動かすことができるポリマー微小球; 金ゾルで標識され藻類の毒素が前記タンパク質ホスファターゼに結合するのを
競合的に阻害できるオカダ酸分子含む。
ドをその上に固定化し、発色団(または蛍光物質など)で標識した、競合的に結
合するリガンドをしみこませた多孔性セルロースの基質をサンプルの水または貝
の流動体に浸漬すること、飽和した基質を所定の期間(サンプルから除去するか
、プリセット量のサンプルに移すかのどちらか)インキュベートすること、たと
えば基質を毒素フリーの水で流すか、基質を毒素フリーの水の所定量に所定の期
間浸して取り去ることにより、結合していない標識リガンドを除去すること、お
よび基質の色または浸漬水の色を検査することを含んでいる。
をつけ、基質の色または浸漬水の色との比較を容易にして、毒素濃度を決定する
か、毒素濃度が1つまたはそれ以上の閾値より上かまたは下であるかどうかを示
す。 ここで本発明を以下の限定的でない実施例に基づき説明する。
ュリンA、タウトマイシンはCalbiochem(San Diego, CA)から購入できる。無担
体Na125Iおよび[Y-32P]ATPはAmersham(Little Chalfont, UK)から得られる
。
ホキシド(DMSO)、ジチオエリスリトール(DTE)、EDTA、EGTA、グリセロール
、Hepes、ヒストンII-AS、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびトリプシン阻害剤(ダ
イズ)はSigma(St Louis, MO)から購入できる。アセトニトリルおよびトリフ
ルオロ酢酸(TFA)はRathburn(Walkerburn, Scotland)から購入できる。部分
精製のタンパク質ホスファターゼ2AはUpstate Biotechnology(Lake Placid, NY
)から購入するか、Resinkら(Eur. J. Biochem.133:455-461(1983))に従い
精製する。ミクロシスチン-YRのヨウ素化 ミクロシスチンYR(10μg)をCiechanoverら(PNAS 77:1365-1368(1980))が
記載したようにクロラミンTを用いて1mCi無担体Na125I(37MBq)でヨウ素化する
。
方法に従い、Sep-PakTMプラスカートリッジ(Waters, Milford,MA)を用いて[1 25 I]ミクロシスチン-YRから分離する。[125I]ミクロシスチン-YRをChrompack
(Raritan, NJ)の3×250mm Inertsil ODS-2 HPLCカラムに適用し、アセトニト
リル勾配により溶離する。競合的結合アッセイ 50mM Hepes(pH7.2)、1mM EDTA、0.3mM EGTA、1mM DTE、5mM MnCl2、0.5mg m
l-1 BSAおよび0.2mg ml-1トリプシンインヒビターで緩衝化された0.5ml容量中で
競合的結合アッセイを実施する。100% DMSO中で希釈した藻類の毒素を10% DMSO
の最終濃度が0-100nMになるように添加してアッセイする。[125I]ミクロシス
チン-YR(1Ci/13ng)を添加して35pMにする。タンパク質ホスファターゼ2A(30p
M)を最後に添加し、反応混合物を氷上で一晩インキュベートする。タンパク質
ホスファターゼ2Aと結合した[125I]ミクロシスチン-YRをBio-Rad(Hercules,C
A)の0.7×15cmカラム中でPharmacia(Uppsala, Sweden)のSephadexTM G-50 fi
neを用いて、ゲル濾過によりフリーの[125I]ミクロシスチン-YRから分離する
。1mM EDTA および0.3mM EGTAを有する50mM Hepes緩衝液(pH7.2)を分離に用い
て4℃で行う。タンパク質ホスファターゼ2Aと結合する[125I]ミクロシスチン-
YRを含む分画を集め、その放射能をシンチレーションカウンティングにより定量
する。ミクロシスチン-LRを過剰に(1μM)添加したコントロール反応において
[125I]ミクロシスチン-YRの非特異的な結合が検出される。
合させるか、ホスファターゼのビオチニル化経由で結合させる)。固定化したタ
ンパク質ホスファターゼをその後、サンプルおよび放射能標識した毒素(たとえ
ば[125I]ミクロシスチン-YR)と混合する。前記の固定化したタンパク質ホス
ファターゼを反応混合物から磁力により分離する。タンパク質ホスファターゼ(
磁性ビーズ)に関係する放射能をシンチレーションカウンティングによって検出
する。タンパク質ホスファターゼに関係する放射能標識の量は、サンプル中の毒
素と結合しているホスファターゼの関数として減少する。
合させるか、ホスファターゼのビオチニル化経由で結合させる)。固定化したタ
ンパク質ホスファターゼをその後、サンプルおよび着色ビーズと結合させた毒素
と混合する。前記の固定化したタンパク質ホスファターゼを反応混合物から磁力
により分離する。タンパク質ホスファターゼ(磁性ビーズ)に関係する着色ビー
ズを視覚または低倍率の顕微鏡(たとえばNikon TMS)により評価する。タンパ
ク質ホスファターゼ(磁性ビーズ)に関係する着色ビーズの量は、サンプル中の
毒素と結合しているホスファターゼの関数として減少する。
合させるか、ホスファターゼのビオチニル化経由で結合させる)。固定化したタ
ンパク質ホスファターゼをその後、サンプルおよび固定化酵素を担持するビーズ
上に固定化した毒素と混合する。前記酵素は、色素原のまたは蛍光原の基質との
好適なインキュベートで検出可能な生成物(着色または蛍光)を生成できる。前
記の固定化したタンパク質ホスファターゼを反応混合物から磁力により分離する
。タンパク質ホスファターゼ(磁性ビーズ)に関係する着色または蛍光をそれぞ
れ分光法または蛍光定量法により測定する。磁性ビーズに関係する色/蛍光の量
は、サンプル中の毒素と結合しているホスファターゼの関数として減少する。
(scintillant)とでプレコートしたウェル(たとえばNEN により供給されるFla
shPlate PLUSストレプトアビジン SMP103)に固定化する。サンプルおよび[125 I]ミクロシスチン-YRをウェルに添加する。固定化したタンパク質ホスファター
ゼに結合した[125I]ミクロシスチン-YRの量をシンチレーションカウンティン
グにより検出する。
質ホスファターゼ2Aとインキュベートした。2 IC50値は、タンパク質ホスファターゼ2Aへの[125I]ミクロシスチン-YRの結
合の50%阻害を得るのに必要な濃度を表す。これらの値をFig.3に記載したように
測定した。前記データは少なくとも3つの別々の実験の平均値を表す。
合物と、または緩衝液単独で(コントロール)、氷上で30分間プレインキュベー
トした。 ホスファターゼ活性を上述したホスホヒストンの脱リン酸化により測定した。 %活性はコントロール反応と比較したものである。2 競合的結合アッセイにおける活性は、緩衝液に溶解した外因性化合物の存在下
および緩衝液単独の場合とを比較したタンパク質ホスファターゼ2Aの[125I]ミ
クロシスチン-YRに対する結合能力を表す。前記データは少なくとも3つの別々の
実験の平均値±標準誤差を表す。
たは海水に溶解した。上述したようにして、これらの溶液の300μl分量をタンパ
ク質ホスファターゼ2Aの結合に関し[125I]ミクロシスチン-YRと競合する能力
について試験した。2 逆浸透水で1/10に希釈した海水。
った。2 HPLCにより抽出物をオカダ酸当量に関して分析した。3 抽出物を100%DMSO中で希釈し、上述した結合アッセイを用いて、タンパク質ホ
スファターゼ2Aへの結合を巡り[125I]ミクロシスチン-YR と競合するそれらの
能力について試験した。オカダ酸当量の濃度は、100%DMSOに溶解したオカダ酸の
標準曲線とデータを比較することによって決定した。
合アッセイの概要図である。 タンパク質ホスファターゼ2Aを[125I]ミクロシスチン-YRとタンパク質ホス
ファターゼ2Aに指向する他の毒素とインキュベートする。該毒素は、ホスファタ
ーゼとの結合を巡って[125I]ミクロシスチン-YRと競合する。
結合を減少させおよびその逆も同様である結果になる。結合平衡に達した後、タ
ンパク質ホスファターゼ2Aに結合した[125I]ミクロシスチン-YRをフリーの[1 25 I]ミクロシスチン-YRからゲル濾過クロマトグラフィーによって分離する。ホ
スファターゼと結合した[125I]ミクロシスチン-YRを含有する分画を集め、放
射能の量をシンチレーションカウンティングにより測定する。
の[125I]ミクロシスチン-YRの結合に及ぼす効果を示す。 タンパク質ホスファターゼ2A(30pM)を35pM[125I]ミクロシスチン-YR(1Ci
/13ng)および図に示した0-100nMの異なる藻類毒素の存在下でインキュベートし
た。
過クロマトグラフィーにより単離し、その放射能をシンチレーションカウンティ
ングにより測定した。各曲線は少なくとも3つの別々の実験の平均値を示す。 添付図の図3は、競合的結合アッセイにおけるミクロシスチン-LRの結合に関
するIC50を示す。
合[125I]ミクロシスチン-YR(Co-Cx)と結合[125I]ミクロシスチン-YR(Cx
)との比として、ミクロシスチン-LRの濃度に対してプロットした。Coは、ミク
ロシスチン-YRが存在しない場合の結合[125I]ミクロシスチン-YRの量を表し、
Cxは、さまざまな濃度のミクロシスチン-LR存在下における結合[125I]ミクロ
シスチン-YRの量を示す。
ファターゼ2Aに結合した[125I]ミクロシスチン-YRの安定度を示す。 タンパク質ホスファターゼ2A(1nM)を[125I]ミクロシスチン-YR(100pM)
の存在下で1時間インキュベートした。ミクロシスチン-LR(2μM)を反応混合物
にゼロの時点で添加した。表示された時点におけるタンパク質ホスファターゼ2A
に結合した[125I]ミクロシスチン-YRの量を、上述のゲル濾過およびシンチレ
ーションカウンティングにより測定した。曲線は4つの別々の実験の平均値を示
す。
結合アッセイの概要図である。
への[125I]ミクロシスチン-YRの結合に及ぼす効果を示す。
関するIC50を示す。
スファターゼ2Aに結合した[125I]ミクロシスチン-YRの安定度を示す。
Claims (21)
- 【請求項1】 タンパク質ホスファターゼを阻害するホスファターゼ標的毒素を測定するため
のアッセイ方法であって、 表面に固定化された固定化リガンドを有する固体支持体を、(i)毒素で汚染
させていると推測されるサンプルおよび(ii)非固定化リガンドと接触させる
こと (ここで、前記固定化リガンドは、前記毒素の少なくとも一つに、前記非固定
化リガンドにまたは前記毒素および前記非固定化リガンドからなる複合体に結合
することができ、かつ、前記非固定化リガンドは、前記固定化リガンドの少なく
とも一つに、前記毒素にまたは前記毒素および前記固定化リガンドからなる複合
体に結合することができ、これにより前記毒素に結合された前記固定化リガンド
、前記非固定化リガンドまたは前記毒素および前記非固定化リガンドからなる複
合体の量比が前記サンプルの毒素含量に依存することを特徴とし、かつ、 前記固定化リガンドは、複合体が形成されていないとき、前記毒素と複合体を
形成しているとき、前記毒素および前記非固定化リガンドの複合体と複合体を形
成しているとき、または前記非固定化リガンドと複合体を形成しているときに、
直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することができるか、あるいは
前記非固定化リガンドは、複合体を形成していないとき、または複合体を形成し
ているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することができ
ることを特徴としている)、 非結合フラクションから結合フラクションを分離すること、および 固定化リガンドに結合した非固定化リガンド(結合フラクション)または水溶
液中で非複合化した非固定化リガンド(非結合フラクション)を直接的または間
接的に測定することからなり、 (i)および(ii)の前記固体支持体への適用が、別個に、連続に、または
同時に行ってもよく、別個にまたは連続に行う場合にはいかなる順序で行っても
よいことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 前記ホスファターゼ標的毒素が、藻類により、またはシアノバクテリアにより
産生されることを特徴とする請求項1に記載のアッセイ方法。 - 【請求項3】 前記測定される毒素が、肝細胞毒素またはオカダ酸であることを特徴とする請
求項1または2に記載のアッセイ方法。 - 【請求項4】 前記サンプル中に存在する毒素分子が、前記非固定化リガンドと、前記固定化
リガンドの限られた数の結合部位を巡って競合し、かつ、前記サンプル中に存在
する毒素のいずれもが、非固定化リガンドが前記固定化リガンドの結合部位に結
合するかまたは結合しないその程度に比例して測定されることを特徴とする請求
項1〜3のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項5】 ホスファターゼ標的毒素の存在または不在が測定されることを特徴とする請求
項1〜4のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項6】 調査されるサンプルが、貝類の表面または遊離の水分、またはこのような貝類
が生息する生息地から取り出された水、または家庭用給水源から取り出された水
であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項7】 前記固定化および/または非固定化リガンドが抗体または抗体断片であること
を特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項8】 前記毒素結合リガンドが、タンパク質ホスファターゼ酵素であることを特徴と
する請求項1〜7のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項9】 前記タンパク質ホスファターゼ酵素が、結合リガンドタンパク質ホスファター
ゼ2Aであることを特徴とする請求項8に記載のアッセイ方法。 - 【請求項10】 前記固定化または非固定化リガンドのいずれかが、リポーター部分を有するこ
とを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項11】 前記非固定化リガンドが、リポーター部分を有することを特徴とする請求項1
0に記載のアッセイ方法。 - 【請求項12】 前記非固定化リガンドが、標識されたペプチド肝細胞毒素または標識されたオ
カダ酸であることを特徴とする請求項11に記載のアッセイ方法。 - 【請求項13】 前記ヘパトキシン(hepatoxin)が、nodularin、microcystin LCまたはmicroc
ystin YRから選択されることを特徴とする請求項12に記載のアッセイ方法。 - 【請求項14】 前記固体支持体が、ディップスティックまたは固体マトリックスであることを
特徴とする請求項1〜13のいずれかに記載のアッセイ方法。 - 【請求項15】 前記固体支持体が、ポリマーまたは磁性ビーズであることを特徴とする請求項
14に記載のアッセイ方法。 - 【請求項16】 ホスファターゼ標的毒素を、本発明に従って検出するためのキットを提供し、
該キットは、 リガンドを固定化させる固相と、 非固定化リガンド、好ましくは水溶液中にあるか固定化リガンドに複合化され
たものとを含み、 前記固定化リガンドおよび非固定化リガンドのいずれも直接的または間接的に
検出可能な部分、および前記固定化リガンドおよび非固定化リガンドの一方と結
合し、かつ検出可能なシグナルを発生させることができるリポーター部分(好ま
しくは、前記検出可能な部分またはシグナルが実験装置なしで直接読み出し可能
である)を含まないことを特徴とするキット。 - 【請求項17】 前記ホスファターゼ標的毒素が、藻類により、またはシアノバクテリアにより
産生されることを特徴とする請求項16に記載のキット。 - 【請求項18】 ホスファターゼ標的毒素結合リガンドを固定化させた固相と、 ホスファターゼ標的毒素による前記毒素結合リガンドへの結合を競合的に阻害
して、実験装置なしに読み出し可能なシグナルを発生させることができるリポー
ター分子とを含むことを特徴とする請求項16または17に記載のキット。 - 【請求項19】 表面に固定化させたタンパク質ホスファターゼを有する磁気的に移動可能なポ
リマー微小球体と、 前記タンパク質ホスファターゼへのシアノバクテリア毒素の結合を競合的に阻
害可能な金ゾル標識したペプチド肝細胞毒素分子を含むことを特徴とする請求項
16〜18のいずれかに記載のキット。 - 【請求項20】 表面に固定化させたタンパク質ホスファターゼを有する磁気的に移動可能なポ
リマー微小球体と、 前記タンパク質ホスファターゼへの藻類毒素の結合を競合的に阻害可能な金ゾ
ル標識したオカダ酸分子を含むことを特徴とする請求項16〜18のいずれかに
記載のキット。 - 【請求項21】 ホスファターゼ標的毒素の測定のための請求項16〜20のいずれかに記載の
キットの使用。
Applications Claiming Priority (3)
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